CN1103429A - 用于生产γ-环糊精的环糊精糖基转移酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及环糊精糖基转移酶，该酶在将该粉或 类似淀粉的物质转化为CD过程中使γ-CD含量提 高，并且在第180位到第240位的氨基酸之间区域 内该蛋白质序列含有氨基酸序列Asn Leu Xxx Asp， 其中蛋白质序列的第1位是CGT酶的信号肽 的起始点，并且Xxx表示天然氨基酸。

Description

本发明涉及用于生产γ-环糊精的环糊精糖基转移酶（CGT酶）EC2.4.1.19，以及涉及这些酶的制备方法及它们的用途。
通常，从淀粉或类似淀粉的物质制备环糊精。由环糊精糖基转移酶将淀粉酶促地转化为环糊精（CD）。不考虑该反应中使用的CGT酶，由于热力学原因，如果将反应进行达到热力学平衡（最高CD产生量），淀粉主要转化为β-CD。但是，在起始阶段，在淀粉转化反应开始时，用于转化反应的酶不同，所得到的一级产物混合物中的组分也不同。就α-，β-或γ-CGT酶在起始阶段形成的主要产物α-，β-或γ-CD而言，三种酶之间也有明显的区别。
至今，只在细菌中检测到适用于工业上生产CD的那些酶，并且已经使用至今，仅在软化芽孢杆菌（Bacillus macerans）（J.Bacteriol.（1986），166，pp.1118-1122）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearochermophilus）（GB2169902）和催产克雷伯氏杆菌（Klebsiella oxytoca）（Gene（1986）47，pp.269-277）中鉴定到α-CGT酶。例如在环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）（Appl.Microbiol.Biotechnol.（1990）34，pp.229-230），巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）（US-A 3，812，011），Bacillus ohbensis（JP74124285），微球菌各个种（Micrococcus sp.）（EP0017242）以及在尚未按分类学规则进行确切分类的嗜碱芽孢杆菌（alkalophilic bacilli），如芽孢杆菌属38-2菌株（Bacillus sp.38-2）（J.Gen.Microbiol.（1988）134，pp.97-105），17-1菌株（关于环糊精的第4届国际专题讨论会的记录汇编（1988），pp.87-92），1011菌株（Appl.Microbiol Biotechnol.（1987）26，pp.149-153）以及1-1菌杆（关于环糊精的第4届国际专题讨论会的记录汇编（1988），pp.71-76）中鉴别出了β-CGT酶。已有人描述在枯草芽孢杆菌313（Bacillus subtilis313）（Agric.Biol.Chem（1986）50，pp.2161-2162），芽孢杆菌属A1-6（Bacillus sp.A1-6）（J.Ferment Bioeng.（1990）70（3），pp.150-154）以及芽孢杆菌属290-3（Bacillus sp.290-3）（关于环糊精的第4届国际专题讨论会记录汇编（1988），pp.87-92）中存在有在起始阶段能形成γ-CD的高活性酶。
X-射线结构分析阐明了环状芽孢杆菌的β-CGT酶的三维空间结构（J.Mol.Biol.（1990）217，pp.737-750）。从该结构可以推断出能够直接参与构建底物结合位点以及构建该CGT酶活性中心的氨基酸残基，但是不能推导出决定该CGT酶底物特异性的氨基酸残基（Biochemistry（1992）31，pp.8740-8746）。
由于在工业上制备环糊精使用CGT酶将淀粉转化为环糊精时总是产生由几种环糊精组成的混合物，因而已经开发了各种用于分离纯化环糊精（α，β或γ）的方法：
-采用，例如基于环糊精分子量不同，用色谱的方法可从产物混合物中分离出限定的CD（例如在US-A4808232中描述）。
-在用酶促方法将淀粉转化为环糊精时，加入复合物形成剂。该形成剂仅与一种限定的CD反应，从而例如，形成一种能通过物理方法从反应混合物中分离出来的一种不溶性复合物。随后，溶解该复合物，并且分离出匀质CD（例如由EP0291067描述）。
-通过向反应混合物中加入一种有机溶剂，例如乙醇，使用γ-CGT酶时产品组分向γ-CD转变（J.Ferm.Bioeng.（1990）70（3），pp.150-154）。
在每种方法中，在最适条件下使用CGT酶，这样对于将要制备其纯化形式的CD而言，这些酶具有形成尽可能高产量的起始产品的优点。
至今已知的α-和β-CGT酶的特异性适合于工业上制备相应的环糊精。相反，没有一种已知的γ-CGT酶具有允许产生相当量的γ-CD的产物特异性。
因此，为了制备γ-CD，在JP-03  053892中建议通过加入γ-CD特异性复合物形成剂糖基甘草素，麦芽糖和一种CGT酶而将α-和/或β-环糊精酶促地转化为γ-CD。
本发明目的是提供环糊精糖基转移酶（CGT酶），该酶在将淀粉或类似淀粉的底物转化为CD时能在更大程度上产生γ-CD。
本发明的另一目的是提供制备所述CGT酶的方法。
本发明的再一目的是提供在所述CGT酶作用下制备γ-CD的方法。
利用下面所述CGT酶可达到本发明的目的。在该酶的蛋白质序列第180位氨基酸和第240位氨基酸的区域内含有氨基酸序列Asn Leu Xxx Asp，其中该蛋白质序列的第1位是CGT酶信号肽的起始点，并且Xxx表示除Tyr外的天然氨基酸。
优选的是，本发明的CGT酶在其蛋白质序列的第180位氨基酸和第240位氨基酸之间的区域内含有氨基酸序列Asn Leu Trp Asp或Asn Leu Ser Asp，其中该蛋白质序列的第1位是CGT酶的信号肽的起始点。
特别优选的是，本发明的CGT酶在其蛋白质序列的第180位氨基酸和第240位氨基酸之间区域内含有Asn Leu Trp Asp序列基元，其中该蛋白质序列的第一位是CGT酶的信号肽的起始点。
在转化淀粉或类似淀粉的物质时，本发明的CGT酶按下列所述产物分布产生CD，即γ-CD和α-CD与β-CD总和的商值大于用相应的未改变的起始酶转化淀粉获得的其产品的商值。
在本文中，起始酶是指用于制备本发明所述的CGT酶的CGT酶。因此，令人意想不到的是，本发明的CGT酶比用于制备该酶的起始酶具有更高的γ-CD特异性。
本发明的CGT酶的例子是由下表1所列的CGT酶通过用另一天然氨基酸取代每一例子中下面划线的Tyr而获得的CGT酶。用Trp或Ser替代Tyr的CGT酶是优选的。用Trp替代Tyr的CGT酶是特别优选的。
表1
CGT酶类型  来源的菌种  位置  氨基的序列
β  环状芽孢杆菌  225  (1)
β  芽孢杆菌1-1  213  (2)
β  B.ohbensis  213  (3)
β  枯草芽孢杆菌  218  (4)
γ  芽孢杆菌290-3  207  (5)
（1）Tyr Lys Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp
（2）Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp
（3）Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp
（4）Tyr Lys Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp
（5）Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Ala ser
对列举的这些CGT酶，表1示出了在β-和γ-CGT酶中普遍存在的氨基酶序列区域以及该序列区域内的Tyr，该序列区域与改变产品的特异性有关。在表1中，将在各种例子中重复产生的氨基酸序列的第一个氨基酸的编号规定为相关的CGT酶的信号肽的第一个氨基酸的位置，编为第1位点。采用常规公知的标准方法可以发现，在所有β-和γ-CGT酶中存在该一致序列区。利用同样已知的标准方法，例如在本发明列举的那些方法，通过用本发明所述的方法在这些CGT酶中诱变Tyr可以从β-或γ-CGT酶制备本发明的酶。
采用下列方法可达到本发明的另一目的，即采用本领域内已知的诱变方法使编码β-或γ-CGT酶的基因的DNA序列突变，从而用另一天然氨基酸替代该突变CGT酶中的Tyr，该Tyr定位于使用的β-或γ-CGT酶的第180位氨基酸到第240位氨基酸之间的区域内的序列单位Asn Leu Tyr Asp中。
所有的β-和γ-CGT酶都适合于制备本发明的CGT酶。采用已知方法分离编码CGT酶的基因，并且采用“体内”或“体外”诱变方法将本发明所述突变引入到CGT酶基因中。
“体内诱变方法”特定地指那些用诱变剂，例如紫外线，亚硝基胍或甲基磺酸乙酯将微生物进行非特异性诱变的方法，其中的微生物在染色体上和/或附加体上携带有编码CGT酶的基因。例如由Miller J.H.在Experiments in Molecular Genetics（172）;Cold Spiring Harbor Laboratory;Cold Spring Marbor，N.Y.中描述了这样一种方法。
随后，用已知方法，例如采用Sanger等人在PNAS74（1977）5463-5467中描述的链终止方法分析序列的方法识别突变体，该突变体中至少是编码与环状芽孢杆菌的CGT酶的Tyr 229同源的酪氨酸的CGT酶基因的密码子由编码另一天然氨基酸残基，优选的是一个丝氨酸或一个色氨酸残基，特别优选的是一个色氨酸残基的一个密码子替代。
在本发明的含意内，与环状芽孢杆菌的CGT酶的Tyr 229同源的密码子是指其他CGT酶基因的为Tyr编码的密码子，该密码子为表1中提供的氨基酸序列基元中底下划线的Tyr编码。
在本发明含意内，“体外”诱变方法是指下述方法，即以本领域内已知的一种方式和途径修饰一个离体的CGT酶基因，或一个CGT酶基因的片段，从而制备一个编码一种CGT酶的基因，在该酶中至少是与环状芽孢杆菌CGT酶的Tyr  229同源的氨基酸残基由另一个氨基酸残基，优选的是色氨基残基或丝氨酸残基，特别优选的是色氨酸残基所取代。
目前已知的“体外”诱变方法的举例是利用“PCR”技术的特异（Biotechniques（1992）13（3）pp.342-346）或非特异（Technique（1989）1（1），pp.11-15）诱变方法。下述方法也是已知的：在合成的寡聚核苷酸帮助下按特定的方式将突变导入靶基因中。利用所谓的“单链方法”（Ausubel F.Met al.（1987）Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates）或使用“双链方法”（Promega 1992-1993 Catalog，150）或使用其他方法，例如在Ann.Eev Genet.（1985）19，pp.423-462中描述的方法，可以完成上述过程。
用于从淀粉中分离γ-CD是本发明所述的具有提高了的形成γ-CD活性的CGT酶的主要应用领域。采用现有的制备方法可将本发明的CGT酶用于该目的。下面例举描述的是制备γ-CD的现行制备方法，其中，该方法中使用的CGT酶可用本发明的CGT酶替代。
-Journal of Fermentation and Bioengineering（1990）70（3），pp.190-192：在能增加γ-CD产量的乙醇存在下，用来自芽孢杆菌AL-6并能生成β-和γ-CD的CGT酶制备γ-CD。
-JP87 25，976：用芽孢杆菌313的γ-CGT酶制备γ-CD。
-EP  291，067：用软化芽孢杆菌的CGT酶制备γ-CD。通过加入复合物形成剂，例如环十六烷-8-烯-1-酮，达到γ-CD产物特异性。
-DE  4009822：用芽孢杆菌290-3的γ-CGT酶制备γ-CD。
通过与α-CD和β-CD两者相比较，γ-CD有特定优点，根据该优点鉴别出该γ-CD是唯一一种可能的CD，或者是一种最适合于系列应用的CD。
与由六个葡萄糖单元构成的α-CD相比，由八个葡萄糖单元构成的γ-CD具有更高程度的疏水空化作用，该作用使其还可以结合由于空间原因而不能被α-CD结合的那些外源分子。
与β-CD（室温下在水中溶解性：约18.5克/升）相比，γ-CD具有显著的更高的溶解性（室温下约为232.0克/升），因此比β-CD更适合于涉及从水溶液形成复合物的反应。γ-CD的低毒性是其与β-CD及改性的β-CD衍生物相比所具有的另一优点。在动物模型中，不论是口服或静脉给药，α-CD衍生物和β-CD衍生物比γ-CD更具毒性。
下列实施例用于进一步阐明本发明。
实施例1 芽孢杆菌290-3（DSM 5850）的γ-CGT酶的诱变处理
以本领域内技术人员已知的途径和方式，用另一个编码任意一种氨基酸残基，而优选的是色氨酸残基的碱基三联体，取代编码211酪氨酸的CGT酶结构基因的碱基三联体而实现了用另一个任意的氨基酸，尤其是用色氨酸或丝氨酸残基取代在芽孢杆菌290-3（保存于在Braunschweig的德国微生物收集中心，DSM  5850）的γ-CGT酶的第211位上的酪氨酸残基。
为了进行诱变，首先将芽孢杆菌290-3的γ-CGT酶基因克隆到可通过商品途径购买的大肠杆菌载体pUC19（Boehringer，Mannheim）。为了完成该步骤，从芽孢杆菌290-3中分离染色体DNA（关于环糊精的第4届国际专题讨论会会议记录汇编），并且用限制性核酸内切酶Sau 3AI（Bochringer，Mannheim）部分切割，所用方法如Ausubel F.M.，Current protocols in molecwlar biology，vol.l;Greene Publishing Associates & Wiley-Interscience，N.Y.描述。分离出2和5kb大小范围内的片段，然后将它们与用限制性核酸内切酶BamHI（Boechringer，Mannheim）线性化的pUC19-DNA和T4  DNA连接酶一起，在16℃保温12小时。采用已知方法将该连接混合物用于转化已变为有能力吸收DNA的大肠杆菌k12细胞（Maniatis，Molecular Cloning，Alaboratory Manaal;Cold Spring Harbor Laboratory（1982），N.Y.）。从大肠杆菌细胞中分离出携带了为芽孢杆菌290-3的γ-CGT酶编码的基因的重组质粒，所述的大肠杆菌细胞在转化后在含有淀粉的指示平板上形成淀粉降解圈（Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory（1982），N.Y.pp.86-92）。
使用由Amersham（Braunsohweig）作为商品销售的“寡聚核苷酸特异性体外诱变系统，变体2.1”完成该基因的诱变，并且诱变是基于Eckstein（Nacl，Acids.Res.（1986）14，pp.9676-9698以及Nacl.Acids.Res.（1988）16，pp.791-802）研制的方法进行的。精确地讲诱变是按照所说的Amersham诱变系统所附的方案完成的。该方法概括于下文。从所说诱变系统的方案可以获得详细方法。
利用可通过商业途径购买的酶，例如限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶（Bochringer，Mannheim），将为芽孢杆菌290-3的γ-CGT酶编码的克隆于pUC19中的基因部分克隆到商业上可得到的M13载体（New English Biolabs），其中的基因部分含有为CGT酶的第211位上的酪氨酸残基编码的碱基三联体。这样一种片段的例子是0.6kb大小的PstI/EcoRI片段。将该片段克隆到已用限制性核酸内切酶PstI和EcoRI切割的M13载体中。
根据Amersham提供的试验方案以及上面提到的诱变系统，从吸收了重组M13载体的大肠杆菌宿主细胞中分离出单链重组M13  DNA（模板DNA）。
合成适用于实际诱变的在每一种情况下都具有所需序列的用化学方法制备的诱变寡核苷酸。该寡核苷酸可通过商业途径，例如从MWG（Ebersberg）获得。选择这样的诱变寡核苷酸序列，即该诱变寡核苷酸的碱基顺序与模板DNA的核苷酸序列部分反向互补，所述模板DNA在每种例子中其上游和下游有15个碱基，并且含有原在于模板DNA中的为芽孢杆菌290-3的γ-CGT酶的第211位的酪氨酸残基编码的碱基三联体。但是诱变的寡核苷酸不含有为酪氨酸编码的碱基三联体，而是含有在完成诱变后导致产生γ-CGT酶衍生物的核苷酸，在该酶衍生物中由另一氨基酸残基代替酪氨酸残基定位于第211位。
本发明使用的两个诱变寡核苷酸的序列描述于表2。
表2：5'  -ATT TAT CGA AAT CTT TGG GAT TTA GCT
AGT CTA  -3'
5'  -ATT TAT CGA AAT CTT NNN GAT TTA GCT
AGT CTA  -3'
使用表2中描绘的上面一个诱变寡核苷酸导致产生γ-CGT酶衍生物，该衍生物中第211位酪氨酸残基已由色氨酸残基取代。
如果使用表2中描绘的下面一个诱变寡核苷酸即所谓的简并或“混合”寡核苷酸，编码211位酪氨酸的碱基三联体由除编码Tyr的三联体以外的64种可能的碱基三联体中任一种所替代。因此该寡核苷酸适合于生产这样的γ-CGT酶衍生物，即该衍生物中的第211位氨基酸残基酪氨酸由任何一种其他天然氨基酸替代。
用T4聚核苷酸激酶和ATP（Maersham）在诱变寡核苷酸的5'末端磷酸化。将磷酸化的诱变寡核苷酸结合到模板DNA的同源区域。为了该目的，将5微克单链模板DNA与约4皮摩尔（pmol）的磷酸化诱变寡核苷酸一起在70℃保温3分钟，然后在37℃保温30分钟。随后，以结合至模板DNA上的诱变寡核苷酸作为合成起始点并且以模板DNA作为突变DNA链从头开始合成的模板，从而合成一条DNA链，该链除诱变位点外其余部分与模板DNA互补。在加入DNA多聚酶klenow片段（Amersham），T4  DNA连接酶以及含有核苷酸dATP，dGTP，dTTP，以用于代替dCTP的硫代核苷酸dCTPαs（Amersham）后，在16℃合成反应进行15小时。
从该合成试样中去除剩余单链模板DNA分子。为完成这一步，向样品中加入NaCl，然后通过能特异性地固定单链DNA的硝化纤维素滤膜（Amersham）过滤。浓缩遗留在滤液中的双链杂交DNA，并用乙醇沉淀脱盐。随后在含有NciI（Amersham）的合适保温缓冲液（Amersham）中，将该杂交DNA在37℃保温90分钟。其NciI是一种识别核苷酸序列CC（G/C）GG，但仅切割天然DNA链并不切割哪些含有dCTPαs核苷酸类似物的链的限制性核酸内切酶。这种处理仅导致非突变链（模板DNA）产生断裂。
然后在37℃用核酸外切酶Ⅲ（Amersham），一种从游离末端开始降解DNA链的酶，处理30分钟以除去模板DNA。在将核酸外切酶热失活（70℃加热15分钟）后，将留下的单链并且突变的DNA链与DNA多聚酶Ⅰ（Amersham），T4  DNA连接酶以及核苷酸dATP，dTTP，dCTP和dGTP一起在16℃保温3小时。这一步骤导致突变的单链DNA链转化为双链。进一步用乙醇沉淀而进行纯化后，将突变DNA转化到感受态大肠杆菌K12细胞中。
通过分析转化后获得的五个克隆中重组DNA相关区域的序列而检验诱变步骤是否成功。如果使用的是简并性诱变寡核苷酸（表2，底部），则通过测序测定得到的突变。使用合适的限制性酶，从那些已证实发生了突变的载体中切除起始时为了诱变而克隆到M13中的DNA片段。
对于本实施例中使用的0.6kb片段，用PstI和CcoRI进行切除。
随后，从表达芽孢杆菌290-3的γ-CGT酶的基于pUC19的表达质粒中切除相应的、未突变的Pst I/EcoRI片段，并用T4  DNA连接酶将突变的片段连接上去而替代该未突变片段。
实施例2  来自芽孢杆菌1-1菌株的β-CGT酶的诱变
类似于实施例1中描述的方法，用编码色氨酸残基的三联体替代为相应的CGT酶的第217位酪氨酸残基编码的芽孢杆菌1-1的β-CGT酶基因的密码子。
表3显示用于进行这种诱变的寡核苷酸。
表3
5'  -ATT TAC AGA AAC TTA T
GG GAT CTG GCA GAC TAT  -3'
实施例3  来自环状芽孢杆菌的β-CGT酶的诱变
类似于实施例1中描述方法，用编码一个色氨酸残基（表4，上）或编码一个丝氨酸的残基（表4，下）的三联体替代为相应CGT酶的第229位酪氨酸残基编码的来自环状芽孢杆菌的β-CGT酶基因的密码子。
表4显示用于这些诱变过程的寡核苷酸。
表4
5'  -ATC TAC AAA AAC CTG T
GG GAC CTG GCC GAC TTC
-3'
5'  -ATC TAC AAA AAC CTG T
C T GAC CTG GCC GAC TT
C  -3'
实施例4  在大肠杆菌中生产本发明所述的芽孢杆菌290-3 γ-CGT酶及其衍生物
为了生产实施例1中制备的芽孢杆菌290-3γ-CGT酶及其衍生物，将实施例1中描述的基于pUC19的表达质粒转化到大肠杆菌的二级菌株中。大肠杆菌WCM105用作为大肠杆菌的二级菌株。按EP338401描述从大肠杆菌DS410制备该菌株。
因此，为了制备芽孢杆菌290-3γ-CGT酶或其衍生物，在一个振荡水浴（旋转速率为250rpm）中将含有合适CGT酶表达质粒的大肠杆菌WCM105细胞在含有10克/升乳糖和0.1克/升氨苄西林的LB培养基（Manitis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory（1982），No.Y.）中30℃保温72小时。然后通过5000×g离心而分离出细胞。无细胞培养物的上清液中含有γ-CGT酶或其衍生物。
实施例5  在大肠杆菌中生产本发明所述的芽孢杆菌1-1β-CGT酶以及其衍生物
以类似于实施例4中的描述，使用实施例2中描述的表达质粒完成制备过程。
实施例6  在大肠杆菌中生产本发明所述的环状带孢杆菌β-CGT酶及其衍生物
以类似于实施例4中的描述，使用实施例3中描述的表达质粒完成制备过程。
实施例7  淀粉转化为环糊精
按照Eur.J.Biochem.（1990）191，pp.177-185描述的方法测定CGT酶的活性。
在每种情况下，将待测试的10单位CGT酶/每克淀粉与5%可溶性淀粉溶液（Merck，Darmstadt）一起在含有20mM Tris/HCl，pH7.2，以及5mM CaCl2的缓冲液中45℃保温一段规定时间。在规定时间后，通过加入1.5倍体积的甲醇而终止该反应。通过在4℃保温1小时而沉淀未发生反应的残留的淀粉，离心（10分钟，12，000×g）分离。在Nukleosil 10-NH2柱（Macherey & Nagel，Diiren）进行HPLC，以规定的环糊精或线性麦芽低聚糖（Singma，Munich）作为标准物，测定得到的产品。
实施例8  使用非突变的芽孢杆菌290-3的γ-CGT酶及实施例4制备的衍生物转化淀粉
按实施例7中描述进行反应。合计出现的线性麦芽低聚糖（G1-G7）的量。获得下列所述结果：
表5
反应时间  淀粉转化为环糊精和G1-G7(%)
(分钟)  非突变CGT酶  突变CGT酶
β-CD  γ-CD  G1-G7  β-CD  γ-CD  G1-G7
5  7.0  8.6  0.0  0.0  7.8  0.0
10  11.0  13.0  0.0  0.0  12.8  0.0
15  12.6  14.4  0.0  0.0  16.2  0.0
30  21.4  18.2  1.2  2.0  22.8  2.2
实施例9  使用非突变的环状芽孢杆菌β-CGT酶以及实施例6中制备的衍生物转化淀粉，在该衍生物中第229位的酪氨酸由色氨酸替代
按实施例7描述进行反应，得到下列结果。
表6
反应时间  淀粉转化为环糊精(%)
(分钟)  非突变CGT酶  突变CGT酶
α-CD  β-CD  γ-CD  α-CD  β-CD  γ-CD
1  0.0  6.4  1.2  0.0  1.0  4.4
2  0.0  10.6  2.0  0.0  2.0  8.0
3  1.6  13.5  2.6  0.0  2.8  14.6
4  2.6  16.4  5.2  0.0  4.8  17.2
5  3.2  18.2  7.0  0.0  5.8  16.4
6  2.6  20.0  6.6  0.0  6.2  16.0
7  3.4  22.2  7.6  1.0  7.4  16.4
8  3.8  23.0  6.4  1.2  8.4  19.8
9  4.4  24.6  7.0  1.8  9.6  22.0
10  4.6  26.2  6.0  1.8  8.2  20.8
实施例10  利用非突变的环状芽孢杆菌β-CGT酶以及实施例6制备的衍生物，在γ-CD复合物形成剂存在下转化淀粉，所述衍生物中第229位的酪氨酸残基由色氨酸残基替代
转化是按实施例7中描述进行的，但作了如下所述修改：-用土豆淀粉替代可溶性淀粉
-每10克淀粉中加入1.25克CHD（环十六碳烯酮）获得下列结果：
表7
反应时间  淀粉转化的环糊精(%)
(分钟)  非突变CGT酶  突变CGT酶
α-CD  β-CD  γ-CD  α-CD  β-CD  γ-CD
1  2.3  18.0  5.4  1.4  10.5  13.7
2  3.2  20.0  7.2  2.2  13.8  22.2
3  4.4  21.8  9.5  3.4  15.8  23.7
4  n.d.  n.d.  n.d.  3.5  11.2  25.5
5  5.4  20.9  12.8  3.5  11.5  29.0
6  5.8  21.1  14.6  n.d.  n.d.  n.d.
7  6.4  20.6  17.0  4.7  11.0  32.0
实施例11：用非突变的环状芽孢杆菌的β-CGT酶以及本发明实施例6所述的衍生物转化淀粉，其中衍生物的第229位酪氨酸由丝氨酸替代
按实施例7所述进行反应。在20分钟保温后获得下列结果
表8
反应时间  从淀粉转化的环糊精(%)
(分钟)  非突变CGT酶  突变的CGT酶
α-CD  β-CD  γ-CD  α-CD  β-CD  γ-CD
20  4.3  20.1  6.6  1  13  13

Claims (6)

1、一种环糊精糖基转移酶(CGT酶)，该酶在将淀粉或类似淀粉物质转化为环糊精(CD)时使γ-CD的含量提高，并且在该酶蛋白质序列的第180位氨基酸至240位氨基酸之间的区域内含有Asn  Leu  Xxx  Asp氨基酸序列，其中该蛋白质序列的第1位是CGT酶信号肽的起始点，Xxx是指除Tyr外的任何天然氨基酸。
2、根据权利要求1所述CGT酶;其中Xxx代表Try或Ser。
3、根据权利要求1所述CGT酶，其中Xxx是指Trp。
4、制备CGT酶的方法，其中采用本领域已知的诱变方法将编码β-或γ-CGT酶的基因的DNA序列进行突变，从而在突变的CGT酶中由另一天然氨基酸代替位于所使用的β-或γ-CGT酶中位于180位-240位氨基酸之间区域内的序列基元Asn Leu Tyr Asp中的Tyr。
5、根据权利要求4所述方法，其中在突变CGT酶中用Trp或Ser代替位于所使用的β-或γ-CGT酶中第180位-240位氨基酸之间区域内序列基元Asn Leu Tyr Asp中的Tyr。
6、权利要求1-3中任一项的CGT酶用于制备γ-环糊精。
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