KR100222379B1 - 감마-시클로덱스트린 제조용 시클로덱스트린 글리코실 전이효소 - Google Patents
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Abstract
CG타아제는 전분 또는 전분유사기질을 CD(Cyclodextrin)로 전환시킬 때 증가량까지 감마-CD를 생산하며, 그 관련효소의 제조에 사용되는 출발 CG타아제의 특이성 CG타아제 활성 전체의 최소 60%를 나타내고, 그 아미노산 배열은 아미노산위치 155에서 아미노산위치 195까지의 영역에서 최소한 하나의 아미노산의 결실에 의한 공지의 CG타아제의 아미노산 배열과 달리하며, 그 단백질 배열의 위치 1은 그 CG타아제의 시그날 펩티드의 개시가 되고 그 결실은 그 단백질의 감마-CG타아제 활성을 증가시킨다.
Description
[발명의 명칭]
감마-시클로덱스트린 제조용 시클로덱스트린 글리코실 전이효소
[발명의 상세한 설명]
[발명의 목적]
[발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술]
본 발명은 감마-시클로덱스트린 제조용 시클로덱스트린 글리코실 전이효소(CG타아제) EC 2.4.1.19, 감마-시클로덱스트린 글리코실 전이효소의 제조방법 및 그 사용에 관한 것이다.
일반적으로, 시클로덱스트린은 전분 또는 전분유사기질에서 제조하였다. 이 시클로덱스트린의 제조에서는 CGXKDKWP(CGTase)가 사용되어 전분을 시클로덱스트린(CD)으로 효소에 의해 전환시켰다.
열역학적인 이유에서, 그 전분은 이 반응을 열역학적 균형에 도달될 때까지(최대 CD수율)실시할 경우, 이 반응에 사용된 CG타아제와는 관련없는 베타-CD로 전환되었다.
그러나, 그 초기 단계에서는 그 전분 전환반응초기에서 그 전환반응에 사용되는 효소가 1차 생성 혼합물의 조성물에서 서로 다르다.
알파-, 베타- 또는 감마-CD에 따라 달라진다.
CD의 공업적 생산에 적합하게 이미 사용되었던 이들의 효소를 종래에는 세균(bacteria)에서만 검출하였다.
종래에는 알파-CG타아제를 바실러스 마세란스(Bacillus macerans), 바실러스 스테아로테르모필러스(Bacilklus stearothermophilus) 및 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca)에서만 확인되었다.
베타-CG타아제는 예로서 바실러스 시르컬란스(Bacillus circulans), 바실러스 메가테륨(Bacillus megaterium), 바실러스 오벤시스(Bacillus ohbensis), 미크로 콕커스(micrococcus) sp. 및 바실러스 sp. 38-2, 17-1, 1011 또는 1-1등 분류학상 정확하게 분류되지 않았던 호알칼리성 바실래(alkalophilic Bacillae)에서 검출되었다.
그리고, 종래에는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 313, 바실러스 sp.A1-6 및 바실러스 sp. 290-3에서 감마-CD-생성 활성이 초기에 높은 자연산 효소의 존재에 대한 보고가 있었다.
시클로덱스트린의 공업적 제조에 사용된 CG타아제는 전분을 시클로덱스트린으로 전환할 때 수개의 시클로덱스트린의 혼합물을 항상 생성하기 때문에 순수시클로덱스트린(알파, 베타 또는 감마)을 분리하는 각종의 방법이 개발되었다. 이들의 방법을 아래에 설명한다.
상기 CD는 그 생성혼합물로부터 크로마토그라피에 의해 분리시킬 수 있다.
즉, 분자량의 차이에 따라 분리시킬 수 있다(예로서 특허문헌 US-A-4,808m232에 기재되어 있음).
일반적으로, 전분을 시클로덱스트린으로 효소에 의해 전환시킬 때, 하나의 상기 CD로만 반응시키는 착체를 첨가시켜 이 CD로 불용성 착체를 생성한다.
예로서, 이 착체는 그 다음 물리적 수단에 의해 반응혼합물로부터 분리시킬 수 있다.
그 다음으로, 그 착체를 용해시켜 균질의 CD를 분리시킨다(예로서 특허문헌 EP0291067에 기재되어 있음).
감마-CG타아제를 사용할 경우 그 생성 조성물은 에타놀등의 유기용매를 첨가시켜 그 감마-CD에서 반응 혼합물로 대치시킬 수 있다(J.Ferm. Bioeng. (1990) 70 (3), pp. 150-154 참조).
각각의 방법에서, 순수형태로 제조되는 그 CD에 대해서 가능한 높은 초기 생성물 생성에 대한 우선권(preference)을 가진 이들의 CG타아제를 선택적으로 사용하였다.
종래에 공지된 알파 - 및 베타-CG타아제의 특이성(specificity)은 그 대응되는 시클로덱스트린의 공업적인 제조에 적합하다.
이와 대조적으로, 공지의 자연산 감마-CG타아제는 대비할 수 있는 감마-CD의 공업적인 제조를 할 수 있는 제품의 특이성을 갖고 있지 않다.
따라서, 감마-CD를 제조하기 위하여, 기술문헌 CA 115:157165에서는 감마-CD-특이성 착화제(complecing agent) 글리코실 글리시리진(glycosyl glycyrrhizin), 말토오스 및 CG타아제를 첨가시켜 알파- 및/ 또는 베타-시클로덱스트린을 감마-CD로 효소에 의해 전환시키는 기술에 대하여 기재되어 있다.
감마-CD의 제조에 대한 다른 선택방법에서는 그 아미노산잔기를 교환시키는 수단에 의해, 그 돌연변이 생성효소(mutagenized enzyme)가 증가량까지 감마-CD를 생성하여 공업적 규모의 감마-CD제조에 사용할 수 있는 범위로 베타-CG타아제의 감마-CD 특이성을 증가시킨다.
적합한 돌연변이(mutation)는 공지되어 있으며, 예로서 특허문헌 DE 43 24 650 A1(특허문헌 US-A-5,474,917의 대응특허), 기술문헌잡지 [Biochemistry (19994) 33 (33), pp. 9929-9936, Biochemistry (1995) 34 (10), pp. 3368-3376 및 J. Biotech. (1994) 32, pp. 283-288]에 기재되어 있다.
베타-CG타아제를 돌연변이시켜 생성시킨 이와 같은 CG타아제 유도체는 감마-CD의 증가 특이성을 가지며, 이들의 생성물 범위에 따라 감마-CD의 공업적 제조용으로 적합하다.
그러나, 돌연변이 생성에 사용되는 출발효소의 소정의 활성은 그 관련된 돌연변이를 도입시킴으로써 감소되는 결점이 있다.
도입된 그 아미노산잔기에 따라, 감마-CD만의 증가특이성을 가진 돌연변이 효소는 그 출발효소의 CD-형성활성 25%~50%를 가진다 [Biochemistry (1994) 33 (33), pp. 9929-9936, Biochemistry (1995) 34 (10), pp. 3368-3376].
[발명이 이루고자 하는 기술과제]
본 발명의 목적은 전분 또는 전분 유사기질을 CD로 전환시킬 때, 감마-CD를 증가량까지 생성하며, 그 효소를 제조하는 데 사용되는 출발 CG타아제의 전체 CG타아제 특이성 활성을 최소 60%로 나타내는 시클로덱스트린 글리코실 전이효소(CG타아제)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 CG타아제의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 감마-CD의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 발명의 첫째 목적은 아미노산위치 155에서 아미노산위치 195까지의 영역에서 최소한 하나의 아미노산을 결실시킴으로써 공지의 CG타아제의 아미노산 배열과는 그 아미노산 배열이 다른 CG타아제에 의해 달성되며, 그 단백질 배열의 위치 1은 그 CG타아제의 시그널 펩티드의 출발이 되며, 그 결실은 그 단백질의 감마-CG타아제 활성을 증가시킨다.
[발명의 구성 및 작용]
본 발명의 범위내에서 감마-CG타아제의 활성증가로 전분 또는 전분유사 기질과 CG타아제를 반응시킬 때 상승되는 생성 혼합물중에서
의 값이 더 커짐을 알 수 있다.
본 발명에 의한 CG타아제의 아미노산 배열은 단백질 배열의 아미노산위치 155와 아미노산위치 195 사이의 영역에서 결실시킨 4~8개의 아미노산잔기에 의해 공지의 CG타아제의 아미노산 배열과 다르며, 여기서 단백질 배열의 위치 1은 그 CG타아제의 시그널 펩티드의 개시가 되며, 그 결실은 단백질 감마-CG타아제 활성을 증가시킨다.
특히 바람직하게는, 본 발명에 의한 CG타아제의 아미노산 배열이 그 단백질 배열의 아미노산위치 155와 아미노산위치 195사이의 영역에서 결실시킨 6개의 아미노산잔기에 의해 공지의 CG타아제의 아미노산 배열과 다르며, 여기서 그 단백질열 위치 1은 그 CG타아제의 시그널 펩티드의 개시가 되며 그 결실은 그 단백질의 감마-CG타아제 활성을 증가시킨다.
그 단백질 배열위치 1이 CG타아제의 시그널 펩티드의 개시가 되어, 본 발명 출원에서 설명한 다른 아미노산위치 각각에서 적용된다.
또, 각각의 경우 표 1에서 눈에 띠게 굵은 활자로 나타낸 아미노산잔기의 결실에 의해, 표 1에 기재된 CG타아제의 아미노산 배열에서 아미노산 배열이 서로 다른 CG타아제가 특히 바람직하다.
본 발명에 의한 각각의 CG타아제의 잔류 아미노산 배열은 본 발명에 의한 결실없이 그 배열이 CG타아제 활성을 나타내는 범위까지 다음 표 1에서 소정의 CG타아제의 아미노산 배열과 동일하다.
본 발명에 의한 CG타아제의 예에는 아미노산잔기 위치 155와 195사이의 영역에서 각각 아미노산잔기를 결실시킴으로써 표 1에 나타낸 CG타아제 또는 다른 CG타아제로부터 얻어진 CG타아제가 있다.
4~8개의 아미노산잔기를 그 영역에서 결실시킨 CG타아제가 바람직하다.
표 1에서 눈에 띠게 굵은 활자로 나타낸 6개의 아미노산을 그 영역에서 결실시킨 CG타아제가 특히 바람직하다.
본 발명에 의한 CG타아제의 또 다른 예로는 표 1에 기재한 아미노산과 동일한 아미노산을 결실시킨 효소가 있다.
이들의 효소는 본 발명에 의한 결실없는 CG타아제의 활성을 나타낸다.
또, 본 발명에 의한 CG타아제의 예에는 각각의 경우 표 1에서 눈에 띄게 굵은 활자로 명백하게 나타낸 아미노산잔기를 아미노산위치 155와 아미노산위치 195 사이의 영역에서 결실시킨 효소가 있으며, 본 발명에 의한 CG타아제의 잔류 아미노산 배열은 그 배열이 본 발명에 의한 결실을 포함하지 않은 효소가 CG타아제 활성을 나타내는 범위까지 각각의 경우 표 1에 나타낸 미생물의 CG타아제의 아미노산 배열과 동일하다.
본 발명에 의한 CG타아제가 CG타아제의 제조에 사용되는 출발 CG타아제보다 더 높은 감마-CD 특이성을 갖고 있다는 것은 비예측적이며, 동시에 그 돌연변이 효소는 그 출발 CG타아제와 비교할 때 CG타아제 특이성활성전체에 있어서 약간의 감소만을 나타낸다.
전분 또는 전분유사기질을 전환시킬 때, 본 발명에 의한 CG타아제는 생성물분포에서 CD를 생성한다.
이 분포에서는 감마-CD와 알파-CD 및 베타-CD의 합을 나눈 값이 각각의 변화없는 출발 CD타아제를 사용하여 전분을 전환시킬 때 얻어진 이들의 생성물의 나눈 값보다 더 크다.
실시예에 의한 수개의 CG타아제를 사용하는 표 1에서는 각각의 경우 그 생성물 특이성에 대하여 관련이 있는 이 배열영역내에서의 6개의 아미노산잔기와 CG타아제에 일반적으로 존재하는 동일 아미노산 배열의 영역을 나타낸다.
표 1에 나타낸 각각의 아미노산 배열의 제1아미노산의 수를 위치로 정하며, 특정의 CG타아제 배열의 시그널 펩티드의 제1아미노산을 위치 1로 산정하였다.
그 대응하는 배열영역은 잘 알려진 기준방법을 사용하는 일체의 CG타아제에서 구할 수 있다.
예로서, 이것은 중복배열맞춤(multiple sequence alignments)을 연산하는 공지의 알고리즘을 사용하여 실시할 수 있다.
적합한 컴퓨터 알고리즘의 예로는 상용되는 위스콘신 시팍스 분석 패키지(유전자 컴퓨터 그륩, 매디슨 : Genetic Computer Group, Madison)시팍스 분석 프로그램의 파일업(pileup) 프로그램이 있다.
CG타아제의 상기 영역을 돌연변이 시킴으로써, 본 발명에 의한 효소는 예로서 본 발명 출원에서 설명한 바와 같이 공지의 기준방법을 사용하는 CG타아제로부터 제조할 수 있다.
이 목적을 위하여, CG타아제를 엔코딩하는 유전자는 일반적으로 이 발명에 의해 CG타아제를 엔코딩하는 방법으로 돌연변이시킨다.
따라서, 본 발명은 이 발명에 의한 CG타아제를 코딩하는 돌연변이 CG타아제 유전자의 제조방법에 관한 것으로, 출발 CG타아제를 연코딩하는 유전자의 DNA배열을 그 자체 공지의 돌연변이 생성방법에 의해 돌연변이시켜, 그 돌연변이 유전자의 DNA배열에 의해 엔코딩한 아미노산위치 155와 195사이영역에서의 아미노산 배열은, 최소한 하나의 아미노산잔기의 결실에 의해 돌연변이가 없는 유전자(unmutated gene)의 DNA에 의해 엔코딩한 아미노산 배열과 다르다.
본 발명에 의한 방법에서 출발 CG타아제를 엔코딩하는 유전자의 DNA배열은 그 자체 공지된 돌연변이 생성방법에 의해 돌연변이시켜, 그 돌연변이 유전자의 DNA배열에 의해 엔코딩한 아미노산 배열은 아미노산위치 155와 195사이영역에서 4-8개의 아미노산잔기의 결실에 의해 돌연변이가 없는 유전자의 DNA에 의해 엔코딩한 아미노산 배열과 다른 것이 바람직하다.
본 발명에 의한 방법에서 출발 CG타아제를 엔코딩하는 유전자의 DNA배열은 그 자체 공지된 돌연변이 생성방법에 의해 돌연변이시켜, 그 돌연변이 유전자의 DNA 배열에 의해 엔코딩하는 아미노산 배열은 아미노산위치 155와 195 사이의 영역에서 6개의 아미노산잔기의 결실에 의해 돌연변이 없는 유전자의 DNA에 의해 엔코딩한 아미노산 배열과 다른 것이 특히 바람직하다.
이 발명은 또 감마-CG타아제의 제조방법에 관한 것으로, 상기 DNA배열중 최소한 하나를 하나의 미생물에서 나타내도록 함을 특징으로 하는 방법이다.
모든 CG타아제(출발 CG타아제)의 유전자는 이 발명에 의한 CG타아제의 제조에 적합하다.
출발 CG타아제는 모두 자연산 CG타아제로 할 수 있으나, 이들은 또 돌연변이생성에 의해 얻어진 CG타아제로 할 수가 있다.
예로서, 본 발명에 의하지 않는 또 다른 돌연변이에 의해 그 생성물 생성비가 이미 변화된 CG타아제로 할 수가 있다(즉, 특허문헌 DE 43 24 650 A1, US-A-5,474,917에 대응되는 특허).
출발 CG타아제는 본 발명에 의하지 않는 또다른 돌연변이에 의해 생성물 생성비가 이미 변화된 CG타아제가 바람직하다(즉, 특허문헌 DE 43 24 650 A1에 기재된 바와 같음).
출발 CG타아제를 엔코딩하는 유전자는 공지의 방법을 사용하여 분리되며, 본 발명에 의한 돌연변이는 생체내(in-vivo) 또는 실험관내(in-vitro) 돌연변이 생성방법에 의해 CG타아제의 유전자에 도입시킨다.
이 방법은 동일하게 종래기술에서 널리 공지되어 있다.
생체내 돌연변이 생성방법은, 특히 CG타아제를 엔코딩하는 유전자를 염색체 및/또는 에피솜에 포함하는 미생물 UV광, 니트로소구아니딘 또는 에틸 메틸 설포네이트등 돌연변이 생성원(mutagen)으로 통상의 방법에 의해 돌연변이 생성을 시키는 방법이다.
이와 같은 방법은 예로서 참고문헌(Miller J.H.(1972) Experiments in Molecular Genetics; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, N.Y.)에 기재되어 있다.
그 다음으로, 참고문헌(Sanger et al. in PNAS 74 (1977) 5463-5467)에 기재된 체인정지방법(chain termination method)에 의한 순서분석(sequence analysis)등 공지의 방법을 사용하여 아미노산잔기를 엔코딩하는 CG타아제 유전자의 최소한 하나의 코돈(codon)이 그 대응하는 CG타아제의 아미노산잔기 위치 155와 195사이에 있는 영역에서 결실되는(deleted) 돌연변이체(mutants)를 확인하였다.
이들의 돌연변이체는 상기 영역에서 4~8개의 코돈을 결실시키는 본 발명에 의해 선택하는 것이 바람직히다.
돌연변이체는 6개의 코돈을 결실시켜 선택하는 것이 특히 바람직하다.
표 1에서 선명하게 굵은 활자로 나타낸 아미노산잔기를 엔코딩하거나, 다른 CG타아제에서 이들 잔기와 동일한 아미노산잔기를 엔코딩하는 6개의 코돈을 결실시켜 이들의 돌연변이체를 일단 다시 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 범위내에서 실험관내 돌연변이 생성방법은, 분리 CG타아제 유전자 또는 CG타아제 유전자의 단편(fragment)을 그자체 공지의 방법으로 변형시켜, 아미노산잔기 위치 155와 195사이영역에서 아미노산잔기중 하나를 엔코딩하는 CG타아제 유전자의 최소한 하나를 결실시키는 CG타아제 효소를 엔코딩하는 유전자를 생산하는 방법이다.
상기 영역에서 4~8개의 코돈을 결실하도록 변경시킨(modified) 돌연변이체가 바람직하다.
돌연변이체는 상기 영역에서 6개의 코돈을 결실하도록 변경시키는 것이 특히 바람직하며, 특히 돌연변이체는 상기 영역에서, 표 1에서 굵은 활자로 선명하게 나타낸 아미노산잔기를 엔코딩하거나 다른 CG타아제에서의 아미노산잔기와 동일한 아미노산잔기를 엔코딩하는 6개의 코돈을 결실하도록 변경시킨 것이 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 의해 감마-CG타아제를 엔코딩한 DNA배열에 관한 것이다.
종래의 기술에서 공지된 실험관내 돌연변이 생성방법의 예로는 PCR기술을 사용하는 소정의 돌연변이 생성방법 [BioTechniques (1992) 13 (3), pp. 342-346] 또는 통상의 돌연변이 생성방법 [Technique (1989) 1 (1), pp. 11-15]이 있다.
합성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 직접적인 방법으로 하여 표적유전자에 돌연변이를 도입시키는 방법 역시 공지되어 있다.
이것은 1개 스트랜드 방법(single-strand methods) [Ausubel F.M.등(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates] 또는 2개 스트랜드 방법(double-strand methods) [Promega 1992-1993 Catalogue, 150) 또는 기타방법, 예로서 참고문헌 [Ann. Rev. Genet. (1985) 19, pp. 423-462]에 기재된 방법을 사용하여 실시할 수 있다.
본 발명에 의한 CG타아제의 처리 주영역은 전분에서 감마-CD를 분리시키는데 사용된다.
본 발명에 의한 CG타아제는 현행 제조방법을 사용하여 이 목적을 사용할 수 있다.
본 발명은 따라서 CG타아제를 사용하여 전분을 전환시켜 감마-CD를 제조하는 방법에 있어서 청구항 1에서와 같이 최소한 하나의 CG타아제를 CG타아제로서 사용함을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
이들 방법에서 구체화한 CG타아제 대신 본 발명에 의한 CG타아제를 사용 할 수 있는 감마-Cd를 생성하는 현행 제조방법은 예로서 아래와 같이 기재되어 있다.
-참고문헌(Journal of Fermentation and Bioengineering (1990) 70 (3), pp. 190-192): 에타놀의 존재하에서 바실러스(Bacillus) sp. AL-6의 베타- 및 감마-CD-형성 CG타아제를 사용하여 감마-CD를 제조하는 기술구성에 대하여 기재되어 있다.
그 결과 감마-CD의 생산이 증가되었다.
-참고문헌(CA 107:57466)에서는 바실러스 sp. 313의 감마-CG타아제를 사용하여 감마-CD를 제조하는 기술구성에 대하여 기재되어 있다.
-특허문헌 EP 291,067: 바실러스 마세란스(Bacillus macerans)의 감마-CG타아제를 사용하여 감마-CD를 제조하는 기술구성에 대하여 기재되어 있다.
착화제, 예로서 시클로헥사덱-8-엔-1-온을 첨가시켜 감마-CD에 대한 생성물 특이성을 얻었다.
-특허문헌 DE 40 09 822(대응특허문헌: US-A-5,409,824): 바실러스 sp.2-90-3의 감마-CD를 제조하는 기술구성에 대하여 기재되어 있다.
감마-CD는 알파-CD와의 대비와 베타-CD와의 대비에서 소정의 효과를 갖고 있는바, 이들의 효과는 일연의 처리에서 가능성만 있는 CD 또는 가장 적합한 CD로서 확인되었다.
8개의 글루코오스단위로 구성되는 감마-CD는 6개의 글루코오스 단위로 구성되는 알파-CD와 비교하여 입체 장해적 이유(steric reasons) 때문에 알파-CD에 의해 착화시킬 수 없는 외래분자(guest molecules)를 착화시킬 수 있도록 하는 더 큰 소수성 공동(hydrophobic cavity)을 가진다.
감마-CD는 베타-CD(실온에서 물에 용해하는 용해도 : 약 18.5g/1)와 비교하여 실제로 더 높은 용해도(실온에서 약 232.0g/1)를 가지며, 수용액에서의 착화반응에 있어서 베타-CD보다 더 적합하다.
감마-CD는 베타-CD 및 변형시킨 베타-CD 유도체와 비교하여 독성이 낮은 또다른 효과가 있다.
동물모델(animal model)에서, 알파-CD 유도체와 베타-CD 유도체는 경구투여 또는 정맥내 투여를 할 때 감마-CD보다 독성이 더 있다.
본 발명을 더 구체적으로 설명하기 위하여 다음에 실시를 예시한다.
[실시예 1]
바실러스 시르컬란스 #8(DSM 10559) CG 타아제의 돌연변이 생성(mutagenesis)
본 발명에 의해 아미노산잔기 155-195의 영역에서 그 어떤 아미노산잔기의 결실, 특히 바실러스 시르컬란스 #8[표 1 참조 : 독일 DSMZ(Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)에서 기탁번호 DSM 10559로 기탁]의 베타-CG타아제 위치 179-184에서 6개의 아미노산잔기 M E T D T S(Seq. ID No.5)의 결실은 통상의 기술자에게 공지된 방법으로 그 대응되는 아미노산잔기를 엔코딩하는 CG타아제 구조유전자의 염기성 트리플렛(base triplets)을 결실시켜 얻었다.
이 돌연변이 생성에 있어서, 일차적으로 바실러스 시르컬란스 #8의 베타-CG타아제 유저자를 시판되는 에.콜리(E.Coli) 벡터 pUC19(Boehringer, Mannheim)로 클론화(cloning)하였다.
이와 같이 하여 염색체 DNA를 참고문헌(Ausubel F.M., Current protocols in molecular biology, Vol. 1; Greene Publishing Associates Wiley-Interscience, N.Y.)에 기재된 바와 같이 바실러스 시르컬란스 #8[Appl. Microbiol. Biotechnol.(1990) 33:pp. 542-546]로부터 분리시켜 제한 핵산 중간분해효소(restriction endonucleases) HindIII 및 XbaI(Boechringer, Mannheim)으로 결실하였다.
크기 2~5kb의 단편(fragments)을 분리시켜, 제한 핵산 중간 분해효소 HindIII 및 Xbai로 결실시킨 pUC19 DNA 및 T4 DNA 리가아제(ligase)와 함께 16
에서 12시간 배양하였다.
그 결찰 혼합물(ligation mixture)를 사용하여 공지의 방법(Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory (1982), N.Y.)에 의해 DNA 흡착에 적당하게 한 에.콜리 K 12 세포를 형질전환시켰다.
그 바실러스 시르컬란스 #8의 베타-CG타아제의 유전자를 가진 그 세포는 재조합 플라스미드를 이들의 에.콜리 세포에서 분리시켜, 형질전화시킨후 전분한유 인디케이터 플레이트(indicator plates)상에서 전분분해할로(starch degradation haloes)를 생성하였다(Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory (1982), N.Y., pp. 86-92).
실험관내 돌연변이 생성장치 버젼(version) 2.1 [아메르샴(Amersham)회사(braunschweig)가 판매하고 있으며, 참고문헌(eckstein (Nucl. Acids. Res(1988) 16. pp. 791-802)에 의해 개발한 방법을 기초로함]에서 직접 올리고뉴클레오티드를 사용하여 이 유전자를 돌연변이시켰다.
이 돌연변이 생성은 상기 돌연변이 생성장치에 대한 프로토콜(protocol)에 따라 정밀하게 실시하였다.
이 방법을 아래에 요약한다.
상기 돌연변이 생성장치의 프로토콜에서 구체적인 설명이 기재되어 있다.
본 발명에 의해, CG타아제의 아미노산잔기위치 155에서 아미노산잔기위치 195까지의 영역을 엔코딩하는 바실러스 시르컬란스 #8의 베타-CG타아제에 대한 pUC19-클론화 유전자의 부분은 제한 엔도뉴클레아제(endonucleases) 및 T4 DNA 리가아제(Boehringer, Mannheim)등 시판용 효소를 사용하여 시판용 벡터 M13(New England Biolabs)에 클론화하였다.
1.6kb AccI단편은 이와 같은 단편의 한 예이다.
이 단편을 AccI-분해 M13 벡터에 클론화하였다.
상기 돌연변이 생성장치와 함께 상기 아메르샴 회사가 제공한 실험 프로토콜에 따라, 재조합 M13 벡터를 흡착한 에.콜리 숙주세포에서 1개 스트랜드 재조합 M13 DNA(초기 DNA)를 분리하였다.
실제의 돌연변이 생성에 있어서, 각각의 경우 소정의 배열을 가진 화학적으로 구성되는 돌연변이 생성 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
이와 같은 올리고뉴클레오티드는 예로서 MWG(Ebersberg)에서 시판용으로 얻을 수 있다.
그 돌연변이 생성 올리고뉴클레오티드의 염기의 순서를, 상류의 15개 염기와 하류의 15개 염기에 대하여 초기 DNA에 포함되고 결실되도록 한 바실러스 시르컬란스 #8의 베타-CG타아제의 염기 트리플렛(base triplets)을 위치시킨 초기 DNA의 뉴클레오티드 배열의 그 부분에 역으로 보충하도록 돌연변이생성 올리고뉴클레오티드의 배열을 선택하였다.
사용한 돌연변이생성 올리고뉴클레오티드의 배열을 다음 표 2에 나타낸다.
위 표 2에 타나낸 돌연변이생성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 6개의 아미노산잔기 M E T D T S(Seq.ID.No.5)를 결실시킨 아미노산 단편을 엔코딩한 베타-CG타아제 유전자 프랙션(fraction)을 얻었다.
T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(kinase) 및 ATP(Amersham)를 사용하여 그 돌연변이생성 올리고뉴클레오티드를 그 5'말단에서 인산화 반응을 시켰다(phosphorylation).
그 인산화 돌연변이생성 올리코뉴클레오티드는 초기 DNA의 동일 영역에 결합시켰다.
이 때문에, 1개 스트랜드 초기 DNA 5㎍을, 그 인산화돌연변이생성 올리고뉴클레오티드 약 4 pmol과 함께 7분간 70
, 그 다음 30분간 37
에서 배양하였다.
그 다음, 결실시킨 뉴클레오티드외에 그 초기 DNA에 보충한 DNA 스트랜드를 그 합성의 출발점으로 작용하는 초기 DNA와 돌연변이 DAN스트랜드의 새로운 합성주형(template)으로 작용하는 초기 DNA에 결합하는 돌연변이생성 올리코뉴클레오티드로 합성하였다.
그 합성자체는 NNA중합효소(Amersham), T4 DNA 리가아제 및 뉴클레오티드 dATP, dGTP 및 dTTP 및 dCTP 대신 티오뉴클레오티드 dCTPS(Amersham)를 포함하는 뉴클레오티드믹스(mix)의 클레노브 단편을 추가한 후 15시간 16
에서 실시하였다.
1개 스트랜드 초기 DNA의 잔류분자는 이 합성 혼합물에서 제거하였다.
따라서, 이 혼합물을 NaCl로 처리하여 1개 스트랜드 DNA를 특이성있게 결합하는 니트로셀룰로오스 필터(Amersham)를 통하여 여과하였다.
그 유동-통과시에 잔류되어 있는 이중 스트랜드의 혼성 DNA(doublestranded hybrid DNA)을 농축시켜 에틸알코올의 침전에 의해 탈염시켰다(desalted).
그 다음, 그 혼성 DNA는 뉴클레오티드 배열 CC(G/C)GG를 인식하나 본래의 DNA스트랜드(native DNA strand)를 다만 결실시키며 뉴클레오티드 아날로그 dCTPS를 포함하는 것을 결실지 않는 제한 엔도뉴클레아제 NCiI(Amersham)로 90분간 37
에서 적당한 배양완충액(Amersham)에서 배양하였다.
이와 같은 처리만을 도입하여 돌연변이생성이 없는 스트랜드(non-mutagenized strand)(초기 DNA)를 결실하였다.
그 다음으로, 자유단에서 개시하는 DNA스트랜드를 분해하는 효소, 엑소뉴클레아제 III로 37
에서 30분간 처리하여 그 초기 DNA를 제거하였다.
그 엑소뉴클레아제 III를 열에 의해(70
, 15분간)불활성시킨 다음, 남아있는 1개 스트랜드 돌연변이생성 DNA스트랜드를 16
에서 3시간 DNA중합 효소I(Amersham), T4 DNA리가아제 및 뉴클레오티드 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP로 배양하였다.
이 배양에 의해 돌연변이시킨 1개 스트랜드의 DNA를 2개의 스트랜드의 DNA로 하였다.
그 다음, 정제하기 위하여 에틸알코올 침전을 더 실시하여 그 돌연변이생성 DNA를 적합한 에.콜리 K12세포에서 형질전환시켰다.
이 형질전환에서 얻은 5개의 클론(clones)에서 재조합 DNA의 관련영역의 배열분석에 의해 돌연변이 생성공정의 결과를 첵크하였다.
그 돌연변이 생성에 사용되는 M13으로 초기에 클론화한 DNA 단편을 벡터에서 결실하였다.
제한효소 XhoI 및 NdeI를 사용하여 돌연변이를 갖고 있음이 확인되었다.
그 다음으로, 돌연변이 생성이 없는 그 대응되는 XhoI/NdeI 단편을 바실러스 시르컬란스 #8의 베타-CG타아제를 발현하는 pUC19-기재 플라스미드로부터 결실하고, T4 DNA 리가아제를 사용하여 돌연변이 단편으로 대치하였다.
[실시예 2]
바실러스 sp. 1-1 베타-CG타아제의 돌연변이생성
표 3(실시예 8의 A), 비교예 2)에 나타낸 올리코뉴클레오티드를 사용하고 실시예 1의 방법과 동일하게 하여, 그 대응하는 CG타아제(표 1 참조)의 위치 167-172에서 아미노산잔기 L E T N P N (Seq.ID.No.7)을 엔코딩하는 바실러스 sp. 1-1의 베타-CG타아제의 6개 코돈을 결실하였다.
동일하게 결실한 그 결실을, 야생타입 효소와 대비할 때 아미노산교환(Tyr => Trp)(실시예 8의 B), 비교예 2)에 의해 감마-CD 특이성이 증가되었고, 특허문헌 DE 43 24 650 A1에 기재된 이 CG타아제의 유도체에 넣었다.
[실시예 3]
에.콜리(E.Coli)에서 본 발명에 의한 바실러스 시르컬란스 #8의 베타-CG타아제 및 그 유도체의 제조
실시예 1에서 설명한 pUC-19기재 발현플라스미드를,
실시예 1에서와 같이 제조한 바실러스 시르컬란스 #8의 베타-CG타아제 및 그 유도체를 제조하기 위하여 분비형 에.콜리 균주에서 형질절환시켰다.
에.콜리 WCM105를 분비형 에.콜리 균주로 사용하였다.
이 균주를 특허문헌 EP 338410에서 기재된 바와 같이 에.콜리 DS 410에서 제조하였다.
따라서, 바실러스 시르컬란스 #8의 베타-CG타아제 또는 그 유도체를 제조하기 위하여 적당한 CG타아제 발현 플라스미드를 가진 에.콜리 WCM105세포를 10g/1의 락토오스와 0.1g/1의 앰피실린을 포함하는 LB배지(Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory (1982), N.Y.)에서 30
, 72시간 동안 진탕수조(shaking water bath)(회전속도:250rpm)중에 배양하였다.
그 다음, 그 세포를 5000 x g에서 원심분리하여 분리하였다.
그 세포없는 배양물 상증액에는 베타-CG타아제 또는 그 유도체가 포함되었다.
[실시예 4]
에.콜리에서 본 발명에 의한 바실러스 sp. 1-1의 베타-CG타아제 및 그 유도체의 제조
실시예 2에서 설명한 그 발현 플라스미드를 사용하여 실시예 3에서와 같이 하여 제조하였다.
[실시예 5]
캐리어(carrier)-결합 베타-시클로덱스트린의 흡착에 의한 CG타아제의 정제
세파로스 결합 베타-CD분자를 사용하여 친화성 정제에 의해 CG타아제를 특이성 있게 그리고 온화하게 정제하였다.
에폭시-활성 세파로스 6B(Sigma) 1g을 H2O 3×10
로 세척시킨 다음 0.1NNaOH 1×5
로 세척하였다.
그 다음 세파로스 6B를 0.1 N NaOHdp 용해한 베타-CD 2.8%(W/V)용액 2
에 현탁하였다.
이 현탁액을 약하게 진탕하면서 45
에서 20시간 배양하였다.
그 다음으로 베타-CD와 세파덱스 6B로 구성되어 있는 결합 생성물을 H2O 2×5
로 세척하였다.
H2O에 글루코오스를 용해한 2.5%(W/V)용액중에서 그 세척한 결합생성물을 현탁시킨 후에, 그 현탁액을 1시간 동안 실온에서 남아 있는 유리결합부위(free coupling sites)를 포화시키기 위하여 배양하였다.
그 다음으로 그 결합생성물을, H2O 2×5
, 0.1M 보레이트 완충액(pH 8.0) H2O 2×5
, 0.1M 아세테이트 완충액(pH 4.0) H2O 2×5
및 20mM 트리에타놀아민/Cl(pH4.0) H2O 2×2
로 연속적으로 세척하였다.
그 결합생성물을 20mM 트리에타놀아민/Cl(pH7.2)(최종용량 약2-2.5
)로 처리하여 4
에서 사용할 때까지 저장하였다.
CG타아제를 세파로오스 6B-결합 베타-CD(CD-세파로오스)에 특이성있게 결합하기 위하여 실시예 3 또는 4에 의해 얻은 세포가 없는 CG타아제-함유 배지 상증액을 CD-세파로오스 0.2
로 처리하여 약하게 진탕시키면서 4
에서 1.5시간 배양하였다.
이 배양기간동안, 그 효소는 CD-세파로오스에 결합하였다.
그 효소/Cd-세파로오스 착체를 원심분리에 의해 분리시켜(400×g에서 5분)20mM 트리에타놀아민/Cl(pH 7.2) 2×10
로 세척하였다.
그 다음으로, 20mM 트리에타놀아민/Cl(pH 7.2)에 베타-CD를 용해한 1%용액 2
로 그 착체를 4
에서 1.5시간 배양시켜 그 CG타아제 효소를 용리하였다.
최종적으로 원심분리시킨후(4000×g에서 5분) 그 정제 CG타아제를 함유 상증액을 제거하였다.
이와같이 하여 정제시킨 CG타아제의 특성을 명백하게 하기 전에 그 용액에 포함되고, 그 용리에 사용되는 베타-CD를 더 제거시킬 필요가 있다.
이와 같이 하기 위하여, 상업적으로 얻을 수 있는 PD-10컬럼(세파덱스G-25M; pharmacia)을 20mM Tris/HCl(pH 7.2)과 5mM CaCl2(TC버터) 35
로 일정하게 균형을 유지시켰다(equilibarated).
베타-CD-함유용액을 TC완충액으로 2.5
이내로 조제하여 그 컬럼에 넣었다.
그 다음 그 컬럼 TC완충액 3.5
로 용리시켰다.
이와 같이 하여 얻어진 그 용리액에는 정제된 베타-CD가 없는 CG타아제가 포함되었다.
[실시예 6]
전분을 시클로덱스트린으로의 전환
참고문헌(Eur. J. Biochem.(1990) 191, pp. 177-185)에 기재되어 있는 방법을 사용하여 그 CG타아제 활성을 측정하였다.
테스트할 서로 다른 양의 CG타아제 용액을 일정시간동안 20mM Tris/HCl과 5mM CaCl2로 구성되어 완충액(pH 7.2)중에서 가용성 전분(Merck, Darmstadt)5%용액으로 45
에서 배양하였다.
소정시간후에, 그 반응을 메타놀 1.5용량부를 첨가시켜 종결하였다.
미반응 잔류전분을 1시간동안 4
에서 배양시켜 침전하고 원심분리(12000×g에서 10분간)에 의해 분리하였다.
그 결과 얻어진 생성물은 기준이 되는 소정의 시클로덱스트린(Sigma, Munich)으로 뉴클레오실(Nucleosil 10-NH2)컬럼 (Macherey & Nagel, Duren)상에서 HPLC에 측정하였다.
1 유닛(1U)은 위에서 설명한 처리조건하에서 전분으로부터 분(分)당 시클로덱스트린 1μM을 생성하는 효소의 량으로 결정하였다.
[실시예 7]
정제 CG타아제의 특이성있는 CG타아제 전체 활성측정
정제한 CG타아제의 특이성있는 CG타아제 활성전체를 단백질 단위량당 용량 활성(U/
)으로 결정하였다.
효소샘플의 CG타아제 용량활성(U/
)을 실시예 6에서와 같이 측정하였다.
그 정제 CG타아제 용액의 단백질 함량(
/
)은 참고문헌(M.Bradford, Anal. Biochem. (1976) 72. pp.248 ff)에 기재되어 있는 방법을 사용하여 측정하였다.
이 목적에 필요로 하는 화학제품은 바이오-래드(Bio-Rad) 제조회시에서 구입하였다.
다음의 특이성있는 CG타아제 활성전체(특이성 활성)는 바실러스 시르컬란드 #8 및 바실러스 sp. 1-1의 베타-CG타아제의 이들로부터 제조한(실시예 1 및 실시예2) 결실형 돌연변이체(deletion mutants)에 대하여 측정하였다.
[실시예 8]
바실러스 시르컬란스 #8 및 바실러스 sp. 1-1의 돌연변이생성이 없는 베타-CG타아제 및 실시예 3 및 4에서와 같이 제조한 유도체를 사용하는 전분의 전환
돌연변이 생성이 없는 CG타아제의 생성물 스펙트럼(product spectra)과, 실시예1 및 2에서와 같이 결실형 돌연변이 생성에 의해 각각의 경우 돌연변이 생성이 없는 CG타아제로부터 얻어진 유도체의 생성물 스펙트럼을 비교하기 위하여 동일한 효소활성을 사용하여 전분을 전환하였다(실시예 6).
소정의 시간에서 그 생성물 조성을 조사하였다.
다음 결과가 얻어졌다:
[비교예 1]
[비교예 2]
배열 리스트(LIST)
(1) 일반 정보:
(i) 출원인
(A) 성명 : 콘소티움 퍼 엘렉트로헤미쉐인더스트리 게엠베하
(B) 로명(路名) : 지엘스타트스트라세 20
(C) 시명 : 뮨헨
(D) 연방주명 : 바파리아(Bavaria)
(E) 국가명 : 독일
(F) 우편번호 : 81379
(G) 전환번호 : 049-89-74844-0
(H) 팩스번호 : 049-89-74844-350
(ii) 발명의 명칭:
감마-시클로덱스트린 제조용 시클로덱스트린 글리콜 전이효소
(iii) 배열수 : 8
(iv) 컴퓨터 판독가능품 :
(A) : 메듐타입 : Floppy disk
(B) 컴퓨터 : IBM PC compatible
(C) 조작시스템 : PC-DOS/MS-JDOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
(2) SEQ. ID. NO : 1의 정보
(i) 배열특성 :
(A) 길이 : 24개의 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 스트랜디드네스(STRANDEDNESS) :
(D) 토폴로지(TOPOLOGY) : 선상(Linear)
(ii) 분자타입 : 펩티드
(iii) 가상형 : 없음
(v) 단편타입 : 내부단편
(vi) 기원 :
(A) 세균 : 바실러스 오벤시스(Bacillus ohbensis)
(xi) 배열설명 : SEQ ID NO: 1:
(2) SEQ. ID. NO : 2의 정보
(i) 배열특성 :
(A) 길이 : 24개의 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 스트랜디드네스(STRANDEDNESS) :
(D) 토폴로지(TOPOLOGY) : 선상(Linear)
(ii) 분자타입 : 펩티드
(iii) 가상형 : 없음
(v) 단편타입 : 내부단편
(vi) 기원 :
(A) 세균 : 바실러스 마세란스(Bacillus macerans)
(xi) 배열설명 : SEQ ID NO: 2:
(2) SEQ. ID. NO : 3의 정보
(i) 배열특성 :
(A) 길이 : 24개의 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 스트랜디드네스(STRANDEDNESS) :
(D) 토폴로지(TOPOLOGY) : 선상(Linear)
(ii) 분자타입 : 펩티드
(iii) 가상형 : 없음
(v) 단편타입 : 내부단편
(vi) 기원 :
(A) 세균 : 바실러스 sp. 1-1(Bacillus sp. 1-1)
(xi) 배열설명 : SEQ ID NO: 3:
(2) SEQ. ID. NO : 4의 정보
(i) 배열특성 :
(A) 길이 : 24개의 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 스트랜디드네스(STRANDEDNESS) :
(D) 토폴로지(TOPOLOGY) : 선상(Linear)
(ii) 분자타입 : 펩티드
(iii) 가상형 : 없음
(v) 단편타입 : 내부단편
(vi) 기원 :
(A) 세균 : 바실러스 시르컬란스(Bacillus circulans) #8
(xi) 배열설명 : SEQ ID NO: 4:
(2) SEQ. ID. NO : 5의 정보
(i) 배열특성 :
(A) 길이 : 6개의 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 스트랜디드네스(STRANDEDNESS) : 1개
(D) 토폴로지(TOPOLOGY) : 선상(Linear)
(ii) 분자타입 : 펩티드
(iii) 가상형 : 없음
(iv) : 앤티센스(ANTISENSE) : 없음
(v) 단편타입 : 내부단편
(xi) 배열설명 : SEQ ID NO: 5:
(2) SEQ. ID. NO : 6의 정보
(i) 배열특성 :
(A) 길이 : 30개의 염기쌍
(B) 타입 : 뉴클레오티드
(C) 스트랜디드네스(STRANDEDNESS) : 1개
(D) 토폴로지(TOPOLOGY) : 선상(Linear)
(ii) 분자타입 : 기타핵산
(A) : 설명 : /desc = "합성"
(iii) 가상형 : 없음
(iv) : 앤티센스(ANTISENSE) : 없음
(viii) 게놈위치 :
(C) 단위 : bp
(xi) 배열설명 : SEQ ID NO: 6:
(2) SEQ. ID. NO : 7의 정보
(i) 배열특성 :
(A) 길이 : 6개의 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 스트랜디드네스(STRANDEDNESS) : 1개
(D) 토폴로지(TOPOLOGY) : 선상(Linear)
(ii) 분자타입 : 펩티드
(iii) 가상형 : 없음
(iv) : 앤티센스(ANTISENSE) : 없음
(v) : 단편타입 : 내부단편
(xi) 배열설명 : SEQ ID NO: 7:
(2) SEQ. ID. NO : 8의 정보
(i) 배열특성 :
(A) 길이 : 30개의 염기쌍
(B) 타입 : 뉴클레오티드
(C) 스트랜디드네스(STRANDEDNESS) : 1개
(D) 토폴로지(TOPOLOGY) : 선상(Linear)
(ii) 분자타입 : 기타핵산
(iii) 가상형 : 없음
(iv) : 앤티센스(ANTISENSE) : 없음
(viii) 게놈의 위치 :
(C) 단위 : bp
(xi) 배열설명 : SEQ ID NO: 8:
[발명의 효과]
이 발명에 의한 CG타아제는 증가량까지 감마-CD(cyclodextrin)를 생성하며, 제조용으로 사용되는 출발 CG타아제의 특이성 CG타아제 전활성의 최소 60%를 나타낸다.
감마-CD를 증가량까지 생성하는 CG타아제를 얻기 위하여 공지의 CG타아제를 어떻게 변경하느냐하는 방법을 제시한다.
감마-CD는 CD로서 가장 효과적이며, 감마-CD의 기술적인 생산을 위하여 공지의 CD타아제 보다 더 우수한 CD타아제가 바람직하다.
이 발명에 의한 CG타아제에 대하여 코딩하는 DNA배열을 제공하며 이와 같은 DNA배열을 사용함으로써 이 발명에 의한 CG타아제를 생산할 수 있다.
또, 이 DNA 배열을 발현하는 미생물을 제공하며, 이와 같은 미생물을 사용함으로써 이 발명에 의한 CG타아제를 생산할 수 있다.
Claims (6)
- 전분 또는 전분유사기질을 CD(cyclodextrin)로 전환시킬 때 감마-CD를 증가량까지 생성하며, 제조에 사용되는 출발 CG타아제의 특이성 CG타아제 전활성의 최소 60%를 더 나타내고, 아미노산 배열은 각각의 경우 표 1에서 눈에 띄게 굵은 활자로 나타낸 아미노산잔기의 결실(deletion)에 최소한 표 1에 나타낸 CG타아제의 아미노산 배열과 다르게 하며, 이 발명에 의한 CG타아제의 잔류 아미노산 배열은 그 배열이 이 발명에 의한 결실없이 CG타아제 활성을 나타내는 범위까지 각각의 경우 표 1에 기재된 미생물의 CG타아제의 아미노산 배열과 동일함을 특징으로 하는 CG타아제.
- 이 발명에 의한 CG타아제를 엔코딩하는 돌연변이 CG타아제 유전자의 제조방법에 있어서, 출발 CG타아제를 엔코딩하는 유전자의 DNA배열을 그 자체 공지된 돌연변이 생성방법에 의해 돌연변이시켜, 그 돌연변이 유전자의 DNA배열에 의해 엔코딩한 아미노산은 아미노산위치 155와 아미노산위치 195사이의 영역에서 4-8개의 아미노산잔기의 결실에 의해 돌연변이가 없는 유전자의 DNA에 의해 엔코딩한 아미노산 배열과 달리함을 특징으로 하는 제조방법.
- 제2항에 있어서, 출발 CG타아제를 엔코딩하는 유전자의 DNA배열을 그 자체 공지된 돌연변이 생성방법에 의해 돌연변이시켜, 그 돌연변이 유전자의 DNA배열에 의해 엔코디이한 아미노산은 아미노산위치 155와 아미노산위치 195사이의 영역에서 6개의 아미노산잔기의 결실에 의해 돌연변이가 없는 유전자의 DNA에 의해 엔코딩을 한 아미노산 배열과 달리함을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항의 CG타아제를 엔코딩하는 DNA배열.
- 감마-CG타아제의 제조방법에 있어서, 최소한 하나의 제4항에 의한 DNA배열을 미생물에서 발현시킴을 특징으로 하는 제조방법.
- CG타아제를 사용하여 전분을 전환시켜 감마-CD를 제조하는 방법에 있어서, 제1항 최소한 하나의 CG타아제를 CG타아제로서 사용함을 특징으로 하는 방법.
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