FI112500B - Mutatoitu subtilisiiniproteaasi - Google Patents

Description

112500

Mutatoitu subtilisiiniproteaasi - Mutaterad subtilisinproteas Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta FI-916050.

5 Keksinnön ala Tämä keksintö liittyy uusiin mutatoituihin entsyymeihin tai entsyymivariantteihin, jotka ovat käyttökelpoisia parannettuja pesuominaisuuksia omaavien detergentti-koostumusten formuloinnissa, mainittuja entsyymejä sisältäviin puhdistus- ja deter-genttikoostumuksiin, mutatoituihin geeneihin, jotka koodaavat mainittujen entsyy-10 mien ilmentymistä sopivaan isäntäsoluun tai -organismiin liitettyinä, ja menetelmiin niiden aminohapporyhmien valitsemiseksi lähtömuotoisesta entsyymistä, jotka vaihtamalla tämän tehokkuutta tietyssä pesunesteessä tiettyjen olosuhteiden vallitessa kyetään parantamaan.

Keksinnön tausta 15 Detergenttiteollisuudessa on entsyymejä käytetty pesuaineformulaatioihin yli 20 vuotta. Näissä formulaatioissa käytettävät entsyymit käsittävät proteaaseja, lipaase-ja, amylaaseja, sellulaaseja sekä muita entsyymejä tai näiden seoksia. Kaupallisesti tärkeimpiä ovat proteaasit.

: Vaikka proteaaseja on käytetty detergenttiteollisuudessa yli 20 vuotta, ei vieläkään : y : 20 tiedetä tarkkaan, mihin fysikaalisiin tai kemiallisiin ominaisuuksiin proteaasin hyvä :" : pesutehokkuus tai pesukyky perustuu.

Nykyisin käytössä olevat proteaasit on löydetty eristämällä proteaaseja luonnosta ja ’ · ’ ' tutkimalla niiden ominaisuuksia detergenttiformulaatioissa.

; '; Bacillus-proteaasit v; ' 25 Proteiinisubstraateissa olevia amidisidoksia pilkkovat entsyymit luokitellaan prote- aaseiksi tai (vaihtoehtoisesti) peptidaaseiksi (katso Walsh, 1979, Enzymatic Reac-tion Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Francisco, luku 3). Bacillus- I t » lajin bakteerit erittävät kahta solunulkoista proteaasityyppiä, neutraalia eli metallo-; proteaasia ja alkalista proteaasia, joka toimii seriiniendopeptidaasina, josta käyte- ··’ 30 tään nimitystä subtilisiini. Näiden proteaasien erittyminen on liittynyt bakteerien 2 ιΐ2:;ηο kasvusykliin siten, että proteaasi ilmenee runsaimmin stationaarivaiheen aikana, jolloin myös sporulaatio tapahtuu. Joliffe et ai. (J. Bacteriol. 141 (1980) 1199-1208) ovat ehdottanut että bacillus-proteaasit toimivat solunseinän tumover-ilmiössä.

Subtilisiini 5 Seriiniproteaasi on entsyymi, joka katalysoi peptidisidosten hydrolyysiä ja jonka aktiivisessa keskuksessa esiintyy olennainen seriiniryhmä (White, Handler ja Smith, 1973, "Principles of Biochemistry," 5. painos, McGraw-Hill Book Company, NY, sivut 271-272).

Bakteerien seriiniproteaasien molekyylipainot ovat alueella 20 000 - 45 000. Niitä 10 inhiboi di-isopropyylifluorifosfaatti, mutta metalloproteaaseista poiketen ne ovat vastustuskykyisiä etyleenidiamiinitetraetikkahapolle (EDTA) (vaikkakin korkeissa lämpötiloissa niitä stabiloivat kalsiumionit). Ne hydrolysoivat yksinkertaisia terminaalisia estereitä ja ovat aktiivisuudeltaan samanlaisia kuin eukaryoottisten organismien kymotrypsiini, joka myös on seriiniproteaasi.

15 Rajoittavampi termi alkalinen proteaasi, joka kattaa yhden alaryhmän, heijastaa joidenkin näiden seriiniproteaasien korkeaa pH-optimia, joka on pH-alueella 9,0-11,0 (näistä on esitetty katsaus julkaisussa Priest, Bacteriological Rev. 41 (1977) 711-753).

Tämän keksinnön yhteydessä subtilisiini on grampositiivisten bakteerien tai sienten : ' 20 tuottama seriiniproteaasi. On tunnistettu useita erilaisia subtilisiineja ja monien sub- ; tilisiinien aminohappojakso on määritetty. Näihin kuuluvat ainakin 6 bacillus-kan- v : noista peräisin olevaa subtilisiinia, nimittäin subtilisiini 168, subtilisiini BPN', : : subtilisiini Carlsberg, subtilisiini DY, subtilisiini amylosacchariticus ja mesenteri- ; : kopeptidaasi (Kurihara et ai., J. Biol. Chem. 247 (1972) 5629-5631, Wells et ai., . 25 Nucleic Acids Res. 11 (1983) 7911-7925, Stahl ja Ferrari, J. Bacteriol. 159 (1984) 811-819, Jacobs et al., Nucl.Acids Res. 13 (1985) 8913-8926, Nedkov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 (1985) 421-430, Svendsen et al., FEBS Lett. 196 (1986) 228-232), yksi actinomycetales-ryhmän edustajasta peräisin oleva subtilisiini, termi-taasi Thermoactinomyces vulgariksesta (Meloun et al., FEBS Lett. 1983 (1985) 195-30 200) ja yksi sienten subtilisiini, proteinaasi K, Tritirachium albumista (Jany ja ! ’Mayer, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 (1985) 584-492).

:’ Subtilisiinit ovat fysikaalisesti ja kemiallisesti tarkoin luonnehdittuja. Näiden ent- .,, syymien primäärisen rakenteen (aminohappojakson) tietämyksen lisäksi on määritet ty yli 50 korkean erotuskyvyn röntgensäderakennetta, jotka kuvaavat substraatin si- 3 112:00 toutumista, transitiotilaa, tuotteita, ainakin 3 erilaista proteaasi-inhibiittoria ja määrittelevät rakenteelliset seuraukset luonnollisen vaihtelun osalta (Kraut, Ann. Rev. Biochem. 46 (1977) 331-358).

Tämän keksinnön yhteydessä subtilisiinivariantti tai mutatoitu subtilisiiniproteaasi 5 tarkoittaa subtilisiinia, joka on sellaisen organismin tuottamaa, joka ilmentää sellaisesta lähtömuotoa olevasta mikro-organismista peräisin olevaa mutatoitunutta geeniä, jolla on alkuperäinen tai lähtömuotoinen geeni, joka on tuottanut vastaavaa lähtömuotoista entsyymiä, ja lähtömuotoiseen geeniin on aiheutettu mutaatioita sellaisen mutaation sisältävän geenin tuottamiseksi, josta mainittu mutatoitu subtilisii-10 niproteaasi on tuotettu ilmentämällä sitä sopivassa isännässä.

Subtilisiinigeenistä tunnetaan sekä satunnaisella tavalla että kohdemutaatioina syntyneitä mutaatioita, jotka perustuvat tämän entsyymin fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuden tuntemiseen, ja näistä on saatu subtilisiinin katalyyttiseen aktiivisuuteen, substraattispesifisyyteen, tertiääriseen rakenteeseen jne liittyvää informaatiota. 15 (Wells et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84 (1987) 1219-1223, Wells et ai., Phil. Trans. R. Soc. Lond. A. 317 (1986) 415-423, Hwang ja Warshel, Biochem. 26 (1987) 2669-2673, Rao et ai., Nature 328 (1987) 551-554).

Erityisesti subtilisiinigeenien kohdemutageneesi on ollut suuren mielenkiinnon kohteena ja useita eri mutaatiota on kuvattu seuraavissa patenttihakemusjulkaisuissa ja 20 patenttijulkaisuissa: EP-patenttijulkaisu n:o. 130 756 (GENENTECH) (joka vastaa > ’.: US-patenttijulkaisua n:o 4 760 025 (GENENCOR)), joka liittyy "karbonyylihydro- : .: laaseissa" oleviin kohde- tai satunnaismutaatioihin ja tämän jälkeen suoritettavaan : : seulontaan, jossa mutatoituneista entsyymeistä määritetään erilaisia ominaisuuksia, . . kuten kcat/Km-suhde, pH-aktiivisuusprofiili ja hapettumisen kesto. Tämä patenttiha- . . 25 kemusjulkaisu ei edistä sen ongelman ratkaisua, mihin mutaatiota on muodostettava •, sellaisten entsyymien saamiseksi, joilla olisi halutut ominaisuudet, muutoin kuin si ten, että siitä käy ilmi se, että kohdemutageneesi on toteuttamiskelpoinen keino ja että subtilisiini BPN':n mutaatiot tietyissä erityisissä asemissa, esimerkiksi 'Tyr, ; ; 32Asp, 155Asn, 104Tyr, 222Met, 166Gly, 64His, 169Gly, 189Phe, 33Ser, 221Ser, 217Tyr, . * 30 156G1u tai 152Ala, saadaan entsyymejä, joiden ominaisuudet ovat muuttuneet.

EP-patenttijulkaisu 214 435 (HENKEL) liittyy subtilisiini Carlsbergin kloonaukseen • ‘ ja ilmentämiseen ja tämän kahteen mutanttiin. Tässä patenttihakemuksessa ei ole esitetty syitä 158Asp:n mutatoimiselle 158Ser:ksi ja 165Ser:n mutatoimiseksi : 161 Aspiksi.

4

112 H C O

Kansainvälisessä patenttijulkaisussa W0 87/04 461 (AMGEN) tehdään ehdotus lähtömuotoisen entsyymin Asn-Gly-jaksojen määrien pienentämiseksi paremmin lämpöä ja valittua pH:ta kestävien entsyymien aikaansaamiseksi, tässä patenttihake-musjulkaisussa korostetaan subtilisiini BPN':n 109Asn ja 218Asn ryhmien poistamista, 5 mutatoimista tai modifioimista.

Kansainvälisessä patenttijulkaisussa WO 87/05 050 (GENEX) kuvataan subtilisiini BPN':n satunnaismutatointia ja tämän jälkeistä suurista mutanttimääristä tehtävää seulontaa parantuneiden ominaisuuksien löytämiseksi. Tässä patenttihakemusjul-kaisussa kuvataan mutaatioita, jotka esiintyvät asemissa Asn, Gly, Thr, 10 166Gly,116Ala,188Ser,126Leuja53Ser.

EP-patenttihakemusjulkaisussa 87 303 761 (GENENTECH) kuvataan se, kuinka sekä primäärisellä että tertiäärisellä rakennetasolla käytettävää homologiaseikkojen tarkastelua voidaan soveltaa vastaavien aminohapporyhmien tunnistamiseen riippumatta siitä, ovatko nämä säilyneet eri entsyymien välillä vai eivät. Tämä informaatio 15 yhdessä keksinnön tekijöiden subtilisiini BPN':n tertiäärisen rakenteen tietämyksestä johti näiden keksinnön tekijöiden valitsemaan mutatoitaviksi tietyn määrän kohtia, joissa odotuksena oli se, että saataisiin muunnettuja ominaisuuksia sisältäviä mu-tantteja. Näin tunnistetut asemat ovat 124Met, 222Met, 104Tyr, 152Ala, 156G1u, 166Gly, 169Gly, 189Phe, 217Tyr. Myös 155Asn, 21Tyr, 22Thr, 24Ser, 32Asp, 33Ser, 36Asp, 46Gly, 20 48Ala, 49Ser, 50Met, 77Asn, 87Ser, 94Lys, 95 Vai, %Leu, 107Ile, 110Gly, 170Lys, 171 Tyr, 172Pro,197Asp, 199Met, 204Ser, 213Lys ja221 Ser, jotka asemat on tunnistettu sellaisiksi, että niiden odotetaan vaikuttavan entsyymin eri ominaisuuksiin. Esitetään myös ; esimerkkejä useista eri mutaatioista, jotka tukevat näitä ehdotuksia. Näissä asemissa olevien yksittäisten mutaatioden lisäksi tämän keksinnön tekijät ovat tehneet myös . 25 useita rinnakkaisia mutaatioita. Tämän keksinnön tekijät tunnistivat lisäksi 215Gly:n, 67His:n, 126Leu:n, 135Leu:n ja segmenteissä 97-103, 126-129, 213-215 ja 152-172 : ; : olevien aminohapporyhmien olevan sellaisia ryhmiä, joilla on mielenkiintoisia omi naisuuksia, mutta mistään näissä asemissa olevista mutaatioista ei ollut taijottu esi-•. merkkejä.

30 EP-patenttijulkaisussa 260 105 (GENENCOR) kuvataan katalyyttisen triadin sisältävissä entsyymeissä olevien tiettyjen ominaisuuksien modifiointia valitsemalla noin :"': 15 Ä etäisyydellä katalyyttisestä triadista oleva aminohapporyhmä ja korvaamalla valittu aminohapporyhmä toisella ryhmällä. Tässä patenttikuvauksessa kuvatut '; ’;' subtilisiinityyppiset entsyymit on erityisesti mainittu kuuluvan sellaisten entsyymien • · ’ 35 luokkaan, joka sisältää katalyyttisen triadin. Subtilisiineissä olevien asemien 222 ja 217 esitetään olevan edullisia asemia korvauksessa käytettäväksi.

5 11/..-ro

Kansainvälisessä patenttijulkaisussa WO 88/06 624 (GIST-BROCADES NV) kuvataan nimityksellä PB92 varustetun subtilisiiniproteaasin DNA- ja aminohappojaksot, jotka ovat aminohappojakson suhteen miltei 100-prosenttisesti homologisia subtili-siini 309:n aminohappojakson suhteen.

5 Kansainvälisessä patenttijulkaisussa WO 88/07 578 (GENENTECH) esitetään patenttivaatimuksia mutatoiduista entsyymeistä, jotka ovat peräisin sellaisesta lähtö-muotoisesta entsyymistä, jossa on korvattu tai modifioitu ainakin yksi aminohappo-ryhmän ainakin yksi katalyyttinen ryhmä. Nämä keksijät toteavat, että näin tehden saadaan käyttöön mutanttimuotoa oleva entsyymi, joka reagoi sellaisten substraat-10 tien kanssa, jotka sisältävät modifioidun tai korvaamalla valmistetun katalyyttisen ryhmän (substraatin tukema katalyysi).

Yleinen teoria perustuu B. amyloliquefaciensin subtilisiiniin (BPN'), jossa on kuvattu asemassa 64His tehtyjä modifikaatioita, joissa tämä modifioitiin pelkästään 64Ala> ksi tai siten, että niihin liittyi "apu"-mutaatio Ser-24-Cys. Tässä on myös ehdotettu 15 aminohapporyhmiin 32Asp ja 221Ser tehtäviä modifikaatioita ja "apu"mutaatiota Ala- 48-Glu.

Kansainvälisessä patenttijulkaisussa 88/08 028 (GENEX) kuvataan geeniteknisin keinoin suoritettua metalli-ionia sitovien kohtien ympäristön muokkausta proteiinien stabiloimiseksi. Myös tässä patenttijulkaisussa käytetään esimerkkinä subtilisiini 20 BPN':ää ja siinä tähdennetään seuraavien aminohapporyhmien tärkeyttä substituu- : tioehdokkaina: 172Pro (P172D, P172E), 131Gly (G131D), 76Asn (N76D, '·/ ; N76D+P172D(E)) ja 78Ser (S78D). Tässä ehdotetaan lisäksi yhdistelmämutantteja, : jotka ovat N76D+S78D+G131D+P172D(E), N76D+G131D, S78D+G131D, : · : S78D+P 172D(E) ja S78D+G131D+P172D(E).

‘; 25 Kansainvälisessä patenttijulkaisussa WO 88/08 033 (AMGEN) kuvataan useita ' · ' subtilisiinianalogeja, joilla on modifioitu kalsiumia sitova kohta ja niissä tahansa molekyylissä esiintyvässä Asn-Gly-jaksossa olevat joko Asn tai Gly on korvattu ja * josta näin on saatu entsyymejä, joiden lämmön- ja pH:n kesto on parantunut. Yhden : : kalsiumia sitovista kohdista kuvataan liittyvän aminohapporyhmiin 41 Asp, 75Leu, , : 30 76Asn, 77Asn, 78Ser, 79Ile, 80Gly, 81 Vai, 208Thr ja 214Tyr; toisia mahdollisia kalsiumia sitovia kohtia ehdotetaan olevan kohdissa 140Asp ja 172Pro; 14Pro ja 271Gln; ja 172Pro ja 195G1u tai197Asp. Tässä ehdotetaan myös 109Asn- ja 218Asn-asemien mutatoimista. ,’· Muodostettuihin mutantteihin kuuluvat N109S, N109S+N218S, N76D+N109S+ ; ;: N218S, N76D+N77D+N109S+N218S, N76D+I79E+N109S+ N218S.

6 11 Γ c o

Kansainvälisessä patenttijulkaisussa W0 88/08 164 (GENEX) kuvataan menetelmä proteiinissa olevien sellaisten ryhmien tunnistamiseksi, jotka voidaan korvata kyste-iinillä mahdollisesti stabiloivien disulfidisidosten muodostuksen mahdollistamiseksi. Tämä menetelmä perustuu yksityiskohtaiseen tietämykseen proteiinin kolmiulottei-5 sesta rakenteesta ja siinä käytetään tietokonetta asemien valitsemiseen. Subtilisiini-proteaasin osalta käytettiin mallisysteeminä subtilisiini BPN':ä. Käyttäen tätä menetelmää subtilisiini BPN':iin saatiin tulokseksi ehdotus, jonka mukaan disulfidisidok-set voidaan muodostaa 11 ehdokkaana olevaan ryhmään: (1: T22C+S87C, 2: V26C+L235C, 3: G47C+P57C, 4: M50C+N109C, 5: E156C+T164C, 6: V165C+ 10 K170C, 7: V165C+S191C, 8: Q206C+A216C, 9: A230C+V270C, 10: I234C+ A274C, 11: H238C+W241C).

Näistä tuotettiin 4 (1, 2, 4 ja 8), joista kahdesta ei saatu lainkaan stabiloivaa vaikutusta (2 ja 4). Lisäksi tuotettiin mutantteja, joissa oli yhdistetty kaksi näistä mutan-teista keskenään ja yksi toisen mutaation kanssa, toisin sanoen T22C+S87C+N218S 15 ja T22C+S87C+Q206C+A216C. Tuotettiin myös lukuisia muita myönteiseen lopputulokseen johtamattomia mutantteja, toisin sanoen AIC+S78C, S24C+S87C, K27C+ S89C, A85C+A232C, I122C+V147C, S249C+A273C ja T253C+A273C.

Thomas, Russell ja Fersht, Nature 318 (1985) 375-376, ovat myös osoittaneet, että 99Asp:n vaihto 99Ser:ksi subtilisiini BPN':ssa muuttaa entsyymin pH-riippuvuutta.

20 Nämä samat tekijät tarkastelevat tämän jälkeen julkaisussaan, J. Mol. Biol. 193 ; (1987) 803-813,156Glu:n substituoimista 156Ser:lla.

Kummatkin nämä mutaatiot ovat noin 15 Ä etäisyydellä aktiivisesta 64His:sta.

: Russel ja Fersht tarkastelevat julkaisussa Nature 328 (1987) 496-500 kokeidensa : : tuloksia ja esittävät sääntöjä, joiden mukaan pH-aktiivisuus-profiilien muuttaminen 25 entsyymejä mutatoimalla tulisi suorittaa, jotta näiden pinnan varaus saataisiin muuttumaan.

Isoelektrinen piste (plo)

Isoelektrinen piste, pl0, määritellään siksi pH-arvoksi, jossa entsyymimolekyyli-kompleksi (siihen mahdollisesti liittyneiden metalli- tai muiden ionien kanssa) on 30 neutraali, ts. kompleksissa olevien sähköstaattisten varausten (sähköstaattinen netto-: varaus, =NEC) on 0. Tätä summaa muodostettaessa on luonnollisesti huomioitava : : yksittäisten sähköstaattisten varausten positiivinen tai negatiivinen luonne.

7

112:' ί: O

Isoelektrinen piste lasketaan kätevästi käyttäen tasapainolähtökohtia ja käyttäen kyseessä olevassa entsyymissä olevien eri varauksellisten ryhmien pK-arvoja ja käyttämällä tämän jälkeen iterointia sen pH-arvon hakemiseksi, jossa entsyymimolekyy-lin NEC on 0.

5 Tämän laskutavan yksi ongelma on se, että varauksellisten ryhmien pK-arvot ovat ympäristöstä riippuvia ja tämän vuoksi ne vaihtelevat. Voidaan kuitenkin saada hyvin hyviä tuloksia antamalla varatuille ryhmille tietyt likimääräiset pK-arvot todellisesta arvosta riippumatta. On myös mahdollista suorittaa pitkälle meneviä laskutoimituksia, joissa ympäristö on otettu osittain huomioon.

10 pl0 voidaan myös määrittää kokeellisesti isoelektrisellä fokusoinnilla tai titraamalla entsyymin sisältävä liuos. Varauksellisten ryhmien eri pK-arvot voidaan myös määrittää kokeellisesti titraamalla.

Subtilisiinien teolliset sovellutukset

Proteaaseilla, kuten subtilisiineilla, on ollut paljon käyttöä teollisuudessa, erityisesti 15 detergenttiformulaatioissa, koska nämä ovat käyttökelpoisia proteiinilian poistoon.

Nykyisin tunnetaan seuraavat proteaasit ja useita niistä markkinoidaan suurina määrinä maailman monissa maissa.

Subtilisiini BPN' eli Novo, joka on saatavilla esim yhtiöstä SIGMA, St. Louis, USA;

Subtilisiini Carlsberg, jota markkinoi Novo-Nordisk a/s (Tanska) tuotenimellä 20 ALCALASE® ja IBIS (Alankomaat) tuotenimellä MAXATASE®;

Bacillus lentus-subtilisiini, jota markkinoi NOVO INDUSTRI A/S (Tanska) tuote-: nimellä SAVINASE®;

Entsyymit, jotka muistuttavat läheisesti SAVINASE®:a, kuten MAXACAL®, jota markkinoi yhtiö IBIS, ja OPTICLEAN®, jota markkinoi MILES KALI CHEMIE 25 (Saksan Liittotasavalta).

Bacillus lentus -subtilisiini, jota markkinoi Novo-Nordisk a/s (Tanska) tuotenimellä ESPERASE®; KAZUSASE®, jota markkinoi SHOWA DENKO (Japani).

8 Λ ', r . - - r-, r.

i I /. .:,.-11

Jotta nämä entsyymit olisivat tehokkaita, niillä ei ainoastaan tule olla aktiivisuutta pesuolosuhteissa, vaan niiden on myös oltava yhteensopivia muiden detergentin komponenttien kanssa detergentin tuotannon ja varastoinnin aikana.

Esimerkiksi subtilisiineja voidaan käyttää yhdessä muita substraatteja vastaan aktii-5 visten entsyymien kanssa ja valitun subtilisiinin tulisi omata stabiiliutta sellaisia entsyymejä vastaan ja valitun subtilisiinin ei myöskään tulisi edullisesti katalysoida muiden entsyymien pilkkoutumista. Valitun subtilisiinin tulisi myös olla vastustuskykyinen detergenttiformulaatiossa olevia muita komponentteja, kuten valkaisuaineita, hapettimia jne., vastaan ja detergenttiformulaatiossa käytettävän entsyymin 10 tulisi erityisesti kestää niitä hapettumista aiheuttavia ja kalsiumia sitovia ominaisuuksia ja pH-olosuhteita, jotka muodostuvat ei-entsymaattisista komponenteista detergenttiin sen varastoinnin aikana ja pesuliuokseen pesun aikana.

Entsyymin kyky katalysoida luonnossa esiintyvien erilaisten substraattien pilkkoutumista pesukohteissa, esimerkiksi pesun aikana, nimitetään usein sen pesukyvyksi, 15 pesemiskyvyksi, detergenttiydeksi tai pesutehokkuudeksi. Tässä patenttihakemus-julkaisussa tämän ominaisuuden kuvaamiseen käytetään termiä pesutehokkuus.

Luonnossa esiintyvillä subtilisiineilla on havaittu olevan pesutehokkuuteen tai pe-semiskykyyn liittyviä ominaisuuksia, jotka vaihtelevat voimakkaasti muuttujien, kuten pH:n, vaihdellessa. Useat näistä edellä mainituista markkinoiduista detergent-20 tiproteaaseista ovat tehokkuudeltaan parempia kuin noin 20 vuotta sitten markkinoidut proteaasit, mutta optimaalisen tehokkuuden osalta kullakin entsyymillä on omat :, spesifiset formulaatioon ja pesuolosuhteisiin liittyvät vaatimuksensa, esim. pH, läm pötila, ionivahvuus (= I), aktiivinen systeemi (tensidit, pinta-aktiiviset aineet, valkai-: ; suaineet jne.), tehoaineet, jne.

25 On siksi havaittu, että entsyymi, jolla on haluttavia ominaisuuksia matalassa pH:ssa ja matalassa I:ssa, voi olla vähemmän houkutteleva käyttää emäksisemmissä olosuhteissa ja korkeassa I:ssa tai entsyymi, jolla on laadukkaat ominaisuudet korkeassa * pH:ssa ja korkeassa I:ssa, voi olla vähemmän houkutteleva käytettäväksi olosuhteis- ; sa, jossa pH ja I ovat matalia.

30 Yhdistelmä-DNA-tekniikan syntymisellä ja kehittymisellä on ollut huomattava vaikutus proteiinikemian alalla.

On nähtävissä, että näillä menetelmillä on mahdollista suunnitella peptidejä ja proteiineja, kuten entsyymejä ja hormoneja, ominaisuuksiltaan halutunlaisiksi, joka mahdollistaa halutut ominaisuudet omaavien yhdisteiden valmistamisen.

9 117 r o

Nykyisin on mahdollista konstruoida haluttuja aminohappojaksoja omaavia entsyymejä, ja, kuten edellä mainittiin, ominaisuuksiltaan muunnettujen subtilisiinien suunnittelua on tutkittu kohtalaisen runsaasti. Tehtyjen ehdotusten joukkoon kuuluva menetelmä, jolla muodostetaan ja seulotaan suuri määrä mutatoituja entsyymejä 5 ja joka on kuvattu EP-patenttijulkaisussa n:o 130756 (GENENTECH) (US-patentti-julkaisu 4 760 025 (GENENCOR)) ja kansainvälinen patenttijulkaisu WO 87/05 050 (GENEX), vastaa klassista menetelmää, jossa eristetään natiiveja entsyymejä ja seulotaan niistä niiden ominaisuudet, mutta on tätä tehokkaampaa, koska tiedetään, että tällöin esiintyy suuri määrä erilaisia mutanttientsyymejä.

10 Koska subtilisiinientsyymi käsittää tyypillisesti 275 aminohapporyhmää, joista kukin voi olla yksi 20:stä mahdollisesta luonnossa esiintyvästä aminohaposta, on yksi tässä menetelmässä esiintyvä hyvin vakava puute se, että on valmistettava suuri joukko alustavan tutkimuksen vaativia mutaatioita, minkä jälkeen ensimmäisessä seulonnassa ominaisuuksiltaan mielenkiintoisiksi osoittautuneet valikoidut mutantit 15 on tutkittava tarkemmin, koska ei ole olemassa suuntaviivoja niiden aminohappo-ryhmien määrittelemiseksi, jotka tulisi muuttaa sellaisen halutun entsyymin saamiseksi, jonka ominaisuudet kyseeseen tulevan käyttömuodon, kuten tässä tapauksessa pesutehokkuudeltaan tietyissä pesuliuoksen olosuhteissa paremmat ominaisuudet omaavan detergenttikoostumusten formuloinnin, osalta olisivat paremmat. Näissä 20 patenttihakemusjulkaisuissa hahmoteltu menetelmä on tämän vuoksi vain hieman parempi kuin jo useita vuosia tunnetut perinteiset satunnaismutaatiomenetelmät.

Muut tunnetut menetelmät liittyvät tiettyjen ominaisuuksien, kuten transesterifioin-nin ja hydrolyysinopeuden (EP-patenttijulkaisu 260 105 (GENENCOR), pH-aktii-visuus-profiilin (Thomas, Russel ja Fersht, katso edellä) ja substraattispesifisyyden ' 25 (kansainvälinen patenttijulkaisu WO 88/07 578 (GENENTECH), muuttamiseen.

Mikään näistä julkaisuista ei liity entsyymien pesutehokkuuden muuttamiseen.

On kehittynyt vielä yksi tekniikka, jossa proteiinien kolmiulotteisesta rakenteesta saatua yksityiskohtaista informaatiota käytetään tiettyjen aminohappojen substituutiosta aiheutuvien mahdollisten seurausten analysointiin. Tätä lähestymistapaa on 30 käytetty ja ne on kuvattu patenttijulkaisuissa EP-260 105 (GENENCOR), WO 88/07 578 (GENENTECH), WO 88/08 028 (GENEX), WO 88/08033 (AMGEN) ja :"j WO 88/08 164 (GENEX).

Kuten edellä mainittiin, ei siten ole vielä tunnistettu suhdetta, joka vallitsee ent-.: syymin, kuten jonkin edellä mainituista entsyymeistä, tarkoin määriteltyjen ominai- 3 5 suuksien ja entsyymin pesutehokkuuden välillä.

10 11::: : o o

Kansainvälisessä patenttihakemus]ulkaisussa PCT/DK 88/00 002 (NOVO INDUSTRI A/S) tehdään se ehdotus, että käytettäisiin homologiaan perustuvan vertaamisen käsitettä sen määrittämiseksi, mikä aminohappoasema tulisi valita mutatoi-tavaksi ja millä aminohapolla näissä asemissa olevat aminohapot tulisi korvata pesu-5 tehokkuuteen vaikuttavan muutoksen aikaansaamiseksi.

Tätä menetelmää käyttäen pienenee seulontatyö huomattavasti, koska valmistettujen mutaatioiden määrä on paljon pienempi, mutta on ennakoitavissa, että tällä menetelmällä voidaan saada ainoastaan sellaisia entsyymejä, joilla esiintyy lähtömuotoa edustavan entsyymin ja vertailussa käytetyn entsyymin yhdistettyjä käyttökelpoisia 10 ominaisuuksia.

Ongelma näyttää olevan se, että vaikka entsyymiaktiivisuuden mekanismin selvittämiseen on kohdistettu runsaasi tutkimusta, on kuitenkin vain vähän tietoa niistä rakenteeseen ja aminohapporyhmien yhdistelmiin liittyvistä tekijöistä, jotka määräävät entsyymien pesutehokkuutta koskevat ominaisuudet.

15 Tämän vuoksi, sekä siksi, että ymmärrettäisiin paremmin puhdistus- tai detergentti-koostumuksien käytännön sovellutuksiin liittyvää proteaasien vaikutusmekanismia, on vielä tarvetta parantaa ja muokata entsyymejä pesusysteemeihin soveltuviksi. Tämän ymmärtämisen perusteella voitaisiin johtaa sääntöjä, joita voitaisiin soveltaa sellaisten mutaatioiden valitsemiseen, jotka kohtuullisella varmuudella johtaisivat ; 20 sellaisen entsyymin aikaansaamiseen, jonka pesutehokkuus tietyissä pesunesteen olosuhteissa olisi parantunut.

Keksinnön yhteenveto Näiden ongelmien tarkemmat tutkimukset ovat nyt yllättäen osoittaneet, että yksi niistä ratkaisevista tekijöistä, jotka liittyvät subtilisiinientsyymien käyttöön deter-25 genttikoostumuksissa, on entsyymin adsorptio substraattiin, ts. tekstiileistä, kovilta pinnoilta tai muista puhdistettavista materiaaleista poistettavaan substraattiin.

Näin ollen tämän keksinnön mukaisesti on aikaansaatu subtilisiinigeenin mutaatioita, jotka on saatu aikaan asemassa 245 olevassa aminohapporyhmässä substituutiolla, jolloin tuloksena on tällaisen mutatoidun geenin ilmentämän mutatoidun subtili-30 siinientsyymin joko korkeampi tai alempi isoelektrinen pH (plo), ja tämän ansiosta mainitun subtilisiinientsyymin mutatoituneen muodon käyttäytyminen detergentti-koostumuksissa on aiempaan verrattuna parantunut.

11

112 2 O O

Mutaatiot muodostetaan lähtömuotona olevaan subtilisiinigeeniin, joka vastaa subti-lisiinientsyymin asemassa 245 olevan tietyn aminohapon ilmentymisestä.

Tämä keksintö liittyy osaksi, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, subtilisiini 309:n ja subtilisiini Carlsbergin geenien mutaatioihin ja näistä saatuihin mutatoituneisiin 5 subtilisiini 309- ja subtilisiini Carlsberg -entsyymeihin, joiden pesuteho erilaisissa, eri pH-arvoisiin pesuliuoksiin johtavissa detergenttikoostumuksissa on parantunut.

Tämä keksintö liittyy lisäksi mutatoituneiden entsyymien käyttöön puhdistuskoos-tumuksissa ja mutatoituneita entsyymejä käsittäviin puhdistuskoostumuksiin, erityisesti mutatoituneita subtilisiinientsyymejä käsittäviin detergenttikoostumuksiin.

10 Lyhenteet

Aminohapot A = Ala Alaniini V = Vai Väliini L = Leu Leusiini 15 I = Ile Isoleusiini P = Pro Proliini F = Phe Fenyylialaniini W = Trp Tryptofaani . . M = Met Metioniini , 20 G = Gly Glysiini ’ ;· S = Ser Seriini ’ T = Thr Treoniini ' . C = Cys Kysteiini :; Y = Tyr Tyrosiini •, : 25 N = Asn Asparagiini Q = Gin Glutamiini ' ': D = Asp Asparagiinihappo E = Glu Glutamiinihappo K = Lys Lysiini 30 R = Arg Arginiini H = His Histidiini

Nukleiinihappojen emäkset • A = Adeniini G = Guaniini 12

112:: -'O

C = Sytosiini T = Tyrniini (vain DNAissa) U = Urasiili (vain RNA:ssa)

Mutaatiot 5 Tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen tai valmistettavaksi aiottujen mutanttien kuvaamiseksi otettiin käyttöön seuraavat nimitystavat niissä käytetyn joustavan viit-taustavan vuoksi:

Alkuperäinen(set) aminohappo (-hapot), asema (asemat), substituoitu(dut) aminohappo (-hapot).

10 Tämän mukaisesti asemassa 195 olevan glysiinin korvaaminen glutamiinihapolla merkitään seuraavasti:

Gly 195 Glu eliG195E

samassa asemassa olevan glysiinin deleetio:

Gly 195 *taiG195* 15 ja ylimääräisen aminohapporyhmän, kuten lysiinin, lisääminen samaan asemaan, on:

: ; Gly 195 GlyLys tai G195GK

Silloin kun taulukossa 1 esitetään deleetio tai se esiintyy sellaisessa subtilisiinissa, jota ei ole esitetty taulukossa 1, tällaisessa asemassa tapahtuva insertio merkitään seuraavasti:

20 * 36 Asp eli *36D

Rinnakkaiset mutaatiot erotetaan + -merkeillä, toisin sanoen:

Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu eli R170Y+G195E, jotka edustavat asemissa 170 ja 195 olevia mutaatioita, joissa arginiini ja glysiini korvataan tyrosiinilla ja glutamiinihapolla, tässä järjestyksessä mainittuna.

lie -.'"O

13

Taulukko 1

Eri proteaasien aminohappojaksojen vertailu a = subtilisiini BPN' (Wells et ai, 1983, ks. edellä) b = subtilisiini amylosacchariticus (Kurihara et ai., 1972, ks. edellä) 5 c = subtilisiini 168 (Stahl ja Ferrari, 1984, ks. edellä) d = subtilisiini mesenterikopeptidaasi (Svendsen et ai., 1986, ks. edellä) e = subtilisiini DY (Nedkov et ai., 1985, ks. edellä) f = subtilisiini Carlsberg (Smith et ai., 1968, ks. edellä) g = subtilisiini Carlsberg (Jacobs et ai., 1985, ks. edellä) 10 h = subtilisiini 309 (kansainvälinen patenttihakemusjulkaisu PCT/DK 88/00 002) i = subtilisiini 147 (kansainvälinen patenttihakemusjulkaisu PCT/DK 88/00 002) j = termitaasi (Meloun et ai., 1985, ks. edellä) k = proteinaasi K (Betzel et ai., Eur. J. Biochem. 178 (1988) 155 ff), ja Gunkel et ai., Eur. J. Biochem. 179 (1989) 185 ff) 15 1 = akvalysiini (Kwon et ai., Eur. J. Biochem. 173 (1988) 491 ff) m = Bacillus PB92 -proteaasi (Eurooppalainen patenttijulkaisu 0 283 075) n = Proteaasi TW7 (Tritirachium album) (kansainvälinen patenttihakemusjulkaisu PCT/US88/01 040) o = Proteaasi TW3 (Tritirachium album) (kansainvälinen patenttihakemusjulkaisu 20 PCT/US88/01 040) * = merkitty deletoiduksi 14 111:Γ: 0 n:o 1 10 a) *_*_*_*_*_*-*-A-Q-S-*-V-P-Y-G-V-S-Q-I-K-*-*-*-*-*-A-P-A- b) *-*-*-*-*-*_*-A-Q-S-*-V-P-Y-G-I-S-Q-I-K-*-*-*-*-*-A-P-A- c) *-*_*_*.*.*_*_a-Q-S-*-V-P-Y-G-I-S-Q-I-K-*-*-*-*-*-A-P-A-5 d) *-*_*_*-*_*-*-A-Q-S-*-V-P-Y-G-I-S-Q-I-K-*-*-*-*-*-A-P-A- e) *-*-*-*-*-*-*-A-Q-S-*-V-P-Y-G-I-S-Q-I-K-*-*-*-*-*-A-P-A- f) *-*-*-*-*.*-*_a-Q-T-*-V-P-Y-G-I-P-L-I-K-*-*-*-*-*-A-D-K- h) *-*-*-*-*-*-*-A-Q-S-*-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-*-*-*-*-*-A-P-A- i) *-*-*-*-*_*-*-*_q-t-*-V-P-W-G-I-S-F-I-N-*-*-*-*-*-T-Q-Q- 10 j) Y-T-P-N-D-P-Y-F-S-S-*-R-Q-Y-G-P-Q-K-I-Q-*-*-*-*-*-A-P-Q- k) *-*-*-*-*-*-A-A-Q-T-N-A-P-W-G-L-A-R-I-S-S-T-S-P-G-T-S-T- l) *_*_*_*.*_*.a-T-Q-S-P-A-P-W-G-L-D-R-I-D-Q-R-D-L-P-L-S-N- m) *-*-*-*-*-*-*-A-Q-S-*-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-*-*-*-*-*-A-P-A- n) *.*_*_*.*-*_a-T-Q-E-D-A-P-W-G-L-A-R-I-S-S-Q-E-P-G-G-T-T-15 o) *-*-*-*-*_*-a-E-Q-R-N-A-P-W-G-L-A-R-I-S-S-T-S-P-G-T-S-T- n: o 20 30 40 a) L-H-S-Q-G-Y-T-G-S-N-V-K-V-A-V-I-D-S-G-I-D-S-S-H-P-D-L-*- b) L-H-S-Q-G-Y-T-G-S-N-V-K-V-A-V-I-D-S-G-I-D-S-S-H-P-D-L-*- c) L-H-S-Q-G-Y-T-G-S-N-V-K-V-A-V-I-D-S-G-I-D-S-S-H-P-D-L-*- 20 d) L-H-S-Q-G-Y-T-G-S-N-V-K-V-A-V-I-D-S-G-I-D-S-S-H-P-D-L-* - e) V-Q-A-Q-G-Y-K-G-A-N-V-K-V-G-I-I-D-T-G-I-A-A-S-H-T-D-L-* - f) V-Q-A-Q-G-F-K-G-A-N-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-Q-A-S-H-P-D-L-*- g) V-Q-A-Q-G - F - K-G-A-N-V - K-V-A-V - L-D - T-G - I -Q-A- S - H - P-D - L - * - : h) A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-*-S-T-H-P-D-L-*- .··[ 25 i) A-H-N-R-G-I-F-G-N-G-A-R-V-A-V-L-D-T-G-I-*-A-S-H-P-D-L-*- ;;; j) a-W-*-D-I-A-E-G-S-G-A-K-I-A-I-V-D-T-G-V-Q-S-N-H-P-D-L-A- k) y-y-y-d-e-s-a-g-q-g-s-c-v-y-v-i-d-t-g-i-e-a-s-h-p-e-f-*- l) S-Y-T-Y-T-A-T-G-R-G-V-N-V-Y-V-I-D-T-G-I-R-T-T-H-R-E-F-*- : m) A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-*-S-T-H-P-D-L-*- 30 η) Y-T-Y-D-D-S-A-G-T-G-T-C-A-Y-1- X-D-T-G-1-Y-T-N-H-T-D-F-* - : o) Y-R-Y-D-D-S-A-G-Q-G-T-C-V-Y-V-I-D-T-G-V-E-A-S-H-P-E-F-*- 112500 15 n:o 50 60 a) *-K-V-A-G-G-A-S-M-V-P-S-E-T-N-P-F-*-*-Q-D-N-N-S-H-G-T-H-V- b) *-N-V-R-G-G-A-S-F-V-P-S-E-T-N-P-Y-*-*-Q-D-G-S-S-H-G-T-H-V-C) *-N-V-R-G-G-A-S-F-V-P-S-E-T-N-P-Y-*-*-Q-D-G-S-S-H-G-T-H-V- 5 d) *-N-V-R-G-G-A-S-F-V-P-S-E-T-N-P-Y-*-*-Q-D-G-S-S-H-G-T-H-V- e) *-K-V-V-G-G-A-S-F-V-S-G-E-S-*-Y-N-*-*-T-D-G-N-G-H-G-T-H-V- f) *-N-V-V-G-G-A-S-F-V-A-G-E-A-*-Y-N-*-*-T-D-G-N-G-H-G-T-H-V- g) *-N-V-V-G-G-A-S-F-V-A-G-E-A-*-Y-N-*-*-T-D-G-N-G-H-G-T-H-V- h) *-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-*-S-T-*-*-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V- 10 i) *-R-I-A-G-G-A-S-F-I-S-S-E-P-*-S-Y-*-*-H-D-N-N-G-H-G-T-H-V- j) G-K-V-V-G-G-W-D-F-V-D-N-D-S-T-P-*-*-*-Q-N-G-N-G-H-G-T-H-C- k) *-*-*-E-G-R-A-Q-M-V-K-T-Y-Y-Y-S-S-*-*-R-D-G-N-G-H-G-T-H-C- l) *_*.*_G_G_R_A_R_v-G-Y-D-A-L-G-G-N-G-*-Q-D-C-N-G-H-G-T-H-V- m) *-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-*-S-T-*-*-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V- 15 n) * - *-*-G-G-R-A-K-F-L-K-N-F-A-G-D-G-Q-D-T-D-G-N-G-H-G-T-H-V- o) *. *.*-E-G-R-A-Q-M-V-K-T-Y-Y-A-S-S-*-*-R-D-G-N-G-H-G-T-H-C- n:o 70 80 90 a) A-G-T-V-A-A-L-*-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-S-L-Y-A-V-K-V- b) A-G-T-I-A-A-L-*-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-S-L-Y-A-V-K-V-20 c) A-G-T-I-A-A-L-*-N-N-S-I-G-V-L-G-V-S-P-S-A-S-L-Y-A-V-K-V- d) A-G-T-I-A-A-L-*-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-S-L-Y-A-V-K-V- e) A-G-T-V-A-A-L-*-D-N-T-T-G-V-L-G-V-A-P-N-V-S-L-Y-A-I-K-V- f) A-G-T-V-A-A-L-*-D-N-T-T-G-V-L-G-V-A-P-S-V-S-L-Y-A-V-K-V- g) A-G - T-V-A-A- L - * - D-N-T-T-G-V - L-G-V-A - P - S - V - S - L - Y-A-V - K-V- 25 h) A-G - T - I - A-A - L - * - N-N - S - I - G-V - L-G-V-A - P - S - A - E - L - Y-A-V - K-V- i) a-g-t-i-a-a-l-*-n-n-s-i-g-v-l-g-v-a-p-s-a-d-l-y-a-v-k-v- j) a-g-i-a-a-a-v-t-n-n-s-t-g-i-a-g-t-a-p-k-a-s-i-l-a-v-r-v- ' k) A-G-T-V-G-S-*-R-*-*-* -*-*-T-Y-G-V-A-K-K-T-Q-L-F-G-V-K-V- : 1) A-G-T-I-G-G-V-*-*-*-*-*-*-T-Y-G-V-A-K-A-V-N-L-Y-A-V-R-V- 30 m) A-G-T-I-A-A-L-*-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V- n) A-G-T-V-G-G-T-*-*-*-*-* -*-T-Y-G-V-A-K-K-T-S-L-F-A-V-K-V- o) A-G-T-I-G-S-*-R-*-*-*-*-*-T-Y-G-V-A-K-K-T-Q-I-F-G-V-K-V- 112500 16 n:o 100 110 120 a) L-G-A-D-G-S-G-Q-Y-S-W-I-I-N-G-I-E-W-*-A-I-A-*-N-N-M-D-*- b) L-D-S-T-G-S-G-Q-Y-S-W-I-I-N-G-I-E-W-*-A-I-A-*-N-N-M-D-*- c) L-D-S-T-G-S-G-Q-Y-S-W-I-I-N-G-I-E-W-* -A-I-A-*-N-N-M-D-* - 5 d) L-D-S-T-G-S-G-Q-Y-S-W-I-I-N-G-I-E-W-*-A-I-A-*-N-N-M-D-*- e) L-N-S-S-G-S-G-T-Y-S-A-I-V-S-G-I-E-W-*-A-T-Q-*-N-G-L-D-*- f) L-N-S-S-G-S-G-S-Y-S-G-I-V-S-G-I-E-W-*-A-T-T-*-N-G-M-D-*- g) L-N-S-S-G-S-G-T-Y-S-G-I-V-S-G-I-E-W-*-A-T-T-*-N-G-M-D-*- h) L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-*-A-G-N-*-N-G-M-H-*-10 i) L-D-R-N-G-S-G-S-L-A-S-V-A-Q-G-I-E-W-* -A-I-N-*-N-N-M-H-* - j) L-D-N-S-G-S-G-T-W-T-A-V-A-N-G-I-T-Y-* -A-A-D-*-Q-G-A-K-* - k) L-D-D-N-G-S-G-Q-Y-S-T-I-I-A-G-M-D-F-V-A-S-D-K-N-N-R-N-C- l) L-D-C-N-G-S-G-S-T-S-G-V-I-A-G-V-D-W-V-*-T-*-R-N-H-R-R-P- m) L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-*-A-G-N-*-N-G-M-H-*- 15 n) L-D-A-N-G-Q-G-S-N-S-G-V-I-A-G-M-D-F-V-T-K-D-A-S-S-Q-N-C- o) L-N-D-Q-G-S-G-Q-Y-S-T-I-I-S-G-M-D-F-V-A-N-D-Y-R-N-R-N-C- n: o 130 140 a) * - * - * - * -v-I-N-M-S -L-G-G-P-S-G-S -A-A-L-K-A-A-V-D-K-A-V-A- b) *-*-*-*-V-i-N-M-S-L-G-G-P-S-G-S-T-A-L-K-T-V-V-D-K-A-V-S- 20 C) *-*-*-*.v-i-n-M-S-L-G-G-P-T-G-S-T-A-L-K-T-V-V-D-K-A-V-S- d) *-*-*-*-V-I-N-M-S-L-G-G-P-T-G-S-T-A-L-K-T-V-V-D-K-A-V-S- e) *_*-*-*_v-I-N-M-S-L-G-G-P-S-G-S-T-A-L-K-Q-A-V-D-K-A-Y-A- f) *_*_*-*_v-I-N-M-S-L-G-G-A-S-G-S-T-A-M-K-Q-A-V-D-N-A-Y-A- : g) *-*-*-* -V-I-N-M-S-L-G-G-P-S-G-S-T-A-M-K-Q-A-V-D-N-A-Y-A- 25 h) *-*-*-*-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S- D *-*-*-*- I-I-N-M-S-L-G-S-T-S-G-S-S-T-L-E-L-A-V-N-R-A-N-N- j ) *-*-*-*-V-I-S-L-S-L-G-G-T-V-G-N-S-G-L-Q-Q-A-V-N-Y-A-W-N- k) P - K-G-V-V-A- S - L - S - L-G-G-G - Y - S - S - S - V-N - S - A-A-A - * - R- L-Q - S -:·* ‘ 1) A-*-*-*-V-A-N-M-S-L-G-G-G-V-*-S-T-A-L-D-N-A-V-K-N-S-I-A- 30 m) *-*-*-*-v-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S- : n) P-K-G-V-V-V-N-M-S-L-G-G-P-S-S-S-A-V-N-R-A-A-A-*-E-I-T-S- o) P-N-G-V-V-A-S-M-S-I-G-G-G-Y-S-S-S-V-N-S-A-A-A-*-N-L-Q-Q- 112500 17 n: o 150 160 170 a) S-G-V-V-V-V-A-A-A-G-N-E-G-T-S-G-S-S-S-T-V-G-Y-P-G-K-Y-P- b) S-G-I-V-V-A-A-A-A-G-N-E-G-S-S-G-S-S-S-T-V-G-Y-P-A-K-Y-P- c) S-G-I-V-V-A-A-A-A-G-N-E-G-S-S-G-S-T-S-T-V-G-Y-P-A-K-Y-P- 5 d) S-G-I-V-V-A-A-A-A-G-N-E-G-S-S-G-S-T-S-T-V-G-Y-P-A-K-Y-P- e) S-G-I-V-V-V-A-A-A-G-N-S-G-S-S-G-S-Q-N-T-I-G-Y-P-A-K-Y-D- f) R-G-V-V-V-V-A-A-A-G-N-S-G-N-S-G-S-T-N-T-I-G-Y-P-A-K-Y-D- g) R-G-V-V-V-V-A-A-A-G-N-S-G-S-S-G-N-T-N-T-I-G-Y-P-A-K-Y-D- h) R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-*-G-S-I-S-*-*-*-Y-P-A-R-Y-A-10 i) A-G-I-L-L-V-G-A-A-G-N-T-G-R-* -Q-G-V-N-* - * - * -Y-P-A-R-Y-S - j) K-G-S-V-V-V-A-A-A-G-N-A-G-N-T-A-P-N-*-*-*-*-Y-P-A-Y-Y-S- k) S-G-V-M-V-A-V-A-A-G-N-N-N-A-D-A-R-N-Y-S - * - * - * -P-A-S -E-P- l) A-G-V-V-Y-A-V-A-A-G-N-D-N-A-N-A-C-N-Y-S-*-*-*-P-A-R-V-A- m) R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-*-G-S-I-S-*-*-*-Y-P-A-R-Y-A- 15 n) A-G-L-F-L-A-V-A-A-G-N-E-A-T-D-A-S-S-S-S-*-*-*-P-A-S-E-E- 0) S-G-V-M-V-A-V-A-A-G-N-N-N-A-D-A-R-N-Y-S - * - * - * -P-A-S-E-S- n: O 180 190 200 a) S-V-1-A-V-G-A-V-D-S -S-N-Q-R-A-S-F-S - S -V-G-P-E-L-D-V-M-A- b) S-T-1-A-V-G-A-V-N-S -S-N-Q-R-A-S -F-S - S-A-G-S-E-L-D-V-M-A- 20 c) S-T-I-A-V-G-A-V-N-S-S-N-Q-R-A-S-F-S-S-A-G-S-E-L-D-V-M-A- d) S-T-I-A-V-G-A-V-N-S-A-N-Q-R-A-S - F-S -S-A-G-S - E-L-D-V-M-A- e) S-V-I-A-V-G-A-V-D-S-N-K-N-R-A-S-F-S-S-V-G-A-E-L-E-V-M-A- : f) S -V - I - A-V-G-A-V-D - S - N- S - N- R-A - S - F - S - S - V-G-A- E - L - E-V-M-A- .·. : g) S -V - I - A-V-G-A-V-D - S - N-S - N-R-A - S - F - S - S - V-G-A- E - L - E-V-M-A- ’ 25 h) N-A-M-A-V-G-A-T-D - Q-N-N-N-R-A - S - F - S - Q - Y-G-A-G - L-D - I - V-A- 1) G-V-M-A-V-A-A-V-D-Q-N-G-Q-R-A-S-F-S-T-Y-G-P-E-I-E-I-S-A- ' j) N-A-I-A-V-A-S-T-D-Q-N-D-N-K-S-S-F-S-T-Y-G-S-V-V-D-V-A-A- ''/ k) S-V-C-T-V-G-A-S-D-R-Y-D-R-R-S-S-F-S-N-Y-G-S-V-L-D-I-F-G- : ' ‘ 1) E-A-L-T-V-G-A-T-T-S-S-D-A-R-A-S-F-S-N-Y-G-S-C-V-D-L-F-A- 30 m) N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A- · : n) S-A-C-T-V-G-A-T-D-K-T-D-T-L-A-E-Y-S-N-F-G-S-V-V-D-L-L-A- : : : o) S-I-C-T-V-G-A-T-D-R-Y-D-R-R-S-S-F-S-N-Y-G-S-V-L-D-I-F-A- 112500 18 n: o 210 220 a) P-G-V-S-I-Q-S-T-L-P-G-N-*-K-*-Y-G-A-Y-N-G-T-S-M-A-S-P-H- b) P-G-V-S-I-Q-S-T-L-P-G-G-*-T-*-Y-G-A-Y-N-G-T-S-M-A-T-P-H- c) P-G-V-S-I-Q-S-T-L-P-G-G-*-T-*-Y-G-A-Y-N-G-T-S-M-A-T-P-H-5 d) P-G-V-S -I-Q-S -T-L-P-G-G-*-T-* -Y-G-A-Y-N-G-T-S-M-A-T-P-H- e) P-G-V-S -V-Y-S -T-Y-P-S-N-*-T-* -Y-T-S -L-N-G-T-S-M-A-S-P-H- f) P-G-A-G-V-Y-S -T-Y-P-T-N-* -T-* -Y-A-T-L-N-G-T-S-M-A-S-P-H- g) P-G-A-G-V-Y-S -T-Y-P-T-S - * -T-* -Y-A-T-L-N-G-T-S-M-A-S -P-H- h) P-G-V-N-V-Q-S -T-Y-P-G-S - * -T-* -Y-A-S -L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-10 i) P-G-V-N-V-N-S-T-Y-T-G-N-*-R-*-Y-V-S-L-S-G-T-S-M-A-T-P-H- j) P-G-S -W-I-Y-S-T-Y-P-T-S - *-T-* -Y-A-S -L-S-G-T-S-M-A-T-P-H- k) P-G-T-S-I-L-S-T-W-I-G-G-*-S-*-T-R-S-I-S-G-T-S-M-A-T-P-H- l) P-G-A-S-I-P-S-A-W-Y-T-S-D-T-A-T-Q-T-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H- m) P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-*-T-*-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H- 15 n) P-G-T-D-I-K-S-T-W-N-D-G-R-T-K-I-I-S-*-*-G-T-S-M-A-S-P-H- o) P-G-T-D-I-L-S-T-W-I-G-G-S-T-R-S-I-S-*-*-G-T-S-M-A-T-P-H- n:o 230 240 250 a) V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-N-W-T-N-T-Q-V-R-S-S-L-E-N-T-T- b) V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-T-W-T-N-A-Q-V-R-D-R-L-E-S-T-A- 20 c) V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-T-W-T-N-A-Q-V-R-D-R-L-E-S-T-A- d) V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-T-W-T-N-A-Q-V-R-D-R-L-E-S-T-A- e) V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-Y-P-T-L-S-A-S-Q-V-R-N-R-L-S-S-T-A- .·. ; f) V-A-G-A-A-A - L - I - L - S - K - H - P-N - L - S - A- S - Q-V-R-N-R - L - S - S - T-A- g) V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-N-L-S-A-S-Q-V-R-N-R-L-S-S-T-A-25 h) V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A- :: i) V-A-G-V-A-A-L-V-K-S-R-Y-P-S-Y-T-N-N-Q-I-R-Q-R-I-N-Q-T-A- j ) V-A-G-V-A-G-L-L-A-S-Q-G-R-S-*-*-A-S-N-I-R-A-A-I-E-N-T-A- ' ‘ ’ k) V-A-G-L-A-A-Y-L-M-T-L-G-K-T-T-A-A-S -A-C-R-* -Y-I-A-D-T-A- : : : 1) V-A-G-V-A-A-L-Y-L-E-Q-N-P-S-A-T-P-A-S-V-A-S-A-I-L-N-G-A- 30 m) V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A- : n) V-A-G-L-G-A-Y-F-L-G-L-G-Q-K-V-Q-G-L-*-C-D-*-Y-M-V-E-K-G- ; o) V-A-G-L-A-A-Y-L-M-T-L-G-R-A-T-A-S-N-A-C-R-* - Y-I-A-Q-T-A- 112500 19 n: o 260 270 275

a) T-K-L-G-D-S-F-Y-Y-*-G-K-G-L-I-N-V-Q-A-A-A-Q

b) T-Y-L-G-D-S-F-Y-Y-*-G-K-G-L-I-N-V-Q-A-A-A-Q

c) T-Y-L-G-N-S-F-Y-Y-*-G-K-G-L-I-N-V-Q-A-A-A-Q

5 d) T-Y-L-G-S-S-F-Y-Y-*-G-K-G-L-I-N-V-Q-A-A-A-Q

e) T-N-L-G-D-S-F-Y-Y-*-G-K-G-L-I-N-V-E-A-A-A-Q

f) T-Y-L-G-S-S-F-Y-Y-*-G-K-G-L-I-N-V-E-A-A-A-Q

g) T-Y-L-G-S-S-F-Y-Y-*-G-K-G-L-I-N-V-E-A-A-A-Q

h) T-S-L-G-S-T-N-L-Y-*-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R

10 i) T-Y-L-G-S-P-S-L-Y-*-G-N-G-L-V-H-A-G-R-A-T-Q

j) D-K-I-S-G-T-G-T-Y-W-A-K-G-R-V-N-A-Y-K-A-V-Q-Y

k) N-K-G-D-L-S-N-I-P-F-G-T-V-N-L-L-A-Y-N-N-Y-Q-A

l) T-T-G-R-L-S-G-I-G-S-G-S-P-N-R-L-L-Y-S-L-L-S-S-G-S-G

m) T-S-L-G-S-T-N-L-Y-*-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R

15 n) L-K-D-V-I-Q-S-V-P-S-D-T-A-N-V-L-I-N-N-G-E-G-S-A

o) N-Q-G-D-L-S-N-I-S-F-G-T-V-N-L-A-Y-N-N-Y-Q-G

Piirroksen lyhyt kuvaus Tätä keksintöä kuvataan yksityiskohdittain vielä tämän patenttikuvauksen seuraavis-sa osissa viitaten piirroksiin, joissa: : : 20 kuva 1 esittää plasmidi pSX88:n konstruktion, ;,,: kuva 2 esittää plasmidi pSX88:n restriktiokarttaa, : kuva 3 on esimerkkinä mutantti subtilisiini 309:n geenien konstruktiosta tämän ; ; keksinnön mukaisten entsyymien ilmentämiseksi, ' * kuva 4 esittää plasmidi pSX92:n restriktiokarttaa ja 25 kuva 5 osoittaa graafisesti maksimisuorituskyvyn mukaisen pH:n ja tämän keksinnön mukaisten mutanttientsyymien lasketun pl:n välistä suhdetta.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Aiemmin mainittiin, että tämän keksinnön mukaisesti on aikaansaatu mutatoituja : subtilisiineja, joissa aminohappojakso on muutettu mutatoimalla subtilisiinientsyy- I 30 miä vastaavaa geeniä, jossa on haluttua modifioida niitä kodoneita, jotka vastaavat tuloksena olevan entsyymin pinnalla tai tätä lähellä sijaitsevan aminohapon no 245 ilmentymisestä.

112500 20 Tämän keksinnön yhteydessä subtilisiini määritellään gram-positiivisten bakteerien tai sienten tuottamaksi seriiniproteaasiksi. Rajoitetummassa mielessä ja tämän keksinnön moniin sovellutusmuotoihin soveltuen subtilisiini myös tarkoittaa gramposi-tiivisten bakteerien seriiniproteaasia. Toisen määritelmän mukaan subtilisiini on 5 seriiniproteaasi, jossa katalyyttisessä triadissa olevien aminohapporyhmien suhteellinen järjestys on Asp-His-Ser (asemat 32, 64 ja 221). Vielä rajoitetummassa mielessä monet näistä tämän keksinnön mukaisista sovellutusmuodoista liittyvät gram-positiivisten bakteerien seriiniproteaaseihin, jotka ovat olennaisen yksiselitteisellä tavalla homologisia primäärirakenteensa osalta taulukossa 1 esitettyjen subtilisiinien 10 suhteen.

Subtilisiini BPN':n aminohappojaksoista peräisin olevaa numerointijärjestelmää käyttäen, joka on esitetty taulukossa 1 useiden muiden tunnettujen subtilisiinien aminohappojaksojen suhteen kohdistettuna, on mahdollista osoittaa subtilisiinient-syymin aminohapporyhmän asema yksiselitteisesti. Asemille, jotka ovat ennen sub-15 tilisiini BPN':n aminohapporyhmää n:o 1, annetaan negatiivinen numero, kuten -6 termitaasin N-terminaalisen Y:n tapauksessa tai 0 kuten proteinaasi K:n terminaalisen A:n osalta. Aminohappoiyhmät, jotka ovat insertioita subtilisiini BPN':n suhteen, numeroidaan lisäämällä kirjaimia aakkosjärjestyksessä edeltävään subtilisiini BPN':n numeroon, mikä käy ilmi numeroista 12a, 12b, 12c, 12d, 12e, jotka on an-20 nettu proteinaasi K:ssa olevan ryhmien Ser ja Thr välisen S-T-S-P-G-insertion tapauksessa.

Käyttäen edellä kuvattua numerointijärjestelmää kiinnostuksen kohteena olevat \ asemat ovat: 1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 36, 37, ; 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 75, : . : 25 76, 77, 78, 79, 87, 89, 91, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 108, : : 109, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 126, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, ; : : 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 188, 189, 191, 192, 194, 195, 197, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 30 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 251, 252, . V , 253, 254, 255, 256, 257, 259, 260, 261, 262, 263, 265, 269, 271, 272, 275.

Isoelektrinen piste (pl0)

Olettaen, että substraatilla on pesuolosuhteissa entsyymin suhteen vastakkainen säh- köstaattinen varaus, voitaisiin odottaa, että entsyymin adsorptio ja siten pesutehok- 112500 21 kuus substraattia kohtaan parantuisi lisäämällä entsyymin sähköstaattista nettovara-usta, NEC.

Havaittiin kuitenkin yllättäen, että entsyymin NEC:n pienentäminen näissä olosuhteissa saattoi johtaa entsyymin pesutehokkuuden paranemiseen.

5 Toisin sanoen havaittiin, että entsyymin isoelektrisen pisteen, plom, muuttaminen alempaa pH-arvoa vastaavaan suuntaan muutti entsyymin optimaalisen pesutehokkuuden pH:ta alempaan arvoon, joka tarkoittaa sitä, että jotta voitaisiin suunnitella entsyymi matalan pH:n pesunestettä varten, jossa entsyymin on oltava aktiivinen, tunnetun subtilisiinientsyymin pesutehokkuuden parantuminen voidaan saada aikaan 10 mutatoimalla tunnettua subtilisiinientsyymiä vastaava geeni siten, että saadaan mu-tanttientsyymi, jonka pl0 on matalampi.

Tämä havainto johti kokeisiin, jotka osoittivat, että myös päinvastainen tapaus on mahdollinen. Tämä tarkoittaa sitä, että tunnettu subtilisiinientsyymi voidaan myös suunnitella käytettäväksi korkean pH:n detergenteissä muuttamalla sen pl0-arvoa 15 korkeammaksi, jonka johdosta entsyymin pesutehokkuuden pH-optimi muuttuu korkeampaan pH-arvoon.

Keksinnön mukaisesti on näin ollen aikaansaatu mutatoitu subtilisiiniproteaasi, jonka sähköstaattinen nettovaraus on muuttunut verrattuna lähtömuotoiseen proteaasiin ,*·,·, samassa pH-arvossa, jolle mutatoidulle subtilisiiniproteaasille on tunnusomaista, et- ’. '. 20 tä ainakin yksi mutaatio on saatu aikaan asemassa 245 substituutiolla, jolloin maini- tun mutatoidun subtilisiiniproteaasin isoelektrinen piste (pl0) on alempi tai korke-‘;;; ‘ ampi kuin mainitun lähtömuotoisen proteaasin vastaava piste.

: : ; Keksinnön edullisen sovellutusmuodon mukaan mutatoidussa subtilisiiniproteaasis- ; ; ’; sa on ainakin yksi siinä on ainakin yksi mutaatio, joka vaikuttaa asemassa 245 ole- 25 vaan aminohapporyhmään, ja ainakin vielä yksi mutaatio, joka vaikuttaa sellaisessa v, asemassa olevaan aminohapporyhmään, joka on 1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, : ’ 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 75, 76, 77, 78, 79, 87, 89, 91, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 126, 128, 129, 30 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 155, 156, 158, 159, 160, ; , 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 181, 182, 183, 184, 185, 186, : 188, 189, 191, 192, 194, 195, 197,204,206,209,210,211,212,213,214,215,216, 217, 218, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 259, 260, 261, 262, 263, 265, 269, 271, 272, 275.

112500 22

Lyhyesti mainittuna tämä keksintö liittyy näiltä kohteiltaan mutatoituihin prote-aaseihin, joissa mutatoidun proteaasin pl0 on alempi kuin lähtömuotoa olevan prote-aasin pl0 ja joissa optimaalista pesutehokkuutta vastaava pH on myös alempi kuin lähtömuotoa edustavan proteaasin pH-optimi; tai mutatoituihin proteaaseihin, joissa 5 mutatoidun proteaasin pl0 on korkeampi kuin lähtömuotoa edustavan proteaasin pl0 ja joissa optimaalista pesutehokkuutta vastaava pH-optimi on myös korkeampi kuin lähtömuotoa edustavan proteaasin pH-optimi.

Arvellaan yleisesti (Thomas, Russel ja Fersht, katso edellä), että kineettisiin ominaisuuksiin voidaan vaikuttaa muuttamalla entsyymin aktiivisen keskuksen läheisyy-10 dessä olevaa sähköstaattista pintavarausta, mutta nyt on yllättäen havaittu, että entsyymin kineettisiä ominaisuuksia voidaan myös muuttaa modifioimalla aktiivisesta keskuksesta kaukana sijaitsevia pintavarauksia.

Tämän keksinnön mukaisesti saadaan käyttöön sellaisia mutatoituja proteaaseja ja niitä sisältäviä detergenttikoostumuksia, joissa mutatoidun proteaasin aminohappo-15 jakso lisäksi sisältää asemassa 36 olevan insertiomutaation, esimerkiksi negatiivisen varauksen omaavan aminohapporyhmän (esim. D:n tai E:n) tai neutraalin polaarisen ryhmän (kuten A:n, Q:n tai N:n) tai positiivisen aminohapporyhmän, kuten R:n tai K:n insertoimiseksi.

Tämä pätee erityisesti esimerkiksi subtilisiiniproteaaseihin 309 ja 147 ja PB92, ja • ' : 20 mihin tahansa muuhun jaksoon, jonka homologiapiirteet viittaavat siihen, että tältä puuttuu luontaisesti subtilisiini PBN':n jaksoon verrattuna asemassa 36 oleva ami-; "; nohapporyhmä.

Mutanteissa, joissa on insertio asemassa 36, voi olla vielä muita mutaatioita, esi-’ merkiksi yhdessä tai useammissa asemista 120, 170, 195, 235, ja/tai 251, ja/tai ase- : : 25 massa 76. Asemassa 76 olevat sopivat mutaatiot ovat esimerkiksi negatiivisen vara uksen omaavia ryhmiä, kuten N76D tai N76E.

112500 23 distää nämä mutaatiot joko toisessa tai molemmissa asemista 36 ja 76 olevaan mutaatioon.

Tämän keksinnön mukaan on vielä edullista, että mutatoitu subtilisiinientsyymi edustaa sellaisesta lähtömuodosta saatua mutaatiota, joka on subtilisiini BPN', sub-5 biisiini amylosacchariticus, subtilisiini 168, subtilisiini mesenterikopeptidaasi, subtilisiini Carlsberg, subtilisiini DY, subtilisiini 309, subtilisiini 147, termitaasi, Bacillus PB92 -proteaasi ja proteinaasi K, edullisesti subtilisiini 309, subtilisiini 147, subtilisiini Carlsberg, akvalysiini, Bacillus PB92 -proteaasi, proteaasi TW7 tai proteaasi TW3.

10 Jäljempänä esitetyissä esimerkeissä käytettiin seuraavia subtilisiinivariantteja:

S001) G195E

5003) R170Y

5004) R170Y+G195E

15 S005) K251E

SOI 2) R170Y+G195E+K251E

SO 19) H120D+R170Y+G195E+K235L

5020) H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E

5021) *36D

20 S022) *36D+R170Y+G195E+K251E

V S023) *36D+H120D+R170Y+G195E+K235L

0·: S024) *3 6D+H120D+R170 Y+G195E+K235L+K2 51E

S025) *36D+H120D+G195E+K235L

S027) E89S 25 S028) D181N

: :·; S031) D197N+E271Q

5032) D197N

5033) E271Q

.,: S035) *3 6D+N76D+H120D+G195E+K23 5L

30 S201) N76D

0\: S202) N76D+G195E

; S203) N76D+R170 Y+G195E

C001) D14K : coo2) D120K

' ! 35 C003) D140K

C004) D14K+D120K

112500 24

C008) D172K

Vielä yhtenä tämän keksinnön kohteena on sellainen menetelmä aminohap(p)o(je)n määrittämiseksi tai valitsemiseksi, jolla voidaan suorittaa lähtömuotoinen entsyymin asemassa 245 olevaan aminohappoon kohdistuva deleetio, substituutio tai insertio, 5 jolle menetelmälle on tunnusomaista, että valinta suoritetaan tavalla, jolla mutatoita-vaksi aiotun entsyymin laskennallinen sähköstaattinen nettovaraus (NEC) on muuttunut valitun lähtömuotoisen entsyymin samassa pH:ssa laskettuun NECrhen verrattuna.

Toinen tapa ilmaista tämän keksinnön kattama periaate on se, että ne asemat ja ami-10 nohapot, jotka mainitussa lähtömuotoa edustavassa entsyymissä aiotaan deletoida, substituoida tai korvata, valitaan tavalla, jolla varausten kokonaismäärä tai koko va-raussisältö (=TCC) ja/tai saadun mutatoidun entsyymin NEC:n muutos on suoritettu siten, että tuloksena on siten mutatoitu proteaasi, jonka isoelektrinen piste (= pl0) on siirtynyt samaan suuntaan kuin entsyymin optimaalista pesutehokkuutta vastaavaa 15 pH:ta olisi siirrettävä, jonka pH-optimin tulisi olla mahdollisimman lähellä sitä pesunesteen pH:ta, jossa mainittua mutatoitua proteaasia aiotaan käyttää.

Kuten edellä mainittiin, lasketaan makromolekyylin, kuten entsyymin, pl0 sinä pH-arvona, jossa molekyylin NEC-arvo on 0. Tästä menetelmästä esitetään esimerkkejä jäljempänä olevissa esimerkeissä, mutta sen periaatteet kuvataan yksityiskohdittain : ’ · ’: 20 välittömästi seuraavassa kohdassa.

Kullekin mahdollisesti varaukselliselle aminohapporyhmälle annetaan pK-arvot.

;;; ’ Tämän jälkeen lasketaan se suhde, joka saadaan tietyssä pH.ssa varauksellisessa tai ' varauksettomassa muodossa esiintyvästä aminohapporyhmästä (varauksellinen/va- v : raukseton, C/U(i)) lasketaan sekä negatiivisen että positiivisen varauksen osalta ·' 25 käyttäen kaavoja Ia ja Ib: ; , ·, C/U(i) = exp(ln]0(pH-pKj)) (negatiivinen varaus) (Ia) ' . i C/U(i) = exp(ln io(pKj-pH)) (positiivinen varaus) (Ib), . tässä järjestyksessä mainittuna.

* Kaavojen Ia ja Ib osalta havaitaan, että pH-arvossa, joka vastaa pK,:tä, C/U(i) vastaa : : 30 arvoa 1.

‘ ; Tämän jälkeen kullekin varaukselliselle aminohapporyhmälle annettu suhteellinen varaus Qr(i) eli varauskontribuutio lasketaan käyttäen kaavoja Ilaja Hb: 112500 25

Qr(i) = C/U(i)/(1+C/U (i)) (negatiivinen varaus) (Ha)

Qr(i) = -C/U(i)/(1+C/U (i)) (positiivinen varaus) (Hb) pH-arvo, jossa kaikkien varauksellisista ryhmistä saatujen varaukseen vaikuttavien osuuksien summa on 0, määritetään iteroimalla tai interpoloimalla riittävän tiheillä 5 väleillä varustetusta pH-varaussummataulukosta.

Mutatoituja entsyymejä käsittävät detergenttikoostumukset Tämä keksintö käsittää lisäksi tämän keksinnön mukaisten mutatoitujen entsyymien käytön puhdistus- ja detergenttikoostumuksissa ja mutatoituja subtilisiinientsyymejä käsittävän tällaisen koostumuksen.

10 Koostumukset käsittävät lisäksi minkä tahansa yhden tai useamman mutatoidun sub-tilisiinientsyymin, joka on minkä tahansa tämän keksinnön mukaisen edellä kuvatun kohteen mukainen käytettynä yksinään tai yhdessä alan ammattimiehen tunteman minkä tahansa näihin koostumuksiin liitetyn muun tavallisen komponentin kanssa.

Näihin komponentteihin kuuluvat tehoaineet, kuten tehoaineina käytetyt fosfaatti tai 15 zeoliitti, pinta-aktiiviset aineet, kuten anioiniset, kationiset tai ionittomat pinta-aktiiviset aineet, polymeerit, kuten akryyli tai muut tätä vastaavat polymeerit, val-kaisujärjestelmät, kuten perboraattia tai aminoryhmiä sisältäviä valkaisuaineen esi-,, . muotoja tai aktivaattoreita, strukturantteja, kuten silikaattistrukturantteja, emästä tai : 1 happoa pH:n säätämiseksi, kosteutusaineita ja neutraaleja epäorgaanisia suoloja.

: 20 Useissa käyttökelpoisissa sovellutusmuodoissa detergenttikoostumukset voidaan . ’ . formuloida seuraavasti: ' · ' a) Detergenttijauheeksi formuloitu detergenttikoostumus, joka sisältää fosfaatti- v ' tehoaineen, anionisen pinta-aktiivisen aineen, ionittoman pinta-aktiivisen aineen, akryyli- tai tätä vastaavan polymeerin, perboraatti-valkaisuaine-esimuodon, amino-’ : 25 ryhmän sisältävän valkuaisaineaktivaattorin, silikaatti- tai muun strukturantin, emäs- :'"; tä käytön aikaisen pH-arvon säätämiseen ja neutraalin epäorgaanisen suolan.

> b) Detergenttijauheeksi formuloitu detergenttikoostumus, joka sisältää zeoliittite- : : hoaineen, anionisen pinta-aktiivisen aineen, ionittoman pinta-aktiivisen aineen, ak- : ryyli- tai tätä vastaavan polymeerin, perboraatti-valkaisuaine-esimuodon, amino- ’ , ! 30 ryhmän sisältävän valkuaisuaineen aktivaattorin, silikaatti- tai muun strukturantin, emästä käytön aikaisen pH-arvon säätämiseen ja neutraalin epäorgaanisen suolan.

112500 26 c) Vesipitoiseksi nestemäiseksi detergentiksi formuloitu detergenttikoostumus, joka sisältää anionisen pinta-aktiivisen aineen, ionittoman pinta-aktiivisen aineen, kosteutusaineen, orgaanisen hapon, alkalihydroksidilipeän, ja jonka pH on säädetty arvojen 9 ja 10 välillä olevaan arvoon.

5 d) Vedettömäksi nestemäiseksi detergentiksi formuloitu detergenttikoostumus, joka käsittää nestemäisen ionittoman pinta-aktiivisen aineen, joka koostuu olennaisesti lineaarisesti alkoksyloidusta primäärisestä alkoholista, triasetiinin, natriumtri-fosfaatin, alkalihydroksidilipeän, valkaisuaineen esimuodon, joka on perboraatti-monohydraatti ja valkaisuaineena aktivaattorina olevan tertiäärisen amiinin, ja jonka 10 pH on säädetty arvojen 9 ja 10 välillä olevaan arvoon.

e) Rakeistetuksi detergenttijauheeksi formuloitu detergenttikoostumus, jonka irtotiheys on 550 g/1, esimerkiksi ainakin 600 g/1, ja joka sisältää anionisiaja ionitto-mia pinta-aktiivisia aineita, esimerkiksi anionisen pinta-aktiivisen aineen ja ionittoman pinta-aktiivisen aineen seoksen, joiden molempien alkoksylointiaste on noin 7 15 ja noin 3, vähän tai olennaisesti ei lainkaan neutraalia epäorgaanista suolaa, fosfaat-titehoainetta, valkaisuaine-esimuotona käytettävää perboraattia, valkaisuaineakti-vaattorina tertiääristä amiinia, natriumsilikaattia ja pieniä määriä lisäaineita ja kosteutta.

f) Rakeistetuksi jauhemaiseksi detergentiksi formuloitu detergenttikoostumus, :' · ’; 20 jonka irtotiheys on ainakin 600 g/1 ja joka sisältää anionisia ja ionittomia pinta-aktii- .'. : visia aineita, esimerkiksi anionisen pinta-aktiivisen aineen ja ionittomien pinta-aktii- , * , visten aineiden seoksen, joiden kunkin alkoksylointiasteet ovat noin 7 ja noin 3, vä- t hän tai olennaisesti ei lainkaan neutraalia epäorgaanista suolaa, zeoliitti-tehoainetta, ,;; valkaisuaine-esimuotona käytettävää perboraattia, valkaisuaineaktivaattorina tertiää- ; ‘ 25 ristä amiinia, natriumsilikaattia ja muita vähäisemmissä määrin esiintyviä aineita ja ’ · ’ ' kosteutta.

; g) Detergenttijauheeksi formuloitu detergenttikoostumus, joka sisältää anionisen pinta-aktiivisen aineen, ionittoman pinta-aktiivisen aineen, akryylipolymeerin, ras-vahapposaippuan, natriumkarbonaattia, natriumsulfaattia, amiineilla täydennettyjä ' 30 tai täydentämättömiä savipartikkeleita, valkaisuaineen esimuotona käytettävää per- :,,. * boraattia, valkaisuaineaktivaattorina käytettävää tertiääristä amiinia, natriumsilikaat- : . tia ja vähäisessä määrässä esiintyviä aineita ja kosteutta.

: h) Detergentti(saippua)tangoksi formuloitu detergenttikoostumus, joka sisältää saippuaa, joka perustuu talin ja kookospähkinäöljyn saponifioituun seokseen, joka 112500 27 on neutraloitu ortofosforihapolla, ja johon on sekoitettu proteaasiaja myös sekoitettu natriumformaattia, booraksia, propyleeniglykolia ja natriumsulfaattia ja tämän jälkeen puristettu saippuatangoksi saippuan tuotantolinjassa.

j) Entsymaattinen detergenttikoostumus, joka on formuloitu siten, että siitä saa-5 daan pesuneste, jonka pH on 9 tai sen alle, kun sitä käytetään annoksena, joka vastaa 0,4-0,8 g/1 pinta-aktiivista ainetta.

k) Entsymaattinen detergenttikoostumus, joka on formuloitu siten, että siitä saadaan pesuneste, jonka pH on 8,5 tai sen yli, kun sitä käytetään annoksena, joka vastaa 0,4-0,8 g/1 pinta-aktiivista ainetta.

10 1) Entsymaattinen detergenttikoostumus, joka on formuloitu siten, että siitä saa daan pesuneste, jonka ionivahvuus on 0,03 tai tämän alle, esimerkiksi 0,02 tai alle tämän, kun sitä käytetään annoksena, joka vastaa 0,4-0,8 g/1 pinta-aktiivista ainetta.

m) Entsymaattinen detergenttikoostumus, joka on formuloitu siten, että siitä saadaan pesuneste, jonka ionivahvuus on 0,01 tai tämän yli, esimerkiksi 0,02 tai tätä 15 enemmän, kun sitä käytetään annoksena, joka vastaa 0,4-0,8 g/1 pinta-aktiivista ainetta.

Mutatoituja entsyymejä yhdessä lipaasin kanssa käsittäviä detergenttikoostu-muksia ; ‘ ; On yllättäen havaittu, että subtilisiinityyppisen proteaasin isoelektrisen pisteen, pl:n, ,·“. 20 alentaminen pesuolosuhteissa voi johtaa ei vain siihen, että entsyymin pesutehok- . *. kuus paranee, vaan myös siihen, että se on paremmin yhteensopiva lipaasin kanssa.

•. ·’ On myös yllättäen tehty löytö, että proteaasin yhteensopivuuteen lipaasin kanssa ei ; ·' vaikuta ainoastaan pl, vaan myös varauksellisten asemien sijainti proteaasin aktiivi seen keskukseen nähden: tuomalla negatiivinen varaus tai positiivisen varaus aktii-;: 25 visen keskuksen läheisyyteen saadaan proteaasin yhteensopivuus lipaasin kanssa pa- . ’". ranemaan, ; : Tämän perusteella tämän keksinnön mukaisista tietyistä sovellutusmuodoista saa- :'": daan käyttöön entsymaattisia detergenttikoostumuksia, jotka käsittävät lipaasin sekä . mutatoidun subtilisiiniproteaasin, jossa mutatoidun proteaasin molekyylin sähkö- ; 30 staattista nettovarausta on muutettu aminohapporyhmien insertiolla, deleetiolla tai : substituutiolla verrattuna lähtömuotoa edustavaan proteaasiin ja jossa mainitussa proteaasissa on mainittua lähtömuotoa edustavaan proteaasiin verrattuna vähemmän 112500 28 positiivisesti varautuneita aminohapporyhmiä ja/tai enemmän negatiivisesti varautuneita aminohapporyhmiä, joiden ansioista mainitulla subtilisiini-proteaasilla on alhaisempi isoelektrinen pH (pl0) kuin mainitun lähtömuotoa edustavan proteaasin plo· 5 Yksi edullinen tällaiseen käyttöön tarkoitettu lipaasiryhmä on peräisin gramnegatii-visista bakteereista ja siihen kuuluu esimerkiksi lipaasientsyymejä, jotka ovat ryhmiä, jotka on määritelty patenttijulkaisuissa EP-0 205 208 ja 0 206 390, jotka on molemmat myönnetty Unileverille (jotka liitetään tähän patenttihakemusjulkaisuun tähän oikeuttavien säädösten nojalla, mukaan lukien lipaasit, jotka muistuttavat im-10 munologisesti tietyistä Ps. fluorescens, P. gladioli ja Chromobacter-kannoista peräisin olevia lipaaseja.

Edellä mainitun lipaasin yhteydessä käytettäväksi tarkoitetut mutatoidun subtilisii-nientsyymin edullisissa sovellutusmuodoissa on yksi tai useampia mutaatioita ami-nohapporyhmän kohdassa, joka sijaitsee noin 15 Ä - 20 Ä aktiivisesta keskuksesta, 15 erityisesti esimerkiksi asemissa 170, 120 tai 195.

Lipaasi voidaan kätevästi lisätä lipolyyttisen entsyymin rakeisena koostumuksena (vaihtoehtoisesti liuoksena tai lietteenä) kantajamateriaaliin yhdistettynä (esim. patenttijulkaisun EP-258 068 (Novo Nordisk A/S) mukaisesti ja Novo Nordisk A/S -yhtiön Savinase®- ja and Lipolase®-tuotteiden tavoin käytettynä).

20 Lisätty lipaasimäärä voidaan valita laajoissa rajoissa, esimerkiksi alueella 50-30 000 LU/g kutakin pinta-aktiivi sen systeemin grammaa tai detergenttikoostumus-grammaa kohti, esimerkiksi vähintään 100LU/g, hyvin hyödyllisesti ainakin 500 LU/g, joskus edullisesti noin 1000, yli 2000 LU/g tai yli 4000 LU/g tai enem-v ' män, siten hyvin usein alueella 50-4000 LU/g ja mahdollisesti alueella 200- v : 25 1000 LU/g. Tässä patenttikuvauksessa lipaasiyksiköt määritellään patenttijulkaisus sa EP 258068 määritellyllä tavalla.

Lipolyyttinen entsyymi voidaan valita suuresta joukosta lipaaseja. Erityisesti li-paaseista, jotka on kuvattu esimerkiksi patenttikuvauksissa EP 214 761 (Novo Nordisk A/S) ja EP 0 258 068 ja erityisesti lipaaseista, joilla esiintyy immunologisia ris-30 tireaktioita sellaisilla antiseerumeilla, jotka on muodostettu Thermomyces lanu-: ginosus ATCC 22070:sta peräisin olevaa lipaasia vastaan, EP-0 205 208 ja-EP- , ; 0 206 309, ja erityisesti lipaaseista, joilla esiintyy immunologisia ristireaktioita an-

: tiseerumeilla, jotka on muodostettu Chromobacter viscosum var lipolyticum NRRL

B-3673:sta peräisin olevaa lipaasia vastaan tai Alcaligenes PL-679:sta, ATCC

112500 29 31371 :stä tai FERM-P 3783 :sta peräisin olevaa lipaasia vastaan ja myöskin patenttijulkaisujen WO 87/00859 (Gist-Brocades) ja-EP 0 204 284 (Sapporo Breweries) pa-tenttikuvauksissa kuvattuja lipaaseja vastaan. Sopivia ovat erityisesti esimerkiksi seuraavat kaupallisesti saatavilla olevat lipaasipreparaatit: Novo Lipolase®, Amano-5 lipaasit CE, P, B, AP, M-AP, AML ja CES, ja Meito-lipaasit MY-30, OF ja PL, sekä Esterase® MM, Lipozym®, SP225, SP285, Saiken-lipaasi, Enzeco-lipaasi, Toyo Jozo -lipaasi ja Diosynth-lipaasi (tavaramerkkejä).

Entsyymejä voidaan muokata geeniteknisin keinoin muuttamalla sopiva lipaasigee-ni, esimerkiksi Thermomyces lanuginosuksesta tai tämän mutantista peräisin oleva 10 lipaasigeeni tuomalla geeni tai sen johdannainen sopivaan tuottajaorganismiin, kuten Aspergillukseen ja ilmentämällä tätä geeniä. Voidaan käyttää menetelmiä, jotka on kuvattu patenttijulkaisuissa WO 88/02 775 (Novo Nordisk A/S), EP 0 243 338 (Labofma), EP 0 268 452 (Genencor) ja erityisesti EP 0 305 216 (Novo Nordisk A/S) tai EP 0 283 075 (Gist-Brocades) ja näitä voidaan käyttää ja muokata sopivasti.

15 Samanlaiset näkökohdat soveltuvat mutatis mutandis muiden mahdollisesti läsnä olevien entsyymien tapauksissa. Tätä keksintöä rajoittamatta pätee se, että amylaasia voidaan esimerkiksi käyttää lisäämällä sitä määriä, jotka ovat alueella noin 1 - noin 100 MU (maltoosiyksikköä) detergenttikoostumuksen grammaa kohti (tai 0,014-1,4, esim. 0,07-0,7, KNU/g (Novo yksikköä)). Sellulaasia voidaan esimerkisi käyttää li-20 säämällä sitä määriä, jotka ovat alueella noin 0,3 - noin 35 CEVU-yksikköä deter-: ·' genttikoostumusgrammaa kohti.

• ' I

; ’ ; Detergenttikoostumuksiin voi lisäksi kuulua seuraavia tavallisia detergenttien ai- . · , nesosia tavallisina määrinä.

v ’ Ne voivat olla tehoaineilla varustettuja tai varustamattomia ja ne voivat olla 0-P- . 25 tyyppisiä (ts. sellaisia, joissa ei esiinny lainkaan fosforia sisältäviä tehoaineita).

Koostumus voi siten sisältää yhteensä noin l-50paino-%, esimerkiksi ainakin noin 5 paino-% ja usein noin 35-40 paino-%:iin asti yhtä tai useampaa orgaanista ja/tai epäorgaanista tehoainetta. Tyypillisiin esimerkkeihin näistä tehoaineista kuuluvat edellä jo aiemmin mainitut aineet ja niihin kuuluvat laajemmin alkalimetalli-orto-, 30 pyro-, ja tripolyfosfaatit, alkalimetallikarbonaatit, joita käytetään joko yksinään tai sekoitettuna kalsiittiin, alkalimetallisitraatit, alkalimetalli-nitrilotriasetaatit, karbo-metyylioksisukkinaatit, zeoliitit, polyasetaalikarboksylaatit jne.

Detergenttikoostumukset voivat lisäksi sisältää 1-35 % valkaisuainetta tai valkaisu-aineen esimuotoa tai systeemin, joka käsittää valkaisuaineen ja/tai esimuodon yh 112500 30 dessä tämän aktivaattorin kanssa. Muita vaihtoehtoisia aineksia ovat vaahdonmuo-dostuksen tehostajat, vaahdonestoaineet, korroosiota ehkäisevät aineet, likaa sus-pendoivat aineet, likaa pidättävät aineet, lian erottumista ehkäisevät aineet, hajusteet, väriaineet, entsyymejä stabiloivat aineet jne.

5 Koostumuksia voidaan käyttää tekstiilimateriaalien pesuun, erityisesti, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, puuvillaan ja polyestereihin ja näiden seoksiin perustuvien tekstiilien pesuun, erityisen sopivia ovat esimerkiksi pesutoimenpiteet, joissa käytetään lämpötiloja, jotka ovat noin 60-65 °C tai tätä alempia, esimerkiksi noin 30 °C -35 °C tai tätä alempia lämpötiloja. Se voi olla hyvin sopivaa käytettäväksi koostu-10 muksessa annoksena, josta pesuliuokseen saadaan esimerkiksi noin 0,4-0,8 g/1 pinta-aktiivista ainetta, vaikkakin on tietenkin mahdollista haluttaessa käyttää pienempiä tai suurempia konsentraatioita. Tätä keksintöä rajoittamatta voidaan esimerkiksi mainita, että käyttömäärä, joka on noin 3 g/1 ja korkeintaan 6 g/1 detergenttiformu-laatiota, on sopiva käytettäväksi niissä tapauksissa, joissa formulaatiot ovat esimer-15 keissä esitettyjen mukaisia.

Menetelmä mutaatioiden muodostamiseksi subtilisiinigeeneihin Tällä alalla tunnetaan useita menetelmiä mutaatioiden muodostamiseksi geeneihin.

Sen jälkeen, kun on lyhyesti tarkasteltu subtilisiinigeenien kloonausta, tarkastellaan menetelmiä mutaatioiden muodostamiseksi subtilisiinigeeniin sekä sattumanvarai- : v. 20 siin kohtiin että spesifisiin kohtiin.

• 1 ’· : Subtilisiinigeenin kloonaus :. Subtilisiinia koodaava geeni voidaan kloonata mistä tahansa grampositiivisesta bak- . ; teeristä tai sienestä monella tällä alalla tunnetulla menetelmällä. Ensin on konstruoi- > tava genomista ja/tai cDNA:sta saatava DNA-kirjasto käyttäen kromosomaalista 25 DNA:ta tai lähetti-RNA:ta tutkittavaa subtilisiinia tuottavasta organismista. Tämän jälkeen, mikäli subtilisiinin aminohappojakso on tunnettu, voidaan syntetisoida ho-;' mologisia leimalla varustettuja oligonukleotidikoettimia ja käyttää niitä subtilisiinia koodaavien kloonien tunnistamiseen bakteeri-DNA-genomikirjastosta tai sienten cDNA-kirjastosta. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää koettimena leimalla varustettua 30 oligonukleotidikoetinta, joka sisältää jaksoja, jotka ovat homologisia muusta bakteerikannasta tai sienistä peräisin olevaan subtilisiinia kohtaan subtilisiinia koodaavien kloonien tunnistamiseksi käyttäen hybridisointi- ja pesuolosuhteita, joiden rajoit-tavuus on alhaista.

112500 31

Vielä yhteen menetelmään subtilisiinia tuottavien kloonien tunnistamiseksi voisi liittyä se, että liitetään genomin DNA:sta muodostuvat fragmentit ilmentämisvektoriin, kuten plasmidiin, transformoidaan proteaasi-negatiivinen bakteeri saadulla genomin DNA-kirjastolla ja maljataan tämän jälkeen transformoidut bakteerit subtilisiinin 5 substraattia, kuten kuorittua maitoa, sisältävälle agarille. Ne bakteerit, joissa on subtilisiinin sisältävä plasmidi, tuottavat kirkkaasta agarista muodostuvan renkaan ympäröimiä pesäkkeitä, mikä johtuu kuoritun maidon pilkkoutumisesta erittyneen subtilisiinin avulla.

Satunnaisten mutaatioiden muodostaminen subtilisiinigeeniin 10 Sen jälkeen, kun subtilisiinigeeni on kloonattu sopivaan vektoriin, kuten plasmidiin, voidaan käyttää useita menetelmiä satunnaisten mutaatioiden aiheuttamiseen geeniin.

Yksi menetelmä voisi olla se, että kloonattu subtilisiini viedään osana talteen saatavaa vektoria Escherichia colin mutaattorikantaan.

15 Toiseen menetelmään voisi liittyä subtilisiinigeenin yksinauhaisen muodon valmistaminen ja subtilisiinigeenin fragmentin liittäminen pituussuunnassa toiseen DNA-fragmenttiin siten, että osa subtilisiinigeeniä jää yksinauhaiseksi. Tämä erillinen yk-sinauhainen alue voitaisiin sitten altistaa yhdelle monista mutagenisoivista aineista, : v, mukaan lukien, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, natriumvetysulfiitti, hydr- : 20 oksyyliamiini, typpihapoke, muurahaishappo tai hydraaliatsiini. Erityinen esimerkki !. tästä satunnaisten mutaatioiden valmistamisesta on kuvattu julkaisussa Shortle ja ;;; Nathans, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75 (1978) 2170-2174). Shortlen ja Nathan- ;; sin menetelmän mukaan subtilisiinigeenin sisältävä plasmidi voitaisiin käsitellä pilk- ‘ ·' komalla se restriktioentsyymillä, joka pilkkomiskohta on geenin alueella. Tämä kat- 25 kos voitaisiin laajentaa aukoksi käyttäen DNA-polymeraasi I:n eksonukleaasivaiku-tusta. Saatu yksinauhainen aukko voitaisiin tämän jälkeen mutagenisoida millä tahansa edellä mainitulla mutagenisoivalla aineella.

Vaihtoehtoisesti Bacillus-lajista peräisin oleva subtilisiinigeeni, joka sisältää luonnollisen promoottorin ja muita ohjaavia jaksoja, voitaisiin kloonata plasmidivekto-30 riin, joka sisältää sekä E. colin että B. subtiliksen replikoneja, selektoitavissa olevan fenotyyppisen markkerin ja M13:n replikaation alkukohdan yksinauhaisen plasmidi-DNA:n muodostamiseksi auttajafaagi-IRl:n superinfektiolla. Kloonatun subtilisiinigeenin sisältämä yksinauhainen plasmidi-DNA eristetään ja liitetään pituussuunnassa yhteen sellaisen DNA-fragmentin kanssa, joka sisältää vektorijaksoja, mutta ei 112500 32 subtilisiinia koodaavaa aluetta, josta muodostuu aukon käsittävä dupleksimolekyyli. Subtilisiinigeeniin muodostetaan mutaatioita joko natriumvetysulfiitilla, typpihapok-keella tai muurahaishapolla tai antamalla replikaation tapahtua E. colin mutaattori-kannassa, kuten edellä on kuvattu. Koska natriumvetysulfiitti reagoi yksinomaisesti 5 yksinauhaisessa DNA:ssa olevien sytosiinien kanssa, tällä mutageenilla aiheutetut mutaatiot rajoittuvat ainoastaan koodaaviin alueisiin. Reaktioaikaa ja vetysulfiitti-konsentraatioita vaihdellaan eri kokeissa siten, että yhtä subtilisiinigeeniä kohti syntyy keskimäärin 1-5 mutaatiota. Kun 10 mg aukon sisältävää dupleksi-DNA:ta inku-boidaan 4 M Na-vetysulfiitissa, jonka pH on 6,0, 9 min ajan 37 °C:ssa ja reaktiotila-10 vuudessa, joka on 400 ml, deaminoituu noin 1 % yksinauhaisessa alueessa olevista sytosiineista. Kypsän subtilisiinin koodaava alue sisältää noin 200 sytosiinia riippuen siitä, mikä DNA-nauha on kyseessä. Reaktioaikaa vaihdellaan edullisesti noin 4 minuutista (josta syntyy mutaatiofrekvenssi, joka on noin 1 mutaatio 200:ssa) noin 20 minuuttiin (noin 5 mutaatiota 200:ssa).

15 Mutageneesin jälkeen aukon sisältäviä molekyylejä käsitellään in vitro -olosuhteissa DNA-polymeraasi 1:11a (Klenow-fragmentti) toisen kaksinauhaisen molekyylin valmistamiseksi ja mutaatioiden kiinnittämiseksi. Tämän jälkeen kompetentteja E. co-li -soluja transformoidaan mutagenisoidulla DNAilla mutatoituneita subtilisiineja sisältävän amplifioidun kirjaston muodostamiseksi. Amplifioidut mutanttikiijastot 20 voidaan myös valmistaa suorittamalla kasvatus plasmidi-DNA:n ollessa E. coli Mut D -kannassa, joka lisää mutaatioiden määrää virheitä aiheuttavan DNA-polyme-'. . raasinsa vuoksi.

: Typpihapoke- ja muurahaishappomutageeneja voidaan myös käyttää mutanttikirjas- : : tojen valmistamiseksi. Koska nämä kemikaalit eivät ole yhtä spesifisiä yksinauhai- : 25 selle DNA:lle kuin natriumvetysulfiitti, suoritetaan mutageneesireaktiot noudattaen . . seuraavaa suoritustapaa. Subtilisiinigeenin koodaava osa kloonataan M13-faagiin standardimenetelmillä ja valmistetaan yksinauhainen faagi-DNA. Yksinauhaisen DNA:n annetaan tämän jälkeen reagoida 1 M typpihapokkeen kanssa pH:ssa 4,3 15-60 minuutin ajan 23 °C:ssa tai 2,4 M muurahaishapon kanssa 1-5 minuuttia 30 23 °C:ssa. Näillä reaktioaikojen alueilla saadaan mutaatiofrekvenssi, joka on alueel la 1/1 000 - 5/1 000. Mutageneesin jälkeen M13-DNA:aan liitetään pituussuunnassa yleisaluke ja syntetisoidaan kaksinauhainen DNA käyttäen templaattina yksinauhais-ta mutagenisoitua DNA:ta siten, että subtilisiinigeenin koodaava osa tulee täysin kaksinauhaiseksi. Tässä vaiheessa koodaava alue voidaan pilkkoa pois M13-vekto-: 35 rista restriktioentsyymeillä ja liittää ligaasin avulla mutagenisoimattomaan ilmentä- 112500 33 misvektoriin siten, että mutaatiot esiintyvät ainoastaan restriktiofragmentissa. (Myers et ai., Science 229 (1985) 242-257).

Kohdemutaatioiden muodostaminen subtilisiinigeeniin

Kun subtilisiinigeeni on kloonattu ja haluttavat mutatoitavat kohdat tunnistettu, nä-5 mä mutaatiot voidaan valmistaa käyttäen synteettisiä oligonukleotidejä. Nämä oli-gonukleotidit sisältävät nukleotidijaksoja, jotka ovat haluttujen mutaatiokohtien viereisillä alueilla; mutaatioita muodostavat nukleotidit liitetään oligonukleotidisyntee-sin aikana. Edullisessa menetelmässä muodostetaan subtilisiinigeenin sisältävään vektoriin aukko, joka muodostuu subtilisigeenin puoliskoja yhdistävästä yksinauhai-10 sesta DNA:sta. Synteettinen nukleotidi, jossa on haluttu mutaatio, liitetään tämän jälkeen yksinauhaisen DNA:n homologiseen osaan pituussuunnassa. Jäljellä oleva aukko täytetään DNA-polymeraasi 1:11a (Klenow-fragmentti) ja konstruktio liitetään ehyeksi ligaasin avulla käyttäen T4-ligaasia. Erityinen esimerkki tästä menetelmästä on kuvattu julkaisussa Morinaga et ai., Biotechnology 2 (1984) 646-639). Julkaisun 15 Morinaga et ai., mukaisesti geenissä oleva fragmentti poistetaan käyttäen restriktio-endonukleaasia. Vektori/geeni, joka tässä vaiheessa sisältää aukon, denaturoidaan ja hybridisoidaan vektori/geeniin, joka sen sijaan, että sisältäisi aukon, on pilkottu toisella restriktioendonukleaasilla sellaisesta kohdasta, joka jää aukkoon sisältyvän alueen ulkopuolelle. Geenin yksinauhainen alue on käytettävissä hybridisointiin mu-20 tatoitujen oligonukleotidien kanssa, jäljellä oleva aukko täytetään DNA-polymeraasi • ' [ · I:n Klenow-fragmentilla, liitetyt molekyylit ligatoidaan T4-DNA-ligaasilla ja yhden : * i replikaatiosyklin jälkeen muodostuu kaksinauhainen plasmidi, jossa on haluttu rau- : ‘ “: taatio. Morinagan menetelmällä vältytään muiden uusien restriktiokohtien konstruk- ; ; tiovaiheilta ja se helpottaa tämän vuoksi mutaatioiden muodostumista useisiin koh- . , 25 tiin. US-patenttijulkaisun 4 760 025, jonka ovat julkaisseet Esteli et ai., ja joka on _ julkaistu 26.7.1988, mukaisesti on mahdollista liittää oligonukleotidejä, joissa on useita mutaatioita suorittamalla kasettiin pieniä muutoksia, mutta kuitenkin Mo-,, , rinagan menetelmällä voidaan aiheuttaa useita erilaisia mutaatioita koska tahansa, : ' koska tällä voidaan tuoda suuri määrä useita erimittaisia oligonukleotidejä.

30 Subtilisiinimutanttien ilmentäminen : : Tämän keksinnön mukaisesti edellä kuvatuilla menetelmillä tai millä tahansa muulla : , vaihtoehtoisella tällä alalla tunnetulla menetelmällä tuotettu mutatoitu subtilisiini- , ’ geeni voidaan ilmentää entsyymimuodossa käyttäen ilmentämisvektoria. Ilmentä- misvektorin määritelmä kuuluu yleisesti kloonausvektorin määritelmään, koska il-35 mentämisvektoriin kuuluvat tavallisesti tyypillisen kloonausvektorin komponentit, 112500 34 nimittäin yksikkö, jolla vektori kykenee replikoituinaan autonomisesti mikro-organismissa mikro-organismin genomista riippumattomalla tavalla ja yksi tai useampi fenotyyppinen markkeri selektiotarkoituksiin. Ilmentämisvektoriin sisältyy kontrolli-jaksoja, jotka koodaavat promoottoria, operaattoria, ribosomia sitova kohta, trans-5 laation aloitussignaali, ja vaihtoehtoisesti repressorigeenit tai useita eri aktivaattori-geenejä. Ilmennetyn proteiinin erittymisen mahdollistamiseksi voidaan ennen geenin koodaavaa jaksoa liittää nukleotidejä, jotka koodaavat "signaalijaksoa". Ohjaavien jaksojen alaisuudessa tapahtuvaa ilmentämistä varten tämän keksinnön mukaisesti käsiteltävä kohdegeeni liitetään toiminnallisesti ohjaaviin jaksoihin oikeaan lukuke-10 hykseen. Promoottorijaksoihin, jotka voidaan liittää plasmidivektoriin ja jotka voivat ylläpitää mutatoidun subtilisiinigeenin transkriptiota, kuuluvat, mainittuihin kuitenkin rajoittumatta, prokaryoottinen β-laktamaasipromoottori (Villa-Kamaroff, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75 (1978) 3727-3731) ja tac-promoottori (DeBoer, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80 (1983) 21-25). Muita viitteitä on saatavilla 15 julkaisussa "Useful proteins from recombinant bacteria" julkaisussa Scientific American, 242 (1980) 74-94.

Yhden sovellutusmuodon mukaisesti B. subtilis transformoidaan mutatoidun DNA:n sisältävällä ilmentämisvektorilla. Jos ilmentymisen on tapahduttava erittävässä mikro-organismissa, kuten B. subtiliksessa, translaation aloitussignaalin jälkeen voi seu-20 rata signaalijakso ja tämä on mielenkiinnon kohteena olevan DNA-jakson edellä. Signaalijakso toimii ilmentämistuotteen kuljettamiseksi soluseinään, jossa se pilko-\ . taan tuotteesta erityksen tapahtuessa. Edellä kuvatulla tavalla määriteltyyn termiin ’; ’ "ohjaavat jaksot" on tarkoitus kuulua signaalijakso silloin kun tämä esiintyy.

r : Esimerkit 25 Kohdemutaatioiden valmistamisesta subtilisiinigeeniin muodostuu käyttökelpoisia ' ' ‘ kemiallisia ominaisuuksia sisältäviä mutantteja.

Materiaalit ja menetelmät

Bakteerikannat . B. subtilis 309 ja 147 ovat Bacillus lentuksen variantteja, jotka on talletettu talletus- 30 laitokseen NCIB ja joille on annettu hakunumerot NCIB 10147 ja NCIB 10309 ja • ; · nämä on kuvattu US-patenttijulkaisussa n:o 3 723 250, joka on julkaistu 27.3.1973 : ja joka on liitetty tähän patenttihakemusjulkaisuun tähän oikeuttavien säädösten no jalla.

112500 35 B. subtilis DN 497 on kuvattu US-patenttihakemusjulkaisussa sarjamo 039 298, joka on jätetty 17.4.1987 ja joka vastaa EP-patenttihakemusjulkaisua n:o 242 220, joka myös on liitetty tähän patenttihakemusjulkaisuun siihen oikeuttavien säädösten nojalla ja tämä on RUB 200:n aro+ -transformantti, jonka kromosomaalinen DNA 5 on peräisin SL 438:sta, joka on sporulaatioon kykenemätön ja proteaaseja vailla oleva kanta ja joka on saatu tri Kim Hardylta Biogen-yhtiöstä.

E. coli MC 1 000 rm+ (Casadaban, M.J. ja Cohen, S.N., J. Mol. Biol. 138 (1980) 179-207) tehtiin rm+:ksi tavanomaisin menetelmin ja se on myös kuvattu US-patenttihakemusjulkaisussa sarjanumero 039 298.

10 B. subtilis DB105 on kuvattu julkaisussa Kawamura, F. ja Doi, R.H. (1984), "Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient in extracellular alkaline and neutral proteases" J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444.

Plasmidit pSX50 (kuvattu US-patenttihakemusjulkaisussa sarjanumero 039 298 ja tämä on lii-15 tetty tähän patenttihakemusjulkaisuun siihen oikeuttavien säädösten nojalla) on plasmidin pDN 1050 johdannainen ja se käsittää promoottori-operaattorin P]Oi, B. pumiluksen xyn B -geenin ja B. subtiliksen xyl R -geenin.

pSX62 (kuvattu US-patenttihakemusjulkaisussa sarjanumero 039 298, katso edellä) ·’ ' on pSX52:n johdannainen, joka käsittää fuusiogeenin, joka on muodostettu vasikan * . : 20 prokymosiinigeenistä ja B. pumiluksen xyn B-geenistä ja joka on sijoitettu pSX50:aan (katso yllä). pSX62 muodostettiin liittämällä E. colin rm B -terminaat-tori pSX52:een prokymosiinigeenin jälkeen.

pSX65 (kuvattu US-patenttihakemusjulkaisussa sarjanumero 039 298, katso edellä) on plasmidin pDN 1050 johdannainen, joka käsittää promoottori-operaattorin P2O2, 25 B. pumiluksen xyn B-geenin ja B. subtiliksen xyl R-geenin.

: pSX88 (kuvattu kansainvälisessä patenttihakemusjulkaisussa PCT/DK 88/0002 (NOVO INDUSTRI A/S) on pSX50:n johdannainen, joka käsittää subtilisiini 309 -geenin.

pSX92 muodostettiin kloonaamalla subtilisiini 309 plasmidiin pSX62 (katso edellä), j 30 joka oli pilkottu Cla I:n ja Hind III:n kohdalta ja Cla I-kohta täytetty ennen kloonatusta subtilisiini 309 -geenistä peräisin olevien Dral - Nhel ja Nhel - Hind III -fragmenttien liittämistä.

112500 36 pSX93, joka on esitetty kuvassa 3, on pUC13 (Vieira ja Messing, Gene 19 (1982) 259-268), joka käsittää subtilisiini 309 -geenin 0,7 kein suuruisen Xbal - Hind III -fragmentin, mukaan lukien polylinker-jaksoon liitetyn terminaattorin.

pSXl 19 (kuvattu kansainvälisessä patenttihakemusjulkaisussa n:o PCT/DK 88/0002 5 (NOVO INDUSTRI A/S) on pUC13, jossa on polylinker-jaksoon liitetty subtilisiini 309 -geenin EcoRI - Xbal -fragmentti.

pSX120 on plasmidi, jossa pSX88:sta peräisin oleva subtilisiini 309 -geenin sisältävä Hpal - Hindlll -fragmentti on liitetty pDN 1681 :ssa olevaan EcoRV - Hindlll -fragmenttiin siten, että proteaasigeeni ilmentyy amy M- ja amy Q-promoottorien 10 avulla. pDN1681 on saatu pDN1380:sta (Diderichsen B. ja Christiansen, L. FEMS Microbiology Letters 56 (1988) 53-60) siten, että siinä on tähän liitetty B. amyloli-quefaciensista peräisin oleva 2,85 ep:n suuruinen Clal-fragmentti, joka sisältää amy Q-geenin promoottoreineen (Takkinen et ai., J. Biol. Chem. 258 (1983) 1007ff.) pUC13 on kuvattu julkaisussa Vieira, J. ja Messing, J. Gene 19 (1982) 259-268.

15 pUC19 on kuvattu julkaisussa Yanisch-Perron, C. ja Vieira, J. Messing, J., Gene 33 (1985) 103-119.

pUBllO on kuvattu Lacey, R.W., Chopra, J., "Genetic studies of a multiresistant strain of Staphylococcus aureus", J. Med. Microbiol. 7 (1974) 285-297, ja jul-• ' ·* kaisussa Zyprian, E., Matzura, H. "Characterization of signals promoting gene ex- 20 pression on the Staphylococcus aureus plasmid pUBllO and development of a ; “ ‘: Gram-positive expression vector system" DNA 5 (1986) 219-225.

;;;' Geenit :Useita eri subtilisiineja vastaavat geenit saatiin edellä mainittujen kirjallisuusviitteiden mukaisesti. Erityisesti subtilisiini 309- ja 147 -entsyymejä vastaavat geenit saa-25 tiin kansainvälisessä patenttihakemusjulkaisussa n:o PCT/DK 88/00002 (NOVO ·· INDUSTRI A/S) kuvatulla tavalla, joka liitetään tähän patenttihakemusjulkaisuun ' > ’ kokonaisuudessaan siihen oikeuttavien säädösten nojalla.

Subtilisiini Carlsberg -geenin konstruktio : Suunniteltiin kypsän subtilisiini Carlsberg -proteaasin koodaavaan jaksoon perustu- :' ·,. 30 va synteettinen geeni ja sen transkription terminaattori (Jacobs, M. Eliasson, M.,

Uhlen, M., Flock, J.-I. Cloning, sequencing and expression of subtilisin Carlsberg from Bacillus licheniformis Nucleic Acids Res. 13 (24) (1985), 8913-8926), liitet- 112500 37 tiin subtilisiini BPN' -proteaasin (Wells, J.A., Ferrari, E., Henner, D.J., Esteli, D.A., Chen, E.Y. Cloning, sequencing and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtili-sin in Bacillus subtilis, Nuclei Acids Res. 11 (22) (1983) 7911-7925) koodaaviin pre- ja pro-jaksoihin. Geeni jaettiin seitsemään fragmenttiin, joiden pituudet olivat 5 alueella 127-313 emäsparia, siten että kukin fragmentti oli rakentunut kemiallisesti syntetisoiduista oligonukleotideista, joiden pituudet olivat 16-77 nukleotidia. Kahden nauhan oligonukleotidin välinen limittäisyys optimoitiin kunkin fragmentin yhdessä vaiheessa pituussuunnassa tapahtuvan liittämisen helpottamiseksi (Mullen-bach, G.T., Tabrizi, A., Blacher, R.W., Steimer, K.S. Chemical synthesis and ex-10 pression in Yeast of a gene encoding connective tissue activating peptide-III, J. Biol. Chem. 261 (2) (1986), 719-722). Kukin fragmentti koottiin ja kloonattiin E. coli -kloonaus- ja sekvensointivektorissa. Näiden kloonattujen fragmenttien sekvenssien analyysi suoritettiin kunkin fragmentin sekvenssin oikeellisuuden varmistamiseksi. Tämän jälkeen kaikki fragmentit koottiin yhteen ja kloonattiin vektoriin 15 pUBllO (Lacey, R.W., Chopra, J. Genetic studies of a multiresistant strain of Staphylococcus aureus, J. Med. Microbiol. 7 (1974) 285-297) ja tuotiin B. subtilis DB105:een (Kawamura, F., Doi, R.H. Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient in extracellular alkaline and neutral proteases, J.Bacteriol. 160 (2) (1984) 442-444). Geenin transkriptio aloitettiin pUBllO plasmidivektorin Hpall-20 promoottorilla (Zyprian, E., Matzura, H. Characterization of signals promoting gene expression on the Staphylococcus aureus plasmid pUBllO and development of a j v Gram-positive expression vector system, DNA 5(3) (1986) 219-225). Geenikon- struktion suorittamisen aikana osoittautui, että pisin fragmentti (#5; 313 emäsparin mittainen) oli tarpeen fragmentoida edelleen (#8 ja #9), jotta olisi vältetty tämän . “ . 25 suhteellisen pitkän fragmentin kokoamisongelmat.

v * Nukleotidijaksosta päätelty aminohappojakso poikkeaa aiemmin subtilisiini Carls- ν’ · bergille julkaistusta jaksosta asemissa 129, 157, 161 ja 212 (Smith, E.L., DeLange, R.J., Evans, W.H., Landon, W., Markland, F.S., Subtilisin Carlsberg V. The conple-v : te sequence: comparison with subtilisin BPN I; evolutionary relationships, J. Biol.

30 Chem. 243 (9) (1968) 2184-2191). Viidettä muutosta, jonka Jacobs et ai. (1985) ovat raportoineet, ei voitu vahvistaa tässä kuvatussa Carlsberg-geenin kloonissa

Isoelektrisen pisteen (pl0) laskeminen : : Seuraavassa esitetään esimerkki villityypin subtilisiini 309 -entsyymin (S000) iso- :. I elektrisen pisteen laskemisesta käytetyn laskentatavan demonstroimiseksi. Sama las- 35 kentatapa on tietenkin sovellettavissa mistä tahansa entsyymistä suoritettaviin laskutoimituksiin riippumatta siitä, onko tämä mutanttientsyymi vai ei.

112500 38

Kullekin mahdollisesti varaukselliselle aminohapporyhmälle annettiin pK-arvot (Tyr, Asp, Glu, Cys, Arg, His, Lys, N-terminaalinen ryhmä, C-terminaalinen ryhmä, Ca2+). Tässä tapauksessa otettiin huomioon ympäristö, jossa samaa aminohappo-ryhmää kohti käytetään erilaisia pK-arvoja riippuen tämän viereisistä ryhmistä. An-5 netut arvot on esitetty taulukossa II.

Tämän jälkeen laskettiin se suhde, jossa aminohapporyhmä esiintyy tietyssä pH.ssa varauksellisessa tai varauksettomassa muodossa (varauksellinen/varaukseton, C/U(i)) sekä negatiivisen että positiivisen varauksen osalta käyttäen kaavoja Ia ja Ib, tässä järjestyksessä mainittuna. Tämä suhde on ilmoitettu taulukossa II pH-arvon 10 osalta, j oka vastaa pl0: aa.

Tämän jälkeen laskettiin suhteellinen varaus Qr(i) eli varauskontribuutio, joka annettiin kullekin varaukselliselle ryhmälle käyttäen kaavoja Haja Hb: pH-arvo, jossa kaikkien varauksen muodostavien ryhmien summa on 0, haettiin iteroimalla.

15 Taulukko II Isoelektrisen pisteen laskeminen S000 subtilisiini 309:lle

Ryhmien Qr(i) Qr(i) Qr(i)

Ryhmä pK lukumäärä C/U(i)* pH 8,3 pH 10,0 pH = plo

Tyr 9,9 3 2,51E-02 -0,07 -1,67 -1,77 : Tyr 11,6 2 5,01E-04 0,00 -0,05 -0,06

Tyr 12,5 2 6,31E-05 0,00 -0,01 -0,01 ; Asp 3,5 5 6,31E+04 -5,00 -5,00 -5,00

Glu 4 5 2,00E+04 -5,00 -5,00 -5,00 C-term. 3 1 2,00E+05 -1,00 -1,00 -1,00 .V. (Arg)

Cys 9,3 0 1,00E-01 0,00 0,00 0,00

Arg 12,8 8 3,16E+04 8,00 7,99 7,99 : His 6,4 7 l,26E-02 0,09 0,00 0,00 : Lys 10 5 5,01E+01 4,90 2,50 2,34

Kalsium 20 1,25 5,01E+11 2,50 2,50 2,50 . N-term. 8 1 5,01E-01 0,33 0,01 0,01 . (Ala) : : Netto- 4,75 0,27 0,0 ; varaus 112500 39

Laskettu isoelektrinen piste on 10,06 * E-02 = 10'2

Kuten edellä ja taulukossa II on kuvattu, kullekin aminohapolle annetut pK-arvot erosivat toisistaan ympäristön paikallisten vaihteluiden huomioonottamisen seurauk-5 sena. Ainoa tulos tästä on se, että laskennassa päästään parempaan tarkkuuteen, vaikka kokemus on osoittanut, että vakioisiksi arvioitujen pK-arvojen avulla kyetään löytämään se suunta, mihin tietyn mutanttientsyymin pl0 siirtyy lähtömuotoa olevan entsyymin pl0:aan verrattuna. Tämä on esitetty taulukossa III, jossa on esitetty arvioituja pK-arvoja vastaavat pl0-arvot.

10 Jotta oltaisiin voitu verrata eri entsyymejä ja mutanttientsyymejä, suoritettiin jäljempänä yksityiskohtaisesti kuvattuja pesukokeita. Taulukossa III esitetään taulukon muodossa tulokset näistä testeistä, joissa käytettiin lähtömuotoista entsyymiä ja mu-tanttientsyymejä subtilisiinista 309 (jolle on annettu nimitys S000 jne.) ja subtilisiini Carlsbergistä (jolle on annettu nimitys C000 jne.), jotta oltaisiin voitu demonstroida 15 pl0:n ja käytetyn pesuliuoksen eri pH-arvoissa havaittavan pesutehokkuuden välinen korrelaatio. Pesutesteissä käytettiin pienen suolapitoisuuden sisältävää nestemäistä detergenttiformulaatiota, jonka pH oli 8,3 ja joka oli detergenttiesimerkin D7 mukainen, ja normaalin suolapitoisuuden sisältävää detergenttijauhetta, jonka pH oli 10,2 ja joka oli detergenttiesimerkin D2 mukainen.

: 20 Taulukossa III esitetyt tulokset on esitetty suhteellisina tuloksina villityypin entsyy- : ’ · meihin (S000 ja C000, tässä järjestyksessä mainittuna) verrattuna. Entsyymien las- ; ‘. ketut ja havaitut pl0-arvot myös esitetty.

112500 40

Taulukko III

Vertailevat pesututkimukset eri pH-arvoissa

Mutantti pl0 Parantumistekijä

laskettu havaittu Detergentin pH

8,3 10,2 5000 10,02 9,7 1 1 5001 9,86 9,4 2,2 1 5003 9,86 9,4 2,0 1 5004 9,68 9,1 3,9 1 5005 9,71 9,1 1,5 1 S012 9,09 8,8 5,0 0,6 5019 9,09 8,5 5,8 0,6 5020 6,71 7,9 8,8 0,5 5021 9,85 - 1,8 0,7 5022 8,07 - 9,0 0,3 5023 8,05 - 9,8 0,2 5024 6,86 - 9,0 0,2 5025 8,94 - 6,9 0,6 5027 10,28 - 0,4 1,0 5028 10,28 - 0,9 1,0 S031 10,53 - 0,4 0,7 : ·'·: S032 10,28 - 0,7 S033 10,28 - 0,4 V': S035 8,07 - 8,0 0,6 :V: S201 9,85 - 2,0 0,7 5202 9,62 - 4,3 0,9 5203 9,27 - 9,0 0,5 C000 8,87 - 1 1 C001 9,38 - 0,2 1,5 C002 9,38 - 0,8 1,9 C003 9,38 - 0,4 1,1 C004 9,64 - 0,2 1,8 : C008 9,38 - 0,2 1,5 112500 41

Taulukosta III havaitaan, että pl0:n siirtäminen matalampien arvojen suuntaan (S-sarja) saa aikaan pesutehokkuuden paranemisen matalassa pH:ssa (pH = 8,3), kun taas pl0:n siirtäminen ylöspäin (C-sarja), saa aikaan pesutehokkuuden parantumisen korkeassa pH:ssa (pH = 10,2).

5 Isoelektrisen pisteen käsitteen on siten havaittu olevan hyvin käyttökelpoinen valittaessa niiden aminohappojen asemia, jotka lähtömuotoisessa entsyymissä tulisi muuttaa.

On usein havaittu, että mutaatioiden aiheuttaminen tulisi suorittaa niissä kodoneissa, jotka vastaavat entsyymimolekyylin pinnalla tai sen lähellä olevia aminohappoja, 10 jotta lähtömuotoisen entsyymin sisärakenne säilyisi ennallaan mahdollisimman hyvin.

Subtilisiinien puhdistus

Suoritusvaiheet liittyvät subtilisiini 147 -entsyymin, subtilisiini 309 -entsyymin tai näiden mutanttien tyypilliseen puhdistukseen 10 litran mittakaavassa suoritetusta 15 fermentaatiosta.

Noin 8 litraa fermentointiliuosta sentrifugoitiin 1 litran astioissa 5000 kierroksen minuuttinopeudella 35 min ajan. Supematanttien pH säädettiin arvoon 6,5 käyttäen 10-prosenttista etikkahappoa ja suodatettiin Seitz Supra S100 -levysuodattimilla.

• : Suodokset väkevöitiin noin 400 ml:ksi käyttäen Amicon CH2A UF -yksikköä, joka . , 20 oli varustettu Amicon SI Y10 UF -kasetilla. UF-konsentraatti sentrifugoitiin ja suo- , , datettiin ennen sen adsorptiota huoneenlämmössä basitrasiiniaffiniteettipylvääseen pH:ssa 7. Proteaasi eluoitiin basitrasiinipylväästä huoneenlämmössä käyttäen 25-prosenttista 2-propanolia ja 1 M natriumkloridia, jotka oli valmistettu puskuriliuokseen käyttäen 0,01 dimetyyliglutaarihappoa, 0,1 M boorihappoa ja 0,002 M kalsium-25 kloridia ja säädetty pH-arvoon 7.

: Basitrasiinipuhdistusvaiheesta saadut proteaasiaktiivisuutta omaavat fraktiot yhdis tettiin ja ne lisättiin 750 ml:n suuruiseen Sephadex G25 -pylvääseen (läpimitta 5 cm), joka oli tasapainotettu puskuriliuoksella, joka sisälsi 0,01 dimetyyliglutaarihappoa, 0,2 M boorihappoa ja 0,002 M kalsiumkloridia ja jonka pH oli säädetty ar-30 voon 6,5.

Sephadex G25 -pylväästä saadut proteolyyttistä aktiivisuutta omaavat fraktiot yhdistettiin ja ne vietiin 150 ml:n suuruiseen CM Sepharose CL 6B -kationinvaihtopyl- 112500 42 vääseen (läpimitta 5 cm), joka oli tasapainotettu puskurilla, joka sisälsi 0,01 M di-metyyliglutaarihappoa, 0,2 M boorihappoa ja 0,002 M kalsiumkloridia ja jonka pH oli säädetty arvoon 6,5.

Proteaasi eluoitiin käyttäen lineaarista 0-0,1 M natriumkloridigradienttia, joka oli 5 valmistettu kahteen litraan samaa puskuria (0-0,2 M natriumkloridi sub 147:n tapauksessa).

Viimeisessä puhdistusvaiheessa CM Sepharose -pylväästä saadut proteaasia sisältävät fraktiot yhdistettiin ja väkevöitiin Amicon-ultrasuodatuskammiossa, joka oli varustettu GR81PP-kalvolla (saatu yhtiöstä Danish Sugar Factories Inc.).

10 Subtilisiini 309 ja tämän mutantit

Gly 195 Glu (G195E (S001)):

Arg 170 Tyr (R170Y (S003)):

Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu (R170Y+G195E (S004)):

Lys 251 Glu (K251E (S005)): 15 His 120 Asp (H 120D (S006)):

Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu + Lys 251 Glu (R170Y+G195E+K251E (SO 12)):

Lys 235 Leu (K235L (SOI5)): v. His 120 Asp + Gly 195 Glu + Lys 235 Leu ! 20 (H120D+G195E+K235L (S017)):

His 120 Asp + Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu + Lys 235 Leu 1 (H120D+R170Y+G195E+K235L (S019)):

His 120 Asp + Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu + Lys 235 Leu + Lys 251 Glu : (H 120D+R170 Y+G195E+K23 5L+K251E (S020): 25 puhdistettiin tällä menetelmällä.

(Mutatoitujen) subtilisiini Carlsberg -proteaasien puhdistus

Fermentaatioliuokset vietiin joko suoraan basitrasiini-affmiteettipylvääseen (läpi-. mitta 5 cm * 15 cm; tasapainotettu 10 mM Tris/HCl-puskurilla, pH 7,9; virtausno peus noin 500 ml/h) tai väkevöitiin 500 ml:ksi käyttäen Nephross Andante H.F. dia-30 lyysilaitetta (Organon Techika) käyttäen 69-83 kPa:n suuruista vastapainetta ja käyt-: täen ulkopiirissä demineralisoitua vettä. Jälkimmäisessä tapauksessa proteaasi saos- • tui väkevöidystä liuoksesta, kun siihen lisättiin ammoniumsulfaattia 600 g/1. Saos tuma koottiin talteen sentrifugoimalla ja liuotettiin uudelleen n. 500 ml:aan demineralisoitua vettä. Ammoniumsulfaatti poistettiin proteaasiliuoksesta käyttäen 112500 43 samaa dialyysilaitetta, joka oli kuvattu edellä. Lopullinen tilavuus oli noin 300 ml ja liuoksen pH oli säädetty arvoon 6,0. Proteaasi eluoitiin (edellä mainitusta) basitra-siinipylväästä käyttäen 10 mM Tris-puskuria (pH 7,9), joka sisälsi 2,7 M NaCkää ja 18 % isopropanolia.

5 Basitrasiinilla puhdistetun tai väkevöidyn proteaasimateriaalin dialyysin jälkeen suoritettiin puhdistus vielä viemällä materiaali CM-trisakryyli-ioninvaihtopylvää-seen (läpimitta 5 cm * 15 cm; joka oli tasapainotettu 0,03 M natriumfosfaatilla, pH 6,0) käyttäen virtausnopeutena 200 ml/h. Proteaasi eluoitiin pylväästä fosfaattipuskuriin valmistetulla lineaarisella 0-0,3 M NaCl-gradientilla (2 x 500 ml). Prote-10 aasiaktiivisuutta sisältävät fraktiot koottiin yhteen ja varastoitiin kylmäkuivauksen jälkeen -20 °C:ssa puskurisuolojen läsnäollessa.

Oligonukleotidisynteesi

Kaikki yhteensopimattomia kohtia sisältävät alukkeet syntetisoitiin Applied Biosys-tems 380 A DNA -syntetisointilaitteella ja puhdistettiin polyakryyliamidigeelielekt-15 roforeesilla (PAGE).

Proteolyyttisen aktiivisuuden määritys

Mutatoitujen entsyymien proteolyyttinen aktiivisuus määritettiin sen määrittämiseksi, missä määrin entsyymin katalyyttinen aktiivisuus oli säilynyt. Määritykset suori-: tettiin käyttäen dimetyylikaseiini (DMC) -menetelmää, joka on kuvattu NOVO:n : 20 julkaisussa AF 220-gb (tai myöhemmissä painoksissa), joka on saatavilla yhtiöstä

Novo-Nordisk a/s, Bagsvasrd, Tanska, ja joka julkaisu on liitetty tähän patent-! tihakemusjulkaisuun siihen oikeuttavien säädösten nojalla.

Pesutehokkuuden määritys A: 25 Tutkittavat kankaat (2,2 cm x 2,2 cm (noin 0,1 g)) esikäsiteltiin käyttämällä liisteri-poistettua puuvillakangasta (100-prosenttinen puuvilla DS 71) oleva kangasmateri-aali TH-tyyppisen Mathis Washing and Drying Unit -laitteen (Werner Mathis AG, Zurich, Sveitsi) astiassa, joka sisälsi ruohosta valmistettua nestettä.

Kangaskappaleet kuivattiin voimakkaassa ilmavirrassa huoneenlämmössä ja varas-30 toitiin huoneenlämmössä kolme viikkoa ja ne säilytettiin tämän jälkeen -18 °C:ssa ennen käyttöä.

112500 44

Kaikki testaukset suoritettiin pienimittakaavaisessa pesusysteemimallilaitteessa. Tässä systeemissä pestään kuusi tutkittavaa kangaskappaletta 150 ml:n dekantterila-sissa, joka sisältää 60 ml detergenttiliuosta. Dekantterilasit säilytetään termostaatti-sella vesihauteella 37 °C:ssa sekoittaen niitä magneettisekoittajalla. Detergenttinä 5 käytetään seuraavaa nestemäistä standardidetergenttiliuosta: AE, Berol 160 15% LAS, Nasa 1169/P 10% kookosrasvahappo 9 % öljyhappo 1 % 10 trietanoliamiini 9 % glyseroli 10,5 % etanoli 1,5% tri-Na-sitraatti. 2 H20 8 %

CaCl2. H20 0,1 % 15 NaOH 1 % vesi LAS:stä 23,3 % vesi glyserolista 1,5% lisätty vesi 34,9 %

Annetut prosenttiosuudet ovat aktiivisen aineen prosenttiosuuksia.

20 pH säädettiin 1 N NaOHdla arvoon 8,14. Käytetty vesi oli kovuudeltaan noin 6° dH , · (saksalaisen kovuusluokituksen mukaisesti).

Testaukset suoritettiin entsyymipitoisuuksissa, joissa käytettiin pitoisuuksia 0, 1,0 mg entsyymiproteiinia/1 ja 10,0 mg entsyymiproteiinia/1 ja suoritettiin kaksi toisistaan riippumatonta koesaqaa kunkin mutantin osalta. Seuraavassa esitetyt tulok-: : 25 set ovat keskiarvoja näistä kokeista.

; _ Pesut suoritettiin 60 min ajan ja pesun jälkeen kangaspalat huuhdeltiin lävikössä ; juoksevassa vesijohtovedessä 25 minuuttia.

. Vaatekappaleet kuivattiin tämän jälkeen yön yli (suojattuna päivänvalolta) ja remis sio, R, määritettiin ELREPHO 2000 -fotometrillä, joka oli hankittu yhtiöstä Dataco-30 lor S.A. Dietkikon, Sveitsi 460 nm:ssa).

; Pesutehon mittana käytettiin differentiaalista remissiota, delta R, siten, että se vasta si entsyymin läsnäollessa suoritetusta pesusta saatua remissiota, josta oli vähennetty sellaisesta pesusta saatu remissio, jossa ei käytetty entsyymiä.

112500 45 B:

Useiden eri mutanttien pesutehokkuus tutkittiin ruohonesteellä liattuja puuvillakan-gaskappaleita vastaan edellä kuvatun menetelmän mukaisesti.

Käytettiin 2,0 g USA:ssa kaupan olevaa nestemäistä detergenttiä.

5 Detergentti liuotettiin 0,005 M etanoliamiinipuskuriin ioninvaihtimessa käsiteltyyn veteen. pH säädettiin arvoihin 8,0, 9,0, 10,0 ja 11,0, tässä järjestyksessä, käyttäen NaOH/HCl:ää.

Lämpötila pidettiin tasaisena 37 °C:ssa.

Kutakin mutanttia annosteltiin 0,25 mg entsyymiproteiinia/litra.

10 C:

Pesukokeet, joissa käytettiin jäljempänä mainituissa detergenttiesimerkeissä olevia esimerkkikoostumuksia, suoritettiin pienoispesulaitteessa, jossa käytettiin testaus-kangaskappaleita, jotka sisäsivät väriaineita, rasvaa ja proteiineja (kaseiinia). Olosuhteet olivat 15 a) 2 g/1 detergenttiä D3 vedessä, jonka kovuus oli 6° fH (ranskalainen kovuus) pH-arvossa 8,3 tai : b) 5 g/1 detergenttiä D2 vedessä, jonka kovuus oli 15° fH ja pH-arvo oli 10,2.

Kun näytteet oli huuhdottu ja kuivattu, mitattiin heijastuma 460 nm:ssa.

; ; Parantumistekijä laskettiin annos-vaste-käyrästä ja siitä käy ilmi se entsyymimäärä, ... 20 joka tarvitaan tietyn delta R -arvon saamiseksi verrattuna kyseiseen villityyppiseen entsyymiin (S000 ja C000), joka tarkoittaa sitä, että kahdenarvoinen parantumisteki-: jä viittaa vain puoleen entsyymimäärästä, joka tarvitaan saman delta R-arvon saami- seksi.

Näiden tutkimusten tulokset on esitetty taulukossa III.

25 D:

Lipaasin pysyvyyden kokeelliset tutkimukset suoritettiin esimerkiksi käyttäen seu-raavia materiaaleja: 112500 46 1 LU/ml Pseudomona cepacia -lipaasia inkuboitiin kummassakin kahden tyyppisessä, O- ja W-tyyppisessä, pesunesteessä. Näytteitä otettiin aikavälein ja näistä testattiin lipaasiaktiivisuus. Suoritettiin rinnakkaisia inkubointeja ilman proteaasia tai pro-teaasin kanssa käyttämällä jäljempänä mainittuja eri tyyppejä sen tutkimiseksi, mikä 5 vaikutus proteaasilla on lipaasiaktiivisuuden säilymiseen. Villityyppiset proteaasit tutkittiin käyttäen niiden konsentraationa 20 GU/ml ja mutatoidut proteaasit tutkittiin käyttäen konsentraatiota 0,5 mg/ml.

Entsyymivariantteja käsittävät detergenttikoostumukset

Detergentti Dl: 10 Tämän keksinnön mukaisen sovellutusmuodon mukainen fosfaattitehoainetta sisältävä detergenttijauhe formuloidaan siten, että siinä on aktiivista detergenttiä yhteensä noin 16 %, anionista detergenttiä n. 9 %, ionitonta detergenttiä n. 6 %, fosfaatti-pitoista tehoainetta n. 20 %, akryyli- tai tätä vastaavaa polymeeriä n. 3,5 % (vaihtoehtoisesti vähemmän, mutta ei alle noin 2 %), perboraattivalkaisuaineen esimuotoa 15 n. 6-18 %, vaihtoehtoisesti n. 15-20 %, aminoryhmän sisältävää valkaisuaineen ak-tivaattoria n. 2 %, silikaattia tai muuta rakenneainetta n. 3,5 %, jota voi vaihtoehtoisesti olla korkeintaan 8 %, entsyymiaktiivisuutta n. 8 glysiiniyksikköä/mg sekä alkalia pH:n säätämiseksi haluttuun käytössä saavutettavaksi asetettuun pH-arvoon ja neutraalia epäorgaanista suolaa ja entsyymejä (kutakin entsyymiä noin 0,5 %).

. 20 Anioninen detergentti on seos, jossa on 6 % natriumdodekyylibentseenisulfonaattia tai vaihtoehtoisesti natrium(lineaarinen alkyylibentseenijsulfonaattia ja 3 % primääristä alkyylisulfaattia. Ioniton detergentti on etoksylaattia, jossa on primääristä noin C13-C15-alkoholia ja moolia kohti 7 etoksylaattiryhmää. Fosfaattitehoaine on natriumtripolyfosfaattia. Polymeeri on polyakryylihappoa, vaihtoehtoisesti akryyli- : 25 happo/maleiinihappo-sekapolymeeria. Perboraattivalkaisuaineen esimuoto on natri- umtetraboraattitetrahydraattia tai -monohydraattia. Aktivaattori on tetra-asetyyli-etyleenidiamiinia. Rakenneaine on natriumsilikaattia. Neutraali epäorgaaninen suola ". on natriumsulfaattia.

: Entsyymit käsittävät mutantin S001 mukaisen proteaasin tai vaihtoehtoisesti prote- 30 aasin S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S015, S017, S021, S226, S223, S224 tai S225.

Detergentti Dia: 47 112500 Tämän keksinnön mukaisen sovellutusmuodon mukainen fosfaattitehoainetta sisältävä detergenttijauhe formuloidaan siten, että siinä on aktiivista detergenttiä yhteensä noin 15 %, anionista detergenttiä n. 7 %, ionitonta detergenttiä n. 6 %, fosfaattipi-5 toista tehoainetta n. 25 %, akryyli- tai tätä vastaavaa polymeeriä n. 0,5 % perboraat-tivalkaisuaineen esimuotoa n. 10 %, aminoryhmän sisältävää valkaisuaineen akti-vaattoria n. 2 %, silikaattia tai muuta rakenneainetta n. 6 %, entsyymitaso n. 8 gly-siiniyksikköä/mg sekä alkalia pH:n säätämiseksi haluttuun käytössä saavutettavaksi asetettuun pH-arvoon ja neutraalia epäorgaanista suolaa ja entsyymejä (kutakin ent-10 syymiä noin 0,5 %).

Anioninen detergentti on natrium(lineaarinen alkyylibentseenijsulfonaattia. Ioniton detergentti on etoksylaattia, jossa on primääristä noin C13-C15-alkoholia ja moolia kohti 7 etoksylaattiryhmää tai se on tämän ja sellaisen vastaavan alkoholin seos, joka on etoksyloitu sisältämään 3 etoksyyliryhmää moolia kohti. Fosfaattitehoaine on 15 natriumtripolyfosfaattia. Perboraatti- tai perhappovalkaisuaineen esimuoto on natri-umtetraboraattitetrahydraattia. Aktivaation on tetra-asetyylietyleenidiamiinia. Ra-kenneaine on natriumsilikaattia. Neutraali epäorgaaninen suola on natriumsulfaattia. Entsyymit käsittävät mutantin S001 mukaisen proteaasin tai vaihtoehtoisesti prote-aasin S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S015, S017, S021 20 ja S226.

Detergentti D2: ‘ · ‘ Tämän keksinnön mukaisen sovellutusmuodon mukainen zeoliittitehoainetta sisältä- .: vä detergenttijauhe formuloidaan siten, että siinä on aktiivista detergenttiä kaikkiaan v : noin 16%, anionista detergenttiä n. 9%, ionitonta detergenttiä n. 6%, zeoliittipi- v : 25 toista tehoainetta n. 20 %, akryyli- tai tätä vastaavaa polymeeriä n. 3,5 %, perboraat- tivalkaisuaineen esimuotoa n. 6-18 %, aminoryhmän sisältävää valkaisuaineen akti-,' vaattoria n. 2 %, silikaattia tai muuta rakenneainetta n. 3,5 %, jota voi vaihtoehtoi- . sesti olla vähemmän, mutta ei alle noin 2,5 %, entsyymitaso n. 8 (vaihtoehtoisesti noin 15) glysiiniyksikköä/mg sekä alkalia pH:n säätämiseksi haluttuun käytössä 30 saavutettavaksi asetettuun pH-arvoon ja neutraalia epäorgaanista suolaa ja entsyy-,: mejä (kutakin entsyymiä noin 0,5 %).

; Anioninen detergentti on seos, jossa on 6 % natriumdodekyylibentseenisulfonaattia : tai vaihtoehtoisesti natrium(lineaarinen alkyylibentseeni)sulfonaattia ja 3% pri määristä alkyylisulfaattia. Ioniton detergentti on etoksylaattia, jossa on primääristä 112500 48 noin C13-C15-alkoholia ja moolia kohti 7 etoksylaattiryhmää. Zeoliittitehoaine on A-tyypin zeoliittia. Polymeeri on polyakryylihappoa, Perboraattivalkaisuaineen esimuoto on natriumtetraboraattitetrahydraattia tai -monohydraattia. Aktivaattori on tetra-asetyylietyleenidiamiinia. Rakenneaine on natriumsilikaattia. Neutraali epäor-5 gaaninen suola on natriumsulfaattia. Entsyymit käsittävät mutantin S001 mukaisen proteaasin tai vaihtoehtoisesti proteaasin S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, SOI5, SO 17, S021 tai S226 mukaisen proteaasin.

Detergentti D2a: Tämän keksinnön mukaisen sovellutusmuodon mukainen zeoliittitehoainetta sisältä-10 vä detergenttijauhe formuloidaan siten, että siinä on aktiivista detergenttiä kaikkiaan noin 14 %, anionista detergenttiä n. 7 %, ionitonta detergenttiä n. 7 %, zeoliittipi-toista tehoainetta n. 25 %, akryyli- tai tätä vastaavaa polymeeriä n. 3 %, perboraatti-tai perhappovalkaisuaineen esimuotoa n. 10%, aminoryhmän sisältävää valkaisuaineen aktivaationa n. 2 %, silikaattia tai muuta rakenneainetta n. 0,5 %, entsyymitaso 15 n. 6 glysiiniyksikköä/mg sekä alkalia pH:n säätämiseksi haluttuun käytössä saavutettavaksi asetettuun pH-arvoon ja neutraalia epäorgaanista suolaa ja entsyymejä (kutakin entsyymiä noin 0,5 %).

Anioninen detergentti on natrium(lineaarinen alkyyl ibcntseeni)sulfonaattia ja 3 % primääristä alkyylisulfaattia. Ioniton detergentti on kahden primäärisestä noin Cl 3-20 Cl5-alkoholista muodostuvan etoksylaatin seos, joissa yksi mooli toista detergenttiä ' ’, · sisältää 7 ja yksi mooli toista detergenttiä sisältää 3 etoksylaattiryhmää. Zeoliittite- hoaine on A-tyypin zeoliittia. Polymeeri on akryylihappo/maleiinihapposekapoly-meeriä. Perboraattivalkaisuaineen esimuoto on natriumtetraboraattimonohydraattia. f Aktivaattori on tetra-asetyylietyleenidiamiinia. Rakenneaine on natriumsilikaattia.

25 Neutraali epäorgaaninen suola on natriumsulfaattia. Entsyymit käsittävät mutantin S001 mukaisen proteaasin tai vaihtoehtoisesti proteaasin S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, SOI 5, S017, S021 tai S226 mukaisen proteaasin.

*

Detergentti D3: : Tämän keksinnön mukainen vesipitoinen nestemäinen detergentti on formuloitu si- : ; 30 ten, että se sisältää 16 % dodekyylibentseenisulfonihappoa, 7% lineaarista C12- C15-alkoholia, joka on kondensoitu 7 moolilla etyleenioksidia yhtä alkoholimoolia kohti, 2 % monoetanoliamiinia, 6,5 % sitruunahappoa 6 % natriumksyleenisulfo-naattia, noin 4,1 % natriumhydroksidia, 0,5 % proteaasia, vähäisiä määrinä lisätyt lisäaineet ja vettä, joilla koostumus täytetään 100-prosenttiseksi. pH säädetään välillä 112500 49 9 ja 10 olevaan arvoon. Entsyymi on mutantin S020 mukainen proteaasi tai vaihtoehtoisesti proteaasin S019, S012, S004, S001, S 003, S005, S015, S017, S021, S022, S025, S035, S201, S223, S224, S225 S226 tai S 235 mukaisen proteaasin.

Detergentti D4: 5 Tämän keksinnön yhden sovellutusmuodon mukainen vedetön nestemäinen detergentti on formuloitu käyttäen 38,5 % lineaarista primääristä C13-C15-alkoholia, joka on alkoksyloitu 4,9 moolilla etyleenioksidia ja 2,7 moolilla propyleenioksidia moolia kohti, 5 % triasetiinia, 30 % natriumtrifosfaattia, 4 % kalsinoitua soodaa, 15,5 % natriumperboraattimonohydraattia, joka sisältää pienen määrän oksoboraat-10 tia, 4 % TAEDia, 0,25 % EDTAa, josta 0,1 % on fosfonihappona, 0,6 % Aerosifia, 1 % SCMC:tä ja 0,6 % proteaasia. pH on säädetty arvojen 9 ja 10 välillä olevaan arvoon, esim. arvoon, joka on noin 9,8. Entsyymit käsittävät mutantin S001 mukaisen proteaasin tai vaihtoehtoisesti proteaasin S003 tai S004, S021, S035, S201, S225, S226 tai S235.

15 Detergentti D5: Tämän keksinnön yhden sovellutusmuodon mukainen jauhemainen detergentti on formuloitu rakeiseen muotoon, jonka irtotiheys on ainakin 600 g/1, ja se sisältää noin 20paino-% pinta-aktiivista ainetta, josta noin 10 % on natriumdodekyylibentseeni-: sulfonaattia ja loppuosa Synperonic A7:n ja Synperonic A3:n (noin 5,5 % - 4,5 %) ’ “. 20 seosta, ja nollatasolla neutraalia epäorgaanista suolaa (esimerkiksi natriumsulfaat- tia), sekä noin 33 % fosfaattitehoainetta, noin 16 % natriumtetraperboraattitetrahyd-raattia, noin 4,5 % TAED-aktivaattoria, noin 6 % natriumsilikaattia ja noin 2 % pieniä määriä lisäaineita, mukaan lukien natriumkarbonaatti, ja kosteuspitoisuus noin 10 %. Seokseen on lisätty entsyymejä (kutakin noin 0,5 %). Entsyymi käsittää mu- : 25 tantin S001 mukaisen proteaasin tai vaihtoehtoisesti proteaasin S003 tai S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S223, S224, S225, S226 tai S235 mukaisen ; proteaasin.

Detergentti D6: Tämän keksinnön yhden sovellutusmuodon mukainen jauhemainen detergentti on 30 formuloitu rakeiseen muotoon, jonka irtotiheys on ainakin 600 g/1 tai vaihtoehtoises-: ti noin 550 g/1 ja se sisältää noin 20 paino-% tai vaihtoehtoisesti vähemmän, mutta : ei alle 16 paino-% pinta-aktiivista ainetta, josta noin 9 % tai vaihtoehtoisesti noin 7 % on natriumdodekyylibentseenisulfonaattia tai vaihtoehtoisesti natrium(lineaari-nen alkyylibentseenijsulfonaattia ja loppuosa Synperonic A7:n ja Synperonic A3:n 112500 50 (tai vastaavan etoksylaatin) seosta (noin 5 % ja 6 %, vaihtoehtoisesti noin 4 % ja 7 %, tässä järjestyksessä mainittuna) ja nollatasolla neutraalia epäorgaanista suolaa (esimerkiksi natriumsulfaattia), sekä noin 30 % tai vaihtoehtoisesti noin 25 % zeo-liittitehoainetta, noin 14 % tai 15 % natriumtetraperboraattitetrahydraattia tai vaihto-5 ehtoisesti monohydraattia, noin 3,6 % TAED-aktivaattoria, ja pieniä määriä lisäaineita mukaan lukien noin 9 % tai korkeintaan 15 % natriumkarbonaattia, noin 0,7 % Dequest® 2047:ää ja kosteuspitoisuus noin 10 %. Seokseen on lisätty entsyymejä (kutakin noin 0,5 % tai noin 0,2 % lipaasia ja noin 0,7 % proteaasia). Entsyymi käsittää mutantin S001 mukaisen tai vaihtoehtoisesti mutantin S003, S004, S005, 10 C001, C002, C003, C004, C005, C008, S223, S224, S225, S226 tai S235 mukaisen proteaasin.

Detergentti D7:

Yhden tämän keksinnön mukaisen sovellutusmuodon mukainen detergenttijauhe-koostumus on formuloitu siten, että se sisältää 6 % dodekyylibentseenisulfonihap-15 poa, 5 % lineaarista C12-C15-alkoholia, joka on kondensoitu 7 moolilla etyleeni-oksidia alkoholimoolia kohti, 3 % rasvahapposaippuaa, 3 % Sokolano CP5 -polymeeriä, 22 % zeoliitti A:ta, 10 % natriumkarbonaattia, 17 % natriumsulfaattia, 8 % savihiukkasia, 13 % natriumperboraattitetrahydraattia, 2 % tetra-asetyylietyleeni-diamiinia, 0,5 % proteaasia, pieninä määrinä esiintyviä aineosia ja vettä, joilla koos-20 tumus täytetään 100 %:iin. pH säädetään arvojen 9 ja 10 välillä olevaan arvoon.

: ‘ Entsyymi käsittää proteaasimutantin S001 tai vaihtoehtoisesti S003, S004, S005, : M C001, C002, C003, C004, C005, C008, S223, S224, S225, S226 tai S235.

, , Detergentti D8: • Yhden tämän keksinnön mukaisen sovellutusmuodon mukainen detergentti(saip- , : 25 pua)tankokoostumus on formuloitu seuraavasti: saippua, jonka perustana on 82 % keittämällä saippuoitua talia ja 18 % kookosöljyä, joka on neutraloitu 0,15-prosentti-,' : sella ortofosforihapolla ja joka on sekoitettu seokseen, jonka koostumus on 2 % nat- : . riumformaattia, 2 % booraksia, 2 % propyleeniglykolia ja 1 % natriumsulfaattia, pu ristetaan näiden vaiheiden jälkeen saippuaksi saippuan tuotantolinjalla. Entsyymi 30 käsittää mutantin S001 tai vaihtoehtoisesti S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226 tai : : S235.

Detergentti D9: 51 112500

Nestemäiset koostetut detergentit voivat tämän patenttikuvauksen mukaisen prote-aasin lisäksi käsittää esimerkiksi 2-15 % ionitonta pinta-aktiivista ainetta siten, että pinta-aktiivisen aineen, joka käsittää ionittoman pinta-aktiivisen aineen ja vaihtoeh-5 toisesti käytettävän anionisen pinta-aktiivisen aineen, määrä on kaikkiaan 5-40 %, 5-35 % fosfaattipitoista tai fosfaattia sisältämätöntä tehoainetta 0,2-0,8 %, paksunnos-aineena käytettävää polymeeriä, esimerkiksi silloitettua akryylipolymeeria, jonka molekyylipaino on yli 106, ainakin 10% natriumsilikaattia, esimerkiksi neutraalina vesilasina, emästä (esimerkiksi kaliumpitoista emästä) seoksen pH:n säätämiseksi 10 haluttuun arvoon, joka on edullisesti alueella 9-10 tai tätä korkeammalla, esimerkiksi pH-arvon 11 ylittävä arvo, ja jossa natriumkationin ja silikaattianionin (vapaana piihappona) välinen painosuhde (painon perusteella) on alle 0,7 : 1, ja viskositeetti 0,3-30 Pa (20 °C:ssaja 20s-l).

Sopivat esimerkit sisältävät noin 5 % ionitonta pinta-aktiivista ainetta, joka on noin 15 5 EO-ryhmällä moolia kohti ja noin 2,7 PO-ryhmällä moolia kohti alkoksyloitu Cl 3- 15-alkoholi, 15-23 % neutraalia vesilasia, jossa piin ja natriumoksidin välinen painosuhde on 3,5, 13-19 % KOH:ta, 8-23 % STPP:tä, 0-11 % natriumkarbonaattia ja 0,5 % Carbopol®941 :tä.

Proteaasiin (esimerkiksi 0,5 %) kuuluu mutantti S001 tai vaihtoehtoisesti S021, : : 20 S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226 tai S235.

; Detergentti Dl0: i : Pyykinpesuun soveltuva sakea vesipitoinen nestemäinen detergentti on formuloitu : : : seuraa vien painoprosenttien mukaiseksi: ; ; *. sitruunahappo 2,5 25 booraksi (10 aq) 4

NaOH 2 glyseroli 5 lineaarinen C14-C15-alkyylibentseenisulfonaatti tai primäärinen Cl 4-C 15-alkoholisulfaatti 6,5 ; 30 Synperonic A3 - , ioniton C12-C15 3 EO 1,2 ! Synperonic A7 • ioniton Cl2-C15 7 EO 3,6 zeoliitti 20

11250C

52 proteaasi 0,5 amylaasi (Termamyl® 300LDX) 0,2 pieninä määrinä olevat aineosat ja vesi täytetään 100 %:ksi 5 pH voidaan säätää arvojen 9 ja 10 välillä olevaan arvoon. Entsyymi käsittää prote-aasimutantin S020 tai vaihtoehtoisesti S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S0351 S201, S223, S224, S225, S226 tai S235.

Detergentti Dll:

Pyykinpesuun soveltuva isotrooppinen vesipitoinen nestemäinen detergentti on for-10 muloitu painoprosentteina seuraavasti: sitruunahappo 2 boori happo 1

NaOH 3 KOH 4,5 15 glyseroli 10 etanoli 6,5 ioniton pinta-aktiivinen aine (C12-alkoholi, 6,5 EO-etoksylaattiryhmää/mol) tai natrium(primäärinen alkoholij-sulfaatti 10 20 öljyhappo 16 ,: kookosöljy (C12) -saippua 11 proteaasi 0,5 pieninä määrinä olevat aineosat : ja vesi täytetään 100 %:ksi 25 pH voidaan säätää arvojen 9 ja 10 välillä olevaan arvoon.

Entsyymi käsittää proteaasimutantin S020 tai vaihtoehtoisesti S019, S012, S004, : S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201, S223, S224, S225, S226 tai S235.

Detergentti Dl2: 53 112500

Vesipitoinen nestemäinen detergenttikoostumus on formuloitu siten, että sen koostumus on: natriumalkyylibentseenisulfonaatti 14,5 5 Cl 8-natriumsaippua 2 ioniton detergentti (C12-15, 6 EO) 9 rasvahappo (öljyhappo) 4,5 natriumalkenyylisukkinaatti 11 propaanidioli 1,5 10 etanoli 3,6 natriumsitraatti 3,2 kompleksoiva aine, esimerkiksi Dequest 2060 0,7 proteaasi 0,5 15 amylaasi 0,1 natriumkloridi 0,5 pieninä määrinä olevat aineosat ja vesi täytetään 100 %:ksi pH voidaan säätää arvojen 9 ja 10 välillä olevaan arvoon.

20 Entsyymi käsittää proteaasimutantin S020 tai vaihtoehtoisesti SOI9, S012, S004, : S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226 tai S235.

: Detergentti D13:

Vesipitoinen nestemäinen detergenttikoostumus on formuloitu siten, että sen koos-25 tumus on: . natriumalkyylibentseenisulfonaatti 8 ioniton detergentti 6,5 EO 10 öjyhapon dietyyliamidi 10 rasvahappo (C12/C18 75 : 25) 18 30 natriumsitraatti 1 trietanoliamiini 5 propanoli 7 etanoli 5 < 112500 54

Dequest 2060 0,5 proteaasi 0,5 amylaasi 0,1 pieninä määrinä olevat aineosat 5 ja vesi täytetään 100 %:ksi pH voidaan säätää arvojen 9 ja 10 välillä olevaan arvoon.

Entsyymi käsittää proteaasimutantin S020 tai vaihtoehtoisesti S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226 tai S235.

10 Detergentti Dl4:

Vedetön nestemäinen detergenttikoostumus on formuloitu siten, että sen koostumus painoprosentteina on: nestemäinen ioniton detergentti (Cl0-12, 6,2 EO) 41 % 15 triasetiini 5 lineaarinen alkyylibentseenisulfonihappo 6 magnesiumoksidistabilisaattori 1 natriumkarbonaattitehoaine/emäs 18 : kalsiumkarbonaattitehoaine 8 : 20 valkaisuaineen aktivaattori TAED 3,5 , valkaisuaineen esimuoto perboraattimonohydraatti 10,5 osittain hydrofobinen piihappo 2 proteaasi 0,4 25 lipaasi (Lipolase®) 3 pieninä määrinä olevat aineosat tai jokin muu nestemäinen ioniton pinta-aktiivinen aine (ei vettä) täytetään 100 %:ksi 30 Tätä koostumusta formuloitaessa lisätään ensin nestemäinen ioniton pinta-aktiivinen aine ja triasetiini, jonka jälkeen lisätään magnesiumoksidi ja tämän jälkeen muut ainesosat entsyymiä lukuunottamatta. Seos käsitellään kolloidimyllyssä, jäähdytetään ja lopuksi lisätään entsyymi(t) ja mitkä tahansa muut lämmölle herkät pieninä määrinä esiintyvät aineosat.

112500 55

Entsyymi käsittää proteaasimutantin S020 tai vaihtoehtoisesti SO 19, SO 12, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226 tai S235.

Käyttökelpoisia ovat myös mitkä tahansa EP-patenttijulkaisussa 0 342 177 kuvatut 5 ja esimerkkeinä olevat detergenttiformulaatiot.

Detergenttinä D3 käyttökelpoisia ovat myös EP-patenttijulkaisussa 0 342 177 esimerkkeinä käytetyt detergenttiformulaatiot käytettynä yhdessä mutanttien kanssa.

Tulokset

Subtilisiini 309 -geenin kohdemutaatioden muodostaminen 10 Kohdemutaatiot saatiin aikaan käyttäen Morinaga et al:n menetelmää (Biotechnology, katso edellä). Mutaatioiden muodostamiseen käytettiin seuraavia oligonukleo-tideja: a) Gly 195 Glu (G195E (S001)): 27-meerinen epäsopiva aluke, Nor-237, joka muodostaa myös uuden Sacl-15 restriktiokohdan: 5' CACAGTATGGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGG 3' Nor-237 5' GTATGGCGCAGAGCTCGACATTTGTCGC 3' ; Sacl b) Arg 170 Tyr (Rl70Y (S003)): : 20 25-meerinen yhteensopimattoman kohdan sisältävä aluke Nor-577, joka hävittää : Haelll-kohdan:

Haelll 5' GCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGC 3'

Nor-577 3’ CGATAGGCCGTATAATACGCTTGCG 5' 25 c) His 120 Asp (H120D (S006)): 32-meerinen yhteensopimattoman kohdan sisältävä aluke, Nor-735, joka hävittää SphI-kohdan: 112500 56

SphI

5' AGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGA 3’

Nor-735 5' AGGGAACAATGGCATGGACGTTGCTAATTTGA 3’ d) Lys 251 Glu (K251E (S005)) 5 32-meerinen yhteensopimattoman kohdan sisältävä aluke Nor-736, joka muodostaa Xhol-kohdan: 5' CAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAAC 3'

Nor-736 5’ CAAATCCGCAATCATCTCGAGAATACGGCAAC 3’

Xhol 10 e) Lys 235 Leu (K235L (S015)): 24-meerinen yhteensopimattoman kohdan sisältävä aluke Nor77-856, joka muodostaa Pstl-kohdan: 5' GCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCA 3'

Nor-856 5’ GCCCTTGTTCTGCAGAAGAACCCA 3'

15 PstI

f) Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu (R170Y; G195E (S004)): : Nor-577:n ja Nor-237:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen ana- : logisella tavalla.

g) Gly 195 Glu; (G195E; K251E (S018)): 20 Nor-237:n ja Nor-736:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen ana- : logisella tavalla.

h) Arg 170 Tyr; LVs 251 Glu (R170Y; K251E (SOI 1)):

Nor-577:n ja and Nor-736:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen analogisella tavalla.

: 25 i) Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu; Lys 251 Glu (R170Y; G195E; K251E (SO 12)): ’ Nor-577:n, Nor-237:n ja Nor-736:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen analogisella tavalla.

j) Gly 195 Glu; Lys 235 Leu (G195E; K235L): 112500 57

Nor-237:n ja Nor-856:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen analogisella tavalla.

k) Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu; Lys 235 Leu (R170Y; G195E; K235L)

Nor-577:n, Nor-237:n ja Nor-856:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan 5 suhteen analogisella tavalla.

l) His 120 Asp; Lys 235 Leu (H120D; K235L (S016)):

Nor-735:n ja Nor-856:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen analogisella tavalla.

m) His 120 Asp; Gly 195 Glu; Lys 235 Leu (H120D; G195E; K235L (S017)): 10 Nor-735:n, Nor-237:n ja Nor-856:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen analogisella tavalla.

n) His 120 Asp; Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu; Lys 235 Leu; (H120D; R170Y; G195E; K235L (SO 19)):

Nor-735:n, Nor-577:n, Nor-237:n ja Nor-856:n yhdistelmä muodostettiin edellä ku-15 vatun tavan suhteen analogisella tavalla.

o) His 120 Asp; Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu; Lys 235 Leu; Lys 251 Glu (H120D; R170Y; G195E; K235L; K251E (S020):

Nor-735:n, Nor-577:n, Nor-237:n, Nor-856:n ja Nor-736:n yhdistelmä muodostettiin : edellä kuvatun tavan suhteen analogisella tavalla.

20 Aukon sisältävään dupleksiin perustuva mutageneesi suoritettiin käyttäen templaat-teina plasmideja pSX93, pSX199 ja pSX120.

pSX93 on esitetty kuvassa 3 ja se on pUC13 (Vieira, J. ja Messing, J., Gene 19 ; (1982) 259-268), jossa on 0,7 ke:n suuruinen subtilisiini 309-geenin Xbal -

Hindlll -fragmentti, joka sisältää polylinker-jaksoon liitetyn terminaattorin.

3 25 Mutaatioiden muodostamiseksi entsyymin N-terminaaliseen osaan käytettiin plas- . midia pSX119. pSX119 on pUC13, jossa on polylinker-jaksoon liitetty subtilisiini ; 309 -geenin EcoRI - Xbal -fragmentti. Templaatit pSX93 ja pSXl 19 kattavat siten koko subtilisiini 309 -geenin.

112500 58

Plasmidi pSX120 on plasmidi, jossa Hpal - Hindlll -fragmentti siihen liittyvine pSX88:sta peräisin olevine subtilisiini 309 -geeneineen liitetään tai on liitetty pDN168:n EcoRV - HindIII:een, sillä tavoin, että amy M ja amy Q -promoottorit ilmentävät proteaasigeeniä. pDN 1681 on saatu pDN 1380:sta (Diderichsen, B. ja 5 Christiansen, L.: FEMS Microbiology Letters 56 (1988) 53-60) ja tässä on siihen liitetty 2,85 ep:n suuruinen B. amyloliquefaciensista peräisin oleva Clal-fragmentti, jossa on oman promoottorinsa sisältävä amy Q -geeni (Takkinen et ai. J. Biol. Chem. 258 (1983) 1007ff.) pSX120:n konstruktio on esitetty pääpiirteissään kuvassa 1, josta käy ilmi, että pDN 1681 on pilkottu EcoR5:lla ja HindllLlla ja pSX88 Hin-10 dllLlla ja HpaLlla, minkä jälkeen suoritetusta ligaatiosta saadaan tulokseksi pSX120, jossa säätely tapahtuu amy M- ja amy Q -promoottorien välityksellä.

Konstruoitiin vielä neljä muuta plasmidia, pSX170, pSX172, pSX173 ja pSX186, subtilisiini 309 -geenin mutatoimiseksi aukon sisältävän dupleksin käsittävää muta-geneesiä käyttäen.

15 -pSX170: Sphl - Kpnl, 700 ep pUC 19:ään liitetystä pSX120:sta, Sphl - Kpnl, kyp sän subtilisiini 309:n aminohapporyhmästä 170 terminaattoriin.

-pSX172: EcoRI - Sphl, 1360 ep pUcl9:aan liitetystä pSX120:sta, EcoRI - Sphl, promoottorista kypsän subtilisiini 309:n aminohapporyhmään 170.

-pSX173: kuten pSX170, mutta valmistuksessa on käytetty G195E:tä : 20 -pSX186: PvuII - EcoRI, 415 ep pUC19:ään liitetystä pSX120:sta, Hincl - EcoRI, : ; kypsässä subtilisiini 309:ssa olevasta aminohapporyhmästä 15 aminohapporyhmään : . 206.

/ Kuvassa 2 esitetään kohtalaisen yksityiskohtainen pSX120:n restriktiokartta, jossa ' ’ on esitetty se, mitä fragmentteja käytettiin plasmidien pSX170, pSX172, pSX173 ja 25 pSX186:n konstruoimiseksi.

Mutaatio a) suoritettiin pilkkomalla pSX93 XbaLlla ja ClaLlla tavalla, joka ilmenee kuvasta 3 ja kansainvälisessä patenttihakemusjulkaisussa n:o PCT/DK 88/00002 (NOVO INDUSTRI A/S) olevasta kappaleesta: "Generation of site directed muta-: tions in the subtilisin gene".

; 30 Mutaatiot b), d) ja e) suoritettiin vastaavalla tavalla pilkkomalla pSX170 SphLlla ja

KpnLlla.

112500 59

Mutaatiot f) ja g) suoritettiin edellä kuvatulla tavalla, mutta pSX170:n tilalla käytettiin pSX173:a.

Mutaatio c) suoritettiin vastaavalla tavalla pilkkoen pSX186 PstLlla ja EcoRLlla.

Mutaatiot h) - o) konstruoitiin yksittäisiä tai kaksoismutaatioita b) - g) sisältäviä 5 DNA-fragmentteja yhdistelemällä käyttäen restriktiokohtia Nhel, Xbal, Clal, Avail ja Kpnl asianmukaisella tavalla.

Valmistettiin vielä muita mutantteja vastaavanlaisia menetelmiä tai kirjallisuudesta tunnettuja yleisiä menetelmiä käyttäen.

Subtilisiini Carlsberg -mutantit 10 Tässä patenttikuvauksessa mainittuja tiettyjä subtilisiini Carlsbergissa olevia mutaa-tioesimerkkejä varten muodostettiin seuraavat nukleotidijakson muutokset:

Asp 14 Lys (D14K (C001)) (GAT -> AAG)

Asp 120 Lys (D120K (C002)) (GAT AAA)

Asp 140 Lys (D140K (C003)) (GAC -» AAA) 15 Asp 14 Lys + Asp 120 Lys (D14K+D120K (C004))

Lys 27 Asp (K27D (C005)) (AAA -> GAT)

Lys 27 Asp + Asp 120 Lys (K27D+D120K (C006)) ;' : Asp 172 Lys (D172K (C008)) (GAC AAA)

Asp 14 Lys + Asp 120 Lys + Asp 140 Lys + Asp 172 Lys . ; 20 (D14K+D120K+DI40K+D172K (CO 10)) ^ ‘ Vai 51 Asp (V51D (Cl00))

Glu 54 Thr (E54T (Cl 01)) (GGG -» AC A) :;;.: Glu 54 Tyr (E54Y (C102)) (GGG -> TAT) Nämä muutokset valmistettiin muuttamalla kyseisissä fragmenteissa olevat oligo-; ‘ ; 25 nukleotidit. Uudet jaksot vahvistettiin oikeiksi, minkä jälkeen alkuperäiset oligonuk- leotidit korvattiin näillä uusilla jaksoilla ja koottiin uusiksi DNA-fragmenteiksi. Fragmentit koottiin lopuksi uudeksi subtilisiini Carlsberg -geeniksi.

Mutatoitujen subtilisiinien ilmentäminen • Sen jälkeen kun mutaation jakso oli vahvistettu oikeaksi, mutatoidut DNA- : 30 fragmentit liitettiin plasmidiin pSX93 tai pSX120, jota käytettiin mutanttien valmis tamiseksi.

112500 60

Plasmidi pSX92 on esitetty kuvassa 4 ja se valmistettiin kloonaamalla Sub 309 -geeni plasmidiin pSX62, joka oli pilkottu Clal-kohdasta, täytetty DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla ja pilkottu Hindlll :11a ennen kloonatusta Sub 309 -geenistä peräisin olevien Dral - Nhel-ja Nhel - Hindlll -fragmenttien liittämistä.

5 Mutanttien ilmentämiseksi mutatoidut fragmentit (Xbal, Clal, Xbal - Hindlll tai EcoRI - Xbal) pilkottiin asianmukaisesta mutaatioplasmidista pSX93, pSX119, pSX170, pSX172, pSX173, ja pSX186, tässä järjestyksessä mainittuna, ja liitettiin pSX92:een tai pSX120:een eri mutantteja ilmentämään kykenevien plasmidien aikaansaamiseksi.

10 B. subtilis DN479 transformoitiin tämän jälkeen mutatoiduilla pSX92:lla tai pSX120:lla.

Tämän jälkeen transformoidut solut levitettiin LB-agarmaljoille, joissa oli 10 mM fosfaattia, pH 7, 6 mg/ml kloramfenikolia ja 0,2 % ksyloosia plasmidissa olevan xyn-promoottorin indusoimiseksi. Maljoilla oli myös 1 % kuorittua maitoa, jotta 15 proteaasia tuottavat transformantit olisi voitu havaita kirkkaina renkaina siellä, missä kuorittu maito on pilkkoutunut.

Mutatoidut entsyymit otettiin talteen ja puhdistettiin sopivalla tavalla suoritetun kasvatuksen jälkeen.

: Subtilisiini Carlsberg -molekyylien fermentaatio , 20 Proteaasientsyymin tuottamiseen tavalla, joka perustuu edellä kuvatulla tavalla val mistettuja BPN':a vastaavia mutatoituja geenejä sisältäviin mikro-organismeihin, käytettiin yleensä Rushton-tyyppistä Chemoferm-fermenttoria, joka oli varustettu 8 suoraa lapaa sisältävällä sekoittajalla ja jonka käyttötilavuus oli 8 litraa. Fermentto-rikonfiguraatio muodostettiin siten, että se oli VMT:n vastaavien turvallisuusmäärä-25 ysten mukainen ja sen koostumukseen kuului: a) Painesäädin (tyyppi 4-3122, Bell & Howell), joka rajoittaa ilman pääsyn laitteeseen 10 kPa:n ylipaineen ylittävältä osalta. Tämä tehdään ulostulevan ilman suodattimien tukkeutumisen ehkäisemiseksi.

b) Kaasun ulostuloputkeen valmistettu vaahtosulku, joka on tehty 20 litran imupul- ; 30 losta, jonka pohjalle on lisätty vaahdonestoainetta.

c) Avoin jäähdytysvesivaippa jäähdytysveden tai vesijohtovedelle tarkoitetun viemärin kontaminoitumisen ehkäisemiseksi.

112500 61 d) Käytetään absoluuttista ulostulosuodinta (Gelman acro 50, 0,45 mm).

e) Näytteiden otto tapahtuu käyttäen pienen sisäisen tilavuuden omaavaa näytteenot-topumppua.

Säätötoimenpiteet 5 Kaasunvirtaus kontrolloitiin käyttäen massavirtausmittareita (Brooks, tyyppi 5852, käyttöalue 0-101).

pH säädettiin käyttäen Hartmann ja Braun -lähetintä ja Philips-säädintä (Witromat). Neutralointiin käytettiin väkevää NaOH:ta (3 M).

Ulos tulevat kaasut analysoitiin käyttäen Maihak, Westinghouse-yhtiöstä hankittuja 10 laitteita Unor 4N (C02) ja Oxygor 7N (02). Liuokseen liuenneen hapen määrä määritettiin käyttäen teollisuuskäyttöön tarkoitettua steriloitavaa happianturia (Ingold, tyyppi 322756702).

Kasvatusliuoksen lämpötilaa seurattiin käyttäen PTlOO-tuntoelintä ja Honeywellin lämpötilansäädintä (luokka 84). Vaahdon muodostuminen pidettiin hyväksyttävällä 15 tasolla käyttäen kosketuselektrodia ja tämän yhteydessä olevaa vaahdonestoaine-pumpun aktivoivaa tasonsäätökytkintä.

Kaikkia ulkopuolisia säätimiä valvottiin Hewlett-Packard -mikrotietokoneella ' (HP220).

Kasvatusolosuhteet 20 Ympit valmistettiin inkuboimalla ravistelupulloviljelmää 30 °C:ssa 16 tunnin ajan 250 kierroksen minuuttinopeudella pyörivässä ravistelijassa (LH fermentation, tyyppi MLx). Käytettiin 300 ml:n suuruista ymppiä, joka oli tarkoitettu 8 litran erää kohti ja jota esikäsiteltiin varsinaisen fermentoinnin olosuhteissa (pH 7,0 30 °C, ilman virtaus 3,5 1/min, sekoittunen nopeus 1000-1500 kierrosta minuutissa). Liuenneen 25 hapen konsentraatio pidettiin 25 % ilmasta saatavan kylläisyystason yläpuolella. Käytetty vaahdonestoaine oli silikoniöljypohjaista materiaalia (Rhodorsil R426, Rhone Poulenc).

Subtilisiiniproteaasin tuotto : Proteaasit (mutatoidut proteaasit) tuotettiin käyttäen geenien konstruointia koske- 30 vassa kohdassa kuvatun mutatoidun geenin sisältävää B. subtilis DB 105 -kantaa.

112500 62

Kasvatusliuoksen koostumus oli 8 g/1 NH4C1; 4 g/1 KH2P04; 4 g/1 K2HP04; 2 g/1 NaCl; 1 g/1 MgS04.2H20; 10 g/1 hiivauutetta; 40 g/1 sakkaroosia; pH 7,0 ja tämä oli steriloitu 45 min 120 °C:ssa. Steriloinnin jälkeen lisättiin 25 mg/1 tryptofaania ja 20 mg/1 neomysiiniä.

5 Fermentaatiot lopetettiin 20-30 tunnin kuluttua. Solut poistettiin kasvatusliuoksista sentrifugoimalla.

Mutatoitujen subtilisiinien proteolyyttinen aktiivisuus

Useiden eri mutanttien proteolyyttinen aktiivisuus tutkittiin proteiinisubstraattina käytettyä kaseiinia vastaan edellä kuvatun DMC-menetelmän mukaisesti. Tulokset 10 on esitetty taulukossa IV.

Taulukosta nähdään, että mutantilla (S005) on jonkin verran lähtömuotoa (S000) suurempi aktiivisuus, kun taas muiden mutanttien aktiivisuus on hieman alempi.

Taulukko IV

Mutatoitujen subtilisiinien proteolyyttinen aktiivisuus Mutantti Suhteellinen aktiivisuus

Ei mutaatiota (S000) 100 S001 95 S003 90 : S004 85 : i S005 105 : S006 100 ; SO12 80 SOI7 90 . S019 70 S020 75 S024 70

Mutatoitujen subtilisiinien pesutehokkuus 15 Useiden eri mutanttien pesutehokkuus pH-arvoltaan 8,14 olevassa nestemäisessä standardidetergentissä tutkittiin mallisysteemissä ruohonestettä vastaan edellä yksi-: tyiskohtaisesti kuvattujen menetelmien mukaisesti. Tulokset on esitetty taulukossa : V.

112500 63

Taulukko V

Delta-R-arvot:

Mutantti Entsyymikonsentraatio l,0mg/l 10mg/l 5000 4,0 10,7 5001 5,9 12,8 5003 6,0 13,5 5004 5,8 13,0 S012 4,2 9,6 5019 10,5 19,4 5020 9,4 18,6

Taulukosta havaitaan, että kaikilla tutkituilla mutanteilla esiintyi villityyppiseen läh-tömuotoiseen entsyymiin verrattuna parantunut tai vastaavantasoinen pesutehok-kuus. Mutanttien SO 19 ja S020 pesutehokkuus on parantunut siten, että 1,0 mg/1 näi-5 tä entsyymejä korvaa karkeasti arvioiden 10 mg/ml villityyppistä lähtömuotoista entsyymiä, joka siten merkitsee sitä, että tämän keksinnön mukaisten mutatoitujen entsyymien pesutehokkuus on parantunut.

B:

Tulokset mallisysteemissä eri pH-arvoissa saaduista joillakin tämän keksinnön mu-10 kaisilla entsyymivarianteilla suoritetuista tutkimuksista, joissa käytettiin modifioitua j Yhdysvalloissa käytettävää kaupallista nestemäistä detergenttiä, on esitetty taulu- : kossa VI.

Taulukko VI

• ’ Pesutehokkuus eri pH-arvoissa

Mutantti Delta R

; : plo pH 8,0 9,0 10,0 11,0 : S000 10,2 1,4 2,6 3,1 10,1 . S001 9,86 2,1 4,0 6,6 14,0 5003 9,86 2,3 5,0 8,1 14,1 5004 8,68 4,1 9,7 11,7 10,9 : S005 9,71 2,2 4,3 6,3 13,9 : S012 9,09 5,7 11,9 13,8 6,3 5019 9,09 6,4 10,7 12,2 3,7 5020 6,71 7,8 10,6 8,5 2,4 112500 64

Tulokset osoittavat selvästi, että entsyymin pl:n siirtäminen suuntaan, johon pH-optimia on haluttua siirtää sen aikaansaamiseksi, että entsyymin pesutehokkuus lähestyisi pesuliuoksen pH:ta, parantaa entsyymin pesutehokkuutta.

5 D:

Useiden eri mutanttien pesutehokkuus tutkittiin ruohonesteellä liattuja puuvillakankaan kappaleita vastaan määrityksessä A kuvatun menetelmän mukaisesti.

Käytettiin nestemäistä detergenttiä (detergentti D3), jonka konsentraatio oli 2,0 g/1. pH säädettiin arvoon 9,1 NaOHdla tai HCkllä.

10 Lämpötila pidettiin 20 °C:ssa isotermisenä 10 min ajan.

Kutakin mutanttia annosteltiin konsentraatioina 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 ja 10,0 mg entsyymiproteiinia/1.

Tutkittujen mutanttien stabiilius tutkittiin mittaamalla denaturaatiolämpötila (maksimaalinen ylimääräinen lämpökapasiteetti) "differential scanning" -kalorimetrialla, 15 DSC:llä. Kuumennusnopeus oli 0,5 °C/min.

Stabiilius tutkittiin liuoksessa, joka sisälsi 91-prosenttiseen standardidetergenttiin, : jonka koostumus on kuvattu määrityksessä A, valmistettua mutanttia noin 2 mg/ml.

i Liuos valmistettiin sekoittamalla 100 ml entsyymiliuosta (noin 20 mg entsyymiä/ml) ' puskuriin, jonka koostumus oli 0,01 M dimetyyliglutaarihappoa, 0,002 M CaCl2:ta, : 20 0,2 M H3B03:a ja 0-0,1 M NaCkää ja jonka pH oli 6,5, 1000 mkaan nestemäistä standardidetergenttiä.

Subtilisiini 309 -mutanttien ryhmää koskevat DSC:llä saadut stabiiliustutkimusten tulokset ovat yhdenmukaisia perinteisillä varastointikestotutkimuksilla saatujen tulosten kanssa.

25 Tulokset:

Useiden eri mutanttien pesutehokkuus nestemäisessä detergentissä on esitetty taulukossa VII. Tulokset on esitetty parantumiskertoimina villityyppiseen lähtömuotoi-seen entsyymiin verrattuna. Parantumiskerroin on määritelty määrityksessä C annetun määritelmän mukaisesti.

112500 65

Taulukossa C on myös esitetty DSC:llä määritetty denaturaatiolämpötila nestemäisessä standardidetergentissä sekä villityyppisen lähtömuotoisen entsyymin ja kyseessä olevan mutantin denaturaatiolämpötilojan erotus.

Taulukko VII

Mutantti Laskettu Parantu- DSC.llä määri- DSC:llä määritetty dena- pl0 mistekijä tetty denaturaa- turaatiolämpötila suh- tiolämpötila teessä S000:aan S 000 10,06 1 65,2 0,0 S 020 7,30 7,6 58,2 -7,0 S 021 9,85 1,3 69,2 +4,0 S 022 8,07 9,3 61,9 -3,3 S 023 8,05 8,8 63,5 -1,7 S 024 6,86 3,9 60,6 -4,6 S 025 8,94 6,7 69,1 +3,9 S 035 8,07 7,0 72,5 +7,3 S 201 9,85 1,4 69,4 +4,2 5 Taulukosta VII nähdään, että kaikkien tutkittujen mutantti en pesutehokkuus oli parantunut villityyppiseen lähtömuotoiseen entsyymiin verrattuna. Paras pesutehokkuus saavutetaan mutanteilla, joiden pl0 on samansuuruinen kuin pesuliuoksen pH : tai juuri tämän alapuolella.

DSC:llä määritetty denaturaatiolämpötila osoittaa, että yksittäisten mutanttien S 021 10 (*36D) ja S 201 (N76D) stabiilius on kohonnut 4 °C:lla ja 4,2 °C:lla, tässä järjestyk sessä mainittuna.

: Niiden mutaatioiden joukosta, jotka sisältyvät yhteen tai useampaan taulukossa VII

lueteltuun mutanttiin, on osoitettu, että mutaatiot R170Y ja K251E vähentävät mutantin stabiiliutta villityyppiseen lähtömuotoiseen entsyymiin verrattuna, kun taas 15 mutaatiot H120D, G195E ja K235L eivät vaikuta stabiiliuteen.

: Taulukosta VII voidaan havaita, että yhden stabiiliutta vähentävän mutaation sisäl tävien mutanttien stabiilius on vähentynyt vieläpä niissäkin tapauksissa, joissa mukana on stabiloiva mutaatio.

: *36D:n ja N76D:n stabiloivat vaikutukset ovat additiivisia. Tämä voidaan osoittaa 20 käyttämällä mutantteja S 025 ja S 035. S 025 sisältää kolme mutaatiota, joilla ei ole vaikutusta stabiiliuteen, ja stabiloivan mutaation *36D:n. S 025:n denaturaatioläm- 66 112500 pötila on noussut 3,9 °C:lla villityyppiseen lähtömuotoiseen entsyymiin verrattuna, joka on samansuuruinen yksittäiselle *36D-mutantille mitatun lisäyksen suhteen.

S 035 sisältää saman mutaation N76D. S 035:n denaturaatiolämpötila on noussut 7,3 °C:lla villityyppiseen lähtömuotoiseen entsyymiin verrattuna, joka nousu vastaa 5 koevirheiden rajoissa yksittäisille mutaatioille *36D, S 021, ja N76D, S 201, mitattujen nousujen summaa.

E:

Kolmen mutantin pesutehokkuus ruohonesteellä liattuja puuvillakangaskappaleita vastaan tutkittiin määrityksessä A kuvatun menetelmän mukaisesti.

10 Käytettiin nestemäistä detergenttiä D3, jonka konsentraatio oli 2,0 g/1. Detergentti liuotettiin ioninvaihtimella käsiteltyyn veteen. pH säädettiin arvoon 9,1 NaOHdla tai HCkllä.

Lämpötila pidettiin isotermisenä 10 min. Kutakin mutanttia annosteltiin 1,0 ja 10,0 mg entsyymiproteiinia/1.

15 Tulokset:

Tutkittiin kolmen Yhdysvalloissa kaupan pidettävään nestemäiseen detergenttiin valmistetun mutantin pesutehokkuus ruohonestettä vastaan. Tulokset on esitetty taulukossa VIII.

Taulukko VIII

Delta R -arvot

Laskettu Entsyymin konsentraatio Mutantti pl0 l,0mg/l 10,0 mg/1 S 000 10,6 4,5 13,6 S 003 9,75 9,4 18,0 S 004 9,54 13,7 18,1 S 006 9,85 6,0 15,6

Taulukosta VIII havaitaan, että kaikkien mutanttien pesuteho on parantunut villi-tyyppiseen lähtömuotoiseen entsyymiin verrattuna. Nähdään lisäksi se, että paras tehokkuus saavutetaan käyttäen mutanttia, jonka pl0 on lähinnä pesuliuoksen pH:ta.

20 112500 67 F:

Tutkittiin kahden mutantin pesutehokkuus ruohonesteellä liattuja puuvillakangas-kappaleita vastaan esimerkissä E kuvattujen olosuhteiden mukaisissa olosuhteissa.

Tulokset: 5 Kahden mutantin pesutehokkuus detergentissä D3 tutkittiin ruohonesteellä liattuja puuvillakangaskappaleita vastaan. Tulokset on esitetty taulukossa IX.

Taulukko IX

Delta R -arvot:

Laskettu Entsyymin konsentraatio plo l,0mg/l 10,0 mg/1 S 000 10,06 5,8 15,3 S 015 9,95 8,4 20,0 S 017 9,40 17,0 20,8

Taulukosta IX nähdään, että kaikkien mutanttien pesutehokkuus on parantunut villi-tyyppiseen lähtömuotoiseen entsyymiin verrattuna. Havaitaan lisäksi se, että paras 10 tehokkuus saavutetaan käyttäen mutanttia, jonka pl0 on lähinnä pesuliuoksen pH:ta.

G: . Useiden eri mutanttien pesutehokkuus ruohonesteellä liattuja puuvillakangaskappa leita vastaan tutkittiin määrityksessä A kuvatun menetelmän mukaisesti.

Käytettiin nestemäistä detergenttiä D3, jonka konsentraatio oli 2,0 g/1.

, 15 Detergentti liuotettiin puskuriin (0,0025 M boorihappo ja 0,001 M dinatriumvety- fosfaatti, joka oli valmistettu ioninvaihtajalla käsiteltyyn veteen) pH säädettiin arvoihin 7,0, 8,0, 9,0 ja 10,0 käyttäen kussakin tapauksessa asianmukaisella tavalla NaOH:ta tai HCl:ää. Lämpötila pidettiin tasaisena 30 °C:ssa 10 min.

Mutantteja annosteltiin määrä, joka kussakin tapauksessa oli 0,2 mg entsyymiprote-20 iinia/1.

; Tulokset:

Joidenkin tämän keksinnön mukaisten entsyymivarianttien pesutehokkuus mallisys teemissä eri pH-arvoissa on esitetty taulukossa X.

112500 68

Taulukko X

Variantti Mutaatio Delta R

pl0 pH 7,0 8,0 9,0 10,0 S000 10,06 0,6 0,8 4,4 7,0 SOI 5 K235L 9,95 1,3 2,4 6,0 8,8 S021 *36D 9,85 2,1 3,2 5,6 8,3 S017 H120D, G195E, 9,40 2,9 5,4 10,8 14,1

K235L

S025 *36D, H120D, 8,95 4,3 9,5 13,9 13,1

R170Y, D235L

5023 *36D, H120D, 8,05 9,6 13,0 12,4 9,2 R170Y, G195E,

K235L

5024 *36D, H120D, 6,86 9,4 10,4 6,7 4,8 R170Y, G195E,

K235L, K251E

Taulukossa X esitetyt tulokset osoittavat selvästi, että proteaasin pl:n siirtäminen pesuliuoksen pH:n suuntaan parantaa proteaasin pesutehokkuutta.

5 Tulokset osoittavat myös, että kaikkien tutkittujen varianttien pesutehokkuus parani villityypin lähtömuotoiseen entsyymiin verrattuna pH-arvoissa, jotka olivat alle 10.

; H:

Useiden eri mutanttien pesutehokkuus ruohonesteellä liattuja puuvillakangaskappa-leita vastaan tutkittiin määrityksessä A kuvatun menetelmän mukaisesti.

10 Käytettiin nestemäistä detergenttiä D3, jonka konsentraatio oli 2,0 g/1.

Detergentti liuotettiin ioninvaihtimella käsiteltyyn veteen valmistettuun 0,005 M glysiiniin. pH säädettiin arvoihin 10,0, 10,25, 10,50, 10,75, 11,0, 11,5 ja 12,0 kussa-: kin tapauksessa erikseen NaOHdla. Lämpötila pidettiin tasaisena 30 °C:ssa 10 min.

Mutantteja annosteltiin määrä, joka kussakin tapauksessa oli 0,2 mg entsyymipro-: 15 teiinia/1.

112500 69

Tulokset:

Joidenkin tämän keksinnön mukaisten entsyymivarianttien pesutehokkuus mallisysteemissä eri pH-arvoissa on esitetty taulukossa XI. Tässä tapauksessa tutkittiin variantteja, joiden pl oli hieman villityypin lähtömuotoisen entsyymin piitä korkeampi.

5 Arvojen 10,0-12,0 välinen pH-alue tutkittiin yksityiskohtaisemmin kuin aiemmissa esimerkeissä.

Taulukko XI

Variantti Mutaatio Delta R

pl0 pH 10,0 10,25 10,50 S000 10,06 7,0 8,7 10,5 5027 E89S 10,28 6,0 8,5 9,8 5028 D181N 10,28 6,9 9,8 10,6 5032 D197N 10,28 4,7 9,2 10,8 5033 E271Q 10,28 7,1 6,7 7,8 5031 D197N, 10,53 4,7 7,2 7,0

E271Q

Variantti Mutaatio Delta R

pl0 pH 10,75 11,0 11,5 12,0 S000 10,06 12,5 14,4 10,6 3,8 S027 E89S 10,28 11,9 14,3 12,8 5,0 ! S028 D181N 10,28 13,0 14,4 10,7 4,6 5032 D197N 10,28 13,8 13,5 11,3 5,0 5033 E271Q 10,28 10,4 13,7 13,3 6,3 S031 D197N, 10,53 10,7 13,0 14,4 8,7

: E271Q

Taulukossa XI esitetyt koetulokset osoittavat, että korkeissa pH-arvoissa maksimaa-10 linen tehokkuus saavutetaan pH-arvoilla, jotka ovat hieman lasketun pl:n yläpuolella. Tässäkin tapauksessa havaitaan proteaasin pl:n nostamisen pyrkivän kohottamaan maksimaalista tehokkuutta vastaavaa pH:ta. Vaikutukset eivät ole niin silmiinpistäviä kuin mitä havaitaan matalissa pH-arvoissa (määritys B ja G).

I: 15 Proteaasin isoelektrisen pisteen ja proteaasin maksimaalista tehokkuutta vastaavan pH:n välisen korrelaation visualisoimiseksi etsittiin esimerkeistä B, G ja H saaduista tuloksista ne pH-arvot, joissa kullakin tutkitulla variantilla (ja villityypin lähtömuo- 112500 70 toisella entsyymillä) oli maksimaalinen tehokkuutensa. Kuvassa 5 tämä pHmax on esitetty laskennallisen pl0:n funktiona.

Huomioiden sen, että pH-alue on tutkittu l,0:n suuruisin pH-muutoksin, on korrelaatio ilmeinen.

5 Kokeellista tuloksista, jotka koskivat tämän keksinnön mukaisten mutanttien yhdistämistä lipaasin kanssa, päädyttiin seuraaviin käytännön johtopäätöksiin: (S)

Lipaasi kesti tunnin tyypin O pesuliuoksessa 37 °C:n lämpötilassa. Savinase :n läsnäolo johti nopeaan aktiivisuuden katoamiseen. Kazusase®:sta aiheutui vähemmän lipaasin inaktivoitumista kokeeseen käytettynä aikana.

10 Subtilisiini BPN' ei kuitenkaan inaktivoinut lainkaan lipaasia näissä olosuhteissa.

Edulliset proteaasit käytettäväksi esimerkiksi lipaasin kanssa tyypin O edustamissa pesukoostumuksissa ovat mutantit S001, S003, S004, SO 12, SO 19, S020, S021, S025, S035 ja S235.

Tyypin O pesuliuos oli valmistettu konsentraatioon 5 g/1, sitä käytettiin 37 °C:ssa ja 15 se oli peräisin detergenttiformulaatiosta, jonka koostumus painoprosentteina oli: anioninen pinta-aktiivinen aine 6 ioniton pinta-aktiivinen aine 5 : rasvahappo 2,8 20 akryylipolymeeri 3 zeoliitti 22 karbonaatti 10 sulfaatti 17,5 savi 8 25 tertiäärinen amiini 2 perboraattimonohydraatti 13 pieninä määrinä olevat aineosat ja vesi, täytetään 100:ksi.

Edullinen proteaasi käytettäväksi esimerkiksi lipaasin kanssa tyypin W edustamissa ; 30 pesukoostumuksissa on mutantti S020, S021, S025, S035 ja S235.

* Tyypin W pesuliuos oli konsentraatioon 2 g/1 valmistettu liuos nestemäisestä deter- gentistä, jonka koostumus painoprosentteina oli: 112500 71 anioninen pinta-aktiivinen aine 16 ioniton pinta-aktiivinen aine 7 hydrotrooppi 6 sitruunahappo 6,5 5 NaOH 4,1 monoetanoliamiini 2 pieninä määrinä olevat aineosat ja vesi, täytetään 100:ksi.

10 Vaikka tätä keksintöä on tarkasteltu ja siitä on esitetty esimerkkejä sen erilaisten erityisten sovellutusmuotojen yhteydessä, tätä ei tulisi käsittää tämän patenttikuvauk-sen, joka kattaa kaikki edellisessä esityksessä mainittujen ja kuvattujen piirteiden yhdistelmät ja alayhdistelmät sekä oheistetut patenttivaatimukset, sovellettavuutta ja kattavuutta rajoittavaksi.

Claims (14)

112500

1. Mutatoitu subtilisiiniproteaasi, jonka sähköstaattinen nettovaraus on muuttunut verrattuna lähtömuotoiseen proteaasiin samassa pH-arvossa, tunnettu siitä, että ainakin yksi mutaatio on saatu aikaan asemassa 245 substituutiolla, jolloin mainitun 5 mutatoidun subtilisiiniproteaasin isoelektrinen piste (pl0) on alempi tai korkeampi kuin mainitun lähtömuotoisen proteaasin vastaava piste.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että siinä on ainakin yksi mutaatio, joka vaikuttaa asemassa 245 olevaan aminohapporyhmään, ja ainakin vielä yksi mutaatio, joka vaikuttaa sellaisessa asemassa olevaan aminohapporyh- 10 mään, joka on 1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 75, 76, 77, 78, 79, 87, 89, 91, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 126, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 15 167, 170, 171, 172, 173, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 188, 189, 191, 192, 194, 195, 197, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 259, 260, 261, 262, 263, 265, 269, 271, 272, 275.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että se edustaa 20 sellaisen lähtömuotoisen entsyymin mutaatiota, joka on: subtilisiini BPN', subtilisii- | ni amylosacchariticus, subtilisiini 168, subtilisiini mesenterikopeptidaasi, subtilisiini Carlsberg, subtilisiini DY, subtilisiini 309, subtilisiini 147, termitaasi, akvalysiini, Bacillus PB92 -proteaasi, proteinaasi K, proteaasi TW7 tai proteaasi TW3.

: 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että lähtömuotoinen ; 25 subtilisiini on subtilisiini 309.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että lähtömuotoinen subtilisiini on subtilisiini 147.

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että lähtömuotoinen subtilisiini on subtilisiini Carlsberg. ; 30

7. Patenttivaatimuksen 3 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että lähtömuotoinen : subtilisiini on Bacillus PB92 -proteaasi. 112500

8. Sellainen menetelmä aminohap(p)o(je)n määrittämiseksi tai valitsemiseksi, jolla voidaan suorittaa lähtömuotoinen entsyymin asemassa 245 olevaan aminohappoon kohdistuva deleetio, substituutio tai insertio, tunnettu siitä, että valinta suoritetaan tavalla, jolla mutatoitavaksi aiotun entsyymin laskennallinen sähköstaattinen 5 nettovaraus (NEC) on muuttunut valitun lähtömuotoisen entsyymin samassa pH:ssa laskettuun NEC:hen verrattuna.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valitut amino-happoryhmät valitaan siten, että ne vaikuttavat aminohapporyhmään, joka sijaitsee asemassa 245, ja ainakin vielä yksi muu ryhmä, joka vaikuttaa aminohapporyhmään, 10 joka sijaitsee asemassa, joka on 1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 75, 76, 77, 78, 79, 87, 89, 91, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 126, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 15 164, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 188, 189, 191, 192, 194, 195, 197, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 214,215, 216, 217,218, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 259, 260, 261, 262, 263, 265, 269, 271, 272, 275.

10. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtö muotoinen entsyymi on subtilisiini BPN', subtilisiini amylosacchariticus, subtilisiini 168, subtilisiini mesenterikopeptidaasi, subtilisiini Carlsberg, subtilisiini DY, subti-: lisiini 309, subtilisiini 147, termitaasi, Bacillus PB92 -proteaasi, proteinaasi K, pro- teaasi TW7 tai proteaasi TW3.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtömuo- ; toinen subtilisiini on subtilisiini 309.

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtömuotoinen subtilisiini on subtilisiini 147.

13. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtömuo- ' 30 toinen subtilisiini on subtilisiini Carlsberg.

14. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtömuo-toinen subtilisiini on Bacillus PB92 -proteaasi. 112500