FI102907B - Mutatoitu subtilisiini-proteaasi - Google Patents

Description

1 102907

Mutatoitu subtilisiini-proteaasi Keksinnön ala 5 Tämä keksintö liittyy uusiin mutatoituihin entsyymeihin tai entsyymivariantteihin, jotka ovat käyttökelpoisia parannettuja pesuominaisuuksia omaavien detergenttikoostumusten formuloinnissa, mainittuja entsyymejä sisältäviin puhdistus- ja detergenttikoostumuksiin, mutatoituihin geeneihin, 10 jotka koodaavat mainittujen entsyymien ilmentymistä sopi vaan isäntäsoluun tai -organismiin liitettyinä, ja menetelmiin niiden aminohapporyhmien valitsemiseksi lähtömuotoi-sesta entsyymistä, jotka vaihtamalla tämän tehokkuutta tietyssä pesunesteessä tiettyjen olosuhteiden vallitessa 15 kyetään parantamaan.

Keksinnön tausta

Detergenttiteollisuudessa on entsyymejä käytetty pesu-aineformulaatioihin yli 20 vuotta. Näissä formulaatioissa 20 käytettävät entsyymit käsittävät proteaaseja, lipaaseja, amylaaseja, sellulaaseja sekä muita entsyymejä tai näiden seoksia. Kaupallisesti tärkeimpiä ovat proteaasit.

Vaikka proteaaseja on käytetty detergenttiteollisuudessa 25 yli 20 vuotta, ei vieläkään tiedetä tarkkaan, mihin fysikaalisiin tai kemiallisiin ominaisuuksiin proteaasin hyvä pesutehokkuus tai pesukyky perustuu.

Nykyisin käytössä olevat proteaasit on löydetty eristämällä 30 proteaaseja luonnosta ja tutkimalla niiden ominaisuuksia detergenttiformulaatioissa.

Baci1lus-proteaasit

Proteiinisubstraateissa olevia amidisidoksia pilkkovat 35 entsyymit luokitellaan proteaaseiksi tai (vaihtoehtoisesti) peptidaaseiksi (katso Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Francisco, luku * 2 102907 3). Bacillus-lajin bakteerit erittävät kahta solunulkoista proteaasityyppiä, neutraalia eli metalloproteaasia ja alkalista proteaasia, joka toimii seriiniendopeptidaasina, josta käytetään nimitystä subtilisiini. Näiden proteaasien 5 erittyminen on liittynyt bakteerien kasvusykliin siten, että proteaasi ilmenee runsaimmin stationaarivaiheen aika-na, jolloin myös sporulaatio tapahtuu. Joliffe et ai. (J. Bacteriol. 141 (1980) 1199 - 1208) ovat ehdottanut että bacillus-proteaasit toimivat solunseinän turnover-ilmiössä.

10

Subtilisiini

Seriiniproteaasi on entsyymi, joka katalysoi peptidisidos-ten hydrolyysiä ja jonka aktiivisessa keskuksessa esiintyy olennainen seriiniryhmä (White, Handler ja Smith, 1973, 15 "Principles of Biochemistry," 5. painos, McGraw-Hill Book

Company, NY, sivut 271 - 272).

Bakteerien seriiniproteaasien molekyylipainot ovat alueella 20 000 - 45 000. Niitä inhiboi di-isopropyylifluorifosfaat-20 ti, mutta metalloproteaaseista poiketen ne ovat vastustuskykyisiä etyleenidiamiinitetraetikkahapolle (EDTA) (vaikkakin korkeissa lämpötiloissa niitä stabiloivat kalsium-ionit) . Ne hydrolysoivat yksinkertaisia terminaalisia este-reitä ja ovat aktiivisuudeltaan samanlaisia kuin eukaryoot-25 tisten organismien kymotrypsiini, joka myös on seriinipro teaasi.

Rajoittavampi termi alkalinen proteaasi, joka kattaa yhden alaryhmän, heijastaa joidenkin näiden seriiniproteaasien 30 korkeaa pH-optimia, joka on pH-alueella 9,0 - 11,0 (näistä on esitetty katsaus julkaisussa Priest, Bacteriological Rev. 41 (1977) 711 - 753).

Tämän keksinnön yhteydessä subtilisiini on grampositiivis-35 ten bakteerien tai sienten tuottama seriiniproteaasi. On tunnistettu useita erilaisia subtilisiineja ja monien sub-tilisiinien aminohappojakso on määritetty. Näihin kuuluvat 3 102907 ainakin 6 bacillus-kannoista peräisin olevaa subtilisiiniä, nimittäin subtilisiini-ri68, subtilisiini-BPN', subtilisiini Carlsberg, subtilisiini-DY, subtilisiini amylosacchariticus ja mesenterikopeptidaasi (Kurihara et ai., J. Biol. Chem.

5 247 (1972) 5629 - 5631, Wells et ai., Nucleic Acids Res. 11 (1983) 7911 - 7925, Stahl ja Ferrari, J. Bacteriol. 159 (1984) 811 - 819, Jacobs et al., Nucl.Acids Res. 13 (1985) 8913 - 8926, Nedkov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 (1985) 421 * 430, Svendsen et al., FEBS Lett. 196 (1986) 10 228 - 232), yksi actinomycetales-ryhmän edustajasta peräi sin oleva subtilisiini, termitaasi Thermoactionomyces vul-gariksesta (Meloun et al., FEBS Lett. 1983 (1985) 195 -200) ja yksi sienten subtilisiini, proteinaasi K, Triti-rachium albumista (Jany ja Mayer, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 15 366 (1985) 584 - 492).

Subtilisiinit ovat fysikaalisesti ja kemiallisesti tarkoin luonnehdittuja. Näiden entsyymien primäärisen rakenteen (aminohappojakson) tietämyksen lisäksi on määritetty yli 50 20 korkean erotuskyvyn röntgensäderakennetta, jotka kuvaavat substraatin sitoutumista, transitiotilaa, tuotteita, ainakin 3 erilaista proteaasi-inhibiittoria ja määrittelevät rakenteelliset seuraukset luonnollisen vaihtelun osalta (Kraut, Ann. Rev. Biochem. 46 (1977) 331 - 358).

25 Tämän keksinnön yhteydessä subtilisiinivariantti tai muta-toitu subtilisiiniproteaasi tarkoittaa subtilisiiniä, joka on sellaisen organismin tuottamaa, joka ilmentää sellaisesta lähtömuotoa olevasta mikro-organismista peräisin olevaa 30 mutatoitunutta geeniä, jolla on alkuperäinen tai lähtömuo-toinen geeni, joka on tuottanut vastaavaa lähtömuotoista entsyymiä, ja lähtömuotoiseen geeniin on aiheutettu mutaatioita sellaisen mutaation sisältävän geenin tuottamiseksi, josta mainittu mutatoitu subtilisiiniproteaasi on tuotettu 35 ilmentämällä sitä sopivassa isännässä.

102907 4

Subtilisiinigeenistä tunnetaan sekä satunnaisella tavalla että kohdemutaatioina syntyneitä mutaatioita, jotka perustuvat tämän entsyymin fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuden tuntemiseen, ja näistä on saatu subtilisiinin kata- 9 5 lyyttiseen aktiivisuuteen, substraattispesifisyyteen, ter-tiääriseen rakenteeseen jne liittyvää informaatiota. (Wells et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84 (1987) 1219 -1223, Wells et ai., Phil. Trans. R. Soc. Lond. A. 317 (1986) 415 - 423, Hwang ja Warshel, Biochem. 26 (1987) 10 2669 - 2673, Rao et ai., Nature 328 (1987) 551 - 554).

Erityisesti subtilisiinigeenien kohdemutageneesi on ollut suuren mielenkiinnon kohteena ja useita eri mutaatiota on kuvattu seuraavissa patenttihakemusjulkaisuissa ja patent-15 tijulkaisuissa: EP-patenttijulkaisu n:o. 130 756 (GENEN- TECH) (joka vastaa US-patenttijulkaisua n:o 4 760 025 (GE-NENCOR)), joka liittyy "karbonyylihydrolaaseissa" oleviin kohde- tai satunnaismutaatioihin ja tämän jälkeen suoritettavaan seulontaan, jossa mutatoituneista entsyymeistä mää-20 ritetään erilaisia ominaisuuksia, kuten k^/I^-suhde, pH- aktiivisuusprofiili ja hapettumisen kesto. Tämä patenttihakemus julkaisu ei edistä sen ongelman ratkaisua, mihin mutaatiota on muodostettava sellaisten entsyymien saamiseksi, joilla olisi halutut ominaisuudet, muutoin kuin siten, että 25 siitä käy ilmi se, että kohdemutageneesi on toteuttamiskel poinen keino ja että subtilisiini-BPN':n mutaatiot tietyissä erityisissä asemissa, esimerkiksi _ITyr, 32Asp, 155Asn, I04Tyr, ^Met, 166Gly, ^His, 169Gly, 189Phe, 33Ser, “‘Ser, 217Tyr, 156G1u tai 152Ala, saadaan entsyymejä, joiden ominaisuudet 3 0 ovat muuttuneet.

EP-patenttijulkaisu n:o 214 435 (HENKEL) liittyy subti-lisiini Carlsbergin kloonaukseen ja ilmentämiseen ja tämän kahteen mutanttiin. Tässä patenttihakemuksessa ei ole esi-35 tetty syitä 15*Asp:n mutatoimiselle 15*Ser:ksi ja ,65Ser:n mu-tatoimiseksi l6lAsp:ksi.

* s 102907

Kansainvälisessä patenttijulkaisussa n:o WO 87/04 461 (AMGEN) tehdään ehdotus lähtömuotoisen entsyymin Asn-Gly-jaksojen määrien pienentämiseksi paremmin lämpöä ja valittua pH:ta kestävien entsyymien aikaansaamiseksi, tässä patent-5 tihakemusjulkaisussa korostetaan subtilisiini-BPN' :n 109Asn ja 218Asn ryhmien poistamista, mutatoimista tai modifioimista.

Kansainvälisessä patenttijulkaisussa n:o WO 87/05 050 (GE-10 NEX) kuvataan subtilisiini-BPN':n satunnaismutatointia ja tämän jälkeistä suurista mutanttimääristä tehtävää seulontaa parantuneiden ominaisuuksien löytämiseksi. Tässä patenttihakemus julkaisussa kuvataan mutaatioita, jotka esiintyvät asemissa 218Asn, 13lGly, 254Thr, li6Gly, 116Ala, 188Ser, 126Leu 15 ja 53Ser.

EP-patenttihakemusjulkaisussa n:o 87 303 761 (GENENTECH) kuvataan se, kuinka sekä primäärisellä että tertiäärisellä rakennetasolla käytettävää homologiaseikkojen tarkastelua 20 voidaan soveltaa vastaavien aminohapporyhmien tunnistamiseen riippumatta siitä, ovatko nämä säilyneet eri entsyymien välillä vai eivät. Tämä informaatio yhdessä keksinnön tekijöiden subtilisiini-BPN':n tertiäärisen rakenteen tietämyksestä johti näiden keksinnön tekijöiden valitsemaan 25 mutatoitaviksi tietyn määrän kohtia, joissa odotuksena oli se, että saataisiin muunnettuja ominaisuuksia sisältäviä mutantteja. Näin tunnistetut asemat ovat 124Met, ^Met, 104Tyr, 152Ala, 156G1u, 166Gly, löGly, 189Phe, 2,7Tyr. Myös 155Asn, 21Tyr, MThr, MSer, 32Asp, 33Ser, ^Asp, ^Gly, 48Ala, 49Ser, 50Met, ' 30 ^Asn, 87Ser, ^Lys, 95Val, ’‘Leu, I07Ile, noGly, ,70Lys, 171Tyr, 172Pro, 197Asp, 199Met, ^Ser, 213Lys ja^Ser, jotka asemat on tunnistettu sellaisiksi, että niiden odotetaan vaikuttavan entsyymin eri ominaisuuksiin. Esitetään myös esimerkkejä useista eri mutaatioista, jotka tukevat näitä ehdotuksia.

35 Näissä asemissa olevien yksittäisten mutaatioden lisäksi tämän keksinnön tekijät ovat tehneet myös useita rinnakkaisia mutaatioita. Tämän keksinnön tekijät tunnistivat lisäk- « 9 6 102907 si 215Gly:n, 67His:n, 126Leu:n, ,35Leu:n ja segmenteissä 97 -103, 126 - 129, 213 - 215 ja 152 - 172 olevien aminohappo-ryhmien olevan sellaisia ryhmiä, joilla on mielenkiintoisia ominaisuuksia, mutta mistään näissä asemissa olevista mu-5 taatioista ei ollut tarjottu esimerkkejä.

9 EP-patenttijulkaisussa 260 105 (GENENCOR) kuvataan katalyyttisen triadin sisältävissä entsyymeissä olevien tiettyjen ominaisuuksien modifiointia valitsemalla noin 15 Ä 10 etäisyydellä katalyyttisestä triadista oleva aminohapporyh-mä ja korvaamalla valittu aminohapporyhmä toisella ryhmällä. Tässä patenttikuvauksessa kuvatut subtilisiinityyppiset entsyymit on erityisesti mainittu kuuluvan sellaisten entsyymien luokkaan, joka sisältää katalyyttisen triadin.

15 Subtilisiineissä olevien asemien 222 ja 217 esitetään ole van edullisia asemia korvauksessa käytettäväksi.

Kansainvälisessä patenttijulkaisussa n:o WO 88/06 624 (GIST-BROCADES NV) kuvataan nimityksellä PB92 varustetun 20 subtilisiiniproteaasin DNA- ja aminohappojaksot, jotka ovat aminohappojakson suhteen miltei 100-%:sesti homologisia subtilisiini-309:n aminohappojakson suhteen.

Kansainvälisessä patenttijulkaisussa n:o WO 88/07 578 (GE-25 NENTECH) esitetään patenttivaatimuksia mutatoiduista ent- .... syymeistä, jotka ovat peräisin sellaisesta lähtömuotoisesta entsyymistä, jossa on korvattu tai modifioitu ainakin yksi aminohapporyhmän ainakin yksi katalyyttinen ryhmä. Nämä keksijät toteavat, että näin tehden saadaan käyttöön mu-30 tanttimuotoa oleva entsyymi, joka reagoi sellaisten subst raattien kanssa, jotka sisältävät modifioidun tai korvaamalla valmistetun katalyyttisen ryhmän (substraatin tukema katalyysi).

35 Yleinen teoria perustuu B. amyloliquefaciensin subtilisii- niin (BPN'), jossa on kuvattu asemassa MHis tehtyjä modifikaatioita, joissa tämä modifioitiin pelkästään wAla:ksi tai 7 102907 siten, että niihin liittyi "apu"-mutaatio Ser-24-Cys. Tässä on myös ehdotettu aminohapporyhmiin 32Asp ja “'Ser tehtäviä modifikaatioita ja Mapu"mutaatiota Ala-48-Glu.

5 Kansainvälisessä patenttijulkaisussa n:o 88/08 028 (GENEX) kuvataan geeniteknisin keinoin suoritettua metalli-ionia sitovien kohtien ympäristön muokkausta proteiinien stabi-loimiseksi. Myös tässä patenttijulkaisussa käytetään esimerkkinä subtilisiini-BPN*:ää ja siinä tähdennetään seuraa-10 vien aminohapporyhmien tärkeyttä substituutioehdokkaina: 172Pro (P172D, P172E) , 131Gly (G131D) , 76Asn (N76D, N76D+ P172D(E)) ja 78Ser (S78D) . Tässä ehdotetaan lisäksi yhdis-telmämutantteja, jotka ovat N76D+S78D+G131D+P172D(E), N76D+G131D, S78D+G131D, S78D+P172D(E) ja S78D+G131D+ 15 P172D(E).

Kansainvälisessä patenttijulkaisussa n:o WO 88/08 033 (AMGEN) kuvataan useita subtilisiinianalogeja, joilla on modifioitu kalsiumia sitova kohta ja missä tahansa molekyylissä 20 esiintyvässä Asn-Gly-jaksossa olevat joko Asn tai Gly on korvattu ja josta näin on saatu entsyymejä, joiden lämmön-ja pH:n kesto on parantunut. Yhden kalsiumia sitovista kohdista kuvataan liittyvän aminohapporyhmiin 4IAsp, 75Leu, 76Asn, ’’Asn, 78Ser, ^Ile, *°Gly, 81Val, 208Thr ja 214Tyr; toisia 25 mahdollisia kalsiumia sitovia kohtia ehdotetaan olevan kohdissa 140Asp ja 172Pro; uPro ja ’’'Gin; ja 172Pro ja 195Glu tai 197Asp. Tässä ehdotetaan myös 109Asn- ja 218Asn-asemien muta-toimista. Muodostettuihin mutantteihin kuuluvat N109S, N109S+N218S, N76D+N109S+N218S, N76D+N77D+N109S+N218S, N76-30 D+I79E+N109S+N218S.

Kansainvälisessä patenttijulkaisussa n:o WO 88/08 164 (GENEX) kuvataan menetelmä proteiinissa olevien sellaisten ryhmien tunnistamiseksi, jotka voidaan korvata kysteiinillä 35 mahdollisesti stabiloivien disulfidisidosten muodostuksen mahdollistamiseksi. Tämä menetelmä perustuu yksityiskohtaiseen tietämykseen proteiinin kolmiulotteisesta rakenteesta 8 102907 ja siinä käytetään tietokonetta asemien valitsemiseen. Subtilisiiniproteaasin osalta käytettiin mallisysteeminä subtilisiini-BPN':ä. Käyttäen tätä menetelmää subtilisiini-BPN':iin saatiin tulokseksi ehdotus, jonka mukaan disulfi-5 disidokset voidaan muodostaa li ehdokkaana olevaan ryhmään: (1: T22C+S87C, 2: V26C+L235C, 3: G47C+P57C, 4: M50C+N109C, 5: E156C+T164C, 6: V165C+K170C, 7: V165C+S191C, 8: Q206C+ A216C, 9: A230C+V270C, 10: I234C+A274C, 11: H238C+W241C).

10 Näistä tuotettiin 4 (l, 2, 4 ja 8), joista kahdesta ei saatu lainkaan stabiloivaa vaikutusta (2 ja 4). Lisäksi tuotettiin mutantteja, joissa oli yhdistetty kaksi näistä mutanteista keskenään ja yksi toisen mutaation kanssa, toisin sanoen T22C+S87C+N218S ja T22C+S87C+Q206C+A216C.

15 Tuotettiin myös lukuisia muita myönteiseen lopputulokseen johtamattomia mutantteja, toisin sanoen A1C+S78C, S24C+ S87C, K27C+S89C, A85C+A232C, I122C+V147C, S249C+A273C ja T253C+A273C.

20 Thomas, Russell ja Fersht, Nature 318 (1985) 375 - 376, ovat myös osoittaneet, että "Asp:n vaihto "Ser:ksi subti-lisiini-BPN':ssa muuttaa entsyymin pH-riippuvuutta.

Nämä samat tekijät tarkastelevat tämän jälkeen julkaisus-25 saan, J. Mol. Biol. 193 (1987) 803 - 813, 156Glu:n substi- tuoimista 156Ser:lla.

Kummatkin nämä mutaatiot ovat noin 15 Ä etäisyydellä aktiivisesta “Hisjsta.

30

Russel ja Fersht tarkastelevat julkaisussa Nature 328 (1987) 496 - 500 kokeidensa tuloksia ja esittävät sääntöjä, joiden mukaan pH-aktiivisuus-profiilien muuttaminen entsyymejä mutatoimalla tulisi suorittaa, jotta näiden pinnan 35 varaus saataisiin muuttumaan.

Isoelektrinen piste (pl0) 9 102907

Isoelektrinen piste, pl0, määritellään siksi pH-arvoksi, jossa entsyymimolekyylikompleksi (siihen mahdollisesti liittyneiden metalli- tai muiden ionien kanssa) on neutraali, ts. kompleksissa olevien sähköstaattisten varausten 5 (sähköstaattinen nettovaraus, =NEC) on 0. Tätä summaa muo dostettaessa on luonnollisesti huomioitava yksittäisten sähköstaattisten varausten positiivinen tai negatiivinen luonne.

10 Isoelektrinen piste lasketaan kätevästi käyttäen tasapai- nolähtökohtia ja käyttäen kyseessä olevassa entsyymissä olevien eri varauksellisten ryhmien pK-arvoja ja käyttämällä tämän jälkeen iterointia sen pH-arvon hakemiseksi, jossa entsyymimolekyylin NEC on 0.

15 Tämän laskutavan yksi ongelma on se, että varauksellisten ryhmien pK-arvot ovat ympäristöstä riippuvia ja tämän vuoksi ne vaihtelevat. Voidaan kuitenkin saada hyvin hyviä tuloksia antamalla varatuille ryhmille tietyt likimääräiset 20 pK-arvot todellisesta arvosta riippumatta. On myös mahdollista suorittaa pitkälle meneviä laskutoimituksia, joissa ympäristö on otettu osittain huomioon.

pl0 voidaan myös määrittää kokeellisesti isoelektrisellä 25 fokusoinnilla tai titraamalla entsyymin sisältävä liuos.

Varauksellisten ryhmien eri pK-arvot myös määrittää kokeellisesti titraamalla.

Subtilisiinien teolliset sovellutukset 30 Proteaaseilla, kuten subtilisiineilla, on ollut paljon käyttöä teollisuudessa, erityisesti detergenttiformulaati-oissa, koska nämä ovat käyttökelpoisia proteiinilian poistoon.

35 Nykyisin tunnetaan seuraavat proteaasit ja useita niistä markkinoidaan suurina määrinä maailman monissa maissa.

1β 102907

Subtilisiini-BPN' eli Novo, joka on saatavilla esim yhtiöstä SIGMA, St. Louis, U.S.A.;

Subtilisiini-Carlsberg, jota markkinoi Novo-Nordisk a/s 5 (Tanska) tuotenimellä ALCALASE* ja IBIS (Alankomaat) tuo- tenimellä MAXATASE*; f

Bacillus lentus -subtilisiini, jota markkinoi NOVO INDUSTRI A/S (Tanska) tuotenimellä SAVINASE*; 10

Entsyymit, jotka muistuttavat läheisesti SAVINASE*:a, kuten MAXACAL*, jota markkinoi yhtiö IBIS, ja OPTICLEAN*, jota markkinoi MILES KALI CHEMIE (Saksan Liittotasavalta).

15 Bacillus lentus -subtilisiini, jota markkinoi Novo-Nordisk a/s (Tanska) tuotenimellä ESPERASE*; KAZUSASE*, jota markkinoi SHOWA DENKO (Japani).

20 Jotta nämä entsyymit olisivat tehokkaita, niillä ei ainoastaan tule olla aktiivisuutta pesuolosuhteissa, vaan niiden on myös oltava yhteensopivia muiden detergentin komponenttien kanssa detergentin tuotannon ja varastoinnin aikana.

25 Esimerkiksi subtilisiineja voidaan käyttää yhdessä muita substraatteja vastaan aktiivisten entsyymien kanssa ja valitun subtilisiinin tulisi omata stabiilisuutta sellaisia entsyymejä vastaan ja valitun subtilisiinin ei myöskään tulisi edullisesti katalysoida muiden entsyymien pilkkoutu-30 mistä. Valitun subtilisiinin tulisi myös olla vastustuskykyinen detergenttiformulaatiossa olevia muita komponentteja, kuten valkaisuaineita, hapettimia jne., vastaan ja detergenttiformulaatiossa käytettävän entsyymin tulisi erityisesti kestää niitä hapettumista aiheuttavia ja kal-35 siumia sitovia ominaisuuksia ja pH-olosuhteita, jotka muodostuvat ei-entsymaattisista komponenteista detergenttiin sen varastoinnin aikana ja pesuliuokseen pesun aikana.

11 102907

Entsyymin kyky katalysoida luonnossa esiintyvien erilaisten substraattien pilkkoutumista pesukohteissa, esimerkiksi pesun aikana, nimitetään usein sen pesukyvyksi, pesemisky-vyksi, detergenttiydeksi tai pesutehokkuudeksi. Tässä pa-5 tenttihakemusjulkaisussa tämän ominaisuuden kuvaamiseen käytetään termiä pesutehokkuus.

Luonnossa esiintyvillä subtilisiineilla on havaittu olevan pesutehokkuuteen tai pesemiskykyyn liittyviä ominaisuuksia, 10 jotka vaihtelevat voimakkaasti muuttujien, kuten pH:n, vaihdellessa. Useat näistä edellä mainituista markkinoiduista detergenttiproteaasista ovat tehokkuudeltaan parempia kuin noin 20 vuotta sitten markkinoidut proteaa-sit, mutta optimaalisen tehokkuuden osalta kullakin entsyy-15 millä on omat spesifiset formulaatioon ja pesuolosuhteisiin liittyvät vaatimuksensa, esim. pH, lämpötila, ionivahvuus (= I), aktiivinen systeemi (tensidit, pinta-aktiiviset aineet, valkaisuaineet jne.), tehoaineet, jne.

20 On siksi havaittu, että entsyymi, jolla on haluttavia ominaisuuksia matalassa pH:ssa ja matalassa I:ssa, voi olla vähemmän houkutteleva käyttää emäksisemmissä olosuhteissa ja korkeassa I:ssa tai entsyymi, jolla on laadukkaat ominaisuudet korkeassa pH:ssa ja korkeassa I:ssa, voi olla 25 vähemmän houkutteleva käytettäväksi olosuhteissa, jossa pH

ja I ovat matalia.

Yhdistelmä-DNA-tekniikan syntymisellä ja kehittymisellä on ollut huomattava vaikutus proteiinikemian alalla.

30

On nähtävissä, että näillä menetelmillä on mahdollista suunnitella peptidejä ja proteiineja, kuten entsyymejä ja hormoneja, ominaisuuksiltaan halutunlaisiksi, joka mahdollistaa halutut ominaisuudet omaavien yhdisteiden valmista-35 misen.

12 102907

Nykyisin on mahdollista konstruoida haluttuja aminohappo-jaksoja omaavia entsyymejä, ja, kuten edellä mainittiin, ominaisuuksiltaan muunnettujen subtilisiinien suunnittelua on tutkittu kohtalaisen runsaasti. Tehtyjen ehdotusten 5 joukkoon kuuluva menetelmä, jolla muodostetaan ja seulotaan suuri määrä mutatoituja entsyymejä ja joka on kuvattu EP-

L

patenttijulkaisussa n:o 130756 (GENENTECH) (US-patenttijulkaisu n:o 4 760 025 (GENENCOR)) ja kansainvälinen patenttijulkaisu n:o W0 87/05 050 (GENEX), vastaa klassista mene-10 telmää, jossa eristetään natiiveja entsyymejä ja seulotaan niistä niiden ominaisuudet, mutta on tätä tehokkaampaa, koska tiedetään, että tällöin esiintyy suuri määrän erilaisia mutanttientsyymejä.

15 Koska subtilisiinientsyymi käsittää tyypillisesti 275 aminohapporyhmää, joista kukin voi olla yksi 20:stä mahdollisesta luonnossa esiintyvästä aminohaposta, on yksi tässä menetelmässä esiintyvä hyvin vakava puute se, että on valmistettava suuri joukko alustavan tutkimuksen vaativia 20 mutaatioita, jonka jälkeen ensimmäisessä seulonnassa ominaisuuksiltaan mielenkiintoisiksi osoittautuneet valikoidut mutantit on tutkittava tarkemmin, koska ei ole olemassa suuntaviivoja niiden aminohapporyhmien määrittelemiseksi, jotka tulisi muuttaa sellaisen halutun entsyymin saamisek-25 si, jonka ominaisuudet kyseeseen tulevan käyttömuodon, kuten tässä tapauksessa pesutehokkuudeltaan tietyissä pesu- « liuoksen olosuhteissa paremmat ominaisuudet omaavan deter-genttikoostumusten formuloinnin, osalta olisivat paremmat.

Näissä patenttihakemusjulkaisuissa hahmoteltu menetelmä on 30 tämän vuoksi vain hieman parempi kuin jo useita vuosia tunnetut perinteiset satunnaismutaatiomenetelmät.

Muut tunnetut menetelmät liittyvät tiettyjen ominaisuuksi-en, kuten transesterifioinnin ja hydrolyysinopeuden (EP-patenttijulkaisu 260 105 (GENENCOR), pH-aktiivisuus-profii-35 Iin (Thomas, Russel ja Fersht, katso yllä) ja substraattis-

pesifisyyden (kansainvälinen patenttijulkaisu n:o WO

» 13 102907 88/07 578 (GENENTECH), muuttamiseen. Mikään näistä julkaisuista ei liity entsyymien pesutehokkuuden muuttamiseen.

On kehittynyt vielä yksi tekniikka, jossa proteiinien kol-5 miulotteisesta rakenteesta saatua yksityiskohtaista informaatiota käytetään tiettyjen aminohappojen substituutiosta aiheutuvien mahdollisten seurausten analysointiin. Tätä lähestymistapaa on käytetty ja ne on kuvattu patenttijulkaisuissa EP 260 105 (GENENCOR), WO 88/07 578 (GENENTECH), WO 10 88/08 028 (GENEX), WO 88/08033 (AMGEN) ja WO 88/08 164 (GENEX).

Kuten edellä mainittiin, ei siten ole vielä tunnistettu suhdetta, joka vallitsee entsyymin, kuten jonkin edellä 15 mainituista entsyymeistä, tarkoin määriteltyjen ominaisuuksien ja entsyymin pesutehokkuuden välillä.

Kansainvälisessä patenttihakemusjulkaisussa n:o PCT/DK 88/00 002 (NOVO INDUSTRI A/S) tehdään se ehdotus, että käy-20 tettäisiin homologiaan perustuvan vertaamisen käsitettä sen määrittämiseksi, mikä aminohappoasema tulisi valita muta-toitavaksi ja millä aminohapolla näissä asemissa olevat aminohapot tulisi korvata pesutehokkuuteen vaikuttavan muutoksen aikaansaamiseksi.

25 Tätä menetelmää käyttäen pienenee seulontatyö huomattavasti, koska valmistettujen mutaatioiden määrä on paljon pienempi, mutta on ennakoitavissa, että tällä menetelmällä voidaan saada ainoastaan sellaisia entsyymejä, joilla esiintyy läh-30 tömuotoa edustavan entsyymin ja vertailussa käytetyn entsyymin yhdistettyjä käyttökelpoisia ominaisuuksia.

Ongelma näyttää olevan se, että vaikka entsyymiaktiivisuuden mekanismin selvittämiseen on kohdistettu runsaasi tut-35 kirnusta, on kuitenkin vain vähän tietoa niistä rakenteeseen ja aminohapporyhmien yhdistelmiin liittyvistä tekijöistä, jotka määräävät entsyymien pesutehokkuutta koskevat ominaisuudet .

14 102907 Tämän vuoksi sekä siksi, että ymmärrettäisiin paremmin puhdistus- tai detergenttikoostumuksien käytännön sovellutuksiin liittyvää proteaasien vaikutusmekanismia, on vielä tarvetta parantaa ja muokata entsyymejä pesusysteemeihin 5 soveltuviksi. Tämän ymmärtämisen perusteella voitaisiin johtaa sääntöjä, joita voitaisiin soveltaa sellaisten mutaatioiden valitsemiseen, jotka kohtuullisella varmuudella johtaisivat sellaisen entsyymin aikaansaamiseen, jonka pe-sutehokkuus tietyissä pesunesteen olosuhteissa olisi paran-10 tunut.

Keksinnön yhteenveto Näiden ongelmien tarkemmat tutkimukset ovat nyt yllättäen osoittaneet, että yksi niistä ratkaisevista tekijöistä, 15 jotka liittyvät subtilisiinientsyymien käyttöön detergent- tikoostumuksissa, on entsyymin adsorptio substraattiin, ts. tekstiileistä, kovilta pinnoilta tai muista puhdistettavista materiaaleista poistettavaan substraattiin.

20 Näin ollen tämän keksinnön mukaisesti on aikaansaatu subti- lisiinigeenin mutaatioita, jotka on saatu aikaan asemassa 27 olevassa aminohapporyhmässä tämän ryhmän deleetiolla tai substituutiolla, jolloin tuloksena on tällaisen mutatoidun geenin ilmentämän mutatoidun subtilisiinientsyymin joko 25 korkeampi tai alempi isoelektrinen pH (plo) , ja tämän ansi- • · osta mainitun subtilisiinientsyymin mutatoituneen muodon käyttäytyminen detergenttikoostumuksissa on aiempaan verrattuna parantunut.

30 Mutaatiot muodostetaan lähtömuotona olevaan subtilisiini- geeniin, joka vastaa subtilisiinientsyymin asemassa 27 olevan tietyn aminohapon ilmentymisestä.

Tämä keksintö liittyy osaksi, mainittuihin kuitenkaan ra-35 joittumatta, subtilisiini-309:n ja subtilisiini Carlsbergin geenien mutaatioihin ja näistä saatuihin mutatoituneisiin subtilisiini-309- ja subtilisiini Carlsberg -entsyymeihin, 15 102907 joiden pesuteho erilaisissa, eri pH-arvoisiin pesuliuoksiin johtavissa detergenttikoostumuksissa on parantunut.

Tämä keksintö liittyy lisäksi mutatoituneiden entsyymien 5 käyttöön puhdistuskoostumuksissa ja mutatoituneita entsyymejä käsittäviin puhdistuskoostumuksiin, erityisesti mutatoituneita subtilisiinientsyymejä käsittäviin detergentti-koostumuksiin.

10 Lyhenteet A = Ala Alaniini V = Vai Väliini L = Leu Leusiini I = Ile Isoleusiini 15 P = Pro Proliini F = Phe Fenyylialaniini W = Trp Tryptofaani M = Met Metioniini G = Gly Glysiini 20 S = Ser Seriini T = Thr Treoniini C = Cys Kysteiini Y - Tyr Tyrosiini N Asn Asparagiini 25 Q - Gin Glutamiini • · - D - Asp Asparagiinihappo E - Glu Glutamiinihappo K - Lys Lysiini R = Arg Arginiini 30 H = His Histidiini

Nukleiinihappojen emäkset A = Adeniini G - Guaniini 35 C - Sytosiini T - Tyrniini (vain DNA:ssa) U = Urasiili (vain RNA:ssa) 16 102907

Mutaatiot Tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen tai valmistettavaksi aiottujen mutanttien kuvaamiseksi otettiin käyttöön seuraavat nimitystavat niissä käytetyn joustavan viittaus-5 tavan vuoksi:

Alkuperäinen(set) aminohappo (-hapot), aseina (asemat), substituoitu(dut) aminohappo (-hapot).

10 Tämän mukaisesti asemassa 195 olevan glysiinin korvaaminen glutamiinihapolla merkitään seuraavasti:

Gly 195 Glu eli G195E

15 samassa asemassa olevan glysiinin deleetio:

Gly 195 1 tai G1951 ja ylimääräisen aminohapporyhmän, kuten lysiinin, lisäämi-20 nen samaan asemaan, on:

Gly 195 GlyLys tai G195GK

Silloin kun taulukossa 1 esitetään deleetio tai se esiintyy 25 sellaisessa subtilisiinissa, jota ei ole esitetty taulukos- • - sa 1, tällaisessa asemassa tapahtuva insertio merkitään seuraavasti: 35 36 Asp eli 136D 30 .. Rinnakkaiset mutaatiot erotetaan +-merkeillä, toisin sa- ' noen:

Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu eli R170Y+G195E, jotka edustavat asemissa 170 ja 195 olevia mutaatioita, joissa arginiini ja glysiini korvataan tyrosiinilla ja glutamiinihapolla, tässä järjestyksessä mainittuna.

17 102907

Taulukko 1

Eri proteaasien aminohappojaksojen vertailu 5 a = subtilisiini-BPN· (Wells et ai, 1983, ks. edellä) b * subtilisiini amylosacchariticus (Kurihara et ai., 1972, ks. edellä) c = subtilisiini-168 (Stahl ja Ferrari, 1984, ks. edellä) d = subtilisiini mesenterikopeptidaasi (Svendsen et ai., 10 1986, ks. edellä) e - subtilisiini-DY (Nedkov et ai., 1985, ks. edellä) f - subtilisiini Carlsberg (Smith et ai., 1968, ks. edellä) g « subtilisiini Carlsberg (Jacobs et ai., 1985, ks. edel-15 lä) h = subtilisiini-309 (kansainvälinen patenttihakemusjulkaisu n:o PCT/DK 88/00 002) i = subtilisiini-147 (kansainvälinen patenttihakemusjul-kaisu n:o PCT/DK 88/00 002) 20 j = termitaasi (Meloun et ai., 1985, ks. edellä) k * proteinaasi-K (Betzel et ai., Eur. J. Biochem. 178 (1988) 155 ff), ja Gunkel et ai., Eur. J. Biochem. 179 (1989) 185 ff) 1 - akvalysiini (Kwon et ai., Eur. J. Biochem. 173 (1988) 25 491 ff) m - Bacillus PB92 -proteaasi (Eurooppalainen patenttijulkaisu No. 0 283 075) n = Proteaasi-TW7 (Tritirachium album) (kansainvälinen patenttihakemusjulkaisu n:o PCT/US88/01 040) 30 o = Proteaasi-TW3 (Tritirachium album) (kansainvälinen patenttihakemusjulkaisu n:o PCT/US88/01 040) : * = merkitty deletoiduksi \ , 18 102907 n:o 1 10 a) *-*-*-*—*-*-*-A-Q-S-*-V-P-Y-G-V-S-Q-I-K—*-*-*-*-*-A-P-A- b) *_*_*_*_*_*_*_a_q-s-*-V-P-Y-G-I-S-Q-I-K-*-*-*-*-*-A-P-A- c) *_*_*_*_*_*_*-A_q_s-*-V-P-Y-G-I-S-Q-I-K-*-*-*-*-*-A-P-A- 5 d) *-*-*-*-*-*-*-a-Q-S-*-V-P-Y-G-I-S-Q-I-K-*-*-*-*-*-A-P-A- e) *—* — * — *—* — *—*—A—Q—S—*—V—P—Y—G-I—S-Q—I-K—*-*—*—*-*—A—P—A— f) *_*_*_*_*_*_*-A_q_t-*-V-P-Y-G-I-P-L-I-K-*-*-*-*-*-A-D-K- h) *_*_*-*_*_*_*_a_q-s-*-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-*-*-*-*-*-A-P-A- 10 j) Y-T-P-N-D-P-Y-F-S-S-*-R-Q-Y-G-P-Q-K-I-Q-*-*-*-*-*-A-P-Q- k) *-*-*-*-*-*-A-A-Q-T-N-A-P-W-G-L-A-R-I-S-S-T-S-P-G-T-S-T- l) *_*_*_*_*_*_A_T_q_s-P-A-P-W—G—L—D—R—I—D—Q—R—D-L-P—L-S-N- m) *—*—*—*—*—*—*—A—Q—S—*—V—P—W—G—I—S—R—V—Q—*—*—*—*—*—A—P—A— n) *_*_*_*_*_*-A-T-Q-E-D-A-P-W-G-L-A-R-I-S-S-Q-E-P-G-G-T-T- 15 O) *-*-*-*-*-*-a-E-Q-R-N-A-P-W-G-L-A-R-I-S-S-T-S-P-G-T-S-T- n:o 20 30 40 a) L-H-S-Q-G-Y-T-G-S-N-V-K-V-A-V-I-D-S-G-I—D-S-S-H-P-D-L-*- b) L-H-S-Q—G—Y-T—G-S-N-V—K—V-A-V—I—D—S—G-I—D-S-S—H-P—D—L-*- 20 c) L-H-S-Q-G-Y-T-G-S-N-V-K-V-A-V-I-D-S-G-I-D-S-S-H-P-D-L-*- d) L—H-S—Q—G-Y—T—G—S-N—V-K—V—A-V-I—D—S—G-I—D-S-S—H-P-D—L-*- e) V-Q-A-Q-G-Y-K-G-A-N-V-K-V-G-I-I-D-T-G-I-A-A-S-H-T-D-L-*- f) V-Q-A-Q-G-F-K-G-A-N-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I—Q-A-S-H-P-D-L-*- g) V-Q-A-Q-G-F-K-G-A-N-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-Q-A-S-H-P-D-L-*- 25 h) A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-1—*-S-T-H-P-D-L-*- i) A-H-N-R-G-1-F-G-N-G-A-R-V-A-V-L-D-T-G-1—*-A-S-H-P-D-L-*- j) A—W—*—D—I—A—E—G—S—G—A—K—I-A-I—V—D—T—G—V—Q—S—N—H—P—D—L—A— k) Y-Y-Y-D—E-S-A—G-Q-G-S—C—V-Y—V-I—D—T-G-I—E-A—S-H-P-E—F—*- l) S-Y-T-Y-T-A-T—G-R-G-V-N—V-Y—V-I-D—T-G-I—R-T—T-H-R-E—F-*- 30 m) A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-*-S-T-H-P-D-L-*- n) Y-T-Y-D-D-S-A-G-T-G-T-C-A-Y-I-I-D-T-G-I-Y-T-N-H-T-D-F-*-O) Y—R-Y—D-D-S-A-G—Q—G-T-C-V—Y—V—I-D-T-G—V—E—A—S-H-P-E—F-*- „ 102907 n:o 50 60 a) *-K-V-A-G-G-A-S-M-V-P-S-E-T-N-P-F-*-*-Q-D-N-N-S-H-G-T-H-V- b) *-N-V-R-G-G-A-S-F-V-P-S-E-T-N-P-Y-*-*-Q-D-G-S-S-H-G-T-H-V- C) *-N-V-R-G-G-A-S-F-V-P-S-E-T-N-P-Y-*-*-Q-D-G-S-S-H-G-T-H-V- 5 d) *-N-V-R-G-G-A-S-F-V-P-S-E-T-N-P-Y-*-*-Q-D-G-S-S-H-G-T-H-V- e) *-K-V-V-G-G-A-S-F-V-S-G-E-S-*-Y-N-*-*-T-D-G-N-G-H-G-T-H-V- f) *-N-V-V-G-G-A-S-F-V-A-G-E-A-*-Y-N-*-*-T-D-G-N-G-H-G-T-H-V- g) *-N-V-V-G-G-A-S-F-V-A-G-E-A-*-Y-N-*-*-T-D-G-N-G-H-G-T-H-V- h) *-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-*-S-T-*-*-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V- 10 i) *-R-I-A-G-G-A-S-F-I-S-S-E-P-*-S-Y-*-*-H-D-N-N-G-H-G-T-H-V- j) G-K-V-V-G-G-W-D-F-V-D-N-D-S-T-P-*-*-*-Q-N-G-N-G-H-G-T-H-C- k) *-*-*-E-G-R-A-Q-M-V-K-T-Y-Y-Y-S-S-*-*-R-D-G-N-G-H-G-T-H-C- l) *-*-*-G-G-R—A-R-V—G—Y-D—A—L-G—G—N—G-*—Q-D-C-N—G—H—G—T-H-V- m) *-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-*-S-T-*-*-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V- 15 n) *-*-*-G-G-R-A-K-F-L-K-N-F-A-G-D-G-Q-D-T-D-G-N-G-H-G-T-H-V- 0) *-*-*-E-G-R-A-Q-M-V-K-T-Y-Y-A-S-S-*-*-R-D-G-N-G-H-G-T-H-C- n:o 70 80 90 a) A-G-T-V-A-A-L-*-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-S-L-Y-A-V-K-V-20 b) A-G-T-I-A-A-L-*-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-S-L-Y-A-V-K-V- c) A-G-T-I-A-A-L-*-N-N-S-I-G-V-L-G-V-S-P-S-A-S-L-Y-A-V-K-V- d) A-G-T-I-A-A-L-*-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-S-L-Y-A-V-K-V- e) A-G-T-V-A-A-L-*-D-N-T-T-G-V-L-G-V-A-P-N-V-S-L-Y-A-I-K-V- f) A-G-T-V-A-A-L-*-D-N-T-T-G-V-L-G-V-A-P-S-V-S-L-Y-A-V-K-V- 25 g) A-G-T-V-A-A-L-*-D-N-T-T-G-V-L-G-V-A-P-S-V-S-L-Y-A-V-K-V- h) A-G-T-I-A-A-L-*-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-E-L-Y-A-V-K-V- 1) A-G-T-I-A-A-L-*-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-S-A-D-L-Y-A-V-K-V- j) A-G-I-A-A-A-V-T-N-N-S-T-G-I-A-G-T-A-P-K-A-S-I-L-A-V-R-V- k) A-G-T-V-G-S-*-R-*-*-*-*-*-T-Y-G-V-A-K-K-T-Q-L-F-G-V-K-V- 30 1) a-G-T-I-G-G-V-*-*-*-*-*-*-T-Y-G-V-A-K-A-V-N-L-Y-A-V-R-V- m) A-G-T-I-A-A-L-*-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V- n) A-G-T-V-G-G-T-*-*-*-*-*-*-t-Y-G-V-A-K-K-T-S-L-F-A-V-K-V- o) A-G-T-I-G-S-*-R-*-*-*-*-*-T-Y-G-V-A-K-K-T-Q-I-F-G-V-K-V- 20 102907 n:o 100 110 120 a) L-G-A-D-G-S-G-Q-Y-S-W-I-I-N-G-I-E-W-*-A-I-A-»-N-N-M-D-*- b) L-D-S-T-G-S-G-Q-Y-S-W-I-I-N—G-I-E-W-*-A—I-A—*-N-N-M-D-*- 5 c) L-D-S-T—G-S-G-Q-Y-S-W-I—I-N-G-I-E-W-*-A-I—A-*-N-N-M-D-*- d) L-D-S-T-G-S-G-Q-Y-S-W-I-I-N-G-I-E-W-*-A-I-A-*-N-N-M-D-*- e) L-N-S-S-G-S-G-T-Y-S-A-I-V-S-G-I-E-W-*-A-T-Q-*-N-G-L-D-*- f) L-N-S-S-G-S-G-S-Y-S-G-I-V-S-G-I-E-W-*-A-T-T-*-N-G-M-D-*- g) L-N-S-S-G-S-G-T-Y-S-G-I-V-S-G-I-E-W-*-A-T-T-*-N-G-M-D-*- 10 h) L-G-A-S-G-S—G-S-V-S-S-I-A-Q—G-L-E-W-*-A-G-N-*-N-G-M-H-*- i) L-D-R-N-G-S-G-S-L-A-S-V-A-Q-G-I-E-W-*-A-I-N-*-N-N-M-H-*- j) L—D-N—S-G-S—G-T-W-T—A-V—A—N-G—I—T—Y—*—A—A—D—*—Q-G—A—K—*- k) l-d-d-n-g-s-g-q-y-s-t-i-i-a-g-m-d-f-v-a-s-d-k-n-n-r-n-c- l) L-D-C-N-G-S-G-S-T-S-G-V-I-A-G-V-D-W-V-*-T-*-R-N-H-R-R-P- 15 m) L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-*-A-G-N-*-N-G-M-H-*- n) L—D-A-N-G—Q—G-S—N-S-G-V-I—A-G-M—D-F—V—T-K-D-A-S-S-Q-N-C- 0) L-N-D-Q-G-S-G-Q-Y-S-T-I-I-S-G-M-D-F-V-A-N-D-Y-R-N-R-N-C- n:o 130 140 20 a) *-*-*-*-V-I-N-M-S-L-G-G-P-S-G-S-A-A-L-K-A-A-V-D-K-A-V-A- b) *—*—*—*—V—X—N—M—S—L—G—G—P—S—G—S—T—A—L—K—T—V—V—D-K—A—V—S— C) *-*_*_*_v-I-N-M-S-L-G-G-P-T-G-S-T-A-L-K-T-V-V-D-K-A-V-S- d) *-*-*-*-V-I-N-M-S-L-G-G-P-T-G-S-T-A-L-K-T-V-V-D-K-A-V-S- e) *-*-*-*-V-I-N-M-S-L-G-G-P-S-G-S-T-A-L-K-Q-A-V-D-K-A-Y-A- 25 f) *—*—*-*-V-I—N-M-S-L-G—G—A-S—G-S-T-A-M-K-Q-A—V—D-N-A-Y-A- g) *_*_*_* _v-1-N-M-S-L-G-G-P-S-G-S-T-A-M-K-Q-A-V-D-N-A-Y-A- h) *-*-*-*-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-i j *-*-*-*-I-I-N-M-S-L-G-S-T-S-G-S-S-T-L-E-L-A-V-N-R-A-N-N-jj *-*-*-*-V-I-S-L-S-L-G-G-T-V-G-N-S-G-L-Q-Q-A-V-N-Y-A-W-N- 30 k) P-K-G-V-V-A-S-L-S-L-G-G-G-Y-S-S-S-V-N-S-A-A-A-*-R-L-Q-S- 1) A-*-*-*-V-A-N-M-S-L-G-G-G-V-*—S—T-A—L—D-N-A—V—K—N—S—I-A- m) *-*-*-*—V—A—N—L—S—L—G—S—P—S—P—S—A—T—L—E—Q—A—V—N—S—A—T—S— n) P-K-G-V-V-V-N-M-S-L-G-G-P-S-S-S-A-V-N-R-A-A-A-*-E-I-T-S-O) P-N-G-V-V-A-S-M-S-I-G-G-G-Y-S-S-S-V-N-S-A-A-A-*-N-L-Q-Q- _ X .

21 102907 n:o 150 160 170 a) S-G-V-V-V-V-A-A-A-G-N-E-G-T-S-G-S-S-S-T-V-G-Y-P-G-K-Y-P- b) S-G-I-V-V-A-A-A-A-G-N-E-G-S-S-G-S-S-S-T-V-G-Y-P-A-K-Y-P-C) S-G-I-V-V-A-A-A-A-G-N-E-G-S-S-G-S-T-S-T-V-G-Y-P-A-K-Y-P- 5 d) S-G-I-V-V-A-A-A-A-G-N-E-G-S-S-G-S-T-S-T-V-G-Y-P-A-K-Y-P- e) S-G-I-V-V-V-A-A-A-G-N-S-G-S-S-G-S-Q-N-T-I-G-Y-P-A-K-Y-D- f) R-G-V-V-V-V-A-A-A-G-N-S—G-N-S-G-S-T-N-T-I—G-Y-P-A-K-Y-D- g) R-G-V-V-V-V-A-A-A-G-N-S-G-S-S-G-N-T-N-T-I-G-Y-P-A-K-Y-D- h) R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-*-G-S-I-S-*-*-*-Y-P-A-R-Y-A- 10 i) A-G-I-L-L-V-G-A-A-G-N-T-G-R-*-Q-G-V-N-*-*-*-Y-P-A-R-Y-S- j) K-G-S-V-V-V-A-A-A-G-N-A-G-N-T-A-P-N-*-*-*-*-Y-P-A-Y-Y-S- k) S-G-V-M-V-A-V-A-A-G-N-N-N-A-D-A-R-N-Y-S-*-*-*-P-A-S-E-P- l) A-G-V—V—Y—A-V-A—A—G-N-D—N—A-N-A—C—N-Y-S—*-*-*-P-A-R-V-A- m) R—G-V—L—V-V-A—A—S—G-N—S—G—A—*—G—S—I-S-*—*—*~Y-P—A—R—Y—A— 15 n) A-G-L-F-L-A-V-A-A-G-N-E-A-T-D-A-S-S-S-S-*-*-*-P-A-S-E-E- 0) S-G-V-M-V-A-V-A-A-G-N-N-N-A-D-A-R-N-Y-S-*-*-*-P-A-S-E-S- n:o 180 190 200 a) S—V-I—A—V—G—A-V-D—S-S—N—Q-R-A—S-F—S-S—V—G—P—E—L-D-V—M-A— 20 b) S-T-I-A-V-G-A-V-N-S-S-N-Q-R-A-S-F-S-S-A-G-S-E-L-D-V-M-A- C) S-T-I-A-V-G-A-V-N-S-S-N-Q-R-A-S-F-S-S-A-G-S-E-L-D-V-M-A- d) S-T-I-A-V-G-A-V-N-S-A-N-Q-R-A-S-F-S-S-A-G-S-E-L-D-V-M-A- e) S-V-I-A-V-G-A-V-D-S-N-K-N-R-A-S-F-S-S-V-G-A-E-L-E-V-M-A- f) S-V-I-A-V-G-A-V-D-S-N-S-N-R-A-S-F-S-S-V-G-A-E-L-E-V-M-A- 25 g) S-V-I-A-V-G-A-V-D-S-N-S-N-R-A-S-F-S-S-V-G-A-E-L-E-V-M-A- h) N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A- 1) G-V-M-A-V-A-A-V-D-Q-N-G-Q-R-A-S-F-S-T-Y-G-P-E-I-E-I-S-A- j) N-A-I-A-V-A-S-T-D-Q-N-D-N-K-S-S-F-S-T-Y-G-S-V-V-D-V-A-A- k) S-V-C-T-V-G-A-S-D-R-Y-D-R-R-S-S-F-S-N-Y-G-S-V-L-D-I-F-G- 30 1) E-A-L-T-V-G-A-T-T-S-S-D-A-R-A-S-F-S-N-Y-G-S-C-V-D-L-F-A- m) N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A- n) S-A-C-T-V-G-A-T-D-K-T-D-T-L-A-E-Y-S-N-F-G-S-V-V-D-L-L-A-O) S-I-C-T-V-G-A-T-D-R-Y-D-R-R-S-S-F-S-N-Y-G-S-V-L-D-I-F-A- 22 102907 n:o 210 220 a) P-G-V-S-I-Q-S-T-L-P-G-N-*-K-*-Y-G-A-Y-N-G-T-S-M-A-S-P-H- b) P-G-V-S-I-Q-S-T-L-P-G-G—*-T-*-Y-G-A-Y-N—G-T-S-M-A-T-P-H- 5 c) P-G-V-S-I-Q-S-T-L-P-G-G-*-T-*-Y-G-A-Y-N-G-T-5-M-A-T-P-H- d) P-G-V-S-I-Q-S-T-L-P-G-G-*-T-*-Y-G-A-Y-N-G-T-S-M-A-T-P-H- e) P-G-V-S-V-Y-S-T-Y-P-S-N-*-T-*-Y-T-S-L-N-G-T-S-M-A-S-P-H- f) P-G-A-G-V-Y-S-T-Y-P-T-N-*-T-*-Y-A-T-L-N-G-T-S-M-A-S-P-H- g) P-G-A-G-V-Y-S-T-Y-P-T-S-*-T-*-Y-A-T-L-N-G-T-S-M-A-S-P-H- 10 h) P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-*-T-*-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H- i) P-G-V-N-V-N-S-T-Y-T-G-N-*-R-*-Y-V-S-L-S-G-T-S-M-A-T-P-H- j) P-G-S-W-I-Y-S-T-Y-P-T-S-*-T-*-Y-A-S-L-S-G-T-S-M-A-T-P-H- k) P-G-T-S-I-L-S-T-W-I-G-G-*-S-*-T-R-S-I-S-G-T-S-M-A-T-P-H- l) P-G-A-S-I-P-S-A-W-Y-T-S-D-T-A-T-Q-T-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H- 15 m) P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-*-T-*-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H- n) P-G-T-D-I-K-S-T-W-N-D-G-R-T-K-I-I-S-*-»-G-T-S-M-A-S-P-H- 0) P-G-T-D-I-L-S-T-W-I-G-G-S-T-R-S-I-S-*-*-G-T-S-M-A-T-P-H- n:o 230 240 250 20 a) V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-N-W-T-N-T-Q-V-R-S-S-L-E-N-T-T- b) V—A-G-A—A-A—L—I—L-S—K-H—P-T-W-T—N—A-Q-V—R—D-R—L—E—S—T-A-C) V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-T-W-T-N-A-Q-V-R-D-R-L-E-S-T-A- d) V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-T-W-T-N-A-Q-V-R-D-R-L-E-S-T-A- e) V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-Y-P-T-L-S-A-S-Q-V-R-N-R-L-S-S-T-A- 25 f) V-A-G-A-A-A-L-I-L-S-K-H-P-N-L-S-A-S-Q-V-R-N-R-L-S-S-T-A- g) V-A-G—A-A-A—L—I—L—S-K—H-P-N-L—S—A-S-Q-V-R—N-R-L—S—S—T—A— h) V—A—G—A-A—A-L-V—K-Q-K-N-P—S-W—S—N-V—Q-I—R-N-H—L-K-N-T—A- 1) V-A-G-V-A-A-L-V-K-S-R-Y-P-S-Y-T-N-N-Q-I-R-Q-R-I-N-Q-T-A- j) V-A-G-V-A-G-L-L-A-S-Q-G-R-S-*-*-A-S-N-I-R-A-A-I-E-N-T-A- 30 k) V-A-G-L-A-A-Y-L-M-T-L-G-K-T-T-A-A-S-A-C-R-*-Y-I-A-D-T-A- l) V-A-G-V-A-A-L-Y-L-E-Q-N-P-S-A-T-P-A-S-V-A-S-A-I-L-N-G-A- m) V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A- n) V-A-G-L-G-A-Y-F-L-G-L-G-Q-K-V-Q-G-L-*-C-D-*-Y-M-V-E-K-G-O) V-A-G-L—A-A-Y—L—M-T-L-G—R-A-T-A—S—N-A-C-R-*-Y—I-A-Q—T-A- 35 23 102907 n:o 260 270 275

a) T-K-L-G-D-S-F-Y-Y-*-G-K-G-L-I-N-V-Q-A-A-A-Q

b) T-Y-L-G-D-S-F-Y-Y-*-G-K-G-L-I-N-V-Q-A-A-A-Q

c) T-Y-L-G-N-S-F-Y-Y-*-G-R-G-L-I-N-V-Q-A-A-A-Q

5 d) T-Y-L-G-S-S-F-Y-Y-*-G-K-G-L-I-N-V-Q-A-A-A-Q

e) T-N-L-G-D-S-F-Y-Y-*-G-K-G-L-I-N-V-E-A-A-A-Q

f) T-Y-L-G-S-S-F-Y-Y-*-G-K-G-L-I-N-V-E-A-A-A-Q

g) T-Y-L-G-S-S-F-Y-Y-*-G-K-G-L-I-N-V-E-A-A-A-Q

h) T-S-L-G-S-T-N-L-Y-*-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R

10 i) T-Y-L-G-S-P-S-L-Y-*-G-N-G-L-V-H-A-G-R-A-T-Q

j) D-K-I-S-G-T-G-T-Y-W-A-K-G-R-V-N-A-Y-K-A-V-Q-Y

k) N-K-G-D-L-S-H-I-P-F-G-T-V-N-L-L-A-Y-N-N-Y-Q-A

l) T-T-G-R-L-S-G-I-G-S-G-S-P-N-R-L-L-Y-S-L-L-S-S-G-S-G

m) T-S-L-G-S-T-N-L-Y-*-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R

15 n) L-K-D-V-I-Q-S-V-P-S-D-T-A-N-V-L-I-N-N-G-E-G-S-A

o) N-Q-G-D-L-S-N-I-S-F-G-T-V-N-L-A-Y-N-N-Y-Q-G

Piirroksen lyhyt kuvaus Tätä keksintöä kuvataan yksityiskohdittain vielä tämän 20 patenttikuvauksen seuraavissa osissa viitaten piirroksiin, joissa: kuva 1 esittää plasmidi pSX88:n konstruktion, 25 kuva 2 esittää plasmidi pSX88:n restriktiokarttaa, kuva 3 on esimerkkinä mutantti subtilisiini-309:n geenien konstruktiosta tämän keksinnön mukaisten entsyymien ilmen-·' tämiseksi, 30 kuva 4 esittää plasmidi pSX92:n restriktiokarttaa ja kuva 5 osoittaa graafisesti maksimisuorituskyvyn mukaisen pH:n ja tämän keksinnön mukaisten mutanttientsyymien laske- 35 tun pl:n välistä suhdetta.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Aiemmin mainittiin, että tämä keksintö liittyy mutatoitui-hin subtilisiineihin, joissa aminohappojakso on muutettu 40 mutatoimalla subtilisiinientsyymiä vastaavaa geeniä, jossa • « N .

24 102907 on haluttua modifioida niitä kodoneita, jotka vastaavat tuloksena olevan entsyymin pinnalla tai tätä lähellä sijaitsevan aminohapon n:o. 27 ilmentymisestä.

5 Tämän keksinnön yhteydessä subtilisiini määritellään gram- positiivisten bakteerien tai sienten tuottamaksi seriini-proteaasiksi. Rajoitetummassa mielessä ja tämän keksinnön moniin sovellutusmuotöihin soveltuen subtilisiini myös tarkoittaa grampositiivisten bakteerien seriiniproteaasia. 10 Toisen määritelmän mukaan subtilisiini on seriiniproteaasi, jossa katalyyttisessä triadissa olevien aminohapporyhmien suhteellinen järjestys on Asp-His-Ser (asemat 32, 64 ja 221). Vielä rajoitetummassa mielessä monet näistä tämän keksinnön mukaisista sovellutusmuodoista liittyvät gram-15 positiivisten bakteerien seriiniproteaaseihin, jotka ovat olennaisen yksiselitteisellä tavalla homologisia primääri-rakenteensa osalta taulukossa 1 esitettyjen subtilisiinien suhteen.

20 Subtilisiini-BPN':n aminohappojaksoista peräisin olevaa numerointijärjestelmää käyttäen, joka on esitetty taulukossa 1 useiden muiden tunnettujen subtilisiinien amino-happojaksojen suhteen kohdistettuna, on mahdollista osoittaa subtilisiinientsyymin aminohapporyhmän asema yksiselit-25 teisesti. Asemille, jotka ovat ennen subtilisiini-BPN':n aminohapporyhmää n:o 1, annetaan negatiivinen numero, kuten -6 termitaasin N-terminaalisen Y:n tapauksessa tai 0 kuten proteinaasi-K:n terminaalisen A:n osalta. Aminohapporyhmät, jotka ovat insertioita subtilisiini-BPN':n suhteen, nume-30 roidaan lisäämällä kirjaimia aakkosjärjestyksessä edeltävään subtilisiini-BPN':n numeroon, mikä käy ilmi numeroista 12a, 12b, 12c, 12d, 12e, jotka on annettu proteinaasi K:ssa olevan ryhmien 12Ser ja 13Thr välisen S-T-S-P-G-insertion tapauksessa.

35 25 102907 Käyttäen edellä kuvattua numerointijärjestelmää kiinnostuksen kohteena olevat asemat ovat: 1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 27, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 5 59, 60, 61, 62, 75, 76, 77, 78, 79, 87, 89, 91, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 126, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 10 181, 182, 183, 184, 185, 186, 188, 189, 191, 192, 194, 195, 197, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 259, 260, 261, 262, 263, 265, 269, 271, 272, 275.

15

Isoelektrinen piste (plo)

Olettaen, että substraatilla on pesuolosuhteissa entsyymin suhteen vastakkainen sähköstaattinen varaus, voitaisiin odottaa, että entsyymin adsorptio ja siten pesutehokkuus 20 substraattia kohtaan parantuisi lisäämällä entsyymin sähkö staattista nettovarausta, NEC.

Havaittiin kuitenkin yllättäen, että entsyymin NEC:n pienentäminen näissä olosuhteissa saattoi johtaa entsyymin pe-25 sutehokkuuden paranemiseen.

Toisin sanoen havaittiin, että entsyymin isoelektrisen pisteen, pl0:n, muuttaminen alempaa pH-arvoa vastaavaan suuntaan muutti entsyymin optimaalisen pesutehokkuuden pH:ta 30 alempaan arvoon, joka tarkoittaa sitä, että jotta voitai- ,, siin suunnitella entsyymi matalan pH:n pesunestettä varten, jossa entsyymin on oltava aktiivinen, tunnetun subtilisii-nientsyymin pesutehokkuuden parantuminen voidaan saada aikaan mutatoimalla tunnettua subtilisiinientsyymiä vastaava 35 geeni siten, että saadaan mutanttientsyymi, jonka plo on matalampi.

26 102907 Tämä havainto johti kokeisiin, jotka osoittivat, että myös päinvastainen tapaus on mahdollinen. Tämä tarkoittaa sitä, että tunnettu subtilisiinientsyymi voidaan myös suunnitella käytettäväksi korkean pH:n detergenteissä muuttamalla sen 5 pl0-arvoa korkeammaksi, jonka johdosta entsyymin pesutehok-kuuden pH-optimi muuttuu korkeampaan pH-arvoon.

Keksinnön mukaisesti on näin ollen aikaansaatu mutatoitu subtilisiiniproteaasi, jonka sähköstaattinen nettovaraus on 10 muuttunut verrattuna lähtömuotoiseen proteaasiin samassa pH-arvossa siten, että mainitussa proteaasissa on mainittuun lähtömuotoiseen proteaasiin verrattuna vähemmän tai enemmän positiivisen varauksen omaavia aminohapporyhmiä tai vain yksi tällainen ryhmä ja/tai enemmän tai vähemmän nega-15 tiivisen varauksen omaavia aminohapporyhmiä tai vain yksi tällainen ryhmä, jolle mutatoidulle substilisiinipro-teaasille on tunnusomaista, että mutaatio on saatu aikaan asemassa 27 olevassa aminohapporyhmässä tämän ryhmän delee-tiolla tai substituutiolla, jolloin mainitun mutatoidun 20 subtilisiiniproteaasin isoelektrinen piste (plo) on alempi kuin mainitun lähtömuotoisen proteaasin vastaava piste, lukuunottamatta asemassa 27 olevan lysiinin substituutiota kysteiinillä.

25 Keksinnön mukaisesti on myös aikaansaatu mutatoitu subtili- § « - siiniproteaasi, jonka sähköstaattinen nettovaraus on muut tunut verrattuna lähtömuotoiseen proteaasiin samassa pH-arvossa siten, että mainitussa proteaasissa on mainittuun lähtömuotoiseen proteaasiin verrattuna vähemmän tai enemmän 30 positiivisen varauksen omaavia aminohapporyhmiä tai vain yksi tällainen ryhmä ja/tai enemmän tai vähemmän negatiivisen varauksen omaavia aminohapporyhmiä tai vain yksi tällainen ryhmä, jolle mutatoidulle subtilisiiniproteaasille on tunnusomaista, että mutaatio on saatu aikaan asemassa 27 35 olevassa aminohapporyhmässä tämän ryhmän deleetiolla tai substituutiolla, jolloin mainitun subtilisiiniproteaasin isoelektrinen pH (plo) on korkeampi kuin mainitun lähtö- 27 102907 muotoisen proteaasin vastaava pH, lukuunottamatta asemassa 27 olevan lysiinin substituutiota kysteiinillä.

Keksinnön edullisen sovellutusmuodon mukaan mutatoidussa 5 subtilisiiniproteaasissa on että siinä on mutaatio, joka vaikuttaa asemassa 27 olevaan aminohapporyhmään, ja ainakin vielä yksi mutaatio, joka vaikuttaa sellaisessa asemassa olevaan aminohapporyhmään, joka on 10 1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 75, 76, 77, 78, 79, 87, 89, 91, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 126, 128, 15 129, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 188, 189, 191, 192, 194, 195, 197, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 20 241, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 259, 260, 261, 262, 263, 265, 269, 271, 272 tai 275.

Lyhyesti mainittuna tämä keksintö liittyy näiltä kohteil-25 taan mutatoituihin proteaaseihin, joissa mutatoidun prote- • - aasin pl0 on alempi kuin lähtömuotoa olevan proteaasin pl0 ja joissa optimaalista pesutehokkuutta vastaava pH on myös alempi kuin lähtömuotoa edustavan proteaasin pH-optimi; tai mutatoituihin proteaaseihin, joissa mutatoidun proteaasin 30 pl0 on korkeampi kuin lähtömuotoa edustavan proteaasin pl0 ja joissa optimaalista pesutehokkuutta vastaava pH-optimi on myös korkeampi kuin lähtömuotoa edustavan proteaasin pH-optimi.

35 Arvellaan yleisesti (Thomas, Russel ja Fersht, katso edellä) , että kineettisiin ominaisuuksiin voidaan vaikuttaa muuttamalla entsyymin aktiivisen keskuksen läheisyydessä olevaa sähköstaattista pintavarausta, mutta nyt on yllättä 28 102907 en havaittu, että entsyymin kineettisiä ominaisuuksia voidaan myös muuttaa modifioimalla aktiivisesta keskuksesta kaukana sijaitsevia pintavarauksia.

5 Tämän keksinnön mukaisesti saadaan käyttöön sellaisia muta- toituja proteaaseja ja niitä sisältäviä detergenttikoostu-muksia, joissa mutatoidun proteaasin aminohappojakso lisäksi sisältää asemassa 36 olevan insertiomutaation, esimerkiksi negatiivisen varauksen omaavan aminohapporyhmän 10 (esim. D:n tai E:n) tai neutraalin polaarisen ryhmän (kuten A:n, Q:n tai N:n) tai positiivisen aminohapporyhmän, kuten R:n tai K:n insertoimiseksi.

Tämä pätee erityisesti esimerkiksi subtilisiiniproteaasei-15 hin 309 ja 147 ja PB92 ja mihin tahansa muuhun jaksoon, jonka homologiapiirteet viittaavat siihen, että tältä puuttuu luontaisesti subtilisiini-PBN':n jaksoon verrattuna asemassa 36 oleva aminohapporyhmä.

20 Mutanteissa, joissa on insertio asemassa 36, voi olla vielä muita mutaatioita, esimerkiksi yhdessä tai useammissa asemista 120, 170, 195, 235, ja/tai 251 ja/tai asemassa 76. Asemassa 76 olevat sopivat mutaatiot ovat esimerkiksi negatiivisen varauksen omaavia ryhmiä, kuten N76D tai N76E.

25

Asemassa 36 (esimerkiksi negatiivisen tai polaarisen neutraalin ryhmän insertio) ja asemassa 76 (negatiivisesti varautuneella ryhmällä tapahtuva substituutio) olevilla mutaatioilla voi olla usein stabiloiva vaikutus mutantti-30 proteaasiin ja näitä voidaan käyttää yhdessä. Esimerkiksi mutaatioiden yhdessä tai useammassa asemista 120, 170, 195, 235 ja 251 on havaittu liittyvän entsyymiaktiivisuuden kohoamiseen. Jopa tapauksissa, joissa näihin viimeksi mainittuihin mutaatioihin liittyy niiden yksinään esiintyessä 35 stabiilisuuden heikentymistä, voi olla hyväksyttävää ja käyttökelpoista yhdistää nämä mutaatiot joko toisessa tai molemmissa asemista 36 ja 76 olevaan mutaatioon.

29 102907 Tämän keksinnön mukaan on vielä edullista, että mutatoitu subtilisiinientsyymi edustaa sellaisesta lähtömuodosta saatua mutaatiota, joka on subtilisiini-BPN', subtilisiini amylosacchariticus, subtilisiini-168, subtilisiini mesente-5 rikopeptidaasi, subtilisiini Carlsberg, subtilisiini-DY, subtilisiini-309, subtilisiini-147, termitaasi, Bacillus PB92 -proteaasi ja proteinaasi-K, edullisesti subtilisiini-309, subtilisiini-147, subtilisiini Carlsberg, akvalysiini, Bacillus PB92 -proteaasi, proteaasi-TW7 tai proteaasi-TW3.

10

Muut edulliset sovellutusmuodot käsittävät subtilisiinient-syymejä, jotka sisältävät yhden tai useamman mutaatioista: K27R, K27V, K27D, K27D+D120K.

15

Muita erityisen edullisia sovellutusmuotoja ovat mutatoitu-neet subtilisiiniproteaasit, jotka käsittävät yhden tai useamman mutaatioista:

20 C005) K27D

C006) K27D+D120K

Jäljempänä esitetyissä esimerkeissä käytettiin seuraavia subtilisiinivariantteja: 25

S001) G195E

5003) R170Y

5004) R170Y+G195E

5005) K251E

30 S012) R170Y+G195E+K251E

S019) H120D+R170Y+G195E+K235L

• : S020) H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E

5021) *36D

5022) *36D+R170Y+G195E+K251E

35 S023) *36D+H120D+R170Y+G195E+K235L

5024) *36D+H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E

5025) *36D+H120D+G195E+K235L

S027) E89S

30 102907

S028) D181N

5031) D197N+E271Q

5032) D197N

5033) E271Q

5 S035) *36D+N76D+H120D+G195E+K235L

5201) N76D

5202) N76D+G195E

5203) N76D+R170Y+G195E

C001) D14K

10 C002) D120K

C003) D140K

C004) D14K+D120K

C008) D172K

15 Vielä yhtenä tämän keksinnön kohteena on sellainen menetelmä aseman(ien) ja aminohap(p)o(je)n määrittämiseksi tai valitsemiseksi, jolla voidaan suorittaa lähtömuotoisessa entsyymissä olevaan(viin) aminohappoon (poihin) kohdistuva de-leetio, substituutio tai insertio, jolle menetelmälle on 20 tunnusomaista, että valinta suoritetaan tavalla, jolla mu- tatoitavaksi aiotun entsyymin laskennallinen sähköstaattinen nettovaraus (NEC) on muuttunut valitun lähtömuotoisen entsyymin samassa pH:ssa laskettuun NEC:hen verrattuna, ja että valittuihin aminohapporyhmiin kuuluu asemassa 27 oleva 25 aminohapporyhmä, lukuunottamatta asemassa 27 olevan lysii- • nin substituutiota kysteiinillä.

Toinen tapa ilmaista tämän keksinnön kattama periaate on se, että ne asemat ja aminohapot, jotka mainitussa lähtö-30 muotoa edustavassa entsyymissä aiotaan deletoida, substitu-oida tai korvata, valitaan tavalla, jolla varausten koko-naismäärä tai koko varaussisältö (=TCC) ja/tai saadun muta-toidun entsyymin NEC:n muutos on suoritettu siten, että tuloksena on siten mutatoitu proteaasi, jonka isoelektrinen 31 102907 piste (= pIq) on siirtynyt samaan suuntaan kuin mihin entsyymin optimaalista pesutehokkuutta vastaavaa pH:ta olisi siirrettävä, jonka pH-optimin tulisi olla mahdollisimman lähellä sitä pesunesteen pH:ta, jossa mainittua mutatoitua 5 proteaasia aiotaan käyttää.

Kuten edellä mainittiin, lasketaan makromolekyylin, kuten entsyymin, plo sinä pH-arvona, jossa molekyylin NEC-arvo on 0. Tästä menetelmästä esitetään esimerkkejä jäljempänä ole-10 vissa esimerkeis-sä, mutta sen periaatteet kuvataan yksityiskohdittain välittömästi seuraavassa kohdassa.

Kullekin mahdollisesti varaukselliselle aminohapporyhmälle annetaan pK-arvot. Tämän jälkeen lasketaan se suhde, joka 15 saadaan tietyssä pH:ssa varauksellisessa tai varauksetto massa muodossa esiintyvästä aminohapporyhmästä (varauksel-linen/varaukseton, C/U(i)) lasketaan sekä negatiivisen että positiivisen varauksen osalta käyttäen kaavoja Ia ja Ib: 20 C/U(i) = exp (lnio (pH-pKi)) (negatiivinen varaus) (Ia) C/U (i) = exp (ln10 (pKi-pH)) (positiivinen varaus) (Ib), tässä järjestyksessä mainittuna.

i I

32 102907

Kaavojen Ia ja Ib osalta havaitaan, että pH-arvossa, joka vastaa pKjitä, C/U(i) vastaa arvoa 1.

Tämän jälkeen kullekin varaukselliselle aminohapporyhmälle 5 annettu suhteellinen varaus Qr(i) eli varauskontribuutio lasketaan käyttäen kaavoja Ha ja Hb:

Qr(i) = C/U(i) / (1+C/U (i)) (negatiiivinen varaus) (Ha) Qr(i) - -C/U(i)/(1+C/U (i)) (positiivinen varaus) (Hb) 10 pH-arvo, jossa kaikkien varauksellisista ryhmistä saatujen varaukseen vaikuttavien osuuksien summa on 0, määritetään iteroimalla tai interpoloimalla riittävän tiheillä väleillä varustetusta pH-varaussumma-taulukosta.

15

Mutatoituja entsyymejä käsittävät detergenttikoostumukset Tämä keksintö käsittää lisäksi tämän keksinnön mukaisten mutatoitujen entsyymien käytön puhdistus- ja detergentti-koostumuksissa ja mutatoituja subtilisiinientsyymejä käsit-20 tävän tällaisen koostumuksen.

Koostumukset käsittävät lisäksi minkä tahansa yhden tai useamman mutatoidun subtilisiinientsyymin, joka on minkä tahansa tämän keksinnön mukaisen edellä kuvatun kohteen 25 mukainen käytettynä yksinään tai yhdessä alan ammattimiehen tunteman minkä tahansa näihin koostumuksiin liitetyn muun tavallisen komponentin kanssa.

Näihin komponentteihin kuuluvat tehoaineet, kuten tehoai-30 neina käytetyt fosfaatti tai zeoliitti, pinta-aktiiviset aineet, kuten anioiniset, kationiset tai ionittomat pinta-aktiiviset aineet, polymeerit, kuten akryyli tai muut tätä vastaavat polymeerit, valkaisujärjestelmät, kuten perbo-raattia tai aminoryhmiä sisältäviä valkaisuaineen esimuoto-35 ja tai aktivaattoreita, strukturantteja, kuten silikaatti-strukturantteja, emästä tai happoa pH:n säätämiseksi, kos-teutusaineita ja neutraaleja epäorgaanisia suoloja.

• I

! a ί

H

;i 33 102907

Useissa käyttökelpoisissa sovellutusmuodoissa detergentti-koostumukset voidaan formuloida seuraavasti: a) Detergenttijauheeksi formuloitu detergenttikoostumus, 5 joka sisältää fosfaattitehoaineen, anionisen pinta-aktiivi- sen aineen, ionittoman pinta-aktiivisen aineen, akryyli-tai tätä vastaavan polymeerin, perboraatti-valkaisuaine-esimuodon, aminoryhmän sisältävän valkuaisaineaktivaatto-rin, silikaatti- tai muun strukturantin, emästä käytön 10 aikaisen pH-arvon säätämiseen ja neutraalin epäorgaanisen suolan.

b) Detergenttijauheeksi formuloitu detergenttikoostumus, joka sisältää zeoliittitehoaineen, anionisen pinta-aktiivi- 15 sen aineen, ionittoman pinta-aktiivisen aineen, akryyli-tai tätä vastaavan polymeerin, perboraatti-valkaisuaine-esimuodon, aminoryhmän sisältävän valkuaisuaineen aktivaat-torin, silikaatti- tai muun strukturantin, emästä käytön aikaisen pH-arvon säätämiseen ja neutraalin epäorgaanisen 20 suolan.

c) Vesipitoiseksi nestemäiseksi detergentiksi formuloitu detergenttikoostumus, joka sisältää anionisen pinta-aktiivisen aineen, ionittoman pinta-aktiivisen aineen, kosteu- 25 tusaineen, orgaanisen hapon, alkalihydroksidilipeän, ja . jonka pH on säädetty arvojen 9 ja 10 välillä olevaan ar voon.

d) Vedettömäksi nestemäiseksi detergentiksi formuloitu 30 detergenttikoostumus, joka käsittää nestemäisen ionittoman pinta-aktiivisen aineen, joka koostuu olennaisesti lineaa- * risesti alkoksyloidusta primäärisestä alkoholista, triase- tiinin, natriumtrifosfaatin, alkalihydroksidilipeän, valkaisuaineen esimuodon, joka on perboraattimonohydraatti ja 35 valkaisuaineena aktivaattorina olevan tertiäärisen amiinin, ja jonka pH on säädetty arvojen 9 ja 10 välillä olevaan arvoon.

34 102907 e) Rakeistetuksi detergenttijauheeksi formuloitu detergenttikoostumus, jonka irtotiheys on 550 g/1, esimerkiksi ainakin 600 g/1, ja joka sisältää anionisia ja ionittomia pin-ta-aktiivisia aineita, esimerkiksi anionisen pinta-aktiivi- 5 sen aineen ja ionittoman pinta-aktiivisen aineen seoksen, joiden molempien alkoksylointiaste on noin 7 ja noin 3, vähän tai olennaisesti ei lainkaan neutraalia epäorgaanista suolaa, fosfaattitehoainetta, valkaisuaine-esimuotona käytettävää perboraattia, valkaisuaineaktivaattorina tertiää-10 ristä amiinia, natriumsilikaattia ja pieniä määriä lisäaineita ja kosteutta.

f) Rakeistetuksi jauhemaiseksi detergentiksi formuloitu detergenttikoostumus, jonka irtotiheys on ainakin 600 g/1 15 ja joka sisältää anionisia ja ionittomia pinta-aktiivisia aineita, esimerkiksi anioinisen pinta-aktiivisen aineen ja ionittomien pinta-aktiivisten aineiden seoksen, joiden kunkin alkoksylointiasteet ovat noin 7 ja noin 3, vähän tai olennaisesti ei lainkaan neutraalia epäorgaanista suolaa, 20 zeoliitti-tehoainetta, valkaisuaine-esimuotona käytettävää perboraattia, valkaisuaineaktivaattorina tertiääristä ami-nia, natriumsilikaattia ja muita vähäisemmissä määrin esiintyviä aineita ja kosteutta.

25 g) Detergenttijauheeksi formuloitu detergenttikoostumus, joka sisältää anionisen pinta-aktiivisen aineen, ionittoman pinta-aktiivisen aineen, akryylipolymeerin, rasvahapposaip-puan, natriumkarbonaattia, natriumsulfaattia, amiineilla täydennettyjä tai täydentämättömiä savipartikkeleita, val-30 kaisuaineen esimuotona käytettävää perboraattia, val kaisuaineaktivaattorina käytettävää tertiääristä amiinia, natriumsilikaattia ja vähäisessä määrässä esiintyviä aineita ja kosteutta.

35 h) Detergentti(saippua)tangoksi formuloitu detergenttikoos tumus, joka sisältää saippuaa, joka perustuu talin ja koo-kospähkinäöljyn saponifioituun seokseen, joka on neutraloi- 35 102907 tu ortofosforihapolla, ja johon on sekoitettu proteaasia ja myös sekoitettu natriumformaattia, booraksia, propyleenig-lykolia ja natriumsulfaattia ja tämän jälkeen puristettu saippuatangoksi saippuan tuotantolinjassa.

5 j) Entsymaattinen detergenttikoostumus, joka on formuloitu siten, että siitä saadaan pesuneste, jonka pH on 9 tai sen alle, kun sitä käytetään annoksena, joka vastaa 0,4 - 0,8 g/1 pinta-aktiivista ainetta.

10 k) Entsymaattinen detergenttikoostumus, joka on formuloitu siten, että siitä saadaan pesuneste, jonka pH on 8,5 tai sen yli, kun sitä käytetään annoksena, joka vastaa 0,4 -0,8 g/1 pinta-aktiivista ainetta.

15 l) Entsymaattinen detergenttikoostumus, joka on formuloitu siten, että siitä saadaan pesuneste, jonka ionivahvuus on 0,03 tai tämän alle, esimerkiksi 0,02 tai alle tämän, kun sitä käytetään annoksena, joka vastaa 0,4 - 0,8 g/1 pinta- 20 aktiivista ainetta.

m) Entsymaattinen detergenttikoostumus, joka on formuloitu siten, että siitä saadaan pesuneste, jonka ionivahvuus on 0,01 tai tämän yli, esimerkiksi 0,02 tai tätä enemmän, kun 25 sitä käytetään annoksena, joka vastaa 0,4 - 0,8 g/1 pinta- .·. aktiivista ainetta.

t

Mutatoituja entsyymejä yhdessä lipaasin kanssa käsittäviä detergenttikoostumuksia 30 On yllättäen havaittu, että subtilisiinityyppisen proteaa- sin isoelektrisen pisteen, pl:n, alentaminen pesuolosuh-teissa voi johtaa ei vain siihen, että entsyymin pesutehok-kuus paranee, vaan myös se on paremmin yhteensopiva lipaasin kanssa.

35

On myös yllättäen tehty löytö, että proteaasin yhteensopivuuteen lipaasin kanssa ei vaikuta ainoastaan pl, vaan myös * 36 102907 varauksellisten asemien sijainti proteaasin aktiiviseen keskukseen nähden: tuomalla negatiivinen varaus tai positiivisen varaus aktiivisen keskuksen läheisyyteen saadaan proteaasin yhteensopivuus lipaasin kanssa paranemaan.

5 Tämän perusteella tämän keksinnön mukaisista tietyistä sovellutusmuodoista saadaan käyttöön entsymaattisia deter-genttikoostumuksia, jotka käsittävät lipaasin sekä muta-toidun subtilisiiniproteaasin, jossa mutatoidun proteaasin 10 molekyylin sähköstaattista nettovarausta on muutettu amino-happoryhmien insertiolla, deleetiolla tai substituutiolla verrattuna lähtömuotoa edustavaan proteaasiin ja jossa mainitussa proteaasissa on mainittua lähtömuotoa edustavaan proteaasiin verrattuna vähemmän positiivisesti varautuneita 15 aminohapporyhmiä ja/tai enemmän negatiivisesti varautuneita aminohapporyhmiä, joiden ansioista mainitulla subtilisiini-proteaasilla on alhaisempi isoelektrinen pH (pl0) kuin mainitun lähtömuotoa edustavan proteaasin pl0.

20 Yksi edullinen tällaiseen käyttöön tarkoitettu lipaasiryhmä on peräisin gramnegatiivisista bakteereista ja siihen kuuluu esimerkiksi lipaasientsyymejä, jotka ovat ryhmiä,jotka on määritelty patenttijulkaisuissa EP-0 205 208 ja 0 206 390, jotka on molemmat myönnetty Unileverille (jotka 25 liitetään tähän patenttihakemusjulkaisuun tähän oikeuttavien säädösten nojalla, mukaanlukien lipaasit, jotka muistuttavat immunologisesti tietyistä Ps. fluorescens, P. gladioli ja Chromobacter-kannoista peräisin olevia lipaaseja.

30 Edellä mainitun lipaasin yhteydessä käytettäväksi tarkoite tut mutatoidun subtilisiinientsyymin edullisissa sovellu-tusmuodoissa on yksi tai useampia mutaatioita aminohappo-ryhmän kohdassa, joka sijaitsee noin 15 k - 20 Ä aktiivisesta keskuksesta, erityisesti esimerkiksi asemissa 170, 35 120 tai 195.

t 37 102907

Lipaasi voidaan kätevästi lisätä lipolyyttisen entsyymin rakeisena koostumuksena (vaihtoehtoisesti liuoksena tai lietteenä) kantajamateriaaliin yhdistettynä (esim. patenttijulkaisun EP 258 068 (Novo Nordisk A/S) mukaisesti ja 5 · Novo Nordisk A/S -yhtiön Savinase®- ja and Lipolase®-tuot- teiden tavoin käytettynä).

Lisätty lipaasimäärä voidaan valita laajoissa rajoissa, esimerkiksi alueella 50 - 30 000 LU/g kutakin pinta-aktii-10 visen systeemin grammaa tai detergenttikoostumusgrammaa kohti, esimerkiksi vähintään 100 LU/g, hyvin hyödyllisesti ainakin 500 LU/g, joskus edullisesti noin 1 000, yli 2 000 LU/g tai yli 4 000 LU/g tai enemmän, siten hyvin usein alueella 50-4 000 LU/g ja mahdollisesti alueella 15 200 - 1 000 LU/g. Tässä patenttikuvauksessa lipaasiyksiköt määritellään patenttijulkaisussa EP 258068 määritellyllä tavalla.

Lipolyyttinen entsyymi voidaan valita suuresta joukosta 20 lipaaseja. Erityisesti lipaaseista, jotka on kuvattu esimerkiksi patenttikuvauksissa EP 214 761 (Novo Nordisk A/S) ja EP 0 258 068 ja erityisesti lipaaseista, joilla esiintyy immunologisia ristireaktioita sellaisilla antiseerumeilla, jotka on muodostettu Thermomyces lanuginosus ATCC 22070:sta 25 peräisin olevaa lipaasia vastaan, EP 0 205 208 ja EP .·. 0 206 309, ja erityisesti lipaaseista, joilla esiintyy immunologisia ristireaktioita antiseerumeilla, jotka on muodostettu Chromobacter viscosum var lipolyticum NRRL B-3673:sta peräisin olevaa lipaasia vastaan tai Alcaligenes 30 PL-679:sta, ATCC 31371:stä tai FERM-P 3783:sta peräisin olevaa lipaasia vastaan ja myöskin patenttijulkaisujen WO 87/00859 (Gist-Brocades) ja EP 0 204 284 (Sapporo Breweries) patenttikuvauksissa kuvattuja lipaaseja vastaan. Sopivia ovat erityisesti esimerkiksi seuraavat kaupallises-35 ti saatavilla olevat lipaasipreparaatit: Novo Lipolase®, Amano-lipaasit CE, P, B, AP, M-AP, AML ja CES, ja Meito-lipaasit MY-30, OF ja PL, sekä Esterase® MM, Lipozym®, 38 102907 SP225, SP285, Saiken-lipaasi, Enzeco-lipaasi, Toyo Jozo -lipaasi ja Diosynth-lipaasi (tavaramerkkejä).

Entsyymejä voidaan muokata geeniteknisin keinoin muuttamal-5 la sopiva lipaasigeeni, esimerkiksi Thermomyces lanu- ginosuksesta tai tämän mutantista peräisin oleva lipaasigeeni tuomalla geeni tai sen johdannainen sopivaan tuottajaorganismiin, kuten Aspergi1lukseen ja ilmentämällä tätä geeniä. Voidaan käyttää menetelmiä, jotka on kuvattu 10 patenttijulkaisuissa WO 88/02 775 (Novo Nordisk A/S), EP 0 243 338 (Labofina), EP 0 268 452 (Genencor) ja erityisesti EP 0 305 216 (Novo Nordisk A/S) tai EP 0 283 075 (Gist-Brocades) ja näitä voidaan käyttää ja muokata sopivasti.

15 Samanlaiset näkökohdat soveltuvat mutatis mutandis muiden mahdollisesti läsnä olevien entsyymien tapauksissa, Tätä keksintöä rajoittamatta pätee se, että amylaasia voidaan esimerkiksi käyttää lisäämällä sitä määriä, jotka ovat alueella noin 1 - nnoin 100 MU (maltoosiyksikköä) deter-20 genttikoostumuksen grammaa kohti (tai 0,014 - 1,4, esim.

0,07 - 0,7, KNU/g (Novo yksikköä)). Sellulaasia voidaan esimerkisi käyttää lisäämällä sitä määriä, jotka ovat alueella noin 0,3 - noin 35 CEVU-yksikköä detergenttikoostu-musgrammaa kohti.

25

Detergenttikoostumuksiin voi lisäksi kuulua seuraavia ta-vallisia detergenttien ainesosia tavallisina määrinä.

Ne voivat olla tehoaineilla varustettuja tai varustamatto-30 mia ja ne voivat olla 0-P-tyyppisiä (ts. sellaisia, joissa ei esiinny lainkaan fosforia sisältäväiä tehoaineita). Koostumus voi siten sisältää yhteensä noin 1-50 paino-%, esimerkiksi ainakin noin 5 paino-% ja usein noin 35 -40 paino-%:iin asti yhtä tai useampaa orgaanista ja/tai 35 epäorgaanista tehoainetta. Tyypillisiin esimerkkeihin näis tä tehoaineista kuuluvat edellä jo aiemmin mainitut aineet ja niihin kuuluvat laajemmin alkalimetalli-orto-, pyro-, ja 39 102907 tripolyfosfaatit, alkalimetallikarbonaatit, joita käytetään joko yksinään tai sekoitettuna kalsiittiin, alkalimetal-lisitraatit, alkalimetalli-nitrilotriasetaatit, karbometyy-lioksisukkinaatit, zeoliitit, polyasetaalikarboksylaatit 5 jne.

Detergenttikoostumukset voivat lisäksi sisältää l - 35 % valkaisuainetta tai valkaisuaineen esimuotoa tai systeemin, joka käsittää valkaisuaineen ja/tai esimuodon yhdessä tämän 10 aktivaattorin kanssa. Muita vaihtoehtoisia aineksia ovat vaahdonmuodostuksen tehostajat, vaahdonestoaineet, korroosiota ehkäisevät aineet, likaa suspendoivat aineet, likaa pidättävät aineet, lian erottumista ehkäisevät aineet, hajusteet, väriaineet, entsyymejä stabiloivat aineet 15 jne.

Koostumuksia voidaan käyttää tekstiilimateriaalien pesuun, erityisesti, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, puuvillaan ja polyestereihin ja näiden seoksiin perustuvien teks- 20 tiilien pesuun, erityisen sopivia ovat esimerkiksi pesutoi- menpiteet, joissa käytetään lämpötiloja, jotka ovat noin 60 - 65 eC tai tätä alempia, esimerkiksi noin 30 ec - 35 °C tai tätä alempia lämpötiloja. Se voi olla hyvin sopivaa käytettäväksi koostumuksessa annoksena, josta pesuliuokseen 25 saadaan esimerkiksi noin 0,4 - 0,8 g/1 pinta-aktiivista ainetta, vaikkakin on tietenkin mahdollista haluttaessa « käyttää pienempiä tai suurempia konsentraatioita. Tätä keksintöä rajoittamatta voidaan esimerkiksi mainita, että käyttömäärä, joka on noin 3 g/1 ja korkeintaan 6 g/1 deter-30 genttiformulaatiota, on sopiva käytettäväksi niissä tapauk sissa, joissa formulaatiot ovat esimerkeissä esitettyjen mukaisia.

t

Menetelmä mutaatioiden muodostamiseksi subtilisiinigeenei-35 hin Tällä alalla tunnetaan useita menetelmiä mutaatioiden muodostamiseksi geeneihin. Sen jälkeen, kun on lyhyesti tar- 4 40 102907 kasteltu subtilisiinigeenien kloonausta, tarkastellaan menetelmiä mutaatioiden muodostamiseksi subtilisiinigeeniin sekä sattumanvaraisiin kohtiin että spesifisiin kohtiin.

5 Subtilisiinigeenin kloonaus

Subtilisiinia koodaava geeni voidaan kloonata mistä tahansa grampositiivisesta bakteerista tai sienestä monella tällä alalla tunnetulla menetelmällä. Ensin on konstruoitava genomista ja/tai cDNA:sta saatava DNA-kirjasto käyttäen 10 kromosomaalista DNA:ta tai lähetti-RNA:ta tutkittavaa subtilisiinia tuottavasta organismista. Tämän jälkeen, mikäli subtilisiinin aminohappojakso on tunnettu, voidaan syntetisoida homologisia leimalla varustettuja oligonukleotidi-koettimia ja käyttää niitä subtilisiinia koodaavien klooni-15 en tunnistamiseen bakteeri-DNA-genomikirjastosta tai sien ten cDNA-kirjastosta. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää koettimena leimalla varustettua oligonukleotidikoetinta, joka sisältää jaksoja,jotka ovat homologisia muusta bakteerikannasta tai sienistä peräisin olevaan subtilisiinia 20 kohtaan subtilisiiniä koodaavien kloonien tunnistamiseksi käyttäen hybridisointi- ja pesuolosuhteita, joiden rajoit-tavuus on alhaista.

Vielä yhteen menetelmään subtilisiinia tuottavien kloonien 25 tunnistamiseksi voisi liittyä se, että liitetään genomin ... DNA:sta muodostuvat fragmentit ilmentämisvektoriin, kuten plasmidiin, transformoidaan proteaasi-negatiivinen bakteeri saadulla genomin DNA-kirjastolla ja maljataan tämän jälkeen transformoidut bakteerit subtilisiinin substraattia, kuten 30 kuorittua maitoa, sisältävälle agarille. Ne bakteerit, joissa on subtilisiinin sisältävä plasmidi, tuottavat kirkkaasta agarista muodostuvan man renkaan ympäröimiä pesäkkeitä, mikä johtuu kuoritun maidon pilkkoutumisesta erittyneen subtilisiinin avulla.

35

Satunnaisten mutaatioiden muodostaminen subtilisiinigeeniin 41 102907

Sen jälkeen, kun subtilisiinigeeni on kloonattu sopivaan vektoriin, kuten plasmidiin, voidaan käyttää useita menetelmiä satunnaisten mutaatioiden aiheuttamiseen geeniin.

5 Yksi menetelmä voisi olla se, että kloonattu subtilisiini viedään osana talteen saatavaa vektoria Escherichia colin mutaattorikantaan.

Toiseen menetelmään voisi liittyä subtilisiinigeenin yk-10 sinauhaisen muodon valmistaminen ja subtilisiinigeenin fragmentin liittäminen pituussuunnassa toiseen DNA-frag-menttiin siten, että osa subtilisiinigeeniä jää yksinauhai-seksi. Tämä erillinen yksinauhainen alue voitaisiin sitten altistaa yhdelle monista mutagenisoivista aineista, mukaan-15 lukien, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, natriumve- tysulfiitti, hydroksyyliamiini, typpihapoke, muurahaishappo tai hydraaliatsiini. Erityinen esimerkki tästä satunnaisten mutaatioiden valmistamisesta on kuvattu julkaisussa Shortle ja Nathans, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75 (1978) 2170 -20 2174). Shortlen ja Nathansin menetelmän mukaan subti lisiinigeenin sisältävä plasmidi voitaisiin käsitellä pilkkomalla se restriktioentsyymillä, joka pilkkomiskohta on geenin alueella. Tämä katkos voitaisiin laajentaa aukoksi käyttäen DNA-polymeraasi I:n eksonukleaasivaikutusta. Saatu 25 yksinauhainen aukko voitaisiin tämän jälkeen mutagenisoida ... millä tahansa edellä mainitulla mutagenisoivalla aineella.

Vaihtoehtoisesti Bacillus-lajista peräisin oleva subtilisiinigeeni, joka sisältää luonnollisen promoottorin ja 30 muita ohjaavia jaksoja, voitaisiin kloonata plasmidivekto-riin, joka sisältää sekä E. colin että B. subtiliksen rep-likoneja, selektoitavissa olevan fenotyyppisen markkerin ja M13:n replikaation alkukohdan yksinauhaisen plasmidi-DNA:n muodostamiseksi auttajafaagi-IRl:n superinfektio11a. Kloo-35 natun subtilisiinigeenin sisältämä yksinauhainen plasmidi-DNA eristetään ja liitetään pituussuunnassa yhteen sellaisen DNA-fragmentin kanssa, joka sisältää vektorijaksoja, • · Λ2 102907 mutta ei subtilisiinia koodaavaa aluetta, josta muodostuu aukon käsittävä dupleksimolekyyli. Subtilisiinigeeniin muodostetaan mutaatioita joko natriumvetysulfiitilla, typ-pihapokkeella tai muurahaishapolla tai antamalla replikaa-5 tion tapahtua E. colin mutaattorikannassa, kuten edellä on kuvattu. Koska natriumvetysulfiitti reagoi yksinomaisesti yksinauhaisessa DNA:ssa olevien sytosiinien kanssa, tällä mutageenilla aiheutetut mutaatiot rajoittuvat ainoastaan koodaaviin alueisiin. Reaktioaikaa ja vetysulfiittikonsent-10 raatioita vaihdellaan eri kokeissa siten, että yhtä subti-lisiinigeeniä kohti syntyy keskimäärin 1-5 mutaatiota.

Kun 10 μg aukon sisältävää dupleksi-DNA:ta inkuboidaan 4 M Na-vetysulfiitissa, jonka pH on 6,0, 9 min ajan 37 °C:ssa ja reaktiotilavuudessa, joka on 400 μΐ, deaminoituu 15 noin 1 % yksinauhaisessa alueessa olevista sytosiineista.

Kypsän subtilisiinin koodaava alue sisältää noin 200 sy-tosiinia riippuen siitä, mikä DNA-nauha on kyseessä. Reaktioaikaa vaihdellaan edullisesti noin 4 minuutista (josta syntyy mutaatiofrekvenssi, joka on noin 1 mutaatio 200:ssa) 20 noin 20 minuuttia (noin 5 mutaatioa 200:ssa).

Mutageneesin jälkeen aukon sisältäviä molekyylejä käsitellään in vitro -olosuhteissa DNA-polymeraasi I:lla (Klenow-fragmentti) toisen kaksinauhaisen molekyylin valmistamisek-25 si ja mutaatioiden kiinnittämiseksi. Tämän jälkeen kompe- .. tenttejä E. coli -soluja transformoidaan mutagenisoidulla « DNA:11a mutatoituneita subtilisiineja sisältävän amplifioi-dun kirjaston muodostamiseksi. Amplifioidut mutanttikirjas-tot voidaan myös valmistaa suorittamalla kasvatus plasmidi-30 DNA:n ollessa E. coli Mut D -kannassa, joka lisää mutaati oiden määrää virheitä aiheuttavan DNA-polymeraasinsa vuoksi.

Typpihapoke- ja muurahaishappomutageeneja voidaan myös 35 käyttää mutanttikirjastojen valmistamiseksi. Koska nämä kemikaalit eivät ole yhtä spesifisiä yksinauhaiselle DNA:-lle kuin natriumvetysulfiitti, suoritetaan mutageneesireak- • · « „ 102907 43 tiot noudattaen seuraavaa suoritustapaa. Subtilisiinigeenin koodaava osa kloonataan M13-faagiin standardimenetelmillä ja valmistetaan yksinauhainen faagi-DNA. Yksinauhaisen DNA:n annetaan tämän jälkeen reagoida 1 M typpihapokkeen 5 kanssa pH:ssa 4,3 15 - 60 minuutin ajan 23 °C:ssa tai 2,4 M muurahaishapon kanssa 1-5 minuuttia 23 °C:ssa. Näillä reaktioaikojen alueilla saadaan mutaatiofrekvenssi, joka on alueella 1/1 000 - 5/1 000. Mutageneesin jälkeen Ml3-DNA:-aan liitetään pituussuunnassa yleisaluke ja syntetisoidaan 10 kaksinauhainen DNA käyttäen templaattina yksinauhaista mutagenisoitua DNA:ta siten, että subtilisiinigeenin koodaava osa tulee täysin kaksinauhaiseksi. Tässä vaiheessa koodaava alue voidaan pilkkoa pois M13-vektorista restrik-tioentsyymeillä ja liittää ligaasin avulla mutagenisoimat-15 tomaan ilmentämisvektoriin siten, että mutaatiot esiintyvät ainoastaan restriktiofragmentissa. (Myers et ai., Science 229 (1985) 242 - 257).

Kohdemutaatioiden muodostaminen subtilisiinigeeniin 20 Kun subtilisiinigeeni on kloonattu ja haluttavat mutatoita-vat kohdat tunnistettu, nämä mutaatiot voidaan valmistaa käyttäen synteettisiä oligonukleotidejä. Nämä oligonukle-otidit sisältävät nukleotidijaksoja, jotka ovat haluttujen mutaatiokohtien viereisillä alueilla; mutaatioita muodosta-25 vat nukleotidit liitetään oligonukleotidisynteesin aikana.

Edullisessa menetelmässä muodostetaan subtilisiinigeenin sisältävään vektoriin aukko, joka muodostuu subtilisigeenin puoliskoja yhdistävästä yksinauhaisesta DNA:sta. Synteettinen nukleotidi, jossa on haluttu mutaatio, liitetään tämän 30 jälkeen yksinauhaisen DNA:n homologiseen osaan pituussuunnassa. Jäljellä oleva aukko täytetään DNA-polymeraasi I:lla (Klenow-fragmentti) ja konstruktio liitetään ehyeksi ligaasin avulla käyttäen T4-ligaasia. Erityinen esimerkki tästä menetelmästä on kuvattu julkaisussa Morinaga et ai., Bio-35 technology 2 (1984) 646-639). Julkaisun Morinaga et ai., mukaisesti geenissä oleva fragmentti poistetaan käyttäen restriktioendonukleaasia. Vektori/geeni, joka tässä vai- * · .44 102907 heessa sisältää aukon, denaturoidaan ja hybridisoidaan vektori/geeniin, joka sen sijaan, että sisältäisi aukon, on pilkottu toisella restriktioendonukleaasilla sellaisesta kohdasta, joka jää aukkoon sisältyvän alueen ulkopuolelle.

5 Geenin yksinauhainen alue on käytettävissä hybridisointiin mutatoitujen oligonukleotidien kanssa, jäljellä oleva aukko täytetään DNA-polymeraasi I:n K1enow-fragmentilla, liitetyt molekyylit ligatoidaan T4-DNA-ligaasilla ja yhden replikaa-tiosyklin jälkeen muodostuu kaksinauhainen plasmidi, jossa 10 on haluttu mutaatio. Horinagan menetelmällä vältytään muiden uusien restriktiokohtien konstruktiovaiheilta ja se helpottaa tämän vuoksi mutaatioiden muodostumista useisiin kohtiin. US-patenttijulkaisun n:o 4 760 025, jonka ovat julkaisseet Esteli et ai., ja joka on julkaistu 26.7.1988, 15 mukaisesti on mahdollista liittää oligonukleotidejä, joissa on useita mutaatioita suorittamalla kasettiin pieniä muutoksia, mutta kuitenkin Morinagan menetelmällä voidaan aiheuttaa useita erilaisia mutaatioita koska tahansa, koska tällä voidaan tuoda suuri määrä useita erimittaisia oli-20 gonukleotidejä.

Subtilisiinimutanttien ilmentäminen Tämän keksinnön mukaisesti edellä kuvatuilla menetelmillä tai millä tahansa muulla vaihtoehtoisella tällä alalla 25 tunnetulla menetelmällä tuotettu mutatoitu subtilisiinigee- ... ni voidaan ilmentää entsyymimuodossa käyttäen ilmentämis- vektoria. Ilmentämisvektorin määritelmä kuuluu yleisesti kloonausvektorin määritelmään, koska ilmentämisvektoriin kuuluvat tavallisesti tyypillisen kloonausvektorin kom-30 ponentit, nimittäin yksikkö, jolla vektori kykenee replikoituinaan autonomisesti mikro-organismissa mikro-organismin genomista riippumattomalla tavalla ja yksi tai useampi fenotyyppinen markkeri selektiotarkoituksiin. Ilmentämisvektoriin sisältyy kontrollijaksoja, jotka koodaavat pro-35 moottoria, operaattoria, ribosomia sitova kohta, translaation aloitussignaali, ja vaihtoehtoisesti repressorigeenit tai useita eri aktivaattorigeenejä. Ilmennetyn proteiinin • * ( 45 102907 erittymisen mahdollistamiseksi voidaan ennen geenin koodaa-vaa jaksoa liittää nukleotidejä, jotka koodaavat "signaali-jaksoa". Ohjaavien jaksojen alaisuudessa tapahtuvaa ilmentämistä varten tämän keksinnön mukaisesti käsiteltävä koh-5 degeeni liitetään toiminnallisesti ohjaaviin jaksoihin oikeaan lukukehykseen. Promoottorijaksoihin, jotka voidaan liittää plasmidivektoriin ja jotka voivat ylläpitää muta-toidun subtilisiinigeenin transkriptiota, kuuluvat, mainittuihin kuitenkin rajoittumatta, prokaryoottinen 0-lakta-10 maasipromoottori (Villa-Kamaroff, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75 (1978) 3727 - 3731) ja tac-promoottori (DeBoer, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80 (1983) 21 - 25). Muita viitteitä on saatavilla julkaisussa "Useful proteins from recombinant bacteria" julkaisussa Scientific 15 American, 242 (1980) 74 - 94.

Yhden sovellutusmuodon mukaisesti B. subtilis transformoidaan routatoidun DNA:n sisältävällä ilmentämisvektorilla.

Jos ilmentymisen on tapahduttava erittävässä mikro-organis-20 missä, kuten B. subtiliksessa, translaation aloitussignaa-lin jälkeen voi seurata signaalijakso ja tämä on mielenkiinnon kohteena olevan DNA-jakson edellä. Signaalijakso toimii ilmentämistuotteen kuljettamiseksi soluseinään, jossa se pilkotaan tuotteesta erityksen tapahtuessa. Edellä 25 kuvatulla tavalla määriteltyyn termiin "ohjaavat jaksot" on ... tarkoitus kuulua signaalijakso silloin kun tämä esiintyy.

Esimerkit

Kohdemutaatioiden valmistamisesta subtilisiinigeeniin muo-30 dostuu käyttökelpoisia kemiallisia ominaisuuksia sisältäviä mutantteja

Materiaalit ja menetelmät Bakteerikannat B. subtilis 309 ja 147 ovat Bacillus lentuksen variantteja, 35 jotka on talletettu talletuslaitokseen NCIB ja joille on annettu hakunumerot NCIB 10147 ja NCIB 10309 ja nämä on kuvattu US-patenttijulkaisussa n:o 3 723 250, joka on jul- • · 46 102907 kaistu 27.3.1973 ja joka on liitetty tähän patenttihakemus-julkaisuun tähän oikeuttavien säädösten nojalla.

B. subtilis DN 497 on kuvattu US-patenttihakemusjulkaisussa 5 sarjan:o 039 298, joka on jätetty 17.4.1987 ja joka vastaa EP-patenttihakemusjulkaisua n:o 242 220, joka myös on liitetty tähän patenttihakemusjulkaisuun siihen oikeuttavien säädösten nojalla ja tämä on RUB 200:n aro+-transformantti, jonka kromosomaalinen DNA on peräisin SL 438:sta, joka on 10 sporulaatioon kykenemätön ja proteaaseja vailla oleva kanta ja joka on saatu Dr. Kim Hardylta Biogen-yhtiöstä.

E. coli MC 1 000 r^t (Casadaban, M.J. ja Cohen, S.N., J. Mol. Biol. 138 (1980) 179 - 207) tehtiin r"“+:ksi ta-15 vanomaisin menetelmin ja se on myös kuvattu US-patenttihakemus julkaisussa sarjanumero 039 298.

B. subtilis DB105 on kuvattu julkaisussa Kawamura, F. ja Doi, R.H. "Construction of a Bacillus subthis double mutant 20 deficient in extracellular alkaline and neutral proteases" J. Bacteriol. 160 (1984) 442 - 444.

Plasmidit pSX50 (kuvattu US-patenttihakemusjulkaisussa sarjanumero 25 039 298 ja tämä on liitetty tähän patenttihakemusjulkaisuun

... siihen oikeuttavien säädösten nojalla) on plasmidin pDN

1050 johdannainen ja se käsittää promoottori-operaattorin PjOj, B. pumiluksen xyn B -geenin ja B. subtiliksen xyl R -geenin.

30 pSX62 (kuvattu US-patenttihakemusjulkaisussa sarjanumero 039 298, katso yllä) on pSX52:n johdannainen, joka käsittää fuusiogeenin, joka on muodostettu vasikan proky-mosiinigeenistä ja B. pumiluksen xyn B -geenistä ja joka on 35 sijoitettu pSX50:aan (katso yllä). pSX62 muodostettiin liittämällä E. colin rrn B -terminaattori pSX52:een proky-mosiinigeenin jälkeen.

47 102907 pSX65 (kuvattu US-patenttihakemusjulkaisussa sarjanumero 039 298, katso yllä) on plasmidin pDN 1050 johdannainen, joka käsittää promoottori-operaattorin P2O2, B. pumiluksen xyn B -geenin ja B. subtiliksen xyl R -geenin.

5 pSX88 (kuvattu kansainvälisessä patenttihakemusjulkaisussa n:o PCT/DK 88/0002 (NOVO INDUSTRI A/S) on pSX50:n johdannainen, joka käsittää subtilisiini-309 -geenin.

10 pSX92 muodostettiin kloonaamalla subtilisiini-309 plasmi-diin pSX62 (katso yllä), joka oli pilkottu Cla I:n ja Hind III:n kohdalta ja Cla I -kohta täytetty ennen kloonatusta subtilisiini-309 -geenistä peräisin olevien Dral - Nhel ja Nhel - Hind III -fragmenttien liittämistä.

15 pSX93, joka on esitetty kuvassa 3, on pUC13 (Vieira ja Messing, Gene 19 (1982) 259 - 268), joka käsittää subti-1isiini-309-geenin 0,7 ke:n suuruisen Xbal - Hind III -fragmentin, mukaanlukien polylinker-jaksoon liitetyn ter-20 minaattorin.

pSX119 (kuvattu kansainvälisessä patenttihakemusjulkaisussa n:o PCT/DK 88/0002 (NOVO INDUSTRI A/S) on pUC13, jossa on polylinker-jaksoon liitetty subtilisiini-309 -geenin Eco-25 Rl - Xbal -fragmentti.

pSX120 on plasmidi, jossa pSX88:sta peräisin oleva subtilisiini-309 -geenin sisältävä Hpal - Hindlll -fragmentti on liitetty pDN 1681:ssa olevaan EcoRV - Hindlll -fragmenttiin 30 siten, että proteaasigeeni ilmentyy amy M- ja amy Q-pro- .. moottorien avulla. pDN1681 on saatu pDN1380:sta (Diderich- ·' sen B. ja Christiansen, L. FEMS Microbiology Letters 56 (1988) 53 - 60) siten, että siinä on tähän liitetty B. amy-loliquefaciensista peräisin oleva 2,85 ep:n suuruinen Clal-35 fragmentti, joka sisältää amy Q-geenin promoottoreineen (Takkinen et ai., J. Biol. Chem. 258 (1983) 1007ff.) 48 1 0 2 9 0 7 pUC13 on kuvattu julkaisussa Vieira, J. ja Messing, J. Gene 19 (1982) 259 - 268.

pUC19 on kuvattu julkaisussa Yanisch-Perron, C. ja Vieira, 5 J. Messing, J., Gene 33 (1985) 103 - 119.

pUBHO on kuvattu Lacey, R.W., Chopra, J., "Genetic studies of a multiresistant strain of Staphylococcus aureus", J. Med. Microbiol. 7 (1974) 285 - 297, ja julkaisussa Zyprian, 10 E., Matzura, H. "Characterization of signals promoting gene expression on the Staphylococcus aureus plasmid pUBHO and development of a Gram-positive expression vector system" DNA 5 (1986) 219 - 225.

15 Geenit

Useita eri subtilisiineja vastaavat geenit saatiin edellä mainittujen kirjallisuusviitteiden mukaisesti. Erityisesti subtilisiini-309 ja 147 -entsyymejä vastaavat geenit saatiin kansainvälisessä patenttihakemusjulkaisussa n:o PCT/DK 20 88/00002 (NOVO INDUSTRI A/S) kuvatulla tavalla, joka liite tään tähän patenttihakemusjulkaisuun kokonaisuudessaan siihen oikeuttavien säädösten nojalla.

Subtilisiini Carlsberg -geenin konstruktio 25 Suunniteltiin kypsän subtilisiini Carlsberg -proteaasin * ' koodaavaan jaksoon perustuva synteettinen geeni ja sen transkription terminaattori (Jacobs, M. Eliasson, M., Uh-len, M., Flock, J.-I. Cloning, sequencing and expression of subtilisin Carlsberg from Bacillus licheniformis Nucleic 30 Acids Res. 13 (24) (1985), 8913 - 8926), liitettiin subti- .. lisiini-BPN’-proteaasin (Wells, J.A., Ferrari, E., Henner, ' D.J., Esteli, D.A., Chen, E.Y. Cloning, sequencing and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis, Nuclei Acids Res. 11 (22) (1983) 7911 - 35 7925) koodaaviin pre- ja pro-jaksoihin. Geeni jaettiin seitsemään fragmenttiin, joiden pituudet olivat alueella N * 49 102907 127 - 313 emäsparia, siten että kukin fragmentti oli rakentunut kemiallisesti syntetisoiduista oligonukleotideista, joiden pituuudet oliva 16 - 77 nukleotidia. Kahden nauhan oligonukleotidin välinen limittäisyys optimoitiin kunkin 5 fragmentin yhdessä vaiheessa pituussuunnassa tapahtuvan liittämisen helpottamiseksi (Mullenbach, G.T., Tabrizi, A., Blacher, R.W., Steimer, K.S. Chemical synthesis and expression in Yeast of a gene encoding connective tissue activating peptide-III, J. Biol. Chem. 261 (2) (1986), 719 -10 722). Kukin fragmentti koottiin ja kloonattiin E. coli -kloonaus- ja sekvenssointivektorissa. Näiden kloonattujen fragmenttien sekvenssien analyysi suoritettiin kunkin fragmentin sekvenssin oikeellisuuden varmistamiseksi. Tämän jälkeen kaikki fragmentit koottiin yhteen ja kloonattiin 15 vektoriin pUBHO (Lacey, R.W., Chopra, J. Genetic studies of a multiresistant strain of Staphylococcus aureus, J.

Med. Microbiol. 7 (1974) 285 - 297) ja tuotiin B. subtilis DB105:een (Kawamura, F., Doi, R.H. Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient in extracellular alka-20 line and neutral proteases, J.Bacteriol. 160 (2) (1984) 442 - 444) . Geenin transkriptio aloitettiin pUBHO plasmi-divektorin Hpall-promoottorilla (Zyprian, E., Matzura, H. Characterization of signals promoting gene expression on the Staphylococcus aureus plasmid pUBllO and development of 25 a Gram-positive expression vector system, DNA 5(3) (1986) . 219 - 225). Geenikonstruktion suorittamisen aikana osoit tautui, että pisin fragmentti (#5; 313 eroäsparin mittainen) oli tarpeen fragmentoida edelleen (#8 ja #9), jotta olisi vältetty tämän suhteellisen pitkän fragmentin kokoamison-30 gelmat.

Nukleotidijaksosta päätelty aminohappojakso poikkeaa aiemmin subtilisiini Carlsbergille julkaistusta jaksosta asemissa 129, 157, 161 ja 212 (Smith, E.L., DeLange, R.J., 35 Evans, W.H., Landon, W., Markland, F.S., Subtilisin Carlsberg V. The conplete sequence: comparison with subtilisin BPN I; evolutionary relationships, J. Biol. Chem. 243 (9) * 50 102907 (1968) 2184 - 2191). Viidettä muutosta, jonka Jacobs et ai (1985) ovat raportoineet, ei voitu vahvistaa tässä kuvatussa Carlsberg-geenin kloonissa 5 Isoelektrisen pisteen (pl0) laskeminen

Seuraavassa esitetään esimerkki villityypin subtilisiini-309-entsyymin (S000) isoelektrisen pisteen laskemisesta käytetyn laskentatavan demonstroimiseksi. Sama laskentatapa on tietenkin sovellettavissa mistä tahansa entsyymistä 10 suoritettaviin laskutoimituksiin riippumatta siitä onko tämä mutanttientsyymi vai ei.

Kullekin mahdollisesti varaukselliselle aminohapporyhmälle annettiin pK-arvot (Tyr, Asp, Glu, Cys, Arg, His, Lys, N-15 terminaalinen ryhmä, C-terminaalinen ryhmä, Ca2+) . Tässä tapauksessa otettiin huomioon ympäristö, jossa samaa amino-happoryhmää kohti käytetään erilaisia pK-arvoja riippuen tämän viereisistä ryhmistä. Annetut arvot on esitetty taulukossa II.

20 Tämän jälkeen laskettiin se suhde, jossa aminohapporyhmä esiintyy tietyssä pH:ssa varauksellisessa tai varauksettomassa muodossa (varauksellinen/varaukseton, C/U(i)) sekä negatiivisen että positiivisen varauksen osalta käyttäen 25 kaavoja Ia ja Ib, tässä järjestyksessä mainittuna. Tämä . suhde on ilmoitettu taulukossa II pH-arvon osalta, joka vastaa pl0:aa.

Tämän jälkeen laskettiin suhteellinen varaus Qr(i) eli va-30 rauskontribuutio, joka annettiin kullekin varaukselliselle ryhmälle käyttäen kaavoja Ha ja Hb: pH-arvo, jossa kaikkien varauksen muodostavien ryhmien summa on 0, haettiin iteroimalla.

51 102907

Taulukko II Isoelektrisen pisteen laskeminen S000 subti-lisiini-309:lie 5 Ryhmien Q,(i) 0,(1) 0,(1) luku- pH *

Ryhmä pK määrä C/U(i)* pH 8,3 pH 10,0 pl0

Tyr 9,9 3 2,51E-02 -0,07 -1,67 -1,77 10

Tyr 11,6 2 5,01E-04 0,00 -0,05 -0,06

Tyr 12,5 2 6,31E-05 0,00 -0,01 -0,01 15 Asp 3,5 5 6,31E+04 -5,00 -5,00 -5,00

Glu 4 5 2,00E+04 -5,00 -5,00 -5,00 C-term. 3 1 2,00E+05 -1,00 -1,00 -1,00 20 (Arg)

Cys 9,3 0 1,00E-01 0,00 0,00 0,00

Arg 12,8 8 3,16E+04 8,00 7,99 7,99 25

His 6,4 7 l,26E-02 0,09 0,00 0,00

Lye 10 5 5,01E+01 4,90 2,50 2,34 30 Kalsium 20 1,25 5,01E+11 2,50 2,50 2,50 N-term. 8 1 5,01E-01 0,33 0,01 0,01 (Ala) 35 Netto- 4,75 0,27 0,0 varaus

Laskettu isoelektrinen piste on 10,06 * E-02 * 10'* 40

Kuten edellä ja taulukossa II on kuvattu, kullekin aminohapolle annetut pK-arvot erosivat toisistaan ympäristön paikallisten vaihteluiden huomioonottamisen seurauksena. Ainoa . tulos tästä on se, että laskennassa päästään parempaan N* . .

52 102907 tarkkuuteen, vaikka kokemus on osoittanut, että vakioisiksi arvioitujen pK-arvojen avulla kyetään löytämään se suunta, mihin tietyn mutanttientsyymin pl0 siirtyy lähtömuotoa olevan entsyymin pl0:aan verrattuna. Tämä on esitetty taulu-5 kossa III, jossa on esitetty arvioituja pK-arvoja vastaavat pl0-arvot.

Jotta oltaisiin voitu verrata eri entsyymejä ja mutant-tientsyymejä, suoritettiin jäljempänä yksityiskohtaisesti 10 kuvattuja pesukokeita. Taulukossa III esitetään taulukon muodossa tulokset näistä testeistä, joissa käytettiin läh-tömuotoista entsyymiä ja mutanttientsyymejä subtilisiinista 309 (jolle on annettu nimitys S000 jne.) ja subtilisiini Carlsbergistä (jolle on annettu nimitys C000 jne.), jotta 15 oltaisiin voitu demonstroida pl0:n ja käytetyn pesuliuoksen eri pH-arvoissa havaittavan pesutehokkuuden välinen korrelaatio. Pesutesteissä käytettiin pienen suolapitoisuuden sisältävää nestemäistä detergenttiformulaatiota, jonka pH oli 8,3 ja joka oli detergenttiesimerkin D7 mukainen, ja 20 normaalin suolapitoisuuden sisältävää detergenttijauhetta, jonka pH oli 10,2 ja joka oli detergenttiesimerkin D2 mukainen.

Taulukossa III esitetyt tulokset on esitetty suhteellisina 25 tuloksina villityypin entsyymeihin (S000 ja C000, tässä . järjestyksessä mainittuna) verrattuna. Entsyymien lasketut ja havaitut pl0-arvot myös esitetty.

53 1 0 2 9 0 7

Taulukko III

Vertailevat pesututkimukset eri pH-arvoissa Mutantti pl0 Parantimistekijä laskettu havaittu Detergentin pH 5 8,3 10,2 5000 10,02 9,7 1 1 5001 9,86 9,4 2,2 1 5003 9,86 9,4 2,0 1 5004 9,68 9,1 3,9 1 10 S005 9,71 9,1 1,5 1 S012 9,09 8,8 5,0 0,6 5019 9,09 8,5 5,8 0,6 5020 6,71 7,9 8,8 0,5 5021 9,85 - 1,8 0,7 15 S022 8,07 - 9,0 0,3 5023 8,05 - 9,8 0,2 5024 6,86 - 9,0 0,2 5025 8,94 - 6,9 0,6 S027 10,28 - 0,4 1,0 20 S028 10,28 - 0,9 1,0 5031 10,53 - 0,4 0,7 5032 10,28 - 0,7 5033 10,28 - 0,4 S035 8,07 - 8,0 0,6 25 S201 9,85 - 2,0 0,7 5202 9,62 - 4,3 0,9 5203 9,27 - 9,0 0,5 C000 8,87 - 1 1 C001 9,38 - 0,2 1,5 30 C002 9,38 - 0,8 1,9 C003 9,38 - 0,4 1,1 C004 9,64 - 0,2 1,8 C008 9,38 - 0,2 1,5

Taulukosta III havaitaan, että pl0:n siirtäminen matalampien arvojen suuntaan (S-sarja) saa aikaan pesutehokkuuden 35 54 1 0 2 9 0 7 paranemisen matalassa pH:ssa (pH * 8,3), kun taas pl0:n siirtäminen ylöspäin (C-sarja), saa aikaan pesutehokkuuden parantumisen korkeassa pH:ssa (pH - 10,2).

5 Isoelektrisen pisteen käsitteen on siten havaittu olevan hyvin käyttökelpoinen valittaessa niiden aminohappojen asemia, jotka lähtömuotoisessa entsyymissä tulisi muuttaa.

On usein havaittu, että mutaatioiden aiheuttaminen tulisi 10 suorittaa niissä kodoneissa, jotka vastaavat entsyymimole- kyylin pinnalla tai sen lähellä olevia aminohappoja, jotta lähtömuotoisen entsyymin sisärakenne säilyisi ennallaan mahdollisimman hyvin.

15 Subtilisiinien puhdistus

Suoritusvaiheet liittyvät subtilisiini-147-entsyymin, sub-tilisiini-309-entsyymin tai näiden mutanttien tyypilliseen puhdistukseen 10 litran mittakaavassa suoritetusta fermen-taatiosta.

20

Noin 8 litraa fermentointiliuosta sentrifugoitiin 1 litran astioissa 5 000 kierroksen minuuttinopeudella 35 min ajan. Supernatanttien pH säädettiin arvoon 6,5 käyttäen 10-%:sta etikkahappoa ja suodatettiin Seitz Supra S100 -levysuodat-25 timilla.

Suodokset väkevöitiin noin 400 ml:ksi käyttäen Amicon CH2A UF-yksikköä, joka oli varustettu Amicon S1Y10 UF -kasetilla. UF-konsentraatti sentrifugoitiin ja suodatettiin ennen 30 sen adsorbtiota huoneenlämmössä basitrasiiniaffiniteetti- pylvääseen pH:ssa 7. Proteaasi eluoitiin basitrasiinipyl-väästä huoneenlämmössä käyttäen 25-%:sta 2-propanolia ja 1 M natriumkloridia, jotka oli valmistettu puskuriliuokseen käyttäen 0,01 dimetyyliglutaarihappoa, 0,1 M boorihappoa ja 35 0,002 M kalsiumkloridia ja säädetty pH-arvoon 7.

\ .

55 102907

Basitrasiinipuhdistusvaiheesta saadut proteaasiaktiivisuut-ta omaavat fraktiot yhdistettiin ja ne lisättiin 750 ml:n suuruiseen Sephadex G25 -pylvääseen (läpimitta 5 cm), joka oli tasapainotettu puskuriliuoksella, joka sisälsi 0,01 di-5 metyyliglutaarihappoa, 0,2 H boorihappoa ja 0,002 M kal-siumkloridia ja jonka pH oli säädetty arvoon 6,5.

Sephadex G25 -pylväästä saadut proteolyyttistä aktiivisuutta omaavat fraktiot yhdistettiin ja ne vietiin 150 ml:n 10 suuruiseen CM Sepharose CL 6B -kationinvaihtopylvääseen (läpimitta 5 cm), joka oli tasapainotettu puskurilla, joka sisälsi 0,01 M dimetyyliglutaarihappoa, 0,2 M boorihappoa ja 0,002 M kalsiumkloridia ja jonka pH oli säädetty arvoon 6,5.

15

Proteaasi eluoitiin käyttäen lineaarista 0 - 0,1 M natrium-kloridigradienttia, joka oli valmistettu kahteen litraan samaa puskuria (0 - 0,2 M natriumkloridi sub-147:n tapauksessa) .

20

Viimeisessä puhdistusvaiheessa CM Sepharose -pylväästä saadut proteaasia sisältävät fraktiot yhdistettiin ja väke-vöitiin Amicon-ultrasuodatuskammiossa, joka oli varustettu GR81PP-kalvolla (saatu yhtiöstä Danish Sugar Factories 25 Inc.).

Subtilisiini-309 ja tämän mutantit Gly 195 Glu (G195E (S001)):

Arg 170 Tyr (R170Y (S003)): 30 Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu (R170Y+G195E (S004)):

Lys 251 Glu (K251E (S005)): : His 120 Asp (H120D (S006)):

Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu + Lys 251 Glu (R170Y+G195E+K251E (S012)): 35 Lys 235 Leu (K235L (S015)):

His 120 Asp + Gly 195 Glu + Lys 235 Leu (H120D+G195E+K235L (S017)): - 56 102907

His 120 Asp + Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu + Lys 235 Leu (H120D+R170Y+G195E+K235L (S019)):

His 120 Asp + Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu + Lys 235 Leu + Lys 251 Glu (H120D+R170Y+G195E+K235L+K251E (S020): 5 puhdistettiin tällä menetelmällä.

(Mutatoitujen) subtilisiini Carlsberg -proteaasien puhdistus 10 Fermentaatioliuokset vietiin joko suoraan basitrasiini- affiniteettipylvääseen (läpimitta 5 cm * 15 cm; tasapainotettu 10 mM Tris/HCl-puskurilla, pH 7,9; virtausnopeus noin 500 ml/h) tai väkevöitiin 500 ml:ksi käyttäen Nephross Andante H.F. dialyysilaitetta (Organon Techika) käyttäen 15 69 - 83 kPa:n suuruista vastapainetta ja käyttäen ulkopii- rissä demineralisoitua vettä. Jälkimmäisessä tapauksessa proteaasi saostui väkevöidystä liuoksesta, kun siihen lisättiin ammoniumsulfaattia 600 g/1. Saostuma koottiin talteen sentrifugoimalla ja liuotettiin uudelleen n. 500 20 ml:aan demineralisoitua vettä. Ammoniumsulfaatti poistettiin proteaasiliuoksesta käyttäen samaa dialyysilaitetta, joka oli kuvattu edellä. Lopullinen tilavuus oli noin 300 ml ja liuoksen pH oli säädetty arvoon 6,0. Proteaasi eluoi-tiin (edellä mainitusta) basitrasiinipylväästä käyttäen 10 25 mM Tris-puskuria (pH 7,9), joka sisälsi 2,7 M NaClrää ja 18 % isopropanolia.

Basitrasiinilla puhdistetun tai väkevöidyn proteaasimateri-aalin dialyysin jälkeen suoritettiin puhdistus vielä vie-30 mällä materiaali CM-Trisakryyli-ioninvaihtopylvääseen (lä pimitta 5 cm * 15 cm; joka oli tasapainotettu 0,03 M nat-riumfosfaatilla, pH 6,0) käyttäen virtausnopeutena 200 ml/h. Proteaasi eluoitiin pylväästä fosfaattipuskuriin valmistetulla lineaarisella 0 - 0,3 M NaCl-gradientilla (2 35 X 500 ml), Proteaasiaktiivisuutta sisältävät fraktiot koottiin yhteen ja varastoitiin kylmäkuivauksen jälkeen.-20 °C:ssa puskurisuolojen läsnäollessa.

i 57 102907

Oligonukleotidisynteesi

Kaikki yhteensopimattomia kohtia sisältävät alukkeet syntetisoitiin Applied Biosystems 380 A DNA-syntetisointilait-teella ja puhdistettiin polyakryyliamidigeelielektroforee-5 silla (PAGE).

Proteolyyttisen aktiivisuuden määritys

Hutatoitujen entsyymien proteolyyttinen aktiivisuus määritettiin sen määrittämiseksi, missä määrin entsyymin kata-10 lyyttinen aktiivisuus oli säilynyt. Määritykset suoritettiin käyttäen dimetyylikaseiini (DMC) -menetelmää, joka on kuvattu NOVO:n julkaisussa AF 220-gb (tai myöhemmissä painoksissa) , joka on saatavilla yhtiöstä Novo-Nordisk a/s, Bagsvsrd, Tanska, ja joka julkaisu on liitetty tähän pa-15 tenttihakemusjulkaisuun siihen oikeuttavien säädösten no jalla.

Pesutehokkuuden määritys A: 20 Tutkittavat kankaat (2,2 cm x 2,2 cm (noin 0,1 g)) esikäsi-teltiin käyttämällä liisteripoistettua puuvillakangasta (100-%:nen puuvilla DS 71) oleva kangasmateriaali TH-tyyp-pisen Mathis Washing and Drying Unit -laitteen (Werner Mathis AG, Ziirich, Sveitsi) astiassa, joka sisälsi ruohosta 25 valmistettua nestettä.

Kangaskappaleet kuivattiin voimakkaassa ilmavirrassa huoneenlämmössä ja varastoitiin huoneenlämmössä kolme viikkoa ja ne säilytettiin tämän jälkeen -18 eC:ssa ennen käyttöä. 30

Kaikki testaukset suoritettiin pienimittakaavaisessa pe-' susysteemimallilaitteessa. Tässä systeemissä pestään kuusi tutkittavaa kangaskappaletta 150 ml:n dekantterilasissa, joka sisältää 60 ml detergenttiliuosta. Dekantterilasit 35 säilytetään termostaattisella vesihauteella 37 °C:ssa se koittaen niitä magneettisekoittajalla. Detergenttinä käytetään seuraavaa nestemäistä standardidetergenttiliuosta: 58 102907 AE, Berol 160 15 % LAS, Nasa 1169/P 10 % kookosrasvahappo 9 % Öljyhappo 1 % 5 trietanoliamiini 9 % glyseroli 10,5 % etanoli 1,5 % tri-Na-sitraatti . 2 H20 8 %

CaCl2 . H20 0,1 % 10 NaOH 1 % vesi LAS:stä 23,3 % vesi glyserolista 1,5 % lisätty vesi 34,9 % 15 Annetut prosenttiosuudet ovat aktiivisen aineen prosent tiosuuksia.

pH säädettiin 1 N NaOH:11a arvoon 8,14. Käytetty vesi oli kovuudeltaan noin 6° dH (saksalaisen kovuusluokituksen 20 mukaisesti).

Testaukset suoritettiin entsyymipitoisuuksissa, joissa käytettiin pitoisuuksia 0, 1,0 mg entsyymiproteiinia/1 ja 10,0 mg entsyymiproteiinia/1 ja suoritettiin kaksi toisis-25 taan riippumatonta koesarjaa kunkin mutantin osalta. Seu-raavassa esitetyt tulokset ovat keskiarvoja näistä kokeista.

Pesut suoritettiin 60 min ajan ja pesun jälkeen kangaspalat 30 huuhdeltiin lävikössä juoksevassa vesijohtovedessä 25 minuuttia.

Vaatekappaleet kuivattiin tämän jälkeen yön yli (suojattuna päivänvalolta) ja remissio, R, määritettiin ELREPHO 2000-35 fotometrillä, joka oli hankittu yhtiöstä Datacolor S.A. Dietkikon, Sveitsi 460 nm:ssa).

59 102907

Pesutehon mittana käytettiin differentiaalista remissiota, delta R, siten, että se vastasi entsyymin läsnäollessa suoritetusta pesusta saatua remissiota, josta oli vähennetty sellaisesta pesusta saatu remissio, jossa ei käytetty 5 entsyymiä.

B:

Useiden eri mutanttien pesutehokkuus tutkittiin ruohones-teellä liattuja puuvillakangaskappaleita vastaan edellä 10 kuvatun menetelmän mukaisesti.

Käytettiin 2,0 g USA:ssa kaupan olevaa nestemäistä deter-genttiä.

15 Detergentti liuotettiin 0,005 M etanoliaminipuskuriin io- ninvaihtimessa käsiteltyyn veteen. pH säädettiin arvoihin 8,0, 9,0, 10,0 ja 11,0, tässä järjestyksessä mainittuna, käyttäen NaOH/HCl:ää.

20 Lämpötila pidettiin tasaisena 37 °C:ssa.

Kutakin mutanttia annosteltiin 0,25 mg entsyymiproteii-nia/litra.

25 C:

Pesukokeet, joissa käytettiin jäljempänä mainituissa deter-genttiesimerkeissä olevia esimerkkikoostumuksia, suoritettiin pienoispesulaitteessa, jossa käytettiin testauskangas-kappaleita, jotka sisäsivät väriaineita, rasvaa ja prote-30 iineja (kaseiinia). Olosuhteet olivat a) 2 g/1 detergenttiä D3 vedessä, jonka kovuus oli 6° fH (ranskalainen kovuus) pH-arvossa 8,3 tai b) 5 g/1 detergenttiä D2 vedessä, jonka kovuus oli 15° fH ja pH-arvo oli 10,2.

Kun näytteet oli huuhdottu ja kuivattu, mitattiin heijastuma 460 nm:ssa.

35 60 102907

Parantumistekijä laskettiin annos-vaste-käyrästä ja siitä käy ilmi se entsyymimäärä, joka tarvitaan tietyn delta R -arvon saamiseksi verrattuna kyseiseen villityyppiseen entsyymiin (S000 ja COOO), joka tarkoittaa sitä, että kah-5 denarvoinen parantumistekijä viittaa vain puoleen entsyymi-määrästä, joka tarvitaan saman delta R-arvon saamiseksi.

Näiden tutkimusten tulokset on esitetty taulukossa III.

10 D:

Lipaasin pysyvyyden kokeelliset tutkimukset suoritettiin esimerkiksi käyttäen seuraavia materiaaleja: 1 LU/ml Pseudomona cepacia -lipaasia inkuboitiin kunmassa-15 kin kahden tyyppisessä, O- ja W-tyyppisessä, pesunesteessä.

Näytteitä otettiin aikavälein ja näistä testattiin li-paasiaktiivisuus. Suoritettiin rinnakkaisia inkubointeja ilman proteaasia tai proteaasin kanssa käyttämällä jäljempänä mainittuja eri tyyppejä sen tutkimiseksi, mikä vaiku-20 tus proteaasilla on lipaasiaktiivisuuden säilymiseen. Vil- lityyppiset proteaasit tutkittiin käyttäen niiden konsent-raationa 20 GU/ml ja mutatoidut proteaasit tutkittiin käyttäen konsentraatiota 0,5 μς/ιηΐ.

25 Entsyymivariantteja käsittävät detergenttikoostumukset

Detergentti Dl; Tämän keksinnön mukaisen sovellutusmuodon mukainen fosfaat-titehoainetta sisältävä detergenttijauhe formuloidaan siten, että siinä on aktiivista detergenttiä yhteensä noin 30 16 %, anionista detergenttiä n. 9 %, ionitonta detergenttiä n. 6 %, fosfaattipitoista tehoainetta n. 20 %, akryyli- tai tätä vastaavaa polymeeriä n. 3,5 % (vaihtoehtoisesti väheni-män, mutta ei alle noin 2 %), perboraatti-valkaisuaineen esimuotoa n. 6 - 18 %, vaihtoehtoisesti n. 15 - 20 %, 35 aminoryhmän sisältävää valkaisuaineen aktivaattoria n. 2 %, silikaattia tai muuta rakenneainetta n. 3,5 %, jota voi vaihtoehtoisesti olla korkeintaan 8 %, entsyymiaktiivisuut 61 102907 ta n. 8 glysiiniyksikköä/mg sekä alkalia pH:n säätämiseksi haluttuun käytössä saavutettavaksi asetettuun pH-arvoon ja neutraalia epäorgaanista suolaa ja entsyymejä (kutakin entsyymiä noin 0,5 %).

5

Anioninen detergentti on seos, jossa on 6 % natriumdode-kyylibentseenisulfonaattia tai vaihtoehtoisesti natrium (lineaarinen alkyylibentseeni)sulfonaattia ja 3 % primääristä alkyylisulfaattia. Ioniton detergentti on etoksy-10 laattia, jossa on primääristä noin C13 - C15 -alkoholia ja moolia kohti 7 etoksylaattiryhmää. Fosfaattitehoaine on natriumtripolyfosfaattia. Polymeeri on polyakryylihappoa, vaihtoehtoisesti akryylihappo/maleiinihappo-sekapolymeeria. Perboraatti- valkaisuaineen esimuoto on natriumtetraboraat-15 titetrahydraattia tai -monohydraattia. Aktivaattori on tetra-asetyylietyleenidiamiinia. Rakenneaine on natriumsi-likaattia. Neutraali epäorgaaninen suola on natriumsulfaat-tia.

20 Entsyymit käsittävät mutantin S001 mukaisen proteaasin tai vaihtoehtoisesti proteaasin S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S015, S017, S021, S226, S223, S224 tai S225.

25 Detergentti Dia: Tämän keksinnön mukaisen sovellutusmuodon mukainen fosfaat-titehoainetta sisältävä detergenttijauhe formuloidaan siten, että siinä on aktiivista detergenttiä yhteensä noin 15 %, anionista detergenttiä n. 7 %, ionitonta detergenttiä 30 n. 6 %, fosfaattipitoista tehoainetta n. 25 %, akryyli- tai tätä vastaavaa polymeeriä n. 0,5 % perboraatti-valkaisuai-neen esimuotoa n. 10 %, aminoryhmän sisältävää valkaisuaineen aktivaattoria n. 2 %, silikaattia tai muuta rakenne-ainetta n. 6 %, entsyymitaso n. 8 glysiiniyksikköä/mg sekä 35 alkalia pH:n säätämiseksi haluttuun käytössä saavutettavak si asetettuun pH-arvoon ja neutraalia epäorgaanista suolaa ja entsyymejä (kutakin entsyymiä noin 0,5 %).

62 102907

Anioninen detergentti on natrium(lineaarinen alkyylibent-seeni)sulfonaattia. Ioniton detergentti on etoksylaattia, jossa on primääristä noin C13 - C15 -alkoholia ja moolia kohti 7 etoksylaattiryhmää tai se on tämän ja sellaisen 5 vastaavan alkoholin seos, joka on etoksyloitu sisältämään 3 etoksyyliryhmää moolia kohti. Fosfaattitehoaine on nat-riumtripolyfosfaattia. Perboraatti- tai perhappo-valkaisu-aineen esimuoto on natriumtetraboraattitetrahydraattia. Aktivaattori on tetra-asetyylietyleenidiamiinia. Rakenneai-10 ne on natriumsilikaattia. Neutraali epäorgaaninen suola on natriumsulfaattia. Entsyymit käsittävät mutantin S001 mukaisen proteaasin tai vaihtoehtoisesti proteaasin S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S015, S017, S021 ja S226.

15

Detergentti D2: Tämän keksinnön mukaisen sovellutusmuodon mukainen zeoliit-titehoainetta sisältävä detergenttijauhe formuloidaan siten, että siinä on aktiivista detergenttiä kaikkiaan noin 20 16 %, anionista detergenttiä n. 9 %, ionitonta detergenttiä n. 6 %, zeoliittipitoista tehoainetta n. 20 %, akryyli- tai tätä vastaavaa polymeeriä n. 3,5 %, perboraatti-valkaisuai-neen esimuotoa n. 6 - 18 %, aminoryhmän sisältävää valkaisuaineen aktivaattoria n. 2 %, silikaattia tai muuta 25 rakenneainetta n. 3,5 %, jota voi vaihtoehtoisesti olla vähemmän, mutta ei alle noin 2,5 %, entsyymitaso n. 8 (vaihtoehtoisesti noin 15) glysiiniyksikköä/mg sekä alkalia pH:n säätämiseksi haluttuun käytössä saavutettavaksi asetettuun pH-arvoon ja neutraalia epäorgaanista suolaa ja 30 entsyymejä (kutakin entsyymiä noin 0,5 %).

Anioninen detergentti on seos, jossa on 6 % natriumdode-kyylibentseenisulfonaattia tai vaihtoehtoisesti natrium (lineaarinen alkyylibentseeni)sulfonaattia ja 3 % pri-35 määristä alkyylisulfaattia. Ioniton detergentti on etoksylaattia, jossa on primääristä noin C13 - C15 -alkoholia ja moolia kohti 7 etoksylaattiryhmää. Zeoliittitehoaine on A- 63 102907 tyypin zeoliittia. Polymeeri on polyakryylihappoa, Perbo-raatti-valkaisuaineen esimuoto on natriumtetraboraattitet-rahydraattia tai -monohydraattia. Aktivaattori on tetra-asetyylietyleenidiamiinia. Rakenneaine on natriumsilikaat-5 tia. Neutraali epäorgaaninen suola on natriumsulfaattia.

Entsyymit käsittävät mutantin S001 mukaisen proteaasin tai vaihtoehtoisesti proteaasin S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S015, S017, S021 tai S226 mukaisen proteaasin.

10

Detergentti D2a Tämän keksinnön mukaisen sovellutusmuodon mukainen zeoliit-titehoainetta sisältävä detergenttijauhe formuloidaan siten, että siinä on aktiivista detergenttiä kaikkiaan noin 15 14 %, anionista detergenttiä n. 7 %, ionitonta detergenttiä n. 7 %, zeoliittipitoista tehoainetta n. 25 %, akryyli- tai tätä vastaavaa polymeeriä n. 3 %, perboraatti- tai perhap-po-valkaisuaineen esimuotoa n. 10 %, aminoryhmän sisältävää valkaisuaineen aktivaattoria n. 2 %, silikaattia tai muuta 20 rakenneainetta n. 0,5 %, entsyymitaso n. 6 glysiiniyksik-köä/mg sekä alkalia pH:n säätämiseksi haluttuun käytössä saavutettavaksi asetettuun pH-arvoon ja neutraalia epäorgaanista suolaa ja entsyymejä (kutakin entsyymiä noin 0,5 %).

25

Anioninen detergentti on natrium(lineaarinen alkyylibent-seeni)sulfonaattia ja 3 % primääristä alkyylisulfaattia. Ioniton detergentti on kahden primäärisestä noin C13 - C15 -alkoholista muodostuvan etoksylaatin seos, joissa yksi 30 mooli toista detergenttiä sisältää 7 ja yksi mooli toista detergenttiä sisältää 3 etoksylaattiryhmää. Zeoliittiteho-aine on A-tyypin zeoliittia. Polymeeri on akryylihappo/ma-leiinihapposekapolymeeriä. Perboraatti-valkaisuaineen esimuoto on natriumtetraboraattimonohydraattia. Aktivaattori 35 on tetra-asetyylietyleenidiamiinia. Rakenneaine on natrium-silikaattia. Neutraali epäorgaaninen suola on natriumsulfaattia. Entsyymit käsittävät mutantin SOOl mukaisen prote- N · 64 102907 aasin tai vaihtoehtoisesti proteaasin S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004f C005, C008, S015, S017, S021 tai S226 mukaisen proteaasin.

5 Detergentti D3: Tämän keksinnön mukainen vesipitoinen nestemäinen detergentti on formuloitu siten, että se sisältää 16 % dodekyy-libentseenisulfonihappoa, 7 % lineaarista C12 - C15 -alkoholia, joka on kondensoitu 7 moolilla etyleenioksidia yhtä 10 alkoholimoolia kohti, 2 % monoetanoliamiinia, 6,5 % sitruunahappoa 6 % natriumksyleenisulfonaattia, noin 4,1 % natriumhydroksidia, 0,5 % proteaasia, vähäisiä määrinä lisätyt lisäaineet ja vettä, joilla koostumus täytetään 100-%:seksi. pH säädetään välillä 9 ja 10 olevaan arvoon.

15 Entsyymi on mutantin S020 mukainen proteaasi tai vaihtoeh toisesti proteaasin S019, S012, S004, S001, S 003, S005, S015, S017, S021, S022, S025, S035, S201, S223, S224, S225 S226 tai S 235 mukaisen proteaasin.

20 Detergentti D4: Tämän keksinnön yhden sovellutusmuodon mukainen vedetön nestemäinen detergentti on formuloitu käyttäen 38,5 % lineaarista primääristä C13 - C15 -alkoholia, joka on alkoksy-loitu 4,9 moolilla etyleenioksidia ja 2,7 moolilla propy-25 leenioksidia moolia kohti, 5 % triasetiinia, 30 % natriumt- rifosfaattia, 4 % kalsinoitua soodaa, 15,5 % natriumperbo-raattimonohydraattia, joka sisältää pienen määrän oksobo-raattia, 4 % TAED:ta, 0,25 % EDTA:a, josta 0,1 % on fos-fonihappona, 0,6 % Aerosil'ia, 1 % SCMC:tä ja 0,6 % prote-30 aasia. pH on säädetty arvojen 9 ja 10 välillä olevaan arvoon, esim. arvoon, joka on noin 9,8. Entsyymit käsittävät mutantin S001 mukaisen proteaasin tai vaihtoehtoisesti proteaasin S003 tai S004, S021, S035, S201, S225, S226 tai S235.

Detergentti D5: « 35 65 102907 Tämän keksinnön yhden sovellutusmuodon mukainen jauhemainen detergentti on formuloitu rakeiseen muotoon, jonka irtoti-heys on ainakin 600 g/1, ja se sisältää noin 20 paino-% pinta-aktiivista ainetta, josta noin 10 % on natriumdode-5 kyylibentseenisulfonaattia ja loppuosa Synperonic A7:n ja

Synperonic A3:n (noin 5,5 % - 4,5 %) seosta, ja nollatasol-la neutraalia epäorgaanista suolaa (esimerkiksi natriumsulfaattia) , sekä noin 33 % fosfaattitehoainetta, noin 16 % natriumtetraperboraattitetrahydraattia, noin 4,5 % TAED-10 aktivaattoria, noin 6 % natriumsilikaattia ja noin 2 % pieniä määriä lisäaineita, mukaanlukien natriumkarbonaatti, ja kosteuspitoisuus noin 10 %. Seokseen on lisätty entsyymejä (kutakin noin 0,5 %). Entsyymi käsittää mutantin S001 mukaisen proteaasin tai vaihtoehtoisesti proteaasin S003 15 tai S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S223, S224, S225, S226 tai S235 mukaisen proteaasin.

Detergentti D6: Tämän keksinnön yhden sovellutusmuodon mukainen jauhemainen 20 detergentti on formuloitu rakeiseen muotoon, jonka irtoti-heys on ainakin 600 g/1 tai vaihtoehtoisesti noin 550 g/1 ja se sisältää noin 20 paino-% tai vaihtoehtoisesti vähemmän, mutta ei alle 16 paino-% pinta-aktiivista ainetta, josta noin 9 % tai vaihtoehtoisesti noin 7 % on natriumdo-25 dekyylibentseenisulfonaattia tai vaihtoehtoisesti nat rium (lineaarinen alkyylibentseeni)sulfonaattia ja loppuosa Synperonic A7:n ja Synperonic A3:n (tai vastaavan etoksy-laatin) seosta (noin 5 % ja 6 %, vaihtoehtoisesti noin 4 % ja 7 %, tässä järjestyksessä mainittuna) ja nollatasolla 30 neutraalia epäorgaanista suolaa (esimerkiksi natriumsul- faattia), sekä noin 30 % tai vaihtoehtoisesti noin 25 % zeoliittitehoainetta, noin 14 % tai 15 % natriumtetraperbo-raattitetrahydraattia tai vaihtoehtoisesti monohydraattia, noin 3,6 % TAED-aktivaattoria, ja pieniä määriä lisäaineita 35 mukaanlukien noin 9 % tai korkeintaan 15 % natriumkarbonaattia, noin 0,7 % Dequest* 2047:ää ja kosteuspitoisuus noin 10 %. Seokseen on lisätty entsyymejä (kutakin noin 0,5 66 102907 % tai noin 0,2 % lipaasia ja noin 0,7 % proteaasia). Entsyymi käsittää mutantin S001 mukaisen tai vaihtoehtoisesti mutantin S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S223, S224, S225, S226 tai S235 mukaisen proteaasin.

5

Detergentti D7:

Yhden tämän keksinnön mukaisen sovellutusmuodon mukainen detergenttijauhekoostumus on formuloitu siten, että se sisältää 6 % dodekyylibentseenisulfonihappoa, 5 % lineaa-10 rista C12 - C15 -alkoholia, joka on kondensoitu 7 moolilla etyleenioksidia alkoholimoolia kohti, 3 % rasvahapposaippu-aa, 3 % Sokolano CP5 -polymeeriä, 22 % zeoliitti A:ta, 10 % natriumkarbonaattia 17 % natriumsulfaattia, 8 % savihiuk-kasia, 13 % natriumperboraattitetrahydraattia, 2 % tetra-15 asetyylietyleenidiamiinia, 0.5 % proteaasia, pieninä määri nä esiintyviä aineosia ja vettä, joilla koostumus täytetään 100 %:iin. pH säädetään arvojen 9 ja 10 välillä olevaan arvoon. Entsyymi käsittää proteaasimutantin S001, tai vaihtoehtoisesti S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, 20 C005, C008, S223, S224, S225, S226 tai S235.

Detergentti D8:

Yhden tämän keksinnön mukaisen sovellutusmuodon mukainen detergentti(saippua)tankokoostumus on formuloitu seuraavas-25 ti: saippua, jonka perustana on 82 % keittämällä saippuoi tua talia ja 18 % kookosöljyä, joka on neutraloitu 0,15-%:sella ortofosforihapolla ja joka on sekoitettu seokseen, jonka koostumus on 2 % natriumformaattia, 2 % booraksia, 2 % propyleeniglykolia ja 1 % natriumsulfaattia, pu-30 ristetään näiden vaiheiden jälkeen saippuaksi saippuan tuotantolinjalla. Entsyymi käsittää mutantin S001, tai vaihtoehtoisesti S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226 tai S235.

Detergentti D9: 35 67 102907

Nestemäiset koostetut detergentit voivat tämän patenttiku-vauksen mukaisen proteaasin lisäksi käsittää esimerkiksi 2 - 15 % ionitonta pinta-aktiivista ainetta siten, että pinta-aktiivisen aineen, joka käsittää ionittoman pinta-5 aktiivisen aineen ja vaihtoehtoisesti käytettävän anionisen pinta-aktiivisen aineen, määrä on kaikkiaan 5 - 40 %, 5 -35 % fosfaattipitoista tai fosfaattia sisältämätöntä tehoainetta 0,2 - 0,8 %, paksuteaineena käytettävää polymeeriä, esimerkiksi silloitettua akryylipolymeeria, jonka molekyy-10 lipaino on yli 106, ainakin 10 % natriumsilikaattia, esimerkiksi neutraalina vesilasina, emästä (esimerkiksi ka-liumpitoista emästä) seoksen pH:n säätämiseksi haluttuun arvoon, joka on edullisesti alueella 9-10 tai tätä korkeammalla, esimerkiksi pH-arvon 11 ylittävä arvo, ja jossa 15 natriumkationin ja silikaattianionin (vapaana piihappona) välinen painosuhde (painon perusteella) on alle 0,7 : 1, ja viskositeetti 0,3 - 30 Pa (20 °C:ssa ja 20s-l).

Sopivat esimerkit sisältävät noin 5 % ionitonta pinta-ak-20 tiivistä ainetta, joka on noin 5 EO-ryhmällä moolia kohti ja noin 2,7 PO-ryhmällä moolia kohti alkoksyloitu C13 - 15 -alkoholi, 15 - 23 % neutraalia vesilasia, jossa piin ja natriumoksidin välinen painosuhde on 3,5, 13 - 19 % KOH:ta, 8 - 23 % STPP:tä, 0 - 11 % natriumkarbonaattia ja 0,5 % 25 Carbopol*941: tä.

«

Proteaasiin (esimerkiksi 0,5 %) kuuluu mutantti S001 tai vaihtoehtoisesti S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226 tai S235.

30

Detergentti D10

Pyykinpesuun soveltuva sakea vesipitoinen nestemäinen detergentti on formuloitu seuraavien painoprosenttien mukaiseksi : sitruunahappo 2,5 booraksi (10 ag) 4 35 68 102907

NaOH 2 glyseroli 5 lineaarinen C14 - C15 -alkyyli-bentseenisulfonaatti tai primää-5 rinen C14 - 15 -alkoholisulfaatti 6,5

Synperonic A3 ioniton C12 - C15 3 EO 1,2

Synperonic A7 ioniton C12 - C15 7 EO 3,6 10 zeoliitti 20 proteaasi 0,5 amylaasi (Termamyl* 300LDX) 0,2 pieninä määrinä olevat aineosat ja vesi täytetään 100 %:ksi 15 pH voidaan säätää arvojen 9 ja 10 välillä olevaan arvoon. Entsyymi käsittää proteaasimutantin S020 tai vaihtoehtoisesti S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S0351 S201, S223, S224, S225, S226 tai S235.

20

Detergentti Dll

Pyykinpesuun soveltuva isotrooppinen vesipitoinen nestemäinen detergentti on formuloitu painoprosentteina seuraavasti: 25 sitruunahappo 2 boorihappo 1

NaOH 3 KOH 4,5 30 glyseroli 10 etanoli 6,5 ioniton pinta-aktiivinen aine (C12 - alkoholi, 6,5 EO-etoksy-laattiryhmää/mol) tai natrium-35 (primäärinen alkoholi)-sulfaatti 10 öljyhappo 16 kookosöljy (C12) -saippua 11 • 69 102907 proteaasi 0,5 pieninä määrinä olevat.aineosat ja vesi täytetään 100 %:ksi 5 pH voidaan säätää arvojen 9 ja 10 välillä olevaan arvoon. Entsyymi käsittää proteaasimutantin S020 tai vaihtoehtoisesti S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201, S223, S224, S225, S226 tai S235.

10 Detergentti D12

Vesipitoinen nestemäinen detergenttikoostumus on formuloitu siten, että sen koostumus on: m natriumalkyylibentseenisulfonaatti 14,5 15 Cl8-natriumsaippua 2 ioniton detergentti (C12 - 15, 6 EO) 9 rasvahappo (öljyhappo) 4,5 natriumalkenyylisukkinaatti 11 propaanidioli 1,5 20 etanoli 3,6 natriumsitraatti 3,2 kompleksoiva aine, esimerkiksi Dequest 2060 0,7 proteaasi 0,5 25 amylaasi 0,1 natriumkloridi 0,5 pieninä määrinä olevat aineosat ja vesi täytetään 100 %:ksi 30 pH voidaan säätää arvojen 9 ja 10 välillä olevaan arvoon.

Entsyymi käsittää proteaasimutantin S020 tai vaihtoehtoisesti S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226 tai S235.

35 Detergentti D13

Vesipitoinen nestemäinen detergenttikoostumus on formuloitu siten, että sen koostumus on: \ * 70 102907 natriumalkyylibentseenisulfonaatti 8 ioniton detergentti 6,5 EO 10 öjyhapon dietyyliamidi 10 rasvahappo (C12/C18 75 : 25) 18 5 natriumsitraatti 1 trietanoliamiini 5 propanoll 7 etanoli 5

Dequest 2060 0,5 10 proteaasi 0,5 amylaasi 0,1 pieninä määrinä olevat aineosat ja vesi täytetään 100 %:ksi 15 pH voidaan säätää arvojen 9 ja 10 välillä olevaan arvoon.

Entsyymi käsittää proteaasimutantin S020 tai vaihtoehtoisesti S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226 tai S235.

20 Detergentti D14

Vedetön nestemäinen detergenttikoostumus on formuloitu siten, että sen koostumus painoprosentteina on: nestemäinen ioniton detergentti 25 (CIO - 12, 6,2 EO) 41 % triasetiini 5 lineaarinen alkyylibentseeni- sulfonihappo 6 ‘ magnesiumoksidistabilisaattori 1 30 natriumkarbonaattitehoaine/emäs 18 kalsiumkarbonaattitehoaine 8 valkaisuaineen aktivaattori TAED 3,5 valkaisuaineen esimuoto perboraattimonohydraatti 10,5 35 osittain hydrofobinen piihappo 2 proteaasi 0,4 lipaasi (Lipolase*) 3 a 71 102907 pieninä määrinä olevat aineosat tai jokin muu nestemäinen ioniton pinta-aktiivinen aine (ei vettä) täytetään 100 %:ksi 5 Tätä koostumusta formuloitaessa lisätään ensin nestemäinen ioniton pinta-aktiivinen aine ja triasetiini, jonka jälkeen lisätään magnesiumoksidi ja tämän jälkeen muut ainesosat entsyymiä lukuunottamatta. Seos käsitellään kolloidimyllys-10 sä, jäähdytetään ja lopuksi lisätään entsyymi(t) ja mitkä tahansa muut lämmölle herkät pieninä määrinä esiintyvät aineosat.

Entsyymi käsittää proteaasimutantin S020 tai vaihtoehtoi-15 eesti S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226 tai S235.

Käyttökelpoisia ovat myös mitkä tahansa EP-patenttijulkaisussa 0 342 177 kuvatut ja esimerkkeinä olevat deter-20 genttiformulaatiot.

Detergenttinä D3 käyttökelpoisia ovat myös EP-patenttijul-kaisussa 0 342 177 esimerkkeinä käytetyt detergenttiformu-laatiot käytettynä yhdessä mutanttien kanssa.

25

Tulokset

Subtilisiini-309-geenin kohdemutaatioden muodostaminen Kohdemutaatiot saatiin aikaan käyttäen Morinaga et ai.':n menetelmää (Biotechnology, katso yllä). Mutaatioiden muo-30 dostamiseen käytettiin seuraavia oligonukleotideja: a) Gly 195 Glu (G195E (S001)): 27-meerinen epäsopiva aluke, Nor-237, joka muodostaa myös uuden SacI-res£riktiokohdan: 5' CACAGTATGGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGG 3' Nor-237 5' GTATGGCGCAGAGCTCGACATTTGTCGC 3' * * 35 72 102907

SacI

b) Arg 170 Tyr (R170Y (S003)): 25-meerinen yhteensopimattoman kohdan sisältävä aluke 5 Nor-577, joka hävittää Haelll-kohdan:

Haelll 5' GCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGC 3'

Nor-577 3' CGATAGGCCGTATAATACGCTTGCG 5' 10 c) His 120 Asp (H120D (S006)): 32-meerinen yhteensopimattoman kohdan sisältävä aluke, Nor-735, joka hävittää Sphl-kohdan: gphl_ 5' AGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGA 3· 15 Nor-735 5* AGGGAACAATGGCATGGACGTTGCTAATTTGA 3' d) Lys 251 Glu (K251E (S005)) 32-meerinen yhteensopimattoman kohdan sisältävä aluke Nor-736, joka muodostaa Xhol-kohdan: 20 5' CAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAAC 3'

Nor-736 5' CAAATCCGCAATCATCTCGAGAATACGGCAAC 3'

Xhol e) Lys 235 Leu (K235L (S015)): 25 24-meerinen yhteensopimattoman kohdan sisältävä aluke

Nor77-856, joka muodostaa Pstl-kohdan: 5' GCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCA 3'

Nor-856 5' GCCCTTGTTCTGCAGAAGAACCCA 3'

PstI

30 f) Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu (R170Y; G195E (S004)):

Nor-577:n ja Nor-237;n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen analogisella tavalla.

35 g) Gly 195 Glu; (G195E; K251E (S018)):

Nor-237:n ja Nor-736:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen analogisella tavalla.

% 73 102907 h) Arg 170 Tyr; LVs 251 Glu (R170Y; K251E (SOll)): Nor-577:n ja and Nor-736:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen analogisella tavalla.

5 i) Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu; Lys 251 Glu (R170Y; G195E; K251E (S012)):

Nor-577:n, Nor-237:n ja Nor-736:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen analogisella tavalla.

10 j) Gly 195 Glu; Lys 235 Leu (G195E; K235L):

Nor-237:n ja Nor-856:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen analogisella tavalla.

k) Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu; Lys 235 Leu (R170Y; G195E; 15 K235L)

Nor-577:n, Nor-237:n ja Nor-856:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen analogisella tavalla.

l) His 120 Asp; Lys 235 Leu (H120D; K235L (S016)): 20 Nor-735:n ja Nor-856:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen analogisella tavalla.

m) His 120 Asp; Gly 195 Glu; Lys 235 Leu (H120D; G195E; K235L (S017)): 25 Nor-735:n, Nor-237:n ja Nor-856:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen analogisella tavalla.

n) His 120 Asp; Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu; Lys 235 Leu; (H120D; R170Y; G195E; K235L (S019)): 30 Nor-735:n, Nor-577:n, Nor-237:n ja Nor-856:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen analogisella tavalla.

o) His 120 Asp; Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu; Lys 235 Leu; 35 Lys 251 Glu (H120D; R170Y; G195E; K235L; K251E (S020): 74 102907

Nor-735:n, Nor-577:n, Nor-237:n, Nor-856:n ja Nor-736:n yhdistelmä muodostettiin edellä kuvatun tavan suhteen analogisella tavalla.

5 Aukon sisältävään dupleksiin perustuva mutageneesi suoritettiin käyttäen templaatteina plasmideja pSX93, pSX199 ja pSX120.

pSX93 on esitetty kuvassa 3 ja se on pUC13 (Vieira, J. ja 10 Messing, J., Gene 19 (1982) 259 - 268), jossa on 0,7 ke:n suuruinen subtilisiini-309-geenin Xbal - Hindlll -fragmentti, joka sisältää polylinker-jaksoon liitetyn ter-minaattorin.

15 Mutaatioiden muodostamiseksi entsyymin N-terminaaliseen osaan käytettiin plasmidia pSX119. pSX119 on pUC13, jossa on polylinker-jaksoon liitetty subtilisiini-309-geenin EcoRI - Xbal -fragmentti. Templaatit pSX93 ja pSX119 kattavat siten koko subtilisiini-309-geenin.

20

Plasmidi pSX120 on plasmidi, jossa Hpal - Hindlll -fragmentti siihen liittyvine pSX88:sta peräisin olevine subti-lisiini-309-geeneineen liitetään tai on liitetty pDNl68:n EcoRV - HindIII:een, sillä tavoin, että amy M ja amy Q-25 promoottorit ilmentävät proteaasigeeniä. pDN 1681 on saatu pDN 1380:sta (Diderichsen, B. ja Christiansen, L.: FEMS Microbiology Letters 56 (1988) 53 - 60) ja tässä on siihen liitetty 2,85 ep:n suuruinen B. amyloliquefaciensista peräisin oleva Clal-fragmentti, jossa on oman promoottorinsa 30 sisältävä amy Q-geeni (Takkinen et ai. J. Biol. Chem. 258 (1983) 1007ff.) pSX120:n konstruktio on esitetty pääpiirteissään kuvassa 1, josta käy ilmi, että pDN 1681 on pilkottu EcoR5:lla ja Hindlll:11a ja pSX88 Hindlll:11a ja Hpal:11a, jonka jälkeen suoritetusta ligaatiosta saadaan 35 tulokseksi pSX120, jossa säätely tapahtuu amy M- ja amy Q- promoottorien välityksellä.

75 102907

Konstruoitiin vielä neljä muuta plasmidia, pSX170, pSX172, pSX173 ja pSX186, subtilisiini-309-geenin mutatoimiseksi aukon sisältävän dupleksin käsittävää mutageneesiä käyttäen.

5 -pSX170: Sphl - Kpnl, 700 ep pUC 19:ään liitetystä pSX120:sta, Sphl - Kpnl, kypsän subtilisiini-309:n amino-happoryhmästä 170 terminaattoriin.

10 -pSX172: EcoRI - Sphl, 1360 ep pUcl9:aan liitetystä pSX120:sta, EcoRI - Sphl, promoottorista kypsän subtilisiini-309: n aminohapporyhmään 170.

-pSX173: kuten pSX170, mutta valmistuksessa on käytetty 15 G195E:tä -pSX186: PvuII - EcoRI, 415 ep pUC19:ään liitetystä pSX120:sta, Hind - EcoRI, kypsässä subtilisiini-309:ssa olevasta aminohapporyhmästä 15 aminohapporyhmään 206.

20

Kuvassa 2 esitetään kohtalaisen yksityiskohtainen pSX120:n restriktiokartta, jossa on esitetty se, mitä fragmentteja käytettiin plasmidien pSX170, pSX172, pSX173 ja pSX186:n konstruoimiseksi.

25

Mutaatio a) suoritettiin pilkkomalla pSX93 Xbalilla ja Clal:lla tavalla, joka ilmenee kuvasta 3 ja kansainvälisessä patenttihakemusjulkaisussa n:o PCT/DK 88/00002 (NOVO INDUSTRI A/S) olevasta kappaleesta: "Generation of site di-30 rected mutations in the subtilisin gene".

Mutaatiot b), d) ja e) suoritettiin vastaavalla tavalla pilkkomalla pSX170 Sphl:11a ja Kpnl:11a.

35 Mutaatiot f) ja g) suoritettiin edellä kuvatulla tavalla, mutta pSX170:n tilalla käytettiin pSX173:a.

76 102907

Mutaatio c) suoritettiin vastaavalla tavalla pilkkoen pSX186 Pstl:lla ja EcoRI:lla.

Mutaatiot h) - o) konstruoitiin yksittäisiä tai kaksoismu-5 taatioita b) - g) sisältäviä DNA-fragmentteja yhdistelemällä käyttäen restriktiokohtia Nhel, Xbal, Clal, Avail ja Kpnl asianmukaisella tavalla.

Valmistettiin vielä muita mutantteja vastaavanlaisia mene-10 telmiä tai kirjallisuudesta tunnettuja yleisiä menetelmiä käyttäen.

Subtilisiini Carlsberg -mutantit Tässä patenttikuvauksessa mainittuja tiettyjä subtilisiini 15 Carlsbergissa olevia mutaatioesimerkkejä varten muodostet tiin seuraavat nukleotidijakson muutokset:

Asp 14 Lys (D14K (C001)) (GAT -> AAG)

Asp 120 Lys (D120K (C002)) (GAT -> AAA) 20 Asp 140 Lys (D140K (C003)) (GAC -> AAA)

Asp 14 Lys + Asp 120 Lys (D14K+D120K (C004))

Lys 27 Asp (K27D (C005)) (AAA -> GAT)

Lys 27 Asp + Asp 120 Lys (K27D+D120K (C006))

Asp 172 Lys (D172K (C008)) (GAC -> AAA) 25 Asp 14 Lys + Asp 120 Lys + Asp 140 Lys + Asp 172 Lys (D14K+D120K+DI40K+D172K (C010))

Vai 51 Asp (V51D (C100))

Glu 54 Thr (E54T (C101)) (GGG -> ACA)

Glu 54 Tyr (E54Y (C102)) (GGG -> TAT) 30 Nämä muutokset valmistettiin muuttamalla kyseisissä fragmenteissa olevat oligonukleotidit. Uudet jaksot vahvistettiin oikeiksi, jonka jälkeen alkuperäiset oligonukleotidit korvattiin näillä uusilla jaksoilla ja koottiin uusiksi 35 DNA-fragmenteiksi. Fragmentit koottiin lopuksi uudeksi subtilisiini Carlsberg -geeniksi.

77 102907

Mutatoitujen subtilisiinien ilmentäminen Sen jälkeen kun mutaation jakso oli vahvistettu oikeaksi, mutatoidut DNA-fragmentit liitettiin plasmidiin pSX93 tai pSX120, jota käytettiin mutanttien valmistamiseksi.

5

Plasmidi pSX92 on esitetty kuvassa 4 ja se valmistettiin kloonaamalla Sub 309 -geeni plasmidiin pSX62, joka oli pilkottu Clal-kohdasta, täytetty DNA-polymeraasi I:n Kle-now-fragmentilla ja pilkottu HindIII:lla ennen kloonatusta 10 sub 309 -geenistä peräisin olevien Dral - Nhel- ja Nhel -

Hindlll -fragmenttien liittämistä.

Mutanttien ilmentämiseksi mutatoidut fragmentit (Xbal,

Clal, Xbal - Hindlll tai EcoRI - Xbal) pilkottiin asianmu-15 kaisesta mutaatioplasmidista pSX93, pSXH9, pSX170, pSXl72, pSX173, ja pSXl86, tässä järjestyksessä mainittuna, ja liitettiin pSX92:een tai pSX120:een eri mutantteja ilmentämään kykenevien plasmidien aikaansaamiseksi.

20 B. subtilis DN479 transformoitiin tämän jälkeen muta-toiduilla pSX92:lla tai pSX120:lla.

Tämän jälkeen transformoidut solut levitettiin LB-agarmal-joille, joissa oli 10 mM fosfaattia, pH 7, 6 Mg/ml kloram-25 fenikolia ja 0,2 % ksyloosia plasmidissa olevan xyn-pro- . moottorin indusoimiseksi. Maljoilla oli myös 1 % kuorittua maitoa, jotta proteaasia tuottavat transformantit olisi voitu havaita kirkkaina renkaina siellä, missä kuorittu maito on pilkkoutunut.

30

Mutatoidut entsyymit otettiin talteen ja puhdistettiin \ sopivalla tavalla suoritetun kasvatuksen jälkeen.

Subtilisiini Carlsberg -molekyylien fermentaatio 35 Proteaasientsyymin tuottamiseen tavalla, joka perustuu edellä kuvatulla tavalla valmistettuja BPN':a vastaavien mutatoituja geenejä sisältäviin mikro-organismeihin, käy- 78 102907 tettiin yleensä Rushton-tyyppistä Chemoferm-fermenttoria, joka oli varustettu 8 suoraa lapaa sisältävällä sekoittajalla ja jonka käyttötilavuus oli 8 litraa. Fermenttorikon-figuraatio muodostettiin siten, että se oli VMT:n vastaavi-5 en turvallisuusmääräysten mukainen ja sen koostumukseen kuului: a) Painesäädin (tyyppi 4-3122, Bell & Howell), joka rajoittaa ilman pääsyn laitteeseen 10 kPa:n ylipaineen ylittäväl- 10 tä osalta. Tämä tehdään ulostulevan ilman suodattimien tukkeutumisen ehkäisemiseksi.

b) Kaasun ulostuloputkeen valmistettu vaahtosulku, joka on tehty 20 litran imupullosta, jonka pohjalle on lisätty 15 vaahdonestoainetta.

c) Avoin jäähdytysvesivaippa jäähdytysveden tai vesijohtovedelle tarkoitetun viemärin kontaminoitumisen ehkäisemiseksi.

20 d) Käytetään absoluuttista ulostulosuodinta (Gelman acro 50, 0,45 μτα) .

e) Näytteiden otto tapahtuu käyttäen pienen sisäisen tila- 25 vuuden omaavaa näytteenottopumppua.

Säätötoimenpiteet

Kaasunvirtaus kontrolloitiin käyttäen massavirtausmittarei-ta (Brooks, tyyppi 5852, käyttöalue 0 - 10 1).

30 pH säädettiin käyttäen Hartmann ja Braun -lähetintä ja Philips-säädintä (Witromat). Neutralointiin käytettiin väkevää NaOH:ta (3 M).

Ulos tulevat kaasut analysoitiin käyttäen Maihak, Wes-35 tinghouse -yhtiöstä hankittuja laitteita Unor 4N (C02) ja

Oxygor 7N (02) . Liuokseen liuenneen hapen määrä määritet- 79 102907 tiin käyttäen teollisuuskäyttöön tarkoitettua steriloitavaa happianturia (Ingold, tyyppi 322756702).

Kasvatusliuoksen lämpötilaa seurattiin käyttäen PT100-tun-5 toelintä ja Honeywellin lämpötilansäädintä (luokka 84). Vaahdon muodostuminen pidettiin hyväksyttävällä tasolla käyttäen kosketuselektrodia ja tämän yhteydessä olevaa vaahdonestoainepumpun aktivoivaa tasonsäätökytkintä.

10 Kaikkia ulkopuolisia säätimiä valvottiin Hewlett-Packard -mikrotietokoneella (HP220).

Kasvatus olosuhteet

Ympit valmistettiin inkuboimalla ravistelupulloviljelmää 15 30 °C:ssa 16 tunnin ajan 250 kierroksen minuuttinopeudella pyörivässä ravistelijassa (LH fermentation, tyyppi MLx). Käytettiin 300 ml:n suuruista ymppiä, joka oli tarkoitettu 8 litran erää kohti ja jota esikäsiteltiin varsinaisen fermentoinnin olosuhteissa (pH 7,0 30 ®C, ilman virtaus 3,5 20 1/min, sekoittimen nopeus 1000 - 1500 kierrosta minuutissa) Liuenneen hapen konsentraatio pidettiin 25 % ilmasta saatavan kylläisyystason yläpuolella. Käytetty vaahdonestoaine oli silikoniöljypohjaista materiaalia (Rhodorsil R426,

Rhone Poulenc).

25

Subtilisiiniproteaasin tuotto »

Proteaasit (mutatoidut proteaasit) tuotettiin käyttäen geenien konstruointia koskevassa kohdassa kuvatun muta-toidun geenin sisältävää B. subtilis DB105 -kantaa.

30 Kasvatusliuoksen koostumus oli 8 g/1 NH4C1; 4 g/1 KH2P04; 4 g/1 K2HP04; 2 g/1 NaCl; 1 g/1 MgS04.2H20; 10 g/1 hiivauutet-ta; 40 g/1 sakkaroosia; pH 7,0 ja tämä oli steriloitu 45 min 120 °C:ssa. Steriloinnin jälkeen lisättiin 25 mg/1 tryptofaania ja 20 mg/1 neomysiiniä.

35 Fermentaatiot lopetettiin 20 - 30 tunnin kuluttua. Solut poistettiin kasvatusliuoksista sentrifugoimalla.

t 80 102907

Mutatoitujen subtilisiinien proteolyyttinen aktiivisuus Useiden eri mutanttien proteolyyttinen aktiivisuus tutkittiin proteiinisubstraattina käytettyä kaseiinia vastaan edellä kuvatun DMC-menetelmän mukaisesti. Tulokset on esi-5 tetty taulukossa IV.

Taulukosta nähdään, että mutantilla (S005) on jonkin verran lähtömuotoa (S000) suurempi aktiivisuus, kun taas muiden mutanttien aktiivisuus on hieman alempi.

10

Taulukko IV

Mutatoitujen subtilisiinien proteolyyttinen aktiivisuus Mutantti Suhteellinen aktiivisuus

Ei mutaatiota (S000) 100 15 S001 95 5003 90 5004 85 5005 105 5006 100 20 S012 80 S017 90 : S019 70 S020 75 S024 70 25

Mutatoitujen subtilisiinien pesutehokkuus

Useiden eri mutanttien pesutehokkuus pH-arvon 8,14 omaavassa nestemäisessä standardidetergentissä tutkittiin mallisysteemissä ruohonestettä vastaan edellä yksityiskohta!- B1 102907 o 1 sesti kuvattujen menetelmien mukaisesti. Tulokset on esitetty taulukossa V.

Taulukko V

5 Delta-R-arvot:

Mutantti Entsyymikonsentraatio 1,0 mg/1 10 mg/1 5000 4,0 10,7 5001 5,9 12,8 10 S003 6,0 13,5 S004 5,8 13,0 S012 4,2 9,6 5019 10,5 19,4 5020 9,4 18,6 15

Taulukosta havaitaan, että kaikilla tutkituilla mutanteilla esiintyi villityyppiseen lähtömuotoiseen entsyymiin verrattuna parantunut tai vastaavantasoinen pesutehokkuus. Mu-tanttien S019 ja S020 pesutehokkuus on parantunut siten, 20 että 1,0 mg/1 näitä entsyymejä korvaa karkeasti arvioiden 10 mg/ml villityyppistä lähtömuotoista entsyymiä, joka : siten merkitsee sitä, että tämän keksinnön mukaisten muta- toi tujen entsyymien pesutehokkuus on parantunut.

25 B:

Tulokset mallisysteemissä eri pH-arvoissa saaduista joillakin tämän keksinnön mukaisilla entsyymivarianteilla suoritetuista tutkimuksista, joissa käytettiin modifioitua Yhdysvalloissa käytettävää kaupallista nestemäistä detergent-30 tiä, on esitetty taulukossa VI

c a • 102907

Taulukko VI

82 -

Pesutehokkuus eri pH-arvoissa Mutantti Delta R

pl0 pH 8,0 9,0 10,0 11,0 5 S000 10,2 1,4 2,6 3,1 10,1 S001 9,86 2,1 4,0 6,6 14,0 5003 9,86 2,3 5,0 8,1 14,1 5004 8,68 4,1 9,7 11,7 10,9 5005 9,71 2,2 4,3 6,3 13,9 10 S012 9,09 5,7 11,9 13,8 6,3 5019 9,09 6,4 10,7 12,2 3,7 5020 6,71 7,8 10,6 8,5 2,4

Tulokset osoittavat selvästi, että entsyymin pl:n siirtämi-15 nen suuntaan, johon pH-optimia on haluttua siirtää sen aikaansaamiseksi, että entsyymin pesutehokkuus lähestyisi pesuliuoksen pH:ta, parantaa entsyymin pesutehokkuutta.

D: 20 Useiden eri mutanttien pesutehokkuus tutkittiin ruohones-teellä liattuja puuvillakankaan kappaleita vastaan määri-tyksessä A kuvatun menetelmän mukaisesti.

Käytettiin nestemäistä detergenttiä (detergentti D3), jonka 25 konsentraatio oli 2,0 g/1. pH säädettiin arvoon 9,1

NaOH:11a tai HCl:llä.

Lämpötila pidettiin 20 °C:ssa isotermisenä 10 min ajan.

30 Kutakin mutanttia annosteltiin konsentraatioina 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 ja 10,0 mg entsyymiproteiinia/1.

N * 83 102907

Tutkittujen mutanttien stabiilisuus tutkittiin mittaamalla denaturaatiolämpötila (maksimaalinen ylimääräinen lämpökapasiteetti) "differential scanning" -kalorimetrialla, DSC:llä. Kuumennusnopeus oli 0,5 °C/min.

5

Stabiilisuus tutkittiin liuoksessa, joka sisälsi 91-%seen standardidetergenttiin, jonka koostumus on kuvattu määrityksessä A, valmistettua mutanttia noin 2 mg/ml. Liuos valmistettiin sekoittamalla 100 μΐ entsyymiliuosta (noin 20 10 mg entsyymiä/ml) puskuriin, jonka koostumus oli 0,01 M dimetyyliglutaarihappo, 0,002 H CaCl2, 0,2 M H3B03 ja 0 -0,1 M NaCl ja jonka pH oli 6,5), 1000 /xl:aan nestemäistä standardidetergenttiä.

15 Subtilisiini-309-mutanttien ryhmää koskevat DSC:llä saadut stabiilisuustutkirousten tulokset ovat yhdenmukaisia perinteisillä varastointikestotutkimuksilla saatujen tulosten kanssa.

20 Tulokset

Useiden eri mutanttien pesutehokkuus nestemäisessä deter-gentissä on esitetty taulukossa VII. Tulokset on esitetty parantumiskertoimina villityyppiseen lähtömuotoiseen entsyymiin verrattuna. Parantumiskerroin on määritelty määri-25 tyksessä C annetun määritelmän mukaisesti. 1

Taulukossa C on myös esitetty DSC:llä määritetty denaturaa tiolämpötila nestemäisessä standardidetergentissä sekä 34 1 0 2 9 0 7 villityyppisen lähtömuotoisen entsyymin ja kyseessä olevan mutantin denaturaatiolämpötilojan erotus.

Taulukko VII

5 Mutant- lasket- Paran- DSC:llä DSC:llä ti tu pl tumis- määritetty määritetty tekijä denaturaa- denaturaa- tiolämpöti- tiolämpö- la tila suh teessa S000:aan S 000 10,06 1 65,2 0,0 S 020 7,30 7,6 58,2 -7,0 S 021 9,85 1,3 69,2 +4,0 10 S 022 8,07 9,3 61,9 -3,3 S 023 8,05 8,8 63,5 -1,7 S 024 6,86 3,9 60,6 -4,6 S 025 8,94 6,7 69,1 +3,9 S 035 8,07 7,0 72,5 +7,3 15 S 201 9,85 1,4 69,4 +4,2

Taulukosta VII nähdään, että kaikkien tutkittujen mutant-tien pesutehokkuus oli parantunut villityyppiseen lähtömuo-toiseen entsyymiin verrattuna. Paras pesutehokkuus saavute-20 taan mutanteilla, joiden pl0 on samansuuruinen kuin pesuli-uoksen pH tai juuri tämän alapuolella.

. DSC:llä määritetty denaturaatiolämpötila osoittaa, että yksittäisten mutanttien S 021 (136D) ja S 201 (N76D) sta-25 biilisuus on kohonnut 4 °C:lla ja 4,2 eC:lla, tässä järjes tyksessä mainittuna.

* 85 102907

Niiden mutaatioiden joukosta, jotka sisältyvät yhteen tai useampaan taulukossa VII lueteltuun mutanttiin, on osoitettu, että mutaatiot R170Y ja K251E vähentävät mutantin sta-biilisutta villityyppiseen lähtömuotoiseen entsyymiin ver-5 rattuna, kun taas mutaatiot H120D, G195E ja K235L eivät vaikuta stabiilisuuteen.

Taulukosta VII voidaan havaita, että yhden stabiilisuutta vähentävän mutaation sisältävien mutanttien stabiilisuus on 10 vähentynyt vieläpä niissäkin tapauksissa, joissa mukana on stabiloiva mutaatio.

*36D:n ja N76D:n stabiloivat vaikutukset ovat additiivisia. Tämä voidaan osoittaa käyttämällä mutantteja S 025 ja 15 S 035. S 025 sisältää kolme mutaatiota, joilla ei ole vai kutusta stabiilisuuteen, ja stabiloivan mutaation *36D:n.

S 025:n denaturaatiolämpötila on noussut 3,9 °C:lla villi-tyyppiseen lähtömuotoiseen entsyymiin verrattuna, joka on samansuuruinen yksittäiselle *36D-mutantille mitatun li-20 säyksen suhteen. S 035 sisältää saman mutaation N76D.

S 035:n denaturaatiolämpötila on noussut 7,3 eC:lla villi-tyyppiseen lähtömuotoiseen entsyymiin verrattuna, joka nousu vastaa koevirheiden rajoissa yksittäisille mutaatioille *36D, S 021, ja N76D, S 201, mitattujen nousujen 25 summaa.

E:

Kolmen mutantin pesutehokkuus ruohonesteellä liattuja puu-villakangaskappaleita vastaan tutkittiin määrityksessä A 30 kuvatun menetelmän mukaisesti.

Käytettiin nestemäistä detergenttiä D3, jonka konsentraatio oli 2,0 g/1. Detergentti liuotettiin ioninvaihtimella käsiteltyyn veteen. pH säädettiin arvoon 9,1 NaOH:lla tai 35 HC1:llä.

Kc 102907 o 6 Lämpötila pidettiin isotermisenä 10 min. Kutakin mutanttia annosteltiin 1,0 ja 10,0 mg entsyymiproteiinia/1.

Tulokset: 5 Tutkittiin kolmen Yhdysvalloissa kaupan pidettävään nestemäiseen detergenttiin valmistetun mutantin pesutehokkuus ruohonestettä vastaan. Tulokset on esitetty taulukossa VIII.

10 Taulukko VIII

Delta R -arvot

Laskettu Entsyymin konsentraatio

Mutantti pl0 1,0 mg/1 10,0 mg/1 S 000 10,6 4,5 13,6 15 S 003 9,75 9,4 18,0 S 004 9,54 13,7 18,1 S 006 9,85 6,0 15,6

Taulukosta VIII havaitaan, että kaikkien mutanttien pesute-20 ho on parantunut villityyppiseen lähtömuotoiseen entsyymiin verrattuna. Nähdään lisäksi se, että paras tehokkuus saavutetaan käyttäen mutanttia, jonka pl0 on lähinnä pesuliuok-*; sen pH:ta.

25 F:

Tutkittiin kahden mutantin pesutehokkuus ruohonesteellä liattuja puuvillakangaskappaleita vastaan esimerkissä E kuvattujen olosuhteiden mukaisissa olosuhteissa.

30 Tulokset 102907 87

Kahden mutantin pesutehokkuus detergentissä D3 tutkittiin ruohonesteellä liattuja puuvillakangaskappaleita vastaan. Tulokset on esitetty taulukossa IX.

Taulukko IX

5 Delta R -arvot:

Laskettu Entsyymin konsentraatio pl0 1,0 mg/1 10,0 mg/1 S 000 10,06 5,8 15,3 S 015 9,95 8,4 20,0 10 S 017 9,40 17,0 20,8

Taulukosta IX nähdään, että kaikkien mutanttien pesutehokkuus on parantunut villityyppiseen lähtömuotoiseen entsyymiin verrattuna. Havaitaan lisäksi se, että paras tehokkuus 15 saavutetaan käyttäen mutanttia, jonka pl0 on lähinnä pesu- liuoksen pH:ta.

G:

Useiden eri mutanttien pesutehokkuus ruohonesteellä liattu-20 ja puuvillakangaskappaleita vastaan tutkittiin määrityksessä A kuvatun menetelmän mukaisesti.

Käytettiin nestemäistä detergenttiä D3, jonka konsentraatio oli 2,0 g/l.

25

Detergentti liuotettiin puskuriin (0,0025 M boorihappo ja 0,001 M dinatriumvetyfosfaatti, joka oli valmistettu ionin-vaihtajalla käsiteltyyn veteen) pH säädettiin arvoihin 7,0, 8,0, 9,0 ja 10,0 käyttäen kussakin tapauksessa asian-30 mukaisella tavalla NaOH:ta tai HCl:ää. Lämpötila pidettiin tasaisena 30 °C:ssa 10 min.

Mutantteja annosteltiin määrä, joka kussakin tapauksessa oli 0,2 mg entsyymiproteiinia/1.

35 28 102907

Tulokset

Joidenkin tämän keksinnön mukaisten entsyymivarlanttien pesutehokkuus mallisysteemissä eri pH-arvoissa on esitetty taulukossa X.

5

Taulukko X

Väri- Mutaatio Delta

antti R

pl0 pH 8,0 9,0 10,0 7,0 10 S000 10,06 0,6 0,8 4,4 7,0 S015 K235L 9,95 1,3 2,4 6,0 8,8 S021 *36D 9,85 2,1 3,2 5,6 8,3 S017 H120D, G195E, K235L 9,40 2,9 5,4 10,8 14,1 S025 *36D, H120D, R170Y, D235L 8,95 4,3 9,5 13,9 13,1 15 S023 *36D, H120D, R170Y, G195E, K235L 8,05 9,6 13,0 12,4 9,2 S024 *36D, H120D, R170Y, G195E, K235L, K251E 6,86 9,4 10,4 6,7 4,8

Taulukossa X esitetyt tulokset osoittavat selvästi, että proteaasin pl:n siirtäminen pesuliuoksen pH:n suuntaan 20 parantaa proteaasin pesutehokkuutta.

Tulokset osoittavat myös, että kaikkien tutkittujen varianttien pesutehokkuus parani villityypin lähtömuotoiseen entsyymiin verrattuna pH-arvoissa, jotka olivat alle 10.

89 102907 H:

Useiden eri mutanttien pesutehokkuus ruohonesteellä liattuja puuvillakangaskappaleita vastaan tutkittiin määrityksessä Ά kuvatun menetelmän mukaisesti.

5 Käytettiin nestemäistä detergenttiä D3, jonka konsentraatio oli 2,0 g/1.

Oetergentti liuotettiin ioninvaihtimella käsiteltyyn veteen 10 valmistettuun 0,005 N glysiiniin. pH säädettiin arvoihin 10,0, 10,25, 10,50, 10,75, 11,0, 11,5 ja 12,0 kussakin tapauksessa erikseen NaOH:lla. Lämpötila pidettiin tasaisena 30 °C:ssa 10 min.

15 Hutantteja annosteltiin määrä, joka kussakin tapauksessa oli 0,2 mg entsyymiproteiinia/1.

Tulokset:

Joidenkin tämän keksinnön mukaisten entsyymivarianttien 20 pesutehokkuus mallisysteemissä eri pH-arvoissa on esitetty taulukossa XI. Tässä tapauksessa tutkittiin variantteja, joiden pl oli hieman villityypin lähtömuotoisen entsyymin pl:tä korkeampi. Arvojen 10,0 - 12,0 välinen pH-alue tutkittiin yksityiskohtaisemmin kuin aiemmissa esimerkeissä.

• .

_ I

9° 102907

Taulukko XI

Va- Mutaa- riantti tio pl0 pH 10,0 10,25 10,50 5 S000 10,06 7,0 8,7 10,5 5027 E89S 10,28 6,0 8,5 9,8 5028 D181N 10,28 6,9 9,8 10,6 5032 D197N - 10,28 4,7 9,2 10,8 5033 E271Q 10,28 7,1 6,7 7,8 10 S031 D197N, E271Q 10,53 4,7 7,2 7,0

Va- Mutaa- Delta R

riantti tio pl0 pH 11,0 11,5 12,0 10,75 S000 10,06 12,5 14,4 10,6 3,8 15 S027 E89S 10,28 11,9 14,3 12,8 5,0 S028 D181N 10,28 13,0 14,4 10,7 4,6 S032 D197N 10,28 13,8 13,5 11,3 5,0 :: S033 E271Q 10,28 10,4 13,7 13,3 6,3 S031 D197N, E271Q 10,53 10,7 13,0 14,4 8,7 20

Taulukossa XI esitetyt koetulokset osoittavat, että korkeissa pH-arvoissa maksimaalinen tehokkuus saavutetaan pH-arvoilla, jotka ovat hieman lasketun pl:n yläpuolella. Tässäkin tapauksessa havaitaan proteaasin pl:n nostamisen 25 pyrkivän kohottamaan maksimaalista tehokkuutta vastaavaa pH:ta. Vaikutukset eivät ole niin silmiinpistäviä kuin mitä havaitaan matalissa pH-arvoissa (määritys B ja G).

-· 91 102907

Proteaasin isoelektrisen pisteen ja proteaasin maksimaalista tehokkuutta vastaavan pH:n välisen korrelaation visu-alisoimiseksi etsittiin esimerkeistä B, G ja H saaduista 5 tuloksista ne pH-arvot, joissa kullakin tutkitulla variantilla (ja villityypin lähtömuotoisella entsyymillä) oli maksimaalinen tehokkuutensa. Kuvassa 5 tämä pH„„ on esitetty laskennallisen pl0:n funktiona.

10 Huomioiden sen, että pH-alue on tutkittu l,0:n suuruisin pH-muutoksin, on korrelaatio ilmeinen.

Kokeellista tuloksista, jotka koskivat tämän keksinnön mukaisten mutanttien yhdistämistä lipaasin kanssa, päädyt-15 tiin seuraaviin käytännön johtopäätöksiin:

Lipaasi kesti tunnin tyypin o pesuliuoksessa 37 eC:n lämpötilassa. Savinase*:n läsnäolo johti nopeaan aktiivisuuden katoamiseen. Kazusase*: sta aiheutui vähemmän lipaasin inak-20 tivoitumista kokeeseen käytettynä aikana.

Subtilisiini-BPN' ei kuitenkaan inaktivoinut lainkaan li-paasia näissä olosuhteissa.

25 Edulliset proteaasit käytettäväksi esimerkiksi lipaasin kanssa tyypin O edustamissa pesukoostumuksissa ovat mutan-tit S001, S003, S004, S012, S019, S020, S021, S025, S035 ja S235.

30 Tyypin O pesuliuos oli valmistettu konsentraatioon 5 g/1, sitä käytettiin 37 eC:ssa ja se oli peräisin detergentti-formulaatiosta, jonka koostumus painoprosentteina oli: anioninen pinta-aktiivinen aine 6 35 ioniton pinta-aktiivinen aine 5 rasvahappo 2,8 akryylipolymeeri 3 x .

92 102907 zeoliitti 22 karbonaatti 10 sulfaatti 17,5 savi 8 5 tertiäärinen amiini 2 perboraattimonohydraatti 13 pieninä määrinä olevat aineosat ja vesi, täytetään 100:ksi.

10 Edullinen proteaasi käytettäväksi esimerkiksi lipaasin kanssa tyypin W edustamissa pesukoostumuksissa on mutantti S020, S021, S025, S035 ja S235.

Tyypin W pesuliuos oli konsentraatioon 2 g/1 valmistettu 15 liuos nestemäisestä detergentistä, jonka koostumus paino prosentteina oli: anioninen pinta-aktiivinen aine 16 ioniton pinta-aktiivinen aine 7 20 hydrotrooppi 6 s i truunahappo 6,5

NaOH 4,l monoetanoliamiini 2 pieninä määrinä olevat aineosat 25 ja vesi, täytetään 100:ksi.

Vaikka tätä keksintöä on tarkasteltu ja siitä on esitetty esimerkkejä sen erilaisten erityisten sovellutusmuotojen yhteydessä, tätä ei tulisi käsittää tämän patenttikuvauk-30 sen, joka kattaa kaikki edellisessä esityksessä mainittujen ja kuvattujen piirteiden yhdistelmät ja alayhdistelmät sekä oheistetut patenttivaatimukset, sovellettavuutta ja kattavuutta rajoittavaksi.

j

Claims (17)

1. Mutatoitu subtilisiiniproteaasi, jonka sähköstaattinen nettovaraus on muuttunut verrattuna lähtömuotoiseen prote- 5 aasiin samassa pH-arvossa siten, että mainitussa proteaa- sissa on mainittuun lähtömuotoiseen proteaasiin verrattuna vähemmän tai enemmän positiivisen varauksen omaavia amino-happoryhmiä tai vain yksi tällainen ryhmä ja/tai enemmän tai vähemmän negatiivisen varauksen omaavia aminohapporyh-10 miä tai vain yksi tällainen ryhmä, tunnettu siitä, että mutaatio on saatu aikaan asemassa 27 olevassa aminohapporyh-mässä tämän ryhmän deleetiolla tai substituutiolla, jolloin mainitun mutatoidun subtilisiiniproteaasin isoelektrinen piste (plg) on alempi kuin mainitun lähtömuotoisen proteaa-15 sin vastaava piste, lukuunottamatta asemassa 27 olevan ly- siinin substituutiota kysteiinillä.

2. Mutatoitu subtilisiiniproteaasi, jonka sähköstaattinen nettovaraus on muuttunut verrattuna lähtömuotoiseen prote- 20 aasiin samassa pH-arvossa siten, että mainitussa proteaa-sissa on mainittuun lähtömuotoiseen proteaasiin verrattuna vähemmän tai enemmän positiivisen varauksen omaavia amino-happoryhmiä tai vain yksi tällainen ryhmä ja/tai enemmän tai vähemmän negatiivisen varauksen omaavia aminohapporyh-25 miä tai vain yksi tällainen ryhmä, tunnettu siitä, että mutaatio on saatu aikaan asemassa 27 olevassa aminohapporyh-mässä tämän ryhmän deleetiolla tai substituutiolla, jolloin mainitun subtilisiiniproteaasin isoelektrinen pH (plo) on korkeampi kuin mainitun lähtömuotoisen proteaasin vastaava 30 pH, lukuunottamatta asemassa 27 olevan lysiinin substituu-. , tiota kysteiinillä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että siinä on mutaatio, joka vaikuttaa asemas- 35 sa 27 olevaan aminohapporyhmään, ja ainakin vielä yksi mu taatio, joka vaikuttaa sellaisessa asemassa olevaan aminohappo ryhmään, joka on 102907 1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 36, 37, 38, 40,' 41, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 75, 76, 77, 78, 79, 87, 89, 91, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 5 107, 108, 109, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 126, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 188, 189, 191, 192, 194, 195, 197, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 10 213, 214, 215, 216, 217, 218, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 259, 260, 261, 262, 263, 265, 269, 271, 272 tai 275.

4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen proteaa- si, tunnettu siitä, että se edustaa sellaisen lähtömuotoi-sen entsyymin mutaatiota, joka on: subtilisiini-BPN', sub-tilisiini amylosacchariticus, subtilisiini-168, subtilisii-ni mesenterikopeptidaasi, subtilisiini Carlsberg, subtili-20 siini-DY, subtilisiini-309, subtilisiini-147, termitaasi, akvalysiini, Bacillus PB92 -proteaasi, proteinaasi-K, pro-teaasi-TW7 tai proteaasi-TW3.

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen proteaa- 25 si, tunnettu siitä, että siinä on jokin seuraavista substi tuutioista: K27R, K27V, K27D, K27D+D120K.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että lähtömuotoinen subtilisiini on subtilisiini-309 30 tai Bacillus PB92 -proteaasi.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että siinä on jokin seuraavista substituutioista: K27R, K27V. 35

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että lähtömuotoinen subtilisiini on subtilisiini- 147. 95 1 0 2 9 0 7

9. Patenttivaatimuksen 5 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että lähtomuotoinen subtilisiini on subtilisiini Carlsberg.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että siinä on jokin seuraavista substituutioista: K27D, K27D+D120K.

11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen proteaasi, tun-10 nettu siitä, että mainittu mutaatio on jokin seuraavista: C005) K27D C006) K27D+D120K

12. Sellainen menetelmä aseman(ien) ja aminohap(p)o(je)n 15 määrittämiseksi tai valitsemiseksi, jolla voidaan suorittaa lähtömuotoisessa entsyymissä olevaan(viin) aminohappoon (poihin) kohdistuva deleetio, substituutio tai insertio, tunnettu siitä, että valinta suoritetaan tavalla, jolla mu-tatoitavaksi aiotun entsyymin laskennallinen sähköstaatti-20 nen nettovaraus (NEC) on muuttunut valitun lähtömuotoisen entsyymin samassa pH:ssa laskettuun NEC:hen verrattuna, ja että valittuihin aminohapporyhmiin kuuluu asemassa 27 oleva aminohapporyhmä, lukuunottamatta asemassa 27 olevan lysii-nin substituutiota kysteiinillä. 25

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valitut aminohapporyhmät valitaan siten, että ne vaikuttavat asemassa 27 olevaan aminohapporyhmään ja ainakin vielä yksi, joka vaikuttaa sellaisessa asemassa ole- 30 vaan aminohapporyhmään, joka on 1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, . ’ 24, 25, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 75, 76, 77, 78, 79, 87, 89, 91, 94, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 35 107, 108, 109, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 120, 126, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 188, 189, 191, 192, 194, 195, 197, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 96 102907 213, 214, 215, 216, 217, 218, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 259, 260, 261, 262, 263, 265, 269, 271, 272 tai 275. 5

14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtömuotoinen entsyymi on subtilisiini-BPN', subtilisiini amylosacchariticus, subtilisiini-168, subtilisiini mesenterikopeptidaasi, subtilisiini Carlsberg, 10 subtilisiini-DY, subtilisiini-309, subtilisiini-147, termi- taasi, Bacillus PB92 -proteaasi, proteinaasi-K, proteaasi-TW7 tai proteaasi-TW3.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu 15 siitä, että lähtömuotoinen subtilisiini on subtilisiini-309 tai Bacillus PB92 -proteaasi.

16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtömuotoinen subtilisiini on subtilisiini- 20 147.

17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtömuotoinen subtilisiini on subtilisiini Carlsberg. 25