RU2136750C1 - МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПРОТЕАЗА ТЕРМОЛИЗИН-ПОДОБНОЙ НЕЙТРАЛЬНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗЫ, СПОСОБ СИНТЕЗА МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА И СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L- ФЕНИЛАЛАНИНА - Google Patents

МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПРОТЕАЗА ТЕРМОЛИЗИН-ПОДОБНОЙ НЕЙТРАЛЬНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗЫ, СПОСОБ СИНТЕЗА МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА И СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L- ФЕНИЛАЛАНИНА Download PDF

Info

Publication number
RU2136750C1
RU2136750C1 RU96115027A RU96115027A RU2136750C1 RU 2136750 C1 RU2136750 C1 RU 2136750C1 RU 96115027 A RU96115027 A RU 96115027A RU 96115027 A RU96115027 A RU 96115027A RU 2136750 C1 RU2136750 C1 RU 2136750C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
thermolysin
plasmid
benzyloxycarbonyl
aspartyl
modified protease
Prior art date
Application number
RU96115027A
Other languages
English (en)
Other versions
RU96115027A (ru
Inventor
Танака Йосиказу
Мияке Тосио
Ханзава Сатоси
Ое Сейгоу
Кидокоро Сунити
Мики Йоитиро
Индо Кимико
Вада Акийоси
Original Assignee
Сагами Кемикал Рисерч Сентр
ХОЛЛАНД СВИТЕНЕР КОМПАНИ В.о.Ф.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сагами Кемикал Рисерч Сентр, ХОЛЛАНД СВИТЕНЕР КОМПАНИ В.о.Ф. filed Critical Сагами Кемикал Рисерч Сентр
Publication of RU96115027A publication Critical patent/RU96115027A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2136750C1 publication Critical patent/RU2136750C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
    • C07K5/06121—Asp- or Asn-amino acid the second amino acid being aromatic or cycloaliphatic
    • C07K5/0613—Aspartame
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Модифицированная протеаза термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы имеет аминокислотную последовательность SEQ IDN:1, в которой 150-й остаток аспарагиновой кислоты замещен на триптофан. Возможно также проведение замещения 227-го остатка аспарагина на гистидин и/или 144-го остатка лейцина на серин. Модифицированная протеаза способна катализировать процесс синтеза и расщепления метилового эфира бензилоксикарбонил--α--L-аспартил-L-фенилаланина. 3 с. и 3 з.п.ф-лы, 13 ил., 1 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к новым термолизин-подобным нейтральным металло-протеазам и их применению, особенно для получения метилового эфира бензилоксикарбонил -α- -L-аспартил-L-фенилаланина.
Термолизин представляет собой ценный энзим, выпускаемый промышленностью и находящий применение в большом числе различных областей, например, в детергентных композициях, в процессах обработки пищи и в косметических рецептурах. Он также используется в синтезе метилового эфира бензилоксикарбонил -α- -L-аспартил-L-фенилаланина (далее в тексте на это вещество кратко ссылаются, как на Z-APM), который представляет собой предшественник аспартама, искусственного подслащивающего агента.
Описание уровня техники
Термолизин впервые был обнаружен в культуральном бульоне Bacillus thermoproteolyticus (Endo, s (1962) J. Fermentation Tech., 40, 346 - 353) и на этом объекте был проведен ряд исследований. Так, например, была установлена его аминокислотная последовательность (Titani. K. с сотр., (1972) Nature New Biol. 238. 35 - 37) и трехмерная структура энзима (Holmes M.A. и Mattews, B. W. , (1982) J. Mol.Biol. 160, 623-639). Между тем протеазный ген был клонирован из Bacillus thermoproteolyticus (EP-A-0418625) и аминокислотная последовательность зрелого энзима, выведенная из нуклеотидной последовательности указанного гена оказалась отличной от оригинальной первичной структуры, установленной Titani, по двум положениям. Так например, было сообщено, что 37-ой (считая от аминоконца) аминокислотный остаток зрелого энзима не является аспарагиновой кислотой, а представляет собой аспарагин, а 119-ый остаток является не глютаминовой кислотой а глютамином. Такая аминокислотная последовательность идентична последовательности закодированной nprM, одним из протеазных генов клонированных из Bacillus thermoproteolyticsu (Kubo, M с сотр., (1988) Journal of General Microb 134, 1883 - 1892).
В связи с этим, в настоящем описании на протеазу закодированную таким nprM геном или геном из Bacillus thermoproteolyticus ссылаются, как на "термолизин-подобную нейтральную металло-протеазу дикого типа".
Об изменении удельной активности и устойчивости термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы сообщалось (Kubo M. c сотр. (1992) Applied and Environmental Microbiology, 58, 3779-3783). В этой статье были описаны мутанты, которые отличаются одним или более аминокислотными остатками в первичной структуре, особенно в положениях 93, 110, 114, 115, 136, 137, 143, 151, 157, 193, 211, 217 и 221. Однако, в этой ссылке активность измеряли только методом казеинового переваривания. Однако, ни один из таких мутантов не демонстрировал сколь-нибудь значительно улучшенной активности в отношении синтеза или переваривания Z-APM. В настоящее время (как это показано в примерах заявки на Европейский патент авторов настоящего изобретения, заявка N 93200773.5) также было установлено, что активность казеинового переваривания не коррелирует с активностью в синтезе Z-APM: оказалось, что даже если удельная активность в отношении переваривания казеина увеличивается, удельная активность в отношении синтеза Z-APM увеличивается не всегда.
Кроме этого, авторы изобретения предварительно обнаружили, что ценные новые протеазы могут быть производными из термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы, имеющей (дикий тип) аминокислотную последовательность SEQ 1D No:1, показанную ниже, в результате замены одного или более аминокислотных остатков в некоторых положениях другими аминокислотными остатками отличными от исходных.
(SEQ 1D No:1)
Заявители уже подали заявку на Европейский патент (Заявка N 93200773.5) на такие новые модифицированные протеазы, полученные из указанного дикого типа в результате замены, по крайней мере одного из следующих аминокислотных остатков на отличающиеся от них аминокислоты: 144-ый (лейцин), 150-ый (аспаргиновая кислота), 187-ой (глютаминовая кислота) и 227-ой (аспарагин) аминокислотные остатки.
Удельная активность модифицированных энзимов, упомянутых в указанных более ранних заявках на патент (которые не опубликованы к дате подачи настоящей заявки), имеющих единственную аминокислотную замену в одном из положений 144, 150, 187 и 227, не более чем в два раза превышает активность энзима дикого типа в отношении синтеза или переваривания Z-APM.
На основании этих наблюдений и поскольку имеются различные проблемы в энзиматическом синтезе Z-APM, например такие, как относительно низкая активность энзима, его инактивация во время реакции конденсации и гидролиза Z-APM и исходного материала - метилового эфира L- или D, L-фенилаланина (PM), вследствие длительного времени реакции и/или неблагоприятных значений pH, существует необходимость в разработке усовершенствованных энзимов, обладающих повышенной активностью в синтезе Z-APM. Разумеется, что при упоминании PM в настоящей заявке могут подразумеваться и его соли.
Краткое изложение сущности изобретения
В настоящее время было неожиданно установлено, что усиление активности модифицированного энзима, имеющего триптофановый остаток в положении 150 в последовательности SEQ 1Д N: 1 во много раз превосходит такой эффект по сравнению с ранее описанными модифицированными протеазами.
На основании этих наблюдений было реализовано настоящее изобретение, на базе которого обеспечиваются модифицированные протеазы, имеющие аминокислотную последовательность, указанную выше (SEQ 1Д N:1) но с заменой, по крайней мере, 150-го аминокислотного остатка аспаргиновой кислоты (дикий тип) на триптофан. Таким образом предусматривается существенное усиление активности Z-APM синтеза под действием термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы, полученной из Bacillus stearothermophilus.
В связи с этим модифицированные протеазы согласно изобретению являются очень ценными веществами для крупномасштабного производства Z-APM.
Краткое описание чертежей
На рис. 1 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUCTZ37 из известной плазмиды pMK4.
На рис. 2 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUCTZ47 из плазмиды pMK 4 и плазмиды pUCTZ37.
На рис. 3 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUBTZ1 из известной плазмиды pUCTZ47 и плазмиды pUB110.
На рис. 4 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUBTZ2 из плазмиды pUBTZ1.
На рис. 5 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUBTZ2 (D150W) из плазмиды pUBTZ2 и фрагмента мутантной ДНК, полученного полимеразной цепной реакцией.
На рис. 6 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUCTZ55 из известной плазмиды pMK1.
На рис. 7 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантного M13 фага под названием M13TZSp-Bc из плазмиды pUCTZ55.
На рис. 8 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды pUBTZ2 (N227H мутант) из плазмиды pUBTZ2 и M13TZSp-Bc (N227H мутант).
На рис. 9 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUBTZ2 (D150W - N227H) из плазмиды pUBTZ2 и фрагмента мутантной ДНК, полученного полимеразной цепной реакцией.
На рис. 10 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды под названием pUBTZ2 (L144S) из плазмиды pUBTZ2 и фрагмента мутантной ДНК, полученного полимеразной цепной реакцией.
На рис. 11 показана схема, используемая для конструирования рекомбинатной плазмиды под названием UBTZ2 - (144S - D150W - N227H) из плазмиды pUBTZ2 (L144) и плазмиды pUBTZ2 (D150W N 227).
На рис. 12 показаны Z-APM синтетические активности модифицированных энзимов. Для аминокислот приняты однобуквенные сокращения. "D" в 150-ом аминокислотном остатке обозначает термолизин-подобную нейтральную металло-протеазу дикого типа. Энзиматическая активность, обеспечивающая синтез 1 моля Z-APM в секунду обозначена, как 1 катал (kat).
На рис. 13 представлены гидролитические активности модифицированных энзимов в отношении Z-APM.20.
Подробное описание изобретения
В упомянутой выше более ранней заявке на патент раскрываются модифицированные протеазы, в 150-ом положении которых аспаргиновая кислота заменена на аспарагин, гистидин и лизин. Активности таких модифицированных протеаз в сентезе или гидролизе Z-APM были в лучшем случае в 2 раза выше, чем активность термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы дикого типа.
Новые модифицированные протеазы согласно настоящему изобретению представляют собой производные, имеющие триптофановой остаток вместо аспаргинокислотного остатка в 150-ом положении последовательности термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы, SEQ 1Д N: 1 (Далее они обозначены, Как D150W). Главным образом такие новые протеазы обладают существенно усиленной активностью в синтезе и/или переваривании Z-APM. Пригодность протеаз, полученных согласно изобретению, может быть определена тестами на окончательную применимость. Обычно такое испытание проводится путем анализа активности в синтезе и/или переваривании Z-AMP и сравнения полученных активностей с активностью термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы дикого типа, испытанной в аналогичных условиях. Такой метод описан в следующих ниже примерах.
Другие положения модифицированных протеаз (D150W) могут быть замены другими аминокислотными остатками. Так например, были синтезированы двух-сайтный мутант, в 150-ом положении которого была произведена замена аспаргиновой кислоты на триптофан, а в 227-ом положении - замена аспарагина на гистидин (D150W - N227H) и трех-сайтный мутант, в 114-ом положении которого лейцин заменяли на серин, в 150-ом положении аспаргиновую кислоту заменяли на триптофан, а в 227-ом положении аспарагин заменяли на гистидин (L144S - D150W - N227H) и было показано, что такие мутанты очень активны и стабильны в синтезе Z-AMP.
Модифицированные энзимы могут быть получены методами, известными perse специалистам в данной области.
Известны различные способы, которые могут использоваться для введения мутаций в клонированные ДНК. Так например, фрагменты мутантного nprM гена могут быть получены с использованием метода мутагенеза фаза M13 (Vandeyar с сотр. (1988) Gene, 65, 129).
Плазмидные и фаговые ДНК, используемые в качестве матриц в таком способе, могут быть производными известной плазмиды pMK1 (Kubo M., Imanaka T., (1989), J. Bacteriol, 171, 4080 - 4082). Некоторые рестриктазы могут использоваться для переваривания и клонирования фрагментов nprM гена в другую плазмиду или в фаговые векторы. Мутагенные праймеры должны быть комплементарны к одно-нитевой матричной ДНК, содержащей nprM ген, за исключением кодона (ов) для замененных аминокислотных остатков. Различные нуклеотидные последовательности также могут использоваться для таких целей. При использовании таких мутагеных праймеров, имеющих различные кодоны для замененных аминокислотных остатков, могут быть достигнуты любые желательные замены аминокислот.
С другой стороны, nprM ген может быть подвергнут мутации с помощью PCR техники (полимеразная цепная реакция) с использованием химически синтезированных праймеров (Higuchi R. , Krummel B., Saiki R. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 7351 - 7367). В том случае, когда сайт рестрикционного энзима существует вблизи от сайта мутации, метод PCR оказывается особенно полезным. Поскольку, например, сайт расщепления для рестрикционного энзима Sphl находится вблизи кодона аспаргиновой кислоты в 150-ом положении термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы дикого типа, мутагенные праймеры, содержащие такой Sphil сайт могут использоваться для продуцирования мутантов в 150-ом положении. Таким образом, мутагенный праймер используется в качестве смыслового праймера. В качестве обратно-направляющего праймера (антисмыслового) может использоваться олигонуклеотид, который комплиментарен nprM гену вправо, например, от сайта расщепления AatI nprM гена.
Два способа могут использоваться для осуществления мутагенеза на более, чем одном сайте. Один способ заключается в осуществлении одновременного мутагенеза на всех сайтах-мишенях, тогда как другой способ включает введение мутаций последовательно. Оба способа обеспечивают получение плазмид с мутациями на более, чем одном сайте.
Основной способ получения рекомбинантной термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы описан в литературе (Kubo M., Imanaka T. (1989) J.Bacteriol, 171, 4080 - 4082) и он включает: вставку ДНК, кодирующий модифицированную термолизин-подобную нейтральную металло-протеазу, в вектор экспрессии, использование такого вектора для трансформации клетки-хозяина, культивирование трансформанта до аккумуляции модифицированной металло-протеазы в культуре и последующее отделение модифицированного энзима от культуры. Однако, плазмида pMK1, используемая в этой ссылке, имеет размер более 20 kb и поэтому довольно трудно трансформировать Escherichia coli с помощью указанной плазмиды. Кроме этого было обнаружено, что в случае Bacillus subtilis плазмида pMK1 в значительной мере выбирает на последней стадии культивирования.
В связи с этим, с целью снятия указанных проблем авторы изобретения сконструировали бифункциональные векторы, с помощью которых оба хозяина, Escherichia coli и Bacillus subtilis, способны подвергаться трансформации и которые способны экспрессировать nprM ген в этих хозяевах. Как показано на рис. 1 - 4 таким образом были сконструированы два бифункциональных вектора, содержащих nptM ген (pUBTZ1 и pUBTZ2). При их использовании для трансформации таких штаммов Escherichia coli, как HB101 и JM103, nprM ген экспрессируется в таких штаммах. Кроме того, трансформация таких штаммов разновидности Bacillus subtilis, как DB104, DB117 и MT-2, такими плазмидами приводит к успешной экспрессии nprM гена. Кроме этого, на последней стадии культивирования не наблюдалось их выхода из процесса.
Аналогичные результаты и преимущества использования таких бифункциональных векторов достигались при использовании модифицированных термолизин-подобных нейтральных металло-протеазных генов, вместо гена дикого типа.
Модифицированная термолизин-подобное нейтральная металло-протеаза может вырабатываться в рекомбинантных бактериях и секретироваться в культуральную среду. Такие протеазы могут быть извлечены осаждением с помощью сульфата аммония и очищены до гомогенности традиционными способами, например, хроматографией гидрофобного взаимодействия и/или гельфильтрацией.
Модифицированные протеазы могут использоваться для синтеза Z-AMP, являющегося предшественником аспартама, более эффективно, чем термолизин-подобная нейтральная металло-протеаза дикого типа. На этот факт указывает сравнение активностей таких модифицированных протеаз и энзимов дикого типа в переваривании Z-APM и синтезе Z-APM. Такие активности оказались значительно выше, чем у энзима дикого типа и у модифицированных протеаз, описанных в упомянутой выше заявке на Европейский патент (заявка N 93200773.5). Измеренные значения таких активностей будут приведены в следующих ниже примерах.
Как отмечалось выше, новые модифицированные протеазы согласно изобретению представляют собой термолизин-подобные нейтральные металло-протеазы с последовательностью SEQ 1D No:1, в которой 150-ый аспаргиновокислотный остаток заменен на триптофан (D150W).
Следует отметить, что активность казеинового переваривания не связана с активностью в синтезе или переваривании Z-APM. При сравнении активностей мутантных энзимов для казеина и Z-APM совершенно очевидно, что даже если активность в переваривании казеина понижается, то активность в синтезе и/или переваривании Z-APM может значительно увеличиваться. Следующие ниже примеры представлены лишь в целях иллюстрации настоящего изобретения и никоим образом не ограничивают его сферу.
Пример 1.
/Синтез модифицированной протеазы, в последовательности которой 150-ый кислотный остаток заменен с аспаргиновой кислоты на триптофан (D150W)/
a) Конструирование экспрессирующей плазмиды pUBTZ2, содержащей nprM ген дикого типа.
Из плазмиды pMK4 (Yamada с сотр., (1991) Gene, 99, 109 - 114), фрагмент ДНК размером примерно 1,0 kb, содержащий часть nprM гена, который был получен расширением BcLI клонировали в BamHI-сайт плазмиды pUC9 с целью конструирования плазмиды pUCTZ37 (Рис. 1).
Плазмида pUCTZ37 была неполной и не содержала 5'-концевого участка nprM гена. Плазмиду pUCTZ37 расщепляли рестрикционной эндонуклеазой HindIII и HindIII фрагмент pMK4 размером 1,2 kb клонировали в более крупный фрагмент pUCTZ37 для конструирования плазмиды pUCTZ47 (Рис. 2). Рекомбинантная плазмида pUCTZ47 содержит последовательность nprM полной длины и его транскрипционную промоторную последовательность.
Для конструирования бифункциональных векторов для Escherichia coli и Bacillus subtilis, как pUCTZ47, так и pUB110 (Keggins K.M. с сотр., Proc, Natl. Ac. Sci USA (1978), 75, 1423 - 1427) расщепляли EcoRI и лигировали T4 ДНК лигазой с целью конструирования плазмиды pUBTZ1, как это показано на Рис. 3.
Наконец, фрагмент ДНК между рестрикционными сайтами Smal и Pvull подвергали делеции из плазмиды pUBTZ1, как это показано на рис. 4, с целью конструирования плазмиды pUBTZ2.
Плазмида pUBTZ2 имеет единственные BamHI, SphI и AatI рестрикционные сайты в nprM гене.
b) Мутагенез сайта 150 Trp
Олигонуклеотиды, используемые для мутагенеза, синтезировали с использованием ДНК синтезатора модели 380B, выпускаемого Апплайд Биосистемс Ко. Лтд. Нуклеотидная последовательность праймера мутагенеза была следующей
(SEQ 1D No:2)
Figure 00000002

Кроме этого синтезировали обратно-направляющий праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной ниже.
(SEQ 1D No:3)
5'-GAGATACCACTTTATTTCACCCCT-3'
1 нг плазмиды pUBTZ2 растворяли в 100 мкл реакционной смеси для PСR (67 мМ Трис-гидрохлорида (pH 8.8), 16,6 мМ сульфата аммония, 6.7 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0.05 мМ dATP, 0.05 мМ dTTP, 0.05 мМ dGTP, 0,05 мМ dCTP, 1 мкМ праймера мутагенеза, 1 мкМ обратно-направляющего праймера) и добавляли 1 единицу Tth ДНК-полимеразы. Раствор покрывали одной каплей минерального масла. Денатурацию в течение 1 минуты при 93oC, отжиг в течение 1 минуты при 45oC и удлинение в течение 45 секунд при 72oC повторяли 30 раз. После завершения реакции водный слой удаляли, экстрагировали фенолом и обрабатывали этанолом для выделения амплифицированной ДНК.
20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7.5, 10 мМ MgCl2, 0.1 M NaCl, 1 мМ ДТТ), содержащей половинное количество амплифицированной ДНК переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов SphI и AatI при 37oC в течение 2 часов и инкубировали в течение 5 минут при 70oC. Мутированный SphI - AatI фрагмент лигировали с SphI - AatI фрагментом pUBTZ2 (7.6 kb) с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Escherichia coli JM103, используя традиционный способ с получением трасформанта JM103/pUBTZ2 (D150W). Замещенные аминокислоты подтверждали путем определения нуклеотидной последовательности такой плазмиды.
c) Приготовление очищенного мутантного энзима из рекомбинантной Bacillus subtilis
Описанную выше плазмиду ДНК экстрагировали быстрым щелочным-SDS методом (Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook Jr., (1989), Молекулярное клонирование: лабораторное руководство (2-ое изд.) Колд Спринг Харбор Лаборатори Пресс, Колд Спринг Харбор, Н-Й. США. 1.25 - 1.28). Трансформацию Bacillus subtilis MT-2 штамма осуществляли способом компетентных клеток (Harby K. (1985) в: Glover D. , ред. Клонирование ДНК, т. 11 (1-е изд.), IRL) Пресс Лимитед. Оксфорд. Англия, 1 - 17).
Одну колонию полученного таким образом трансформанта Bacillus subtilis MT-2/pUBTZ2 (D150W) переносили в 5 мл LB среды, содержащей канамицин (5 мкг/мл) и инкубировали в течение ночи при 37oC. Культуру переносили в 500 мл 2 L среды (2% триптона Бакто, 1% дрожжевого экстракта, 0.5% NaCl), содержащей канамицин (5 мкг/мл) и инкубировали в течение 20 часов при 37oC. Культуральный бульон центрифугировали в течение 30 минут со скоростью 8000 об/мин для удаления бактерий, к супернатанту добавляли сульфат аммония до достижения 60% насыщения и смесь перемешивали в течение ночи при 4oC.
Осадок удаляли центрифугированием и растворяли в 10 мл буфера A (20 мМ Трис-гидрохлорида при pH 9.0 10 мМ CaCl2). Раствор наносили на 20 мл Butyl-Toyopearl, после чего элюировали буфером A при скорости потока 1,5 мл/мин. Активные фракции объединяли и обессоливали с помощью 60% насыщенного сульфата аммония. Осадок собирали центрифугированием в течение 30 минут со скоростью 15000 об/мин и растворяли в 5 мл буфера B (10 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,0, 0,1 M NaCl, 10 мМ CaCl2). Энзимный раствор дополнительно пропускали через гель-фильтрационную колонку (TSK Гель G2000( 21,5 x 300 мм)), с последующим элюированием буфером B с объемной скоростью 1 мл/мин. Активные фракции объединяли с получением очищенного энзима.
На рис. 5 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды pUBTZ2 (D150W).
Пример 2
/Синтез модифицированной протеазы с двойной заменой на 150-ом аминокислотном остатке аспаргиновой кислоты на триптофан и на 227-ом аминокислотном остатке аспарагина на гистидин (D150W - N227H)/
D150W - N227H двух-сайтный мутант термолизин-подобной нейтральной металло-протеазы конструировали следующим образом:
а) мутагенез сайта 227 His
1 мкг плазмиды рМК1, содержащей термолизин-подобный нейтральный металло-протеазный ген nprM, производный из Bacillus stearothermophilus MK 232 (Kubo M. , и Imanaka T (1989) J. Becteriol 171, 4080 - 4082) переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов Pst I и BamHI в 20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 0,1 M NaCl, 1 мM ДДТ) при 37oC в течение 2 часов. Образец подвергали гельэлектрофорезу на 1% агарозе и фрагмент ДНК размером примерно 3,5 kb выделяли и очищали с помощью набора для очистки ДНК Био-101 Ген Клин.
Отдельно, 1 мкг плазмиды pUC9 переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов PstI и BamHI в 20 мкл такой же реакционной среды, что указана выше в течение 2 часов при 37oC.
PstI - BamHI фрагмент nprM гена лигировали с PstI - BamHI фрагментом pUC9 с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Escherichia coli JM109 традиционным способом с получением рекомбинантной плазмиды (pUCTZ55), содержащей PstI - BamHI фрагмент nprM гена (рис. 6).
1 мкг рекомбинантной плазмиды pUCTZ55 переваривали 5 единицами каждого из SphI и BClI в 20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 0,1 M NaCl, 1 мМ ДДТ) при 37oC в течение 2 часов. Образец подвергали гельэлектрофорезу на 1% агарозе и фрагмент ДНК размером примерно 550 bp выделяли и очищали с использованием набора для очистки ДНК Био-101 Ген Клин.
Отдельно, 1 мкг фагового вектора M13mp18 переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов SphI и BamHI в 20 мкл такой же реакционной среды, что указана выше, в течение 2 часов при 37oC.
SphI - BclI фрагмент nprM гена лигировали с SphI - BamHI фрагментом M13mp18 с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Esherichia coli JM109 традиционным способом с получением рекомбинантного фага (M13TZSp-Bc), содержащего SphI - BclI фрагмента nprM гена (рис. 7).
Однонитевую ДНК получали из M13TZSp-Bc традиционным способом и подвергали мутагенезу. Олигонуклеотиды, используемые для мутагенеза, получали с использованием ДНК-синтезатора фирмы Апплайд Биосистемс модель 380В.
Мутагенный олигонуклеотид, используемый для замены 227-го остатка (аспарагин на гистидин), показан ниже.
(SEQ 1Д No:4)
Figure 00000003

Мутагенез осуществляли с использованием USBT7-GEN in vitro мутагенного набора, после чего устанавливали последовательность ДНК для подтверждения мутации.
Двунитевую ДНК мутированной M13TZSp - Bc получали традиционным способом и 1 мкг двунитевой ДНК переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов SphI и AatI в 20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 0,1 М NaCl, 1 мМ ДДТ) в течение 2 часов при 37oC и подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле. Фрагмент ДНК размером около 550 bp выделяли из M13TZSp - Bc переваров и фрагмент ДНК очищали с использованием набора для очистки ДНК Био-101 Ген Клин.
Плазмиду pUBTZ2 переваривали рестрикционными энзимами SphI и AatI и выделяли фрагмент размером 7,6 kb. Мутированный SphI и AatI фрагмент nprM гена (около 550 bp) лигировали с помощью полученного таким образом SphI и AatI фрагмента pUBTZ2 с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Escherichia coli JM103 традиционным способом с получением рекомбинантной плазмиды pUBTZ2 (N227H) (рис. 8).
b) Мутагенез сайта 150 Trp и получение мутантного энзима (D150W - N 227H)
Плазмиду pUBTZ2 (N227H) использовали в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции. Использовали мутагенезный праймер последовательности SEQ 1Д No:2 и обратно-направляющий праймер последовательности SEQ 1Д No:3.
1 нг плазмиды pUBTZ2 (N227H) растворяли в 100 мкл реакционной смеси PCR (67 мМ Трис-гидрохлорида при pH 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,05 мМ dATP, 0,05 мМ dTTP, 0,05 мМ dGTP, 0,05 мМ dCTP, 1 мкМ мутагенезного праймера, 1 мкм обратно-направляющего праймера) и добавляли 1 единицу Thh ДНК полимеразы. Раствор покрывали одной каплей минерального масла. Денатурацию в течение 1 минуты при 93oC, отжиг в течение 1 минуты при 45oC и удлинение в течение 45 секунд при 72oC повторяли 30 раз. После завершения реакции водный слой удаляли, экстрагировали фенолом и обрабатывали этанолом для извлечения амплифицированной ДНК (D150W - N227H).
20 мкл реакционной среды (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ ДДТ), содержащей половинное количество амплифицированной ДНК переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов SphI и AatI при 37oC в течение 2 часов и инкубировали в течение 5 минут при 70oC. Мутированный SphI - AatI фрагмент лигировали с 7,6 kb SphI - AatI фрагментом pUBTZ2 с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Escherichia coli JM103 традиционным способом с получением трансформанта JM103/pUBTZ2 (D150W - N227H). Замещенную аминокислоту подтверждали определением нуклеотидной последовательности такой плазмиды.
Плазмидную ДНК использовали для трансформации Bacillus subtilis MT-2 и модифицированную протеазу (D150W - N227H) получали тем же способом, что описан в примере 1.
На рис. 9 показана схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды pUBTZ2 (D150W - N227H).
Пример 3
/Синтез модифицированной протеазы с тройным замещением: лейцина на серин на 144-ом аминокислотном остатке, аспаргиновой кислоты на триптофан на 150-ом аминокислотном остатке и аспарагина на гистидин на 227-ом аминокислотном остатке (L144S - D 150W - N227H)/
Трех-сайтный мутант термолизин-подобный нейтральный металло-протеазы конструировали следующим образом.
a) Мутагенез сайта 144 Ser.
Мутагенный олигонуклеотид, используемый для замены 144-го остатка (лейцина на серин), показан ниже.
(SEQ 1Д No: 5)
Figure 00000004

Кроме этого синтезировали смысловой праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной ниже.
(SEQ 1Д No: 6)
Figure 00000005

1 нг плазмиды pUBTZ2 растворяли в 100 мкл реакционной смеси для PCR (67 мМ Трис-гидрохлорида при pH 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,05 мМ dATP, 0,05 мМ dTTP, 0,05 мМ dGTP, 0,05 мМ dCTP, 1 мкМ мутагенезного праймера, 1 мкм смыслового праймера), и добавляли 1 единицу Tth ДНК полимеразы. Раствор покрывали одной каплей минерального масла. Денатурацию в течение 1 минуты при 93oC, отжиг в течение 1 минуты при 45oC и удлинение в течение 45 секунд при 72oC повторяли 30 раз. После завершения реакции водный слой удаляли, экстрагировали фенолом и обрабатывали этанолом для извлечения амплифицированной ДНК.
20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 0,1 М NaCl, 1 мМ ДДТ), содержащей половинное количество амплифицированной ДНК, переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов BamI и SphI при 37oC в течение 2 часов, после чего инкубировали в течение 5 минут при 70oC. Мутированный BamI - SphI фрагмент лигировали с BamI - SphI фрагментом pUBTZ2 (7,4 kb) с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Escherichia coli JM103 традиционным методом с получением трансформанта JM103/pUBTZ2 (L144S). Замещенную аминокислоту подтверждали определением нуклеотидной последовательности такой плазмиды.
На рис. 10 приведена схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды .
b) Конструирование плазмиды pUBTZ2 (L144S - D150W - N227H)
20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 0,1 М NaCl, 1 мМ ДДТ), содержащей 1 мкг pUBTZ2 (D150W - N227H), полученной в примере 2, переваривали 5 единицами каждого из рестрикционных энзимов SphI и AatI в течение 2 часов при 37oC и инкубировали в течение 5 минут при 70oC. Мутантный SphI - AatI фрагмент лигировали с 7,6 kb SphI - AatI фрагментом pUBTZ2 (L144S) с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Escherichia coli JM103 традиционным способом с получением трансформанта JM103/pUBTZ2 (L144S - D150W - N227H). Замещенную аминокислоту подтверждали определением нуклеотидной последовательности такой плазмиды.
Плазмидную ДНК использовали для трансформации Bacillus subtilis MT-2 и модифицированную протеазу (L144S - D150W - N227H) получали тем же способом, что описан в примере 1.
На рис. 11 приведена схема, используемая для конструирования рекомбинантной плазмиды pUBTZ2 (L144S - D150W - N227H).
Пример 4.
/Определение активности модифицированных протеаз/
(1) Активность в синтезе Z-APM
Z-APM синтетическую активность определяли методом жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) после реакции конденсации бензилоксикарбонил-L-аспаргиновой кислоты (Z-Asp) с гидрохлоридом метилового эфира L-фенилаланина (L-PM). Мутантную протеазу инкубировали с 0,1 M Z-Asp и 0,1 M L-PM в 0,1 M Трис-малеатном буфере (pH 6 и 7) при 35oC в течение 30 минут. Реакцию обрывали добавлением равного объема 0,125 М ЕДТА. Количество синтезированной Z-APM определяли методом HPLC на колонке с космосил C-18 (Nakalai tesgue). HPLC осуществляли с помощью 60 мМ Триэтиламин-фосфатного буфера (pH 3,0), содержащего 40% ацетонитрила в качестве элюента, при скорости потока 1,0 мл/мин. и элюированный Z-APM определяли по поглощению при длине волны 224 нм. Активность синтеза 1 моля Z-APM в секунду определяли, как 1 катал (kat).
В целях сравнения авторы изобретения также синтезировали и исследовали все другие D150 мутанты с использованием случайного мутагенезного праймера.
Нуклеотидная последовательность случайного мутагенезного праймера была следующей:
Figure 00000006

Кодон 150-ой аминокислоты где каждый Х, независимо друг от друга, представляет собой G, A, T или C.
Такой праймер имеет изменчивость на команде 150-го аминокислотного остатка и может вводить все 20 аминокислотных остатков в 150-е положение. Авторы изобретения ввели различные мутации в 150-е положение с использованием мутагенезного праймера и изучили их все, за исключением триптофана.
1 нг плазмиды pUBTZ2 растворили в 100 мкл реакционной смеси PCR (67 мМ трис-гидрохлорида при pH 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола. 0,05 мМ dATP 0,05 мМ dTTP, 0,05 мМ dGTP, 0,05 dCTP, 1 мкМ мутагенезного праймера, 1 мКм обратно-направляющего праймера) и добавляли 1 единицу Tth ДНК полимеразы. Раствор покрывали одной каплей минерального масла. Денатурацию в течение 1 минуты при 93oC, отжиг в течение 1 минуты при 45oC и удлинение в течение 45 секунд при 72oC повторяли 30 раз. После завершения реакции водный слой удаляли, экстрагировали фенолом и обрабатывали этанолом для извлечения амплифицированной ДНК.
20 мкл реакционной смеси (50 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 0,1 M NaCl, 1 мМ ДТТ), содержащей половинное количество амплифицированной ДНК, переваривали 5 единицами каждого из SphI и AatI при 37oC в течение 2 часов и инкубировали в течение 5 минут при 70oC. Мутантный SphI - AatI фрагмент лигировали с 7,6 kb SphI - AatI фрагментом pUBTZ2 с использованием набора для лигирования ДНК Takara Shuzo. Лигирующую смесь использовали для трансформации Escherichia coli Jm103 традиционным способом с получением трансформанта JM103/pUBTZ2. Замещенную аминокислоту подтверждали определением нуклеотидной последовательности плазмиды.
Плазмидную ДНК, за исключением D150W мутанта, выделяли быстрым щелочным - SDS методом. Трансформацию штамма Bacillus subtilis МТ-2 проводили способом компетентных клеток.
Одну колонию каждого различного Bacillus subtilic МТ-2/pUBTZ2 (мутантного) трансформанта инокулировали в 5 мл LB среды, содержащей канамицин (5 мкг/мл), и инкубировали при 37oC в течение ночи. Культуру переносили в 500 мл 2L среды (2% Бакто триптона, 1% дрожжевого экстракта, 0,5% NaCl), содержащей канамицин (5 мкг/мл), и инкубировали при 37oC в течение 20 часов. Культуральный бульон центрифугировали со скоростью 8000 об/мин в течение 30 минут для удаления бактерий, к супернатанту добавляли сульфат аммония до достижения 60% насыщения и смесь перемешивали в течение ночи при 4oC.
Осадок извлекали центрифугированием и растворяли в 10 мл буфера A (20 мМ Трис-гидрохлорида при pH 9,0,10 мМ CaCl2). Энзимный раствор наносили на 20 мл Butil-Toypearl с последующим элюированием буфером A при скорости потока 1,5 мл/мин. Активные фракции объединяли и подвергали обработке 60% насыщенным сульфатом аммония. Осадок собирали центрифугированием со скоростью 15000 об/мин в течение 30 минут и растворяли в 5 мл буфера B (20 мМ Трис-гидрохлорида при pH 7,5, 10 мМ CaCl2). Энзимный раствор дополнительно пропускали через гель-фильтрационную колонку (TSK Гель G2000SW (21,5х300 мМ)), с последующим элюированием буфером B при скорости потока 1 мл/мин. Активные фракции объединяли с получения каждого очищенного энзима.
Синтетические активные модифицированных протеаз в которых 150-ый аспаргиново-кислотный остаток заменен на другие аминокислотные остатки (D150W мутанты) показаны на рис. 12. Мутант, у которого 150-ый аспаргиновокислотный остаток заменен на триптофан (D150W) проявляет явно более высокую удельную активность примерно в 4 раза более высокую, чем активность термолизина дикого типа (D), при этом большинство других мутантов проявляет более высокие активности, чем термолизин дикого типа (D), однако, эти активности значительно ниже, чем активность D150W. Совершенство очевидно, что триптофановый мутант обладает наивысшей активностью.
Активность, определенная для двух дополнительных мультисайтных мутантов, а именно, 2-сайтного мутанта D150W - N227H (т.е. при замене аспаргиновой кислоты на триптофан в положении 150 и аспарагина на гистидин в положении 227), а также 3-сайтного мутанта L144S - D150W - N227H (т.е. при замене лейцина на серин в положении 144, аспаргиновой кислоты на триптофан в положении 150 и аспарагина на гистидин в положении 227) еще выше, как это следует из данных, представленных в таблице 1. (2) Z-APM гидролитическая активность.
Гидролиз Z-APM в Z-Asp и PM в присутствии модифицированных протеаз измеряли, наблюдая уменьшение поглощения при длине волны 224 нм в соответствии с методом Inoue (Inoue K., (1992), J. Biochem 112, 335-340). Три мл 1 мМ Z-APM, растворенного в 0,1 М Трис-гидрохлоридном буфере (pH 7,0), инкубировали в присутствии модиицированных протеаз при 35oC и регистрировали уменьшение оптического спектрального поглощения при длине волны 224 нм. Количество гидролизованного Z-APM определяли по разнице в молярном коэффициенте поглощения Δε 224, которая согласно расчету составила - 493 (М-1. см-1).
Активности D150 мутантов показаны на рис. 13. D150W мутант обладает весьма высокой активностью, которая примерно в 4 раза выше активности термолизина дикого типа. Большинство других мутантов обладают активностями в гидролизе Z-APM, которые лишь в 1-3 раза выше активности термолизина дикого типа (D). Триптофановый мутант обладает явно более высокой активностью.
Активности D150W - N227H и L144S - D150W - Т227H также указаны в таблице 1. Их активности в отношении гидролиза Z-PMA в 6-7 раз и в 9-10 раз выше чем активность дикого типа.

Claims (6)

1. Модифицированная протеаза термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы, имеющая аминокислотную последовательность SEQID N : 1, в которой 150-ый остаток аспарагиновой кислоты заменен на триптофан.
2. Модифицированная протеаза термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы по п. 1, отличающаяся тем, что в указанной модифицированной протеазе дополнительно 227-ой остаток аспарагина заменен на гистидин.
3. Модифицированная протеаза термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что в указанной модифицированной протеазе дополнительно 144-ый лейциновый остаток заменен на серин.
4. Модифицированная протеаза термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы по любому из пп.1 - 3, отличающаяся тем, что модификация обеспечивает применение ее для синтеза или расщепления метилового эфира бензилоксикарбонил-α-L-аспартил L-фенилаланина.
5. Способ синтеза метилового эфира бензолоксикарбонил-α-L-аспартил-L-фенилаланина, включающий контактирование раствора-субстрата, содержащего бензилоксикарбонил-α-L-аспарагиновую кислоту и метиловый эфир L- или D, L-фенилаланина, с нейтральной металлопротеазой, отличающийся тем, что металлопротеаза представляет собой модифицированную протеазу по любому из пп.1 - 3.
6. Способ расщепления метилового эфира бензилоксикарбонил-α-L-аспартил-L-фенилаланина, включающий контактирование раствора-субстрата, содержащего бензилокси-карбонил-α-L-аспарагиновую кислоту и метиловый эфир L- или D, L-фенилаланина, с нейтральной металлопротеазой, отличающийся тем, что металлопротеаза представляет собой модифицированную протеазу по любому из пп.1 - 3.
RU96115027A 1993-12-07 1994-12-06 МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПРОТЕАЗА ТЕРМОЛИЗИН-ПОДОБНОЙ НЕЙТРАЛЬНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗЫ, СПОСОБ СИНТЕЗА МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА И СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L- ФЕНИЛАЛАНИНА RU2136750C1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP30650893 1993-12-07
JP5-306508 1993-12-07
PCT/JP1994/002050 WO1995016029A1 (en) 1993-12-07 1994-12-06 Mutants of a thermostable neutral protease from bacillus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU96115027A RU96115027A (ru) 1998-10-20
RU2136750C1 true RU2136750C1 (ru) 1999-09-10

Family

ID=17957875

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU96115027A RU2136750C1 (ru) 1993-12-07 1994-12-06 МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПРОТЕАЗА ТЕРМОЛИЗИН-ПОДОБНОЙ НЕЙТРАЛЬНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗЫ, СПОСОБ СИНТЕЗА МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА И СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L- ФЕНИЛАЛАНИНА

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5728544A (ru)
EP (1) EP0728196B1 (ru)
KR (1) KR100344204B1 (ru)
CN (1) CN1141649A (ru)
AU (1) AU1121495A (ru)
CA (1) CA2177381A1 (ru)
DE (1) DE69432599D1 (ru)
RU (1) RU2136750C1 (ru)
WO (1) WO1995016029A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2536255C2 (ru) * 2007-11-01 2014-12-20 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Продуцирование термолизина и его вариантов и его использование в жидких детергентах

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997021804A1 (fr) * 1995-12-11 1997-06-19 Sagami Chemical Research Center Nouvelle protease analogue a la thermolysine et son utilisation
US6521440B1 (en) * 1997-09-15 2003-02-18 Genencor International, Inc. Proteases from gram-positive organisms
KR20140027423A (ko) * 2005-10-12 2014-03-06 다니스코 유에스 인크. 저장-안정성 중성 메탈로프로테아제의 용도 및 제조
US9828597B2 (en) 2006-11-22 2017-11-28 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Biofunctional materials
US10988714B2 (en) 2010-06-21 2021-04-27 Regents Of The University Of Minnesota Methods of facilitating removal of a fingerprint from a substrate or a coating
US8796009B2 (en) * 2010-06-21 2014-08-05 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Clearcoat containing thermolysin-like protease from Bacillus stearothermophilus for cleaning of insect body stains
US11015149B2 (en) 2010-06-21 2021-05-25 Toyota Motor Corporation Methods of facilitating removal of a fingerprint
US9121016B2 (en) 2011-09-09 2015-09-01 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Coatings containing polymer modified enzyme for stable self-cleaning of organic stains
US9388370B2 (en) 2010-06-21 2016-07-12 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Thermolysin-like protease for cleaning insect body stains
CN111944790B (zh) * 2020-07-01 2022-09-09 深圳润康生态环境股份有限公司 中性蛋白酶基因、中性蛋白酶及其制备方法和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04349883A (ja) * 1991-05-28 1992-12-04 Tosoh Corp 修飾サ−モリシン様酵素及びこの酵素を用いるアルファ−ｌ−アスパラチル−ｌ−フェニルアラニンメチルエステル前駆体の合成方法
US5496710A (en) * 1992-06-08 1996-03-05 Sagami Chemical Research Center Protease
CA2093199A1 (en) * 1992-06-08 1993-12-09 Hiromasa Nagao Protease
EP0616033B1 (en) * 1993-03-17 2001-06-13 Holland Sweetener Company V.O.F. Mutants of a thermostable neutral protease from Bacillus

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
T.Jmanaka et al. "A new way of enhancing the thermostability of proteases" Nature, 1986, v. 324, N 6098, pp. 695 - 697. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2536255C2 (ru) * 2007-11-01 2014-12-20 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Продуцирование термолизина и его вариантов и его использование в жидких детергентах
RU2733541C2 (ru) * 2007-11-01 2020-10-05 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Продуцирование термолизина и его вариантов и его использование в жидких детергентах

Also Published As

Publication number Publication date
DE69432599D1 (de) 2003-06-05
CA2177381A1 (en) 1995-06-15
EP0728196B1 (en) 2003-05-02
EP0728196A1 (en) 1996-08-28
US5728544A (en) 1998-03-17
AU1121495A (en) 1995-06-27
WO1995016029A1 (en) 1995-06-15
KR100344204B1 (ko) 2002-11-30
CN1141649A (zh) 1997-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3471797B2 (ja) 安定化酵素及び洗剤
AU614929B2 (en) Non-human carbonyl hydrolase mutants,DNA sequences and vectors encoding same and hosts transformed with vectors
US5801039A (en) Enzymes for detergents
US5543302A (en) Proteases of altered stability to autolytic degradation
RU2136750C1 (ru) МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПРОТЕАЗА ТЕРМОЛИЗИН-ПОДОБНОЙ НЕЙТРАЛЬНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗЫ, СПОСОБ СИНТЕЗА МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА И СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ МЕТИЛОВОГО ЭФИРА БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-α-L-АСПАРТИЛ-L- ФЕНИЛАЛАНИНА
EP0516200A1 (en) Detergent compositions containing stabilized enzymes
Van den Burg et al. A highly thermostable neutral protease from Bacillus caldolyticus: cloning and expression of the gene in Bacillus subtilis and characterization of the gene product
US5496710A (en) Protease
EP0616033B1 (en) Mutants of a thermostable neutral protease from Bacillus
EP0416967B1 (en) Novel alkaline protease
JP2001510037A (ja) グラム陽性微生物からのプロテアーゼ
KR0180749B1 (ko) 프로테아제 및 그 이용방법
WO1994019371A1 (fr) Nouveau peptide presentant une activite inhibitrice de l'elastase et son procede de production
US20020103100A1 (en) Nucleic acids encoding polypeptides having proteolytic activity
EP0896056A1 (en) Novel thermolysin-like protease and use thereof
JPH06181761A (ja) 新規プロテアーゼ
JPH11501501A (ja) バチルス由来の熱安定中性プロテアーゼの変異体
JPH11137254A (ja) バチルス属細菌由来のトランスグルタミナーゼの製造法
JP3463951B2 (ja) 耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ及びその遺伝子
JPH09255A (ja) 変異型サーモリシンｙｔ７３及びその遺伝子
US5646044A (en) Expression systems for the production of target proteins in bacillus
JPH05184363A (ja) 新規プロテア−ゼ及びその製造方法
JPH05199873A (ja) 新規プロテア−ゼ
JP4050654B6 (ja) 安定化酵素及び洗剤
NL1013260C2 (nl) Nieuwe actieve mutanten van neutrale thermolysine-achtige proteases.