CN105181978B - 一种凝血酶时间测定试剂及其制备方法 - Google Patents

一种凝血酶时间测定试剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种凝血酶时间测定试剂，组分包括：牛凝血酶和稳定剂，所述的稳定剂为缬氨酸和香豆酸，所述缬氨酸的加入量为质量体积比0.5‑2.5％，所述香豆酸的加入量为0.1‑4mM。上述凝血酶时间测定试剂的制备过程包括，配制50mM的Tris缓冲液，调节pH至中性，向该缓冲液中加入稳定剂，混合均匀后，添加牛凝血酶，混匀即得凝血酶时间测定试剂。本发明试剂选用缬氨酸和香豆酸替代常用的叠氮酸钠作为稳定剂，凝血酶时间测定试剂生产和使用过程更安全、且试剂的稳定性也更高。

Description

一种凝血酶时间测定试剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种凝血试剂及其制备方法，特别涉及一种凝血酶时间测定试剂及其制备方法。
背景技术
凝血酶时间(TT)用来检测凝血、抗凝及纤维蛋白溶解系统功能，是临床上常用的检测项目之一。TT测定试剂的主要成份为凝血酶，作为生物大分子，凝血酶很容易失活。为了避免凝血酶变性，需要在试剂中添加稳定性组份。目前，市场上现有的TT测定试剂，大多采用多醇或多糖类或盐酸盐作为凝血酶的稳定剂，同时添加叠氮酸钠作为抗菌剂或稳定剂，其中包括专利US4696812、WO 01/23536。多醇或多糖类物质，能够提升凝血酶的稳定性，但这类物质的过量加入，会增加混合液的粘度，从而降低采用光学法测定的TT值的准确度。而过量氯酸盐的加入，在调节溶液的离子强度的同时，会导致混合液的玻璃化温度降低。叠氮酸钠具有较好的抗菌性能(Lichstein,H.C.；Soule,M.H.Studies of the effect of sodium azide onmicrobic growth and respiration:I.The action of sodium azide on microbic growth".Journal of Bacteriology 47(3):221–230)，但是它的毒性较大，临床研究表明，吸入叠氮酸钠，可引起鼻、眼刺激，头痛、眩晕、软弱无力、支气管炎、血压降低等症状，同时，在受到冲击的条件下，叠氮酸钠易于引爆，因此，增添了生产过程中原料的使用和控制难度。本发明在实验研究的基础上，克服现有产品的不足，采用牛凝血酶为主要原料，通过优化牛凝血酶稳定试剂种类，制备凝血酶时间测定试剂。以本发明配比制备的凝血酶时间测定试剂，具有较好的稳定性。
发明内容
本发明针对现有TT测定试剂中稳定剂的不足，提供一种新型的TT测定试剂及其制备方法，生产安全性更高、稳定性效果更强、检测准确度更高。
一种凝血酶时间测定试剂，组分包括：牛凝血酶和稳定剂，所述的稳定剂为缬氨酸和香豆酸，所述缬氨酸的加入量为质量体积比0.5-2.5％，所述香豆酸的加入量为0.1-4mM。
优选地，缬氨酸的加入量为质量体积比1％、香豆酸的加入量为2mM。
所述牛凝血酶的用量为5-10U/mL。
进一步的，上述凝血酶时间测定试剂中还包括其它稳定剂，包括：牛血清白蛋白、氯化钙、聚乙二醇、甘露醇、麦芽糖中的一种或几种。
所述其它稳定剂的加入量为：牛血清白蛋白0.05-0.5％、氯化钙8-12.5mM、聚乙二醇0.05-0.5％、甘露醇2-5％、麦芽糖1-3％，其中的百分比均为质量体积百分比。
优选地，其它稳定剂的加入量为：牛血清白蛋白0.2％、氯化钙12.5mM、聚乙二醇0.2％、甘露醇2％、麦芽糖1.5％。
进一步优选地，所述凝血酶时间测定试剂的pH为7.2-7.5，优选7.3。
上述凝血酶时间测定试剂的制备过程包括，配制50mM的Tris缓冲液，调节pH至中性，向该缓冲液中加入稳定剂，混合均匀后，添加牛凝血酶，混匀即得凝血酶时间测定试剂。
上述凝血酶时间测定试剂的制备过程包括，先配制50mM的Tris缓冲液，其中含100mM的氯化钠，调节pH值为7.2-7.5，向该缓冲液中添加牛血清白蛋白0.05-0.5％、缬氨酸0.5-2.5％、氯化钙8-12.5mM、聚乙二醇0.05-1％、甘露醇2-5％、麦芽糖1-3％和香豆酸0.1-4mM，将该混合液充分搅拌均匀后，添加牛凝血酶5-10U/mL，混匀即得凝血酶时间测定试剂。
与现有的凝血酶时间测定试剂相比，本发明试剂有如下优势：(1)采用香豆酸作为抗氧化剂，香豆酸中含有邻苯二酚结构，邻苯二酚结构具有很强的金属离子蛰合能力，从而降低了二价金属离子对氧化反应的催化作用；同时，香豆酸中的邻苯二酚结构能够与过氧自由基发生反应，从而终止蛋白质过氧化链反应，从而进一步提升了试剂的稳定性能。(2)在制备凝血试剂的过程中，所用原料中的少量重金属离子，会导致活化部分凝血酶时间测定试剂不稳定，香豆酸与其它抗氧化剂共同使用时可以增强对金属离子的螯合效果，比如香豆酸可与缬氨酸一起，起到类似EDTA钠盐或钾盐对金属离子的螯合作用。(3)剔除了一般稳定剂中毒性较大的组份，选用香豆酸替代常用的叠氮酸钠，凝血酶时间测定试剂的生产和使用过程更安全。(4)去掉叠氮酸钠后，用以提升试剂稳定性的多糖或多醇类聚合物用量减少甚至完全不用，大大提高了采用光学法测定的凝血酶时间值的准确度。(5)在一般稳定剂的基础上，配合缬氨酸和香豆酸共同作用，凝血酶时间测定试剂的稳定性也更高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1
称取6.2g Tris、2.5g氯化钠，加入体积为1.5L的玻璃瓶中，加去离子水至500mL，搅拌溶解，用稀盐酸调节至pH为7.3，加入2g牛血清白蛋白、1.4g氯化钙、2g聚乙二醇、15g甘露醇、10g麦芽糖、0.5g叠氮酸钠，经充分混合均匀后，定容至1L，加入牛凝血酶，使牛凝血酶浓度为5U/ml，经搅拌混匀后，即得凝血酶时间测定试剂。
实施例2
称取6.2g Tris、2.5g氯化钠，加入体积为1.5L的玻璃瓶中，加去离子水至500mL，搅拌溶解，用稀盐酸调节至pH为7.3，加入1.5g牛血清白蛋白、1.4g氯化钙、2g聚乙二醇、15g甘露醇、10g麦芽糖、0.5g叠氮酸钠、10g缬氨酸，经充分混合均匀后，定容至1L，加入牛凝血酶，使牛凝血酶浓度为5U/ml，经搅拌混匀后，即得凝血酶时间测定试剂。
实施例3
称取6.2g Tris、2.5g氯化钠，加入体积为1.5L的玻璃瓶中，加去离子水至500mL，搅拌溶解，用稀盐酸调节至pH为7.3，加入1.5g牛血清白蛋白、1.4g氯化钙、2g聚乙二醇、15g甘露醇、10g麦芽糖、10g缬氨酸、2mM香豆酸，经充分混合均匀后，定容至1L，加入牛凝血酶，使牛凝血酶浓度为5U/ml，经搅拌混匀后，即得凝血酶时间测定试剂。
对实施例1、实施例2和实施例3所得试剂，分别进行2-8℃稳定性和37℃条件下稳定性实验。
1)2-8℃条件下稳定性实验
将实施例1、实施例2和实施例3配制的凝血酶时间测定试剂，用CA1500全自动血凝仪对正常人新鲜血浆的凝血酶时间进行测定。具体地，将实施例1、实施例2和实施例3制备的三种凝血酶时间测定试剂，在2-8℃条件下保存，每月定时取样一次，连取12个月，检测三种试剂的凝血酶时间，结果见表1。
表1 不同组份凝血酶时间测定试剂的检测结果 单位：秒
上述结果表明，增添缬氨酸后的凝血酶时间测定试剂的稳定性增强，而用香豆酸替代叠氮酸钠后，凝血酶时间测定试剂的稳定性进一步提升。说明缬氨酸与香豆酸发挥了共同作用特点，抗氧化性能相互促进，组合效果既优于各自作用效果，也明显优于缬氨酸与叠氮酸钠的组合。
2)37℃条件下稳定性实验
将实施例1、实施例2和实施例3配制的凝血酶时间测定试剂，用CA1500全自动血凝仪对正常人新鲜血浆的凝血酶时间进行测定。具体地，将实施例1、实施例2和实施例3制备的三种凝血酶时间测定试剂，在37℃条件下保存，每天定时取样一次，连取1个月，检测三种试剂的凝血酶时间，结果见表2。
表2 37℃条件下不同组份凝血酶时间测定试剂的检测结果 单位：秒
上述结果表明，在37℃条件下，增添缬氨酸后的凝血酶时间测定试剂的稳定性增强，而用香豆酸替代叠氮酸钠后，凝血酶时间测定试剂的稳定性进一步提升。说明缬氨酸与香豆酸发挥了共同作用特点，抗氧化性能相互促进，组合效果既优于各自作用效果，也明显优于缬氨酸与叠氮酸钠的组合。

Claims (10)

1.一种凝血酶时间测定试剂，其特征在于，组分包括：牛凝血酶和稳定剂，所述的稳定剂为缬氨酸和香豆酸，所述缬氨酸的加入量为质量体积比0.5-2.5％，所述香豆酸的加入量为0.1-4mM。
2.根据权利要求1所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，缬氨酸的加入量为质量体积比1％、香豆酸的加入量为2mM。
3.根据权利要求1所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述牛凝血酶的用量为5-10U/mL。
4.根据权利要求1或3所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，组分中还包括其它稳定剂，包括：牛血清白蛋白、氯化钙、聚乙二醇、甘露醇、麦芽糖中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述其它稳定剂的加入量为：牛血清白蛋白0.05-0.5％、氯化钙8-12.5mM、聚乙二醇0.05-0.5％、甘露醇2-5％、麦芽糖1-3％，其中的百分比均为质量体积百分比。
6.根据权利要求4所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述其它稳定剂的加入量为：牛血清白蛋白0.2％、氯化钙10mM、聚乙二醇0.2％、甘露醇2％、麦芽糖1.5％，其中的百分比均为质量体积百分比。
7.根据权利要求1或3所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，试剂的pH为7.2-7.5
8.根据权利要求1或3所述的凝血酶时间测定试剂，其特征在于，试剂的pH为7.3。
9.根据权利要求1或3所述的凝血酶时间测定试剂的制备方法，其特征在于，过程如下：配制50mM的Tris缓冲液，调节pH至7.2-7.5，向该缓冲液中加入稳定剂，混合均匀后，添加牛凝血酶，混匀即得凝血酶时间测定试剂；所述的稳定剂为缬氨酸和香豆酸。
10.根据权利要求1所述的凝血酶时间测定试剂的制备方法，其特征在于，过程如下：先配制50mM的Tris缓冲液，其中含100mM的氯化钠，调节pH值为7.2-7.5，向该缓冲液中添加牛血清白蛋白0.05-0.5％、缬氨酸0.5-2.5％、氯化钙8-12.5mM、聚乙二醇0.05-1％、甘露醇2-5％、麦芽糖1-3％和香豆酸0.1-4mM，将该混合液充分搅拌均匀后，添加牛凝血酶5-10U/mL，混匀即得凝血酶时间测定试剂。
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