CN107254497A - 海洋微生物酶法制备α‑环糊精响应面设计方法及应用 - Google Patents

海洋微生物酶法制备α‑环糊精响应面设计方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及海洋微生物酶法制备α‑环糊精响应面设计方法及应用,属于海洋微生物酶领域。具体包括酶法转化的底物种类、底物浓度、来源于海洋微生物菌株Y112的α‑环糊精葡萄糖基转移酶添加量、转化温度、反应时间和反应pH,以及通过响应面法获得的最优制备方法。最优条件为:马铃薯淀粉浓度为5%,加酶量200u/g(淀粉),pH值为8.4,温度30摄氏度,转速200转每分钟,反应6小时。该条件下α‑环糊精转化率可以达到28.67%。所述方法去掉了有机溶剂正癸醇的应用,同时保证了转化效率,且该方法工艺简单,快速效果好,用来转化淀粉制备α‑环糊精有效、可靠、经济。

Description

海洋微生物酶法制备α-环糊精响应面设计方法及应用
技术领域
本发明涉及海洋微生物酶领域,特别是涉及海洋微生物菌株Y112产生的α-环糊精葡萄糖基转移酶转化淀粉制备α-环糊精的响应面设计优化方法及应用。
背景技术
环糊精(CD)是一类环状低聚糖。一般常见的有α-、β-和γ-环糊精,分别由6,7,8个D-吡喃葡萄糖单元,以α-1,4糖苷键首尾相连而成。环糊精可以包埋众多的形状各异和适当大小的疏水性客体分子,进而改变它们的稳定性、溶解度、挥发性及化学反应性能等理化性质。环糊精的化学性质均比较稳定,α-环糊精在体内的代谢作用最慢且无毒。环糊精在药品、食品、化妆品、环保、工业和农业等领域都有良好的应用前景,而且作为一种新型的膳食纤维逐渐走入人们的视野。
环糊精的制备主要有两种方法:化学合成法和生物酶转化法,化学合成法因为过程复杂等原因已经被淘汰,而生物酶转化法的主要原理是利用环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)作用于淀粉或者底物生成环糊精。CGTases酶能催化转糖基化反应,包括环化,耦合,歧化和水解反应,是一种多功能酶。大多数的CGTase生成的都是多种环糊精的混合体。Bharat等利用来自肺炎克雷伯菌AS-22分泌的CGTase酶生产α-环糊精,当CGTase作用于溶解性较好的糊精时,转化率只能达到10.9%。Duan等以15%(W/V)马铃薯淀粉为底物,每克底物同时加入10U的α-CGTase和48U的异淀粉酶,加入5%的环化反应促进剂正癸醇,温度30℃,pH 5.6,反应24h后CD的总产量达到84.6%(w/w),比单独使用α-CGTase的转化率提高了31.2%,其中α-CD、β-CD、γ-CD的重量比1.00:0.05:0.01,这是所知的同时使用α-CGTase和异淀粉酶转化CD的第一份报告,也是迄今为止环糊精生产效率最高的报道。随着近年来的不断研究,CD和CGTase的应用越来越广泛,但高成本和低产量依然是制约其应用的关键问题,因此继续研究提高环糊精产率的方法仍具有重要的意义。本发明对来自海洋芽孢杆菌Y112生产的α-CGTase生产α-环糊精的条件进行了优化,使得α-环糊精的产量达到较高水平。
发明专利“海洋α-环糊精葡萄糖基转移酶转化淀粉制备α-环糊精的方法”(专利申请号201610959716.3)公开了α-环糊精葡萄糖基转移酶转化淀粉制备α-环糊精的方法,但所述方法中添加了有机溶剂正癸醇,而这一有机溶剂在食品应用中存在一定的限制。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种海洋微生物酶法转化淀粉生成α-环糊精响应面设计优化方法及应用,本发明是在所述专利(专利申请号201610959716.3)方法的基础上进行了部分反应条件的优化;所述方法对淀粉比例,反应温度,反应时间,酶添加量,特别是使用响应面设计优化技术进行了条件的优化试验,去掉了有机溶剂正癸醇的添加,同时保证了转化效率。
本发明是通过如下技术方案来实现的:
一种海洋微生物酶法转化淀粉生成α-环糊精响应面设计优化方法,所述方法为确定影响α-环糊精葡萄糖基转移酶转化淀粉生成α-环糊精的主要影响因子为底物浓度、温度和pH,以此3个因素为自变量,每个因素选择3个水平,以转化率为响应值,做3因素3水平共17个试验点、5个中心点的二次回归正交组合试验,对试验结果进行响应面分析,经过二次回归拟合后,得到转化率对底物浓度A、温度B和pH C的二次多项回归方程为:Y=+28.58-0.91A+0.28B-0.83C+0.012AB+0.57AC-0.13BC-1.30A2-2.30B2-2.76C2,利用软件分析得到最大响应值时A、B、C对应的值即为最佳实验条件。
进一步,通过上述响应面设计优化出最佳条件为:淀粉种类为马铃薯淀粉,淀粉浓度为5%(W/V),海洋微生物菌株Y112产生的α-环糊精葡萄糖基转移酶添加量为每克淀粉200u,pH值为8.4,温度30摄氏度,转速每分钟200转,反应6小时。该条件下α-环糊精转化率为28.67%。
本发明还提供一种利用上述方法进行α-环糊精的酶法制备方法,其特征在于包括下列步骤:
⑴取浓度为5%(W/V)的马铃薯淀粉,加热溶解至100mL水溶液;
⑵取步骤⑴的淀粉水溶液冷却至30℃,调整pH为8.4后,添加海洋微生物菌株Y112产生的α-环糊精葡萄糖基转移酶于淀粉水溶液中,添加比例为200U/g淀粉;
⑶取步骤⑵的酶淀粉水溶液置于振荡器进行反应,振荡器转速为每分钟200转,反应时间为6小时,既得α-环糊精水溶液。
本发明与现有技术相比的有益效果:
本发明通过转化淀粉生成α-环糊精响应面设计优化方法,得到转化率对底物浓度A、温度B和pH C的二次多项回归方程为:Y=+28.58-0.91A+0.28B-0.83C+0.012AB+0.57AC-0.13BC-1.30A2-2.30B2-2.76C2,利用软件分析得到最佳实验条件。利用所述实验条件对α-环糊精葡萄糖基转移酶转化淀粉生成α-环糊精,获得了较高的α-环糊精转化率,可以达到28.67%,所述方法去掉了有机溶剂正癸醇的应用,且该方法工艺简单,快速效果好,用来转化淀粉制备α-环糊精有效、可靠、经济。
附图说明
图1底物种类对α-环糊精转化率的影响;
图2底物浓度对环糊精转化率的影响;
图3α-环糊精的转化率随着加酶量的增加的变化趋势;
图4不同的温度对转化率的影响;
图5不同作用时间对α-环糊精转化率的影响;
图6不同pH对α-环糊精转化率的影响;
具体实施方式
下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案作进一步解释,但本发的保护范围不受实施例任何形式上限制。
实施例
一种海洋微生物酶法转化淀粉生成α-环糊精响应面设计优化方法,具体方法如下:
⑴底物种类:取5%浓度的玉米淀粉、马铃薯淀粉、麦芽糊精和可溶性淀粉溶液各100mL加热溶解,待冷却后,温度30℃,pH值为9,加酶量200U/g淀粉,200r/min,6h取出煮沸灭活测α-CD产量。底物种类对α-环糊精转化率的影响如附图1所示。由图中可以看出,可溶性淀粉的环糊精转化率最高,麦芽糊精的转化率最低。马铃薯淀粉的转化率略低于可溶性淀粉。马铃薯淀粉的价格比较低,使得生产环糊精的成本降低,因此马铃薯淀粉在此试验是适合生产环糊精的底物。
⑵底物浓度:分别取3%、5%、8%、10%、15%、20%浓度的马铃薯淀粉溶液各100mL加热溶解,待冷却后,温度30℃,pH值为9,加酶量200U/g淀粉,200r/min,6h取出煮沸灭活测α-CD产量。底物浓度对环糊精转化率的影响如附图2所示。由图可以看出当淀粉浓度5%时,α-环糊精的转化率为25.9%,当淀粉浓度升到10%时,α-环糊精的转化率和5%时相比下降50%,两者相差较大,继续增大底物浓度,转化率降低越明显。相反底物浓度越小,环糊精转化率越高,但是成本升高,总的产量过低,综合考虑,选用5%的马铃薯淀粉作为生产α-环糊精的淀粉浓度。
⑶加酶量:5%浓度的马铃薯淀粉溶液100mL,温度为30℃,pH值为9,分别加入100、150、200、250、300U/g马铃薯淀粉的α-CGTase进行反应,200rpm摇床反应6h后灭活测α-CD产量。在一定范围内,α-环糊精的转化率随着加酶量的增加呈现先上升后下降的趋势,见附图3。当加酶量在200u/g时,转化率达到最高。
⑷反应温度:5%浓度的马铃薯淀粉溶液100mL、pH值为9、加酶量200U/g马铃薯淀粉、分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃反应,200r/min摇床反应6h后煮沸灭活测定α-CD产量。从附图4可以看出,不同的温度对转化率的影响比较明显,转化率在30℃时最高,之后随着温度的继续升高,α-环糊精的转化率降低幅度增大。该酶的最适反应温度是55℃,在40℃以下稳定,高于50℃对酶活影响较大,与试验结果基本保持一致,在不失活的状态下,30℃时最有利于α-环糊精的生产。
⑸作用时间:5%浓度的马铃薯淀粉溶液100mL加热溶解,待冷却后,温度为30℃,pH值为9,加酶量为200U/g马铃薯淀粉,200r/min,反应分别进行1、2、4、6、8、10、12、24h后煮沸灭活测定α-CD产量。由附图5可知,α-环糊精转化率达到最高点的时间为6h,继续增加反应时间,转化率并没有增高,反而有明显的降低趋势。随着反应时间的加长,酶的其他作用增强,造成α-环糊精的分解。另一方面,反应时间的减少,更有利于节约成本。
⑹作用pH:5%浓度的马铃薯淀粉溶液100mL、温度30℃、加酶量200U/g马铃薯淀粉、分别在pH值为6、7、8、9、10条件下反应,200r/min摇床反应6h后煮沸灭活,测定α-CD产量。结果(见附图6)显示,初始pH值为9时,转化率最高,此时即为α-环糊精转化的最适反应pH。
⑺响应面实验设计与分析
根据单因素试验,确定影响酶转化淀粉生成α-环糊精的主要影响因子为底物浓度、温度和pH。以此3个因素为自变量,每个因素又选择3个水平,以转化率为响应值,做3因素3水平共17个试验点(5个中心点)二次回归正交组合试验。试验设计及结果见表1。对表1中试验结果进行响应面分析,经过二次回归拟合后,得到转化率对底物浓度(A)、温度(B)和pH(C)的二次多项回归方程为:Y=+28.58-0.91A+0.28B-0.83C+0.012AB+0.57AC-0.13BC-1.30A2-2.30B2-2.76C2
表1 Box-Behnken实验设计及结果
利用Design-Expert8.06软件对试验结果进行多元回归拟合(表2),发现该模型是显著的,F值为506.71表示仅有0.01%的可能是由噪音引起的,其中A、B、C、AC、A2、B2、C2的P值均小于0.05是显著模型项,失拟F值为0.96(P=0.4921)表示该模型的失拟不显著,因此该模型是合适的。方程的R2等于0.9985,说明α-环糊精转化率的实测值与预测值的拟合度较好,该模型能较好的解释环糊精产率的变化。F值越大,表明影响因子对实验指标的影响越大。由方差分析表可得出,FA=369.36,FC=303.67,FB=33.64,即各因素对产物制备的影响程度大小顺序为底物浓度>pH>温度。
表2回归模型系数的显著性
注:“**”表示极显著(p<0.01)
软件分析得到最大响应值(产量)时A、B、C对应的最佳实验条件为:底物浓度为4.61、温度30.2℃、pH8.40,反应时间6h,α-环糊精最大预测转化率为28.84%。按照试验筛选出的最佳条件,为方便实验操作,在底物浓度5%,温度30℃,pH8.40,加酶量200U/g,反应6h条件下进行反应,实际转化率为28.67%与理论值接近。
本实施例所用到的α-CGTase酶活力的测定方法:取4g水溶性淀粉,用配制好的pH8.5的0.2mol/L的NaOH-甘氨酸缓冲液100mL(现用现配)溶解并进行加热糊化作为底物,待其冷却后取0.9mL液体在试管中,放入50℃水浴锅中预热5min,然后加入适当稀释倍数的粗酶液0.1mL混合均匀,50℃水浴准确反应4min,取出迅速加入1mL盐酸溶液(1mol/L)终止反应,最后加入4mL稀释4倍的甲基橙溶液,混匀,室温静置20min。对照组为取底物0.9mL于试管中,预热5min。随实验组一起放入水浴反应4min后,加入1mL盐酸溶液混合均匀后再加入与实验组相同的粗酶液,其它处理与实验组相同。最后用分光光度计在507nm下测定实验组与对照组的吸光度。酶活定义为一个单位上述条件下生成1μgα-环糊精所需要的酶量。
本实施例所用到的α-环糊精含量测定方法:取一支试管,分别加入1ml梯度浓度的α-环糊精标准溶液和1ml1mol/L的盐酸,再加入4ml稀释4倍的甲基橙溶液于试管中,摇匀,室温静置20min,在507nm处测吸光度。其中,空白不含α-环糊精,其余操作相同。以环糊精浓度为横坐标,吸光度差值为纵坐标,绘制标准曲线。吸光度差值(△OD)=空白溶液吸光度-样品吸光度。将待测溶液按照上述步骤进行测定,根据标准曲线计算得到α-环糊精的浓度,然后得出α-环糊精的含量值。

Claims (3)

1.一种海洋微生物酶法转化淀粉生成α-环糊精响应面设计优化方法,其特征在于所述方法为确定影响α-环糊精葡萄糖基转移酶转化淀粉生成α-环糊精的主要影响因子为底物浓度、温度和pH,以此3个因素为自变量,每个因素又选择3个水平,以转化率为响应值,做3因素3水平共17个试验点、5个中心点的二次回归正交组合试验,对试验结果进行响应面分析,经过二次回归拟合后,得到转化率对底物浓度A、温度B和pH C的二次多项回归方程为:Y=+28.58-0.91A+0.28B-0.83C+0.012AB+0.57AC-0.13BC-1.30A2-2.30B2-2.76C2,利用软件分析得到最大响应值时A、B、C对应的值即为最佳实验条件。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于通过上述响应面设计优化出最佳条件为:淀粉种类为马铃薯淀粉,淀粉浓度为5%,海洋微生物菌株Y112产生的α-环糊精葡萄糖基转移酶添加量为200u/g淀粉,pH值为8.4,温度30摄氏度,转速每分钟200转,反应6小时。
3.一种权利要求2所述方法进行α-环糊精的酶法制备方法,其特征在于包括下列步骤:
⑴取浓度为5%(W/V)的马铃薯淀粉,加热溶解至100mL水溶液;
⑵取步骤⑴的淀粉水溶液冷却至30℃,调整pH为8.4后,添加海洋微生物菌株Y112产生的α-环糊精葡萄糖基转移酶于淀粉水溶液中,添加比例为200U/g淀粉;
⑶取步骤⑵的酶淀粉水溶液置于振荡器进行反应,振荡器转速为每分钟200转,反应时间为6小时,既得α-环糊精水溶液。
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