DE4324650A1 - Cyclodextringlycosyltransferasen zur Produktion von gamma-Cyclodextrin - Google Patents
Cyclodextringlycosyltransferasen zur Produktion von gamma-CyclodextrinInfo
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Description
Die Erfindung betrifft Cyclodextringlycosyltransferasen
(CGTasen) EC 2.4.1.19 zur Produktion von γ-Cyclodextrin,
Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.
Cyclodextrine werden in der Regel aus Stärke oder stärke
ähnlichen Substraten hergestellt. Stärke wird dabei mit
CGTasen enzymatisch in Cyclodextrin (CD) umgewandelt. Aus
thermodynamischen Gründen wird die Stärke unabhängig von der
zur Umsetzung verwendeten CGTase hauptsächlich in β-CD umge
wandelt, wenn die Reaktion bis zum Erreichen des thermodyna
mischen Gleichgewichts (maximaler CD-Ertrag) durchgeführt
wird. In der Initialphase, zu Beginn der Stärkekonversions
reaktion jedoch unterscheiden sich die zur Konversion ver
wendeten Enzyme in der Zusammensetzung des primären Produkt
gemisches. In Abhängigkeit von dem in dieser Initialphase
durch das Enzym hauptsächlich gebildeten Produkt, α-, β-
oder γ-CD, wird unterschieden zwischen α-, β- oder γ-CGTasen.
Solche zur industriellen CD-Produktion geeigneten und auch
bereits verwendeten Enzyme wurden bisher ausschließlich bei
Bakterien nachgewiesen. α-CGTasen wurden bisher ausschließ
lich bei Bacillus macerans (J. Bacteriol. (1986) 166, S.
1118-1122), Bacillus Stearothermophilus (GB 2169902) und
Klebsiella oxytoca (Gene (1986) 47, S. 269-277) identifi
ziert. β-CGTasen wurden zum Beispiel bei Bacillus circulans
(Appl. Microbiol. Biotechnol. (1990) 34, S. 229-230),
Bacillus megaterium (US-A 3,812,011), Bacillus ohbensis (JP
74124285), Micrococcus sp. (EP 0017242) und taxonomisch
nicht exakt klassifizierten alkalophilen Bacillen wie
Bacillus sp. 38-2 (J. Gen. Microbiol. (1988) 134, S. 97-
105), 17-1 (Proceedings of the 4th International Symposium
on Cyclodextrins (1988), S. 87-92, 1011 (Appl. Microbiol
Biotechnol. (1987) 26, S. 149-153), 1-1 (Proceedings of the
4th International Symposium on Cyclodextrins (1988), S. 71-
76) nachgewiesen. Enzyme mit einer initial hohen γ-CD-Bil
dungsaktivität wurden aus Bacillus subtilis 313 (Agric.
Biol. Chem (1986) 50, S. 2161-2162), Bacillus sp. Al-6 (J.
Ferment. Bioeng. (1990) 70 (3), S. 150-154) und Bacillus sp.
290-3 (Proceedings of the 4th International Symposium on
Cyclodextrins (1988), S. 87-92) beschrieben.
Durch eine Röntgenstrukturanalyse wurde die dreidimensionale
Struktur der β-CGTase aus Bacillus circulans, aufgeklärt (J.
Mol. Biol. (1991) 217, S. 737-750). Aus dieser Struktur
konnte abgeleitet werden, welche Aminosäurereste unmittelbar
am Aufbau der Substratbindestelle und des aktiven Zentrums
dieser CGTase beteiligt sein könnten, nicht jedoch, welche
Aminosäurereste die Produktspezifität dieser CGTase determi
nieren (Biochemistry (1992) 31, S. 8740-8746).
Da die bei der industriellen Herstellung von Cyclodextrinen
verwendeten CGTasen bei der Umwandlung von Stärke in Cyclo
dextrine immer Gemische aus mehreren Cyclodextrinen liefern,
wurden verschiedene Verfahren zur Gewinnung reiner Cyclo
dextrine (α, β oder γ) entwickelt:
- - Definierte CD′s können aus den Produktgemischen, z. B. aufgrund ihrer Molekulargewichtsunterschiede, chromato graphisch abgetrennt werden (beschrieben beispielsweise in US-A 4808232).
- - Bei der enzymatischen Umwandlung von Stärke in Cyclo dextrine werden Komplexbildner zugesetzt, die nur mit einem definierten CD reagieren und damit z. B. einen unlöslichen Komplex bilden, der physikalisch aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden kann. Anschließend wird der Komplex aufgelöst und das homogene CD gewonnen (beschrieben beispielsweise in EP 0291067).
- - Durch die Zugabe eines organischen Lösungsmittels, wie z. B. Äthanol, zum Reaktionsgemisch kann die Produkt zusammensetzung bei Verwendung einer γ-CGTase in Rich tung γ-CD verschoben werden (J. Ferm. Bioeng. (1990) 70 (3), S. 150-154).
Bei jedem der Verfahren werden optimalerweise solche CGTasen
verwendet, die eine möglichst hohe initiale Produktbildungs
präferenz für das CD besitzen, das rein hergestellt werden
soll.
Die Spezifität der bisher bekannten α- und β-CGTasen ist
ausreichend für eine technische Produktion der entsprechen
den Cyclodextrine. Im Gegensatz dazu besitzt keine der be
kannten γ-CGTasen eine Produktspezifität, die eine ver
gleichbare γ-CD-Produktion ermöglicht.
Zur Herstellung von γ-CD wurde daher in JP 03053892 vorge
schlagen, α- und/oder β-Cyclodextrine enzymatisch durch die
Zugabe des γ-CD-spezifischen Komplexbildners Glycosylgly
cyrrhizin, Maltose und einer CGTase in γ-CD umzuwandeln.
Aufgabe der Erfindung war es, Cyclodextringlycosyltransfera
sen (CGTasen) zur Verfügung zu stellen, welche bei der Um
setzung von Stärke oder stärkeähnlichen Substraten zu CD in
erhöhtem Ausmaß γ-CD produzieren.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung war es, Verfahren zur
Herstellung der genannten CGTasen zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung war es, Verfahren zur
Produktion von γ-CD mittels der genannten CGTasen zur Verfü
gung zu stellen.
Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch CGTasen, die da
durch gekennzeichnet sind, daß ihre Proteinsequenz im Be
reich zwischen Aminosäureposition 180 und Aminosäureposition
240 die Aminosäuresequenz Asn Leu Xxx Asp enthält, wobei
Position 1 der Proteinsequenz der Beginn des Signalpeptids
der CGTase ist und Xxx eine natürliche Aminosäure mit Aus
nahme von Tyr bedeutet.
Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen CGTasen im Bereich
zwischen Aminosäureposition 180 und Aminosäureposition 240
ihrer Proteinsequenz die Aminosäuresequenz Asn Leu Trp Asp
oder Asn Leu Ser Asp wobei Position 1 der Proteinsequenz der
Beginn des Signalpeptids der CGTase ist.
Besonders bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen CGTasen
im Bereich zwischen Aminosäureposition 180 und Aminosäure
position 240 ihrer Proteinsequenz das Sequenzmotiv Asn Leu
Trp Asp, wobei Position 1 der Proteinsequenz der Beginn des
Signalpeptids der CGTase ist.
Die erfindungsgemäßen CGTasen produzieren bei der Umsetzung
von Stärke oder stärkeähnlichen Substraten CD′s in einer
Produktverteilung bei der der Quotient aus γ-CD und der
Summe aus α-CD und β-CD größer ist als der Quotient dieser
Produkte, der bei der Stärkeumsetzung mit dem jeweiligen
unveränderten Ausgangsenzym erzielt wird.
Unter Ausgangsenzym ist dabei die CGTase, die zur Herstel
lung der erfindungsgemäßen CGTase verwendet wurde. Die er
findungsgemäßen CGTasen besitzen somit unerwarteterweise
eine höhere γ-CD Spezifität als die zu Ihrer Herstellung
verwendeten Ausgangsenzyme.
Beispiele für erfindungsgemäße CGTasen sind CGTasen, die aus
den in Tabelle 1 aufgeführten CGTasen durch Austausch des
jeweils unterstrichenen Tyr gegen eine anderer natürliche
Aminosäure erhalten werden. Bevorzugt sind CGTasen, bei
denen das Tyr gegen Trp oder Ser ausgetauscht ist. Besonders
bevorzugt sind CGTasen, bei denen das Tyr gegen Trp ausge
tauscht ist.
Die Aufstellung in Tabelle 1 zeigt beispielhaft anhand einiger
CGTasen den in β und γ-CGTasen generell vorhandenen Amino
säuresequenzbereich, sowie das für die Modifikation der Pro
duktspezifität relevante Tyr innerhalb dieses Sequenzberei
ches. Als Position ist in Tabelle 1 die Zahl der ersten Amino
säure der jeweils wiedergegebenen Aminosäuresequenz bezeich
net, wobei als Position 1 die erste Aminosäure des Signal
peptids der jeweiligen CGTase Sequenz gezählt wurde. Anhand
von allgemein bekannten Standardverfahren läßt sich der ent
sprechende Sequenzbereich bei allen β und γ-CGTasen eruieren.
Durch erfindungsgemäße Mutagenese des Tyr in solchen CGTasen
mittels ebenfalls bekannter Standardverfahren, wie Sie
beispielhaft auch in der vorliegenden Anmeldung ausgeführt
sind, lassen sich erfindungsgemäße Enzyme somit aus beliebi
gen β und γ-CGTasen herstellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren
gelöst, bei dem die DNA Sequenz eines für eine β- oder γ-
CGTase kodierenden Gens mittels an sich bekannter Mutagene
semethoden derart mutiert wird, daß dadurch das im Bereich
zwischen Aminosäureposition 180 und 240 liegende Tyr im
Sequenzmotiv Asn Leu Tyr Asp der eingesetzten β- oder γ-
CGTase in der mutierten CGTase gegen eine andere natürliche
Aminosäure ausgetauscht ist.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen CGTasen sind alle
β- und γ-CGTasen geeignet. Das für eine CGTase kodierende
Gen wird mittels bekannter Verfahren isoliert und die erfin
dungsgemäße Mutation wird in das Gen der CGTase durch "in
vivo"- oder "in vitro" -Mutageneseverfahren eingeführt.
Unter "in vivo"-Mutageneseverfahren sind besonders solche
Methoden zu verstehen, bei denen Mikroorganismen, die chro
mosomal und/oder episomal ein für eine CGTase kodierendes
Gen enthalten, mit einem Mutagen wie z. B. UV-Licht, Nitro
soguanidin oder Ethylmethylsulfonat unspezifisch mutageni
siert werden. Ein solches Verfahren ist beispielsweise von
Miller J. H. in (172) Experiments in Molecular Genetics;
Cold Spring Harbour Laboratory; Cold Spring Harbour, N.Y.
beschrieben worden.
Anschließend werden durch bekannte Methoden wie beispiels
weise der Sequenzanalyse nach der von Sanger et al in PNAS
74 (1977) 5463-5467 beschriebenen Kettenabbruchmethode Mutan
ten identifiziert, bei denen zumindest das Codon des CGTase-
Gens, welches für das Tyrosin, welches homolog zu Tyr 229
der CGTase aus Bacillus circulans ist, kodiert, durch ein
Codon, welches für einen anderen natürlichen Aminosäurerest,
bevorzugt einen Serin oder Tryptophanrest, besonders bevor
zugt einen Tryptophanrest, kodiert, ersetzt ist.
Im Sinne der Erfindung sind unter Codons welche homolog zu
Tyr 229 der CGTase aus Bacillus circulans sind die für Tyr
kodierenden Codons anderer CGTase Gene zu verstehen die für
das in Tab. 1 unterstrichen Tyr in dem dort dargestellten
Aminosäuresequenzmotiv kodieren.
Unter "in vitro"-Mutagenesemethoden sind im Sinne der Erfin
dung solche Methoden zu verstehen, bei denen ein isoliertes
CGTase-Gen oder ein Fragment eines CGTase-Gens in an sich
bekannter Art und Weise so modifiziert wird, daß ein Gen
entsteht, welches für ein CGTase-Enzym kodiert, bei dem
zumindest der Aminosäurerest, der homolog zu Tyr 229 in der
CGTAse aus Bacillus circulans ist, durch einen anderen Ami
nosäurerest, bevorzugt einen Tryptophanrest oder einen
Serinrest, besonders bevorzugt einen Tryptophanrest, ersetzt
wurde.
Aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren zur "in vitro"-
Mutagenese sind z. B. spezifische (Bio Techniques (1992)13
(3), S. 342-346) oder unspezifische (Technique (1989) 1 (1),
S. 11-15) Mutageneseverfahren mit Hilfe der "PCR"-Technik.
Ebenso sind Verfahren bekannt, bei denen die Mutation ge
richtet mit Hilfe eines synthetisierten Oligonukleotids in
das Zielgen eingebracht wird. Dies kann sowohl mittels soge
nannter "Einzelstrangverfahren" (Ausubel F. M et al. (1987)
Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing
Associates) oder auch mittels "Doppelstrangverfahren"
(Promega 1992-1993 Cataloque, 150) oder mittels anderer Ver
fahren wie sie beispielsweise in Ann. Rev. Genet. (1985) 19,
S. 423-462) beschrieben werden geschehen.
Die Verwendung zur Gewinnung von γ-CD aus Stärke ist das
Hauptanwendungsgebiet der erfindungsgemäßen CGTase mit er
höhter γ-CD-Bildungsaktivität. Die erfindungsgemäßen CGTasen
lassen sich dazu mittels gängiger Herstellungsverfahren
nutzen. Gängige Herstellungsverfahren zur Produktion von γ-
CD, in denen sich die erfindungsgemäßen CGTasen an Stelle
der dort genannten CGTasen einsetzen lassen, sind zum
Beispiel beschrieben bei:
- - Journal of Fermentation and Bioengineering (1990) 70 (3), S. 190-192: Die Herstellung von γ-CD unter Verwen dung der β-, γ-CD bildenden CGTase aus Bacillus sp. AL-6 in Gegenwart von Äthanol, welcher eine verstärkte γ-CD- Produktion bewirkt.
- - JP 87 25,976: Die Herstellung von γ-CD unter Verwendung der γ-CGTase aus Bacillus sp. 313.
- - EP 291,067: Herstellung von γ-CD unter Verwendung der CGTase aus Bacillus macerans. Die Produktspezifität für γ-CD wird durch die Zugabe eines Komplexbildners, z. B. Cyclohexadec-8-in-1-on, erreicht.
- - DE 40 09 822: Produktion von γ-CD mit der γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3.
γ-CD besitzt sowohl im Vergleich zu α-CD als auch im Ver
gleich zu β-CD spezifische Vorteile, die es für eine Reihe
von Anwendungen als einzig mögliches oder am besten geeigne
tes CD ausweisen.
Im Vergleich zu α-CD, das aus sechs Glukoseeinheiten aufge
baut ist, besitzt das aus acht Glukoseeinheiten bestehende
γ-CD eine größere hydrophobe Kavität, die auch eine Komple
xierung solcher Gastmoleküle ermöglicht, die aus sterischen
Gründen von α-CD nicht komplexiert werden können.
Im Vergleich zu β-CD (Löslichkeit in Wasser bei Raumtempera
tur: ca. 18,5 g/l) besitzt γ-CD eine wesentlich höhere Lös
lichkeit (bei Raumtemperatur: ca. 232,0 g/l) und ist damit
für Komplexierungsreaktionen aus wäßrigen Lösungen besser
geeignet als β-CD. Ein weiterer Vorteil von γ-CD gegenüber
β-CD und modifizierten β-CD-Derivaten ist die geringe Toxi
zität von γ-CD. Sowohl bei oraler als auch bei intravenöser
Applikation sind α-CD- und β-CD-Derivate im Tiermodell toxi
scher als γ-CD.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der
Erfindung.
Der Austausch des Aminosäurerestes Tyrosin an der Position
211 in der γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3 (hinterlegt bei
der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen in Braunschweig
unter der Nummer DSM 5850) gegen einen beliebigen anderen
Aminosäurerest, insbesonders jedoch gegen einen Trypto
phan- oder Serinrest, wird erreicht, indem das für die Tyro
sin 211 kodierende Basentriplet des CGTase-Strukturgens in
einer dem Fachmann an sich bekannten Art und Weise durch ein
anderes Basentriplet, kodierend für einen beliebigen Amino
säurerest, vorzugsweise jedoch einen Tryptophanrest, ersetzt
wird.
Zur Mutagenese wurde das γ-CGTase-Gen aus Bacillus sp. 290-3
zunächst in den kommerziell erhältlichen E. coli-Vektor
pUC19 (Boehringer, Mannheim) kloniert. Dazu wurde wie bei
Ausubel F.M., Current protocols in molecular biology, vol.
1; Greene Publishing Associates & Wiley - Interscience, N.
Y. beschrieben chromosomale DNS aus Bacillus sp. 290-3
(Proceedings of the 4th International Symposium on Cyclodex
trins (1988) 87-92) isoliert und partiell mit der Restrik
tionsendonuklease Sau3AI (Boehringer, Mannheim) gespalten.
Fragmente in einem Größenbereich zwischen zwei und fünf kb
wurden isoliert und zusammen mit einer mit der Restriktions
endonuklease BamHI (Boehringer, Mannheim) linearisierten
pUC19-DNS und T4 DNS-Ligase bei 16°C für 12 Stunden
inkubiert. Der Ligationsansatz wurde zur Transformation von
E. coli K 12-Zellen, die mit bekannten Verfahren (Maniatis,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor
Laboratory (1982), N.Y.) kompetent für die Aufnahme von DNS
gemacht wurden, verwendet. Aus solchen E. coli-Zellen, die
nach der Transformation auf Stärke enthaltenden Indikator
platten Stärkeabbauhöfe bildeten, wurde das rekombinante
Plasmid, welches das Gen für die γ-CGTase aus Bacillus sp.
290-3 trägt, isoliert (Maniatis, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory (1982),
N.Y. S 86-92).
Die Mutagenese dieses Gens wurde mit dem von der Firma
Amersham (Braunschweig) kommerziell vertriebenen ′Oligonu
cleotide - directed in vitro mutagenesis system, version
2.1′, basierend auf einem von Eckstein entwickelten
Verfahren (Nucl. Acids. Res. (1986) 14, S. 9679-9698 und
Nucl. Acids. Res. (1988) 16, S. 791-802) durchgeführt. Die
Mutagenese wurde exakt nach dem Protokoll durchgeführt,
welches dem genannten Mutagenese System der Fa. Amersham
beiliegt. Das Verfahren wird im Folgenden summarisch wieder
gegeben. Details sind dem Protokoll des genannten Mutagene
sesystems zu entnehmen.
Unter Verwendung kommerziell erhältlicher Enzyme wie
Restriktionsendonukleasen und T4 DNS-Ligase (Boehringer,
Mannheim) wurde ein solcher Teil des in pUC19 klonierten
Gens für die γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3, der das für
den Aminosäurerest Tyrosin an Position 211 dieser CGTase
kodierende Basentriplet enthält, in den kommerziell erhält
lichen Vektor M13 (New England Biolabs) kloniert. Ein
Beispiel für ein solches Fragment ist ein 0,6 kb großes
PstI/EcoRI-Fragment. Dieses Fragment wurde in den mit den
Restriktionsendonukleasen PstI und EcoRI gespaltenen M13-
Vektor kloniert.
Aus solchen E. coli-Wirtszellen, die den rekombinanten M13-
Vektor aufgenommen hatten, wurde nach der von Amersham mit
dem oben genannten Mutagenese-System gelieferten Versuchs
protokoll einzelsträngige, rekombinante M13-DNS (Vorlagen-
DNS) isoliert.
Zur eigentlichen Mutagenese wurden chemisch definierte Muta
geneseoligonukleotide mit jeweils erwünschter Sequenz
synthetisiert. Solche Oligonukleotide sind beispielsweise
bei der Fa. MWG (Ebersberg) käuflich erhältlich. Die Sequenz
des Mutageneseoligonukleotids wurde so gewählt, daß die
Abfolge der Basen in dem Mutageneseoligonukleotid invers
komplementär zu dem Teil der Nukleotidsequenz der Vorlagen-
DNS ist, der das in der Vorlagen-DNS enthaltene Basen
triplet, kodierend für den Tyrosinrest an Position 211 der
γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3 jeweils 15 Basen stromauf
und stromab umgibt. An Stelle des für Tyrosin kodierenden
Basentriplets enthielt das Mutageneseoligonukleotid jedoch
solche Nukleotide, die nach erfolgter Mutagenese zur Produk
tion von γ-CGTase-Derivaten führen, bei denen an Position
211 statt eines Tyrosinrestes ein anderer Aminosäurerest
lokalisiert ist.
In Tabelle 2 sind die Sequenzen der zwei verwendeten Mutagene
seoligonukleotiden dargestellt.
Der Einsatz des oberen in Tabelle 2 dargestellten Mutagenese
oligonukleotids führte zu γ-CGTase-Derivaten, bei denen der
Tyrosinrest 211 durch einen Tryptophanrest ersetzt war.
Bei Verwendung des unteren in Tabelle 2 dargestellten Mutagene
seoligonukleotids, einem sogenannten degenerierten-, oder
′mixed′ - Oligonukleotid kann das für Tyrosin 211 kodierende
Basentriplet durch jedes der 64 möglichen Basentriplets mit
Ausnahme der für Tyr kodierenden Triplets ersetzt werden.
Dieses Oligonukleotid ist daher geeignet zur Erzeugung von
γ-CGTase-Derivaten, bei denen der Aminosäurerest Tyrosin an
Position 211 durch jeweils eine der anderen natürlichen
Aminosäuren ersetzt ist.
Die Mutageneseoligonukleotide wurden am 5′-Ende unter Ver
wendung von T4 Polynukleotid-Kinase und ATP (Amersham)
phosphoryliert. Die phosphorylierten Mutageneseoligonukleo
tide wurden an die homologen Bereiche der Vorlagen-DNS ge
bunden. Dazu wurden 5 µg einzelsträngiger Vorlagen-DNS mit
ca. 4 pMol des phosphorylierten Mutageneseoligonukleotids
für drei Minuten bei 70°C und dann für 30 Minuten bei 37°C
inkubiert. Anschließend erfolgte die Synthese eines zur Vor
lagen-DNS, mit Ausnahme der zu mutagenisierenden Position,
komplementären DNS-Strangs, wobei das an die Vorlagen-DNS
gebundene Mutageneseoligonukleotid als Startpunkt der Syn
these und die Vorlagen-DNS als Vorlage für die Neusynthese
des mutierten DNS-Strangs diente. Die Synthese selbst er
folgte nach Zugabe des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase
(Amersham), einer T4 DNS-Ligase und eines Nukleotidmixes,
der die Nukleotide dATP, dGTP, dTTP und anstelle des dCTP
das Thionukleotid dCTPαS (Amersham) enthält, über 15 Stunden
bei 16°C.
Aus diesem Syntheseansatz wurden verbliebene Moleküle ein
zelsträngiger Vorlagen-DNS entfernt. Dazu wurde der Ansatz
mit NaCl versetzt und über einen Nitrozellulosefilter
(Amersham) filtriert, der spezifisch einzelsträngige DNS
bindet. Die im Durchlauf verbliebene doppelsträngige Hybrid-
DNS wurde durch eine EtOH-Fällung konzentriert und entsalzt.
Anschließend wurde die Hybrid-DNS mit NciI (Amersham), einer
Restriktionsendonuklease, die die Nukleotidsequenz CC(G/C)GG
erkennt, aber nur native DNS-Stränge, nicht jedoch solche,
die das Nukleotid-Analogon dCTPαS enthalten, spaltet, in ge
eignetem Inkubationspuffer (Amersham) für 90 Minuten bei
37°C inkubiert. Durch diese Behandlung wurden nur in den
nicht mutagenisierten Strang (Vorlagen-DNS) Brüche einge
führt.
Bei einer 30 minütigen Behandlung bei 37°C mit Exonuklease
III (Amersham), einem Enzym, das DNS-Stränge von freien
Enden her abbaut, wurde die Vorlagen-DNS dann entfernt. Nach
einer thermischen Inaktivierung der Exonuklease III (15
Minuten bei 70°C) wurde der verbliebene, einzelsträngige und
mutagenisierte DNS-Strang mit DNS-Polymerase I (Amersham),
T4 DNS-Ligase und den Nukleotiden dATP, dTTP, dCTP und dGTP
für 3 Stunden bei 16°C inkubiert. Dabei wurde die mutageni
sierte Einzelstrang-DNS zum Doppelstrang ergänzt. Nach einer
weiteren EtOH-Fällung zur Reinigung kann die mutagenisierte
DNS in kompetente E. coli K12-Zellen transformiert werden.
Durch die Sequenzanalyse des betreffenden Bereichs der re
kombinanten DNS aus fünf der bei der Transformation erhal
tenen Klone wurde der Erfolg der Mutageneseprozedur kon
trolliert. Bei Verwendung eines degenerierten Mutagenese
oligonukleotids (Tab. 2 unten) wurde bei dieser Sequenzierung
die erhaltene Mutation bestimmt. Aus solchen Vektoren, bei
denen eine Mutation bestätigt wurde, wurde das zur Mutagene
se ursprünglich in M13 klonierte DNS-Fragment mit geeigneten
Restriktionsenzymen herausgespalten. Im Falle des hier ver
wendeten 0,6 kb Fragmentes wurde mit PstI und EcoRI
gespalten.
Anschließend wurde das entsprechende, jedoch nicht mutageni
sierte PstI/EcoRI-Fragment aus dem auf pUC19 basierenden
Expressionsplasmid für die γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3
herausgespalten und unter Verwendung von T4 DNS-Ligase durch
das mutagenisierte Fragment ersetzt.
Analog zu der in Beispiel 1 dargestellten Methode wurde das
Kodon des β-CGTase-Gens aus Bacillus sp. 1-1, das für den
Tyrosinrest an Position 217 der entsprechenden CGTase
kodiert, durch ein Triplet ersetzt, das für einen Trypto
phanrest kodiert. Tab. 3 zeigt das Oligonukleotid, das für
diese Mutagenese verwendet wurde.
Analog Beispiel 1 wurde das Kodon des β-CGTase-Gens aus
Bacillus circulans, das für den Tyrosinrest an Position 229
der entsprechenden CGTase kodiert, durch ein Triplet
ersetzt, das entweder für einen Tryptophanrest (Tab. 4 oben)
oder einen Serinrest (Tab. 4 unten) kodiert. Tab. 4 zeigt
die Oligonukleotide, die für diese Mutagenesen verwendet
wurden.
Zur Produktion der γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3 und ihrer
gemäß Bsp. 1 hergestellten Derivate wurden die in Beispiel
1. beschriebenen Expressionsplasmide auf pUC19-Basis in
einen E. coli-Sekretionsstamm transformiert. Als E. coli-
Sekretionsstamm wurde E. coli WCM105 verwendet. Dieser
Stamm wurde wie in EP 338410 beschrieben aus E. coli DS 410
hergestellt.
Zur Produktion der γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3 oder de
ren Derivaten wurden daher Zellen von E. coli WCM105, die
geeignete CGTase-Expressionsplasmide enthalten, in LB-Medium
(Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Cold
Spring Harbor Laboratory (1982), N.Y.), das 10 g/l Laktose
und 0,1 g/l Ampicillin enthält, für 72 Stunden bei 30°C in
einem Wasserbadschüttler (Drehzahl 250 Upm) inkubiert. Dann
wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 5000 x g abge
trennt. Der zellfreie Kulturüberstand enthält die γ-CGTase
oder deren Derivate.
Die Produktion erfolgte analog Beispiel 4 unter Verwendung
der in Bsp. 2 beschriebenen Expressionsplasmide.
Die Produktion erfolgte analog Beispiel 4 unter Verwendung
der in Bsp. 3 beschriebenen Expressionsplasmide.
Die Bestimmung der Aktivitäten von CGTasen erfolgte nach der
in Eur. J. Biochem. (1990) 191, S. 177-185 beschriebenen
Methode.
Jeweils 10 Einheiten pro Gramm Stärke einer zu testenden
CGTase wurden mit einer 5%-igen Lösung einer löslichen
Stärke (Merck, Darmstadt) in einem Puffer bestehend aus 20
mM Tris/Cl pH 7,2 und 5 mM CaCl2 für eine definierte Zeit
bei 45°C inkubiert. Nach der Zeit wurde die Reaktion durch
die Zugabe von 1,5 Volumenteilen Methanol beendet. Nicht
umgesetzte Reststärke wurde durch eine einstündige Inkubati
on bei 4°C gefällt und durch Zentrifugation (10 min, 12 000 x
g) abgetrennt. Die entstandenen Produkte wurden über HPLC an
einer Nukleosil 10-NH₂-Säule (Macherey & Nagel, Düren)
bestimmt, wobei definierte Cyclodextrine oder lineare
Maltooligosaccharide (Sigma, München) als Standard dienten.
Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 7 beschrieben durchge
führt. Die Menge entstandener lineare Maltooligosaccharide
(G1-G7) wurde aufaddiert. Die folgenden Resultate wurden
erhalten:
Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 7 beschrieben durchge
führt. Die folgenden Resultate wurden erhalten:
Die Konversion wurde wie in Bsp 7 beschrieben
mit den folgenden Modifikationen durchgeführt:
- - Lösliche Stärke wurde durch Kartoffelstärke ersetzt
- - 1,25 Gramm CHDC (Cyclohexadecenon) pro 10 Gramm Stärke wurden zugesetzt.
Die folgenden Resultate wurden erhalten:
Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 7 beschrieben durchge
führt. Bei einer 20 minütigen Inkubation wurden die folgen
den Resultate erhalten:
Claims (6)
1. Cyclodextringlycosyltransferase (CGTase) welche bei der
Umsetzung von Stärke oder stärkeähnlichen Substraten zu
Cyclodextrin (CD) in erhöhtem Ausmaß γ-CD produziert,
dadurch gekennzeichnet, daß Ihre Proteinsequenz im
Bereich zwischen Aminosäureposition 180 und
Aminosäureposition 240 die Aminosäuresequenz Asn Leu Xxx
Asp enthält, wobei Position 1 der Proteinsequenz der
Beginn des Signalpeptids der CGTase ist und Xxx eine
natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Tyr bedeutet.
2. CGTase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Xxx
Trp oder Ser bedeutet.
3. CGTase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Xxx
Trp bedeutet.
4. Verfahren zur Herstellung von CGTasen dadurch
gekennzeichnet, daß die DNA Sequenz eines für eine β-
oder γ-CGTase kodierenden Gens mittels an sich bekannter
Mutagenesemethoden derart mutiert wird, daß dadurch das
im Bereich zwischen Aminosäureposition 180 und 240
liegende Tyr im Sequenzmotiv Asn Leu Tyr Asp der
eingesetzten β oder γ-CGTase in der mutierten CGTase
gegen eine andere natürliche Aminosäure ausgetauscht
ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
das im Bereich zwischen Aminosäureposition 180 und 240
liegende Tyr im Sequenzmotiv Asn Leu Tyr Asp der
eingesetzten β oder γ-CGTase in der mutierten CGTase
gegen Trp oder Ser ausgetauscht ist.
6. Verwendung von CGTasen nach einem der Ansprüche 1 bis 3
zur Produktion von γ-Cyclodextrin.
Priority Applications (13)
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---|---|---|---|
DE4324650A DE4324650A1 (de) | 1993-07-22 | 1993-07-22 | Cyclodextringlycosyltransferasen zur Produktion von gamma-Cyclodextrin |
TW083105372A TW383336B (en) | 1993-06-24 | 1994-06-14 | Cyclodextrin glycosyl transferases for the preparation of gama-cyclodextrin |
FI943007A FI943007A (fi) | 1993-06-24 | 1994-06-22 | Syklodekstriiniglykosyylitransferaasit gamma-syklodekstriinin valmistamiseksi |
JP6140476A JP2635932B2 (ja) | 1993-06-24 | 1994-06-22 | シクロデキストリングリコシル転移酵素、該転移酵素の製造法並びにγ−シクロデキストリンの産生法 |
US08/263,764 US5474917A (en) | 1993-06-24 | 1994-06-22 | Modified cyclodextrin glycosyltransferases for producing γ-cyclodextrins |
CA002126514A CA2126514C (en) | 1993-06-24 | 1994-06-22 | Cyclodextrin glycosyltransferases for producing y-cyclodextrins |
DK94109708T DK0630967T4 (da) | 1993-06-24 | 1994-06-23 | Cyclodextringlycosyltransferaser til fremstilling af gamma-cyclodextrin |
DE59409820T DE59409820D1 (de) | 1993-06-24 | 1994-06-23 | Cyclodextringlycosyltransferasen zur Produktion von gamma-Cyclodextrin |
KR1019940014464A KR0144637B1 (ko) | 1993-06-24 | 1994-06-23 | 감마-시클로텍스트린을 생산하는 시클로덱스트린글리코실전이효소 |
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CZ941563A CZ283880B6 (cs) | 1993-06-24 | 1994-06-24 | Cyklodextringlykosyltransferázy pro výrobu gama-cyklodextrinu, způsob jejich výroby a jejich použití |
HU9401915A HU216331B (hu) | 1993-06-24 | 1994-06-24 | Eljárás ciklodextrin-glikozil-transzferázok előállítására |
CN94107818A CN1122717C (zh) | 1993-06-24 | 1994-06-24 | 用于生产γ-环糊精的环糊精糖基转移酶 |
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Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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ID=6493470
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE4324650A Withdrawn DE4324650A1 (de) | 1993-06-24 | 1993-07-22 | Cyclodextringlycosyltransferasen zur Produktion von gamma-Cyclodextrin |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4324650A1 (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6472192B1 (en) | 1996-04-18 | 2002-10-29 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Cyclodextrin glycosyl transferases for producing γ-cyclodextrin |
US6740692B2 (en) | 2001-07-05 | 2004-05-25 | Wacker Polymer Systems Gmbh & Co. Kg | Solvent free coating compositions for soiling-resist ant facades |
-
1993
- 1993-07-22 DE DE4324650A patent/DE4324650A1/de not_active Withdrawn
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