BR9608149B1 - processos para efetuar mutação no dna que codifica uma enzima de subtilase ou sua pré- ou pré-pró-enzima e para a manufatura de uma enzima de subtilase mutante. - Google Patents

Description

"PROCESSOS PARA EFETUAR MUTAÇÃO NO DNA QUE CODIFICA UMA ENZIMA DE SUBTILASE OU SUA PRÉ- OU PRÉ-PRÓ-ENZIMA E PARA A MANUFATURA DE UMA ENZIMA DE SUBTILASE MUTANTE"

Campo técnico

Esta invenção refere-se a novas enzimas mutantes ou variantes de enzimas úteis na formulação de composições detergentes, que apresentam uma estabilidade aperfeiçoada ao armazenamento ao mesmo tempo em que retêm ou aperfeiçoam o desempenho de lavagem; refere-se a composições limpantes e detergentes que contêm as referidas enzimas; refere-se à codificação mutante de genes para a expressão das referidas enzimas quando inseridas em um organismo ou em uma célula hospedeira adequados; e refere-se a essas células hospedeiras transformadas e capazes de expressar as referidas variantes de enzima.

Anterioridades da invenção

Na indústria de detergentes, as enzimas têm sido implantadas há mais de 30 anos em formulações de lavagem. As enzimas utilizadas nessas formulações compreendem proteases, lipases, amilases, celulases, bem como outras enzimas, ou suas misturas. As proteases são as comercialmente mais importantes.

Embora as proteases tenham sido utilizadas na indústria de detergentes durante mais de 30 anos, muito permanece desconhecido no que se refere aos detalhes de como estas enzimas interagem com substratos e/outras substâncias presentes em, p.ex., composições detergentes. Alguns fatores relacionados com os resíduos específicos e que influenciam determinadas propriedades, como a estabilidade oxidativa e térmica, têm sido geralmente elucidadas, porém muito resta para ser feito. Ainda não se sabe exatamente quais características físicas ou químicas são responsáveis por um bom desempenho de lavagem ou pela estabilidade de uma protease numa composição detergente específica.

As proteases correntemente utilizadas têm sido, em sua maior parte, encontradas por meio do isolamento de proteases da natureza, sendo testadas em formulações detergentes.

Um número crescente de proteases utilizadas comercialmente são as variantes de proteína elaboradas geneticamente da protease do tipo selvagem correspondente que ocorre naturalmente, p.ex., DURAZYM® (Novo Nordisk A/S), RELASE®, Novo Nordisk A/S), MAXAPEM® (Gist- Brocades Ν.V.), PURAFECT® (Genencor International, Inc.).

Portanto, um objeto da presente invenção é proporcionar variantes aperfeiçoadas de protease de proteína elaborada geneticamente, especialmente para o uso na indústria dos detergentes.

Proteases

As enzimas que clivam as ligações amida em substratos de proteína são classificadas como proteases, ou (alternativamente, peptidases) ver Walsh, 1979, "Enzymatic Reaction Mechanisms", W.H. Freeman and Company, San Francisco, capítulo 3). As bactérias da espécie Bacillus secretam duas espécies extracelulares de protease, uma neutra, ou metaloprotease, e uma protease alcalina que é, funcionalmente, uma serina endopeptidase e é referida, usualmente, como uma subtilisina. A secreção destas proteases tem sido relacionada ao ciclo de crescimento bacteriano, com a maior expressão de protease durante a fase estacionária, quando a esporulação também ocorre. Joliffe et al„ (1980) "J. Bacteriol." 141 1199- 1208, sugeriram que as proteases do Bacillus funcionam na inversão da parede celular.

Subtilases

Uma serina protease é uma enzima que catalisa a hidrólise de ligações peptídicas e em que existe um resíduo essencial de serina no sítio ativo (White, Handler e Smith, 1973, "Principies of Biochemistry", quinta edição, McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272).

As serina proteases bacterianas têm pesos moleculares na faixa de 20.000 a 45.000 Daltons. Elas são inibidas pelo diisopropilfluorofosfato. Elas hidrolisam ésteres terminais simples e têm atividade semelhante à quimotripsina eucariótica, também uma serina protease. Um termo mais estrito, protease alcalina, que abrange um subgrupo, reflete o pH elevado que é ótimo para algumas das serina proteases, desde o pH 9,0 até 11,0 (ver Priest (1977) "Bacteriological Rev." 41, 711-753).

Um subgrupo de serina proteases que se experimentou denominar subtilases foi proposto por Siezen et al„ "Protein Engng." 4 (1991) 719-737. São definidos por meio de análises de homologia de mais de 40 seqüências de aminoácidos de serina proteases previamente referidas como proteases do tipo subtilisina. Definiu-se uma subtilisina, previamente, com uma serina protease produzida por fungos ou bactérias Gram-positivas e, de acordo com Siezen et al„ é agora um subgrupo das subtilases. Identificou- se uma ampla variedade de subtilisinas, e determinou-se a seqüência de aminoácidos de uma quantidade de subtilisinas. Estas incluem mais de seis subtilisinas das cepas Bacillus, nominalmente: a subtilisina 168, subtilisina BPN', subtilisina Carlsberg, subtilisina Y, subtilisina amylosaccahariticus, e mesentericopeptidase (Kurihara et al„ (1972) "Nucleic Acids Res." 11, 7911- 7925; Stahl e Ferrari (1984) "J. Bacteriol." 159 811-819, Jacobs et al„ (1985) "Nucl. Acids Res." 13 8913-8926; Nedkov et al„ (1985) "Biol. Chem. Acids Res." 13 8913-8926; Nedkov et al„ (1985) "Biol. Chem. Hoppe-Seyler" 366 421-430, Svendsen et al„ (1986) "FEBS Lett." 196 228-232), uma subtilisina de um actinomycetales, termitase do Thermoactinomyces vulgaris (Meloun et al„ (1985) "FEBS Lett." 198 195-200), e uma subtilisina fungica, proteinase K do Tritirachium álbum (Jany e Mayer (1985) "Biol. Chem.", Hoppe-Seyler 366 584-492). Para maior referência, reproduzimos abaixo a tabela I de Siezen et al,

As subtilisinas são bem caracterizadas fisicamente e quimicamente. Adicionalmente ao conhecimento da estrutura primária (seqüência de aminoácido) destas enzimas, mais de 50 estruturas de subtilisinas foram determinadas com raios-X de alta resolução, que delineam a ligação substrato, estado de transição, produtos, pelo menos três diferentes inibidores de protease, definindo as conseqüências estruturais para a variação natural (Kraut (1977) "Ann. Rev. Biochem." 46 331-358).

No contexto deste pedido, substrato deveria ser interpretado em sua forma mais ampla, compreendendo um composto que contém, pelo menos, uma ligação de peptídeo suscetível à hidrólise por meio de uma protease de subtilisina.

Da mesma forma, a expressão "produto" deveria ser interpretada, no contexto desta invenção, como incluindo os produtos da reação de hidrólise que envolvem a protease de subtilisina. Um produto pode ser o substrato numa subseqüente reação de hidrólise.

Um subgrupo de subtilase, I-S1, compreende as subtilisinas "clássicas", como a subtilisina 168, subtilisina BPN', subtilisina Carlsberg (ALCALASE®, NOVO NORDISK A/S), e subtilisina DY.

Um outro grupo de subtilases I-S2 é reconhecido por Siezen et al„ (referido acima). O subgrupo I-S2 de proteases é descrito como subtilisinas altamente alcalinas, e compreende enzimas como a subtilisina PB92 (MAXACAL®, Gist-Brocades NY), subtilisina 309 (SAVINASE®, NOVO NORDISK A/S), subtilisina 147 (ESPERASE®, NOVO NORDISK A/S), e elastase alcalina YaB.

No contexto desta invenção, uma variante de subtilisina ou subtilisina mutante significa uma subtilisina que foi produzida por um organismo que expressa um gene mutante derivado de um microorganismo- pai que possuía um gene original ou pai e que produziu uma enzima-mãe correspondente, sendo que o gene-pai foi modificado de modo a produzir o gente mutante do qual a referida protease de subtilisina mutante é produzida quando expressa num hospedeiro adequado.

Mutações, randômicas e direcionadas a determinados sítios, do gene da subtilisina vieram à luz através do conhecimento das propriedades físicas e químicas da enzima e contribuíram com informação referente à atividade catalítica da subtilase, da especificidade do substrato, da estrutura terciária, etc. (Wells et al„ (1987) "Proc. Natl. Acad. Sci. EUA" 84; 1219- 1223; Wells et al„ (1986) "Phil. Trans. R. Soc. Lond. A." 317 415-423; Hwang e Warshel (1987) "Biochem." 26 2669-2673; Rao et al„ (1987) "Nature" 328 551-554.

Publicações mais recentes que cobrem esta área são: Carter et al„ (1989) "Proteins" 6 240-248 referente ao projeto de variantes que clivam uma seqüência-alvo específica em um substrato (posições 24 e 64); Graycar et al, (1992). "Annals of the New York Academy of Sciences" 672 71-79 que discute uma quantidade de resultados previamente publicados; e Takagi (1993) "Int. J. Biochem." 25 307-312 também revê resultados anteriores.

Especialmente, a mutagenese direcionada a sítios que ocorre em genes de subtilisina atraiu muita atenção, e descreve-se diversas mutações nos seguintes pedidos de patentes e nas seguintes patentes:

A EP, com n° de publicação 130756 (GENENTECH) (correspondente à patente reexpedida US n° 34 606 (GENENCOR)) referente a mutações específica a sítios ou geradas randomicamente em "hidrolases de carbonila" e a subseqüente análise das enzimas mutantes quanto a diversas propriedades, como a proporção kcat/Km, perfil de atividade do pH, e estabilidade à oxidação. Esta publicação revela que a mutação específica para sítios é exeqüível, e que a mutação da subtilisina BPN' em determinadas posições, i.e., "1Tyr, 32Asp, 155Asn, 104Tyr, 222Met, 166Gly, 64His, 169Gly, 189Phe, 33Ser, 221Ser, 217Tyr, 156Glu ou 152Ala, proporcionam enzimas que apresentam propriedades alteradas. Como estas posições, exceto a -1, eram conhecidas por estarem envolvidas no funcionamento da enzima antes do depósito deste pedido, e, portanto, evidentes para seleção, este pedido não contribui muito para resolver o problema de decidir onde introduzir mutações de modo a se obter enzimas com propriedades desejadas.

A EP com n° de publicação 214435 (HENKEL) referente à clonagem e expressão da subtilisina Carlsberg e a dois de seus mutantes. Neste pedido, não se oferece nenhuma razão para a mutação de 158Asp a 158Sere161Sera161Asp.

No pedido de patente internacional WO 87/04461 (AMGEN)

propôs-se reduzir o número de seqüências Asn-Gly presentes na enzima-mãe de modo a se obter enzimas mutantes que apresentam um pH aperfeiçoado e estabilidades ao calor, sendo que no pedido se enfatiza a remoção, a mutação ou a modificação dos resíduos 109Asn e 218Asn na subtilisina BPN'. Não se oferece exemplos para quaisquer deleções ou para a modificação dos resíduos Gly.

O pedido de patente internacional n° WO 87/05050 (GENEX) descreve uma mutação randômica e a subseqüente análise de um grande número de mutantes de subtilisina BPN' no que se refere às propriedades aperfeiçoadas. No pedido as mutações são descritas nas posições 218Asn, 131Gly, 254Thr, 166Gly, 116Ala, 188Ser, 126Leu, e 53Ser.

No pedido EP n° 251 446 (GENENCOR) descreve-se como as considerações quanto à homologia nos níveis primário e terciário podem ser aplicadas para identificar se resíduos equivalentes de aminoácido estão conservados ou não. Esta informação, juntamente com o conhecimento da estrutura terciária da subtilisina BPN' leva os inventores a selecionaram uma quantidade de posições suscetíveis para mutação com uma expectativa de se obter mutantes com propriedades alteradas. As posições identificadas desta forma são: 124Met, 222Met, 104Tyr, 152Ala, 156Glu, 166Gly, 169Gly, 189Phe, 217Tyr. E também: 155Asn, 21Tyr, 22Thr, 24Ser, 32Asp, 33Ser, 36Asp, 46Gly, 48Ala, 49Ser, 50Met, 77Asn, 87Ser, 94Lys, 95Val, 95Leu, 107Ile, 110Gly, 170Lys, 171Tyr, 172Pro, 197Asp, 204Ser, 213Lys, e 221Ser, posições estas que são identificadas como esperadas para influenciar diversas propriedades da enzima. Da mesma forma, exemplifica-se uma quantidade de mutações para subsidiar estas sugestões. Adicionalmente às mutações singelas nestas mutações, os inventores também realizaram uma quantidade de mutações múltiplas. Além disso, os inventores identificam 215Gly, 67His, 126Leu, e resíduos de aminoácidos dentro dos segmentos 97-103, 126-129, 213-215 e 152-172 como sendo de interesse, porém as mutações em quaisquer destas posições não são exemplificadas.

De especial interesse para a finalidade da presente invenção, os inventores da EP 251 446 sugerem substituir 170Lys (na subtilisina BPN', tipo I-S1), especialmente, eles sugerem introduzir Glu ou Arg pelo Lys original. Parece que a variante Glu foi produzida, e verificou-se que é altamente suscetível à degradação autolítica (cf. pp. 48, 121, 123 (a tabela XXI inclui um erro óbvio, porém indica uma redução na meia-vida da autólise de 86 para 13 minutos) e fig. 32).

A EP com n° de publicação 260105 (GENENCOR) descreve a modificação de determinadas propriedades nas enzimas que contêm uma tríade catalítica, por meio da seleção de um resíduo de aminoácido em cerca de 15 Â da tríade catalítica, e substitui o resíduo de aminoácido selecionado por outro resíduo. As enzimas do tipo subtilase descritas no presente pedido são mencionadas especificamente como pertencentes à classe de enzimas que contêm uma tríade catalítica.

No caso das subtilisinas, as posições 222 e 217 são indicadas como posições preferidas para substituição.

Também foi mostrado por Thomas, Russell, e Fersht (1985) "Nature" 318 375-376 que a substituição de 99Asp em 99Ser na subtilisina BPN' altera a dependência do pH da enzima.

Em um artigo subseqüente (1987) "J. Mol. Biol." 193 803- 813, os mesmos autores também discutem a substituição de 156Ser no lugar de 156Glu.

Ambas estas mutações encontram-se à distância de cerca 15 Â do 64His ativo.

No periódico "Nature" 328 496-500 (1987), Russel e Fersht discutem os resultados de seus experimentos e apresentam regras para alterar os perfis de atividade do pH por mutarem uma enzima de modo a obter alterações na carga superficial.

O WO 88/08028 (Genex) e o WO 88/08033 (Amgen) referem- se, ambos, a modificações de resíduos de aminoácido nos sítios de ligação de cálcio da subtilisina BPN'. Considera-se que a enzima é estabilizada através da substituição de resíduos mais negativamente carregados pelos originais.

No WO 89/06279 (NOVO NORDISK A/S) a posição 170 é indicada como interessante e sugere-se substituir o resíduo existente por Tyr. Contudo, não se menciona quaisquer dados com respeito a uma variante dessas. No WO 91/00345 (NOVO NORDISK A/S) faz-se a mesma sugestão, e mostra-se que a variante de Tyr da posição 170 na subtilisina 309 (tipo I- S2) apresenta um desempenho aperfeiçoado de lavagem em detergentes com um pH de cerca 8 (variante S003 nas tabelas III, IV, V, VI, VIII, X). A mesma substituição, em combinação com outras substituições em outras posições, também indica um desempenho aperfeiçoado de lavagem (S004, SOl 1-S014, S022-S024, S019, S020, S203, S225, S227, na mesma tabela e na tabela VII) todos de acordo com o conceito genérico do referido pedido.

No EP 525 610 Al (SOLVAY) sugere-se aperfeiçoar a estabilidade da enzima (uma subtilase do tipo I-S2 intimamente relacionada com a subtilisina PB92) no sentido de tensoativos iônicos através do decréscimo da hidrofobicidade em determinadas de suas regiões superficiais. Sugere-se, conseqüentemente, substituir Gln por Arg na posição 164 (170 caso se utilize a numeração BPN'). Nenhuma variante que compreende esta substituição no pedido.

No WO 94/02618 (GIST-BROCADES N.V.) descreve-se uma quantidade de variantes de posição 164 (170 caso se utilize a numeração BPN') da subtilisina PB92 do tipo I-S2. Oferece-se exemplos que mostram a substituição de Met, Vai, Tyr, lie, pelo Arg original. Ensaios de desempenho de lavagem em detergentes em pó feitos com estas variantes indicam um ligeiro aperfeiçoamento. Especialmente no que se refere aos ensaios de desempenho de lavagem com a variante lie, sobre cacau, observou-se um aperfeiçoamento de cerca de 20-30%. Não se oferece quaisquer dados acerca da estabilidade.

No WO 95/30011, WO 95/30010, e no WO 95/29979 (PROCTER & GAMBLE COMPANY) descreve-se 6 regiões, especialmente a posição 199-220 (numeração BPN'), tanto no caso da subtilisina BPN' e na subtilisina 309, que são destinadas para alterar (i.e., diminuir) a adsorção da enzima sobre sujeiras ligadas à superfície. Sugere-se que a menor adsorção por parte de uma enzima sobre um substrato resulta num melhor desempenho de limpeza detergente. Não são fornecidos dados específicos sobre o desempenho de lavagem detergente proporcionado pelas variantes sugeridas.

O WO 95/27049 (SOLVAY S.A.) descreve uma protease do tipo subtilisina 309 com as seguintes mutações: N43R+N116R+N117R (numeração BPN'). Os dados indicam que a variante correspondente apresenta uma estabilidade aperfeiçoada, comparado com o tipo selvagem.

Aplicações Industriais das Subtilases

Proteases, como as subtilisinas, encontraram muita utilidade na indústria, particularmente em formulações detergentes, onde são úteis na remoção de manchas proteináceas.

Presentemente, pelo menos, as proteases descritas a seguir são conhecidas como sendo comercialmente obteníveis, e muitas destas são comercializadas em grandes quantidades em muitos países do mundo.

Subtilisina BPN' ou Novo, obtenível, por exemplo, da firma SIGMA, St. Louis, EUA.

Subtilisina Carlsberg, comercializada pela NOVO NORDISK A/S (Dinamarca) como ALCALASE® e por Gist-Brocades N.V. (Holanda) como MAXATASE®;

Ambas referidas acima pertencem ao subgrupo de subtilase I- S1.

No subgrupo I-S2 de subtilase sabe-se que são comercializados as descritas a seguir.

Uma subtilisina de Bacillus lentus, subtilisina 309, comercializadas pela NOVO NORDISL S/A (Dinamarca) como SAVINASE®. Uma variante elaborada geneticamente de proteína desta enzima é comercializada como DURAZYM/®.

As enzimas assemelhadas intimamente com a SAVINASE®, como a subtilisina PB92, MAXACAL® comercializada pela Gist-Brocades N.V. (uma variante elaborada geneticamente de proteína desta enzima é comercializada como MAXAPEM®), OPTICLEAN® comercializada pela firma SOLVAY et Cie. e PURAFECT/® comercializada pela GENENCOR International.

Uma subtilisina de Bacillus lentus, subtilisina 147, comercializada pela NOVO NORDISK A/S (Dinamarca) como ESPERASE®;

No entanto, para serem efetivas, essas enzimas não só precisam apresentar atividade sob condições de lavagem, mas também precisam ser compatíveis com outros componentes detergentes durante a produção e o armazenamento dos detergentes.

Por exemplo, as subtilisinas podem ser utilizadas em combinação com outras enzimas ativas contra outros substratos, e a subtilisina selecionada deveria possuir uma estabilidade em relação a essas enzimas, e, também, a subtilisina selecionada, de preferência, não deveria catalisar a degradação das outras enzimas. A subtilisina escolhida também deveria ser resistente à ação de outros componentes na formulação detergente, como agentes alvejantes, agentes de oxidação, etc., em particular, uma enzima que se pretende utilizar numa formulação detergente deveria ser estável com respeito ao pó de oxidação, às propriedades ligantes de cálcio, e às condições de pH propiciadas pelos componentes não-enzimáticos no detergente durante o armazenamento e no licor de lavagem durante a lavagem.

A capacidade de uma enzima catalisar a degradação de diversos outros substratos presentes nos objetos a serem limpados durante, p.ex., a lavagem, é freqüentemente referida como sua capacidade de lavagem, lavabilidade, detergência, ou desempenho de lavagem. Através de todo este pedido, o termo desempenho de lavagem será utilizado de modo a abranger esta propriedade.

A capacidade de uma enzima permanecer ativa na presença de outros componentes de uma composição detergente antes de ser utilizada (normalmente pela adição de água no processo de lavagem) é referida, usualmente, como estabilidade ao armazenamento ou vida de prateleira. Ela é freqüentemente medida como meia-vida, ty2. Utilizaremos a expressão estabilidade ao armazenamento quanto a esta propriedade através deste pedido de modo a abranger esta propriedade.

Verificou-se que as subtilisinas naturalmente ocorrentes possuem propriedades que são altamente variáveis em relação a seu poder de lavagem ou capacidade de lavagem sob variações em parâmetros, como o pH. Diversas proteases detergentes comercializadas referidas acima apresentam um desempenho melhor que aquelas comercializadas a cerca de 20 anos atrás, porém, no que se refere ao desempenho ótimo, cada enzima tem suas próprias condições específicas no que se refere à formulação e às condições de lavagem, p.ex., pH, temperatura, concentração iônica (=1), sistema ativo (tensoativos, agentes alvejantes, etc.), builders, etc.

Como uma conseqüência, verificou-se que uma enzima que possua propriedades desejáveis a um pH baixo e um I baixo, podem ser menos atrativa em condições mais alcalinas e alto I, ou, uma enzima que apresenta propriedades finas a um alto pH e alto I pode ser menos atrativa a um baixo pH, e baixas condições de I.

Verificou-se também que a capacidade de armazenamento difere entre as enzimas, mas também se verificou que uma enzima específica apresenta grandes variações no que se refere à estabilidade ao armazenamento em relação a diferentes formulações detergentes, dependendo de uma quantidade de parâmetros, como o pH, pi, sistema de alvejamento, tensoativos, etc., e do estado físico das composições detergentes, que pode ser em forma de pó, poeira, ou em forma líquida. Além disso, pode ser concentrada ou diluída.

O advento e o desenvolvimento de técnicas de DNA recombinante exerceu uma profunda influência no campo da química das proteínas.

Com a aplicação desta tecnologia é possível, agora, construir enzimas possuidoras de seqüências desejadas de aminoácidos, e, como indicado acima, tem sido devotado muito esforço de pesquisa para se projetar subtilisinas com propriedades alteradas.

Entre as propostas, a técnica de se produzir e analisar um grande número de enzimas mutantes, como descrito na EP com n° de publicação 130756 (GENENTECH) (Patente US reexpedida n° 34 606 (GENENCOR)) e patente internacional com n° de publicação WO 87/05050 (GENEX) corresponde, em grande parte, ao processo clássico de se isolar enzimas nativas, submetê-las a programas clássicos de mutagênese (usando radiação ou mutagens químicos) e analisá-las quanto a suas propriedades. A diferença reside no fato de que estes processos são mais eficientes devido ao conhecimento da presença de uma grande quantidade de enzimas variantes substituídas numa posição específica.

Uma enzima de subtilisina compreende, tipicamente, cerca de 275 resíduos de aminoácido. Cada resíduo é capaz representar 1 entre 20 possíveis aminoácidos naturalmente ocorrentes.

Portanto, uma desvantagem séria deste procedimento é o número muito grande de mutações geradas que precisam ser submetidas a uma quantidade de análises preliminares para se determinar suas propriedades.

Um procedimento, como o delineado nestes pedidos de patente, conseqüentemente só será ligeiramente melhor do que os procedimentos de mutação randômicos tradicionais que já são conhecidos há muitos anos.

As outras técnicas conhecidas referem-se à alteração de propriedades específicas, como a estabilidade à oxidação, estabilidade térmica, taxa de hidrólise e transesterificação (EP com n° de publicação 260105 (GENENCOR), perfil de atividade do pH (Thomas, Russel, e Fersht, ver acima) e espeficidade de substrato (patente internacional com n° de publicação WO 88/07578 (GENENTECH)). Nenhuma desta publicações refere-se à alteração do desempenho de lavagem das enzimas ou à sua estabilidade ao armazenamento.

No pedido de patente internacional n° PCT/DK 88/00002 (NOVO NORDISK A/S) propõe-se o uso do conceito de comparação de homologia para se determinar quais posições de aminoácidos deveriam ser selecionadas para mutação e quais aminoácidos deveriam ser substituídos nessas posições de modo a obter-se uma alteração desejada no desempenho de lavagem. Utilizando-se um procedimento desses, a tarefa de analisar torna-se drasticamente reduzida já que o número de mutantes gerados é muito menor, porém com aquele procedimento só se pode prever que se pode obter as enzimas que apresentam as propriedades úteis combinadas da enzima-mãe e a enzima utilizada na comparação.

Assim, como indicado acima, não se identificou qualquer relação entre as propriedades bem definidas de uma enzima, como aquelas mencionadas acima, e o desempenho de lavagem e a estabilidade ao armazenamento de uma enzima em diversas composições detergentes.

O problema parece consistir no fato de que embora muita pesquisa tenha sido dirigida para revelar o mecanismo da atividade da enzima, ainda pouco se sabe acerca dos fatores na estrutura e na combinação do resíduo de aminoácido que determinam as propriedades, como a capacidade de armazenamento em detergentes, de enzimas em relação à maioria de suas características, especialmente quando as enzimas estão presentes em misturas complexas.

Conseqüentemente, ainda existe uma necessidade de um maior aperfeiçoamento e uma adaptação das enzimas a sistemas detergentes, bem como de um melhor entendimento do mecanismo da ação da protease e da degradação no uso prático de composições limpantes ou detergentes. Uma compreensão dessas poderia resultar em normas que podem ser aplicadas para selecionar mutações que, com um razoável grau de certeza, resultarão numa enzima que apresentará uma capacidade aperfeiçoada ao armazenamento sob condições específicas numa composição detergente.

Sumário da Invenção

Verificou-se agora, com surpresa, que uma variante de subtilase que possui uma estabilidade aperfeiçoada ao armazenamento e/ou um desempenho aperfeiçoado em detergentes, pode ser obtida substituindo-se um ou mais resíduos de aminoácido, situados ali ou nas imediações de um domínio hidrofóbico da subtilase-mãe, para um aminoácido mais hidrofóbico do que o resíduo original, sendo que o referido domínio hidrofóbico compreende os resíduos que correspondem aos resíduos P129, P131, 1165, Yl67, Yl71 do BLS309 (na numeração BASBPN), e os referidos resíduos em suas imediações compreendem os resíduos E136, G159, S164, R170, Al94, e Gl95 do BLS309 (na numeração BASPN), com exceção do R170M, Rl 701 e R170V, variantes do BABP92.

A presente invenção refere-se conseqüentemente, em seu primeiro aspecto, a variantes de enzima que apresentam uma estabilidade aperfeiçoada e/ou um desempenho aperfeiçoado de lavagem no detergente.

Em seu segundo aspecto, a invenção refere-se a construções de DNA capazes de expressarem as enzimas do primeiro aspecto, quando inseridas de uma maneira adequada numa célula hospedeira que, subseqüentemente, expressa a(s) enzima(s) de subtilisina do primeiro aspecto.

Em um terceiro aspecto a invenção, refere-se à produção de enzimas de subtilisina da invenção através da inserção de uma construção de DNA de acordo com o segundo aspecto num hospedeiro adequado, cultivando-se o hospedeiro para expressar a desejada enzima de subtilase, e recuperando-se a enzima produto.

A invenção refere-se, em parte, mas sem limitar-se, a mutantes de genes que expressam as enzimas do subgrupo I-S2 de subtilase e as decorrentes variantes de enzimas, como indicado acima. Outras variantes de genes de subtilase abrangidas pela invenção são como aquelas do subgrupo I- S1 de subtilase, p.ex., genes de subtilisina BPN' e subtilisina Carlsberg e as decorrentes enzimas variantes de subtilisina BPN', proteinase K, e enzimas de subtilisina Carlsberg que apresentam estabilidade aperfeiçoada em detergentes líquidos concentrados.

Ainda outras variantes de gene de subtilase abrangidas pela invenção são como a proteinase K e outros genes, e a variante decorrente proteinase K, e outras enzimas de subtilase que apresentam uma estabilidade aperfeiçoada em detergentes líquidos concentrados.

Outros exemplos de enzimas da subtilase mãe que podem ser modificadas de acordo com a invenção estão listados na tabela I.

Além disso, a invenção refere-se ao uso de enzimas mutantes em composições limpantes, e a composições limpantes que compreendem enzimas mutantes, especialmente composições detergentes que compreendem as enzimas de subtilisina mutante. Especificamente, a invenção refere-se a composições detergentes líquidas concentradas que compreendem essas variantes de enzima.

Abreviaturas

<table>table see original document page 17</column></row><table> E Glu = ácido glutâmico

K = Lys Lisina

R Arg = Arginina

H His = Histidina

X Xaa = qualquer aminoácido

Bases de ácido nucléico

A = Adenina

G = Guanina

C = Citosina

T = Timina(apenas em DNA)

U = Uracila(apenas em RNA)

Variantes

Ao se descrever as diversas variantes de enzima produzidas ou consideradas de acordo com a invenção, adaptou-se as seguintes nomenclaturas para maior facilidade de referência:

Posição/Posições de aminoácido(s) originais de aminoácido(s) substituído(s).

De acordo com isto, a substituição do ácido glutâmico por glicina na posição 195 é designada como:

Gly 195 Glu ou G195E uma deleção de glicina na mesma posição é:

Gly 195 * ou G195*

e inserção de um resíduo de aminoácido adicional, como a lisina é:

Gly 195 GlyLys ou G195GK

Onde a deleção é indicada, em comparação com a seqüência utilizada para a numeração, uma inserção numa posição dessas é indicada como:

* 36 Asp ou *36D

para a inserção de um ácido aspártico na posição 36

As mutações múltiplas são separadas por sinais de mais, i.e.: Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu ou R170Y+G195E representando mutações nas posições 170 e 195, substituindo tirosina e ácido glutâmico por arginina e glicina, respectivamente.

Posições

Ao se descrever as variantes neste pedido e nas reivindicações apensas, utilizou-se o alinhamento de diversas subtilases conforme encontrado em Siezen et al„ ver acima. Em outras publicações referentes a subtilases, utilizou-se outros alinhamentos ou a numeração de enzimas específicas. E um assunto rotineiro para a pessoa versada estabelecer a posição de um resíduo específico na numeração utilizada aqui. Também se faz referência à fig. 1 mostrando um alinhamento de resíduos, relevante para a presente invenção, a partir de uma grande quantidade de subtilases. Também se faz referência à tabela I do WO 91/00345 que mostra um alinhamento de resíduos, relevante para a presente invenção, a partir de uma quantidade de subtilases.

Tabela I

Subtilases presentemente estabelecidas (de Siezen et aL ver acima) Organismo gene de cDNA, enzima acrônimo

PROKARYOTES

BACTÉRIAS: GRAM-POSITIVAS

Bacillus subtilis 168 apr A subtilisina Il68,apr ABSS168

Bacillus apr subtilisina BPN' BASBPN

amyloliquefaciens (NOVO)

BacillussubtilisDY - subtilisina DY BSSDY

Bacillus + subtilisina Carlsberg BLSCAR

lieheniformis

Bacilluslentus + subtilisina 147 BLS147

Bacillus + subtilisina PB92 BAPB92

alealophilus PB92 <table>table see original document page 20</column></row><table>

BACTÉRIAS: GRAM-NEGATIVAS

<table>table see original document page 20</column></row><table> <table>table see original document page 21</column></row><table>

EUKARYOTES INFERIORES

FUNGOS:

<table>table see original document page 21</column></row><table> <table>table see original document page 22</column></row><table>

Referências usadas para a tabela I

Referências às seqüências de aminoácidos (os números de acesso do banco de dados GenBank®/EMBL Data Bank são mostrados entre parênteses):

ARB172 Kamekura e Seno, (1990) Biochem. Cell Biol. 68 352-359 (sequenciamento de aminoácido de resíduos de proteases maduras 1-35; resíduo 14 não determinado).

BSS168 Stahl. e Ferrari. (1984) J. Bacteriol. 158, 411-418 (KO1988). Yoshimoto, Oyama et al„ (1488) J1 Biochem. 103, 1060-1065 (a subtilisina madura do B.subtilis var. amylosacchariticius difere por possuir T130S e T162S). Svenden et al„ (1986) FEBS Lett. 196, 228-232 (PIR Α23624; sequenciamento de aminoácido; a mesentericopeptidase alcalina madura do B. mesentericus difere por possuir S85A, A88S, S89A, S183A e N259S).

BASBPN Wells et al„ (1983) Nucl. Acids Res. 11 7911-7925 (X00165). Vasanthaetal,, (1984) J. Bacteriol. 159 811-814 (K02496)

BSSDY NedKov et al„ (1983) Hoppe-SeyleriS Z. Phvsiol. Chem. 364 1537-1540 (PIR A00969); sequenciamento de aminoácido).et al„

BLSCAR Jacobs et al, (1985) Nucleic Acid Res. 13 8913- 8926 (X03341). Smith et al, (1968) J. Biol. Chem. 243 2184-2191 (PIR A00968;

seqüenciamento de aminoácido; a seqüência da protease madura difere por possuir T103 S, P129, S158N, N161S e S212N).

BLS147 Hastrup et al, (pedido de patente PCT 1989 WO 8906279.

publicado em 13 de julho de 1989. (Esperase® do B. lentus).

Takami et al, (1990) Appl. Microbiol. Biotechnol., 33 519-523 (seqüenciamento de aminoácido de resíduos de protease alcalina 1-20 do Bacillus sp. n0 AH-101; esta seqüência difere do BLS147 por possuir N11S).

BABP92 van der Laan et al, (1991) Appl. Environ Microbiol. 57 901-909. (Maxacal®). Hastrup et al, (1989) pedido de patente PCT WO 8906279. Publicado em 13 de julho de 1989. (subtilisina 309. Savinase®, do B. Ientus difere apenas por possuir N87S). Godette et al, (1991) Abstracts 5 Protein Society Symposium, 6 de junho, Baltimore: resumo M8 (uma protease altamente alcalina do B. Ientus difere por possuir N87S, S99D, S101R, S103A, V104I e G159S).

BDSM48 Rettenmaier et al, (1990) pedido de patente PCT WO 90/04022. Pub. 19 de abril de 1990.

BYSYAB Kaneko et al, (1989) J. Bacteriol. 171 5232-5236 (M28537). BSEPR Sloma et al, (1988) J. Bacteriol. 170 5557-556 (M22407). Bruckner (1990) Mol. Gen. Genet. 221 486-490 (X53307).

BSBPF Sloma et al, (1990) J. Bacteriol. 172 1470-1477 (M29035; corrigido). Wu et al, (1990) J.Biol. Chem. 265 6845-6850 (J05400; esta seqüência difere por possuir A169V e menos 586 resíduos de C terminal devido a um desvio da estrutura).

BSISPl Koide et al, (1986) J. Bacteriol. 167 110-116 (M13760).

BSIA50 Strongin et al, J. Bacteriol. 133 1401-1411 (seqüenciamento de aminoácido de resíduos de protease madura 1-54; resíduos 3. 39, 40. 45, 46, 49 e 50 não determinado).

BTFINI Chestukhina et al, (1985) Biokhimiva 50 1724-173 (seqüenciamento de aminoácido de resíduos de protease madura 1-14 do B. thuringiensis variedade israeliensis, e resíduos 1-16 e 223-243 da variedade fmitimus). Kunitate et al, (1989) Agric.

Biol. Chem. 53 3251-3256 (seqüenciamento de aminoácido de resíduos de protease madura 6-20 da variedade kurstaki. BTKURS).

BCESPR Chestukhina et al, (1985) Biokhimiva 50 1724-1730 (seqüenciamento de aminoácido de resíduos de protease madura 1-16 e 223-243).

NDAPII Tsujibo et al, (1990) Agric. Biol. Chem. 54 2177- 2179(seqüenciamento de aminoácido de resíduos de protease madura 1- 26).

TVTHER Meloun et al, (1985) FEBS Lett. 183 195-200 (PIR A00973;

seqüenciamento de aminoácido de resíduos de protease madura 1-274).

EFCYLA Segarra et al, (1991). Infect Immun. 59 1239-1246.

SEEPIP Schnell et al, (1991) comunicação pessoal (Siezen et al, (supra)).

SPSCPA Chen et al, (1990) J. Biol. Chem. 265 3161-3167 (J05224). DNEBPR Kortt et al, (1991) Resumo do 5° simpósio da Protein Society, 22-26 de junho, Baltimore. Resumo S76.

LLSK11 Vos et al, (1989) J. Biol. Chem. 264 13579-13585 (J04962). Kok et al, (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 231-238 (M24767) ; a seqüência da cepa Wg2 difere em 44 posições, incluindo 18 diferenças no domínio da protease, e uma deleção de resíduos 1671-1676). Kiwaki et al, (1989) Mol. Microbiol. 3 359-369 (X14130; a seqüência da cepa NCD0763 difere em 46 posições, incluindo 22 no domínio da protease, e uma deleção de resíduos 1617-1676).

XCEXPR Liu et al, (1990) Mol. Gen. Genet. 220 433-440

SMEXSP Tanagida et al, (1986) J. Bacteriol. 166 937-994 (Ml3469).

TAAQUA Terada et al, (1990) J. Biol. Chem. 265 6576-6581 (J054I4).

TRT41A Mc Hale et al, (1990) Abstracts 5th Eur. Congr. Biotechn. Christiansen, Munck and Villadsen (editores), Munksgaard Int. Publishers, Copenhagen.

VAPROA Deane et al, (1989) Gene 76 281-288 (M25499).

SRESPD Lavrenova et al, (1984) Biochemestrv USSR. 49 447-454 (seqüenciamento de aminoácido dos resíduos 1-23; residues 13, 18 e 19 não determinados).

AVPRCA Maldener et al, (1991) Mol. Gen. Genet. 225 113-120 (a seqüência publicada tem 28 resíduos incertos próximos da posição 200-210 devido a um erro de leitura proveniente de um desvio de estrutura).

TAPROK Gunkel and Gassen (1989) Eur. J. Biochem. 179 185-194 (X14688/X14689). Jany et al, (1986) J. Biol. Chem. Hoppe- Seyler 367 87 (PIR A24541); seqüenciamento de aminoácido; a protease madura difere por possuir S745G, SILST204-208DSL e VNLL264-267FNL). TAPROR Samal et al, (1990) Mol. Microbiol. 4 1789-1792 (X56116).

TAPROT Samal et al, (1989) Gene 85 329-333.

AOALPR Tatsumi et al, (1989) Mol. Gen. Genet. 219 33-38. Cheevadhanarah et al, (1991) EMBL Data Library (X54726).

MPTHMY Gaucher e Stevenson (1976) Methods Enzymol. 45 415-433 (seqüenciamento de aminoácido de resíduos 1-28, e hexapeptide LSGTSM com serina de sítio ativo).

ACALPR Isogai et al, (1991) Agric. Biol. Chem. 55 471-477. Stepanov et al, (1986) Int. J. Biochem. 18 369-375 (seqüenciamento de aminoácido de resíduos 1-27: a protease madura difere por possuir H13 [1]Q, Rl 3 [2]N e S13 [6]A).

KLKEXl Tanguy-Rougeau, Wesolowski-Louvel e Fukuhara (1988) FEBS lett. 234 464-470 (X07038).

SCKEX2 Mizuno et al, (1988) Biochem. Biophvs. Res.Commun. 156 246- 254 (M24201).

SCPRBl Moehle et al, (1987) Mol Cell Biol 7 4390-4399 (M18097).

YLXYPR2 Davidow et al, (1987) J. Bacteriol 169 4621-4629 (M17741).

Matoba et al, (1988) Mol Cell Biol 8 4904-4916 (M23353).

CEBl 14 Peters and Rose (1991) The Worm Breeder's Gazette 11 28.

DMFURl Roebroek et al, (1991) FEBS Lett. 289 133-137 (X59384).

DMFUR2 Roebroek et al, (1992) 267 17208-17215.

CMCUCU Kaneda et al, (1984) J. Biochem. 95 825-829 (seqüenciamento de aminoácido do octapeptídeo NIISGTSM com serina de sítio ativo).

HSFUR Ivan den Ouweland et al, (1990) Nucl Acids. Res. 18 664 (X04329) (a seqüência da furina de camundongo difere em 51 posições, incluindo cinco no domínio catalítico: Al5E, Y21F, S223F, A232V e N258[2]D). Misumi et al, (1990) Nucl Acids Res. 18 6719 (X55660: a seqüência da furina de rato difere em 49 posições, incluindo três no domínio catalítico: Al5E, Y21F, H24R).

Smeekens e Steiner (1990) J. Biol. Chem. 265 2997-3000 (J05252). Seidah et al, (1990) DNA Cell Biol. 9 415-424 (a seqüência da protease PC2 da pituitária de rato difere em 23 posições, incluindo sete no domínio da protease: I4F, S42[2]Y, E45D, N76S, D133E, V134L e G239[1]D). Smeekens et al, (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 340-344 (M58507). Seidah et al, (1990) DNA Cell Biol. 9 415-424 (M55668/M55669; seqüência parcial).

Tomkinson e Jonsson (1991) Biochemestrv 30 168-174 (J05299).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Nos desenhos, a fig. 1 mostra um alinhamento de uma quantidade das subtilases mencionadas na tabela I;

A fig. 2 é uma representação tridimensional da subtilisina 309 que mostra a localização do domínio hidrofóbido e alguns dos resíduos de aminoácido em suas imediações a serem substituídos de acordo com a invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Verificou-se, com surpresa, que a estabilidade ao armazenamento e/ou o desempenho aperfeiçoado em detergentes de subtilases melhorou, em geral, quando resíduos de aminoácidos situados em, ou na vizinhança de, um domínio hidrofóbico que compreende os resíduos P129, P131, 1165, Yl67, Yl71 ou subtilisina 309 são substituídos por um resíduo mais hidrofóbico. Os resíduos em questão são, especialmente, E136, G159, S164, R170, A194, e G195.

Além disso, a referida variante apresenta uma estabilidade aperfeiçoada particularmente alta em detergentes líquidos e em detergentes em forma sólida modelada.

A fig. 2 mostra o domínio hidrofóbico na subtilisina 309 e resíduos em suas imediações, sendo que uma quantidade destes dever ser substituída de modo a aumentar-se a hidrofobicidade do domínio. Isto pode ser alcançado substituindo-se resíduos hidrofóbicos por resíduos não- hidrofóbicos e/ou substituindo-se resíduos de modo a se tornarem ainda mais hidrofóbicos do que na enzima mãe.

O mesmo princípio aplica-se ao domínio correspondente em outras subtilases, sendo que sua identificação encontra-se dentro da capacidade de uma pessoa média que trabalha neste campo técnico. As representações gráficas como aquela na figura 2 podem ser produzidas para outras subtilases para se determinar os resíduos-alvo a serem substituídos de acordo com a invenção.

Uma quantidade destes é indicada na tabela II, abaixo: Tabela II

Resíduos no domínio hidrofóbico e em suas imediações

<table>table see original document page 29</column></row><table>

A tabela II foi construída utilizando-se o alinhamento mostrado na fig. 2. E óbvio que outras tabelas semelhantes ou maiores que abrangem outras subtilases podem ser facilmente confeccionadas pela pessoa versada na arte.

Conseqüentemente, a invenção refere-se a variantes de subtilase em que a seqüência de aminoácido foi alterada através da mutação do gene da enzima de subtilisina que se deseja modificar (a enzima mãe ou gene) no códon responsável pela expressão do resíduo de aminoácido nas posições 129, 131, 165, 167, 171, 136, 159, 164, 170, 194, e 195, cujos resíduos são mais hidrofóbicos do que o(s) resíduo(s) na enzima mãe, especialmente os resíduos hidrofóbicos que compreendem uma cadeia lateral hidrofóbica relativamente longa, como lie, Leu, e Vai, com o que, quando o gene mutante é expresso, o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo mais hidrofóbico, o que aumenta a hidrofobicidade do domínio como tal.

Os resíduos de aminoácido hidrofóbicos são geralmente os seguintes:

Val (V), Ile (I), Leu (L), Met (M)5 Phe (F), Pro (P) e Trp (W).

Entre estes, prefere-se Vai, Ile e Leu.

Observando-se a tabela II e aplicando-se o princípio da invenção, uma quantidade de candidatos para substituição torna-se clara.

Tanto para BASPN e BLSCAR, parece apropriado realizar substituições nas posições 129, 131, 136, 159, 164, 167, 170, 171 e 195. No BLS309 as posições 136, 164, 167, e 170, 171, seriam as primeiras escolhas, e as posições 159 e 195, também, constituiriam uma segunda escolha. No B1S147, as posições 129, 131, 136, 167, 170, 171, e 195 são a primeira escolha, enquanto que as posições 159 e 164 são a segunda. Finalmente, no TVTHER, as posições 129, 131, 136, 167, 171, e 194 são as primeiras escolhas, sendo que 164 é a segunda escolha.

De acordo com a invenção, constituiria uma vantagem substituir os resíduos Gly no domínio hidrofóbico por resíduos mais volumosos e mais hidrofóbicos.

Essas considerações aplicam-se para qualquer resíduo hidrofílico ou hidrofóbico que possa ocupar qualquer uma das posições referidas acima, significando que qualquer aumento em hidrofobicidade parece ser vantajoso. Isto significa que, p.ex., um resíduo muito hidrofílico, como os resíduos carregados Arg (R), Asp (D), Glu (E) ou Lys (K), pode ser substituído por qualquer resíduo que seja menos hidrofílico. Resíduos menos hidrofílicos desse tipo compreendem os resíduos Gly (G), Cys (C), Ser (S), Ala (A), Thr (T), Tyr (Y), Gln (Q), His (H) ou Asn (N). Isto também significa que um Tyr (R) pode ser substituído por um resíduo mais hidrofílico, como o Phe (F), Leu (L), ou Ile (I).

Considerações semelhantes podem ser aplicadas a outras subtilases que possuem um domínio hidrofóbico nesta parte da superfície da enzima.

No contexto desta invenção, uma subtilase é definida de acordo com Siezen et al„ ver acima. Em um sentido mais estrito, aplicável a muitas concretizações da invenção, as subtilases de interesse são aquelas que pertencem aos subgrupos I-Sl e I-S2. Em um sentido mais específico, muitas concretizações referem-se a serina proteases de bactérias gram-positivas que podem ser trazidas a uma homologia substancialmente inambígua em sua estrutura primária com as subtilases listadas na tabela I, acima.

A presente invenção também compreende qualquer uma ou mais substituições nas posições referidas acima, em combinação com quaisquer outra substituição, deleção ou adição à seqüência de aminoácido da enzima mãe. Enfoca-se, especialmente, as combinações com outras substituições conhecidas por proporcionarem propriedades aperfeiçoadas para a enzima.

Essas combinações compreendem as posições: 222 (aperfeiçoa a estabilidade contra a oxidação), 218 (aperfeiçoa a estabilidade térmica), substituições nos sítios ligadores de Ca que estabilizam a enzima, p.ex., posição 76, e muitas outras aparentes do estado da técnica.

Além disso, as combinações com as variantes mencionadas na EP 405 901 também são contempladas especificamente.

Variantes

A: Variantes simples:

Variantes de subtilisina BPN', subtilisina Carlsberg, subtilisina 168, e subtilisina DY:

P129V, P1291, P129L, P129M, P129F, G131V, G131I, G131L, G131M, G131F, K136V, K1361, K136L, K136M, K136F, S159V, S1591, S159L, S159M, S159F, T164V, T1641, T164L, Τ164Μ, T164F, Υ167Ι, Y167L, Υ167Μ, Y167F, K170V, Kl 701, K170L, Κ170Μ, K170F, Y171V, Υ171Ι, Y171L, Υ171Μ, Y171F, A194V, Al941, A194L, Α194Μ, A194F, E195V, Ε195Ι, E195L, Ε195Μ, E195F, Variantes de termitase: T129V, T129I, T129L, T129M, T129F, G131V, G131I, G131L, G131M, G131F, Q136V, Q136I, Q136L, Q136M, Q136F, T159V, T159I, T159L, T159M, T159F, A164V, A1641, A164L, A164M, A164F, Y167V, Yl671, Y167L, Y167M, Y167F, Y171I, Y171L, Y171M, Y171F, Y170V, Y170I, Y170L, Y170M, Y170F, S194V, S1941, S194L, S194M, S194F,

Variantes de subtilisina 309, subtilisina 147, e protease do Bacillus PB92:

T129V, T 12.91, T129L, T129M, T129F, G131V, Gl3II, G131L, G131M, G131F (BLS147), P131V, P131I, P131L, P131M, P131F (BLS309, BAPB92), E136V, E136I, E136L, E136M, E136F, G159V, G1591, G159L, G159M, G159F, G164V, G1641, G164L, G164M, G164F, (BLS147) S164V, S1641, S164L, S164M, S164F, (BLS309 e BAPB92) Y167A, Y167H, Y167N, Y167P, Y167C, Y167W, Y167Q, Y167S, Y167T, Y167G, Y167I, Y167L, Y167M, Y167F, R170W, R170A, R170H, R170N, R170P, R170S, R170T, R170Y (desreivindicado para o BLS309), Rl7V (desreivindicado para o BAPB92, R1701 (desreivindicado para o BAPB92), R170L, R170M (desreivindicado para o BAPB92), R170F, R170G, R170C,

Y171A, Y171H, Y171N, Y171P, Y171C, Y171W, Y171Q, Y171S, Y171T, Y171G, Y171V, Y171I, Y171L, Y171M, Y171F A194V, A194I, A194L, A194M, A194F, (BLS309 e BAPB92) P194V, P1941, P194L, P194M, P194F, (BLS147) E195V, E1951, E195L, E195M, E195F, (BLS147) G195V, G195I, G195L, G195M, G195F, (BLS309 e BAPB92)

B: Variantes de combinação:

Quaisquer variantes acima são consideradas como vantajosas se combinadas com outras variantes, se as houver, nas posições;

27, 36, 57, 76, 97, 101, 104, 120, 123, 206, 218, 222, 224, 235 e 274.

Especificamente, as variantes BLS309 e BAPB92 a seguir são consideradas apropriadas para combinação:

K27R, *36D, S57P, N76D, G97N, S101G, V104A, V104N, V104Y, H120D, N123S, A194P, Q206E, N218S, M222S, M222A, T224S, K235L e T274A.

Além disso, muitas variantes que compreendem uma ou duas das substituições X167V, X167M, X167F, X167L, X167I, X170V, X170M, X170F, X170L, e/ou Xl701 em combinação com quaisquer um ou mais das outras substituições, deleções e/ou inserções mencionadas acima são vantajosas.

Além disso, as variantes que compreendem quaisquer das variantes V104N+S101G, K27R+V104Y+N123S+T274A, ou N76D+V104A ou outras combinações destas mutações (V104N, S101G, K27R, V104Y, N123S, T274A, N76D, V104A), em combinação com quaisquer uma ou mais das substituições, deleções ou inserções mencionadas acima tendem a apresentar propriedades aperfeiçoadas.

São combinações específicas a serem mencionadas: a) S57P+R170L a') S57P+R170I

b) R170L+N218S

b') R170I+N218S

5 c) S 5 7P+R170L+N218 S

c') S 5 7P+R17 0I+N218 S

c") S57P+V104Y+R170L+N218S

c'") S57P+V104Y+R170I+N218S

d) Rl 70L+N218S+M222A

d') Rl 70I+N218S+M222S

d") Rl 70L+N218S+M222A

d'") Rl70I+N218S+M222S

e) S57P+R170L+S188P+A194P

e') S57P+R170I+S188P+A194P

15f) Y167L+R170L

f) Y167L+R170I

g) Y167J+R170L

g') Y167I+R170I

h) N76D+R170L+N218S

h') N76D+R170I+N218S

i) S57P+N76D+R170L+N218S i') S57P+N76D+R170I+N218S

j) N76D+R170L+N218S+M222A

j') N76D+R170I+N218S+M222S

j") N76D+R170L+N218S+M222A

j'") N76D+R170L+N218S+M222S

k) S 5 7P+R170I+S18 8P+A194P+N218 S

k') S57P+R170I+S188P+A194P+N218S

l) *36D+N76D+H120D+R170L+G195E+K235L 1') *36D+N76D+H120D+R170I+G195E+K235L

1") *36D+N76D+H120D+Y167I+R170L+G195E+K235L

1'") *36D+N76D+H120D+Y167I+R170I+G195E+K235L

m) N76D+H120D+R170L+G195E+K23 5L

m') N76D+H120D+R170I+G195E+K23 5L

m") N76D+H120D+Y167I+R170L+G195E+K235L

m"') N76D+H120D+Y167I+R170I+G195E+K235L

n) * 3 6D+G97N+V104Y+H120D+R170L+A194P+G195E+K23 5L

n') * 3 6D+G97N+V104Y+H120D+R170I+A194P+G195E+K23 5L

o) S57P+R170L+Q206E

o') S57P+R170I+Q206E

p) R170L+Q206E

p') R170I+Q206E

q) Y167I+R170L+Q206E

q') Yl 67I+R170I+Q206E

r) Y167F+R170L

r') Y167F+R170I

t) Y167I+R170L+A194P

t') Y167I+R170I+A194P

t") Y167L+R170L+A194P

t'") Y167L+R1701+A194P

u) Yl 67I+R170L+N218S

u') Yl 671+Rl 70I+N218S

u") Yl 67L+R170L+N218S

u"') Y167L+R170I+N218S

ν) Y1671+R170L+A194P+N218 S

v') Yl 671+R170I+A194P+N218S

ν") Y167L+R170L+A194P+N218 S

ν"') Y167L+R170I+A194P+N218S χ) R170L+P131V

χ') R170I+P131V

y) *36D+Y167I+R170L

y') *36D+Y167I+R170I

z) Y167I+Y171I

aa) Y167V+R170L

aa') Y167V+R170I

bb) R170L+Y171I

bb') R170I+Y171L

bb") R170L+Y171L

bb"') R170I+Y171I

cc) Y167I+Y171L+N218S

cc') Y1671+Y1711+N218 S

COMPOSIÇÕES DETERGENTES COMPREENDENDO AS ENZIMAS MUTANTES

A presente invenção também compreende a utilização das enzimas mutantes da invenção em composições limpantes e detergentes, e a utilização de composições desse tipo que compreendem as enzimas de subtilisina mutantes. Em princípio, essas composições limpantes e detergentes podem ter qualquer forma física, mas as variantes de subtilase são incorporadas, de preferência, em composições detergentes líquidas ou em composições detergentes na forma de barras, tabletes, bastões e análogos, para aplicação direta, sendo que apresentam uma estabilidade ou um desempenho aperfeiçoados da enzima.

Entre as composições líquidas da presente invenção, encontram-se detergentes líquidos aquosos possuindo, por exemplo, um caráter físico homogêneo, por exemplo, podendo consistir de uma solução micelar de tensoativos numa fase aquosa contínua, os assim chamados sólidos isotrópicos. Alternativamente, elas podem ter a uma fase física heterogênea e podem ser estruturadas, por exemplo, elas podem consistir de uma dispersão de gotículas lamelares numa fase aquosa contínua, por exemplo, compreendendo um polímero desfloculador com uma estrutura de hidrofílica e, pelo menos, uma cadeia lateral hidrofóbica, como descrito na EP-A-346 995 (Unilever) (incorporada aqui por referência). Estes últimos líquidos são heterogêneos e podem conter partículas sólidas suspensas, como partículas de materiais builder, por exemplo, dos tipos mencionados abaixo.

No que se refere a composições detergentes em pó, essas composições compreendem, adicionalmente a qualquer uma ou mais das variantes de enzima de subtilisina de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes da invenção, sozinha ou em combinação, quaisquer dos componentes usuais incluídos nessas composições que são bem conhecidas da pessoa versada na arte.

Esses componentes compreendem builders, como os builders de zeólito ou fosfato, tensoativos, como os tensoativos aniônicos, catiônicos, não-iônicos ou hibridamente iônicos, sistemas de branqueamento, como os ativadores ou precursores de alvejamento contendo perborato ou amino, estruturadores, como os estruturadores de silicato, álcali ou ácido para ajustar o pH, umectantes, e/ou sais inorgânicos neutros.

Além disso, uma quantidade de outros ingredientes está normalmente presente nas composições da invenção, como:

A. Co-tensoativos

B. Builder de succinato de tartarato

C. Sistema de neutralização

D. Supressor de espumação

E. Outras enzimas

F. Outros componentes adicionais

A proporção em pesos de tensoativo aniônico para tensoativo não-iônico é, de preferência, de 1:1 a 5:1. As composições têm um pH, numa solução a 10 % em peso em água, a 20°C, de 7,0 a 9,0, uma Concentração Crítica de Micelas menor ou igual a 200 ppm, e uma Tensão Interacial ar/água na Concentração Crítica de Micelas menor ou igual a 32 dynes/cm a 35°C em água destilada. As composições são, preferivelmente, límpidas, homogêneas e de fase estável, e apresentam um bom desempenho de limpeza e boa estabilidade da enzima.

Diversos componentes

1. Tensoativo aniônico

As composições da presente invenção contêm de cerca de 10 % a cerca de 50 % em peso, de preferência, de cerca 15 % a cerca de 50 % em peso, mais preferivelmente, de cerca de 20 % a 40 % em peso, sendo o mais preferível, de 20 % a cerca de 30 % em peso, de um tensoativo aniônico natural ou sintético. Tensoativos aniônicos naturais ou sintéticos adequados 15 são, p.ex., sabões, como os descritos na patente US n° 4 285 841, e na patente US n° 3 929 678.

Tensoativos aniônicos úteis incluem os sais solúveis em água, particularmente os sais de metal de álcali, amônio e alquilamônio (p.ex., monoetanol amônio, ou trietanol amônio), dos produtos orgânicos de reação sulfürica contendo, em sua estrutura molecular, um grupo alquila contendo de cerca de 10 a cerca de 20 átomos de carbono, e um grupo éster do ácido sulfürico ou ácido sulfônico. (Incluído no termo "alquila" encontra-se a porção alquila de grupos arila). Exemplos deste grupo de tensoativos sintéticos são os sulfatos de alquila, especialmente aqueles obtidos pela sulfatação dos álcoois superiores (C8-18 átomos de carbono) como aqueles produzidos pela redução de glicerídeos do sebo ou do óleo de coco; e os sulfonatos de alquilbenzeno em que o grupo alquila contém de cerca de 9 a cerca de 15 átomos de carbono, numa configuração de cadeia reta ou ramificada, p.ex., aqueles do tipo descrito nas patentes US nums. 2 220 099 e 2 477 383. São especialmente valiosos os sulfonatos de alquilbenzeno de cadeia reta linear em que o número médio de átomos de carbono no grupo alquila é de cerca de 11 a 14.

Outros tensoativos aniônicos aqui descritos são os sais solúveis em água de: sulfonatos de parafina contendo de 8 a cerca de 24 (de preferência, de cerca de 12 a 18) átomos de carbono; sulfonatos de alquil gliceril éter, especialmente aqueles éteres de álcoois C8-18 (p.ex., aqueles derivados do sebo ou do óleo de coco); éter sulfatos do óxido de etileno de alquil fenol contendo de 1 a cerca de 4 unidades de óxido de etileno por molécula e de 8 a 12 átomos de carbono no grupo alquila; e éter sulfatos de óxido de etileno contendo de 1 a 4 unidades de óxido de etileno por molécula, e de 10 a 20 átomos de carbono no grupo alquila.

Outros tensoativos aniônicos úteis incluem os sais solúveis em água de ésteres de ácidos graxos α-sulfonados contendo de 6 a 20 átomos de carbono no grupo de ácido graxo e de 1 a 10 átomos de carbono no grupo éster; sais solúveis em água de ácidos 2-aciloxi-alcano-l-sulfônico contendo de 2 a 9 átomos de carbono no grupo acila e de 9 a 23 átomos de carbono na porção alcano; sais solúveis em água de sulfonatos de olefina contendo de 12 a 24 átomos de carbono; e alcano sulfonatos de β-alquiloxi contendo de 1 a 3 átomos de carbono no grupo alquila e de 8 a 20 átomos de carbono na porção alcano.

Os tensoativos aniônicos preferidos são os sabões, os sulfatos de alquila Cio-ie e os sulfatos de alquil etóxi contendo uma média de até 4 unidades de óxido de etileno por mol de sulfato de alquila, sulfonatos de alquil benzeno lineares com Cn.n, e suas misturas.

2. Tensoativo aniônico

Outro ingrediente opcional constitui-se de 2 % a 14 %, de preferência, de 2 % a 8 %, sendo o mais preferível, de 3 % a 5 % em peso, de um tensoativo não-iônico opcionalmente etoxilado. A proporção em pesos do tensoativos aniônico natural ou sintético (numa base ácida) para o tensoativo não-iônico é de 1:1 a 5:1, de preferência, de 2:1 a 5:1, sendo o mais preferível de 3:1 a 4:1. Isto serve para assegurar a formação e a adsorção de tensoativos com dureza suficiente na interface ar/água de modo a proporcionar uma boa remoção da sujeira gordurosa/oleosa.

O tensoativo não-iônico opcionalmente etoxilado tem a fórmula R1(C2H4)n OH, em que R1 é um grupo alquila Ci0-I6 ou um grupo alquil fenila C8-i2, η tem um valor de 3 a 9, e o referido tensoativo não-iônico tem um HLB (Balanço Hidrofílico-Lipofílico) de 6 a 14, de preferência, de 10 a 13. Estes tensoativos são mais plenamente descritos nas patentes US 4 285 841 e 4 284 532. São particularmente preferidos os produtos de condensação de álcoois C12-15 com de 3 a 8 moles de óxido de etileno por mol de álcool, p.ex., álcool C12-13 condensado com cerca de 6,5 moles de óxido de etileno por mol de álcool. Outros tensoativos não-iônicos a serem mencionados são o APG, EGE, e os tensoativos de glucamida.

3. Builder de detergência

Entre os ingredientes detergentes usuais que podem estar presentes em quantidades usuais nas composições detergentes desta invenção encontram-se os seguintes: As composições podem ser built ou não-built, e podem ser do tipo zero-P (i.e., não contendo quaisquer builders contendo fósforo). Assim, a composição pode conter no agregado, por exemplo, de 1- 50 %, p.ex., pelo menos em torno de 5 % e, freqüentemente, até cerca de 35- 40 % em peso, de um ou mais builders orgânicos e/ou inorgânicos. Exemplos típicos de builders incluem aqueles já mencionados acima e, mais amplamente, incluem orto, piro e tripolifosfatos de metal de álcali, carbonatos de metal de álcali, sozinhos ou em mistura com calcito, citratos de metal de álcali, nitrilotriacetatos de metal de álcali, carboximetiloxi succinatos, zeólitos, carboxilatos de poliacetal, e assim por diante.

Mais especificamente, as composições aqui contêm de 5 % a 20 %, de preferência, de 10 % a 15 % em peso de um builder de detergência que pode ser um ácido graxo contendo de 10 a 18 átomos de carbono e/ou um policarboxilato, zeólito, polifosfonato e/ou um polifosfato. Prefere-se entre 0 a 10 % (mais preferivelmente, de 3 % a 10 % em peso de ácidos graxos saturados contendo de 12 a 14 átomos de carbono, juntamente com de 0 a 10 %, mais preferivelmente, de 2 % a 8 %, sendo o mais preferível, de 2 % a 5 %, em peso de um builder de policarboxilato, sendo o mais preferível, o ácido cítrico, numa proporção em pesos de 1:1 a 3:1.

Como as enzimas proteolíticas aqui parecem oferecer ótimos benefícios de estabilidade ao armazenamento versus outras enzimas, quando a proporção de durezas de builder para água é próxima de um, as composições contêm, de preferência, suficiente builder para seqüestrar de 2 a 10, de preferência, de 3 a 8, grãos por galão (4 1) de dureza.

Os ácidos graxos saturados adequados podem ser obtidos de fontes naturais, como os ésteres de plantas ou animais (p.ex., óleo de cerne de palma, óleo de palma, e óleo de coco) ou preparados sinteticamente (p.ex., via a oxidação do petróleo ou por meio de hidrogenação de monóxido de carbono via o processo Fisher-Tropsch). Exemplos de ácidos graxos saturados adequados para uso nas composições desta invenção, incluem os ácidos graxos cáprico, láurico, mirístico, de coco e de cerne de palma. Prefere-se os ácidos graxos saturados de coco; misturas de proporções em pesos de 5:1 a 1:1 (de preferência, em torno de 3:1) de ácido láurico e ácido mirístico; misturas dos referidos acima com quantidades menores (p.ex., 1 % a 30 % do total de ácido graxo) de ácido oléico; e ácido graxo de cerne de palma.

As composições aqui também contêm, de preferência, os builders de policarboxilato, polifosfonato e polifosfato descritos na patente US n° 4 284 532. Os builders de policarboxilato solúveis em água, particularmente os citratos, são os preferidos deste grupo. Os builderes de policarboxilato preferidos incluem os diversos amino policarboxilatos, policarboxilatos de cicloalcano, policarboxilatos de éter, policarboxilatos de alquila, policarboxilatos de epóxi, policarboxilatos de tetraidrofurano, policarboxilatos de benzeno, e policarboxilatos de poliacetal.

Exemplos desses builders de policarboxilato são o etileno diamino tetracetato de sódio e de potássio; nitrilo triacetato de sódio e potássio; os sais solúveis em água do ácido fítico, p.ex., os fitatos de sódio e de potássio, descritos na patente US n° 1 729 942, os materiais de policarboxilato descritos na patente US n° 3 364 103; e os sais solúveis em água de polímeros de policarboxilato e copolímeros descritos na patente US n° 3 308 067.

Outros builders de detergentes considerados úteis incluem os sais solúveis em água de ácidos policarboxílicos alifáticos poliméricos possuindo as seguintes características estruturais e físicas: (a) um peso molecular mínimo de aproximadamente 350, calculado quanto à forma de ácido; (b) um peso equivalente de 50 a 80, calculado quanto à forma de ácido; (3) pelo menos 45 porcento em mol do tipo monômero possuindo pelo menos dois átomos de carbono: (d) o sítio de ligação da cadeia de polímero de qualquer radical contendo carboxila é separado por não mais que três átomos de carbono juntamente com a cadeia de polímero do sítio de ligação do próximo radical contendo carboxila. Exemplos específicos desses builders são os polímeros e copolímeros do ácido itacônico, ácido aconítico, ácido maléico, ácido mesacônico, ácido fumárico, ácido metileno malônico e ácido citracônico.

Outros builders de policarboxilato adequados incluem os sais solúveis em água, especialmente os sais de sódio e de potássio, do ácido melítico, ácido cítrico, ácido piromelítico, ácido benzeno pentacarboxílico, ácido oxidiacético, ácido carbóxi metiloxi succínico, ácido carbóxi metiloxi malônico, ácido cis-cicloe-hexano-hexacarboxílico, ácido cis-ciclopentano tetracarboxílico e ácido oxidi-succínico.

Outros policarboxilatos são constituídos dos carboxilatos de poliacetal descritos na patente US n° 4 144 226 e na patente US n° 4 146 495.

Outros builders de detergência incluem os zeólitos, como o material de troca de íons de alumino silicato descrito na patente US n° 4 405 483.

Outros builders preferidos são aqueles de fórmula geral R- CH(COOH)CH2(COOH), i.e., os derivados do ácido succínico, em que R é alquenila ou alquila C10-20, de preferência, C12-16, ou em que R pode ser substituído por substituintes hidroxila, sulfo, sulfóxi ou sulfona. Estes builders de succinato são utilizados, de preferência, em forma de seus sais solúveis em água. Exemplos específicos de builders de succinato incluem: succinato de laurila, succinato de miristila, succinato de palmitila, succinato de 2-dodecila, e similares.

4. Enzima proteolítica

As enzimas da invenção podem ser utilizadas nas composições detergentes em quantidades padrão bem conhecidas. As quantidades podem variar muito amplamente, p.ex., em torno de 0,0002-0,1, p.ex., em torno de 0,005-0,05, unidades Anson por grama da composição detergente. Expressa em unidades alternativas, a protease pode ser incluída na composição em quantidades da ordem de cerca de 0,1 a 100 GU/mg (p.ex., 1-50, especialmente 5-20 GU/mg) da formulação detergente, ou qualquer quantidade numa ampla faixa que gravita em torno de 0,01-4, p.ex., 0,1-0,4 KNPU por água de formulação detergente.

Pode ser adequado, por exemplo, utilizar-se enzimas presentes numa taxa de cerca de 0,25 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavagem, o que corresponde a uma atividade de enzima da ordem de 0,08 KNPU por litro. Formulações detergentes correspondentes podem conter as enzimas numa quantidade, por exemplo, na ordem de 0,1-0,4 KNPU/g. Expresso de forma diferente, as composições da presente invenção contêm de cerca de 0,01 % a cerca de 5 %, de preferência, de cerca de 0,1 % a cerca de 2 %, em peso das enzimas proteolíticas da invenção.

A enzima proteolítica descrita é incluída, de preferência, numa quantidade suficiente para proporcionar uma atividade de 0,05 a cerca de 1,0, mais preferivelmente de cerca de 0,1 a 0,75, sendo o mais preferível, de cerca de 0,125 a cerca de 0,5 mg de enzima ativa por grama da composição.

O componente enzima pode ser adicionado aos outros componentes em qualquer forma conveniente, como na forma de uma solução, calda, calda LDP, ou de cristais.

5. Sistema de estabilização da enzima

Os detergentes líquidos da presente invenção podem compreender um sistema de estabilização de enzima, que compreende íons de cálcio, ácido bórico, propileno glicol e/ou ácidos carboxílicos de cadeia curta.

O sistema de estabilização da enzima compreende de cerca de 0,5 % a cerca de 15 % em peso da composição.

A composição contém, de preferência, de cerca de 0,01 a cerca de 50, de preferência, de cerca de 0,1 a cerca de 30, mais preferivelmente, de cerca de 1 a 20 milimoles de íons de cálcio por litro. O nível do íon de cálcio deveria ser selecionado de tal forma que sempre haja um nível mínimo disponível para a enzima, depois de permitir a complexação com builders, etc. na composição. Qualquer sal de cálcio solúvel em água pode ser utilizado como a fonte de íon de cálcio, incluindo o cloreto de cálcio, formiato de cálcio, e acetato de cálcio. Uma pequena quantidade de íon de cálcio, de preferência, de cerca de 0,05 a cerca de 0,4 milimoles por litro, está freqüentemente presente na composição devido ao cálcio na calda da enzima e à água de formulação. Prefere-se de cerca de 0,03 % a cerca de 0,6 % de formiato de cálcio.

Um segundo estabilizador de enzima preferido é constituído de polióis que contêm apenas átomos de carbono, hidrogênio e oxigênio. Eles contêm, de preferência, de 2 a 6 átomos de carbono e de 2 a 6 grupos hidróxi. Exemplos incluem o propileno glicol (especialmente, 1,2-propanodiol), etileno glicol, glicerol, sorbitol, manitol, e glucose. O poliol representa geralmente de cerca de 0,5 % a 15 %, de preferência, de cerca de 15 % a cerca de 18 %, em peso da composição. De preferência, a proporção em pesos de poliol para qualquer ácido bórico adicionado é de, pelo menos, 1, mais preferivelmente, de pelo menos 1,3.

As composições também contêm, de preferência, os carboxilatos de cadeia curta e solúveis em água descritos na patente US n° 4 318 818. Os formiatos são preferidos porque podem ser utilizados em níveis de cerca de 0,05 % a cerca de 5 %, de preferência, de cerca de 0,2 % a cerca de 2 %, sendo o mais preferível, de cerca de 0,4 % a 1,5 %, em peso da composição. Prefere-se o formiato de sódio.

As composições aqui também contêm, opcionalmente, de cerca de 0,25 % a cerca de 5 %, sendo o mais preferível, de cerca de 0,5 % a cerca de 3 %, em peso de ácido bórico. O ácido bórico pode ser, embora preferivelmente não o deva, formado por um composto capaz de formar ácido bórico na composição. O ácido bórico é preferido, embora outros compostos, como o óxido bórico, borax e outros boratos de metal de álcali (p.ex., orto-, meta- e piroborato, e pentaborato de sódio) sejam adequados. [Ácidos bóricos substituídos (p.ex., ácido fenilborônico, ácido butano borônico, e ácido p- bromo fenilborônico) também podem ser utilizados em lugar do ácido bórico.

6. Agua

As composições líquidas da presente invenção podem ser líquidos aquosos ou líquidos não-aquosos. Quando são líquidos aquosos, elas contêm de cerca de 15 % a cerca de 60 %, de preferência, de cerca de 25 % a cerca de 45 %, em peso de água.

Outros componentes opcionais A. Co-tensoativos

Co-tensoativos opcionais para serem utilizados com os tensoativos não-iônicos referidos acima incluem as amidas de fórmula

<formula>formula see original document page 46</formula>

em que R1 é um radical alquila, hidroxialquila ou alquenila contendo de 8 a 20 átomos de carbono, e R e R são selecionados do grupo que consiste de hidrogênio, metila, etila, propila, isopropila, 2-hidroxietila, 2-hidroxipropila, 3-hidroxipropila, sendo que os referidos radicais contêm, adicionalmente, até 5 unidades de óxido de etileno, desde que pelo menos um dentre R2 e R3 contenha um grupo hidroxila.

As amidas preferidas são as amidas de alquilol de ácido graxo C8-20 em que cada grupo alquilol contém de 1 a 3 átomos de carbono, e pode conter, adicionalmente, até 2 unidades de óxido de etileno. São particularmente preferidas as amidas de dietanol e monoetanol de ácido graxo C12-16.

Caso utilizadas, as amidas estarão presentes, preferivelmente, a um tal nível que o tensoativo não-iônico etoxilado e o tensoativo de amida apresente uma proporção em pesos de 4:1 a 1:4, de preferência, de 3:1 a 1:3.

Co-tensoativos preferidos e opcionais, utilizados num nível de 0,15 % a 1 %, são constituídos dos tensoativos de amônio quaternário, amina e óxido de amina descritos na patente US n° 4 507 219.

Dentre os referidos acima, os sais de alquil trimetil amônio C10-14 são os preferidos, p.ex., o metilsulfato de decil trimetil amônio, cloreto de lauril trimetil amônio, brometo de miristil trimetil amônio, e cloreto de trimetil amônio de côco, e sulfato de metila. Prefere-se de 0,2 % a 0,8 % de cloreto de monoalquil trimetil amônio.

B. Builder de succinato de tartarato As composições aqui referidas contêm, de preferência, de 0 a cerca de 10 %, de preferência, de 0 a cerca de 6 %, em peso numa base de ácido, de um material builder de succinato de tartarato selecionado do grupo que consiste de:

i)

<formula>formula see original document page 47</formula>

em que X é um cátion formador de sal;

ii)

<formula>formula see original document page 47</formula>

em que χ é um cátion formador de sal; e

iii) suas misturas.

Os compostos de succinato de tartarato utilizados aqui são descritos na patente US n° 4 663 071.

C. Sistema de neutralização

As presentes composições também podem conter, opcionalmente, de cerca de O a cerca de 0,04 moles, de preferência, de cerca de 0,01 a 0,035 moles, mais preferivelmente, de cerca de 0,015 a cerca de 0,03 moles, por 100 gramas da composição de uma alcanolamina selecionada do grupo que consiste de monoetanolamina, dietanolamina, trietanolamina, e suas misturas. Prefere-se níveis baixos de alcanolaminas, particularmente a monoetanolamina, para realçar a estabilidade do produto, o desempenho da detergência. e o odor. No entanto, a quantidade de alcanolamina deveria ser minimizada visando-se a melhor compatibilidade com o alvejante de cloro.

Adicionalmente, as composições contêm íons de sódio e, de preferência, íons de potássio, a um nível suficiente para neutralizar os tipos aniônicos e proporcionar o desejado pH do produto.

D. Supressor de espumação

Outro componente opcional para uso nos detergentes líquidos aqui descritos é constituído de O a cerca de 1,5 %, de preferência, de cerca de 5 0,5 % a cerca de 1,0 %, em peso de um agente supressor de espumação à base de silicone. Os silicones são amplamente conhecidos e são ensinados como agentes controladores de espuma altamente efetivos. Por exemplo, a patente US n° 3 455 839 refere-se a composições e a processos para desespumar soluções aquosas através da incorporação, nessas soluções, de pequenas quantidades de fluídos de polidimetilsiloxano.

Silicones controladores de espuma que são úteis neste contexto, constituem-se de misturas de silicone e sílica silanada, como descritos, por exemplo, no pedido de patente alemã DOS 2 124 526.

Os desespumantes de silicone e os agentes controladores de espumação foram incorporados com sucesso em composições detergentes granuladas através de sua proteção em relação aos tensoativos detergentes, como na patente US n° 3 933 672, e na patente US n° 4 652 392.

Um supressor de espumação preferido à base de silicone para uso aqui consiste de uma quantidade supressora de espumação de um agente controlador de espumação que consiste essencialmente de:

(i) fluído de polidimetil siloxano possuindo uma viscosidade de cerca de 20 cs. a cerca de 1500 cs. a 25 °C;

(ii) de cerca de 5 a cerca de 50 partes por 100 partes em peso de (i) resina de siloxano composta unidades de (Cl SiO 1/2 e unidades de S1O2 numa proporção de unidades (CH^ SiO 1/2 e

unidades de S1O2 de cerca de 0,6:1 a cerca de 1,2:1; e

(iii) de cerca de 1 a cerca de 20 partes por 100 partes em peso de (i) de um gel de sílica sólido.

Por "quantidade supressora de espumação" compreende-se que o formulador da composição pode selecionar uma quantidade deste agente controlador de espumação que controlará a espumação até a extensão desejada. A quantidade de controlador de espumação variará com o tensoativo detergente selecionado. Por exemplo, com tensoativos de alta espumação, utiliza-se relativamente mais agente controlador de espumação para se atingir o desejado controle de espumação do que com tensoativos de baixa espumação.

E. Outras enzimas

As composições detergentes da invenção também podem conter outras enzimas.

Por exemplo, pode-se adicionar cuidadosamente lipase em forma de uma solução ou de uma calda de enzima lipofílica com material de suporte (p.ex., como na publicação de patente EP n° 258 068 (NOVO NORDISK A/S).

A quantidade adicionada de lipase pode ser escolhida dentro de limites amplos, por exemplo, 50 a 30.000 LU/g por grama do sistema de temperatura ambiente ou da composição detergente, p.ex., freqüentemente, pelo menos, 100 LU/g, sendo muito útil se for de pelo menos 500 LU/g, algumas vezes preferivelmente acima de 1000, acima de 2000 LU/g ou acima de 4000 LU/g ou mais, muito freqüentemente, dentro da faixa de 50-4000 LU/g, e possivelmente, na faixa de 200-1000 Ll/g. Neste pedido, as unidades de lipase são definidas como constam na publicação de patente EP n° 258 068.

A enzima lipolítica pode ser selecionada dentre uma ampla faixa de lipases. Em particular, as lipases descritas, por exemplo, nos seguintes relatórios descritivos das patentes: publicações de patentes EP nums. 214 761 (NOVO NORDISK A/S), 258 068, e, especialmente, as lipases que apresentam uma reatividade imunológica cruzada com anti- serinas desenvolvidos contra lipase a partir do Chromobacter viscosum var lipolvticum NRRL B-3673, ou contra lipase do Alealigenes PL-679, ATCC 31371 e FERM-P 3783, também as lipases descritas nos relatórios descritivos do WO 87/00859 (Gist-Brocades) e publicação de patente EP n° 204 284 (Sapporo Breweries). Considera-se particularmente adequadas, por exemplo, as seguintes preparações de lipase comercialmente obteníveis: Lipolase® Novo Nordisk A/S, lipases Amano CE, Ρ, B, AP, M-AP, AML, e CES, e lipases Meio MY-30, OF, e PL, também Esterase® MM (Novo Nordisk A/S), Lipozym, SP225, SP285, (todos Novo Nordisk A/S), lipase Saiken, lipase Enzeco, lipase Toyo Jozo e lipase Diosynth (marcas registradas), Lumafast® (Genencor Inc.). Lipomax® (Gist-Brocades N.V.), e lipases como as descritas no WO 94/03578 (Unilever).

A amilase, por exemplo, pode ser utilizada quando desejado, numa quantidade na faixa de cerca de 1 a cerca 100 MU (unidades de maltose) por grama de composição detergente (ou 0,014-1,4, p.ex., 0,07-0,7, KNU/g (unidades Novo)). Amilases adequadas são, por exemplo, Termamyl®, e BAN (Novo Nordisk A/S). A celulase pode ser usada, por exemplo, quando desejada, numa quantidade na faixa de cerca de 0,3 a cerca de 35 unidades CEVU por grama da composição detergente. São celulases adequadas, por exemplo, Celluzime®, e Carezyme® (Novo Nordisk A/S).

Outras enzimas que se considera utilizar na presente invenção são as oxidases e peroxidases.

F. Outros componentes opcionais

Outros componentes opcionais para uso em detergentes líquidos considerados por esta invenção incluem os agentes de remoção de sujeira, polímeros de liberação de sujeira, agentes anti-redeposição, como o etoxilato de tetraetileno pentamina (de cerca de 0,5 % a 3 %, de preferência, de cerca de 1 % a cerca de 3 %, em peso), reguladores de espumação, poli vinil pirrolidona, carbóxi metil celulose, argilas, e hidrótropos, como o cumeno sulfonato de sódio, opacificadores, antioxidantes, bactericidas, corantes, perfumes, e abrilhantadores conhecidos na arte. Esses componentes opcionais representam, geralmente, menos que cerca de 15%, de preferência, de cerca de 0,5% a 10%, mais preferivelmente de cerca de 1% a cerca de 10% em peso da composição.

As composições podem conter de 0% a cerca de 8%, de preferência, de 0% a cerca de 5%, em peso de um ácido alquenil succínico C12-14 ou um seu sal. Estes materiais têm a fórmula geral R- CH(COOX)CH2(COOX), em que R é um grupo alquenila C12-14 e cada X é H ou um cátion adequado, como o sódio, potássio, amônio ou alcanol amônio (p.ex., mono-, di-, ou tri-etanol amônio).

Exemplos específicos são o 2-dodecenil succinato (preferido) e o 2-tetradecenil succinato.

As composições aqui descritas contêm, opcionalmente, de cerca de 0,1% a cerca de 1%, de preferência, de cerca de 0,2% a cerca de 0,6%, em peso de sais solúveis em água do ácido etilenodiamino tetrametilenofosfônico, ácido dietilenotriamino pentametilenofosfônico, ácido etilenodiamino tetraacético (preferido), ou ácido dietilenotriamino pentaacético (o mais preferido) para realçar o desempenho de limpeza quando se submete tecidos a um pré-tratamento.

Além disso, as composições detergentes podem conter de 1-35% de um agente alvejante ou de um precursor de alvejamento ou um sistema que compreende um agente alvejante e/ou um precursor com ativador adequado.

Outros ingredientes opcionais são os intensificadores de espumação, agentes anti-corrosão, agentes de suspensão de sujeira, agentes seqüestrantes, agentes anti-redeposição de sujeira, e assim por diante.

As composições aqui descritas contêm, de preferência, até cerca de 10% de etanol.

G. Outras propriedades A presente composição apresenta, usualmente, um pH de cerca de 7,0 a 9,0, de preferência, de cerca de 8,0 a cerca de 8,5, numa solução a 10 % em água, a 20°C.

As presentes composições também podem apresentar uma Concentração Crítica de Micelas (CMC) menor que ou igual a 200 partes por milhão (ppm), e uma Tensão Interfacial ar/água acima do CMC menor ou igual a 32, de preferência, menor ou igual a cerca de 30, dynes por centímetro a 3 5 0C em água destilada. Estas medições são descritas em "Measurement of Interfacial Tension and Surface Tension - General Review for Practical Man", C. Weser, GIT Fachzeitschrift fuer das Laboratorium, 24 (1980) 642- 648 e 734-742, FIT Verlag Ernst Giebeler, Darmstadt, e "Interfacial Phenomena - Equilibrium and Dynamic Effects", C.A. Miller and P. Neogi, capítulo 1, pp. 29-36 (1985), Mareei Dekker, Inc. New York.

As composições da invenção podem ser utilizadas para a lavagem de materiais têxteis, especialmente, mas sem limitar-se aos citados: têxteis à base de algodão e poliéster e suas misturas. Por exemplo, processos de lavagem realizados a temperaturas de cerca de 60-65°C ou menores, p.ex., 30-35°C ou menores, são particularmente adequadas. Pode ser muito adequado utilizar as composições a uma taxa suficiente para proporcionar cerca de, p.ex., 0,4-0,8 g/l de tensoativo no licor de lavagem, embora seja possível, evidentemente, utilizar concentrações menores ou maiores, se desejado. Sem desejar limitar-nos, pode-se afirmar, por exemplo, que uma taxa de utilização de cerca de 1 a 10 g/l, p.ex., de cerca de 3-6 g/l, da formulação detergente é adequada para utilização no caso em que as formulações são substancialmente como nos exemplos.

Neste aspecto, a invenção refere-se especialmente a: a) Uma composição detergente formulada como um líquido detergente aquoso compreendendo tensoativo aniônico, tensoativo não-iônico, umectante, ácido orgânico, álcali cáustico, com um pH ajustado a um valor entre 9 e 10.

b) Uma composição detergente formulada como um líquido detergente aquoso compreendendo tensoativo não-iônico que consiste essencialmente de álcool primário linear alcoxilado, triacetina, trifosfato de sódio, álcali cáustico, precursor de alvejamento de monoidrato de perborato, e ativador de alvejamento de amina terciária, com um pH ajustado a um valor entre cerca de 9 e 10.

c) Composição detergente líquida enzimática formulada para dar um pH do licor de lavagem de 9 ou menos, quando utilizada a uma taxa que corresponde a 0,4-0,8 g/l de tensoativo.

d) Composição líquida detergente enzimática formulada para dar um pH do licor de lavagem de 8,5 ou mais, quando utilizada a uma taxa que corresponde a 0,4-0,8 g/l de tensoativo.

e) Composição líquida detergente enzimática formulada para dar uma concentração iônica do licor de lavagem de 0,03 ou menos, p.ex., 0,02 ou menos, quando utilizada a uma taxa que corresponde a 0,4-0,8 g/l de tensoativo.

f) Composição líquida detergente enzimática formulada para dar uma concentração iônica do licor de lavagem de 0,01 ou mais, p.ex., 0,02 ou mais, quando utilizada a uma taxa que corresponde a 0,4-0,8 g/l de tensoativo.

Verificou-se que as variantes de subtilase da presente invenção também podem ser incorporadas de forma útil numa composição detergente em forma de barras, tabletes, bastões, e análogos para a aplicação direta sobre os tecidos, superfícies duras ou qualquer outra superfície. Em particular, elas podem ser incorporadas em composições de sabão ou composições sabão/sintético em forma de barras, nas quais elas apresentam uma estabilidade notável da enzima. Uma composição detergente em forma de barras, tabletes, bastões e análogos para aplicação direta, é descrita, por exemplo, na patente sul-africana 93/7274, incorporada aqui por referência. De forma correspondente, as barras preferidas de acordo com esta invenção compreendem, adicionalmente à variante de subtilase:

i) 25 a 80 %, sendo o mais preferível de 25 a 70 %, em peso de um ativo de detergente que é um sabão ou uma mistura de sabão e

5 ativos de detergente sintético, reconhecido como anidro;

ii) 0 a 50 % e, sendo o mais preferível, de 10 a 30 % em peso de água;

iii) 0 a 35 % e, sendo o mais preferível, de 0,1 a 30 % em peso de carga.

Em geral, a quantidade da variante de subtilase a ser incluída nessas composições da invenção é tal que corresponde com uma atividade proteolítica de 0,1 a 100 GU/mg baseado na composição, de preferência, de 0,5 a 20 GU/mg, sendo o mais preferível, de 1,0 a 10 GU/mg, onde GU/mg é unidade de glicina por miligrama.

PROCESSO PARA PRODUZIR MUTAÇÕES EM GENES DE SUBTILASE

Conhece-se muitos processos na arte para a introdução de mutações em genes. Após uma breve discussão sobre a clonagem de genes de subtilase, se discutirão processos para gerar mutações tanto em sítios randômicos, como em sítios específicos, dentro do gene de subtilase.

CLONAGEM DE UM GENE DE SUBTILASE

O gene que codifica uma subtilase pode ser clonado de qualquer um dos organismos indicados na tabela I, especialmente fungos ou bactérias gram-positivos, segundo diversos processos, bem conhecidos na arte. Primeiramente, precisa-se construir uma biblioteca de DNA genômica, e/ou de cDNA, utilizando-se DNA cromossômico ou RNA mensageiro do organismo que produz a subtilase a ser estudada. Em seguida, caso a seqüência de aminoácido da subtilase seja conhecida, pode-se sintetizar amostras conhecidas, homólogas, marcadas de oligonucleotídeos, as quais podem ser utilizadas para identificar clones que codificam a subtilisina de uma biblioteca genômica de DNA bacteriano, ou de uma biblioteca de cDNA. Alternativamente, poderia utilizar-se uma amostra marcada de oligonucleotídeo contendo seqüências homólogas com a subtilase a partir de uma cepa de bactérias ou outro organismo, de modo a se identificar os clones que codificam a subtilase, empregando-se condições de lavagem e hibridização de menor rigor.

Ainda outro processo para se identificar clones produtores de subtilase envolve insertar-se fragmentos de DNA genômico num vetor de expressão, como um plasmídeo, transformando bactérias negativas a protease com a biblioteca de DNA genômico resultante, e, depois, acamando-se em discos as bactérias transformadas sobre agar contendo um substrato de subtilase, tal como leite desnatado. Aquelas bactérias contendo plasmídeo portando subtilase produzirão colônias envolvidas por um halo de agar claro, devido à digestão do leite desnatado pela subtilase excretada.

GERAÇÃO DE MUTAÇÕES RANDÔMICAS NO GENE DE SUBTILASE

Uma vez que o gene da subtilase foi clonado em um vetor adequado, como um plasmídeo, pode-se utilizar diversos processos para introduzir mutações randômicas no gene.

Um processo seria o de incorporar o gene de subtilase clonado, como parte de um vetor recuperável, numa cepa geradora de mutação do Escherichia coli.

Outro processo consistiria em gerar um forma de filamento único do gene de subtilase, e, depois, combinar-se o fragmento de DNA contendo o gene de subtilase com outro fragmento de DNA de tal forma que uma porção do gene de subtilase permaneça como filamento único. Este região distinta de filamento único seria, então, exposta a qualquer um dentre uma quantidade de agentes mutagenizadores, incluindo, mas sem limitar-se a estes, o bissulfito de sódio, hidroxilamina, ácido nitroso, ácido fórmico, ou hidralazina. Um exemplo específico deste processo de se gerar mutações randômicas é descrito por Shortle e Nathans (1978, "Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.Α." 75 2170-2174). De acordo com o processo de Shortle e Nathans, o plasmídeo que porta o gene de subtilase seria cortada por uma enzima de restrição que cliva dentro do gene. Este corte seria alargado a uma fenda utilizando a ação da exonuclease da polimerase I do DNA. A fenda de filamento único resultante seria, então, mutagenizada utilizando-se um dos agentes mutagenizadores referidos acima.

Alternativamente, o gene de subtilisina da espécie Bacillus que inclui um promotor natural e outras seqüências de controle poderia ser clonado num vetor de plasmídeo contendo replicados para E. coli e B. subtilis, um marcador fenotípico selecionável e a origem Ml3 da replicação para a produção de DNA de plasmídeo de filamento único quando da superinfecçâo com fago auxiliar IR1. O DNA de plasmídeo de filamento único contendo o gene de subtilisina clonado é isolado e combinado com um fragmento de DNA contendo seqüências de vetor mas não a região de codificação da subtilisina, resultando numa molécula duplex fendida. As mutações são introduzidas no gene de subtilisina com bissulfito de sódio, ácido nitroso, ou ácido fórmico ou por meio de replicação numa cepa geradora de mutações de E. coli, como descrito acima. Como o bissulfito de sódio reage exclusivamente com a citosina em DNA de filamento único, as mutações criadas com este mutágeno restringem-se apenas às regiões de codificação. O tempo de reação e a concentração de bissulfito variam nos diferentes ensaios, de tal forma que são criadas, em média de uma a cinco mutações por gene de subtilisina. A incubação de 10 mg de DNA duplex fendida em bissulfito de sódio 4M, pH 6,0, durante 9 minutos a 37°C, em um volume de reação de 400 ml, desamina cerca de 1 % das citosinas na região de filamento único. A região de codificação da subtilisina madura contém cerca de 200 citosinas, dependendo da cepa de DNA. Vantajosamente, o tempo de reação variará de cerca de 4 minutos (para produzir uma freqüência de cerca uma em 200) a cerca de 20 minutos (cerca de 5 em 200). Após a mutagênese, as moléculas fendidas são tratadas in vitro com polimerase I de DNA (fragmento Klenow) para criar moléculas totalmente de filamento duplo e fixar as mutações. As E1 coli competentes são, então, transformadas com o DNA mutagenizado para produzir uma biblioteca amplificada de subtilisinas mutantes. As bibliotecas mutantes ampliadas também podem ser preparadas desenvolvendo-se DNA de plasmídeo em uma cepa Nut D do E. coli que aumenta a faixa de mutações devido a sua polimerase de DNA propensa a erro.

Os mutagens ácido nítrico e ácido fórmico também podem ser utilizados para produzir bibliotecas mutantes. Devido ao fato de estes produtos químicos não serem tão específicos para o DNA de um só filamento como o bissulfito de sódio, as reações de mutagênese são realizadas de acordo com o procedimento descrito a seguir. A porção codificadora do gene de subtilisina é clonado em fago Ml3 segundo processos convencionais e prepara-se o DNA de fago de um só filamento. O DNA de um só filamento é então reagido com ácido nitroso 1M, pH 4,3 durante 15-60 minutos a 23°C ou ácido fórmico 2,4M durante 1-5 minutos a 23°C. Estas faixas de tempos de reação produzem uma freqüência de mutação de 1 em 1000 até 5 em 1000. Após a mutagênese, combina-se um prímer universal ao DNA Ml3 e sintetiza-se DNA duplex utilizando-se DNA de um só filamento mutagenizado como um padrão, de tal modo que a porção codificadora do gene de subtilisina torna-se totalmente de filamento duplo. Neste ponto, a região codificadora pode ser recortada do vetor Ml3 com enzimas de restrição e ligada em um vetor de expressão nao-mutagenizado de modo que as mutações ocorram apenas no fragmento de restrição. (Myers et al., "Science" 229 242-257 (1985)).

GERAÇÃO DE MUTAÇÕES DIRECIONADAS PARA SÍTIO NO GENE DE SUBTILASE

Uma vez que o gene de subtilase foi clonado, e os sítios desejáveis para mutação identificados, e o resíduo para substituir pelos originais foi decidido, estas mutações podem ser introduzidas empregando-se oligonucleotídeos sintéticos. Estes oligonucleotídeos contêm seqüências que flanqueam os desejados sítios de mutação; os nucleotídeos mutantes são inseridos durante a síntese do oligonucleotídeo. Em um processo preferido, cria-se uma fenda de um só filamento, ligando em ponte o gene de subtilase, em um vetor que porta o gene de subtilase. Em seguida, o nucleotídeo sintético que porta a mutação desejada, é combinado com uma porção homóloga do DNA de um só filamento. A fenda remanescente é, então, preenchido com polimerase I de DNA (fragmento de Klenow) e a construção é ligada usando-se ligase T4. Um exemplo específico deste processo é descrito por Morinaga et al., (1984, "Biotechnology" 2 646-639). De acordo com Morinaga et al., remove-se um fragmento dentro de um gene utilizando- se endonuclease de restrição. O vetor/gene, agora contendo um GAP, é então desnaturado e hibridizado a um vetor/gene que, em lugar de conter uma fenda foi clivado com outra endonuclease de restrição em um sítio fora da área envolvida na fenda. Uma região de um só filamento do gene torna-se então disponível para hibridização com oligonucleotídeos mutantes, sendo que a fenda remanscente é preenchida com o fragmento de Klenow de polimerase I de DNA, sendo que as inserções são ligadas com ligase de DNA T4 e, após um ciclo de replicação, produz-se um plasmídeo de dois filamentos portando a mutação desejada. O processo de Morinaga elimina a manipulação adicional de se construir novos sítios de restrição, facilitando, portanto, a geração de mutações em múltiplos sítios. A patente reexpedida US n° 34 606, para Estell et al., expedida em 10 de maio de 1994, é capaz de introduzir oligonucleotídeos portadores de mutações múltiplas através da realização de pequenas alterações do cassette, contudo, uma variedade ainda maior de mutações pode ser introduzida a qualquer momento pelo processo de Morinaga, porque pode ser introduzida uma grande quantidade de oligonucleotídeos de diversos tamanhos.

EXPRESSÃO DOS MUTANTES DE SUBTILASE

De acordo com a invenção, pode-se expressar um gene de subtilase mutante, produzido pelos processos descritos acima, ou por quaisquer processos alternativos conhecidos na arte, em forma de enzima, utilizando um vetor de expressão. Um vetor de expressão geralmente enquadra-se na definição de um vetor de clonagem, já que um vetor de expressão usualmente inclui os componentes de um típico vetor de clonagem, nominalmente, um elemento que permite a replicação autônoma do vetor em um microorganismo independente do genoma do microorganismo, e um ou mais marcadores fenotípicos para fins de seleção. Um vetor de expressão inclui seqüências de controle que codificam um promotor, operador, sítio ligador de ribossoma, sinal de iniciação de translação, e, opcionalmente, um gene repressor ou diversos genes ativadores. Para permitir a secreção da proteína expressa, os nucleotídeos que codificam a "seqüência de sinal" podem ser inseridos antes na seqüência de codificação do gene. Para expressão sob a direção de seqüências de controle, um gene-alvo a ser tratado de acordo com a invenção é ligado operativamente às seqüências de controle no quadro de leitura apropriado. As seqüências promotoras que podem ser incorporadas nos vetores plasmídeos, e que podem suportar a transcrição do gene de subtilase mutante, incluem, porém sem limitar-se a estes, o promotor procariótico de β-lactamase (Villa-Kamaroff, et al. (1978) "Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A." 75 3727-3731) e o promotor tac (DeBoer, et al., (1983) "Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A." 80 21-25). Também se pode encontrar outras referências em "Useful proteins from recombinant bactéria" e, "Scientific American" (1980) 242 74-94.

De acordo com uma concretização, o B. subtilis é transformado por um vetor de expressão que porta o DNA mutante. Se a expressão deve ocorrer num microorganismo segretador, como o B. subtilis, uma seqüência de sinal pode seguir-se ao sinal de iniciação de translação e precede a seqüência de DNA de interesse. A seqüência de sinal atua transportando o produto de expressão para a parede da célula onde é clivado do produto quando da secreção. O termo "seqüências de controle", como definido acima, abrange uma seqüência de sinal, quando presente.

Outros sistemas hospedeiros conhecidos pela pessoa versada na arte também são considerados para expressão e produção das variantes de protease da invenção. Esses sistemas hospedeiros compreendem fungos, incluindo fungos filamentosos, células de plantas, aves e mamíferos, como outras também.

MATERIAIS E PROCESSOS

Cepas:

B. subtilis 309 e 147 são variantes do Bacillus lentus, depositadas com o NCIB e que receberam os números NCIB 10309 e 10147, e descritas na patente US n° 3 723 250, incorporada aqui por referência.

E. coli MC 1000 (MJ. Casadaban e S.N. Cohen (1980); "J. Mol. Biol." 138 179-207), foi preparado segundo processos convencionais e também é descrito no pedido de patente com n° de série 039 298.

Atividade proteolítica

No contexto desta invenção, a atividade proteolítica é expressa em quilo unidades NOVO de protease (KNPU). A atividade é determinada relativamente a um padrão de enzima (SAVINASEO), e a determinação baseia-se na digestão de uma solução de dimetil caseína (DMC) pela enzima proteolítica em condições padrão, i.e., 50°C, pH 8,3, 9 min de tempo de reação, 3 min de tempo de medição. Uma pasta ou prospecto AF 220/1 é obtenível da Novo Nordisk A/S, Dinamarca, mediante solicitação, pasta esta que é incluída aqui por referência.

GU é uma unidade de glicina, definida como a atividade da enzima proteolítica que, em condições padrão, e durante uma incubação de 15 minutos a 40°C, com N-acetil caseina como substrato, produz uma quantidade de grupos NH2 equivalente a 1 mmol de glicina.

A atividade da enzima também pode ser medida utilizando-se a análise PNA, de acordo com a reação com o substrato solúvel succinil- alanina-alanina-prolina-fenil-alanina-para-nitrofenol, que é descrito no : Journal of American Oil Chemists Society", Rothgeb, T.M., Goodlander, B.D., Garrison, P.H., e Smith, L.A. (1988).

Exemplos

Para a geração de variantes de enzima de acordo com a invenção, emprega-se os mesmo materiais e processos como descritos, entre outros, no WO 89/06279 (Novo Nordisk A/S), EP 130 756 (Genentech), EP 479 870 (Novo Nordisk A/S), EP 214 435 (Henkel, WO 87/04461 (Amgen), WO 87/05050 (Genex), pedido EP n° 87303761 (Genentech), EP 260 105 (Genencor), WO 88/06624 (Gist-Brocades NV). WO 88/07578 (Genentech), WO 88/08028 (Genex), WO 88/08033 (Amgen), WO 88/08164 (Genex), Thomas et al., (1985) "Nature", 318 375-376; Thomas et al., (1987), "J. Mol. Biol.", 193, 803-813; Russel and Fersht (1987) "Nature" 328 496-500. Também se pode utilizar outros processos estabelecidos na arte.

Exemplo I

Construção e expressão de variantes de enzima:

Construiu-se um vetor adequado para a codificação sintética de genes para a subtilase 309 e seus mutantes. Trata-se essencialmente de um plasmídeo pUC19 (Yanish-Perron e Messing (1985) "Gene"; 33 103-119), em que o sítio múltiplo de clonagem foi substituído por um ligante que contém os sítios de restrição usados para separar cinco sub-fragmentos que constituem o gene. O novo ligante foi inserido em EcoRI - HindIII corte pUC19 destruindo, com isso, estes sítios. Os detalhes desta construção são descritos no WO 92/19729 nas páginas 25-26 e em sua figura 1 (folhas 1/7- 7/7), cujo conteúdo é incluído aqui por referência. Cada subfragmento foi preparado a partir de 6 a 12 oligonucleotídeos. Os oligonucleotídeos foram sintetizados em um sintetizador automático de DNA utilizando química de fosforamidita sobre um suporte de vidro controlado (Beaucage and Carruthers (1991); "Tetrahedron Letters" 22 1859-1869).

Os cinco subfragmentos foram isolados num gel de agarose e insertados em pSX191. A seqüência foi verificada por meio de seqüenciamento de nucleotídeo. Os fragmentos A-E foram isolados e ligados juntamente com KpnI-BamHI corte pSX191. As mistura de ligação foram utilizadas para transformar E. coli competente MClOOO r", m" selecionando-se quanto à resistência à ampicilina. O fragmento 850 bp KpnI-BamHI que constitui a parte do gene de subtilisina 309 que codifica a parte madura da enzima foi usado, então, para substituir o gene de tipo selvagem no pSX212 dando origem a pSX222, que foi então transformado na cepa de B1 subtilis competente. Após a fermentação da cepa transformada e purificação da enzima, demonstrou-se que o produto era indistingüível do produto do tipo selvagem.

As variantes de protease derivadas do gene sintético são preparadas utilizando-se oligonucleotídeos com uma seqüência alterada no lugar ou nos lugares em que a mutação é desejada (por exemplo, com seqüências como as apresentadas abaixo) e misturando-as com o restante dos oligonucleotídeos apropriados para o gene sintético. A montagem do gene variante é realizada com os materiais variantes de uma maneira que é, de outra forma, análoga com aquela descrita acima. Mais informações acerca de genes sintéticos são geralmente obteníveis em Agarval et al. (1970); "Nature"; 227 27-34.

Introduziu-se um sítio KpnI no começo do gene sintético de subtilase 309 que codifica a parte madura da enzima. O processo utilizado é denominado de mutagênese de reparo de quebra de filamento duplo direcionada para oligonucleotídeo e é descrito por Mandecki (1986) "Proc. Nat. Acad. Sei. USA" 83 7177-7181. O pSX172 é aberto com NcoI no começo da parte madura do gene de subtilase 309 e é misturado com o oligonucleotídeo NOR 789 (ver WO 92/19729), aquecido a 100°C, resfriado a 0°C, e transformado em E. coli. Após a retransformação, os recombinantes podem ser analisados por meio de hibridização de colônia usando NOR 789 rotulado 32-P. Os recombinantes que mostraram ser positivos durante a análise tinham um sítio KpnI introduzido exatamente na frente de NcoI alterando-se as bases sem modificar a seqüência de amino ácido. pSX172 é descrito no pedido de patente EP n° 405 901. O sítio KpnI criado desta maneira é inserido em psX120 sobre um fragmento de 400-bp de PvuI-NheI, dando origem a pSX212. o pSX120 também é descrito na publicação de patente EPn0 405 901.

O gene sintético é inserido entre KpnI e BamHI sobre pSX212, dando origem a pSX222.

A seguir, apresentamos exemplos de mutações e seqüências correspondentes de oligonucleotídeos:

R170L (fragmento Dl)

5'-AATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCGCTCTAT-3'

IlllllilllllMllllllllllllllIhIIII

5'- GTCCACGTCCGAGTTAGTCGATAGGCCGCGAGATACGC-

TTG-3'

Rl701 (fragmento Dl)

5'-AATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCGATCTAT-3'

IllMlllllilllllllllilllillII^IIII

5' - GTCCACGTCCGAGTTAGTCGATAGGCCGCTAGATACGC-

TTG-3'

S57P (fragmento BI)

5 ' -AGC TT T G TACC AGG GGAAC C GC CGACT CAAGAT GG G— 3 '

IlllMllllllllllhlllllllIIIIIiI

3'- AACATGGTCCCCTTGGCOGCTGAGTTCTACCCTTACCC-5' Estes oligonucleotídeos foram combinados com o restante dos oligonucleotídeos do gene sintético que não foi modificado.

Exemplo 2

Purificação das variantes de enzima:

Este procedimento refere-se à purificação de uma fermentação em escala de 10 litros da enzima subtilisina 147, da enzima de subtilisina 309 ou seus mutantes.

Aproximadamente 8 litros do brodo de fermentação foram centrifugados a 5000 rpm durante 35 minutos em béqueres de um litro. Os sobrenadantes foram ajustados a pH 6,5 usando-se ácido acético a 10 %, e foram filtrados sobre placas filtrantes Seitz Supra S100.

Os filtrados foram concentrados a aproximadamente 400 ml usando-se uma unidade Amicon CH2A UF equipado com um cartucho Amicon SlYlO UF. O concentrado UF foi centrifugado e filtrado antes da absorção à temperatura ambiente sobre uma coluna de afinidade de Bacitracina a pH 7. A protease foi eluída desde a coluna de Bacitracina à temperatura ambiente utilizando-se 2-propanol a 25 % e cloreto de sódio IM numa solução tampão com ácido dimetilglutárico 0,01, ácido bórico 0,1 M e cloreto de cálcio 0,002M ajustado a pH 7.

As frações com atividade de protease provenientes da etapa de purificação de Bacitracina foram combinadas e aplicadas numa coluna de Sephadex G25 de 750 ml (5 cm de diâmetro) equilibrada com um tamponador contendo ácido dimetilglutárico 0,01, ácido bórico 0,2M e cloreto de cálcio 0,002M ajustado a pH 6,5.

As frações com atividade proteolítica provenientes da coluna de Sephadex G25 foram combinadas e aplicadas a uma coluna de troca de cátions CM Sepharose CL 6B de 150 ml (5 cm de diâmetro) equilibrada com um tamponador contendo ácido dimetilglutárico 0,01M, ácido bórico 0,2M e cloreto de cálcio 0,002M ajustado a pH 6,5. A protease foi eluída utilizando-se um gradiente linear de cloreto de sódio 0-0,1 M em 2 litros do mesmo tamponador (cloreto de sódio 0-0,2 M, no caso da subtilisina 147).

Numa etapa final de purificação, a protease contendo frações da coluna de Sepharose CM foi combinada e concentrada numa célula de ultrafiltração Amicon equipada com uma membrana GR81PP (da firma Danish Sugar Factories, Inc.).

Utilizando-se as técnicas do exemplo 1 para a construção e o procedimento de isolamento referido acima, foram produzidas e isoladas as seguintes variantes de subtilisina 309:

A: Gl 591 B: S1641 C: Y1671 D: Rl 701 E: R170L F: R170M G: R170F H: G195F I: S57P+R170L J: R170L+N218S K: S57P+R170L+N218S L: Rl 70L+N218S+M222A M: S57P+R170L+S188P+A194P N: Y167I+R170L O: S 5 7P+R170L+Q206E P: R170L+Q206E Q: Y1671+R170L+Q206E R: Y16 7I+R170L+A194P S: Yl 67I+R170L+N218S T: Yl 67I+R170L+A194P+N218S

U: Y167I+Y171I

V: R170G

W: R170C

X: Y171I

Y: Y167I+R170L+N218S

Exemplo 3

Estabilidade em composições detergentes que compreendem variantes de enzima

Exemplo D1:

Um líquido detergente aquoso (isotrópico) de acordo com uma concretização da invenção é formulado de tal modo a conter:

<table>table see original document page 66</column></row><table> O pH é ajustado em 7,1.

Tabela III

A atividade residual da enzima (em um percentual da atividade original) após armazenamento a 37°C, para o exemplo Dl, compreendendo a variante BLS309 S57P+R170L+N218S.

Tempo de armazenagem(em dias) TipoSelvagem S57P+R170L+N218S

<table>table see original document page 67</column></row><table>

Na tabela III é evidente que a variante S57P+R170L+N218S apresenta uma estabilidade notavelmente aperfeiçoada neste tipo de detergente. Além disso, a variante S57P+R170L+N218S apresenta uma excelente compatibilidade em relação à lipase. Tabela IV

A atividade residual da lipase (em um percentual da atividade original) após armazenamento a 37°C, para o exemplo Dl, compreendendo a variante BLS309 S57P+R170L+N218S e LIPOLASE®.

Tempo de armazenagem (dias)

Lipolase plus Tipo Selvagem S57P+R170L+N218S

<table>table see original document page 67</column></row><table>

Na tabela IV, acima, percebe-se que, adicionalmente à estabilidade da protease, a compatibilidade da protease também é aperfeiçoada. Exemplo D2:

Um líquido detergente não-aquoso de acordo com uma concretização da invenção é formulado utilizando-se 38,5 % de álcool primário linear com C13.15 alcoxilado com 4,9 mol/mol de oxido de etileno e 2,7 mol/mol de óxido de propileno, 5 de triacetina, 30 % de trifosfato de sódio, 4 % de cinza de soda, 15,5 % de monoidrato de perborato de sódio contendo uma proporção menor de oxoborato, 4 % de TAED, 0,25 % de EDTA, dos qual 0,1 % como ácido fosfônico, Aerosil 0,6 %, SCMC 1 %, e 0,6 % de protease. O pH é ajustado a um valor entre 9 e 10, por exemplo, em torno de 9,8.

Exemplo D3:

Os detergentes líquidos estruturados podem conter, por exemplo, adicionalmente a uma protease como descrita aqui, 2-15 % de tensoativo não-iônico, 5-40 % de tensoativo total, compreendendo tensoativo não-iônico e, opcionalmente, aniônico, 5-35 % de builder contendo fosfato ou contendo não-fosfato, 0,2-0,8 % de espessante polimérico, por exemplo, um polímero acrílico reticulado com peso molecular acima de IO6, pelo menos 10 % de silicato de sódio, por exemplo, como silicato de sódio neutro, álcali (por exemplo, álcali contendo potássio) para ajustar o pH desejado, de preferência, na faixa de 9-10 ou maior, por exemplo, acima de pH 11, com uma proporção de cátion de sódio para ânion de silicato (como silica livre) (em peso) menor que 0,7:1, e uma viscosidade de 0,3-30 Pas (a 20°C e 205"1).

Exemplos adequados contêm cerca de 5 % de tensoativo não- iônico álcool alcoxilado C13.15 com aproximadamente 5 grupos de EO (óxido de etileno) por mol e com cerca de 2,7 grupos de PO por mol, 15-23 % de silicato de sódio neutro com uma proporção em pesos de 3,5 entre a sílica e o óxido de sódio, 13-19 % de KOH, 8-23 % STPP, 0-11 % de carbonato de sódio, 0,5 % de Carbopol 941 (TM).

A protease pode ser incorporada a, por exemplo, 0,5 %. Exemplo D4:

<table>table see original document page 69</column></row><table>

A atividade residual da enzima (em um percentual da atividade original) após armazenamento a 37°C, para o exemplo D4, compreendendo a variante R170L do BLS309.

<table>table see original document page 69</column></row><table>

Na tabela V percebe-se que a variante R170L apresenta uma estabilidade notavelmente aperfeiçoada neste tipo de detergente. <table>table see original document page 70</column></row><table>

Na tabela VI percebe-se que as variantes testadas apresentam uma estabilidade aperfeiçoada em comparação com a enzima do tipo selvagem neste tipo de detergente.

Exemplo D5:

<table>table see original document page 70</column></row><table>

Tabela VII

Atividade da enzima residual (em um percentual da atividade original) após armazenamento a 37°C para o exemplo D5 compreendendo a variante BLS309 S57P+R170L+N218S.

<table>table see original document page 71</column></row><table>

Na tabela VII observa-se que a variante S57P+R170L+N218S apresenta uma estabilidade notavelmente aperfeiçoada neste tipo de detergente. Além disso, a variante S57P+R170L+N218S possui uma excelente compatibilidade em relação à lipase.

Exemplo D6:

Produziu-se barras de sabão contendo 49,7 % em peso de sabão de sebo/coco a 80/20, 49,0 % de água, 20 % de citrato de sódio, 1,0 % de ácido cítrico e 0,031 % de protease. Após a preparação das barras de sabão estas foram armazenadas à temperatura ambiente e, em intervalos de tempo específicos, coletou-se amostras que foram medidas no que se refere a sua atividade de protease. Os dados de estabilidade são apresentados abaixo:

Tabela VIII

<table>table see original document page 71</column></row><table> <table>table see original document page 72</column></row><table>

Na tabela acima observa-se que a variante de subtilase R170L+N218S+S57P apresenta uma estabilidade notavelmente aperfeiçoada neste tipo de detergente.

Na tabela acima observa-se que as variantes de subtilase R170L, R170L+N218S+S57P e R170L+Y167I apresentam uma estabilidade notavelmente aperfeiçoada neste tipo de detergente. Exemplo D7:

Produziu-se barras de sabão contendo 63,88 % em peso de sabão de sebo/coco a 80/20, 1 % de ácido graxo de coco, 25,1 % de água, 10 % de citrato de sódio, e 0,021 % de protease.

As barras de sabão para lavanderia foram armazenadas a 37°C e, em intervalos de tempo específicos, coletou-se amostras que foram medidas no que se refere a sua atividade de protease. Tabela IX. Dados de estabilidade: Exemplo 4

Desempenho de lavagem de composições detergentes que compreendem variantes de enzima

Os exemplos a seguir proporcionam resultados a partir de uma quantidade de ensaios de lavagem que foram realizados sob as condições indicadas.

Condições experimentais

Tabela X: Condições experimentais para a avaliação das variantes de subtilisina 309

<table>table see original document page 73</column></row><table>

Subseqüentemente à lavagem dos tecidos, estes foram enxaguados com água potável e secados ao ar.

O detergente do modelo referido acima é uma formulação de detergente simples. As características mais notáveis são que o STP é utilizado como builder e que o teor de tensoativo aniônico (LAS) é bastante elevado.

Além disso, o pH é ajustado em 9,5, o que é baixo para um detergente em pó.

Tabela XI

<table>table see original document page 73</column></row><table> 10% Na2CO3

20 % LAS (Nansa 80S)

5 % NI (Dobanol 25-7)

5 % Na2Si2O3

0,5 % carboximetilcelulose (CMC)

9,5 % água

dose: 3 g/l

o pH é ajustado em 9,5

A medição da remissão (R) no material de ensaio foi realizada a 460 nm utilizando-se um fotômetro Elrepho 2000 (sem UV). Os valores medidos foram adaptados à expressão:

<formula>formula see original document page 74</formula>

O fator de aperfeiçoamento é calculado por meio da utilização da inclinacao inicial da curva:

<formula>formula see original document page 74</formula>

DR é o efeito de lavagem da enzima em unidades de remissão.

A é a inclinação inicial da curva adaptada (c®0).

aref. é a inclinação inicial para a enzima de referência.

C é a concentração de enzima em mg/l

DRmax é o efeito de lavagem máximo teórico da enzima em unidades de remissão (c®Y). Tabela XII: Variantes e fatores de aperfeiçoamento para a subtilisina 309.

<table>table see original document page 75</column></row><table>

*Descrito no WO 91/00345

Como se pode observar na tabela XII, todas as variantes de subtilisina 309 da invenção apresentam um aperfeiçoamento no desempenho de lavagem.

Tabela XIII: Variantes e fatores de aperfeiçoamento para a subtilisina 309 em um detergente como descrito no exemplo D4

<table>table see original document page 75</column></row><table> <table>table see original document page 76</column></row><table>

* Descrito no WO 91/00345

Como se pode observar na tabela XIII, todas as variantes de subtilisina 309 da invenção apresentam um aperfeiçoamento no desempenho de lavagem.

Claims (2)

1. Processo para efetuar mutação no DNA que codifica uma enzima de subtilase ou sua pré- ou pré-pró-enzima, em uma ou mais posições correspondentes a resíduos de aminoácido em, ou nas imediações de, um domínio hidrofóbico da subtilase-mãe, sendo substituídos por um resíduo de aminoácido mais hidrofóbico do que o resíduo original, caracterizado pelo fato de o que o referido domínio hidrofóbico compreende os resíduos P129, P131,1165, Y167, Y171 de BLS309, e os resíduos nas suas imediações, para BLS309 são E136, G159, S164, Rl70, Al94, e G195, com a exceção das variantes R170M, Rl 701, e R170V de BABP92, testando-se quanto à estabilidade aperfeiçoada ao armazenamento e/ou ao desempenho de lavagem aperfeiçoado em detergentes.

2. Processo para a manufatura de uma enzima de subtilase mutante possuindo uma estabilidade aperfeiçoada ao armazenamento ou um desempenho de lavagem aperfeiçoado, caracterizado pelo fato de que ser segundo o procedimento definido na reivindicação 1.