CN105603048A - 含杨梅酮和咖啡酸的凝血酶原时间测定试剂及其制备方法 - Google Patents

含杨梅酮和咖啡酸的凝血酶原时间测定试剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种稳定的液相凝血酶原时间测定试剂及其制备方法，所用的稳定剂为在一般稳定剂的基础上，加入了0.5-3mM杨梅酮和0.5-3mM咖啡酸。本发明的稳定剂组合，可以降低原料或工艺过程中有害金属离子、自由基对组织因子和磷脂的破坏，提高液相凝血酶原时间测定试剂的稳定性能。

Description

含杨梅酮和咖啡酸的凝血酶原时间测定试剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种含杨梅酮和咖啡酸的液态凝血酶原时间测定试剂及其制备方法。
背景技术
作为血液凝固因子中的第II因子，凝血酶原存在于血浆中，是由肝脏合成的维生素K依赖因子之一，含579个氨基酸残基的单链糖蛋白，分子量72,000。自N-末端起，有1个Gla区(1－40)，2个环区(41－271)和1个催化区(271－579)。Gla区内含10个r-羧基谷氨酸残基，主要功能为通过结合钙离子与磷脂联结。环区参与其与底物和辅因子间的相互作用，环区2可与FⅤa结合，并含有FⅩa的作用位点组氨酸205～精氨酸220。催化区包括激活区和丝氨酸蛋白酶区。在钙离子、FⅤa和磷脂的参与下，凝血酶原被FⅩa激活，形成凝血酶。
用于凝血酶原测定的试剂中，含有组织因子和磷脂。自Schmid与Moranitz提出血液凝固是由血液暴露受损组织后引起的设想以来，组织因子成为了凝血机制研究的热点。组织因子定位于染色体1p22-1p23，结构基因长12.4kb，由6个外显子和5个内含子组成，分子量为47kD。成熟的组织因子是由263个氨基酸残基组成的跨膜单链糖蛋白，包括细胞膜外、跨膜区和内膜区。经脂化的组织因子通过与因子Ⅶ/Ⅶa结合而启动血液凝固级联反应，最终导致凝血酶产生，并催化纤维蛋白原转变成纤维蛋白。
凝血酶原时间是口服各类抗凝药物治疗的主要监测手段，也是其它内科、外科病人进行治疗或手术前凝血功能的一项重要检查指标。
凝血酶原时间测定试剂的稳定性受很多因素的影响，为了准确测定待测血浆的凝血酶原时间，保证试剂中各组份的原有活性是很重要的。在维系组织因子和磷脂的稳定性方面，已经有很多文献报导。譬如，在专利WO1998048283A1中，提出加入0.1-10％的甘氨酸和0.1-5％的PEG及包括叠氮酸钠在内的杀菌剂；专利US7148067B2提出的凝血酶原时间测定试剂的制备中，加入了离子强度调节剂氯化钠、氯化钾等，同时还加入牛血清白蛋白(0.1％)及叠氮酸钠(0.2％)；专利US6733985B1中，提出加入的稳定剂为H2N-CR1R2-CR3R4-(CR5R6)n-(CR7R8)m-COOH，其中R1－R8为氢原子，或羟基或氨基等，同时含有载体蛋白(牛血清白蛋白)、抗氧化剂(BHT、BHA)及氨基酸螯合剂等。
目前，市场上的凝血酶原时间测定试剂，以干粉状为主。在干粉试剂中，采用的稳定剂可大致划分为氨基酸类(包括甘氨酸)、用于调节混合相离子强度的碱金属氯酸盐(包括氯化钠)、多醇类(包括PEG)、抗氧化(主要是磷脂的抗氧化剂，如BHT)和杀菌剂(如叠氮酸钠)。研究表明，上述稳定剂对试剂具有较好的稳定效果，另一方面，干粉试剂在使用前需要复溶，恢复到冻干前的溶液状态。但是，复溶过程存在许多风险，也为检测过程带来了一些不便，同时，在冻干过程中，如果对玻璃化温度、共晶温度和坍塌温度把控不好，干粉状试剂的产率会明显降低，同时，在冻干过程中，凝血酶原时间测定试剂中的磷脂体易于破裂，从而导致试剂失活。在研究已有的稳定剂的过程上，本发明人发现，在已有的稳定剂的基础上，添加杨梅酮和咖啡酸，可明显提升凝血酶原时间测定试剂的稳定性，并以此制备出稳定性较好的液态凝血酶原时间测定试剂。
本发明中提到的稳定剂之一为杨梅酮。杨梅酮主要来源于杨梅树皮和树叶，为浅棕色粉末，分子式为C15H10O8，分子量318.2351，现有的研究表明，杨梅酮可作为血小板活化因子(PAF)的拮抗剂(鄢丹，李果，杨梅素抗血小板聚集的作用机理研究，中国药理通讯,2005(3):43-43)，可抑制血小板聚焦；可用于癌症治疗(陈璇，童晔玲，任泽明，杨梅酮对人肺腺癌A549细胞凋亡和细胞周期的影响，中国现代应用药学,2015(1):14-17)；杨梅酮还具有抗氧化性(陈学丽，叶立斌，励建荣，杨梅渣黄酮类化合物提取及其抗氧化活性研究，食品工业科技，2011(2):85-87)和消除体内自由基等的作用(陈卫，沈洋，聂颢，杨梅叶多酚的自由基清除活性与防护DNA损伤的研究，中国食品学报，2014，14(3):9-16)。
杨梅酮化学结构式
谢湖均等人(谢湖均，牟望舒，林芙蓉，徐结慧，杨梅酮的抗氧化活性，ActaPhys.–Chem.Sin.2013,29(7),1421-1432)研究了杨酶酮的抗氧化活性，他们采用密度泛函理论(DFT)，研究了杨酶酮的分子结构、电子结构和羟基离解焓。计算结果表明，杨酶酮的4’-OH位置具有最高的抗氧化活性，主要是由于4’位上脱氢后生成的羰基与相邻的羟基之间形成了稳定的氢键。同时，杨梅酮可用于抗菌剂，抑制微生物生长(V.V.Polyakov，Chemicalmodificationofthenaturalflavonoidmyricetin,ChemistryofNaturalCompounds,1999,35(1):21-28；ChristinaKourtesi,AnthonyRBall,MicrobialEffluxSystemsandInhibitors:ApproachestoDrugDiscoveryandtheChallengeofClinicalImplementation,TheOpenMicrobiologyJournal,2013,7:34-52)。
在制备凝血酶原时间试剂的过程中，液相环境中会有少量的二价金属离子残留，它们可能来源于处理水(特别是水处理工艺为一级反渗透或缺乏EDI工序的处理水中)，或来源于制备凝血酶原时间测定试剂的其它原材料，而杨梅酮可吸收水溶液中的重金属离子(MananF.A.,MamatD.D,SamadA.A,Heavymetalaccumulatedandantioxidantpropertiesofnephrolepisbiserratagrowinginheavymetal-contaminatedsoil,GlobalNESTJournal,2015,17(3):544-554)，从而稳定由氨基酸残基组成的跨膜单链糖蛋白组织因子。
本发明中提到的另一种稳定剂为咖啡酸。咖啡酸存在于许多中药中，如野胡萝卜(男鹤虱)、光叶水苏、荞麦、木半夏等，分子式C9H8O4，分子量180.15。与杨梅酮一样，咖啡酸也抑制血小板活性或抑制血小板聚焦(ChenTG,LeeJJ,LinKH,AntiplateletactivityofcaffeicacidphenethylesterismediatedthroughacyclicGMP-dependentpathwayinhumanplatelets,ChinJPhysiol.2007Jun30；50(3):121-126)。另外，咖啡酸也抑制癌细胞生长(ChuuCP,LinHP,CiaccioMF,Caffeicacidphenethylestersuppressestheproliferationofhumanprostatecancercellsthroughinhibitionofp70S6KandAktsignalingnetworks,CancerPrevRes(Phila).2012May；5(5):788-797),同时也具有较好的抗氧化性能( Antioxidantactivityofcaffeicacid(3,4-dihydroxycinnamicacid),2006January217(2–3):213–220；LucM.LeBlanc,SynthesisandAntiradical/AntioxidantActivitiesofCaffeicAcidPhenethylEsterandItsRelatedPropionic,Acetic,andBenzoicAcidAnaloguesc,Molecules2012,17(12),14637-14650)
咖啡酸化学结构
与杨梅酮一样，咖啡酸具有抗菌和抑制微生物生长的作用(SakharkarMK,JayaramanP,SoeWM,InvitrocombinationsofantibioticsandphytochemicalsagainstPseudomonasaeruginosa,JMicrobiolImmunolInfect.2009,42(5):364-70；EunaOhandByeonghwaJeon,Synergisticanti-Campylobacterjejuniactivityoffluoroquinoloneandmacrolideantibioticswithphenoliccompounds,Front.Microbiol.,2015,volume6:1-9)，同时也具有消除液相环境中重价金属离子的作用(ConcettaDeStefano,ClaudiaFoti,Acid–baseandUVbehaviorof3-(3,4-dihydroxyphenyl)-propenoicacid(caffeicacid)andcomplexingabilitytowardsdifferentdivalentmetalcationsinaqueoussolution,JournalofMolecularLiquids,July2014,195:9-16)。
发明内容
本发明的目的，是在干粉状凝血酶原时间测定试剂的基础上，提出加入杨梅酮和咖啡酸作为稳定剂，从而制备出稳定性较好的液态凝血酶原时间测定试剂。
一种含杨梅酮和咖啡酸的凝血酶原时间测定试剂，含有稳定剂杨梅酮和咖啡酸。
进一步地，上述凝血酶原时间测定试剂中杨梅酮的含量为0.5-3mM，咖啡酸的含量为0.5-3mM。
优选地，杨梅酮的含量为2.5mM、咖啡酸的含量为2.5mM。
进一步地，上述凝血酶原时间测定试剂中还含有重组组织因子、合成磷脂、氯化钙和肝素中和剂。
所述肝素中和剂优选聚凝胺。
进一步地，上述凝血酶原时间测定试剂中，重组组织因子的含量为250-350nM、合成磷脂的含量为0.05-0.1mM、氯化钙的含量为8-13mM、肝素中和剂的含量为10-50μg/mL。
优选地，重组组织因子的含量为350nM、合成磷脂的含量为0.1mM、氯化钙的含量为10mM、肝素中和剂的含量为30μg/mL。
进一步地，上述凝血酶原时间测定试剂中还含有稳定剂牛血清白蛋白、聚乙醇、氯化钠、麦芽糖、山梨酸钾中的一种或几种。
进一步地，上述凝血酶原时间测定试剂中，牛血清白蛋白的含量为0.05-1％、聚乙醇的含量为0.05-0.5％、氯化钠的含量为25-100mM、麦芽糖的含量为0.5-1.5％、山梨酸钾的含量为0.05-0.1％，其中的百分比均为质量体积百分比。
优选地，牛血清白蛋白的含量为0.5％、聚乙醇的含量为0.05％、氯化钠的含量为75mM、麦芽糖的含量为1.5％、山梨酸钾的含量为0.05％。
上述凝血酶原时间测定试剂的制备方法，步骤如下：分别配制含合成磷脂和组织因子的Tricine缓冲液，Tricine缓冲液浓度为50mM；将上述两者混合，制成重组组织因子的浓度为250-350nM、合成磷脂的浓度为0.05-0.1mM的混合液相，向混合相中加入8-13mM的氯化钙、10-50μg/mL的肝素中和剂、0.05-1％的牛血清白蛋白、0.05-0.5％的聚乙醇、25-100mM的氯化钠、0.5-1.5％的麦芽糖、0.05-0.1％的山梨酸钾，上述浓度及百分比均为在测定试剂中的终浓度。
含磷脂的Tricine缓冲液的配制方法为：用氯仿和甲醇的混合液溶解磷脂，混合液与磷脂的体积质量比为1:1，混合液中氯仿和甲醇的体积比为2:1；磷脂溶解后得到的胶状物置于50-55℃恒温；按照体积比1:20的比例将磷脂胶状物加入到50mM的Tricine缓冲液中，混合均匀，静置，除去不溶性组份。
与凝血酶原时间测定试剂中的一般稳定剂相比，本发明提出的杨梅酮和咖啡酸具有如下共性：1)具有抑制血小板聚集的作用。2)具有芳环结构，且芳环结构上相邻的两个碳原子之间，均分布羟基，其中，杨酶酮的羟基分布在B环上。3)具有抗氧化性。4)具有抗菌性，可抑制微生物生长。5)可吸附液相环境中的重金属离子。在凝血酶原时间测定试剂中，加入杨梅酮和咖啡酸之后，可以降低原料或工艺过程中有害金属离子、自由基对组织因子和磷脂的破坏，提高液相凝血酶原时间测定试剂的稳定性能，这与杨梅酮和咖啡酸的抗氧化性、抗菌性和吸附重价金属离子的特性密切相关。另外，杨酶酮和咖啡酸的加入量对凝血酶原时间测定试剂的结果有影响，当加入量(特别是杨梅酮的加入量)超过8-10mM时，对相同的质控血浆，测定的凝血酶原时间有显明的差距，这是由于较多的杨梅酮的加入，抑制了包括组织因子在内的凝血酶原时间测定试剂中主要成份的活性(通过HPLC、Biosensor等手段得以验证)。因此，本发明对杨梅酮和咖啡酸的加入量作了限定。
附图说明
图1杨梅酮与咖啡酸加入量对凝血酶原时间的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
实施例1
杨梅酮和咖啡酸对凝血酶原时间测定试剂稳定性的影响
取氯仿和甲醇，两者按体积比2:1混合，得到5mL氯仿与甲醇的混合物，在该混合物中，加入5g磷脂(含4gPC和1gPS)，将得到的胶状物在50-55℃的水浴箱中恒温。取100uL的磷脂混合物，加入2mL浓度为50mM的Tricine缓冲液(50mMTris-HCl+1％甘氨酸)中，以3000rpm混合搅拌20min，混合相静置10min，除去不溶性组份。将含有组织因子的缓冲液Tricine与经搅拌后溶解磷脂的Tricine缓冲液混合，制成重组组织因子的浓度为350nM、合成磷脂的浓度为0.1mM的混合液相。在该混合相中，加入10mM的氯化钙、30μg/mL的肝素中和剂聚凝胺、0.5％的牛血清白蛋白、0.05％的聚乙醇、75mM的氯化钠、1.5％的麦芽糖、0.05％的山梨酸钾，上述浓度及百分比均为在测定试剂中的终浓度。
作为对比，在另一组以上述过程制备的凝血酶原时间测定试剂中，加入终浓度为2.5mM的杨梅酮和终浓度为2.5mM的咖啡酸。
将上述两种方法制备的凝血酶原时间测定试剂，在4-8℃保存，每隔1个月，分别选取上述两种方法制备的凝血酶原时间试剂，用CA1500凝血分析仪，测定同一种质控血浆的凝血酶原时间，连续测定12个月。结果如表1所示。
表14-8℃条件下凝血酶原时间测定试剂的检测结果单位：秒
稳定剂1组成：氯化钙、牛血清白蛋白、聚乙醇、氯化钠、麦芽糖、山梨酸钾；
稳定剂2组成：氯化钙、牛血清白蛋白、聚乙醇、氯化钠、麦芽糖、山梨酸钾、杨梅酮、咖啡酸。
上述结果表明，在4-8℃保存条件下，液态凝血酶原时间测定试剂中，因为加入了具有抗氧化性、抗菌性和对二价重金属离子具有吸附作用的杨梅酮和咖啡酸，所以试剂在指定的保存期内，稳定性得到改善。上述组成的凝血酶原时间测定试剂，具有较好的稳定性，且在使用时不需要复溶，为临床检验应用带来便捷条件。
实施例2
杨酶酮及咖啡酸加入量对凝血酶原时间测定试剂的影响
按实施例1相同的方式，制备凝血酶原时间测定试剂，其中，杨梅酮与咖啡酸的总加入量不同，为了实验的方便，将杨梅酮和咖啡酸的加入量按摩尔比1:1来处理。
用CA1500凝血分析仪，采用杨梅酮与咖啡酸总加入量不同的凝血酶原时间测定试剂，测定同一种质控血浆的凝血酶原时间，其中，杨梅酮与咖啡酸的总加入量为1mM-10mM。结果如图1所示。从图1中可以看出，杨梅酮与咖啡酸的加入量，与凝血酶原时间基本上呈正相关，两者的线性关系为y＝0.277x+13.627。当杨梅酮与咖啡酸的总加入量在6mM以下时，质控血浆的凝血酶原时间基本没有变化，当二者的总加入量高于7mM时，质控血浆的凝血酶原时间呈线性增加。
实施例3
杨梅酮和咖啡酸对含有组织因子与磷脂的溶液中重价金属离子的屏蔽效应
按实施例1相同的方式，制备凝血酶原时间测定试剂，其中，一组凝血酶原时间试剂的稳定剂同实施例1中的稳定剂1；另一组凝血酶原时间测定试剂的稳定剂同实施例1的稳定剂2。
在含组织因子和磷脂的混合液中，重价金属离子的存在，对包括组织因子在内的核心组份有影响。为了验证不同稳定剂对溶液中可能存在的重价金属离子对凝血酶原时间测定试剂的作用。分别在上述两组试剂中，加入1.5％(质量体积百分比)的硫酸铜。
用CA1500凝血分析仪，测定同一质控血浆的凝血酶原时间，采用的试剂均含有硫酸铜，只是一组试剂中没有加入杨梅酮和咖啡酸。结果表明，当凝血酶原时间测定试剂中加入杨梅酮和咖啡酸后，硫酸铜的加入量，对凝血酶原时间没有影响，其中，加入硫酸铜时，凝血酶原时间为14.5s，不加入硫酸铜时，凝血酶原时间测定值没有变化，即液相环境中存在重金属离子时，杨梅酮与咖啡酸的加入，能够屏蔽重金属离子对凝血酶原时间的影响。另一方面，在不加入杨梅酮和咖啡酸的凝血酶原试剂中，当液相环境中不存在硫酸铜时，质控血浆的凝血酶原时间为14.6s，当存在硫酸铜时，同一质控血浆的凝血酶原时间延长到16.4s，增加12.3％。这说明，在凝血酶原时间测定试剂中加入杨梅酮和咖啡酸，能有效地保护组织因子和磷脂等核心组份的活性，避免液相环境中重价金属离子对试剂的干扰，从而制备出稳定的液态凝血酶原时间测定试剂。

Claims (10)

1.一种含杨梅酮和咖啡酸的凝血酶原时间测定试剂，其特征在于，含有稳定剂杨梅酮和咖啡酸，所述杨梅酮的含量为0.5-3mM，咖啡酸的含量为0.5-3mM。
2.根据权利要求1所述的含杨梅酮和咖啡酸的凝血酶原时间测定试剂，其特征在于，杨梅酮的含量为2.5mM、咖啡酸的含量为2.5mM。
3.根据权利要求1所述的含杨梅酮和咖啡酸的凝血酶原时间测定试剂，其特征在于，所述测定试剂中还含有重组组织因子、合成磷脂、氯化钙和肝素中和剂。
4.根据权利要求3所述的含杨梅酮和咖啡酸的凝血酶原时间测定试剂，其特征在于，所述重组组织因子的含量为250-350nM、合成磷脂的含量为0.05-0.1mM、氯化钙的含量为8-13mM、肝素中和剂的含量为10-50μg/mL。
5.根据权利要求3所述的含杨梅酮和咖啡酸的凝血酶原时间测定试剂，其特征在于，所述重组组织因子的含量为350nM、合成磷脂的含量为0.1mM、氯化钙的含量为10mM、肝素中和剂的含量为30μg/mL。
6.根据权利要求1或3或4所述的含杨梅酮和咖啡酸的凝血酶原时间测定试剂，其特征在于，所述测定试剂中还含有稳定剂牛血清白蛋白、聚乙醇、氯化钠、麦芽糖、山梨酸钾中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的含杨梅酮和咖啡酸的凝血酶原时间测定试剂，其特征在于，所述牛血清白蛋白的含量为0.05-1％、聚乙醇的含量为0.05-0.5％、氯化钠的含量为25-100mM、麦芽糖的含量为0.5-1.5％、山梨酸钾的含量为0.05-0.1％，其中的百分比均为质量体积百分比。
8.根据权利要求6所述的含杨梅酮和咖啡酸的凝血酶原时间测定试剂，其特征在于，所述牛血清白蛋白的含量为0.5％、聚乙醇的含量为0.05％、氯化钠的含量为75mM、麦芽糖的含量为1.5％、山梨酸钾的含量为0.05％。
9.权利要求1-8任一所述的含杨梅酮和咖啡酸的凝血酶原时间测定试剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：分别配制含合成磷脂和组织因子的Tricine缓冲液，Tricine缓冲液浓度为50mM；将上述两者混合，制成重组组织因子的浓度为250-350nM、合成磷脂的浓度为0.05-0.1mM的混合液相，向混合相中加入8-13mM的氯化钙、10-50μg/mL的肝素中和剂、0.05-1％的牛血清白蛋白、0.05-0.5％的聚乙醇、25-100mM的氯化钠、0.5-1.5％的麦芽糖、0.05-0.1％的山梨酸钾，上述浓度及百分比均为在测定试剂中的终浓度。
10.根据权利要求9所述的含杨梅酮和咖啡酸的凝血酶原时间测定试剂的制备方法，其特征在于，含合成磷脂的Tricine缓冲液的配制方法为：用氯仿和甲醇的混合液溶解磷脂，混合液与磷脂的体积质量比为1:1，混合液中氯仿和甲醇的体积比为2:1；磷脂溶解后得到的胶状物置于50-55℃恒温；按照体积比1:20的比例将磷脂胶状物加入到50mM的Tricine缓冲液中，混合均匀，静置，除去不溶性组份。
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