JPH05184363A - 新規プロテア−ゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】配列表１のアミノ酸配列のアミノ末端残基が他
のアミノ酸残基に置換されていることを特徴とする新規
なプロテアーゼ及び配列表１のアミノ酸配列を有する耐
熱性中性プロテアーゼあるいは該プロテアーゼの特定の
アミノ酸残基を置換、改変したＤＮＡを含み、大腸菌お
よび枯草菌で発現させることができるプラスミド並びに
当該新規なプロテア−ゼの製造法において、上記のプラ
スミドを使用することを特徴とする新規なプロテアーゼ
の製造方法。 【効果】本発明における変異体酵素は、種々の活性測定
方法、例えばＺ−ＡＰＭの分解活性において、野生型酵
素に比べて有意にその比活性が向上しており、種々の用
途における本酵素の利用に際し、反応効率の上昇や反応
時間の短縮などの点で優れた効果を発揮する可能性があ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】サーモリシンは工業的に製造され
ている有用な酵素であり、その用途は洗剤、食品製造、
化粧品等、広範な分野にわたっている。例えば人工甘味
料の一種であるアスパルテームの前駆体であるベンジル
オキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチルフェニルアラ
ニンメチルエステル（以下Ｚ−ＡＰＭと略する）の合成
等に使用される。本発明は、サーモリシン様金属プロテ
アーゼの改良およびその製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】サーモリシンは好熱菌の一種であるバチ
ルス・サーモプロテオリチカス（Bacillus thermoprote
olytics ）の培養上清中に見つけられた金属プロテアー
ゼであり（J. Fermentation Tech.,40,346 (1962) 参
照）、これまで数多くの研究が行われてきた。たとえ
ば、酵素蛋白質の一次構造（Titani K.,et al.,Nature
NewBiol.(1972) 238,35-37)や、三次構造( Holmes, M.
A., Matthews, B.W. J. Mol. Biol.(1982) 160,623-63
9)が明らかにされている。ところが最近、バチルス・サ
ーモプロテオリチカス（Bacillus thermoproteolytics
）よりプロテアーゼ遺伝子がクローン化され（特開平
３−２３２４９４）、その塩基配列から推測される成熟
酵素のアミノ酸配列は、これまで推定されていた配列と
は２つの位置で異なった。即ち成熟酵素のアミノ末端か
ら３７番目のアスパラギン酸の代わりにアスパラギン及
び１１９番目のグルタミン酸の代わりにグルタミンとな
っていることが報告された。ところがこの配列は以前、
バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearoth
ermophilus ) からクローン化されたプロテアーゼ遺伝
子の一つ（ｎｐｒＭ）と全く同一であることがわかった
(Kubo M.,et al.,Journal ofGeneral Microbiology(198
8),134 1883-1892)。以下、本明細書においてはこのｎ
ｐｒＭ遺伝子に由来するプロテアーゼを「サーモリシン
様金属プロテアーゼ」と呼ぶ。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本酵素の基質特異性、
至適ｐＨ、物理的安定性等はアミノ酸配列により規定さ
れている。工業用酵素として本酵素の利用範囲を拡大す
るためには、これらの諸性質を利用分野に適するよう改
変しなければならない。一般に蛋白質の高次構造はアミ
ノ酸配列に由来しており、蛋白質の性質を改変するため
にはアミノ酸配列を改変することが必須である。また、
改良された変異体酵素を生産するためには組換えＤＮＡ
技術による、宿主−ベクター系の開発が必要である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】この様な課題を解決する
ために、本発明者らはタンパク質工学の手法を用いて、
上記バチルス・ステアロサーモフィラス (Bacillus ste
arothermophilus ) 由来のサーモリシン様金属プロテア
ーゼの改変を行い、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、配列表１のアミノ酸配列を有す
る上記サーモリシン様金属プロテアーゼにおいて、アミ
ノ末端残基を他のアミノ酸に置換することにより、新規
なプロテアーゼを作成した。置換するアミノ酸としては
種々のものが考えられるが、たとえばフェニルアラニン
に置換した場合に、優れた性質の酵素が得られることが
わかった。

【０００６】また、これらの変異体酵素を大腸菌及び枯
草菌において発現生産できるプラスミド・ベクターも構
築した。

【０００７】以下、これらの変異体酵素の作成方法につ
いて具体的に説明する。組換えＤＮＡ技術によるサーモリシン様金属プロテアー
ゼの生産 ｎｐｒ Ｍ遺伝子を枯草菌において発現させる方法が報告
されている(Kubo M.and Imanaka T., J. Bacteriol.(19
89) 171, 4080-4082) 。本報告における、プラスミドｐ
ＭＫ１はｎｐｒＭ遺伝子を含み枯草菌で複製される領域
およびカナマイシン耐性遺伝子を有する。本プラスミド
によって形質転換された枯草菌は培地中に多量のサーモ
リシン様金属プロテアーゼを分泌することが見出だされ
た。この結果からｎｐｒＭ遺伝子は枯草菌においても効
率よく発現されることがわかる。

【０００８】しかしながら、本プラスミドは２０キロベ
ースペア以上の大きさであり、実質的に大腸菌を形質転
換することが困難であるばかりでなく、枯草菌内でも、
培養後期において著しいプラスミドの脱落が起こること
がわかった。

【０００９】そこで本発明者らは、大腸菌及び枯草菌の
両方の宿主に形質転換が可能であり、これらの宿主でｎ
ｐｒＭ遺伝子を発現することができるシャトルベクター
を構築した。その方法としては例えば、ｎｐｒＭの構造
遺伝子およびそのプロモーター領域を、ｐＢＲ３２２又
はｐＵＣ９の様な大腸菌で複製可能なベクターおよびｐ
ＵＢ１１０等の枯草菌で複製可能なベクターと結合する
ことによって構築することができる。すなわち図１から
図４に示したような方法で作成したプラスミドｐＵＢＴ
Ｚ１及びｐＵＢＴＺ２は、大腸菌ＨＢ１０１、ＪＭ１０
３株等に形質転換することによって、ｎｐｒＭ遺伝子を
発現することができた。同時にこのプラスミドは枯草菌
ＤＢ１０４、ＤＢ１１７、ＭＴ−２株等を形質転換する
ことによっても、ｎｐｒＭ遺伝子を発現することができ
た。

【００１０】枯草菌ＭＴ−２株をプラスミドｐＭＫ１、
ｐＵＢＴＺ１及びｐＵＢＴＺ２で形質転換し、試験管培
養したときの、プラスミドの脱落の程度を調べたとこ
ろ、図５から図７に示した様にｐＭＫ１では培養後期に
著しい脱落が認められるのに対し、ｐＵＢＴＺ１及びｐ
ＵＢＴＺ２では安定に維持されていることが示された。
この結果は、枯草菌内でのプラスミドのコピー数が前者
に比べて後者の方が多いためではないかと考えられる。ｎｐｒＭ遺伝子への変異導入 クローン化ＤＮＡへの部位特異的な変異導入方法は種々
の方法が報告されている。我々はVandeyarらの方法（Va
ndeyar M.,et al. Gene (1988) 65, 129.) を用いて、
Ｍ１３ファージにｎｐｒＭ遺伝子の全体または一部をク
ローン化して得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、化学合
成したオリゴヌクレオチドを変異プライマーとして、変
異体ｎｐｒＭ遺伝子断片を作成した。

【００１１】鋳型一本鎖ＤＮＡの作成はたとえば次のよ
うにして行うことができる。図８に示したように、プラ
スミドｐＵＣＴＺ４７からＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩで消化
して得られる約７２０ｂｐの断片を、Ｍ１３ファージｍ
ｐ１９にクローン化し（Ｍ１３ＴＺＢａ−Ｓｐ）一本鎖
ＤＮＡを調製した。

【００１２】変異プライマーは成熟酵素のアミノ末端残
基であるイソロイシン残基のコドンを含む鋳型一本鎖Ｄ
ＮＡと部分的に相補性があれば良く、種々の塩基配列が
考えられる。

【００１３】これらの変異プライマーを用いることによ
り所望のアミノ酸に置換することができる。部位特異的
変異導入を行った後、変異体Ｍ１３ファージをクローン
化し、ＤＮＡ塩基配列を決定することによって目的のア
ミノ酸置換が起こっていることを確認した。変異体Ｍ１
３ファージの二本鎖ＤＮＡから変異体ｎｐｒＭ遺伝子断
片を切り出し、プラスミドｐＵＢＴＺ２の相当領域と置
換することにより変異体ｎｐｒＭ遺伝子を含むプラスミ
ドｐＵＢＴＺ２（ｍｕｔａｎｔ）が得られた。 変異体ｎｐｒＭ遺伝子の枯草菌における発現 この様にして作成したプラスミドｐＵＢＴＺ２（ｍｕｔ
ａｎｔ）は、公知方法に従って、枯草菌に形質転換する
ことができる。本プラスミドにより形質転換された枯草
菌は変異体酵素を培地中に分泌発現することができる。

【００１４】分泌された酵素は通常の方法、たとえば疎
水クロマトグラフィーやゲル濾過によって均一に精製す
ることが出来る。変異体酵素の性質 精製された変異体酵素のカゼイン分解活性、合成ペプチ
ドであるベンジルオキシカルボニルα−Ｌ−アスパルチ
ルフェニルアラニンメチルエステル（以下Ｚ−ＡＰＭと
略す）の分解活性及びこれを合成する活性を測定したと
ころ、表１に示される様に、アミノ末端残基がフェニル
アラニンに置換された変異体酵素（Ｉ０１Ｆ変異体）
が、いずれの活性測定方法（カゼイン分解活性、Ｚ−Ａ
ＰＭ分解活性及びＺ−ＡＰＭ合成活性）においても有意
に高い活性値を示すことがわかった。

【００１５】

【表１】 本発明の新規プロテアーゼは、上に詳細に記載したアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドのほかに、これと実質上
同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。特
定の酵素活性を有するポリペプチド中の酵素活性に関与
しない領域においてアミノ酸配列に変更を加えても、該
酵素活性が影響を受けない場合があることは、当業者に
より良く知られている。したがって、そのような変更を
含むポリペプチドも、本発明の特徴を保持している限
り、すなわち配列表１においてアミノ末端残基を置換し
たものである限り本発明の範囲に属するものである。

【００１６】実施例１ ヤマダ(Yamada)ら、ジーン（Gene）、第９９巻、第１０
９−１１４頁、１９９１年に記載された、バチルス・ス
テアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus
）MK232 株由来のサ−モリシン様金属プロテア−ゼ遺
伝子、ｎｐｒＭを含むプラスミドｐＭＫ４から、制限酵
素ＢｃｌＩにてｎｐｒＭを含む約１ｋｂ断片のＤＮＡを
切り出し、公知方法でプラスミドｐＵＣ９のＢａｍＨＩ
部位にクローン化した（図１）。

【００１７】得られたプラスミドｐＵＣＴＺ３７は、ｎ
ｐｒＭ遺伝子の５´末端領域を欠失した不完全なもので
あるので、このプラスミドｐＵＣＴＺ３７を制限酵素Ｈ
ｉｎｄIII で分解し、同じようにプラスミｐＭＫ４から
制限酵素ＨｉｎｄIII にて切り出した約１．２ｋｂ断片
と連結することによってプラスミドｐＵＣＴＺ４７を作
成した（図２）。

【００１８】続いてプラスミドｐＵＣＴＺ４７及びスタ
フィロコッカス・アウレウス由来のプラスミドｐＵＢ１
１０を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼで連結することにより、図３に示したよう
にプラスミドｐＵＢＴＺ１を作成した。

【００１９】さらにこのプラスミドｐＵＢＴＺ１から図
４に示した制限酵素ＳｍａＩとＰｖｕIIの間のＤＮＡ断
片を欠失させることによってプラスミドｐＵＢＴＺ２を
作成した。ｐＵＢＴＺ２はｎｐｒＭ遺伝子の内部に、制
限酵素ＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩ、ＡａｔＩのそれぞれ単
一切断部位を有し、以下に行うような本遺伝子の組換え
操作を簡便ならしめている。

【００２０】実施例２ 枯草菌ＭＴ−２株における、組換えプラスミドｐＭＫ１
及びｐＵＢＴＺ１の保持安定性について検討した。５μ
ｇ／ミリリットルのカナマイシンを含むＬブロスを５ミ
リリットルずつ試験管に分注し、これら２種類の組換え
枯草菌のグリセロールストックを１０マイクロリットル
ずつ植菌し、３７℃で振盪培養を行った。

【００２１】経時的に一定量を採取し、菌体濁度（６０
０ｎｍの吸光度）を測定すると共に、培養液を生理食塩
水で稀釈し、Ｌアガープレート上に塗布した。３７℃で
１６時間保温した後、コロニーを楊子で、５μｇ／ミリ
リットルのカナマイシンを含むＬアガープレートに５０
個ずつ移した。３７℃で１６時間保温した後のコロニー
の数を調べ、その全体との割合をもってプラスミドの保
持率とし、その結果を図５から図７に示した。

【００２２】実施例３ 一方プラスミドｐＵＣＴＺ４７を制限酵素ＢａｍＨＩ及
びＳｐｈＩにて切断して得られる約７２０ｂｐの断片
を、Ｍ１３ファージｍｐ９の二本鎖ＤＮＡのＢａｍＨＩ
及びＳｐｈＩ消化物と混合し、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼで連結することにより、ｎｐｒＭ遺伝子のＢａｍ
ＨＩ−ＳｐｈＩ断片を含む組換体ファ−ジ（Ｍ１３ＴＺ
Ｂａ−Ｓｐ）を得た（図８）。

【００２３】得られたＭ１３ＴＺＢａ−Ｓｐから、常法
に従って１本鎖ＤＮＡを調製し、変異の導入に用いた。
変異の導入に用いたオリゴヌクレオチドはアプライドバ
イオシステムズ社製３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置を用いて
作成し、その塩基配列を以下に記す。

【００２４】５´−ＧＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣＡ
ＣＡＧＧＡＡＣＡＴ−３´ 変異の導入は、東洋紡社製Ｔ７−ＧＥＮインビトロミュ
−タゲネシスキットを用いて行い、ＤＮＡの配列決定に
よって確認した。

【００２５】変異を導入したＭ１３ＴＺＢａ−Ｓｐの二
本鎖ＤＮＡを常法に従って調整し、制限酵素ＢａｍＨＩ
及びＳｐｈＩで消化した。このサンプルを１％アガロ−
スゲルで電気泳動し、約７２０ベ−スペアのＤＮＡ断片
を分離し、バイオ１０１社ジ−ンクリ−ンＤＮＡ精製キ
ットを用いて精製した。一方、このようにして得られた
変異の導入されたＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片と、ｐＵＢ
ＴＺ２のＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片７．４ｋｂを宝酒造
社製ＤＮＡライゲ−ションキットを用いて反応させ、常
法に従って大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺
伝子の変異の導入された組換体プラスミドｐＵＢＴＺ２
（Ｉ０１Ｆ）を得た。

【００２６】常法に従って枯草菌ＭＴ−２株に形質転換
し、１％カゼイン、５μｇ／ミリリットルのカナマイシ
ンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて一夜培養
し、ハロー形成コロニーを単離することにより、組換体
プラスミドｐＵＢＴＺ２（Ｉ０１Ｆ）を持った形質転換
体を得た。

【００２７】実施例４ 組換枯草菌ＭＴ−２／ｐＵＢＴＺ２（Ｉ０１Ｆ）の単一
コロニーを５ミリリットル、５μｇ／ミリリットルのカ
ナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃にて一夜培養したの
ち、５００ミリリットルの５μｇ／ミリリットルのカナ
マイシンを含む２Ｌ培地（２％バクトトリプトン、１％
イ−ストエクストラクト、０．５％食塩）に植菌し３７
℃、２０時間培養した。

【００２８】培養液を８０００ｒｐｍにて３０分間遠心
し菌体を除去し、上清に６０％飽和になるように硫安を
加えて４℃一夜攪拌した。

【００２９】この沈殿を１０ミリリットルの緩衝液（２
０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ９．０、１０ｍＭ塩化カルシ
ウム）に溶解し、２０ミリリットルのブチルトヨパ−ル
にアプライし、同じ緩衝液で１．５ミリリットル／分の
流速で溶出、活性画分を集め、６０％飽和硫安にて塩
析、１５０００ｒｐｍにて３０分間遠心して、沈殿を集
めた。続いて、この沈殿を５ミリリットルの緩衝液（２
０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ塩化カルシ
ウム）に溶解し、ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷ（２
１．５ｘ６００ｍｍ）にアプライし、同じ緩衝液で１ミ
リリットル／分の流速で溶出、活性画分を集め精製酵素
を得た。

【００３０】精製酵素のアミノ末端残基を分析したとこ
ろ、フェニルアラニンであることがわかった。

【００３１】実施例５ カゼイン分解活性の測定 １ミリリットルの基質溶液（１％カゼイン、１／１５Ｍ
リン酸緩衝液ｐＨ７．２）に１ミリリットルの精製酵素
溶液（１０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ８．０、２ｍＭ硫酸カ
ルシウムに１〜２μｇ／ミリリットルの酵素を溶解した
もの）を加え、３５℃で１０分間保温した後、２．０ミ
リリットルの反応停止液（０．１Ｍトリクロロ酢酸、
０．２Ｍ酢酸ナトリウム、０．３Ｍ酢酸）を加え、さら
に３０分間３５℃に置き、酸不溶性の蛋白質を完全に析
出させた。不溶物をろ過し、ろ液を新しい試験管に１ミ
リリットルずつ分注した。これにアルカリ溶液（０．４
Ｍ炭酸ナトリウム）５ミリリットルとフォリン試薬（蛋
白質測定用フェノール試薬液を蒸留水で５倍稀釈する）
１ミリリットルを加え、３５℃で２０分間保温する。

【００３２】６６０ｎｍの吸光度を測定し、１分間に１
μｇのチロシン量に相当する吸光度の変化を起こす酵素
量を１単位（ＰＵ）と定義し、酵素蛋白質１ｍｇ当たり
の比活性を野生型酵素との相対値で表した。結果はすで
に表１に示した。

【００３３】実施例６ Ｚ−ＡＰＭ分解活性の測定 ０．５ミリリットルの基質溶液（１０ｍＭトリス−マレ
イン酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０
ｍＭＺ−ＡＰＭ）に０．５ミリリットルの精製酵素溶液
（１０ｍＭトリス−マレイン酸（ｐＨ８．０）、１０ｍ
Ｍ塩化カルシウムに酵素を溶解したもの）を混合し３７
℃、２０分保温したのち、０．５ミリリットルの反応停
止液（０．１Ｍ酢酸）を加え、続いて１ミリリットルの
ニンヒドリン溶液を加えた。１００℃、１５分間処理し
た後、２ミリリットルの５０％エタノールを加えて、５
７０ｎｍの吸光度を測定した。酵素蛋白質１ｍｇ当たり
の吸光度の変化を比活性として野生型酵素との相対値で
表した。結果はすでに表１に示した。

【００３４】実施例７ Ｚ−ＡＰＭ合成活性の測定 １ミリリットルの基質溶液（０．１Ｍ Ｎ−ベンジルオ
キシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸、０．１Ｍ Ｌ−
フェニルアラニンメチルエステル・塩酸塩をｐＨ７．０
の緩衝液に溶解したもの）に０．１ミリリットルの精製
酵素溶液（１ｍｇ／ミリリットル）を加え、混合後、３
７℃の水浴で酵素反応を行った。１０、２０、３０分後
にそれぞれ反応液１０マイクロリットルを採取し、逆相
用カラムに注入し、高速液体クロマトグラフ装置による
分析を行った。Ｚ−ＡＰＭの標準物質をもちいて、酵素
反応によって生じるＺ−ＡＰＭの量を定量し、酵素蛋白
質１ｍｇ当たりの比活性を野生型酵素との相対値で表し
た。結果はすでに表１に示した。

【００３５】

【発明の効果】本発明における変異体酵素は、種々の活
性測定方法において、野生型酵素に比べて有意にその比
活性が向上しており、種々の用途における本酵素の利用
に際し、反応効率の上昇や反応時間の短縮などの点で優
れた効果を発揮する可能性がある。

【００３６】なお、本酵素の立体構造等から類推した場
合、アミノ末端残基は、活性中心と呼ばれる触媒機能を
発揮するアミノ酸残基からは遠く離れた場所にあり、こ
れを置換することによって、このように比活性が向上す
ることは予想できないことであり、またこの結果を特定
の化学結合の形成や静電的相互作用等によって説明する
ことは難しい。恐らく、このアミノ末端残基の置換が酵
素蛋白質全体の構造に何等かの影響を与え、酵素機能の
向上に寄与したのではないかと考えられる。

【００３７】また本発明におけるシャトルベクターは、
組換え枯草菌内での安定性が著しく向上したものであ
り、大量培養による本酵素の工業生産を行うためにも有
用であると考えられる。

【００３８】尚、本発明における配列表１は以下の様に
表現される。

【００３９】［配列表１］ 配列の長さ：３１６ トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源：バチルス属 Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu 20 25 30 Gln Asp Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys 35 40 45 Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn 50 55 60 Gln Phe Phe Ala Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr 65 70 75 Tyr Ala Gly Val Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg 80 85 90 Leu Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His 95 100 105 Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met 110 115 120 Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly 125 130 135 Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu Thr His Ala Val Thr Asp 140 145 150 Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu Ser Gly Ala Ile Asn 155 160 165 Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val Glu Phe Tyr Ala 170 175 180 Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val Tyr Thr Pro 185 190 195 Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Ala Lys 200 205 210 Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr Gln 215 220 225 Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala 230 235 240 Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val 245 250 255 Val Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala 260 265 270 Leu Thr Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg 275 280 285 Ala Ala Ala Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser 290 295 300 Gln Glu Val Ala Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val 305 310 315 Ｌｙｓ

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＭＫ４からプラスミドｐＵＣＴＺ
３７を構築する工程図である。

【図２】プラスミドｐＵＣＴＺ３７からプラスミドｐＵ
ＣＴＺ４７を構築する工程図である。

【図３】プラスミドｐＭＫ１からプラスミドｐＭＫ８を
構築する工程図である。

【図４】プラスミドｐＵＢＴＺ１からプラスミドｐＵＢ
ＴＺ２を構築する工程図である。

【図５】組換えプラスミドｐＭＫ１の場合の菌体濁度と
プラスミド保持率の経時変化を示した図である。

【図６】組換えプラスミドｐＵＢＴＺ１の場合の菌体濁
度とプラスミド保持率の経時変化を示した図である。

【図７】組換えプラスミドｐＵＢＴＺ２の場合の菌体濁
度とプラスミド保持率の経時変化を示した図である。

【図８】プラスミドｐＵＣＴＺ４７からｎｐｒＭ遺伝子
断片をバクテリオファージＭ１３ｍｐ１９にクローン化
する工程図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表１のアミノ酸配列のアミノ末端残基
   が他のアミノ酸残基に置換されていることを特徴とする
   新規なプロテアーゼ。
2. 【請求項２】配列表１のアミノ酸配列を有する耐熱性中
   性プロテアーゼあるいは該プロテアーゼの特定のアミノ
   酸残基を置換、改変したＤＮＡを含み、大腸菌および枯
   草菌で発現させることができるプラスミド。
3. 【請求項３】請求項１に記載された他のアミノ酸残基が
   フェニルアラニンである新規なプロテア−ゼ
4. 【請求項４】請求項１の新規なプロテア−ゼの製造法に
   おいて、請求項２のプラスミドを使用することを特徴と
   する新規なプロテアーゼの製造方法。