CN107828835A - 一种海洋微生物酶法制备aa‑2g的方法 - Google Patents

一种海洋微生物酶法制备aa‑2g的方法 Download PDF

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刘均忠
孙晶晶
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Abstract

本发明涉及一种海洋微生物酶法制备AA‑2G的方法，属于海洋微生物酶领域。具体包括酶法转化的底物配比、底物浓度、来源于海洋微生物菌株Y112的α‑环糊精葡萄糖基转移酶添加量、转化温度、反应时间和反应pH，以及通过响应面法获得的最优制备方法。最优条件为：反应pH 9.07，反应时间24小时，加酶量90.78U/gβ‑环糊精，底物配比1:1，底物浓度为56.81g/L，该条件下2‑氧‑α‑D‑葡萄糖基‑L‑抗坏血酸达到最高产量为10.67g/L。所述方法工艺简单，快速效果好，用来转化L‑抗坏血酸制备2‑氧‑α‑D‑葡萄糖基‑L‑抗坏血酸有效、可靠、经济。

Description

一种海洋微生物酶法制备AA-2G的方法
技术领域
本发明涉及海洋微生物酶领域，特别是涉及一种海洋微生物菌株Y112产生的α-环糊精葡萄糖基转移酶转化L-抗坏血酸制备AA-2G的方法。
背景技术
L-抗坏血酸(L-ascorbic acid，L-AA)又名维生素C(VC)，是一种人体不可缺少的营养素，人体自身无法合成VC，必须从食物中获得。VC在多种生理活动中均起到重要作用，如胶原蛋白合成、改善脂肪代谢、提高免疫力等。VC的应用非常广泛，可应用于食品、化妆品、医药领域等。在食品领域，VC常被用作食品添加剂，有利于保持食品良好的感官品质、防止其中的组分被氧化。近年来研究发现VC对人类白血病细胞、恶性黑色素瘤细胞及其他肿瘤细胞有细胞毒性，对于癌症病人可起到辅助治疗的作用且安全无风险。此外VC能够抑制黑色素的形成，与维生素E协同可起到良好的光保护作用，显著减轻因紫外线照射引起的皮肤炎症、色素沉着。然而，VC分子结构中具有特殊的连烯二醇结构，容易被氧化失去生理活性，限制了它在各领域中的应用。
2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)是VC和葡萄糖基利用糖基转移酶的转糖基作用形成的缩合物，葡萄糖基以α-1,4糖苷键接于L-抗坏血酸的C2上，取代了原有的羟基。由于葡萄糖基的掩蔽作用，AA-2G不易氧化降解，在各种水溶液中均有良好的稳定性，是一种良好的VC替代品。
AA-2G的用途广泛，可应用在化妆品、食品、医疗保健等领域。最常见的是在化妆品领域的应用，它的美白效果显著，可以直接排出表皮层中已经形成的黑色素，作为一种附加成分已被投入商业化妆品的生产中。AA-2G能够有效地促进成纤维细胞合成胶原蛋白，缓解细胞氧化及细胞衰老，因而在维持皮肤弹性和延缓皮肤衰老方面起到重要作用。由于AA-2G进入人体后在可被缓慢分解成VC与D-葡萄糖，能持续提供VC，因此可添加到食品及饮品中作为抗氧化剂、VC补充剂等。在医疗保健方面，AA-2G能够促进B细胞分化成浆细胞，延缓其死亡时间，加强B细胞在体液免疫中的作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种海洋微生物酶法制备AA-2G的方法。本发明方法利用海洋微生物菌株Y112产的环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)转化VC合成AA-2G，通过优化反应条件,使AA-2G产量达到较高水平。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种海洋微生物酶法制备AA-2G的方法，其特征在于包括下列步骤：
⑴在VC和β-CD混合液中加入Na2SO3作为抗氧化剂，其中混合液中VC和β-CD质量比为1：1，VC和β-CD的浓度均为56.81g/L，抗氧化剂的浓度为10％(g/ml)；
⑵取步骤⑴的水溶液调整pH为9后，添加海洋微生物菌株Y112产生的α-CGTase于水溶液中，添加量为90U/gβ-CD；
⑶取步骤⑵的水溶液置于振荡器进行反应，温度设定为35℃，反应时间为24小时，既得AA-2G水溶液。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明通过转化VC制备AA-2G响应面设计优化方法，得到AA-2G产量对酶添加量A、反应体系pH B和底物浓度C二次多项回归方程为：Y＝10.25-0.99A-0.41B+2.06C-0.90AB+0.74AC+1.60BC-2.18A2-2.02B2-3.01C2，利用软件分析得到最大响应值时A、B、C对应的值即为最佳实验条件。利用所述实验条件对α-CGTase转化VC制备AA-2G，获得了较高的AA-2G产量，可以达到10.67g/L，该方法工艺简单，快速效果好，用来转化VC制备AA-2G有效、可靠、经济。
附图说明
图1转化时间对合成AA-2G的影响；
图2温度对合成AA-2G的影响；
图3pH对合成AA-2G的影响；
图4底物浓度对合成AA-2G的影响；
图5底物配比对合成AA-2G的影响；
图6加酶量对合成AA-2G的影响；
具体实施方式
下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发的保护范围不受实施例任何形式上限制。
实施例
一种筛选影响海洋微生物酶法制备2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的方法，具体方法如下：
⑴转化时间单因素实验：在反应容器中加入终浓度均为50g/L的VC和β-CD各1mL作为底物，以及0.2gNa2SO3作为抗氧化剂，调节pH至9，按照100U/gβ-CD的比例加入α-CGTase，在35℃，pH9，150r/min的条件下，分别反应6h，12h，18h，24h，36h，42h，48h。
⑵转化温度单因素实验：在反应容器中加入终浓度均为50g/L的VC和β-CD各1mL作为底物，以及0.2gNa2SO3作为抗氧化剂，调节pH至9，按照100U/gβ-CD的比例加入α-CGTase，在150r/min的条件下反应24h，温度分别设为15℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃。
⑶pH单因素实验：在反应容器中加入终浓度均为50g/L的VC和β-CD各1mL作为底物，以及0.2gNa2SO3作为抗氧化剂，调节pH分别至4，5，6，7，8，9，10，11，按照100U/gβ-CD的比例加入α-CGTase，在35℃、150r/min的条件下反应24h。
⑷底物浓度单因素实验：在反应容器中加入0.2gNa2SO3作为抗氧化剂，终浓度相同的VC和β-CD各1mL作为底物，浓度分别设置为10，20，30，40，50g/L，调节pH至9，按照100U/gβ-CD的比例加入α-CGTase，在35℃、150r/min的条件下反应24h。
⑸底物配比单因素实验：反应总体系为2mL，分别按照1:4，2:3，1:1，3:2，4:1的体积比例在反应容器中加入初始浓度均为100g/L的VC和β-CD作为底物，以及0.2gNa2SO3作为抗氧化剂，调节pH至9，按照100U/gβ-CD的比例加入α-CGTase，在35℃、150r/min的条件下反应24h。
⑹加酶量单因素实验：在反应容器中加入终浓度均为50g/L的VC和β-CD各1mL作为底物，以及0.2gNa2SO3作为抗氧化剂，调节pH至9，分别按照0，50，100，150，200，250，300U/gβ-CD的比例加入α-CGTase，在35℃、150r/min的条件下反应24h。
⑺响应面实验设计与分析
在单因素实验的基础上，通过Plackett-Burman实验对转化时间、转化温度、pH、底物浓度、底物配比、加酶量6个因素进行筛选，从中选出对酶法合成AA-2G具有显著影响的因素，采Design-Expert.8.0.6软件进行实验设计及结果分析。试验设计及结果见表1。对表1中试验结果进行响应面分析，经过二次回归拟合后，得到AA-2G产量对酶添加量A、反应体系pH B和底物浓度C的二次多项回归方程为：Y＝10.25-0.99A-0.41B+2.06C-0.90AB+0.74AC+1.60BC-2.18A2-2.02B2-3.01C2。
表1 Box-Behnken实验设计及结果
用Design-Expert V8.0.6数据分析软件对数据进行回归分析，分析结果见表2，P值<0.0001，说明该模型是显著的，失拟项P＝0.1273>0.05，表明该模型的失拟向不显著。方程的R2＝0.9769，说明表明模型拟合度较好，能较好的预测AA-2G产量变化。
表2回归模型系数的显著性
对回归方程进行分析，得到理论上的最优条件组合：加酶量90.78U/gβ-CD，pH9.07，底物浓度为56.81g/L，该条件下AA-2G达到最高产量为10.67g/L。为操作简便，将最终反应条件定为加酶量90U/gβ-CD，pH 9，底物浓度60g/L，在此条件下进行验证实验，三次实验的平均AA-2G生成量为9.86g/L，与模型预测值基本吻合，这能够有效说明该实验选用的模型是合理的。
本实施例所用到的α-CGTase酶活力的测定方法：实验组用0.2mol/L的NaOH-甘氨酸缓冲液(pH 8.5)配制4％(w/v)可溶性淀粉液做为底物，取0.9mL底物于试管中，50℃水浴预热5min，然后加入适当稀释倍数的酶液0.1mL混合均匀，50℃水浴准确反应10min，再加入1mL盐酸溶液(1mol/L)终止反应，最后加入4mL甲基橙溶液(8mg/L)混匀，室温静置20min。对照组取底物0.9mL于试管中，50℃水浴预热5min。随实验组一起50℃水浴反应10min，加入1mL盐酸溶液混合均匀后再加入与实验组相同的酶液，其它处理与实验组相同。最后用紫外分光光度计在507nm下测定实验组与对照组的吸光度。酶活定义为1个单位上述条件下1分钟生成1μgα-环糊精所需要的酶量。
本实施例所用到的AA-2G含量测定方法采用高效液相色谱法测定，其HPLC条件如下：检测波长254nm，流动相为20mmol/L稀磷酸，流速0.8mL/min，柱温35℃。用超纯水配制浓度为：250mg/L、500mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L、3000mg/L的AA-2G标准液，通过HPLC分析，以峰面积为横坐标，AA-2G浓度为纵坐标，制作AA-2G的标准曲线。将待测溶液按照上述步骤进行测定，根据标准曲线计算得到AA-2G的浓度，然后得出AA-2G的含量值。

Claims (1)

1.一种海洋微生物酶法制备AA-2G的方法，其特征在于它包括下列步骤：
⑴在VC和β-CD混合液中加入Na2SO3作为抗氧化剂，其中混合液中VC和β-CD质量比为1：1，VC和β-CD的浓度均为56.81g/L，抗氧化剂的浓度为10％(g/ml)；
⑵取步骤⑴的水溶液调整pH为9后，添加海洋微生物菌株Y112产生的α-CGTase于水溶液中，添加量为90U/gβ-CD；
⑶取步骤⑵的水溶液置于振荡器进行反应，温度设定为35℃，反应时间为24小时，既得AA-2G水溶液。
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