CN104593453B - 一种提高酶法制备β‑环糊精得率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高酶法制备β‑环糊精得率的方法，属于环糊精生产技术领域。本发明配制10～30％的淀粉乳或麦芽糊精溶液作为酶反应底物，经适当预处理后，调节pH值为4～7，加入环糊精葡萄糖基转移酶，并添加活性酵母和氮源，控制反应温度为30～37℃，充分反应12～24h。相比于不加酵母的生产方法，本发明通过添加酵母大幅度提高了β‑环糊精的得率。本发明不额外添加有机溶剂，反应过程无毒害无污染，无有毒试剂残留，且操作简单，生产成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高酶法制备β-环糊精得率的方法，属于环糊精生产技术领域。
背景技术
环糊精是由D-吡喃葡萄糖通过α-1,4-糖苷键连接而成的环状化合物，其中以6、7和8个葡萄糖单元所构成的α-、β-和γ-环糊精最为常见。环糊精能与许多疏水性分子形成包合物，从而改变它们的理化性质，因此，在食品、医药、化工、农业等领域中有着广泛的应用。α、β和γ三种环糊精均为白色晶体粉末，其中β-环糊精的水溶解度最低，因此它易于结晶和提纯，因此目前工业上生产和广泛应用的是β-环糊精。
环糊精的工业化生产主要采用酶法工艺，即在环糊精葡萄糖基转移酶催化作用下通过环化反应转化淀粉所合成，一般采用两种方式：非控制过程和控制过程。这两种工艺的主要区别是，非控制过程的酶反应体系中不添加有机溶剂作为复合剂，而控制过程的反应体系中添加有机溶剂作为复合剂。有机溶剂的添加虽可降低产物抑制，增加环糊精得率，但由于其具有毒性和危险性，在一定程度上限制了环糊精的工业应用。
本发明在反应体系中添加酵母，在酵母生长过程可以利用酶反应所产生的葡萄糖，并产生乙醇，反应体系中葡萄糖含量的减少可以在一定程度上抑制环糊精葡萄糖基转移酶的偶合反应，乙醇的产生能促进其环化反应，从而提高β-环糊精的得率。
发明内容
本发明目的是提供一种提高酶法制备β-环糊精得率的方法，是在β-环糊精的制备过程中添加活性酵母和氮源，本发明工艺流程简单，不额外添加任何有机溶剂作为复合剂，所添加的活性酵母和氮源安全无污染。
本发明采用的技术方案在于配制10～30％的淀粉乳或麦芽糊精溶液作为酶反应底物，经适当预处理后，调节pH值为4～7，加入环糊精葡萄糖基转移酶，并添加活性酵母和氮源，控制反应温度为30～37℃，充分反应12～24h。
在本发明的一种实施方式中，所述酶反应底物主要为玉米淀粉、蜡质玉米淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、大米淀粉或小麦淀粉中的一种或它们的组合，或是上述淀粉来源的DE值为2～30的麦芽糊精。
在本发明的一种实施方式中，以淀粉为底物时，所述预处理是用α-淀粉酶或CGT酶在80～100℃下液化30～60min，120℃过热蒸汽使酶失活。α-淀粉酶用量1～12U/g干淀粉，CGT酶用量为1～10U/g干淀粉。
在本发明的一种实施方式中，所用的底物为麦芽糊精时，所述预处理是在80～100℃下加热15～30min。
在本发明的一种实施方式中，所述活性酵母为酿酒酵母，接种量为0.5-3％(v/v)。
所述酿酒酵母在加入到反应体系前经过活化。所述活化所使用的活化培养基配方可以是：葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉3g/L、KH2PO41g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，将1g待活化的干酵母加入到19ml上述已灭菌的培养基中，在37℃、200r/min的摇床内活化30～45min。
在本发明的一种实施方式中，加入反应体系中的氮源为尿素、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、硝酸盐、铵盐中的一种或它们的组合。
在本发明的一种实施方式中，氮源添加量为5-10g/L。
本发明中所用的CGT酶为主产β-环糊精的β-CGT酶，用量为1～10U/g干淀粉。
本发明中所用反应体系的pH值控制在4～7，由于pH对CGT酶催化活力的影响较大，所以反应pH值与酶最适pH值接近，同时要考虑酵母的生长。
本发明通过添加酿酒酵母明显提高环糊精的得率，与现有技术相比，不额外添加有机溶剂，反应过程无毒害无污染，无有毒试剂残留，且操作简单，生产成本低。
具体实施方式
环糊精得率的测定及计算方法：将反应液煮沸灭酶10min，加入10μL糖化酶(100U/mL)糖化30min，煮沸灭酶。将反应液10000r/min离心并取上清液，经0.45μm超滤膜过滤后经高效液相色谱法(HPLC)测定环糊精的浓度。HPLC测定条件为：Waters 600高效液相色谱仪(配示差折光检测器)，色谱柱Lichrosorb NH2(4.6mm×150mm)，流动相采用68％的乙腈水溶液，柱温为30℃，流速为1mL/min。环糊精得率为实际环糊精浓度与理论最大环糊精浓度的比值。
实施例1未添加酵母的生产方法和添加酵母及尿素后的β-环糊精得率的比较。
CGT酶环化活力的测定方法：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用10mM磷酸缓冲液(pH 6.5)配制的1％(w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，加入3.5mL 30mM NaOH和0.5mL由5mM Na2CO3溶液配制的0.02％(w/v)酚酞溶液反应，在室温下保温15min，在550nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolβ-环糊精所需的酶量。
酵母活化方法：将1g待活化的干酵母加入到19ml已灭菌的培养基(葡萄糖，20g/L；蛋白胨，5g/L；酵母粉，3g/L；KH2PO4，1g/L；MgSO4·7H2O，0.5g/L)中，在37℃、200r/min的摇床内活化30min。
未添加酵母的生产方法，其具体过程为：调制15％的麦芽糊精(DE 5)溶液，在沸水浴中加热15min，冷却至室温后，按照1U/ml的加酶量添加来源于环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)STB01的β-CGT酶，调节pH至6.0，在温度为37℃下充分反应24h。
添加酵母的生产方法，其具体过程为：调制15％的麦芽糊精(DE 5)溶液，在沸水浴中加热15min，冷却至室温后，按照1U/ml的加酶量添加上述CGT酶，再添加10μl/ml酵母和5mg/ml尿素。调节pH至6.0，在温度为37℃下充分反应24h。
结果见表1，相比于不添加酵母的生产工艺，添加酵母能明显增加β-环糊精得率，提高比例达到88％。
表1：两种生产方法β-环糊精得率的比较
实施例2未添加酵母的生产方法和添加酵母及酵母粉后的β-环糊精得率的比较。
CGT酶环化活力的测定方法：取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用10mM磷酸缓冲液(pH 6.5)配制的1％(w/v)麦芽糊精(DE＝5)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，加入3.5mL 30mM NaOH和0.5mL由5mM Na2CO3溶液配制的0.02％(w/v)酚酞溶液反应，在室温下保温15min，在550nm下测定吸光度。以失活的酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolβ-环糊精所需的酶量。
酵母活化方法：将1g待活化的干酵母加入到19ml已灭菌的培养基(葡萄糖，20g/L；蛋白胨，5g/L；酵母粉，3g/L；KH2PO4，1g/L；MgSO4·7H2O，0.5g/L)中，在37℃、200r/min的摇床内活化30min。
未添加酵母的生产方法，其具体过程为：调制15％的麦芽糊精(DE 5)溶液，在沸水浴中加热15min，冷却至室温后，按照1U/ml的加酶量添加来源于环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)STB01的β-CGT酶，调节pH至6.0，在温度为37℃下充分反应24h。
添加酵母的生产方法，其具体过程为：调制15％的麦芽糊精(DE 5)溶液，在沸水浴中加热15min，冷却至室温后，按照1.5U/ml的加酶量添加上述CGT酶，再添加10μl/ml酵母和10mg/ml酵母粉。调节pH至6.0，在温度为37℃下充分反应24h。
结果见表2，相比于不添加酵母的生产工艺，添加酵母能明显增加β-环糊精得率，提高比例达到123％。
表2：两种生产方法β-环糊精得率的比较
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种提高酶法制备β-环糊精得率的方法，其特征在于，配制10～30％的淀粉乳或麦芽糊精溶液作为酶反应底物，预处理后，调节pH值为4～7，加入环糊精葡萄糖基转移酶，并添加活性酵母和氮源，控制反应温度为30～37℃，反应12～24h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶反应底物淀粉乳为玉米淀粉乳、木薯淀粉乳、马铃薯淀粉乳、大米淀粉乳或小麦淀粉乳中的一种或它们的组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述麦芽糊精是来源于玉米淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、大米淀粉或小麦淀粉中的一种或它们的组合的DE值为2～30的麦芽糊精。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理为对底物进行液化处理。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所用的底物为淀粉乳时，所述预处理是用α-淀粉酶或CGT酶在80～100℃下液化处理30～60min。
6.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所用的底物为麦芽糊精溶液时，所述预处理是在80～100℃下加热15～30min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为1～10U/g干淀粉或麦芽糊精。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性酵母是酿酒酵母，接种量为0.5-3％。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氮源为尿素、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、硝酸盐、铵盐中的一种或它们的组合。
10.根据权利要求1或9所述的方法，其特征在于，所述氮源的添加量为5-10g/L。
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