HU216331B - Eljárás ciklodextrin-glikozil-transzferázok előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány őlyan ciklődextrin-glikőzil-transzferáz (CGTáz)előállítására vőnatkőzik, amely keményítő vagy keményítőszerű anyagőkciklődextrinné (CD) történő átalakítása sőrán főkőzőtt mérté ben g-ciklődextrint termel. A CGTázt úgy állítják elő, hőgy egy b- vagy g-CGTázt kódőló gén DNS-szekvenciáját önmagában ismert műtagenezis-módszerek el úgy módősítják, hőgy az eredeti b- vagy g-CGTáz 180. és240. aminősavpőzíciója között található Asn–Leű–Tyr– Aspszekvenciamőtívűm tirőzintagját más természetes a inősavra, előnyösentriptőfánra vagy szerinre cserélik. ŕ

Description

A találmány ciklodextrin-glikozil-transzferáz-enzimek (CGTázok) (EC 2.4.1.19) előállítására vonatkozik. A CGTázok γ-ciklodextrin termeléséhez alkalmazhatók.

A ciklodextrineket általában keményítőből vagy keményítőszerű szubsztrátumokból állítják elő. Ennek során a keményítő a CGTáz-enzim hatására ciklodextrinné (CD-vé) alakul. Termodinamikai okokra vezethető vissza, hogy - az alkalmazott CGTáztól függetlenül - a keményítő főleg β-CD-vé alakul, ha a reakciót a termodinamikai egyensúly eléréséig (maximális CDhozam) hagyják folyni. A kezdeti szakaszban viszont, a keményítő átalakulásának elején az alkalmazott enzimek különböznek a primer termékelegy összetételében. Az enzim által ebben a kezdeti szakaszban főleg képzett terméktől - α-, β- vagy γ-ciklodextrin - függően α-, βvagy γ-CGTázt különböztetnek meg.

Az ilyen, ipari CD-termelésre alkalmas és ilyen célra már használt enzimeket eddig kizárólag baktériumokban mutatták ki. α-CGTázok eddig csak a Bacillus macerans [J. Bacteriol. (1986), 166, 1118-1122. oldal), Bacillus stearothermophilus (GB 2169902) és Klebsiella oxytoca [Gene (1986), 47, 269-277. oldal] mikroorganizmusokban azonosítottak. β-CGTázokat például az alábbi mikroorganizmusokban találtak: Bacillus circulans (Appl. Microbiol. Biotechnoi. (1990) 34, 229-230. oldal, Bacillus megaterium (USA 3 812011), Bacillus ohbensis (JP 74124285), Micrococcus sp. (EP 0017242), valamint taxonómiailag nem pontosan azonosított alkalofil bacilusok, így Bacillus sp. 38-2 [J. Gén. Microbiol. (1988), 134, 97-105. oldal], 17-1 [Proceedings of the 4th International Symposium on Cyclodextrins (1988), 87-92. oldal], 1011 [Appl. Microbiol. Biotechnoi. (1987), 26, 149-153. oldal), 11 [Proceedings of the 4th International Symposium on Cyclodextrins (1988), 71-76. oldal], A kezdeti szakaszban nagy részarányban γ-ciklodextrint képező enzimeket az alábbi mikroorganizmusokban találtak: Bacillus subtilis 313 [Agric. Bioi. Chem. (1986), 50, 2161-2162. oldal], Bacillus sp. Al-6 [J. Ferment. Bioeng. (1990), 70 (3), 150-154. oldal] és Bacillus sp. 290-3 [Proceedings of the 4th International Symposium on Cyclodextrins (1988), 87-92. oldal].

Röntgensugaras szerkezetelemzés útján tisztázták a Bacillus circulans β-CGTázának háromdimenziós szerkezetét [J. Mól. Bioi. (1991), 217, 737-750. oldal]. A szerkezetből következtetni lehetett arra, hogy milyen aminosavmaradékok vesznek közvetlenül részt a szubsztrátumkötőhely és az aktív centrum felépítésében, arra azonban már nem, hogy milyen aminosavmaradékok determinálják a CGTáz termelési fajlagosságát [Biochemistry (1992), 31, 8740-8746. oldal].

Tekintettel arra, hogy az iparilag hasznosított CGTázok - a keményítőt ciklodextrinné alakítva - mindig több ciklodextrin elegyét szolgáltatják, a tiszta ciklodextrinek (α, β vagy γ) előállítására több eljárást fejlesztettek ki:

- Definiált ciklodextrinek a termékelegyből, például a móltömegkülönbségek alapján kromatográfiásan elválaszthatók (például USA 4 808 232).

- A keményítő ciklodextrinné történő enzimes átalakítása során komplexképzőt adagolnak, ezek csak definiált ciklodextrinnel reagálnak, például oldhatatlan komplexet képeznek, amely fizikai módszerrel elválasztható. Az elválasztott komplexet feloldják, és a homogén CD-t kinyerik (például EP 0291067).

- Szerves oldószer, például etanol adagolása γCGTáz alkalmazása esetén a termékösszetételt eltolhatja γ-CD irányába [J. Ferm. Bioeng. (1990), 70 (3), 150-154. oldal].

Mindegyik eljárás során előnyösen olyan CGTázt alkalmaznak, amely a tisztán előállítani kívánt ciklodextrint lehetőleg nagy részarányban termeli.

Az eddig ismert a- és β-CGTázok fajlagossága elegendő a megfelelő ciklodextrinek ipari termeléséhez. Ezzel szemben egyetlenegy γ-CGTáz sem rendelkezik olyan fajlagossággal, amely a γ-ciklodextrin hasonló termelését lehetővé tenné.

A JP 03053892 szabadalmi irat szerint γ-ciklodextrin úgy állítható elő, hogy a- és/vagy β-CD-hez a glikozilglicirrhizin nevű, γ-ciklodextrinre szelektív komplexképzőt, maltózt és CGTázt adagolnak.

A találmány feladata olyan ciklodextrin-glikoziltranszferázok (CGTázok) megtalálása volt, amelyek keményítőt vagy keményítőszerű anyagot ciklodextrinné alakítva fokozott mértékben γ-ciklodextrint termelnek.

A találmány további feladata olyan eljárás kifejlesztése volt, amellyel a fenti CGTázok előállíthatók.

Végül a találmány feladata olyan eljárás kidolgozása volt, amellyel az említett CGTázok segítségével γciklodextrint lehet termelni.

A találmány feladatát olyan CGTázzal oldottuk meg, amelyre jellemző, hogy proteinszekvenciájában a 180. és 240. aminosavpozíció között az Asn Leu Xxx Asp szekvencia szerepel, az 1. aminosavpozíció a CGTáz jelzőpeptidjének eleje, és Xxx jelentése természetes aminsav Tyr kivételével.

A találmány szerinti CGTázok a 180. és 240. aminosavpozíció között előnyösen az Asn Leu Trp Asp vagy Asn Leu Ser Asp szekvenciát tartalmazzák, és az

1. aminosavpozíció a CGTáz jelzőpeptidjének eleje.

A találmány szerinti CGTázok a 180. és 240. aminosavpozíció között különösen előnyösen az Asn Leu Trp Asp szekvenciát tartalmazzák, és az 1. aminosavpozíciót a CGTáz jelzőpeptidjének eleje.

A találmány szerinti CGTázok, ha keményítőt vagy keményítőszerű anyagokat ciklodextrinné alakítanak, olyan termékösszetételt eredményeznek, amelyben a γciklodextrin mennyisége osztva az a- és β-ciklodextrin mennyiségének összegével nagyobb részarányt ad, mint a nem módosított kiindulási enzim.

A kiindulási CGTázon itt azt a CGTázt értjük, amelyből a találmány szerinti CGTázt előállítjuk. A találmány szerinti CGTázok meglepő módon nagyobb γciklodextrin-szelektivitással rendelkeznek, mint az előállításukhoz felhasznált kiindulási enzimek.

A találmány szerinti CGTázok például az 1. táblázatban összefoglalt CGTázokból készíthetők úgy, hogy az aláhúzott Tyr-csoportot más természetes aminosavra

HU 216 331 Β cseréljük. Előnyben részesítjük az olyan CGTázokat, amelyben Tyr a Trp vagy Ser aminosavra van kicserélve. Különösen előnyösek az olyan CGTázok, amelyekben Tyr a Trp aminosavra van kicserélve.

7. táblázat

CGTáz		Pozíció	Aminosav- szekvencia
Típus	Törzs
β	Β. circulans	225	Tyr Lys Ans Leu Tyr Asp Leu Alá Asp
β	Β. sp. 1-1	213	Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Alá Asp
β	Β. ohbensis	213	Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Alá Asp
β	Β. subtilis	218	Tyr Lys Asn Leu Tyr Asp Leu Alá Asp
Υ	Β. sp. 290-3	207	Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Alá Ser

Az 1. táblázat néhány példa alapján mutatja a β- és γ-CGTázokban mindig található aminosavszekvenciatartományt, valamint ezen tartományon belül a termékszelektivitás módosítása szempontjából fontos Tyr aminosavat. A „Pozíció” oszlop az utána megadott aminosavszekvencia első aminosavának a pozícióját adja meg, és 1-es pozícióban a CGTáz jelzőszekvenciájának az első aminosava van. Általánosan ismert standardeljárások segítségével a megfelelő szekvenciatartomány minden βés γ-CGTázban található. A tirozin (Tyr) találmány szerinti mutagenezise révén, szintén ismert eljárásokkal (például a jelen leírásban megadottakkal) tetszőleges β- és γ-CGTázból találmány szerinti enzimeket készíthetünk.

A találmány egy további feladatát egy eljárással oldottuk meg, amelynek során egy β- vagy γ-CGTázt kódoló gén DNS-szekvenciáját önmagában ismert mutagenezis-módszerekkel úgy módosítjuk, hogy az eredeti β- vagy γ-CGTáz 180. és 240. aminosavpozíciója között található Asn-Leu-Tyr-Asp szekvencia-motívum tirozintagja más természetes aminosawal cserélődik fel.

A találmány szerinti CGTázok előállítására minden β- és γ-CGTáz alkalmas. A CGTáz kódoló gént ismert módon izoláljuk, és a találmány szerinti mutációt a CGTáz génjébe in vivő és in vitro mutagenezis-eljárásokkal visszük be.

In vivő mutagenezis-eljáráson különösen olyan eljárásokat értünk, amelynek során kromozómában vagy epizómában CGTázt kódoló gént tartalmazó mikroorganizmust mutagénnel, például ultraibolya fénnyel, nitrozo-guanidinnel vagy etil-metil-szulfonáttal nem fajlagosan mutagenizálnak. Ilyen eljárást például Miller J. H. írt le (172 Experiments in Molecular Genetics; Cold Spring Harbour, N. Y.).

Ezt követően ismert módszerekkel, például a Sanger és munkatársai által kifejlesztett láncmegszakítási módszerrel [Sanger és munkatársai, PNAS, 74 (1977), 5463-5467] azokat a mutánsokat azonosítjuk, amelyekben a CGTáznak legalább a Bacillus circulans CGTázában a 229. pozícióban szereplő tirozinnal (Tyr) homológ tirozint kódoló kodonja más természetes aminosavat, előnyösen szerint vagy triptofánt, különösen előnyösen triptofánt kódoló kodonnal van helyettesítve.

A találmány értelmében a Bacillus circulans CGTázának 229. Tyr-jével homológ kodonon más CGTáz-gének azon kodonjait értjük, amelyek az 1. táblázatban ábrázolt aminosavszekvenciák aláhúzott tirozinját kódolják.

Az in vitro mutagenezis-módszereken a találmány értelmében olyan módszert értünk, amelyeknél izolált CGTáz-gént vagy CGTáz-gén fragmenst ismert módon úgy módosítunk, hogy a keletkező gén által kódolt CGTáz-enzimnek a Bacillus circulans CGTázában a 229. pozícióban szereplő tirozinja más aminosavmaradékkal, előnyösen triptofán- vagy szerinmaradékkal, különösen előnyösen triptofánmaradékkal van helyettesítve.

In vitro mutagenetikai eljárások a technika állásából ismertek, például a „PCR”-technikát alkalmazó fajlagos [BioTechniques (1992), 13 (3), 342-346. oldal] vagy nem fajlagos [Technique (1989), 1 (1), 11-15. oldal] mutagenezis. Ismert olyan eljárás is, amelynek során a mutációt szintetizált oligonukleotid segítségével viszik be a célgénbe. Ez történhet egyszálú módszerrel [Ausubel F. M. és munkatársai (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Assiciates] és kétszálú módszerrel (Progema 1992-1993 Catalogue, 150), vagy egyéb módszerrel [például Ann. Rév. Génét. (1985), 19,423-462. oldal],

A találmány szerinti, γ-ciklodextrin-termelés szempontjából növelt aktivitású γ-CGTáz fő alkalmazási területe a γ-ciklodextrin előállítása keményítőből. A találmány szerint CGTázok ismert előállítási eljárásokban használhatók fel. Ismert előállítási eljárások, amelyekben a találmány szerinti CGTázok γ-ciklodextrin előállítására alkalmazhatók, például az alábbi irodalmi helyeken találhatók:

- Journal of Fermentation and Bioengineering (1990), 70 (3), 190-192. oldal: A Bacillus sp. Al-6 mikroorganizmusból származó β-, γ-CGTázt felhasználják γ-ciklodextrin előállítására, etanol jelenlétében, mert az etanol a γ-CD-képződést fokozza;

- JP 8725 976: γ-ciklodextrin előállítása a Bacillus sp. 313 γ-CGTázával;

- EP 291 067: γ-ciklodextrin előállítása a Bacillus macerans γ-CGTázának felhasználásával. A termelés szelektivitását komplexképző, például ciklohexadec-8-én-l-on adagolásával biztosítják;

- DE 4009 822: γ-ciklodextrin termelése a Bacillus sp. 290-3 mikroorganizmus γ-CGTáza segítségével.

A γ-ciklodextrinnek vannak az a- és a β-ciklodextrinhez viszonyítva olyan fajlagos előnyei, amelyek révén számos alkalmazási területen az egyetlen lehetséges vagy a leginkább alkalmas ciklodextrin.

A hat glükózegységből felépülő a-ciklodextrinhez viszonyítva a 8 glükózegységből álló γ-ciklodextrin nagyobb hidrofób belső térrel rendelkezik, így olyan vendégmolekula is komplexálható, amely térbeli okokból α-ciklodextrinnel nem képez komplexet.

HU216 331 Β β-ciklodextrinnel összehasonlítva (ennek vízoldhatósága szobahőmérsékleten körülbelül 18,5 g/1) a γ-ciklodextrin sokkal jobban oldódik vízben (szobahőmérsékleten körülbelül 232,0 g/1), és ezért alkalmasabb a vizes oldatban komplexet képezni, mint a β-ciklodextrin. A γ-ciklodextrin további előnye a β-CD-vel és a CD^-származékokkal szemben a csekély toxicitás. Mind orális, mind intravénás beadás esetén állatkísérletben az a- és β-ciklodextrin a γ-ciklodextrinnél toxikusabbnak bizonyult.

A találmányt az alábbi példákkal közelebbről ismertetjük.

1. példa

Bacillus sp. 290-3 (DSM 5850) j-CGTázának mutagenezise

A Bacillus sp. 290-3 [letétbe helyezve a Deutsche Sammlung für Mikroorganismen, Braunschweigban (NSZK) letéti intézménynél DSM 5850 szám alatt 1990. 04. 04-én) mikroorganizmusból származó CGTáz 211. pozíciójában lévő tirozin aminosavmaradék más aminosavmaradékkal, előnyösen azonban triptofán- vagy szerinmaradékkal való kicserélését úgy végezzük, hogy a CGTáz szerkezeti génjében található, a 211. tirozint kódoló bázistripletet szakember számára ismert módon más, tetszőleges aminosavat, előnyösen azonban triptofánt kódoló triplettel helyettesítjük.

A mutagenezis során a Bacillus sp. 290-3 γ-CGTázgénjét a kereskedelmi forgalomban kapható pUC19 jelű E. coli vektorba (Boehringer, Mannheim) klónozzuk. Ennek során Ausubel által leírt módon (Ausubel F. M., Current protocols in molecular biology, Vol. 1; Greene Publishing Associates & Wiley - Interscience, N. Y.) a Bacillus sp. 290-3 kromozóma-DNS-t izoláljuk [Proceedings of the 4th International Sympozium on Cyclodextrins (1988), 87-88], és a Sau3Al restrikciós endonukleázzal (Boehringer, Mannheim) parciálisán vágjuk. A 2-5 kb méretű fragmenseket izoláljuk, és BamHI restrikciós endonukleáz (Boehringer, Mannheim) segítségével linearizált pUC19-DNS-sel, valamint T4 DNSligázzal együtt 16 °C-on, 12 órán át inkubáljuk. A ligációs elegyet ismert módon [Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratoiy Manual; Cold Spring Harbor Laboratory (1982), N. Y.] DNS-felvételre kompetenssé tett E. coli K 12 sejtek transzformálásához használjuk fel. A transzformálás után keményítőtartalmú indikátorlemezen keményítő lebontásáról árulkodó foltokat képző E. coli sejtekből a Bacillus sp. 290-3 γ-CGTázát kódoló gént tartalmazó rekombináns plazmidot elkülönítjük [Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory (1982), N. Y. 86-92. oldal],

E gén mutagenezisét az Amersham cég (Braunschweig, NSZK) által forgalmazott „Oligonucleotide directed in vitro mutagenesis system, version 2.1” készülékkel, Eckstein eljárása alapján [Nucl. Acids. Rés. (1986), 14,9679-9698 és Nucl. Acids. Rés. (1988), 16, 791-802. oldal] végezzük, pontosan betartva a készülékhez mellékelt protokoll előírásait. Az eljárás lényegét az alábbiakban ismertetjük, a részletek az említett protokollból vehetők ki.

A kereskedelmi forgalomban kapható enzimek, például restrikciós endonukleázok és T4 ligáz (Boehringer, Mannheim) segítségével a Bacillus sp. 290-3 mikroorganizmusból származó γ-CGTázt kódoló, a pUC19 plazmidba klónozott génnek azt a részét, amely a CGTáz 211. pozíciójában lévő tirozint kódoló tripletet tartalmazza, kivágjuk, és a kereskedelemben kapható M13 vektorba (New England Biolabs) klónozzuk. Egy ilyen fragmens például a 0,6 kb méretű Pstl/EcoRI fragmens, amelyet a PstI és EcoRI restrikciós endonukleázzal nyitott Ml3 vektorba klónozunk.

A rekombináns Ml3 vektort felvett E. coli gazdasejtekből az Amersham fent említett mutagenezis-rendszerével együtt szállított kísérleti jegyzőkönyv alapján egyszálú, rekombináns M13-DNS-t (kiindulási DNS-t) különítünk el.

A tulajdonképpeni mutagén kezeléséhez a kívánt szekvenciát tartalmazó, kémiailag definiált mutagenezis-oligonukleotidokat szintetizálhatjuk, de az ilyen oligonukleotidok például az MWG cégnél (Ebersberg) vásárolhatók is.

A mutagenezis-oligonukleotid szekvenciáját úgy választjuk meg, hogy benne a bázisok sorrendje a kiindulási DNS azon részéhez képest inverz-komplementer, amelyet a Bacillus sp. 290-3 γ-CGTázának 211. pozíciójában lévő tirozinmaradékot kódoló tripletet felfelé és lefelé körülvevő 15-15 bázis alkot. A tirozint kódoló bázistriplet helyén a mutagenezis-oligonukleotid azonban olyan nukleotidokat tartalmaz, amelyek a mutagenezis után olyan γ-CGTázok termelését eredményezik, amelyekben a 211. pozícióban tirozin helyett más aminosavmaradék van.

A két alkalmazott mutagenezis-oligonukleotid szekvenciáját a 2. táblázat mutatja.

2. táblázat

5’-ATT TAT CGA AAT CTT TGG GAT TTA GCT AGT CTA-3’ ₅,-ATT TAT CGA AAT CTT NNN GAT TTA GCT AGT CTA-3’

A felső sorban szereplő mutagenezis-oligonukleotid alkalmazása olyan γ-CGTáz-származékokat eredményezett, amelyekben a 211. tirozin helyett triptofán van.

A 2. táblázat 2. sorában szereplő mutagenezis-oligonukleotid egy úgynevezett degenerált (vagy mixed) oligonukleotid a 211. tirozint kódoló bázistriplet a lehetséges 64 bázistriplet bármelyikével lehet helyettesítve, kivéve a tirozint kódoló tripleteket. Ez az oligonukleotid alkalmas az olyan γ-CGTáz-származékok előállítására, amelyekben a 211. pozícióban a tirozinmaradék más természetes aminosavmaradékkal helyettesítve van.

A mutagenezis-oligonukleotidokat az 5’-végén T4polinukleotid-kináz és ATP (Amersham) felhasználásával foszforilezzük. A foszforilezett mutagenezis-oligonukleotidokat a kiindulási DNS homológ tartományai60 hoz kötjük, mégpedig úgy, hogy 5 pg egyszálú kiindu4

HU 216 331 Β lási DNS-t és mintegy 4 pmol foszforilezett mutagenezis-oligonukleotidot 70 °C-on 3 percig, majd 37 °C-on 30 percen át inkubáljuk. Ezt követően szintetizáltunk egy, a kiindulási DNS-hez képest (kivéve a változtatni kívánt pozíciót) komplementer szálat, aminek során a kiindulási DNS-hez kötött mutagenezis-oligonukleotid a szintézis kiindulópontját jelöli, és a kiindulási DNS mintaként szolgál a mutáns DNS-szál újraszintéziséhez. A szintézishez DNS-polimeráz Klenow-fragmensét (Amersham), T4 DNS-ligázt és olyan nukleotidelegyet használunk, amely a dATP, dGTP, dTTP nukleotidokat és a dCTP helyett a dCTPaS (Amersham) tionukleotidot tartalmazza. A reakcióelegyet 16 °C-on, 15 órán át inkubáljuk.

Az elegyből az egyszálú kiindulási DNS-maradék molekuláit eltávolítjuk. E célból nátrium-kloridot adagolunk, és az elegyet az egyszálú DNS-t fajlagosan megkötő nitro-cellulóz-szűrőn (Amersham) át szűrjük. Az elegyben maradt kétszálú DNS-t etanolos kicsapással koncentráljuk és sótalanítjuk. Ezt követően a hibridDNS-t Ncil restrikciós endonukleázzal (Amersham) 37 °C-on 90 percen át inkubáljuk. Az Ncil olyan restrikciós endonukleáz, amely a CC(G/C)GG szekvenciát felismeri, de csak természetes DNS-t vág, a dCTPaS nukleotidanalogont tartalmazó szálakat viszont nem. E kezelés tehát csak a nem mutagenizált kiindulási szálban eredményez töréseket.

°C-on III. exonukleázzal végzett 30 perces kezeléssel a kiindulási DNS-t eltávolítjuk. AIII. exonukleáz (Amersham) olyan enzim, amely szabad végei felől bontja a DNS-szálat. Utána az exonukleázt termikusán inaktiváljuk (15 perc 70 °C-on), utána a megmaradt egyszálú, mutagenizált DNS-szálat DNS-polimeráz (I) enzimmel (Amersham), T4 DNS-ligázzal, valamint a dATP, dTTP, dCTP és dGTP nukleotidokkal 16 °C-on,

3 órán át inkubáljuk. Tisztítás céljából végzett további etanolos kicsapás után a mutagenizált DNS-t kompetens E. coli K12 sejtekbe transzformáljuk.

A mutagenezises eljárás sikerességét a rekombináns DNS megfelelő tartományának szekvenálásával ellen10 őrizzük. A kapott kiónok közül ötöt vizsgálunk. A 2. táblázat alsó sorában leírt, degenerált mutagenezis-oligonukleotid alkalmazásakor kapott mutációt szekvenálással meghatározzuk. Azokból a vektorokból, amelyeknél mutációt találtunk, az eredetileg mutagenezis céljából az M13 vektorba klónozott DNS-fragmenst kivágjuk. Az itt alkalmazott, 0,6 kb méretű fragmens esetén PstI és EcoRI enzimmel vágunk.

Ezt követően a pUC19 plazmid alapú expressziós plazmidból kivágjuk a Bacillus sp. 290-3 γ-CGTázát kódoló, de nem mutagenizált Pstl/EcoRI fragmenst, és T4 DNS-ligáz alkalmazásával a mutagenizált fragmenst ültetjük a helyére.

2. példa

Bacillus sp. 1-1 β-CGTázának mutagenezise

Az 1. példában leírtak szerint a Bacillus sp. 1-1 mikroorganizmusból származó β-CGTázt kódoló génben a 217. pozícióban lévő tirozinmaradékot kódoló tripletet kicseréljük olyanra, amely triptofáncsoportot kódol.

A 3. táblázat a mutagenezisben felhasznált oligonukleotidot mutatja.

3. táblázat

5’-ATT TAC AGA AAC TTA TGG GAT CTG GCA GAC TAT-3’

3. példa

Bacillus circulans β-CGTázának mutagenezise Az 1. példában leírtak szerint a Bacillus circulans β-CGTáz-génjében a megfelelő CGTáz 229. pozíciójában szereplő tirozint kódoló kodont kicseréljük vagy triptofánt (4. táblázat 2. sora), vagy szerint kódoló tripletre. A 4. táblázat a mutagenezishez felhasznált oligonukleotidokat mutatja.

4. táblázat

5’-ATC TAC AAA AAC CTG TGG GAC CTG GCC GAC TTC-3’ 5’-ATC TAC AAA AAC CTG TCT GAC CTG GCC GAC TTC-3’

4. példa

Bacillus sp. 290-3 j-CGTázának, valamint találmány szerin ti származékainak termelése E. coli-ban Bacillus sp. 290-3 γ-CGTázának és 1. példa szerinti származékainak a termelése céljából az 1. példában leírt, pUC19 bázisú expressziós plazmidot E. coli szekréciós törzsbe transzformáljuk. Szekréciós törzsként az E. coli WCM105 számú törzset alkalmazzuk. Ezt az E. coli törzset az EP 338410 szerinti módszerrel állítjuk elő E. coli 410 számú törzsből.

A Bacillus sp. 290-3 γ-CGTázának vagy ennek származékainak a termelésére a megfelelő CGTáz-expressziós plazmidot tartalmazó E. coli WCM105 sejteket 10 g/1 laktózt és 0,1 g/1 ampicillint tartalmazó LBközegben [Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory (1982), N. Y.] °C-on, 72 órán át inkubáljuk, miközben a tenyészetet rázzuk (250 fordulat/perc). Utána a sejteket 5000 g mellett lecentrifiigáljuk. A sejtmentes felülúszó tartalmazza a γ-CGTázt vagy származékait.

5. példa

Bacillus sp. 1-1 β-CGTázának, valamint találmány szerinti származékainak termelése E. coli-ban A 4. példa szerint járunk el, és a 2. példában leírt expressziós plazmidokat alkalmazzuk.

6. példa

Bacillus circulans β-CGTázának, valamint találmány szerinti származékainak termelése E. coli-ban A 4. példa szerint járunk el, de a 3. példában leírt expressziós plazmidokat alkalmazzuk.

HU 216 331 Β

7. példa

Keményítő átalakítása ciklodextrinné A CGTázok aktivitását ismert módon [Eur. J.

Biochem. (1990), 191,177-185. oldal] határoztuk meg. Egy g keményítőre számítva a vizsgálni kívánt

CGTáz 10 egységét oldható keményítő (Merck, Darmstadt) 5%-os oldatával 20 mM trisz/HCl pH 7,2 és 5 mM CaCl₂-pufferben 45 °C-on, meghatározott időn át inkubáljuk. Utána a reakciót 1,5 térfogat metanol adagolásával megszakítjuk. El nem reagált maradék keményítőt 4 °C-on végzett egyórás inkubálással kicsapjuk, és centrifugálással (10 perc, 12000 g) eltávolítjuk. A termékeket nagynyomású folyadékkromatográfiával, Nukleosil 10-NH₂-oszlopon (Macherey & Nagel, Düren) határozzuk meg, definiált ciklodextrineket vagy lineáris maltooligoszacharidokat (Sigma, München) alkalmazva etanonként.

8. példa

Keményítő átalakítása a Bacillus sp. 290-3 nem mutagenizált '{-CGTázával és a 4. példa szerint előállított származékkal

A 7. példa szerint járunk el. A képződött lineáris malto-oligoszacharidok mennyiségét (G1-G7) halmozódva az 5. táblázatban adjuk meg.

9. példa

Keményítő átalakítása Bacillus circulans nem mutagenizált fi-CGTázával, valamint a 6. példa szerint kapott származékával (a 229. pozíciójú tirozin helyett triptofán van)

A 7. példa szerint járunk el. Az eredményeket a 6.

táblázatban adjuk meg.

5. táblázat

Reakcióidő, perc	A keményítő ciklodextrinné és G1 -G7-vé alakulása (%)
Nem mutagenizált CGTáz	Mutagenizált CGTáz
β-CD	γ-CD	G1-G7	β-CD	γ-CD	G1-G7
5	7,0	8,6	0,0	0,0	7,8	0,0
10	11,0	13,0	0,0	0,0	12,8	0,0
15	12,6	14,4	0,0	0,0	16,2	0,0
30	21,4	18,2	1,2	2,0	22,8	2,2

6. táblázat

Reakcióidő, perc	Keményítő átalakulása ciklodextrinné (%)
Nem mutagenizált CGTáz	Mutagenizált CGTáz
a-CD	β-CG	γ-CD	a-CD	β-CG	γ-CD
1	0,0	6,4	1,2	0,0	1,0	4,4
2	0,0	10,6	2,0	0,0	2,0	8,0
3	1,6	13,5	2,6	0,0	2,8	14,6
4	2,6	16,4	5,2	0,0	4,8	17,2
5	3,2	18,2	7,0	0,0	5,8	16,4
6	2,6	20,0	6,6	0,0	6,2	16,0
7	3,4	22,2	7,6	1,0	7,4	16,4
8	3,8	23,0	6,4	1,2	8,4	19,8
9	4,4	24,6	7,0	1,8	9,6	22,0
10	4,6	26,2	6,0	1,8	84	20,8

10. példa

Keményítő átalakítása Bacillus circulans nem mutagenizált β-CG lazával, valamint a 6. példa szerint kapott származékával (a 229. pozíciójú tirozin helyett triptofán van) y-ciklodextrin-komplexképző jelenlétében

A 7. példa szerint járunk el, azzal az eltéréssel, hogy az oldható keményítő helyett burgonyakeményítőt használunk, és az elegyhez - 10 g keményítőre vonatkoztatva - 1,25 g CHDC-t (diklohexadecenont) adagolunk. A 7. táblázatban megadott eredményeket kapjuk.

HU216 331 Β

7. táblázat

Reakcióidő, perc	Keményítő átalakulása ciklodextrinné (%)
Nem mutagenizált CGTáz	Mutagenizált CGTáz
a-CD	β-CD	γ-CD	a-CD	β-CD	γ-CD
1	2,3	18,0	5,4	1,4	10,5	13,7
2	3,2	20,0	7,2	2,2	13,8	222
3	4,4	21,8	9,5	3,4	15,8	23,7
4	-	-	-	3,5	11,2	25,5
5	5,4	20,9	12,8	3,5	11,5	29,0
6	5,8	21,1	14,6	-	-	-
7	6,4	20,1	17,0	4,7	11,0	32,0

11. példa A 7. példa szerint járunk el, és az alábbi eredményeKeményító átalakítása Bacillus circulans nem 20 két kapjuk 20 perc reakcióidő után:

mutagenizált $-CGTázával, valamint a 6. példa szerint kapott származékával (a 229. pozíciójú tirozin helyett szerin van)

Nem mutagenizált CGTáz	Mutagenizált CGTáz
a-CD	β-CD	γ-CD	a-CD	β-CD	γ-CD
4,3	20,1	6,6	1	13	13

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (2)

1. Eljárás ciklodextrin-glikozil-transzferáz (CGTáz) előállítására, amely keményítő vagy keményítőszerű anyagok ciklodextrinné (CD) történő átalakítása során fokozott mértékben γ-ciklodextrint termel, azzal jellemezve, hogy egy β- vagy γ-CGTázt kódoló gén DNSszekvenciáját önmagában ismert mutagenezis-módszerekkel úgy módosítjuk, hogy az eredeti β- vagy γCGTáz 180. és 240. aminosavpozíciója között található

35 Asn-Leu-Tyr-Asp szekvenciamotívum tirozintagját más természetes aminosavra cseréljük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 180. és 240. aminosavpozíció között található Asn-Leu-Tyr-Asp szekvenciamotívum tirozintagját

40 triptofánra vagy szerűire cseréljük.