DE4324650A1 - Cyclodextringlycosyltransferasen zur Produktion von gamma-Cyclodextrin - Google Patents

Cyclodextringlycosyltransferasen zur Produktion von gamma-Cyclodextrin

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Description

Die Erfindung betrifft Cyclodextringlycosyltransferasen (CGTasen) EC 2.4.1.19 zur Produktion von γ-Cyclodextrin, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.
Cyclodextrine werden in der Regel aus Stärke oder stärke­ ähnlichen Substraten hergestellt. Stärke wird dabei mit CGTasen enzymatisch in Cyclodextrin (CD) umgewandelt. Aus thermodynamischen Gründen wird die Stärke unabhängig von der zur Umsetzung verwendeten CGTase hauptsächlich in β-CD umge­ wandelt, wenn die Reaktion bis zum Erreichen des thermodyna­ mischen Gleichgewichts (maximaler CD-Ertrag) durchgeführt wird. In der Initialphase, zu Beginn der Stärkekonversions­ reaktion jedoch unterscheiden sich die zur Konversion ver­ wendeten Enzyme in der Zusammensetzung des primären Produkt­ gemisches. In Abhängigkeit von dem in dieser Initialphase durch das Enzym hauptsächlich gebildeten Produkt, α-, β- oder γ-CD, wird unterschieden zwischen α-, β- oder γ-CGTasen.
Solche zur industriellen CD-Produktion geeigneten und auch bereits verwendeten Enzyme wurden bisher ausschließlich bei Bakterien nachgewiesen. α-CGTasen wurden bisher ausschließ­ lich bei Bacillus macerans (J. Bacteriol. (1986) 166, S. 1118-1122), Bacillus Stearothermophilus (GB 2169902) und Klebsiella oxytoca (Gene (1986) 47, S. 269-277) identifi­ ziert. β-CGTasen wurden zum Beispiel bei Bacillus circulans (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1990) 34, S. 229-230), Bacillus megaterium (US-A 3,812,011), Bacillus ohbensis (JP 74124285), Micrococcus sp. (EP 0017242) und taxonomisch nicht exakt klassifizierten alkalophilen Bacillen wie Bacillus sp. 38-2 (J. Gen. Microbiol. (1988) 134, S. 97- 105), 17-1 (Proceedings of the 4th International Symposium on Cyclodextrins (1988), S. 87-92, 1011 (Appl. Microbiol Biotechnol. (1987) 26, S. 149-153), 1-1 (Proceedings of the 4th International Symposium on Cyclodextrins (1988), S. 71- 76) nachgewiesen. Enzyme mit einer initial hohen γ-CD-Bil­ dungsaktivität wurden aus Bacillus subtilis 313 (Agric. Biol. Chem (1986) 50, S. 2161-2162), Bacillus sp. Al-6 (J. Ferment. Bioeng. (1990) 70 (3), S. 150-154) und Bacillus sp. 290-3 (Proceedings of the 4th International Symposium on Cyclodextrins (1988), S. 87-92) beschrieben.
Durch eine Röntgenstrukturanalyse wurde die dreidimensionale Struktur der β-CGTase aus Bacillus circulans, aufgeklärt (J. Mol. Biol. (1991) 217, S. 737-750). Aus dieser Struktur konnte abgeleitet werden, welche Aminosäurereste unmittelbar am Aufbau der Substratbindestelle und des aktiven Zentrums dieser CGTase beteiligt sein könnten, nicht jedoch, welche Aminosäurereste die Produktspezifität dieser CGTase determi­ nieren (Biochemistry (1992) 31, S. 8740-8746).
Da die bei der industriellen Herstellung von Cyclodextrinen verwendeten CGTasen bei der Umwandlung von Stärke in Cyclo­ dextrine immer Gemische aus mehreren Cyclodextrinen liefern, wurden verschiedene Verfahren zur Gewinnung reiner Cyclo­ dextrine (α, β oder γ) entwickelt:
  • - Definierte CD′s können aus den Produktgemischen, z. B. aufgrund ihrer Molekulargewichtsunterschiede, chromato­ graphisch abgetrennt werden (beschrieben beispielsweise in US-A 4808232).
  • - Bei der enzymatischen Umwandlung von Stärke in Cyclo­ dextrine werden Komplexbildner zugesetzt, die nur mit einem definierten CD reagieren und damit z. B. einen unlöslichen Komplex bilden, der physikalisch aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden kann. Anschließend wird der Komplex aufgelöst und das homogene CD gewonnen (beschrieben beispielsweise in EP 0291067).
  • - Durch die Zugabe eines organischen Lösungsmittels, wie z. B. Äthanol, zum Reaktionsgemisch kann die Produkt­ zusammensetzung bei Verwendung einer γ-CGTase in Rich­ tung γ-CD verschoben werden (J. Ferm. Bioeng. (1990) 70 (3), S. 150-154).
Bei jedem der Verfahren werden optimalerweise solche CGTasen verwendet, die eine möglichst hohe initiale Produktbildungs­ präferenz für das CD besitzen, das rein hergestellt werden soll.
Die Spezifität der bisher bekannten α- und β-CGTasen ist ausreichend für eine technische Produktion der entsprechen­ den Cyclodextrine. Im Gegensatz dazu besitzt keine der be­ kannten γ-CGTasen eine Produktspezifität, die eine ver­ gleichbare γ-CD-Produktion ermöglicht.
Zur Herstellung von γ-CD wurde daher in JP 03053892 vorge­ schlagen, α- und/oder β-Cyclodextrine enzymatisch durch die Zugabe des γ-CD-spezifischen Komplexbildners Glycosylgly­ cyrrhizin, Maltose und einer CGTase in γ-CD umzuwandeln.
Aufgabe der Erfindung war es, Cyclodextringlycosyltransfera­ sen (CGTasen) zur Verfügung zu stellen, welche bei der Um­ setzung von Stärke oder stärkeähnlichen Substraten zu CD in erhöhtem Ausmaß γ-CD produzieren.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung war es, Verfahren zur Herstellung der genannten CGTasen zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung war es, Verfahren zur Produktion von γ-CD mittels der genannten CGTasen zur Verfü­ gung zu stellen.
Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch CGTasen, die da­ durch gekennzeichnet sind, daß ihre Proteinsequenz im Be­ reich zwischen Aminosäureposition 180 und Aminosäureposition 240 die Aminosäuresequenz Asn Leu Xxx Asp enthält, wobei Position 1 der Proteinsequenz der Beginn des Signalpeptids der CGTase ist und Xxx eine natürliche Aminosäure mit Aus­ nahme von Tyr bedeutet.
Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen CGTasen im Bereich zwischen Aminosäureposition 180 und Aminosäureposition 240 ihrer Proteinsequenz die Aminosäuresequenz Asn Leu Trp Asp oder Asn Leu Ser Asp wobei Position 1 der Proteinsequenz der Beginn des Signalpeptids der CGTase ist.
Besonders bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen CGTasen im Bereich zwischen Aminosäureposition 180 und Aminosäure­ position 240 ihrer Proteinsequenz das Sequenzmotiv Asn Leu Trp Asp, wobei Position 1 der Proteinsequenz der Beginn des Signalpeptids der CGTase ist.
Die erfindungsgemäßen CGTasen produzieren bei der Umsetzung von Stärke oder stärkeähnlichen Substraten CD′s in einer Produktverteilung bei der der Quotient aus γ-CD und der Summe aus α-CD und β-CD größer ist als der Quotient dieser Produkte, der bei der Stärkeumsetzung mit dem jeweiligen unveränderten Ausgangsenzym erzielt wird.
Unter Ausgangsenzym ist dabei die CGTase, die zur Herstel­ lung der erfindungsgemäßen CGTase verwendet wurde. Die er­ findungsgemäßen CGTasen besitzen somit unerwarteterweise eine höhere γ-CD Spezifität als die zu Ihrer Herstellung verwendeten Ausgangsenzyme.
Beispiele für erfindungsgemäße CGTasen sind CGTasen, die aus den in Tabelle 1 aufgeführten CGTasen durch Austausch des jeweils unterstrichenen Tyr gegen eine anderer natürliche Aminosäure erhalten werden. Bevorzugt sind CGTasen, bei denen das Tyr gegen Trp oder Ser ausgetauscht ist. Besonders bevorzugt sind CGTasen, bei denen das Tyr gegen Trp ausge­ tauscht ist.
Tabelle 1
Die Aufstellung in Tabelle 1 zeigt beispielhaft anhand einiger CGTasen den in β und γ-CGTasen generell vorhandenen Amino­ säuresequenzbereich, sowie das für die Modifikation der Pro­ duktspezifität relevante Tyr innerhalb dieses Sequenzberei­ ches. Als Position ist in Tabelle 1 die Zahl der ersten Amino­ säure der jeweils wiedergegebenen Aminosäuresequenz bezeich­ net, wobei als Position 1 die erste Aminosäure des Signal­ peptids der jeweiligen CGTase Sequenz gezählt wurde. Anhand von allgemein bekannten Standardverfahren läßt sich der ent­ sprechende Sequenzbereich bei allen β und γ-CGTasen eruieren. Durch erfindungsgemäße Mutagenese des Tyr in solchen CGTasen mittels ebenfalls bekannter Standardverfahren, wie Sie beispielhaft auch in der vorliegenden Anmeldung ausgeführt sind, lassen sich erfindungsgemäße Enzyme somit aus beliebi­ gen β und γ-CGTasen herstellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren gelöst, bei dem die DNA Sequenz eines für eine β- oder γ- CGTase kodierenden Gens mittels an sich bekannter Mutagene­ semethoden derart mutiert wird, daß dadurch das im Bereich zwischen Aminosäureposition 180 und 240 liegende Tyr im Sequenzmotiv Asn Leu Tyr Asp der eingesetzten β- oder γ- CGTase in der mutierten CGTase gegen eine andere natürliche Aminosäure ausgetauscht ist.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen CGTasen sind alle β- und γ-CGTasen geeignet. Das für eine CGTase kodierende Gen wird mittels bekannter Verfahren isoliert und die erfin­ dungsgemäße Mutation wird in das Gen der CGTase durch "in vivo"- oder "in vitro" -Mutageneseverfahren eingeführt.
Unter "in vivo"-Mutageneseverfahren sind besonders solche Methoden zu verstehen, bei denen Mikroorganismen, die chro­ mosomal und/oder episomal ein für eine CGTase kodierendes Gen enthalten, mit einem Mutagen wie z. B. UV-Licht, Nitro­ soguanidin oder Ethylmethylsulfonat unspezifisch mutageni­ siert werden. Ein solches Verfahren ist beispielsweise von Miller J. H. in (172) Experiments in Molecular Genetics; Cold Spring Harbour Laboratory; Cold Spring Harbour, N.Y. beschrieben worden.
Anschließend werden durch bekannte Methoden wie beispiels­ weise der Sequenzanalyse nach der von Sanger et al in PNAS 74 (1977) 5463-5467 beschriebenen Kettenabbruchmethode Mutan­ ten identifiziert, bei denen zumindest das Codon des CGTase- Gens, welches für das Tyrosin, welches homolog zu Tyr 229 der CGTase aus Bacillus circulans ist, kodiert, durch ein Codon, welches für einen anderen natürlichen Aminosäurerest, bevorzugt einen Serin oder Tryptophanrest, besonders bevor­ zugt einen Tryptophanrest, kodiert, ersetzt ist.
Im Sinne der Erfindung sind unter Codons welche homolog zu Tyr 229 der CGTase aus Bacillus circulans sind die für Tyr kodierenden Codons anderer CGTase Gene zu verstehen die für das in Tab. 1 unterstrichen Tyr in dem dort dargestellten Aminosäuresequenzmotiv kodieren.
Unter "in vitro"-Mutagenesemethoden sind im Sinne der Erfin­ dung solche Methoden zu verstehen, bei denen ein isoliertes CGTase-Gen oder ein Fragment eines CGTase-Gens in an sich bekannter Art und Weise so modifiziert wird, daß ein Gen entsteht, welches für ein CGTase-Enzym kodiert, bei dem zumindest der Aminosäurerest, der homolog zu Tyr 229 in der CGTAse aus Bacillus circulans ist, durch einen anderen Ami­ nosäurerest, bevorzugt einen Tryptophanrest oder einen Serinrest, besonders bevorzugt einen Tryptophanrest, ersetzt wurde.
Aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren zur "in vitro"- Mutagenese sind z. B. spezifische (Bio Techniques (1992)13 (3), S. 342-346) oder unspezifische (Technique (1989) 1 (1), S. 11-15) Mutageneseverfahren mit Hilfe der "PCR"-Technik. Ebenso sind Verfahren bekannt, bei denen die Mutation ge­ richtet mit Hilfe eines synthetisierten Oligonukleotids in das Zielgen eingebracht wird. Dies kann sowohl mittels soge­ nannter "Einzelstrangverfahren" (Ausubel F. M et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates) oder auch mittels "Doppelstrangverfahren" (Promega 1992-1993 Cataloque, 150) oder mittels anderer Ver­ fahren wie sie beispielsweise in Ann. Rev. Genet. (1985) 19, S. 423-462) beschrieben werden geschehen.
Die Verwendung zur Gewinnung von γ-CD aus Stärke ist das Hauptanwendungsgebiet der erfindungsgemäßen CGTase mit er­ höhter γ-CD-Bildungsaktivität. Die erfindungsgemäßen CGTasen lassen sich dazu mittels gängiger Herstellungsverfahren nutzen. Gängige Herstellungsverfahren zur Produktion von γ- CD, in denen sich die erfindungsgemäßen CGTasen an Stelle der dort genannten CGTasen einsetzen lassen, sind zum Beispiel beschrieben bei:
  • - Journal of Fermentation and Bioengineering (1990) 70 (3), S. 190-192: Die Herstellung von γ-CD unter Verwen­ dung der β-, γ-CD bildenden CGTase aus Bacillus sp. AL-6 in Gegenwart von Äthanol, welcher eine verstärkte γ-CD- Produktion bewirkt.
  • - JP 87 25,976: Die Herstellung von γ-CD unter Verwendung der γ-CGTase aus Bacillus sp. 313.
  • - EP 291,067: Herstellung von γ-CD unter Verwendung der CGTase aus Bacillus macerans. Die Produktspezifität für γ-CD wird durch die Zugabe eines Komplexbildners, z. B. Cyclohexadec-8-in-1-on, erreicht.
  • - DE 40 09 822: Produktion von γ-CD mit der γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3.
γ-CD besitzt sowohl im Vergleich zu α-CD als auch im Ver­ gleich zu β-CD spezifische Vorteile, die es für eine Reihe von Anwendungen als einzig mögliches oder am besten geeigne­ tes CD ausweisen.
Im Vergleich zu α-CD, das aus sechs Glukoseeinheiten aufge­ baut ist, besitzt das aus acht Glukoseeinheiten bestehende γ-CD eine größere hydrophobe Kavität, die auch eine Komple­ xierung solcher Gastmoleküle ermöglicht, die aus sterischen Gründen von α-CD nicht komplexiert werden können.
Im Vergleich zu β-CD (Löslichkeit in Wasser bei Raumtempera­ tur: ca. 18,5 g/l) besitzt γ-CD eine wesentlich höhere Lös­ lichkeit (bei Raumtemperatur: ca. 232,0 g/l) und ist damit für Komplexierungsreaktionen aus wäßrigen Lösungen besser geeignet als β-CD. Ein weiterer Vorteil von γ-CD gegenüber β-CD und modifizierten β-CD-Derivaten ist die geringe Toxi­ zität von γ-CD. Sowohl bei oraler als auch bei intravenöser Applikation sind α-CD- und β-CD-Derivate im Tiermodell toxi­ scher als γ-CD.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1 Mutagenese der γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3 (DSN 5850)
Der Austausch des Aminosäurerestes Tyrosin an der Position 211 in der γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3 (hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen in Braunschweig unter der Nummer DSM 5850) gegen einen beliebigen anderen Aminosäurerest, insbesonders jedoch gegen einen Trypto­ phan- oder Serinrest, wird erreicht, indem das für die Tyro­ sin 211 kodierende Basentriplet des CGTase-Strukturgens in einer dem Fachmann an sich bekannten Art und Weise durch ein anderes Basentriplet, kodierend für einen beliebigen Amino­ säurerest, vorzugsweise jedoch einen Tryptophanrest, ersetzt wird.
Zur Mutagenese wurde das γ-CGTase-Gen aus Bacillus sp. 290-3 zunächst in den kommerziell erhältlichen E. coli-Vektor pUC19 (Boehringer, Mannheim) kloniert. Dazu wurde wie bei Ausubel F.M., Current protocols in molecular biology, vol. 1; Greene Publishing Associates & Wiley - Interscience, N. Y. beschrieben chromosomale DNS aus Bacillus sp. 290-3 (Proceedings of the 4th International Symposium on Cyclodex­ trins (1988) 87-92) isoliert und partiell mit der Restrik­ tionsendonuklease Sau3AI (Boehringer, Mannheim) gespalten. Fragmente in einem Größenbereich zwischen zwei und fünf kb wurden isoliert und zusammen mit einer mit der Restriktions­ endonuklease BamHI (Boehringer, Mannheim) linearisierten pUC19-DNS und T4 DNS-Ligase bei 16°C für 12 Stunden inkubiert. Der Ligationsansatz wurde zur Transformation von E. coli K 12-Zellen, die mit bekannten Verfahren (Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory (1982), N.Y.) kompetent für die Aufnahme von DNS gemacht wurden, verwendet. Aus solchen E. coli-Zellen, die nach der Transformation auf Stärke enthaltenden Indikator­ platten Stärkeabbauhöfe bildeten, wurde das rekombinante Plasmid, welches das Gen für die γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3 trägt, isoliert (Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory (1982), N.Y. S 86-92).
Die Mutagenese dieses Gens wurde mit dem von der Firma Amersham (Braunschweig) kommerziell vertriebenen ′Oligonu­ cleotide - directed in vitro mutagenesis system, version 2.1′, basierend auf einem von Eckstein entwickelten Verfahren (Nucl. Acids. Res. (1986) 14, S. 9679-9698 und Nucl. Acids. Res. (1988) 16, S. 791-802) durchgeführt. Die Mutagenese wurde exakt nach dem Protokoll durchgeführt, welches dem genannten Mutagenese System der Fa. Amersham beiliegt. Das Verfahren wird im Folgenden summarisch wieder­ gegeben. Details sind dem Protokoll des genannten Mutagene­ sesystems zu entnehmen.
Unter Verwendung kommerziell erhältlicher Enzyme wie Restriktionsendonukleasen und T4 DNS-Ligase (Boehringer, Mannheim) wurde ein solcher Teil des in pUC19 klonierten Gens für die γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3, der das für den Aminosäurerest Tyrosin an Position 211 dieser CGTase kodierende Basentriplet enthält, in den kommerziell erhält­ lichen Vektor M13 (New England Biolabs) kloniert. Ein Beispiel für ein solches Fragment ist ein 0,6 kb großes PstI/EcoRI-Fragment. Dieses Fragment wurde in den mit den Restriktionsendonukleasen PstI und EcoRI gespaltenen M13- Vektor kloniert.
Aus solchen E. coli-Wirtszellen, die den rekombinanten M13- Vektor aufgenommen hatten, wurde nach der von Amersham mit dem oben genannten Mutagenese-System gelieferten Versuchs­ protokoll einzelsträngige, rekombinante M13-DNS (Vorlagen- DNS) isoliert.
Zur eigentlichen Mutagenese wurden chemisch definierte Muta­ geneseoligonukleotide mit jeweils erwünschter Sequenz synthetisiert. Solche Oligonukleotide sind beispielsweise bei der Fa. MWG (Ebersberg) käuflich erhältlich. Die Sequenz des Mutageneseoligonukleotids wurde so gewählt, daß die Abfolge der Basen in dem Mutageneseoligonukleotid invers komplementär zu dem Teil der Nukleotidsequenz der Vorlagen- DNS ist, der das in der Vorlagen-DNS enthaltene Basen­ triplet, kodierend für den Tyrosinrest an Position 211 der γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3 jeweils 15 Basen stromauf und stromab umgibt. An Stelle des für Tyrosin kodierenden Basentriplets enthielt das Mutageneseoligonukleotid jedoch solche Nukleotide, die nach erfolgter Mutagenese zur Produk­ tion von γ-CGTase-Derivaten führen, bei denen an Position 211 statt eines Tyrosinrestes ein anderer Aminosäurerest lokalisiert ist.
In Tabelle 2 sind die Sequenzen der zwei verwendeten Mutagene­ seoligonukleotiden dargestellt.
Tabelle 2
Der Einsatz des oberen in Tabelle 2 dargestellten Mutagenese­ oligonukleotids führte zu γ-CGTase-Derivaten, bei denen der Tyrosinrest 211 durch einen Tryptophanrest ersetzt war.
Bei Verwendung des unteren in Tabelle 2 dargestellten Mutagene­ seoligonukleotids, einem sogenannten degenerierten-, oder ′mixed′ - Oligonukleotid kann das für Tyrosin 211 kodierende Basentriplet durch jedes der 64 möglichen Basentriplets mit Ausnahme der für Tyr kodierenden Triplets ersetzt werden. Dieses Oligonukleotid ist daher geeignet zur Erzeugung von γ-CGTase-Derivaten, bei denen der Aminosäurerest Tyrosin an Position 211 durch jeweils eine der anderen natürlichen Aminosäuren ersetzt ist.
Die Mutageneseoligonukleotide wurden am 5′-Ende unter Ver­ wendung von T4 Polynukleotid-Kinase und ATP (Amersham) phosphoryliert. Die phosphorylierten Mutageneseoligonukleo­ tide wurden an die homologen Bereiche der Vorlagen-DNS ge­ bunden. Dazu wurden 5 µg einzelsträngiger Vorlagen-DNS mit ca. 4 pMol des phosphorylierten Mutageneseoligonukleotids für drei Minuten bei 70°C und dann für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte die Synthese eines zur Vor­ lagen-DNS, mit Ausnahme der zu mutagenisierenden Position, komplementären DNS-Strangs, wobei das an die Vorlagen-DNS gebundene Mutageneseoligonukleotid als Startpunkt der Syn­ these und die Vorlagen-DNS als Vorlage für die Neusynthese des mutierten DNS-Strangs diente. Die Synthese selbst er­ folgte nach Zugabe des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase (Amersham), einer T4 DNS-Ligase und eines Nukleotidmixes, der die Nukleotide dATP, dGTP, dTTP und anstelle des dCTP das Thionukleotid dCTPαS (Amersham) enthält, über 15 Stunden bei 16°C.
Aus diesem Syntheseansatz wurden verbliebene Moleküle ein­ zelsträngiger Vorlagen-DNS entfernt. Dazu wurde der Ansatz mit NaCl versetzt und über einen Nitrozellulosefilter (Amersham) filtriert, der spezifisch einzelsträngige DNS bindet. Die im Durchlauf verbliebene doppelsträngige Hybrid- DNS wurde durch eine EtOH-Fällung konzentriert und entsalzt. Anschließend wurde die Hybrid-DNS mit NciI (Amersham), einer Restriktionsendonuklease, die die Nukleotidsequenz CC(G/C)GG erkennt, aber nur native DNS-Stränge, nicht jedoch solche, die das Nukleotid-Analogon dCTPαS enthalten, spaltet, in ge­ eignetem Inkubationspuffer (Amersham) für 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Durch diese Behandlung wurden nur in den nicht mutagenisierten Strang (Vorlagen-DNS) Brüche einge­ führt.
Bei einer 30 minütigen Behandlung bei 37°C mit Exonuklease III (Amersham), einem Enzym, das DNS-Stränge von freien Enden her abbaut, wurde die Vorlagen-DNS dann entfernt. Nach einer thermischen Inaktivierung der Exonuklease III (15 Minuten bei 70°C) wurde der verbliebene, einzelsträngige und mutagenisierte DNS-Strang mit DNS-Polymerase I (Amersham), T4 DNS-Ligase und den Nukleotiden dATP, dTTP, dCTP und dGTP für 3 Stunden bei 16°C inkubiert. Dabei wurde die mutageni­ sierte Einzelstrang-DNS zum Doppelstrang ergänzt. Nach einer weiteren EtOH-Fällung zur Reinigung kann die mutagenisierte DNS in kompetente E. coli K12-Zellen transformiert werden.
Durch die Sequenzanalyse des betreffenden Bereichs der re­ kombinanten DNS aus fünf der bei der Transformation erhal­ tenen Klone wurde der Erfolg der Mutageneseprozedur kon­ trolliert. Bei Verwendung eines degenerierten Mutagenese­ oligonukleotids (Tab. 2 unten) wurde bei dieser Sequenzierung die erhaltene Mutation bestimmt. Aus solchen Vektoren, bei denen eine Mutation bestätigt wurde, wurde das zur Mutagene­ se ursprünglich in M13 klonierte DNS-Fragment mit geeigneten Restriktionsenzymen herausgespalten. Im Falle des hier ver­ wendeten 0,6 kb Fragmentes wurde mit PstI und EcoRI gespalten.
Anschließend wurde das entsprechende, jedoch nicht mutageni­ sierte PstI/EcoRI-Fragment aus dem auf pUC19 basierenden Expressionsplasmid für die γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3 herausgespalten und unter Verwendung von T4 DNS-Ligase durch das mutagenisierte Fragment ersetzt.
Beispiel 2 Mutagenese der β-CGTase aus Bacillus sp. 1-1
Analog zu der in Beispiel 1 dargestellten Methode wurde das Kodon des β-CGTase-Gens aus Bacillus sp. 1-1, das für den Tyrosinrest an Position 217 der entsprechenden CGTase kodiert, durch ein Triplet ersetzt, das für einen Trypto­ phanrest kodiert. Tab. 3 zeigt das Oligonukleotid, das für diese Mutagenese verwendet wurde.
Tabelle 3
Beispiel 3 Mutagenese der β-CGTase aus Bacillus circulans
Analog Beispiel 1 wurde das Kodon des β-CGTase-Gens aus Bacillus circulans, das für den Tyrosinrest an Position 229 der entsprechenden CGTase kodiert, durch ein Triplet ersetzt, das entweder für einen Tryptophanrest (Tab. 4 oben) oder einen Serinrest (Tab. 4 unten) kodiert. Tab. 4 zeigt die Oligonukleotide, die für diese Mutagenesen verwendet wurden.
Tabelle 4
Beispiel 4 Produktion der γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3 und ihrer erfindungsgemäßen Derivaten in E. coli
Zur Produktion der γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3 und ihrer gemäß Bsp. 1 hergestellten Derivate wurden die in Beispiel 1. beschriebenen Expressionsplasmide auf pUC19-Basis in einen E. coli-Sekretionsstamm transformiert. Als E. coli- Sekretionsstamm wurde E. coli WCM105 verwendet. Dieser Stamm wurde wie in EP 338410 beschrieben aus E. coli DS 410 hergestellt.
Zur Produktion der γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3 oder de­ ren Derivaten wurden daher Zellen von E. coli WCM105, die geeignete CGTase-Expressionsplasmide enthalten, in LB-Medium (Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory (1982), N.Y.), das 10 g/l Laktose und 0,1 g/l Ampicillin enthält, für 72 Stunden bei 30°C in einem Wasserbadschüttler (Drehzahl 250 Upm) inkubiert. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 5000 x g abge­ trennt. Der zellfreie Kulturüberstand enthält die γ-CGTase oder deren Derivate.
Beispiel 5 Produktion der β-CGTase aus Bacillus sp. 1-1 und ihrer erfindungsgemäßen Derivate in E. coli
Die Produktion erfolgte analog Beispiel 4 unter Verwendung der in Bsp. 2 beschriebenen Expressionsplasmide.
Beispiel 6 Produktion der β-CGTase aus Bacillus circulans und ihrer erfindungsgemäßen Derivate in E. coli
Die Produktion erfolgte analog Beispiel 4 unter Verwendung der in Bsp. 3 beschriebenen Expressionsplasmide.
Beispiel 7 Konversion von Stärke zu Cyclodextrinen
Die Bestimmung der Aktivitäten von CGTasen erfolgte nach der in Eur. J. Biochem. (1990) 191, S. 177-185 beschriebenen Methode.
Jeweils 10 Einheiten pro Gramm Stärke einer zu testenden CGTase wurden mit einer 5%-igen Lösung einer löslichen Stärke (Merck, Darmstadt) in einem Puffer bestehend aus 20 mM Tris/Cl pH 7,2 und 5 mM CaCl2 für eine definierte Zeit bei 45°C inkubiert. Nach der Zeit wurde die Reaktion durch die Zugabe von 1,5 Volumenteilen Methanol beendet. Nicht umgesetzte Reststärke wurde durch eine einstündige Inkubati­ on bei 4°C gefällt und durch Zentrifugation (10 min, 12 000 x g) abgetrennt. Die entstandenen Produkte wurden über HPLC an einer Nukleosil 10-NH₂-Säule (Macherey & Nagel, Düren) bestimmt, wobei definierte Cyclodextrine oder lineare Maltooligosaccharide (Sigma, München) als Standard dienten.
Beispiel 8 Konversion von Stärke unter Einsatz der nicht mutagenisierten γ-CGTase aus Bacillus sp. 290-3 sowie dem gemäß Bsp. 4 hergestellten Derivat
Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 7 beschrieben durchge­ führt. Die Menge entstandener lineare Maltooligosaccharide (G1-G7) wurde aufaddiert. Die folgenden Resultate wurden erhalten:
Tabelle 5
Beispiel 9 Konversion von Stärke unter Einsatz der nicht mutagenisierten β-CGTase aus Bacillus circulans sowie dem gemäß Bsp. 6 hergestellten Derivat, bei dem der Tyrosinrest an Position 229 durch einen Tryptophanrest ersetzt wurde
Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 7 beschrieben durchge­ führt. Die folgenden Resultate wurden erhalten:
Tabelle 6
Beispiel 10 Konversion von Stärke unter Einsatz der nicht mutagenisierten β-CGTase aus Bacillus circulans sowie dem gemäß Bsp. 6 hergestellten Derivat, bei dem der Tyrosinrest an Position 229 durch einen Tryptophanrest ersetzt wurde in Anwesenheit eines γ-CD-Komplexbildners
Die Konversion wurde wie in Bsp 7 beschrieben mit den folgenden Modifikationen durchgeführt:
  • - Lösliche Stärke wurde durch Kartoffelstärke ersetzt
  • - 1,25 Gramm CHDC (Cyclohexadecenon) pro 10 Gramm Stärke wurden zugesetzt.
Die folgenden Resultate wurden erhalten:
Tabelle 7
Beispiel 11 Konversion von Stärke unter Einsatz der nicht mutagenisierten β-CGTase aus Bacillus circulans sowie des erfindungsgemäßen Derivats aus Bsp. 6, bei dem der Tyrosin­ rest an Position 229 durch einen Serinrest ersetzt wurde
Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 7 beschrieben durchge­ führt. Bei einer 20 minütigen Inkubation wurden die folgen­ den Resultate erhalten:
Tabelle 8

Claims (6)

1. Cyclodextringlycosyltransferase (CGTase) welche bei der Umsetzung von Stärke oder stärkeähnlichen Substraten zu Cyclodextrin (CD) in erhöhtem Ausmaß γ-CD produziert, dadurch gekennzeichnet, daß Ihre Proteinsequenz im Bereich zwischen Aminosäureposition 180 und Aminosäureposition 240 die Aminosäuresequenz Asn Leu Xxx Asp enthält, wobei Position 1 der Proteinsequenz der Beginn des Signalpeptids der CGTase ist und Xxx eine natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Tyr bedeutet.
2. CGTase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Xxx Trp oder Ser bedeutet.
3. CGTase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Xxx Trp bedeutet.
4. Verfahren zur Herstellung von CGTasen dadurch gekennzeichnet, daß die DNA Sequenz eines für eine β- oder γ-CGTase kodierenden Gens mittels an sich bekannter Mutagenesemethoden derart mutiert wird, daß dadurch das im Bereich zwischen Aminosäureposition 180 und 240 liegende Tyr im Sequenzmotiv Asn Leu Tyr Asp der eingesetzten β oder γ-CGTase in der mutierten CGTase gegen eine andere natürliche Aminosäure ausgetauscht ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das im Bereich zwischen Aminosäureposition 180 und 240 liegende Tyr im Sequenzmotiv Asn Leu Tyr Asp der eingesetzten β oder γ-CGTase in der mutierten CGTase gegen Trp oder Ser ausgetauscht ist.
6. Verwendung von CGTasen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Produktion von γ-Cyclodextrin.
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