JPH06296487A - 高アルカリ性プロテアーゼ、該プロテアーゼの洗浄−、清浄化および食器洗いの組成物のためにコードしているｄｎａ配列および高アルカリ性プロテアーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 改善された性質を有する新規の高アルカリ性
プロテアーゼ並びに該プロテアーゼのために必要なＤＮ
Ａ配列、ベクターおよび形質転換された微生物。 【構成】 本発明の高アルカリ性プロテアーゼは、図
１、図２および図３に記載されたアミノ酸配列に対する
同族体少なくとも８０％を有し、前記アミノ酸配列と、
図１、図２および図３の４２、４３、１１４、２１６、
２４９の位置の２つ、３つ、４つまたは５つで異なるか
またはこれに対して相同の位置で異なるようなアミノ酸
配列を有し、この場合、４２の位置に存在するアミノ酸
がアルギニンに対して交換されており、４３の位置に存
在するアミノ酸がグルタミンに対して交換されており、
１１４の位置に存在するアミノ酸がアルギニンに対して
交換されており、２１６の位置に存在するアミノ酸がセ
リン、グルタミンまたはアラニンに対して交換されてお
り、２４９の位置に存在するアミノ酸がグルタミン酸に
対して交換されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、改善された高アルカリ
性プロテアーゼに関するものであり、この高アルカリ性
プロテアーゼの場合、意図された突然変異によって変化
させられており、かつ前記の改善されたプロテアーゼの
ためにコードしているＤＮＡ配列上および前記ＤＮＡ配
列を有するベクター上で特定のアミノ酸が交換されてい
る。同様に、本発明は、前記ベクターで形質転換された
微生物、最適にされた高アルカリ性プロテアーゼの製造
法並びに前記の改善されたプロテアーゼを含有する洗剤
に関する。

【０００２】

【従来の技術】高アルカリ性プロテアーゼは、該プロテ
アーゼがタンパク質含有の汚染物質を除去するので、殊
に洗剤工業において、有利に使用される重要な工業製品
である。有効性を有するためには、前記プロテアーゼ
は、洗浄条件下（ｐＨ値、温度）でのタンパク質分解活
性を有するばかりではなく、その上更に、別の洗剤成分
と、即ち、別の酵素、界面活性剤、骨格物質（Ｇｅｒｕ
ｅｓｔｓｔｏｆｆ）（ビルダー）、漂白剤、漂白剤活性
物質および別の添加剤および助剤との組合せ物と相容
性、即ち、前記洗剤成分に抗して十分に安定性であり、
かつ前駆物質の存在下で十分な有効性を有していなけれ
ばならない。

【０００３】高アルカリ性プロテアーゼは、特異性酵素
であり、微生物の培養、殊に、例えばバシラス アルカ
ロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌ
ｕｓ）のような、望ましい高アルカリ性プロテアーゼを
生産し、培地中に排出され、その培地から、プロテアー
ゼを単離することができるようなバシラス種（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ Ｓｐｅｚｉｅｓ）の培養によって取得され
る。前記の高アルカリ性プロテアーゼは、高アルカリ性
プロテアーゼがバシルス種、殊に例えば枯草菌（Ｂ．ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリクファシエンス（Ｂ．
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）およびＢ．リヘ
ニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の培養
によって取得することができるような通常の高アルカリ
性プロテアーゼとは相違する。

【０００４】公知技術水準の場合、多数の天然のアルカ
リ性プロテアーゼおよび天然の高アルカリ性プロテアー
ゼ並びに人工的（遺伝子工学的）に変化したアルカリ性
プロテアーゼおよび天然の高アルカリ性プロテアーゼ
は、公知である。従って、例えば国際出願番号ＷＯ ９
１／００３４５号、および欧州特許第３２８２２９号明
細書および同第４１５２９６号明細書には、アミノ酸配
列が意図された突然変異（点突然変異）によって多数の
位置で変化させられたプロテアーゼが記載されている。

【０００５】それにもかかわらず、更に、該プロテアー
ゼの洗浄効率または安定性の点で改善された性質を示す
ような新規の、更に最適にされた高アルカリ性プロテア
ーゼの必要性がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、更に改善された性質を有する新規の高アルカリ性プ
ロテアーゼ並びに該プロテアーゼのために必要なＤＮＡ
配列、ベクターおよび形質転換された微生物を提供する
ことである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】前記の課題は、本発明に
よる高アルカリ性プロテアーゼ、本来のＤＮＡ配列、ベ
クターおよび形質転換された微生物並びに前記プロテア
ーゼの製造のための本発明による方法によって解決され
る。

【０００８】本発明は、高アルカリ性プロテアーゼに関
するものであり、該プロテアーゼは、図１、図２および
図３に記載されたアミノ酸配列に対する同族体少なくと
も８０％を有し、前記アミノ酸配列と、図１、図２およ
び図３の４２、４３、１１４、２１６、２４９の位置の
２つ、３つ、４つまたは５つで異なるかまたはこれに対
して相同の位置で異なるようなアミノ酸配列を有し、こ
の場合、４２の位置に存在するアミノ酸がアルギニンに
対して交換されており、４３の位置に存在するアミノ酸
がグルタミンに対して交換されており、１１４の位置に
存在するアミノ酸がアルギニンに対して交換されてお
り、２１６の位置に存在するアミノ酸がセリン、グルタ
ミンまたはアラニンに対して交換されており、２４９の
位置に存在するアミノ酸がグルタミン酸に対して交換さ
れていることによって特徴付けられる。

【０００９】前記の高アルカリ性プロテアーゼは、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、公知の
分子量を有する対照タンパク質（Ｒｅｆｅｒｅｎｚｐｒ
ｏｔｅｉｎ）と比較して測定された分子量２６０００〜
２８０００ｇ／モルを有する。該プロテアーゼのｐＨ最
適値は、大部分、８〜１２．５の範囲内であり、この場
合、ｐＨ最適値とは、プロテアーゼが最大のタンパク質
分解活性を有するようなｐＨ範囲のことである。本発明
によるプロテアーゼは、良好なｐＨ安定性を有する。

【００１０】本発明の１つの詳細は実施態様の場合、ア
ミノ酸配列が、図１、図２および図３のアミノ酸配列に
対する同族体９０％以上、殊に９５％以上を有するよう
なプロテアーゼが存在する。この場合、図１、図２およ
び図３に記載されたアミノ酸配列に対する同族体とは、
図１、図２および図３に記載されたアミノ酸配列に対し
て、当該のアミノ酸配列の構造的に極めて密接な類縁物
（Ｖｅｒｗａｎｄｔｓｃｈａｆｔ）のことである。この
同族体の決定のために、それぞれ、図１、図２および図
３のアミノ酸配列と、この図１、図２および図３のアミ
ノ酸配列と比較すべきアミノ酸配列との相互の構造的に
相応する部分を、最大の構造の一致がこれらのアミノ酸
配列の間に存在するような程度に、互いに一致させ、こ
の場合、個々のアミノ酸の欠失または挿入によって引き
起こされた相違が考慮され、かつ配列部分の相応する転
位（Ｖｅｒｓｃｈｉｅｂｕｎｇ）によって均衡される。
この場合、図１、図２および図３の配列中に含まれるア
ミノ酸の総数に対して、配列の中で互いに一致するアミ
ノ酸（“相同の位置”）の数は、％での同族体を示す。
配列中での相違は、アミノ酸の変異、挿入並びに欠失に
よって制限することができる。相応して、図１、図２お
よび図３に関連して記載されたアミノ酸の位置は、図
１、図２および図３に対して少なくとも８０％まで相同
のプロテアーゼから取得された本発明による高アルカリ
性プロテアーゼの場合、該プロテアーゼに対して相同の
位置で関連する。図１、図２および図３に対して相同の
プロテアーゼの場合の欠失または挿入は、アミノ酸の位
置の相対的な転位を生じ、その結果、互いに相同のアミ
ノ酸配列の相同の部分で、互いに相応するアミノ酸の位
置の数字の符号は、同一である必要はない。

【００１１】本発明による高アルカリ性プロテアーゼの
場合、交換位置に当初から存在するアミノ酸は、特定の
別のアミノ酸に対して交換されていなければならない。
従って、４２の位置に存在するアミノ酸はアルギニンに
対して交換されており、４３の位置に存在するアミノ酸
はグルタミンに対して交換されており、１１４の位置に
存在するアミノ酸はアルギニンに対して交換されてお
り、２１６の位置に存在するアミノ酸はセリン、グルタ
ミンまたはアラニンに対して交換されており、っかつ２
４９の位置に存在するアミノ酸はグルタミン酸に対して
交換されている。この場合、当初交換位置に存在するア
ミノ酸は、記載された位置の２つ、３つ、４つまたは５
つ、有利に２つまたは３つで交換されることができる。
従って、本発明によるプロテアーゼは、図１、図２およ
び図３に記載された位置またはこれに相同の位置に対し
て、アミノ酸交換体Ｎ４２Ｒ、Ｉ４３Ｑ、Ｎ１１４Ｒ、
Ｔ２４９Ｅ、Ｍ２１６ＳまたはＭ２１６ＱまたはＭ２１
６Ａの２つ、３つ、４つまたは５つを有する。この場
合、変異の表示のために、自体常用の命名法が使用され
る。アミノ酸は、一文字コードによって表示され、この
場合、当初のアミノ酸は、位置の記載の前に置かれ、か
つ導入されたアミノ酸は、位置の記載の後に置かれる。

【００１２】有利に、本発明の高アルカリ性プロテアー
ゼは、２１６の位置に存在するアミノ酸がセリン、グル
タミンまたはアラニンに対して交換されており、４３の
位置に存在するアミノ酸はグルタミンに対して交換され
ているかまたは１１４の位置に存在するアミノ酸がアル
ギニンに対して交換されているかまたは２４９の位置に
存在するアミノ酸がグルタミン酸に対して交換されてい
るようなアミノ酸配列を有する。従って、図１、図２お
よび図３に記載されたかまたはこれに対して相同の位置
に関連して、本発明によるプロテアーゼは、アミノ酸交
換体Ｍ２１６ＳまたはＭ２１６ＱまたはＭ２１６Ａおよ
びＩ４３ＱまたはＮ１１４ＲまたはＴ２４９Ｅを有す
る。

【００１３】更に有利に、本発明による高アルカリ性プ
ロテアーゼは、２１６の位置に存在するアミノ酸がセリ
ン、グルタミンまたはアラニンに対して交換されてお
り、１１４の位置に存在するアミノ酸がアルギニンに対
して交換されており、かつ４２の位置に存在するアミノ
酸がアルギニンに対して交換されているかまたは４３の
位置に存在するアミノ酸がグルタミンに対して交換され
ているようなアミノ酸配列を有する。従って、図１、図
２および図３に記載されているかまたはこれに対して相
同の位置に関連して、本発明によるプロテアーゼは、２
つのアミノ酸交換体Ｍ２１６ＳまたはＭ２１６Ｑまたは
Ｍ２１６ＡおよびＮ４２ＲまたはＩ４３Ｑを有する。

【００１４】更に有利に、本発明による高アルカリ性プ
ロテアーゼは、４２の位置に存在するアミノ酸がグルタ
ミンに対して交換されており、２４９の位置に存在する
アミノ酸はグルタミン酸に対して交換されており、かつ
１１４の位置に存在するアミノ酸がアルギニンに対して
交換されているかまたは２１６の位置に存在するアミノ
酸がセリン、グルタミンまたはアラニンに対して交換さ
れているようなアミノ酸配列を有する。従って、図１、
図２および図３に記載された位置またはこれに対して相
同の位置に関連して、本発明によるプロテアーゼは、３
つのアミノ酸交換体Ｉ４３ＱおよびＴ２４９ＥおよびＮ
１１４ＲまたはＭ２１６ＳまたはＭ２１６ＱまたはＭ２
１６Ａを有する。

【００１５】もう１つの有利な実施態様は、４３の位置
に存在するアミノ酸がグルタミンに対して交換されてお
り、１１４の位置に存在するアミノ酸はアルギニンに対
して交換されており、２４９の位置に存在するアミノ酸
はグルタミン酸に対して交換されており、かつ２１６の
位置に存在するアミノ酸はセリン、グルタミンまたはア
ラニンに対して交換されているようなアミノ酸配列を有
する本発明による高アルカリ性プロテアーゼに関する。
従って、図１、図２および図３に記載された位置または
これに対して相同の位置に関連して、本発明によるプロ
テアーゼは、４つのアミノ酸交換体Ｉ４３Ｑ、Ｎ１１４
Ｒ、Ｔ２４９ＥおよびＭ２１６ＳまたはＭ２１６Ｑまた
はＭ２１６Ａを有する。

【００１６】本発明による高アルカリ性プロテアーゼの
アミノ酸配列の場合の前記の有利な交換体組合せ物のう
ちでは、２１６の位置に存在するアミノ酸がグルタミン
に対して交換されているようなものが特に有利である。
図１、図２および図３に記載された位置またはこれに対
して相同の位置に関連して、このことは、本発明による
プロテアーゼの配列の場合に、１つのアミノ酸交換体Ｍ
２１６Ｑを表わす。

【００１７】もう１つの特に有利な実施態様の場合、本
発明による高アルカリ性プロテアーゼは、１１４の位置
に存在するアミノ酸がアルギニンに対して交換されてお
り、かつ４３の位置に存在するアミノ酸がグルタミンに
対して交換されているかまたは２４９の位置に存在する
アミノ酸がグルタミン酸に対して交換されているような
アミノ酸配列を有する。従って、図１、図２および図３
に記載されたかまたはこれに対して相同の位置に関連し
て、本発明によるプロテアーゼは、２つのアミノ酸交換
体Ｎ１１４ＲおよびＩ４３ＱまたはＴ２４９Ｅを有す
る。

【００１８】本発明による高アルカリ性プロテアーゼ
は、その洗浄効率およびその貯蔵安定性において、前記
の位置で、アミノ酸が、それぞれの位置のために記載さ
れたアミノ酸に対して交換されなかったプロテアーゼを
明らかに凌駕している。この場合、ちょうど、アミノ酸
配列の前記の位置への記載された特定のアミノ酸の組合
せ物を用いて、出発プロテアーゼと比べて性質の点で著
しい改善を達成させることができることは驚異的であ
り、この場合、驚異的なことにプラスの作用が記載され
たアミノ酸交換体の組合せ物中で達成される。

【００１９】本発明によるプロテアーゼの取得のために
は、当該のプロテアーゼのためにコードしている構造遺
伝子を有する発現ベクターで形質転換された微生物が培
養される。

【００２０】従って、本発明は、高アルカリ性プロテア
ーゼのために上記のアミノ酸配列でコードしているＤＮ
Ａ配列も包含する。

【００２１】本発明によるＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列
が、図１、図２および図３に記載されたアミノ酸配列に
対する同族体少なくとも８０％を有し、前記アミノ酸配
列と、図１、図２および図３の４２、４３、１１４、２
１６、２４９の位置の２つ、３つ、４つまたは５つかま
たはこれに対して相同の位置で、当該の位置での交換の
場合に、４２の位置に存在するアミノ酸がアルギニンに
対して交換されており、４３の位置に存在するアミノ酸
がグルタミンに対して交換されており、１１４の位置に
存在するアミノ酸がアルギニンに対して交換されてお
り、２１６の位置に存在するアミノ酸がセリン、グルタ
ミンまたはアラニンに対して交換されており、２４９の
位置に存在するアミノ酸がグルタミン酸に対して交換さ
れていることによって異なるようなアミノ酸配列を有す
る高アルカリ性プロテアーゼのためにコードしているこ
とによって顕著である。

【００２２】アミノ酸配列が、図１、図２および図３の
アミノ酸配列に対する同族体９０％以上、殊に９５％以
上を有し、かつ記載された位置の２つ、３つ、４つまた
は５つが交換されているような高アルカリ性プロテアー
ゼのためにコードしているような本発明のＤＮＡ配列
は、有利である。本発明によるＤＮＡ配列は、殊に、図
１、図２および図３の位置またはこれに対して相同の位
置に関連した該ＤＮＡ配列中で、上記のアミノ酸交換体
を有するプロテアーゼのためにコードすることができ
る。

【００２３】更に、本発明は、本発明による高アルカリ
性プロテアーゼの少なくとも１つを含有するい洗浄用組
成物および清浄化用組成物を包含する。この種の洗剤お
よび清浄化剤は、例えば衛生または食品分野での表面の
清浄化のために使用することができる。有利に、本発明
によるプロテアーゼは、編織布または食器の清浄化のた
めの洗剤調製物中で使用される。前記の使用目的のため
に、本発明は、使用すべき高アルカリ性プロテアーゼの
特別に必要とされた性質（洗浄効率、温度安定性、別の
成分との相容性）に応じて、それぞれ特殊な洗剤調製物
に特に公的な本発明によるプロテアーゼが選択できるよ
うな、個々の既に知られたプロテアーゼと比べて改善さ
れた性質、殊に改善された洗浄効率および／または改善
された酵素安定性を有する新規の高アルカリ性プロテア
ーゼの群を提供する。本発明によるプロテアーゼは、洗
剤調製物中、例えば粉末洗剤、固形洗剤または液体洗剤
中で、別個にかまたは望ましい場合には、互いに組合せ
て使用することができ、場合によっては公知技術水準の
洗剤プロテアーゼまたは別の自体常用の洗剤用酵素（Ｗ
ａｓｃｈｍｉｔｔｅｌｅｎｚｙｍｅｎ）、例えばアミラ
ーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、ヌクレアーゼ、オキシ
ドレダクターゼ等と組合せても使用することができる。
本発明によるプロテアーゼは、洗剤調製物中で、洗剤用
酵素のために自体常用の量、殊に（全組成物の乾燥物質
に対して）５重量％までの量、有利に０．２〜１．５重
量％の量で使用される。

【００２４】既に記載した洗剤用酵素以外に、本発明の
洗剤は、界面活性剤、漂白剤またはビルダー物質（骨格
物質）のような全ての公知技術水準で自体常用の洗剤内
容物並びに他の常用の助剤を、洗剤の調製のために、自
体常用の量で含有することができる。この助剤には、例
えば増強剤、酵素安定化剤、汚れ運搬体（Ｓｃｈｍｕｔ
ｚｔｒａｅｇｅｒ）および／または相容化剤（Ｋｏｍｐ
ａｔｉｂｉｌｉｓｉｅｒｕｎｇｓｍｉｔｔｅｌ）、錯形
成剤およびキレート形成剤、石鹸発泡調整剤（Ｓｅｉｆ
ｅｎｓｃｈａｕｍｒｅｇｕｌａｔｏｒ）および光学漂白
剤、蛍光増白剤、混濁剤、腐食防止剤、静電気防止剤、
染料、殺菌剤、漂白剤活性化剤、過酸漂白剤前駆物質の
ような添加剤が属する。

【００２５】こうして、本発明による洗剤調製物は、乾
燥物質に対して、 ａ）界面活性剤または界面活性剤混合物、少なくとも１
重量％、 ｂ）ビルダーまたはビルダー混合物４０重量％まで、 ｃ）漂白剤または漂白剤混合物、有利にペルオクソホウ
酸ナトリウム−四水和物、ペルオクソホウ酸ナトリウム
−一水和物またはペルオクソ炭酸ナトリウムのようなペ
ルオクソホウ酸塩４０重量％まで、 ｄ）少なくとも１つの本発明によるプロテアーゼ３重量
％までおよび ｅ）他の成分、例えば助剤等、１００重量％になるまで
の典型的な例示的組成で得られた。

【００２６】本発明によるプロテアーゼは、例えば常法
では機械的食器洗浄に使用されるような粉末状の食器清
浄化剤にも特に良好に適している。

【００２７】粉末状の洗剤組成物は、自体常法で調製す
ることができる。本発明によるプロテアーゼは、該洗剤
調製物に、例えば粉末または固形洗剤中で、顆粒、小球
またはペレットの形で、場合によってはまた表面被覆を
設けていてもよく、洗剤調製物の別の成分と、自体公知
の方法で混合することができる。

【００２８】本発明によるプロテアーゼは、その改善さ
れた安定性に基づいて、極めて良好に液体洗剤中で使用
することができる。

【００２９】本発明は、更に、出発プロテアーゼの図
１、図２および図３に記載されたアミノ酸配列に対する
同族体少なくとも８０％を有し、前記アミノ酸配列と、
図１、図２および図３の４２、４３、１１４、２１６、
２４９の位置の２つ、３つ、４つまたは５つで異なり、
この場合、４２の位置に存在するアミノ酸がアルギニン
に対して交換されており、４３の位置に存在するアミノ
酸がグルタミンに対して交換されており、１１４の位置
に存在するアミノ酸がアルギニンに対して交換されてお
り、２１６の位置に存在するアミノ酸がセリン、グルタ
ミンまたはアラニンに対して交換されており、２４９の
位置に存在するアミノ酸がグルタミン酸に対して交換さ
れているようなアミノ酸配列のためにコードしているＤ
ＮＡ配列を有するベクターを有する形質転換された微生
物を用いて本発明により最適にされた高アルカリ性プロ
テアーゼの製造法を包含する。形質転換された微生物が
培養され、かつこの培地から改善された高アルカリ性プ
ロテアーゼが単離される。

【００３０】製造方法で使用された微生物を得るため
に、 ａ）まず、図１、図２および図３のアミノ酸配列に対す
る同族体少なくとも８０％、有利に９０％以上、殊に９
５％以上を有するアミノ酸配列を有する高アルカリ性プ
ロテアーゼを生産するような適当な細菌から、プロテア
ーゼのためにコードしているＤＮＡ配列（例えば、プロ
テアーゼの構造遺伝子）を単離し、 ｂ）前記ＤＮＡ配列のヌクレオチド順序を定め、 ｃ）公知のＤＮＡ配列中で、変異したＤＮＡ配列が、原
プロテアーゼ（Ｕｒｓｐｒｕｎｇｓｐｒｏｔｅａｓｅ）
のアミノ酸中で、前記の位置で、当該の位置のために記
載されたアミノ酸に対して交換されているような高アル
カリ性プロテアーゼのために、コードしているような突
然変異（点突然変異）を生じさせ、 ｄ）次に、変異したＤＮＡ配列を用いて発現ベクターを
生じさせ、 ｅ）得られた発現ベクターを、最終的に、変異した高ア
ルカリ性プロテアーゼの製造のために使用することがで
きるような適当な微生物中で形質転換させるように進行
させることができる。

【００３１】図１、図２および図３に記載されたアミノ
酸配列に対する同族体少なくとも８０％を有する高アル
カリ性プロテアーゼのアミノ酸配列のためにコードして
いる構造遺伝子は、自体公知の方法により得ることがで
きる。これについては、例えば細菌（“供与菌”）、殊
に、高アルカリ性プロテアーゼを生産するバシラス種か
ら、染色体ＤＮＡが単離され、かつ適当な制限エンドヌ
クレアーゼを用いて部分的に加水分解される。

【００３２】供与ＤＮＡの得られた制限フラグメント
を、例えばゲル電気泳動によって大きさに応じて分離
し、次に、望ましい大きさのフラグメントを適当なベク
ターＤＮＡを用いて組換えることができる。好ましく
は、ベクターとして、プラスミドが使用され、このプラ
スミドを用いて、使用された宿主生物（Ｗｉｒｔｓｏｒ
ｇａｎｉｓｍｕｓ）中に導入された異種ＤＮＡの発現が
可能である。

【００３３】試験管内で組換えＤＮＡ（ベクター＋供与
ＤＮＡの制限フラグメント）を用いて、細菌、好ましく
はバシラス種を形質転換し、かつこの形質転換体を、ベ
クターＤＮＡの公知の標識の性質（Ｍａｒｋｅｒｅｉｇ
ｅｎｓｃｈａｆｔ）（例えば、ネオマイシン耐性）によ
り選択することができる。こうして得られた形質転換体
の内で、増殖し、高アルカリ性プロテアーゼを排出する
ものを、タンパク質含有の平板上で試験し、その後で、
単離することができる。この種のクローンから、最終的
に前記の形質転換体中で導入されたプラスミドＤＮＡが
単離される。引続き、出発プロテアーゼの構造遺伝子お
よび供与ＤＮＡ配列からの付加的なＤＮＡ配列を包含す
るようなプラスミドが、得られたＤＮＡフラグメントを
ゲル電気泳動によって大きさに応じて分離し、見出され
た結合型に基づいて制限地図（Ｒｅｓｔｒｉｋｔｉｏｎ
ｓｋａｒｔｅ）を生じる若干の種々の制限エンドヌクレ
アーゼを用いて切断（制限）される。プラスミドの制限
地図の知識は、選択された制限エンドヌクレアーゼを用
いる切断によって、本質的に、前単位および後単位に属
する高アルカリ性プロテアーゼのための構造遺伝子並び
に遺伝子発現に必要なプロモーター単位を包含するよう
なＤＮＡフラグメントを供与ＤＮＡ配列から切り出せる
ようにする。

【００３４】適当なベクター中への、前記の大きさの減
少した供与ＤＮＡ配列の再組込によって、細菌、殊にバ
シラス種を前記ベクターで形質転換させ、得られた形質
転換体を培養し、かつプロテアーゼ活性を検査すること
によって、高アルカリ性出発プロテアーゼの発現のため
の能力を検査することができるような新規の複製可能な
ベクターを得ることができる。名称ｐＣＬＥＡＮ４を有
するこの種の還元ベクターの例は、図４の制限地図が再
現している。

【００３５】プロテアーゼ構造遺伝子の配列化のために
は、まず、前記のベクターが適当な微生物中で複製さ
れ、引続き、プロテアーゼが単離される。前記構造遺伝
子は、直ちに、ＤＮＡ配列化のために一般に知られた方
法により配列化される（例えば、ＭａｘａｍおよびＧｉ
ｌｂｅｒｔの方法、１９８０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ Ｌ．、Ｍ
ｏｌｄａｖｅ Ｋ．、出版社、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ Ｉｎｃ．、ニューヨークおよびロンドン、第６
５巻、第４９９頁またはＳａｎｇｅｒおよびＢｒｏｗｎ
ｌｅｅによるＤｉｄｅｏｘｙ−Ｋｅｔｔｅｎｔｅｒｍｉ
ｎａｔｏｒ−Ｍｅｔｈｏｄｅ、１９７７年、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第７４巻：５４
７３）。

【００３６】求められたヌクレオチド配列は、遺伝子コ
ードを用いて、プロテアーゼのアミノ酸配列中に翻訳す
ることができる。

【００３７】本発明によれば、プロテアーゼのためにコ
ードしているＤＮＡ配列は、図１、図２および図３のア
ミノ酸配列の４２、４３、１１４、２１６、２４９の位
置の２つ、３つ、４つまたは５つ、好ましくは２つまた
は３つでかまたはこれに相同の位置の１つで、当該のア
ミノ酸が前記のアミノ酸の１つに対して交換されている
ようなアミノ酸配列を有する変異したＤＮＡ配列が最適
にされた高アルカリ性プロテアーゼのためにコードして
いる方法で相応するコドンの交換によって突然変異され
る。

【００３８】高アルカリ性プロテアーゼのためにコード
しているＤＮＡ中への点突然変異の導入は、意図された
突然変異誘発（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｅ）のための公知方
法によって実施される。これについて、適当なベクター
（ファージェミド（Ｐｈａｇｅｍｉｄｅ））、例えば図
６のｐＣＬＭＵＴＮ１または図７のｐＣＬＭＵＴＣ１か
ら、場合によってはヘルパーファージの助力下に、全て
の、プロテアーゼのためにコードしているＤＮＡ配列ま
たは突然変異が行われなければならないような好ましく
はＤＮＡ配列だけを有する環状一本鎖ＤＮＡが得られ
る。前記の環状一本鎖ＤＮＡを用いて、望ましい点突然
変異部位で、それぞれの位置のために既に記載されたア
ミノ酸の１つ、例えば１１４の位置のアルギニンのため
に添付されたコドンがコードしているような程度に選択
されているヌクレオチド成分を有するような合成の、ハ
イブリッド化可能なオリゴヌクレオチドをハイブリッド
化する。付加的に、オリゴヌクレオチドは、ハイブリッ
ド化すべき、元のヌクレオチド配列に対して、更に、元
のアミノ酸配列のコーディングは、確かに、遺伝子的コ
ードの縮重の範囲内に留まるが、しかしながら、元のヌ
クレオチド配列中では、場合によっては存在する制限位
置が、合成オリゴヌクレオチド中で除去されるかもしく
はもう１つの制限位置が合成オリゴヌクレオチド中に導
入されるような程度に、１つまたは若干の僅かに異なる
ヌクレオチド配列によって変化している。除去されたか
もしくは導入された制限位置は、後に、適当な制限エン
ドヌクレアーゼを用いて、出発型のＤＮＡ配列に対して
変異したＤＮＡ配列の同定に有用である。１つの変法の
場合、意図された突然変異誘発の方法の場合に、ウラシ
ル化した一本鎖ＤＮＡがマトリックスとして得られ、合
成オリゴヌクレオチドのハイブリット化のために使用さ
れる。意図された突然変異誘発の方法の反応の終結後
に、ウラシル含有ＤＮＡ一本鎖は、変異したＤＮＡ鎖
（ベクター）を得るためのマトリックスとして有用であ
り、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを用いる処理によっ
て、突然変異体の表現型の選択を必要とせずに除去する
ことができる。グリコシラーゼ処理は、単離した酵素お
よびウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ活性を有する、変異
したベクターＤＮＡで形質転換した適当な微生物を用い
て実施することができる。

【００３９】次に、完全な二本鎖のための、ハイブリッ
ド化によって得られた部分的な二本鎖ＤＮＡ配列の補充
は、必要とされたヌクレオチドの添加によって、かつＤ
ＮＡ−ポリメラーゼおよびＤＮＡ−リガーゼの作用下に
実施される。この後、得られた環状、二本鎖ＤＮＡ配列
は、ベクターとして、適当な微生物中へ形質転換され
る。引続き、変異したＤＮＡ配列は、統一の制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位を介して同定され、かつ形質転換
体から単離される。ウラシル化した一本鎖ＤＮＡが使用
される場合には、複製は、例えば好ましくは変異方法で
得られた二本鎖ベクターの変異した、ウラシル化してい
ないＤＮＡ鎖を増殖する大腸菌菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｓ
ｔａｍｍ）中で行われる。このことによって、変異した
ＤＮＡベクターの選択は、付加的に容易にされる。

【００４０】意図された突然変異誘発のために必要とさ
れた合成オリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により
得られる（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．および
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ Ｍ．Ｈ、１９８１年、Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ 第２２巻：第１８５９
〜１８６２頁）。

【００４１】意図された突然変異誘発によって得られ
た、導入された突然変異を有する、環状二本鎖ＤＮＡ配
列は、変異したベクターを製出し、このベクターから、
適当な制限エンドヌクレアーゼを用いる処理によって、
場合により、全部の変異したプロテアーゼ構造遺伝子ま
たはプロテアーゼ構造遺伝子の変異した部分を切り出す
ことができ、適当な発現ベクター中へ組込むこと（サブ
クローニング）ができる。次に、前記表現ベクターを用
いて、適当な微生物、例えばバシラス種は、形質転換さ
れ、次に、変異した高アルカリ性プロテアーゼの発現お
よび取得のために、適当な条件下で培養される。

【００４２】本発明の有利な実施態様の場合、全部の構
造遺伝子が、意図された突然変異誘発のために使用され
るのではなく、突然変異が発生しなければならないのと
同じ部分だけが使用される。このためには、構造遺伝子
の複製に有用であるベクターから、例えば構造遺伝子の
Ｎ−末端またはＣ−末端の半分が、適当な制限エンドヌ
クレアーゼを用いて切り出され、かつ適切なファージェ
ミド中でサブクローニングされる。構造遺伝子のＮ−末
端またはＣ−末端の半分を有し、かつ適当な微生物中、
例えば大腸菌中で、まず、十分に複製され、次に、上記
の意図された突然変異誘発が行われるようなベクターが
得られる。構造遺伝子のＤＮＡ部分突然変異誘発は、よ
り短い一本鎖ＤＮＡ配列を使用することができ、ひいて
は合成オリゴヌクレオチドを用いるハイブリッド化工程
後に、部分的なＤＮＡ二本鎖中で、全部のＤＮＡ配列の
使用の場合よりも本質的に少ないヌクレオチドが補充さ
れるという利点を有する。このことによって、合成によ
る消耗および付加的に望ましくない偶発的突然変異の危
険が減少される。

【００４３】変異したＤＮＡ配列は、変異を生じるのに
有用なベクターから、適当な制限エンドヌクレアーゼに
よって切り出すことができ、かつ相応する制限部位中
に、有するベクターを組込むことができ、本来の、高ア
ルカリ性プロテアーゼの発現のために必要とされる発現
ベクターの前駆物質を製出することができる。前記ベク
ターは、該ベクターが適当な制限部位の外で（例えば、
合成リンカーから）、既に、プロテアーゼ発現のために
宿主生物中で必要とされた調節配列、シグナル配列、プ
ロモーター配列およびプロテアーゼの前単位および後単
位（Ｐｒｅ−ｕｎｄ Ｐｒｏｅｉｎｈｅｉｔｅｎ）のた
めにコードしているＤＮＡ配列をも有するような程度に
構成さている。

【００４４】この種のベクター中の変異したＤＮＡ配列
のサブクローニングによって、最適にされた高アルカリ
性プロテアーゼのための本来の発現ベクターが得られ
る。発現ベクターの前記前駆物質中の変異したＤＮＡ配
列の構成は、適当な読み取りラスター（Ｌｅｓｅｒａｓ
ｔｅｒ）を有する発現ベクターが生じるような程度に行
われる。この場合、プロテアーゼのためにコードしてい
るＤＮＡ配列の変異した部分、例えばＣ−末端またはＮ
−末端部分は、既に、それぞれ残りの変異していないか
場合によってはまた変異した（数回の突然変異の発生）
部分を有するベクター中へ組込まれてもよいか；または
まだ前記のプロテアーゼ−ＤＮＡ−配列の部分を有して
いないベクター中の全部の、プロテアーゼのためにコー
ドしている変異したＤＮＡ配列が組込まれる。この種
の、既にプロテアーゼ遺伝子の部分を有する発現ベクタ
ーの前駆物質ベクターの例は、名称ｐＡＬ１Ｎおよびｐ
ＡＬ１Ｃを有するベクターであり、その制限地図は、図
１１もしくは図１２で再現されている。

【００４５】本発明の有利な変法のための発現ベクター
の前駆物質（Ｎ末端の半分またはＣ末端の半分での突然
変異）は、例えばバシラスプラスミド（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ−Ｐｌａｓｍｉｄ）を、適当な部位で制限し、マーカ
ーおよび複製のために重要な配列部分を有する大腸菌プ
ラスミドフラグメント（Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｐｌａｓｍｉｄ
ｆｒａｇｍｅｎｔ）を用いて組換ることができる。引続
き、場合によっては、後の処理工程を阻害することにな
るような制限部位は、例えば意図された突然変異誘発に
よって除去される。こうして得られたプラスミドから、
バシラスプラスミドおよび大腸菌プラスミドから複製に
有用なＤＮＡ配列、プロモーターのためのＤＮＡ配列、
（例えば、図４のプラスミドｐＣＬＥＡＮ４得られた）
プロテアーゼの前−後配列（ｐｒｅ−ｐｒｏｓｅｑｕｅ
ｎｚ）のためにコードしているＤＮＡ配列および合成リ
ンカーを有する新規のベクターが構成される。名称ｐＡ
Ｌ１Ｐを有するこの種のプラスミドの例は、図９の制限
地図が再現している。この場合、この合成リンカーは、
適当な制限エンドヌクレアーゼを用いる切断後に、ベク
ターが、熟成プロテアーゼのためにコードしている全部
の本来のまたは変異したＤＮＡ配列もしくは構造遺伝子
の変異したかまたは変異していない部分と組合わせるこ
とができるような程度に選択されている。例えば、構造
遺伝子の変異したＮ−末端の半分を用いて組換えられな
ければならない発現ベクターの前駆物質の製造のために
は、プロテアーゼの記載されたバシラス配列、大腸菌配
列、プロモーター配列および前配列および後配列並びに
合成リンカーを有する前記の組換ベクター中へ、合成リ
ンカーの切断によって、例えば、まず、構造遺伝子の変
異していないかまたは場合によってはまた既に変異した
Ｃ−末端の半分が導入される。引続き、合成リンカーの
再度の切断によって、プロテアーゼ構造遺伝子の、なお
欠落している、変異したＮ−末端の半分が導入される。
こうして、図１０のｐＡＬ１ＮＣ型のベクターが得られ
る。同様のことは、反対の場合にも当てはまる。つま
り、まず、変異していないかまたは場合によってはまた
既に変異したＮ−末端の半分が、ベクター中に導入さ
れ、こうして得られたベクター中に、後に変異したＣ−
末端の半分が組込まれ、この場合、同様に、図１０のｐ
ＡＬ１ＮＣ型のベクターが得られる。

【００４６】上記の発現ベクターを用いて、適当な細
菌、好ましくはバシラス種、殊に枯草菌、Ｂ．リヘニホ
ルミスまたはＢ．アルカロフィラスは、形質転換され
る。引続き、この形質転換体は、自体公知の方法で培養
され、形成された高アルカリ性プロテアーゼは、培地か
ら単離される。このために、該発現ベクターは、更に固
有プロテアーゼ（Ｅｉｇｅｎｐｒｏｔｅａｓｅ）を形成
する能力がある細菌およびプロテアーゼ欠失細菌（固有
プロテアーゼをもはや形成しない）中で形質転換させる
ことができる。固有プロテアーゼ形成を有する宿主生物
の場合、本発明による高アルカリ性プロテアーゼは、望
ましい場合には、引続く清浄化活動（Ｒｅｉｎｉｇｕｎ
ｇｓｏｐｅｒａｔｉｏｎｅｎ）、例えば高速液体クロマ
トグラフィー処理（ＨＰＬＣ）によって、形成された固
有プロテアーゼから除去することができる。それに対し
て、この種の清浄化工程は、プロテアーゼ欠失宿主生物
の場合に、前記宿主生物が、本発明によるプロテアーゼ
のみ（または本質的にはこれだけのみ）を形成すること
ができるので不用にすることができる。

【００４７】以下の実施例は、本発明を詳細に説明する
ものであるが、本発明は、それによって制限されるもの
ではない。

【００４８】別記しない限り、一般に、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ他（Ｍａｎｉａｔｉｓ他＝．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ．
Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２年）に記載されて
いるような方法により作業した。

【００４９】本明細書で使用した出発ベクターは、市販
されており、無制限に使用可能であるか；または該出発
ベクターは、自体公知の方法により、使用可能なベクタ
ーから得ることができる。

【００５０】例１で使用されかつバシラスアルカロフィ
ラスＨＡ１として知られたバシルスアルカロフィラス菌
株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ−Ｓ
ｔａｍｍ）は、ドイッチェン ザンムルング フォン
ミクロオルガニスメン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｓａｍｍ
ｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）
（ＤＳＭ）で、ＤＳＭナンバー５４６６で、１９８９年
７月２８日に寄託されている。

【００５１】

【実施例】

例 １： Ｂ．アルカロフィラスからのゲノムＤＮＡライブラリー
の製造および高アルカリ性出発プロテアーゼのための遺
伝子の単離 天然分離片バシラスアルカロフィラスＨＡ１（ドイッチ
ェン ザンムルングフォン ミクロオルガニスメンでＤ
ＳＭ５４６６の番号で寄託されている）から、サイトウ
（Ｓａｉｔｏ）他（１９６３年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．第７２巻：第６１９〜６２９
頁）の方法により、染色体ＤＮＡを単離し、かつ制限エ
ンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａを用いて、部分的に加水分
解した。この制限フラグメントを、電気泳動によってア
ガロースゲル上で分離し、かつこのフラグメントを３〜
８キロベース（ＫＢ）の大きさで単離した。

【００５２】バシラスアルカロフィラスＨＡ１からの単
離されかつ大きさ選択されたＤＮＡフラグメントを、プ
ラスミドｐＵＢ１１０（例７に記載されたのと同様にし
て取得）のベクターＤＮＡと、試験管内で組み合わせ
た。

【００５３】このために、プラスミドｐＵＢ１１０を、
まず、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで制限し、引
続き、子牛の腸からのアルカリ性ホスファターゼで脱リ
ン酸化した。引続き、制限されかつ脱リン酸化されたベ
クターＤＮＡ２μｇを、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを有する
１００μｌの全体容量中のバシラスアルカロフィラスＤ
ＮＡフラグメント８μｇと一緒に、２４時間１６℃で培
養した。

【００５４】得られた試験管内で新たに組合せられたＤ
ＮＡを用いて、枯草菌ＢＤ２２４菌株のプロトプラスト
を、Ｓ．ＣｈａｎｇおよびＮ．Ｃｏｈｅｎによって記載
された方法（１９７９年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．第１６８巻：第１１１〜１１５頁）により形質転換
した。この形質転換体を、平板上で、ネオマイシンを用
いて選択し、引続き、脱脂乳寒天上に移した。１３８０
０の試験した形質転換体に、脱脂乳寒天のタンパク質分
解によって明らかにより大きなかさ（Ｈｏｆ）を形成し
たものが見出された。前記のクローンから、プラスミド
−ＤＮＡが、Ｍａｎｉａｔｉｓ他により単離された。前
記プラスミド中に含まれた、Ｂ．アルカロフィラス−Ｄ
ＮＡからのクローン化したフラグメントは、４．１ＫＢ
の大きさを有し、バシラスアルカロフィラスＨＡ１から
の高アルカリ性プロテアーゼのための完全な情報を有し
ていた。

【００５５】更に、方法の簡略化のために、４．１ＫＢ
の大きさのＤＮＡフラグメントを、縮小させた。このた
めに、制限エンドヌクレアーゼのためのＤＮＡフラグメ
ント上に存在する認識部位を、種々の制限エンドヌクレ
アーゼを用いるプラスミドの切断および制限されたＤＮ
Ａのフラグメントの、寒天ゲル上での電気泳動による分
離によって除去した。２．３ＫＢの大きさの、制限エン
ドヌクレアーゼＡｖａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる
切断によって得られる、高アルカリ性プロテアーゼのた
めの完全な情報を有し、他の方法のために使用されたよ
うなＤＮＡフラグメントを除去した。このために、４．
１ＫＢフラグメントを有する上記プラスミドを、制限エ
ンドヌクレアーゼＡｖａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用い
て制限した。２．３ＫＢの大きさのＤＮＡフラグメント
を単離し、予め同様にＡｖａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを
用いて切断しておいたベクターｐＵＢ１３１（例７に記
載されたようにして取得）を用いて結紮した。

【００５６】名称ｐＣＬＥＡＮ４を有する、得られたプ
ラスミドに、枯草菌ＢＤ２２４菌株中に導入した。この
形質転換体は、高アルカリ性プロテアーゼを排出する状
態であり、このことは、ＡｖａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラ
グメントが、Ｂ．アルカロフィラスＨＡ１からの高アル
カリ性プロテアーゼのための完全な構造遺伝子を有する
ことを示す。プラスミドｐＣＬＥＡＮ４の制限地図は、
図４で再現されている。

【００５７】例 ２： 高アルカリ性プロテアーゼのための構造遺伝子の配列化 プロテアーゼ構造遺伝子の一本鎖ＤＮＡの製造のため
に、プラスミドｐＣＬＥＡＮ４を、制限エンドヌクレア
ーゼＡｖａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断し、約
２．３ＫＢの大きさのＡｖａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−ＤＮ
Ａフラグメント（プロテアーゼ構造遺伝子）を、ファー
ジェミドｐＢＳ（＋）またはｐＢＳ（−）中に導入し
た。単離された一本鎖ファージェミド中に含まれるプロ
テアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を、サンガー（Ｓａ
ｎｇｅｒ）他のジデオキシ−チェインターミネーション
法（１９７７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、第７４巻：第５４６３頁）およびマクサム
（Ｍａｘａｍ）他によるＤＮＡ一本鎖の塩基特異点の化
学分解法（１９８０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、Ｇｒｏｓｓｍａｍｍ Ｌ．、Ｍｏｌｄ
ａｖｅ Ｋ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎ
ｃ．、ニューヨークおよびロンドン、第６５巻、第４９
９頁）により決定した。プロテアーゼの測定されたヌク
レオチド配列および分類されたアミノ酸配列は、図１、
図２および図３で再現されている。ヌクレオチド配列の
１１９０の位置での熟成高アルカリ性のアミノ酸配列の
ための起点を、高アルカリ性プロテアーゼのＮ−末端の
末端部のアミノ酸配列化によって定めた。

【００５８】例 ３： 意図された突然変異誘発による変異したＤＮＡ配列の製
造 意図された突然変異誘発を、プロテアーゼ構造遺伝子の
ＤＮＡ部分配列中で、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８
５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
第８２巻：第４８８〜４９２頁）によって記載された
“プライマー拡張（ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏ
ｎ）”技術を用いて実施した。このために、まず、以下
に記載されたのと同様にして、プラスミドのウラシル化
した一本鎖類縁体に変えたプラスミドｐＣＬＭＵＴＮ１
（例４に記載されたのと同様にして製造）およびｐＣＬ
ＭＵＴＣ１（例５に記載されたのと同様にして製造）を
使用した。出発ベクターｐＣＬＭＵＴＮ１およびｐＣＬ
ＭＵＴＣ１は、Ｂ．アルカロフィラスＨＡ１からのプロ
テアーゼ構造遺伝子の全部のＤＮＡ配列を保持している
のではなく、該プロテアーゼ構造遺伝子のＮ−末端の半
分（ｐＣＬＭＵＴＮ１）またはＣ−末端の半分（ｐＣＬ
ＭＵＴＣ１）だけを保持している。

【００５９】前記ベクターは、ファージェミドの誘導体
として、ある程度の大きさで、本明細書で記載された条
件下で、複製に使用する宿主生物から除去し、かつ単離
することができた一本鎖ベクターＤＮＡを形成できる。

【００６０】前記の全てのベクターを、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ他により（第２５０〜２５１頁）、ＣａＣｌ₂法を用
いて、宿主生物としての大腸菌ＣＪ２３６中に導入し
た。

【００６１】細菌大腸菌ＣＪ２３６（ウラシル−Ｎ−グ
リコシラーゼ欠乏突然変異体）は、ベクターの複製の際
に、チミンの代りに、ヌクレオチド ウラシルを、ベク
ターのＤＮＡ配列中に組込むので、前記の形質転換体の
培養によって、ベクターｐＣＬＭＵＴＮ１またはｐＣＬ
ＭＵＴＣ１のウラシル含有の類縁体が得られた。前記の
ウラシル含有のベクターは、通常のチミン含有のベクタ
ーと、試験管内反応の場合に区別できない。ベクターＤ
ＮＡ中のウラシル含量は、ウラシルが試験管内でも、生
体内でも突然変異原であり、かつウラシルは、チミンと
同様にコードしているので、試験管内ＤＮＡ合成を阻害
しない。ウラシル化したベクターは、有利に意図された
突然変異誘発の引続く試験管内反応に使用できる。反応
の終結後に、マトリックスとして、変異したＤＮＡ鎖
（ベクター）を得るのに使用したウラシル含有のＤＮＡ
一本鎖は、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを用いる処理
によって、突然変異体の表現型の選択を必要とせずに、
除去することができる。グリコシラーゼ処理は、単離さ
れた酵素を用いてかまたはウラシル−Ｎ−グリコシラー
ゼ活性を有するベクターＤＮＡによって形質転換された
大腸菌菌株を用いて実施することができる。

【００６２】意図された突然変異誘発のためにマトリッ
クスとして必要とされたウラシル化された、ベクターｐ
ＣＬＭＵＴＮ１およびｐＣＬＭＵＴＣ１の一本鎖ＤＮＡ
を、双方のベクターの１つで形質転換した、付加的に、
ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、リッチモンド、カルフォルニア
州に関連する）で汚染された大腸菌ＣＪ２３６細菌を培
養して製造した。

【００６３】このヘルパーファージ自体は、ほとんど増
殖できず、ベクターｐＣＬＭＵＴＮ１またはｐＣＬＭＵ
ＴＣ１のベクターＤＮＡとの邪魔な相互作用を示さな
い。該ヘルパーファージの氏名は、形成されたウラシル
化した一本鎖ベクターＤＮＡのための被覆タンパク質
（Ｈｕｅｌｌｐｒｏｔｅｉｎ）の合成にある。被覆され
た一本鎖ベクターＤＮＡは、宿主生物大腸菌ＣＪ２３６
から除去され、かつ培地から単離することができる。ヘ
ルパーファージの助力によって、（本明細書では、ウラ
シル化した）一本鎖ベクターＤＮＡの質的収量および量
的収量は、本質的に向上する。

【００６４】単離された、ウラシル化したＤＮＡ一本鎖
ベクターｐＣＬＭＵＴＮ１またはｐＣＬＭＵＴＣ１を、
例８により製造された、合成オリゴヌクレオチドを用い
てハイブリッド化させ、変異部位を有し、同時にプライ
マーとして、突然変異を用いて完全なＤＮＡ二本鎖へと
引続く補充に使用した。

【００６５】第２のＤＮＡ鎖の合成を、Ｔ４−ＤＮＡ−
ポリメラーゼを有するヌクレオチドを添加しながら実施
し、かつ新たに形成された鎖とＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ
との引続く結紮を実施した（Ｋｕｎｋｅｌ他、１９８７
年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、第１５４
巻、第３６７〜３８２頁）。形成された二本鎖ベクター
ＤＮＡを、大腸菌ＭＣ１０６１中で形質転換し、かつ変
異したベクターを、合成オリゴヌクレオチドを用いて導
入したかもしくは除去した相応する単位制限エンドヌク
レアーゼ−認識部位の検査によって同定した。

【００６６】例えば、プロテアーゼ構造遺伝子のＮ−末
端またはＣ−末端部分での２つの突然変異を得るため
に、前記実施例の方法を、プロテアーゼ構造遺伝子の一
部分への第１の突然変異の導入（例６の第１の合成オリ
ゴヌクレオチドの使用）後に、同様の方法で、例８のも
う１つの合成オリゴヌクレオチドの使用下に、プロテア
ーゼ構造遺伝子の前記の部分への第２の突然編にの導入
のため反復した。こうして、例えばプロテアーゼ構造遺
伝子のＮ−末端またはＣ−末端部分での２つの突然変異
を有するｐＣＬＭＵＴＮ１型またはｐＣＬＭＵＴＣ１型
の変異したベクターが得られた。

【００６７】例 ４： ベクターｐＣＬＭＵＴＮ１の構成 例１で得られたプラスミドｐＣＬＥＡＮ４を、ＡｖａＩ
を用いて切断した。突出末端（Ｄｉｅ ｕｅｂｅｒｓｔ
ｅｈｅｎｄｅｎ Ｅｎｄｅｎ）（“スティッキーエンド
（ｓｔｉｃｋｅｙ ｅｎｄｓ）”）を、必要とされたヌ
クレオチドを添加しながら、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのクレノウフラグメント（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１１
４頁）で補充して、ＤＮＡ二本鎖にした。ＸｂａＩを用
いる前記ＤＮＡの引続く制限後に、Ｎ−末端の１６１８
の塩基対（ＢＰ）を包括する、プロテアーゼ遺伝子のフ
ラグメントを単離し、ｐＢＳのＳｍａＩ／ＸｂａＩ部位
へとクローニングする。生じたベクターに、名称ｐＣＬ
ＭＵＴＮ１を与えた。前記ベクターの制限地図は、図６
に再現されている。

【００６８】例 ５： ベクターｐＣＬＭＵＴＣ１の硬性 例１で得られたプラスミドｐＣＬＥＡＮ４を、制限エン
ドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８を用いて切
断した。プロテアーゼ構造遺伝子のＣ−末端の半分を法
かつするような、６５８ＢＰを包括するＸｂａＩ／Ａｓ
ｐ７１８二本鎖ＤＮＡフラグメントを、ｐＢＳのＸｂａ
Ｉ／Ａｓｐ７１８部位でクローン化した。生じたベクタ
ーに、名称ｐＣＬＭＵＴＣ１を与えた。前記ベクターの
制限地図は、図７に再現されている。

【００６９】例 ６： 意図された突然変異誘発のための人造オリゴヌクレオチ
ドの合成 合成オリゴヌクレオチドを、Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｓ．
Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ Ｍ．Ｈ．（１９８１
年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ 第２２
巻：第１８５９〜１８６２頁）により、β−シアノエチ
ル−ホスホルアミダイトを用いて、サイクロン合成器
（Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｓｅｒ）（バイオ
サーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ））中で製造した。得られ
たオリゴヌクレオチドを、ポリアクリルアミドゲルから
溶離し、引続き、セファーデクス−Ｇ２５−カラム（Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５−Ｓａｅｕｌｅ）を用いる脱塩
によって精製した。合成したヌクレオチド配列の例およ
びその性質は、図５で再現されている。例３による方法
においていプロテアーゼ遺伝子中に突然変異を導入する
ために使用された合成オリゴヌクレオチドの配列は、こ
の配列が、以下の条件を充足するような程度に選択され
た。

【００７０】合成オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は、
プロテアーゼ遺伝子の相応する配列に対して、その十分
なハイブリッド化が保証されている限り補完的であっ
た。

【００７１】別のヌクレオチドによって、交換すべきア
ミノ酸のためにコートしているようなコドン内での１つ
またはそれ以上のヌクレオチドを交換し、その結果、前
記の変異したコドンは、更に、別のアミノ酸のためにコ
ードしていた（突然変異）。この新規アミノ酸のために
は、プロテアーゼ遺伝子中で、相応するアミノ酸のため
に、極めてしばしば見出されたようなコドンを使用し
た。

【００７２】別のコドン内の他のヌクレオチドを交換
し、その結果、アミノ酸の本来のコーディングは、確か
に保持されたままであるが、このことによって、制限エ
ンドヌクレアーゼのための、プロテアーゼ遺伝子中に存
在する認識配列は除去されるかまたは新たに得られた。
このことは、新規の高アルカリ性プロテアーゼのための
変異したＤＮＡ配列を有するベクターへのスクリーニン
グの簡易化のために使用された。

【００７３】例 ７： プラスミドｐＵＢ１１０の単離および精製並びにベクタ
ーｐＵＢ１３１の構造 枯草菌ＢＤ３３６菌株から、Ｔ．Ｊ．Ｇｒｙｃｚａｎ他
（１９７８年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．第１３４巻：
第３１８〜３２９頁）の方法により、プラスミドｐＵＢ
１１０を単離し、引続き、Ｍａｎｉａｔｉｓ他（９３
頁）により、塩化セシウム−密度勾配遠心法によって精
製した。このベクターｐＵＢ１１０は、ネオマイシンに
対する抗生物質耐性のためにコードしているＤＮＡ配列
並びにバシラス種中への複製のために必要とされたＤＮ
Ａ配列（“複製起点（ｏｒｉｇｉｎｏｆ ｒｅｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎ）”）のようなマーカーとして、制限エンド
ヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩのための１回
だけ存在する制限部位を有する。

【００７４】前記の得られたプラスミドを、ＥｃｏＲＩ
およびＢａｍＨＩを用いて制限した。このより小さなフ
ラグメント（７９０ＢＰ）を、予めＥｃｏＲＩ／Ｂｇｌ
ＩＩフラグメントとしてベクターＭ１３ｔｇ１３１から
単離しておいた６７の塩基対からなるポリリンカーによ
って代替した。従って、こうして得られた、名称ｐＢ１
３１を有するベクターは、約０．８ＫＢの大きさのＥｃ
ｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを欠失し、このために
ポリクローニング部位を組込んだｐＵＢ１１０の誘導体
である。

【００７５】例 ８： ベクターｐＵＢＣ１３１およびｐＵＢＣ１３２の構成 プラスミドｐＵＣ１８を、ＡａｔＩＩおよびＰｖｕＩＩ
を用いて切断した。β−ラクタマーゼ遺伝子および大腸
菌“複製起点”を有する１９９０の塩基対の大きさのフ
ラグメントを、単離した。突出末端（“スティッキーエ
ンド”）を、必要とされたヌクレオチドを添加しなが
ら、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｍａｎｉａｔｉｓ
他、１１４頁）のクレノウフラグメントを用いて補充し
て、ＤＮＡ二本鎖にした。引続き、このフラグメント
を、例７により得られたベクターｐＵＢ１３１のＳｎａ
ＢＩ部位へ組込みこのことによって、名称ｐＵＢＣ１３
１を有するベクターが得られた。

【００７６】前記により得られたベクターｐＵＢＣ１３
１の２１８７ＢＰのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩフラグメン
トを、ｐＢＳ（＋）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にサ
ブクローニングし、この場合、名称ｐＢＳＲＥＰＵを有
するベクターが得られた。引続き、ベクターｐＢＳＲＥ
ＰＵ中のｒｅｐＵ−ポリペプチドのためのＤＮＡ配列中
に存在している（Ｉ．Ｍａｃｉａｇ他、１９８８年、Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．第２１２巻：第２３２〜３
４０頁）ＮｃｏＩもしくはＳｔｙＩ認識部位を、ヌクレ
オチド配列ＣＣＡ ＴＧＧが、ヌクレオチド、配列ＣＣ
Ｇ ＴＧＧ（双方のヌクレオチド配列は、アミノ酸列ト
リプトファン−プロリンのためにコードしている）によ
って代替されたことにより、意図された突然変異誘発に
よって除去された。この実施は、例３の方法と同様であ
った。このために、ベクターｐＢＳＲＥＰＵのウラシル
化した一本鎖ＤＮＡを、ＮｃｏＩもしくはＳｔｙＩ認識
部位の除去のために意図された突然変異のためのマトリ
ックスとして製造した。引続き、前記マトリックスを、
例３に記載された“プライマー伸長法”技術（“ｐｒｉ
ｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ”−Ｔｅｃｈｎｉｋ）と同
様に、次の合成オリゴヌクレオチド（例６の合成オリゴ
ヌクレオチドの製造法と同様にして製造し、かつ精製し
た）

【００７７】

【化１】

【００７８】の使用下に補充して、ＤＮＡ二本鎖ベクタ
ーにし、かつ大腸菌ＭＣ１０６１の形質転換および培養
によって、ＮｃｏＩもしくはＳｔｙＩ認識部位のないベ
クターを単離した。単離されたベクターの１７２６ＢＰ
のＥｃｏＲＩ／ＡｐａＩ−フラグメントを、ｐＵＢＣ１
３１のＥｃｏＲＩ／ＡｐａＩ−部位に導入した。制限地
図が、図８に再現されているこの新規のベクターに、名
称ｐＵＢＣ１３２を与えた。

【００７９】例 ９： プラスミドｐＡＬ１Ｐの構成 プラスミドｐＡＬ１Ｐを、次の３つの成分の結紮によっ
て製造した： − ｐＣＬＥＡＮ４の１２０１の塩基対の大きさのＡｖ
ａＩ／ＮｃｏＩ−フラグメント；このフラグメントは、
高アルカリ性出発プロテアーゼのプロモーターおよび前
後の部位（Ｐｒｅｐｒｏ−Ｒｅｇｉｏｎ）を有する； − 変異したベクターｐＣＬＭＵＴ１もしくはｐＣＬＭ
ＵＴＣ１からのプロテアーゼ遺伝子の変異したＮ末端も
しくはＣ末端の半分の導入またはプラスミドｐＣＬＥＡ
Ｎ４からの出発プロテアーゼの全部の遺伝子の導入が可
能である、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩ、ＸｂａＩ
およびＡｓｐ７１８のための個々の認識部位を有する次
の合成リンカー；

【００８０】

【化２】

【００８１】突出末端５’末端を有する前記の二本鎖合
成リンカーを、まず、双方の一本鎖ＤＮＡ配列を、例６
の合成オリゴヌクレオチドの合成と同様にして、それぞ
れ別個に製造しかつ精製することによって製造した。こ
うして得られた一本鎖を、引続き、相互にハイブリッド
化して二本鎖にした。

【００８２】− 例８で製造されたベクターｐＵＢＣ１
３２からの５７７６の塩基対の大きさのＡｖａＩ／Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ−フラグメント；前記フラグメントは、大腸
菌中の複製のためのＤＮＡ配列および選択化可能なマー
カー並びに枯草菌、Ｂ．リヘニホルムスおよびＢ．アル
カロフィラス中の複製のためのＤＮＡ配列および選択化
可能なマーカーを有する。

【００８３】ベクターｐＡＬ１Ｐの構成を、大腸菌ＭＣ
１０６１中で実施し、前記ベクターを、アムピシリン耐
性（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔｅｎｔ）の大
腸菌形質転換体から単離した。得られたベクターの制限
地図は、図９に再現されている。

【００８４】例 １０： プラスミドｐＡＬ１ＮおよびｐＡＬ１Ｃの構成 ベクターｐＡＬ１ＮおよびｐＡＬ１Ｃの構成を、大腸菌
ＭＣ１０６１中で実施し、この場合、該ベクターを、ア
ムピリシン耐性の大腸菌形質転換体から単離した。

【００８５】プラスミドｐＡＬ１Ｎを、まず、例１で得
られたベクターｐＣＬＥＡＮ４を、制限エンドヌクレア
ーゼＮｃｏＩおよびＸｂａＩを用いて切断し、得られた
ＮｃｏＩ／ＸｂａＩ−フラグメントを、引続き、ベクタ
ーｐＡＬ１Ｐ（例９により製造された）のＮｃｏＩ／Ｘ
ｂａＩ−部位中にクローン化することによって構成させ
た。得られたベクターは、熟成酵素のためにコードして
いるＤＮＡ配列のＮ−末端部分および高アルカリ性プロ
テアーゼの転写および翻訳のための調整要素並びにシグ
ナル配列およびプロセッシング配列（Ｐｒｏｃｅｓｓｉ
ｎｇ−Ｓｅｑｕｅｎｚ）を有する。

【００８６】プラスミドｐＡＬ１Ｃを、まず、例１で得
られたベクターｐＣＬＥＡＮ４を、制限エンドヌクレア
ーゼＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８を用いて切断し、得ら
れたＸｂａＩ／Ａｓｐ７１８−フラグメントを、ベクタ
ーｐＡＬ１Ｐ（例９により製造された）のＸｂａＩ／Ａ
ｓｐ７１８−部位中にクローン化することによって構成
させた。得られたベクターは、熟成酵素のためにコード
しているＤＮＡ配列のＣ−末端部分および高アルカリ性
プロテアーゼの転写および翻訳のための調整要素並びに
シグナル配列およびプロセッシング配列を有する。

【００８７】例 １１： 発現ベクターｐＡＬ１ＮＣの構成 プロテアーゼＤＮＡ配列のＣ−末端部分に突然変異を有
する発現ベクター、プロテアーゼＤＮＡ配列のＮ−末端
部分に突然変異を有する発現ベクター、ＤＮＡ配列のＮ
−末端およびＣ−末端部分に突然変異を有する発現ベク
ターおよび比較の目的のために、プロテアーゼＤＮＡ配
列に突然変異を有していない発現ベクターを製造した。

【００８８】Ａ．プロテアーゼのＤＮＡ配列のＮ−末端
部分に突然変異を有する発現ベクター 例３により、意図された突然変異誘発によって得られた
変異したベクターｐＣＬＭＵＴＮ１を、制限エンドヌク
レアーゼＮｃｏＩおよびＸｂａＩを用いて切断した。単
離された４１１の塩基対の大きさのＮｃｏＩ／ＸｂａＩ
−フラグメント（それぞれ突然変異Ｎ４２Ｒ、Ｎ１１４
Ｒ、Ｉ４３Ｑ、Ｎ４２Ｒ／Ｎ１１４ＲおよびＩ４３Ｑ／
Ｎ１１４Ｒ、Ｎ４２Ｒ／Ｉ４３Ｑ、Ｎ４２Ｒ／Ｉ４３Ｑ
／Ｎ１１４Ｒを有するプロテアーゼ構造遺伝子の変異し
たＮ−末端部分）を、例１５により得られたプラスミド
ｐＡＬ１ＣのＮｃｏＩ／ＸｂａＩ−部位中へクローン化
した。それぞれ得られたベクターは、変異したプロテア
ーゼの発現のために適当な読み取りラスターを有する完
全な発現ベクターを製出する。このベクターを、次によ
うに命名した： ｐＡＬＮ４２Ｒ ＝ 突然変異Ｎ４２Ｒを有するプロテ
アーゼのための発現ベクター； ｐＡＬＩ４３Ｑ ＝ 突然変異Ｉ４３Ｑを有するプロテ
アーゼのための発現ベクター； ｐＡＬＮ１１４Ｒ ＝ 突然変異Ｎ１１４Ｒを有するプ
ロテアーゼのための発現ベクター； ｐＡＬＮ４２Ｒ／Ｎ１１４Ｒ ＝ 突然変異Ｎ４２Ｒ／
Ｎ１１４Ｒを有するプロテアーゼのための発現ベクタ
ー； ｐＡＬＩ４３Ｑ／Ｎ１１４Ｒ ＝ 突然変異Ｉ４３Ｑ／
Ｎ１１４Ｒを有するプロテアーゼのための発現ベクタ
ー； ｐＡＬＮ４２Ｒ／Ｉ４３Ｑ ＝ 突然変異Ｎ４２Ｒ／Ｉ
４３Ｑを有するプロテアーゼのための発現ベクター； ｐＡＬＮ４２Ｒ／Ｉ４３Ｑ／Ｎ１１４Ｒ ＝ 突然変異
Ｎ４２Ｒ／Ｉ４３Ｑ／Ｎ１１４Ｒを有するプロテアーゼ
のための発現ベクター。

【００８９】Ｂ．プロテアーゼのＤＮＡ配列のＣ−末端
部分に突然変異を有する発現ベクター 例３により、意図された突然変異誘発によって得られた
変異したベクターｐＣＬＭＵＴＣ１を、制限エンドヌク
レアーゼＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８を用いて切断し
た。単離された６０９の塩基対の大きさのＸｂａＩ／Ａ
ｓｐ７１８−フラグメント（それぞれ突然変異Ｍ２１６
Ｑ、Ｔ２４９ＥおよびＭ２１６Ｑ／Ｔ２４９Ｅを有する
プロテアーゼ構造遺伝子の変異したＣ−末端部分）を、
例１０により得られたプラスミドｐＡＬ１ＮのＸｂａＩ
／Ａｓｐ７１８部位中へクローン化した。それぞれ得ら
れたベクターは、変異したプロテアーゼのために適当な
読み取りラスターを有する完全な発現ベクターを製出す
る。このベクターを、次のように命名した： ｐＡＬＭ２１６Ｑ ＝ 突然変異ｐＡＬＭ２１６Ｑを有
するプロテアーゼのための発現ベクター； ｐＡＬＴ２４９Ｅ ＝ 突然変異ｐＡＬＴ２４９Ｅを有
するプロテアーゼのための発現ベクター； ｐＡＬＭ２１６Ｑ／Ｔ２４９Ｅ ＝ 突然変異ｐＡＬＭ
２１６Ｑ／Ｔ２４９Ｅを有するプロテアーゼのための発
現ベクター。

【００９０】Ｃ．プロテアーゼＤＮＡ配列のＣ−末端部
分およびＮ−末端部分に突然変異を有する発現ベクター 前記実施例中、Ａで得られた発現ベクターｐＡＬＮ１１
４ＲおよびＢで得られた発現ベクターｐＡＬＭ２１６Ｑ
を、それぞれ、制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよび
ＡｖａＩを用いて切断した。プラスミドｐＡＬＮ１１４
Ｒの１６１２の塩基対の大きさのフラグメントを、プラ
スミドｐＡＬＭ２１６Ｑの６３８８の塩基対の大きさの
フラグメントと結紮した。生じたプラスミドに、名称ｐ
ＡＬＮ１１４Ｒ／Ｍ２１６Ｑを与えた。

【００９１】同様にして、次の発現ベクターを製造し
た： ｐＡＬＮ１１４Ｒ／Ｍ２１６Ｑ ｐＡＬＩ４３Ｑ／Ｍ２１６Ｑ ｐＡＬＮ４２Ｒ／Ｍ２１６Ｑ ｐＡＬＩ４３Ｑ／Ｍ２１６Ｑ／Ｔ２４９Ｅ ｐＡＬＩ４３Ｑ／Ｎ１１４Ｒ／Ｔ２４９Ｅ ｐＡＬＩ４３Ｑ／Ｎ１１４Ｒ／Ｍ２１６Ｑ／Ｔ２４９Ｅ ｐＡＬＮ４２Ｒ／Ｉ４３Ｑ／Ｎ１１４Ｒ／Ｍ２１６Ｑ／
Ｔ２４９Ｅ ｐＡＬＮ１１４Ｒ／Ｔ２４９Ｅ ｐＡＬＩ４３Ｑ／Ｎ１１４Ｒ／Ｍ２１６Ｑ ｐＡＬＮ１１４Ｒ／Ｍ２１６Ｓ ｐＡＬＩ４３Ｑ／Ｍ２１６Ｓ／Ｔ２４９Ｅ ｐＡＬＮ４２Ｒ／Ｍ２１６Ａ ｐＡＬＮ４２Ｒ／Ｍ２１６Ａ／Ｔ２４９Ｅ Ｄ．出発プロテアーゼの変異していないＤＮＡ配列を有
する発現ベクター プロテアーゼの変異していない出発構造遺伝子を有する
発現ベクターを、例１により得られたプラスミドｐＣＬ
ＥＡＮ４からの４１１の塩基対の大きさの変異していな
いＮｃｏＩ／ＸｂａＩ−フラグメントを、例１０により
得られたプラスミドｐＡＬ１ＣのＮｃｏＩ／ＸｂａＩ−
部位中へクローン化したか；または例１により得られた
プラスミドｐＣＬＥＡＮ４からの６０９の塩基対の大き
さのＸｂａＩ／Ａｓｐ７１８−フラグメントを、例１０
により得られたプラスミドｐＡＬ１ＮのＸｂａＩ／Ａｓ
ｐ７１８−部位中へクローン化することによって得た。
こうして得られたベクターは、変異していない高アルカ
リ性出発プロテアーゼの発現のために適当な読み取りラ
スターを有する完全な発現ベクターである。

【００９２】ｐＡＬ１ＮＣ型の前記ベクターの制限地図
は、図１０で再現されている。

【００９３】例 １２： 突然変異によって変化した高アルカリ性プロテアーゼお
よび比較目的のための出発プロテアーゼの製造 未処理培地５０ｍｌ（Ｖｏｒｋｕｌｔｕｒｍｅｄｉｕ
ｍ）（トリプトン２０ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ
５ｇ、可溶性澱粉７５ｇ、１ｌ当りコーン・スティープ
・リカー１０ｍｌ）に、試験すべき菌株のコロニー（そ
れぞれ、例１１により得られたベクターｐＡＬ１ＮＣで
形質転換した枯草菌ＢＤ２２４）を接種した。この培地
を、１６時間３７℃および２５０ｒ．ｐ．ｍ．で恒温保
持した。前記培地２．５ｍｌを、主要培地（Ｈａｕｐｔ
ｋｕｌｔｕｒｍｅｄｉｕｍ）５０ｍｌ（大豆粉３０ｇ、
ジャガイモ澱粉９０ｇ、Ｎａ−カゼイン酸塩および１ｌ
当りコーン・スティープ・リカー１０ｍｌ）に接種し
た。この主要培地を、未処理培地と同一条件下に恒温保
持した。７２時間後に、この培地を、遠心分離した。形
成されたプロテアーゼを、培地成分（Ｋｕｌｔｕｒｂｅ
ｓｔａｅｎｄｅｎ）からアセトンを用いて沈殿させ、引
続き、次のようにして精製した：陽イオン交換体Ｍｏｎ
ｏ Ｓ，ＦＰＬＣ；酢酸アンモニウム、ｐＨ＝６、２０
ミリモル〜２００ミリモルの上昇勾配を用いる溶離。

【図面の簡単な説明】

【図１】バシラスアルカロフィラスＨＡ１からの高アル
カリ性出発プロテアーゼの構造遺伝子を有するＡｖａＩ
／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのＤＮＡ配列図並びに該
出発プロテアーゼのアミノ酸配列図。

【図２】図１に続く配列図。

【図３】図２に続く配列図。

【図４】プラスミドｐＣＬＥＡＮ４の制限地図。

【図５】意図された突然変異誘発に使用された合成オリ
ゴヌクレオチドのためのＤＮＡ配列図および個々の制限
エンドヌクレアーゼのための除去もしくは製造の認識部
位を記載する図；出発プロテアーゼの本来のＤＮＡ配列
に対して得られたヌクレオチド変化は、小文字を用いて
変化したヌクレオチドを記載することによって示されて
いる。

【図６】ベクターｐＣＬＭＵＴＮ１の制限地図。

【図７】ベクターｐＣＬＭＵＴＣ１の制限地図。

【図８】ベクターｐＵＢＣ１３２の制限地図。

【図９】ベクターｐＡＬ１Ｐの制限地図。

【図１０】突然変異によって変化した高アルカリ性プロ
テアーゼおよび高アルカリ性出発プロテアーゼの発現の
ためのｐＡＬ１ＮＣ型の発現ベクターの制限地図。

【図１１】ベクターｐＡＬ１Ｎの制限地図。

【図１２】ベクターｐＡＬ１Ｃの制限地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/57 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 アンドレ クリッペ ベルギー国 ヴァラーイン リュ ヴァリ シェ 12 (72)発明者 ゲルハルト コニーツニー−ヤンダ ドイツ連邦共和国 パテンゼン シェーネ ベルガー シュトラーセ 23 (72)発明者 ローマン フェター ドイツ連邦共和国 ブルクドルフ ヴァル ネッケヴェーク １

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 図１、図２および図３に記載されたアミ
   ノ酸配列に対する同族体少なくとも８０％を有し、前記
   アミノ酸配列と、４２、４３、１１４、２１６、２４９
   の位置の２つ、３つ、４つまたは５つで異なるかまたは
   これに対して相同の位置で異なるようなアミノ酸配列を
   有する高アルカリ性プロテアーゼにおいて、当該の位置
   での交換の際に、４２の位置に存在するアミノ酸がアル
   ギニンに対して交換されており、４３の位置に存在する
   アミノ酸がグルタミンに対して交換されており、１１４
   の位置に存在するアミノ酸がアルギニンに対して交換さ
   れており、２１６の位置に存在するアミノ酸がセリン、
   グルタミンまたはアラニンに対して交換されており、２
   ４９の位置に存在するアミノ酸がグルタミン酸に対して
   交換されていることを特徴とする、高アルカリ性プロテ
   アーゼ。
2. 【請求項２】 高アルカリ性プロテアーゼが、図１、図
   ２および図３に記載されたアミノ酸配列に対する同族体
   少なくとも９０％、有利に少なくとも９５％を有するよ
   うなアミノ酸配列を有する、請求項１記載の高アルカリ
   性プロテアーゼ。
3. 【請求項３】 ２１６の位置に存在するアミノ酸がセリ
   ン、グルタミンまたはアラニンに対して交換されてお
   り、４３の位置に存在するアミノ酸がグルタミンに対し
   て交換されているかまたは１１４の位置に存在するアミ
   ノ酸がアルギニンに対して交換されているかまたは２４
   ９の位置に存在するアミノ酸がグルタミン酸に対して交
   換されているようなアミノ酸配列を有する、請求項１ま
   たは２記載の高アルカリ性プロテアーゼ。
4. 【請求項４】 ２１６の位置に存在するアミノ酸がセリ
   ン、グルタミンまたはアラニンに対して交換されてお
   り、１１４の位置に存在するアミノ酸がアルギニンに対
   して交換されており、４２の位置に存在するアミノ酸が
   アルギニンに対して交換されているかまたは４３の位置
   に存在するアミノ酸がグルタミンに対して交換されてい
   るようなアミノ酸配列を有する、請求項１または２記載
   の高アルカリ性プロテアーゼ。
5. 【請求項５】 ４３の位置に存在するアミノ酸がグルタ
   ミンに対して交換されており、１１４の位置に存在する
   アミノ酸がアルギニンに対して交換されているかまたは
   ２１６の位置に存在するアミノ酸がセリン、グルタミン
   またはアラニンに対して交換されているようなアミノ酸
   配列を有する、請求項１または２記載の高アルカリ性プ
   ロテアーゼ。
6. 【請求項６】 ４３の位置に存在するアミノ酸がグルタ
   ミンに対して交換されており、１１４の位置に存在する
   アミノ酸がアルギニンに対して交換されており、２４９
   の位置に存在するアミノ酸がグルタミン酸に対して交換
   されており、かつ２１６の位置に存在するアミノ酸がセ
   リン、グルタミンまたはアラニンに対して交換されてい
   るようなアミノ酸配列を有する、請求項１または２記載
   の高アルカリ性プロテアーゼ。
7. 【請求項７】 ２１６の位置に存在するアミノ酸が、グ
   ルタミンに対して交換されている、請求項３から６まで
   のいずれか１項記載の高アルカリ性プロテアーゼ。
8. 【請求項８】 １１４の位置に存在するアミノ酸がアル
   ギニンに対して交換されており、４３の位置に存在する
   アミノ酸がグルタミンに対して交換されているかまたは
   ２４９の位置に存在するアミノ酸がグルタミン酸に対し
   て交換されているようなアミノ酸配列を有する、請求項
   １または２記載の高アルカリ性プロテアーゼ。
9. 【請求項９】 図１、図２および図３に記載されたアミ
   ノ酸配列に対する同族体少なくとも８０％を有し、前記
   アミノ酸配列と、４２、４３、１１４、２１６、２４９
   の位置の２つ、３つ、４つまたは５つで異なるかまたは
   これに対して相同の位置で異なるようなアミノ酸配列を
   有する高アルカリ性プロテアーゼのためにコードしてい
   るＤＮＡ配列において、当該の位置での交換の際に、４
   ２の位置に存在するアミノ酸がアルギニンに対して交換
   されており、４３の位置に存在するアミノ酸がグルタミ
   ンに対して交換されており、１１４の位置に存在するア
   ミノ酸がアルギニンに対して交換されており、２１６の
   位置に存在するアミノ酸がセリン、グルタミンまたはア
   ラニンに対して交換されており、２４９の位置に存在す
   るアミノ酸がグルタミン酸に対して交換されていること
   を特徴とする、ＤＮＡ配列。
10. 【請求項１０】 ＤＮＡ配列が、請求項３から８までの
    いずれか１項記載のアミノ酸が交換されているようなア
    ミノ酸配列のためにコードしている、請求項９記載のＤ
    ＮＡ配列。
11. 【請求項１１】 洗浄、清浄化または食器洗い用の組成
    物において、請求項１から８までのいずれか１項記載の
    高アルカリ性プロテアーゼを含有することを特徴とす
    る、洗浄、清浄化または食器洗い用の組成物。
12. 【請求項１２】 組成物が高アルカリ性プロテアーゼ
    を、洗剤および清浄化剤中で常用の、プロテアーゼ、リ
    パーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、ヌクレアーゼ、オ
    キシドレダクターゼおよびセルラーゼの群からなる酵素
    の１つまたはそれ以上の存在下に含有する、請求項１１
    記載の組成物。
13. 【請求項１３】 ビルダー物質、漂白剤並びに場合によ
    っては他の洗剤成分として常用の添加剤および助剤を含
    有する、請求項１２記載の組成物。
14. 【請求項１４】 請求項１記載のアミノ酸配列を有する
    高アルカリ性プロテアーゼを製造するための方法におい
    て、図１、図２および図３に記載されたアミノ酸配列に
    対する同族体少なくとも８０％を有し、前記アミノ酸配
    列と、４２、４３、１１４、２１６、２４９の位置の２
    つ、３つ、４つまたは５つで異なるかまたはこれに対し
    て相同の位置で異なり、この場合、当該の位置での交換
    の際に、４２の位置に存在するアミノ酸がアルギニンに
    対して交換されており、４３の位置に存在するアミノ酸
    がグルタミンに対して交換されており、１１４の位置に
    存在するアミノ酸がアルギニンに対して交換されてお
    り、２１６の位置に存在するアミノ酸がセリン、グルタ
    ミンまたはアラニンに対して交換されており、２４９の
    位置に存在するアミノ酸がグルタミン酸に対して交換さ
    れているようなアミノ酸配列のためにコードしているＤ
    ＮＡ配列を有する、形質転換された微生物を培養し、培
    地から、形成された高アルカリ性プロテアーゼを単離す
    ることを特徴とする、高アルカリ性プロテアーゼの製造
    法。