CN1183800A - 蛋白酶变体和组合物 - Google Patents

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Abstract

一种在洗涤剂中具有改善的贮存稳定性和改善的性能的枯草杆菌蛋白酶,其中位于亲本枯草酶疏水区中或者其邻近区中的一个或多个氨基酸残基已由一种比原来的残基更为疏水的氨基酸所取代,所说疏水区包括相应于BLS309(按BASBPN编号)的残基P129、P131、I165、Y167、Y171的残基,所说的疏水区邻近区中的残基包括相应于BLS309(按BASBPN编号)的残基E136、G159、S164、R170、A194和G195的残基(BLS309的R170M、R170I和R170Y变体除外)。

Description

蛋白酶变体和组合物
技术领域
本发明涉及在配制洗涤剂组合物中有用的新的突变酶或酶变体，它们在保持或提高其洗涤性能的同时表现出改善的贮存稳定性；本发明也涉及含有所说的酶的清洗或洗涤剂组合物，本发明也涉及在插入到合适的宿主细胞或者微生物中时使得所说的酶表达的突变基因；本发明还涉及用该基因转化的并且能够表达所说的酶变体的宿主细胞。发明背景
在洗涤剂工业中，酶用于洗涤剂制剂中已经有30多年了，应用于这种制剂中的酶包括蛋白酶、脂酶、淀粉酶、纤维素酶和其它的酶或这些酶的混合物。在商业上最重要的是蛋白酶。
尽管蛋白酶已经用于洗涤剂工业30多年了，这些酶是如何与底物和其它存在于如洗涤剂组合物中的物质相互作用的细节仍然不太了解。已经阐明了有关特异性残基的一些因素和影响某些性质的因素(如一般意义上的氧化稳定性和热稳定性)，但是仍然有许多还没有研究出来。而且也不确切知道哪一个物理和化学性质影响好的洗涤性能或者特异性洗涤剂组合物中的蛋白酶稳定性。
发现目前应用的蛋白酶大部分选自从天然蛋白酶中分离出来的，并且在洗涤剂制剂中检验它们。
在商业上使用数量不断增加的蛋白酶是相应的天然存在的野生型蛋白酶的工程化蛋白变体，例如DURAZYM(Novo Nordisk A/S)、RELASE(NovoNordisk A/S)、MAXAPEM(Gist-Brocades N.V.)、PURAFECT((GenencorInternational公司)。
因此，本发明的目的是提供改善的蛋白质工程蛋白酶变体，特别是用于洗涤剂工业中的变体。蛋白酶
在蛋白质底物中切割酰胺键的酶分类为蛋白酶，或(可互换的)肽酶(参见Walsh，1979，酶促反应机制。W.H.Freeman和公司，旧金山，第3章)。芽孢杆菌属的细菌种分泌两种细胞外蛋白酶，一种是中性的或金属蛋白酶，一种在功能上作为丝氨酸内肽酶的碱性蛋白酶。通常被称为枯草杆菌蛋白酶。这些蛋白酶的分泌和细菌周期相联系，在稳定期具有最大的蛋白酶表达量，此时也发生孢子形成，Joliffe等在(1980)细菌学杂志1411199-1208中提出芽孢杆菌属蛋白酶在细胞壁翻转中起作用。枯草酶
丝氨酸蛋白酶是一种催化肽键水解的酶，其中在活性位点有一个重要的丝氨酸残基(White，Handler和Smith，1973“生物化学原理”第15版，McGraw-Hill Book公司，NY，pp.271-272)。
细菌丝氨酸蛋白酶具有20,000至45,000道尔顿范围内的分子量，此酶被氟磷酸二异丙酯抑制。它们水解简单的末端酯，并在活性上和胰凝乳蛋白酶(也是一种丝氨酸蛋白酶)相似。更狭义地讲，一亚组的碱性蛋白酶具有一些丝氨酸蛋白酶的较高的最适pH(从pH0.9-11.0)(参见Priest(1977)细菌学综述41 711-753)。
Siezen等人已经提出一亚组暂时命名为枯草酶(subtilase)的丝氨酸蛋白酶(蛋白质工程4(1991)719-737)。通过丝氨酸蛋白酶的40多个氨基酸序列的同源分析限定它们，这些丝氨酸蛋白酶原来称为类枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶。以前把枯草杆菌蛋白酶定义为革兰氏阳性细菌产生的丝氨酸蛋白酶，按照Siezen等人所述，现在是枯草酶的一个亚组。鉴别了各种枯草杆菌蛋白酶，也测定了一些枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列。这些蛋白酶包括得自芽胞杆菌属菌株的6种以上的枯草杆菌蛋白酶，即枯草杆菌蛋白酶168、枯草杆菌蛋白酶BPN′、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶Y、枯草杆菌蛋白酶amylosacchariticus和mesentericopeptidase(Kurihara等(1972)生物化学杂志247 5629-5631；Wells等(1983)核酸研究11 7911-7925；Stahl和Ferrari(1984)细菌学杂志159 811-819，Jacobs等(1985)核酸研究13 8913-8926；Nedkov等(1985)生物化学Hoppe-Seyler366 421-430，Svendsen等(1986)FEBSLett.196 228-232)；一种得自放线菌目的枯草杆菌蛋白酶；得自普通高温放线菌的thermitase(Meloun等(1985)FEBS Lett.198 195-200)和一种真菌枯草杆菌蛋白酶，得自Tritirachium album的蛋白酶K(Jany和Mayer(1985)生物化学Hoppe-Seyler 366 584-492)。为了进一步参考，下文重复了Siezen等的表I。
已鉴定了枯草酶的物理和化学性质。除了已知这些酶的一级结构(氨基酸序列)外，已经测定了枯草酶的50多种高分辨率X光结构，这些结构描绘了底物结合、过渡状态、产物、至少三种不同的蛋白酶抑制因子，并且限定了天然变异的序列结构((Kraut(1977)生物化学年度综述46 331-358)。
在此申请中底物被以最广泛的形式解释为包括含有至少一个对枯草杆菌蛋白酶水解敏感的肽键的化合物。
而且在本发明中应该将表达产物解释为包括与枯草杆菌蛋白酶有关的水解反应产物。此产物可以是以后水解反应的底物。
枯草酶的一个亚组(即I-S1)包括典型的枯草杆菌蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶168、枯草杆菌蛋白酶BPN′、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(ALCALASENOVO NORD ISK A/S)和枯草杆菌蛋白酶DY。
Siezen等人鉴定了枯草酶的另一个亚组(即I-S2)(同上)。Siezen把I-S2亚组蛋白酶描述为高碱性枯草杆菌蛋白酶，其包括诸如枯草杆菌蛋白酶PB92(MAXACAL，Gist-Brocades NV)、枯草杆菌蛋白酶309(SAVINASE，NOVO NORDISK A/S)、枯草杆菌蛋白酶147(ESPERAS E，NOVO NORDISK A/S)和碱性弹性蛋白酶YaB的酶。
在本发明中枯草酶变体或突变的枯草酶意指一种已由有机体产生的枯草酶，所述有机体表达来源于亲本微生物的突变基因，这种微生物具有原始或亲本基因并且产生相应的亲本酶，为了产生突变基因，所述亲本基因已被诱变，当在合适的宿主中表达时，所说的变突的枯草杆菌蛋白酶从这种突变体基因产生。
酶的物理和化学性质的知识引起了枯草酶基因的随机和定点突变，并且这些突变提供了和枯草酶催化性质、底物特异性、三级结构等有关的信息(Wells等(1987)美国科学院学报84；1219-1223；Wells等(1986)Phil.Trans.R.Soc.Lond.A.317 415-423；Hwang和Warshel(1987)生物化学26 2669-2673；Rao等，(1987)自然328 551-554)。
涉及这个领域的较新的出版物是Carter等(1989)在《蛋白质》6 240-248，其涉及在底物酶中(24位和64位)切割特异性靶序列设计变体；Garter等(1992)纽约科学院年报672 71-79，其讨论了一些以前出版的结果；Takayi(1993)，国际生物化学杂志25 307-312，其也评述了以前的结果。
尤其是枯草杆菌蛋白酶基因定点突变引人关注，在下面的专利申请和专利中描述了各种突变：
EP公开号130756(GENENTECHL)(相应于美国专利34,606(GENENCOR))涉及“羰基水解酶”的特异性位点或随机产生的突变和以后的突变酶的各种性质的筛选，如kcat/ka比率、pH-活性分布和氧化稳定性。这一出版物指出点特异性突变是可行的，也描述了枯草杆菌蛋白酶BPN′在某些持异位点(即-1Tyr、32Asp、155Asn、104Tyr、222Me t、166Gly、64His、169Gly、189Phe、33Ser、221Ser、217Tyr、156Glu或152Ala)的突变提供了改变性质的酶，因为在申请之前已知除了-1位外的所有位点都与此酶的功能有关，所以此申请没有试图解决下面的问题，即确定在哪里引入突变以便获得所需性质的酶。
EP公开号214435(HENKEL)描述了枯草杆菌蛋白酶Carlsbery以及它的两个突变体的克隆和表达。在这个申请中没有提供由158Asp至158Ser和由161Ser至161Asp突变的原因。
在国际专利公开号WO 87/04461(AMGEN)中提出了减少存在于亲本酶中的Asn-Gly序列的数量，以便获得表现出改善的pH和热稳定性的突变的酶，这一申请的重点是除去、突变或修饰枯草杆菌蛋白酶BPN′的109Asn和218Asn残基，它没有提供任何缺失或修饰Gly残基的例子。
在国际专利公开号WO 87/05050(GENEX)中公开了随机突变和大量的改善特性的枯草杆菌蛋白酶BPN的突变体的筛。这一申请描述了在218ASN、131Gly、254Thr、166Gly、116Ala、188Ser、126Leu和53Ser位点的突变。
在EP公开号251446(GENENCOR)中描述了如何考虑应用一级结构和三级结构水平的同源性鉴定无论保守还是不保守的等价氨基酸残基。这一信息和发明人的枯草杆菌蛋白酶BPN′的三级结构方面的知识使发明人选择了大量的容易突变的位点，以期获得改变性质的突变体。这样鉴定的位置是124Met、222Met、104Tyr、152Ala、156Glu、166Gly、169Gly、189Phe、217Tyr、155Asn、21Tyr、22Thr、24Ser、32Asp、33Ser、36Asp、46Gly、48Ala、49Ser、50Met、77Asn、 87Ser、94Lys、95Val、96Leu、107Ile、110Gly、170Lys、171Tyr、172Pro、197Asp、199Met、204Ser、213Lys、221Ser。鉴定这些位点，以期影响此酶的各种性质。而且例证了大量突变以支持这些观点。除了在这些位置的单一突变外，发明人还进行了大量的多样化突变。发明人进一步鉴定出215Gly、67His、126Leu、135Leu和片段97-103、126-129、213-215和152-172中的氨基酸残基也有意义，但没有例示在这些位点中的任何突变。
对本发明的目的而言，尤其有益的是EP 251 446的发明人提出了取代170Lys(在枯草杆菌蛋白酶BPN′，I-SI型中)，特别是他们提出引入Glu或Arg取代原来的Lys。看来产生了Glu变体，并且发现它容易自溶降解(参见48、121、123页(表XXI有一个明显错误，但是表明裂解半衰期从86减少至13分钟)和图32)。
EP公开号260105(GENENCOR)描述了从催化三联体中通过选择15A左右的氨基酸残基和用另一种残基取代选择的氨基酸残基修饰含有催化三联体的酶的某些性质。特别提到在本说明书中描述的枯草酶型的酶属于含有催化三联体的酶类。还指出在枯草杆菌蛋白酶的222和217位是取代的优选位置。
而且Thomas、Russell和Fersht(1985)《自然》318 375-376已经表明在枯草杆菌蛋白酶BPN′中的99ASP变成99Ser改变了酶的pH特性。
在同一作者后来的文章((1987)分子生物学杂志193 803-813)中讨论了156Ser取代156Glu的取代。
所有这些突变都是在离活性64His 15A的距离内产生的。
在《自然》328 496-500(1987)中，Russel和Fersht讨论了他的实验结果，并阐述通过酶突变获得表面电荷发生变化来改变pH活性分布的规则。
WO 88/08028(Genex)和WO 88/08033(Amgen)描述了枯草杆菌蛋白酶BPN′
钙结合位点中的氨基酸残基的修饰。通过用更多的负电荷残基取代原来的残基使酶稳定。
在WO 89/06279(NOVO NORDISK A/S)中表明170位具有意义，提出在这一位置用Tyr取代已有的残基。然而没有给出关于这样一种变体的数据。在WO 91/00345(NOVO NORDISK A/S)中提出相同的建议，并且表明在枯草杆菌蛋白酶309(I-S2型)中的170位上的Tyr变体在洗涤剂中在pH大约为8时表现出改善的洗涤性能(表III、IV、V、VI、VIII、X中的变体S003)。根据所说申请的一般概念，同样的取代连同在其它位置上的其它取代也指示改善的洗涤性能(在同一表和表VII中的S004、S011-S014、S022-S024、S019、S020、S203、S225、S227)。
在EP 525 610 Al(SOLVAY)中提出通过减弱某些表面区域的疏水性改善酶(和枯草杆菌蛋白酶PB92密切相关的I-S2型枯草酶)对离子性表面活性剂稳定性。它最后建议在164位(如果采用BPN′编号则为170位)用Glu取代Arg。在这一申请中没有公开包含这种取代的变体。
在WO 94/02618(GIST-BROCADES N.V.)中描述了I-S2型枯草杆菌蛋白酶PB92的一些164位(如果用BPN′编号则为170位)变体。提供的例子表明用Met、Val、Try、Ile取代原来的Arg。变体的粉未状洗涤剂性能试验表明洗涤性能有轻微的提高。尤其是Ile变体在可可(cacao)上的洗涤性能试验表明提高大约20-30％。这一申请没有提供稳定性方面的数据。
在WO 95/30011、WO 95/30010和WO 95/29979(PROCTER & GAMBLE公司)描述了6个区域，尤其是设计了在枯草杆菌蛋白酶BPN′和枯草杆菌蛋白酶309的199-220位(按BPN′编号)以改变(即减少)酶对表面结合的污物的吸收作用。这一申请建议利用酶对底物的吸附作用的减少产生更好的洗涤剂性能，它没有提供所提出的变体的洗涤剂的详细洗涤性能数据。
WO 95/27049(SOLVAY S.A.)中描述了带有以下突变的枯草杆菌蛋白酶309型蛋白酶：N43R+N116R+N117R(按BPN′编号)。数据表明和野生型相比，相应的变体具有改善的稳定性。枯草酶的工业应用
发现蛋白酶(如枯草杆菌蛋白酶)在工业上非常有用，特别是在洗涤剂制剂中，因为它们对除去蛋白污点有用。
目前发现从商业途径可以得到至少以下蛋白酶，并且其中的很多蛋白酶在世界上许多国家都已大量上市。
例如，可以从美国圣路易斯的西格玛公司获得枯草杆菌蛋白酶BPN′或Novo。
枯草杆菌蛋白酶Carlsberg由NOVO NORDISK A/S(丹麦)以ALCALASE销售和由Gist-Brocades N.V.(荷兰)以MAXATASE销售。
这两个都属于枯草酶I-S1亚组。
在枯草酶I-S2亚组中，已知上市了以下的酶。
由NOVO NORDISK A/S(丹麦)以SAVI NASE销售迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶即枯草杆菌蛋白酶309。这种酶的蛋白质工程化变体以DURAZYM销售。
与SAVINASE非常类似的酶(如枯草杆菌蛋白酶PB92)有由Gist-Brocade N.V.销售的MXACAL(这种酶的蛋白质工程化变体以MAXAPEM销售)、由SOLVAY et Cie.销售的OPTICLEAN和国际GENENCOR销售的PURFUFECT。
迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，即枯草杆菌蛋白酶147由NOVONORDISK A/S(丹麦)以ESPERASE销售；
然而，在有效性方面，这样的酶一定要不仅在洗涤时表现出活性，而且在洗涤剂的生产和贮存过程中要和洗涤剂的其它组分相容。
例如，枯草杆菌蛋白酶可以和其它酶组合起来使用以作用于其它底物，选择的枯草杆菌蛋白酶应该对这样的酶具有稳定性，同时选择的枯草杆菌蛋白酶最好不应催化其它酶的降解。而且选择枯草杆菌蛋白酶应对洗涤剂制剂中的其它组分的反应具有抵抗性，如漂白剂、氧化剂等，特别是用于洗涤剂制剂中的酶对氧化力、钙结合特性和在洗涤剂贮存期间和使用洗涤液的洗涤期间的其它非酶组分提供的pH值稳定。
酶催化存在于要洗涤的物体上(例如在洗涤期间)的各种自然产生的底物的降解能力经常被称为洗涤能力、洗涤力、去垢力或者洗涤性能。在整个申请中，洗涤性能这一术语将用于表述这种属性。
在使用洗涤剂之前(一般在洗涤过程中加水)在洗涤剂组合物的其它组分存在的条件下酶保持活性的能力通常称为贮存稳定性或货架寿命。经常测量的是半寿期t1/2。我们在此申请中仍将使用这种贮存稳定性表述法。
发现仍然存在的枯草杆菌蛋白酶具有这样的性质，就是在参数(如pH)变化的条件下他们的洗涤力或洗涤能力有很大的变化。实际上以上上市的一些洗涤剂蛋白酶比大约20年前上市的那些具有更好的性能，但就理想的性能来说在制剂和洗涤条件方面每一种酶具有自己的特定条件，如pH、温度、离子强度(＝I)、活性体系(Tersides、表面活性剂、漂白剂等)、助洗剂等。
结果发现在低pH值和低I值时具有理想特性的酶在更为碱性的条件和高I值时可能具有较小的吸引力，或者在高pH值和高I值表现较好特性的酶在低pH值和低I值时可能有较小的吸引力。
而且发现在不同的酶之间的贮存稳定性也不同，但进一步发现不同洗涤剂制剂的特异酶在很多参数(如pH、PI、漂白体系、Tenside等)和洗涤剂组合物的物理状态(可以为粉状、粒状或液体形式)方面表现出很大的变化，而且酶可以是浓缩的或稀释的。
重组DNA技术的出现和发展在蛋白质化学领域产生了深刻的影响。
现在通过应用这种技术可以构建具有所需氨基酸序列的酶，而且开展了以上所列的一些研究以设计具有改变的性质的枯草杆菌蛋白酶。
在这些申请中，如在EP公开号130756(GENENTECH)(美国专利34,606(GENENCOR))，和国际专利公开号WO 87/05050(GENEX)中描述的生产和筛选大量突变酶技术在很大程度上相当于分离天然酶的经典方法，把天然酶用于经典诱变方法(利于辐射诱变和化学诱变)，并且筛选它们的特性，不同之处在于在知道一些特异性位置被取代的变体酶存在的条件下这些方法会更有效。
枯草杆菌蛋白酶典型地包含大约275个氨基酸残基。每个残基可以是20种可能天然产生的氨基酸中的一种。
因此在这一方法中一个非常严重的障碍是产生的大量突变要进行许多初步筛选以确定它们的性质。
因而，在这些专利申请中概述的方法只比已经了解了多年的传统随机突变方法稍好一些。
其它的已知技术涉及改变特定属性，如氧化稳定性、热稳定热、Ca稳定性、酯基转移作用和水解率(EP公开号260105(GENENCOR))、pH活性分布(Thomas、Pussell和Fersht，同上)和底物特异性(国际专利公开号WO 88/07578(GENENTECH))。这些出版物没有一个涉及改变酶的洗涤性能或它们的贮存稳定性。
在国际专利申请PCT/DK 88/00002(NOVO NORDISK A/S)中提出使用同源性比较这一概念来确定应该选择哪一个氨基酸位置用于突变及确定在这些位置上应该取代的氨基酸，以获得洗涤性能的所需变化。
通过使用这样一种方法，筛选的工作量急剧减少，因为产生的变体的数量减少了。但是利用这种方法只能预见可以获得表现出结合了亲本酶和比较酶的有用特性的酶。
问题似乎是，虽然许多研究的目的在于揭示酶活性的机制，但决定与它们的性质有关的酶的属性(如在洗涤剂中贮存稳定性)的结构因子和氨基酸残基的组合还知道得很少，尤其当酶存在于复杂的混合物中。
因此还存在需要进一步改善的和制作洗涤剂体系的酶，也需要更好地了解在洗涤或洗涤剂组合物的实际应用中蛋白酶的作用机制以及降解机制。这种理解能够产生用于选择突变的规律，这种规律在十分合理的程度上会产生在洗涤剂组合物中在特定条件下表现出改善的贮存稳定性的酶。发明概述
现在已令人惊奇地发现在洗涤剂中具有改善的贮存稳定性和/或改善的性能的枯草酶变体可以通过将位于亲本枯草酶疏水区中或者其邻近区中的一个或多个氨基酸残基用一种比原来的残基更为疏水的氨基酸取代而获得，所说的疏水区包括相应于BLS309(按BASBPN编号)的残基P129、P131、1165、Y167、Y171的残基，所说的疏水区邻近区中的残基包括相应于BLS309(按BASBPN编号)的残基E136、G159、S164、R170、A194和G195的残基，除了BABP92的R170M、R170I和R170Y变体之外。
因而在第一方面本发明涉及表现出在洗涤剂中改善的稳定性和/或改善的洗涤性能的酶变体。
在第二方面本发明涉及能够表达第一方面的酶的DNA构建体，当以一种合适的方式插入到宿主细胞中时可以产生第一方面的枯草杆菌蛋白酶的表达。
在第三方面本发明涉及产生本发明的枯草杆菌蛋白酶的方法。该方法通过把第二方面的构建体插入到合适宿主中，并且培养宿主以表达所需的枯草酶；然后回收酶产品。
本发明部分涉及但不限于表达以上所述的枯草酶I-S2亚组酶基因的突变体和产生的酶变体。本发明包括的其它枯草酶基因变体是例如枯草酶I-S1亚组的那些(如枯草杆菌蛋白酶BPN′、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg基因)和产生的变体枯草杆菌蛋白酶BPN′、蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶，它们在浓缩的液体洗涤剂中表现出改善的稳定性。
本发明包括的另一种枯草酶基因变体是例如蛋白酶K和其它的基因以及产生的变体蛋白酶K和其它的枯草酶，它们在浓缩的液体洗涤剂中表现出改善的稳定性。
能够按照本发明进行修饰的亲本枯草酶的其它例子列于表I中。
本发明还涉及在清洗组合物中的突变酶和包含突变酶的清洗组合物(尤其是含有突变的枯草杆菌蛋白酶的洗涤剂组合物)的用途。特别是本发明涉及含有这种酶变体的浓缩液体洗涤剂组合物。
                     缩写表氨基酸A    ＝    Ala    ＝    丙氨酸V    ＝    Val    ＝    缬氨酸L    ＝    Leu    ＝    亮氨酸I    ＝    Ile    ＝    异亮氨酸P    ＝    Pro    ＝    脯氨酸F    ＝    Phe    ＝    苯丙氨酸W    ＝    Trp    ＝    色氨酸M    ＝    Met    ＝    蛋氨酸G    ＝    Gly    ＝    甘氨酸S    ＝    Ser    ＝    丝氨酸T    ＝    Thr    ＝    苏氨酸C    ＝    Cys    ＝    半胱氨酸Y    ＝    Tyr    ＝    酪氨酸N    ＝    Asn    ＝    天冬酰胺Q    ＝    Gln    ＝    谷氨酰胺D    ＝    Asp    ＝    天门冬氨酸E    ＝    Glu    ＝    谷氨酸K    ＝    Lys    ＝    赖氨酸R    ＝    Arg    ＝    精氨酸H    ＝    His    ＝    组氨酸X    ＝    Xaa    ＝    任何氨基酸核酸碱基A    ＝    腺嘌呤G    ＝    鸟嘌呤C    ＝    胞嘧啶T    ＝    胸腺嘧啶(只
       在DNA中)U    ＝    尿嘧啶(只在
       RNA中)变体：
在描述本发明所产生或研究的各种酶变体时，为易于指称采用了以下表示法：
原来的氨基酸位置取代的氨基酸
按照这种表示法，在195位上的谷氨酸取代甘氨酸表示为Gly 195 Glu或G195E。
在同一位置缺失甘氨酸表示为：Gly 195*或G195*。
插入另外一种氨基酸残基(如Lys)表示为Gly 195 Gly Lys或G 195GK。
在与所使用的编号序列比较显示缺失时，在这一位置上的插入表示为
         *36ASP或*36D，
其表示在36位插入一个天冬氨酸。
通过+分开多重突变，即：
Arg170Try+Gly195Glu或R170Y+G195E
它表示在170和195位上的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代的突变。位置
在本申请和所附权利要求中描述变体时，使用了上述Siezen等人的各种枯草酶的排列方式。在其它与枯草酶有关的出版物中已采用了其它推定酶的排列方式和编号方式。对于技术人员来说用本文使用的编号方式确定特定残基的位置是平常的事情。还参照了显示与本发明的枯草酶相关大量枯草酶残基的序列对比的图1。还参照了WO 91/00345的显示与本发明的枯草酶相关大量枯草酶残基的序列对比表I。
    表I  目前已知的枯草酶(来源于Siezen等，同上)生物体             cDNA基因   酶                   缩写原核生物细菌：格兰氏阳性枯草芽孢杆菌168     aprA     枯草杆菌蛋白酶I168，apr ABSS168液解化淀粉杆菌      apr      枯草杆菌蛋白酶BPN′BASBPN
                         (NOVO)枯草芽孢杆菌DY      -        枯草杆菌蛋白酶DY    BSSDY地衣芽孢杆菌        +        枯草杆菌蛋白酶Carlsberg  BLSCAR迟缓芽孢杆菌        +        枯草杆菌蛋白酶147        BLS147嗜碱芽孢杆菌PB92    +        枯草杆菌蛋白酶PB92       BAPB92芽孢杆菌DSM 4828    -        碱性蛋白酶               BDSM48芽孢杆菌YaB         ale      碱性弹性蛋白酶YaB        BYSYAB枯草芽孢杆菌168     epr      min.胞外蛋白酶           BSEPR枯草芽孢杆菌        bpf      芽胞杆菌肽酶F            BSBPF枯草芽孢杆菌IF03013 isp1     胞内胞内丝氨酸蛋白酶1    BSISP1枯草芽孢杆菌A50      -       胞内丝氨酸蛋白酶         BSIASO苏云金芽孢杆菌       -       胞外丝氨酸蛋白酶         BTFINI蜡状芽孢杆菌         -       胞外丝氨酸蛋白酶         BCESPR达松维尔拟诺卡氏菌   -       碱性丝氨酸蛋白酶         NDAP II普通高温放线菌       -       thermitase               TVTHER粪肠球菌              cylA    溶细胞素组分A         EFCYLA表皮葡萄球菌          epiP    表皮纤维引导蛋白酶    SEEPIP酿脓链球菌            scpA     C5a肽酶              SPSCPA乳乳球菌SK11          prtP     SK11细胞壁蛋白酶     LLSK11细菌：格兰氏阴性节瘤偶蹄形菌           +       碱性蛋白酶蛋白酶     DNEBPR野油菜黄单胞菌         +       胞外蛋白酶           XCEXPR粘质沙雷氏菌           +       胞外丝氨酸蛋白酶     SMEXSP水生栖热菌YT-1        pstI     水剂细胞溶解酶I      TAAQUA栖热菌属rT41A          +       T41A蛋白酶           TRT41A解藻朊酸弧菌          proA     蛋白酶A              VAPROA鲁地链霉菌             -       蛋白酶D              SRESPDArchaea嗜盐菌株172P1          -       嗜盐菌胞外蛋白酶     ARB172蓝细菌多变鱼腥蓝细菌        prcA     Ca依赖性蛋白酶       AVPRCA低等真核生物真菌Tritirachiu malbum     +       蛋白酶K              TAPROKLimberTritirachium album     +       蛋白酶R              TAPRORTritirachium album    proT     蛋白酶T              TAPROT米曲霉                 +       碱性蛋白酶           AOALPRMalbranchea pulchella  -       热分支菌素           MPTHMY枝顶孢霉              alp      碱性蛋白酶           ACALPR酵母菌乳酸克鲁维酵母        kex1     Kex1丝氨酸蛋白酶     KLKEX1酿酒酵母              kex2     Kex2丝氨酸蛋白酶     SCKEX2酿酒酵母              prb1     蛋白酶B              SCPRB1Yarrowia lipolytica   xpr2     碱性胞外蛋白酶       LXPR2高等真核生物虫Caenorhabditis elegans  bli4      表皮蛋白酶           CEBLI4昆虫果蝇属(果蝇)            fur1      弗林蛋白酶1          DMFUR1果蝇属(果蝇)            fur2      弗林蛋白酶2          DMFIJR2植物甜瓜(甜瓜)               -        cucumisin            CMCUCU哺乳动物人(也可以是大鼠，小鼠)  fur       弗林蛋白酶           HSFURI人(也可以是小鼠)         +        胰岛瘤PC2蛋白酶      HSIPC2小鼠                     +        粘液PC3蛋白酶        MMPPC3人                       +        三肽基肽II           HSTPP
                  表I的参考文献
氨基酸序列的参考文献(Genbank/EMBL数据库登记号列于括弧中)ARB172 Kamekura和Seno，(1990)生物化学细胞生物学68 352-359(成熟蛋
白酶残基1-35的氨基酸测序；没有确定残基I4)BSS168 Stahl.和Ferrari.(1984)细菌学杂志158，411-418(K01988)。
   Yoshimoto，Oyama等(I488)生物化学杂志103，1060-1065(枯草
   芽孢杆菌amylosacchariticus变种的成熟枯草杆菌蛋白酶不同
   之处在于具有T130S和T162S)。Svendsen，等(1986)FEBS Lett.
   196，228-232(PIR A23624；氨基酸测序；肠膜芽孢杆菌的成熟碱
   性空肠肽酶不同之处在于具有S85A，A88S，S89A.S183A和
   N259S)。BASBPN Wells，等(1983)核酸研究11 7911-7925(X00165)。Vasantha
   等，(1984)细菌学杂志159 811-814(K02496)。BSSDY  Nedkov等(1983)Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem.364 1537-
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   (1968)生物化学杂志243 2184-2191(PIR A00968；氨基酸测序；
    成熟蛋白酶序列不同之处在于具有T103S，P129A，S158N，N161S
    和S212N)。BLS147  Hastrup等(1989)PCT专利申请WO 8906279。1989年7月13日
    出版。(迟缓芽孢杆菌的Esperase)。Takami等(1990)微生物生
    物技术应用，33 519-523(Bacillus sp.no.AH-101的成熟碱性
    蛋白酶残基1-20的氨基酸测序；此序列在N11S上与BLS147不
    同)。BABP92  van der Laan等(1991)应用环境微生物学57 901-
    909.(Maxacal)。Hastrup等(1989)PCT专利申请WO 8906279。
    1989年7月13日出版。(枯草杆菌蛋白酶-309的Savinase，仅
    在N87S上不同)。Godette等(1991)第5界蛋白质协会讨论会文
    摘，6月6日，巴尔的摩：文摘M8(迟缓芽孢杆菌的高碱性蛋白酶
    不同之处在于具有N87S，S99D，S101R，S103A，V104I和G159S)。BDSM48  Rettenmaier等(1990)PCT专利申请WO 90/04022。1990年4月
    19日出版。BYSYAB  Kaneko等(1989)细菌学杂志171 5232-5236(M28537)。BSEPR   Sloma.等(1988)细菌学杂志170 5557-5563(M22407)。
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    等(1990)生物化学杂志265 6845-6850(J05400；由于移码，此序
    列不同之处在于具有A169V和缺少C末端残基的586)。BSISP1  Koide等(1986)细菌学杂志167 110-116(M13760)。BSIA50  Strongin等(1978)细菌学杂志133 1401-1411(成熟蛋白酶残基
    1-54的氨基酸测序；没有确定残基3.39，40.45，46，49和50)。BTFINI  Chestukhina等(1985)Biokhimiya  50  1724-1730(Bacillus
    thuringiensis variety israeliensis的成熟蛋白酶残基1-14
    和变种finitimus的1-16和223-243残基的氨基酸测序)。
    Kunitate等(1989)农业生物化学53 3251-3256(变种kurstaki.
    BTKURS的成熟蛋白酶残基6-20的氨基酸测序)。BCESPR  Chestukhina等(1985)Biokhimiya 50 1724-1730(成熟残基1-16
    和223-243的氨基酸测序)。NDAAPII Tsujibo等(1990)农业生物化学54 2177-2179(成熟残基1-26的
    氨基酸序列)。TVTHER  Meloun等(1985)FEBS Lett.183 195-200(PIR A00973；成熟蛋白
    酶残基1-274的氨基酸测序)。EFCYLA  Segarra等(1991)传染免疫学59 1239-1246。SEEPIP  Schnell等(1991)个人通讯(Siezen等(见上文))。SPSCPA  Chen等(1990)生物化学杂志265 3161-3167(J05224)。DNEBPR  Kortt等(1991)第5界蛋白质协会讨论会文摘，6月22-26日，巴
    尔的摩：文摘S76。LLSK11  Vos等(1989)生物化学杂志264 13579-13585(J04962)。Kok等
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    44位上不同，包括蛋白酶域的18种差异和残基1617-1676的缺
    失)。Kiwaki等(1989)分子微生物学3 359-369(X14130；菌株
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    1617-1676的缺失)。XCEXPR  Liu等(1990)分子基因遗传学220 433-440。SMEXSP  Yanagida等(1986)细菌学杂志166 937-994(M13469)。TAAQUA  Terada等(1990)生物化学杂志265 6576-6581(J054I4)。TRT41A  McHale等(1990)Abstracts 5th Eur.Congr.Biotechn，
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    肽NIISGTSM的氨基酸测序)。HSFURI  van den Ouweland等(1990)核酸研究18 664(X04329)(小鼠furin
    的序列在51个位置上不同，包括位于催化域中的5个位置：A15E，
    Y21F，S223F，A232V和N258[2]D)。Misumi等(1990)核酸研究18
    6719(X55660：大鼠furin的序列在49个位置上不同，包括位于
    催化域中的3个位置：A15E，Y21F，H24R)。HSIPC2  Smeekens和Steiner(1990)生物化学杂志265 2997-
    3000(J05252)。Seidah等(1990)DNA细胞生物学9 415-424(小鼠
   粘液PC2蛋白酶的序列在23个位置上不同，包括蛋白酶域中的7
    个位置：I4F，S42[2]Y，E45D，N76S，D133E，V134L和G239
    [1]D)。MMPPC3  Smeekens等(1991)美国科学院学报88 340-344(M58507)。Seidah
    等(1990)DNA细胞生物学9 415-424(M55668/M55669；部分序
    列)。HSTPP   Tomkinson和Jonsson(1991)生物化学30 168-174(J05299)。附图简要描述
附图中，图1显示了表1所列出的大量的枯草酶的序列对比；
图2是枯草杆菌蛋白酶309的三维结构，显示疏水区位点和其邻近区中的按照本发明将被取代的一些氨基酸残基。发明详述
令人惊奇的是发现在洗涤剂中枯草酶的贮存稳定性和/或改善的性能在以下情况下通常得到提高，即位于疏水区中或者其邻近区中的氨基酸残基由一种更疏水的残基取代时，所说的疏水区中的残基包括枯草杆菌蛋白酶309的P129、P131、I165、Y167、Y171。所研究的残基特别是E136、G159、S164、R170、A194和G195。
而且，所说的变体表现出特别高的改善的稳定性(在液体洗涤剂和在成形的固体洗涤剂中)。
图2显示了枯草杆菌蛋白酶309的疏水区中和其邻近区中的残基，其中一些残基将被取代以增加疏水区的疏水性。这可以通过用疏水残基取代非疏水残基和/或通过取代使亲本酶的残基变得更疏水的残基来完成。
把相同的原则适用于其它枯草酶的相应区域，这些区域的鉴定在本技术领域的普通人员的技术范围内。可以产生其它枯草酶的类似于图2的图示以确定按照本发明将被取代的目标残基。
其编号如以下表II所示：表II疏水区和其邻近区中的氨基酸残基位置\酶  BRSBPN   BLSCAR   BLS309   IBLS147  TVTHER疏水区129      P        A        P        T        T131      G        G        P        G        G165      V        I        I        V        P167      Y        Y        Y        Y        Y171      Y        Y        Y        Y        Y邻近区136      K        K        E        E        Q159      S        S        G        G        T164      T        T        S        G        A170      K        K        R        R        Y194      P        A        A        P        S195      E        E        G        E        V
用图2所示的排列方式(algnment)构建了表II。显然，技术人员可以很容易地制成包括其它枯草酶的相同的表或大一些的表。
因此本发明涉及这样的枯草酶变体，其中通过突变枯草杆菌蛋白酶的基因改变了氨基酸序列，对负责129、131、165、167、171、136、159、164、170、194和195位氨基酸残基表达的密码子(亲本酶或基因)进行修饰是合乎需要的，这些残基是比亲本酶中的残基更具有疏水性的残基，尤其是包含较长疏水侧链的疏水残基(如Ile，Leu和Val)，因此，当突变的基因表达后，氨基酸残基被更疏水的残基取代，这样增加了此区域的疏水性。
疏水的氨基酸残基一般为以下几种：Val(V)、Ile(l)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)和Trp(W)，在这些残基中，Val、Ile和Leu是优选的。
通过浏览表II和使用本发明的原则，可以清楚许多候选的取代。
对于BASBPN和BLSCAR，似乎适合于在129、131、136、159、164、167、170、171和195位发生取代。在BLS309中136、164、167、170、171位是首选的位置，位置159和195是第二种选择。在BLS147中129、131、136、167、170、171和195位是首选的位置，而159和164位是第二选择的位置。最后在TVTHER中129、131、136、167、171和194位是首选的位置，而164位是第二选择的位置。
按照本发明，用更多和更疏水的残基取代疏水区的Gly残基是有利的。
这种考虑可应用于任一种亲水或疏水残基，其可以占据以上提到的任何位置，也就是说任何疏水性的增加都是有利的。这就意味着，例如，一个非常亲水的残基如带电荷的残基Arg(R)、Asp(D)、Glu(E)或Lys(K)可以被任何一个不太亲水的残基取代，这样的不太亲水的残基包括Gly(G)、Cys(C)、Ser(S)、Ala(A)、Thr(T)、Tyr(Y)、Gln(Q)、His(H)或Asn(N)残基。这也意味着一个Tyr(Y)可以被更疏水的残基如Phe(F)、Leu(L)或Ile(I)所取代。
同样的考虑可以应用于其它的在酶表面具有疏水区的枯草酶。
在本发明中按照以上Siezen等人的方法限定枯草酶。在狭义的意义上讲，适用于本发明的许多实施方案的兴趣枯草酶是那些属于I-S1和IS2亚组的。更具体地说，本发明的一些实施方案涉及革兰氏阳性细菌的丝氨酸蛋白酶，这种丝氨酸蛋酶在一级结构上和上述表I所列的枯草酶实质上具有非常确切的同源性。
本发明也包括任何以上提到的亲本酶的氨基酸序列位置上的一个或多个取代以及任何其它的取代、缺失或添加。特别是包括与其它的已知给出酶性质改善的取代的组合。
这样的组合包含的位置有：222位(提高氧化稳定性)、218位(提高热稳定性)、在能稳定酶的钙结合位置上的取代(如76位)和从现有技术来看明显的其它位置。
而且也特别涉及与EP 405 901中提到的变体的组合。变体
A：单一变体：
枯草杆菌蛋白酶BPN′、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶168和枯草杆菌蛋白酶DY变体：A129V，A129I，A129L，A129M，A129FG131V，G131I，G131L，G131M，G131FK136V，K136I，K136L，K136M，K136F，S159V，S159I，S159L，S159M，S159F，T164V，T164I，T164L，T164M，T164F，Y167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167FK170V，K170I，K170L，K170M，K170F，Y171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171FA194V，A194I，A194L，A194M，A194FE195V，E195I，E195L，E195M，E195F，Thermitase变体：A129V，A129I，A129L，A129M，A129FG131V，G131I，G131L，G131M，G131FQ136V，Q136I，Q136L，Q136M，Q136F，T159V，T159I，T159L，T159M，T159F，A164V，A164I，A164L，A164M，A164F，Y167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167FY171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171FY170V，Y170I，Y170L，Y170M，Y170F，S194V，S194I，S194L，S194M，S194F，枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和芽孢杆菌属PB92蛋白酶变体：T129V、T129I、T129L、T129M、T129FG131V、G131I、G131L、G131M、G131FE136V、E136I、E136L、E136M、E136F、G159V、G159I、G159L、G159M、G159F、G164V、G164I、G164L、G164M、G164F、(BLS147)S164V、S164I、S164L、S164M、S164F、(BLS309和BAPB92)Y167A、Y167H、Y167N、Y167P、Y167C、Y167W、Y167Q、Y167S、Y167T、Y167G、Y167V、Y167I、Y167L、Y167M、Y167F、R170W、R170A、R170H、R170N、R170P、R170Q、R170S、R170T、R170Y(对BLS309放弃)、R170V(对BAPB92放弃)、R170I(对BAPB92放弃)、R170L、R170M(对BAPB92放弃)、R170F、R170G、R170C、Y171A、Y171H、Y171N、Y171P、Y171C、Y171W、Y171Q、Y171S、Y171T、Y171G、Y171V、Y171I、Y171L、Y171M、Y171F、A194V、A194I、A194L、A194M、A194F、(BLS309和BAPB92)P194V、P194I、P194L、P194M、P194F、(BLS147)E195V、E195I、E195L、E195M、E195F、(BLS147)G195V、G195I、G195L、G195M、G195F、(BLS309和BAPB92)B.组合变体：
上述任何一种变体如果和其它在以下任何一个位置上的变体组合预期是有用的，这些位置是：27、36、57、76、97、101、104、120、123、206、218、222、224、235和274。
特别是以下的BLS309和BAPB92变体被认为适合于组合：K27R、*36D、S57P、N76D、G97N、S101G、V104A、V104N、V104Y、H120D、N123S、A194P、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。
而且包含以下任何一种或二种取代以及以上提到的任何一种或多种其它取代、缺失和或插入的变体是有利的：X167V、X167M、X167F、X167L、X167I、X170V、X170M、X170F、X170L和/或X170。
此外包含任何一种变体V104N+S101G、K27R+V104Y+N123S+T274A或N76D+V104A或这些突变(V104N、S101G、K27R、V104Y、J123S、T274A、N76D、V104A)与以上提到的任何一种或多种取代、缺失和/或插入的其它组合的变体被认为能表现出改善的性质。要提到的特定组合是：a)      S57P+R170La′)    S57P+R170Ib)      R170L+N218Sb′)    R170I+N218Sc)      S57P+R170L+N218Sc′)    S57P+R170I+N218Sc＂)    S57P+V104Y+R170L+N218Sc)    S57P+V104Y+R170I+N218Sd)      R170L+N218S+M222Ad′)    R170I+N218S+M222Sd＂)    R170L+N218S+M222Ad)    R170I+N218S+M222Se)      S57P+R170L+S188P+A194Pe′)    S57P+R170I+S188P+A194Pf)      Y167L+R170Lf′)    Y167L+R170Ig)      Y167I+R170Lg′)    Y167I+R170Ih)      N76D+R170L+N218Sh′)    N76D+R170I+N218Si)      S57P+N76D+R170L+N218Si′)    S57P+N76D+R170I+N218Sj)      N76D+R170L+N218S+M222Aj′)    N76D+R170I+N218S+M222Sj＂)    N76D+R170L+N218S+M222Aj)    N76D+R170L+N218S+M222Sk)      S57P+R170I+S188P+A194P+N218Sk′)    S57P+R170I+S188P+A194P+N218S1)      *36D+N76D+H120D+R170L+G195E+K235L1′)    *36D+N76D+H120D+R170I+G195E+K235L1＂)    *36D+N76D+H120D+Y167I+R170L+G195E+K235L1)    *36D+N76D+H120D+Y167I+R170I+G195E+K235Lm)      N76D+H120D+R170L+G195E+K235Lm′)    N76D+H120D+R170I+G195E+K235Lm＂)    N76D+H120D+Y167I+R170L+G195E+K235Lm)    N76D+H120D+Y167I-R170I+G195E+K235Ln)      *36D+G97N+V104Y+H120D+R170L+A194P+G195E+K235Ln′)    *36D+G97N+V104Y+H120D+R170I+A194P+G195E-K235Lo)      S57P+R170L+Q206Eo′)    S57P+R170I+Q206Ep)      R170L+Q206Ep′)    R170I+Q206Eq)      Y167I+R170L+Q206Eq′)    Y167I+R170I+Q206Er)      Y167F+R170Lr′)    Y167F+R170It)      Y167I+R170L+A194Pt′)    Y167I+R170I+A194Pt＂)    Y167L+R170L+A194Pt)    Y167L+R170I+A194Pu)      Y167I+R170L+N218Su′)    Y167I+R170I+N218Su＂)    Y167L+R170L+N218Su)    Y167L+R170I+N218Sv)      Y167I+R170L+A194P+N218Sv′)    Y167I+R170I+A194P+N218Sv＂)    Y167L+R170L+A194P+N218Sv)    Y167L+R170I+A194P+N218Sx)      R170L+P131Vx′)    R170I+P131Vy)      *36D+Y167I+R170Ly′)    *36D+Y167I+R170Iz)      Y167I+Y171Iaa)     Y167V+R170Laa′)   Y167V+R170Ibb)     R170L+Y171Ibb′)   R170I+Y1 71Lbb＂)   R170L+Y171Lbb)   R170I+Y171Icc)     Y167I+Y171L+N218Scc′)   Y167I+Y171I+N218S含有突变酶的洗涤剂组合物
本发明也包括本发明的突变酶在清洗剂和洗涤剂组合物中的用途以及含有突变枯草杆菌蛋白酶的组合物。在原则上这样的清洗剂和洗涤组合物可以有任意的物理形式，但是枯草酶变体优选地加入到液体组合物中或加入到柱状、片状、棒状等形式的直接应用的组合物中。在其中它们表现出改善的酶稳定性或性能。
在本发明的液体组合物中，含水的液体洗涤剂具有均一的物理性状，例如它们都是由不断连续的含水相的表面活性剂的分子溶液构成，即所谓的各向同性的液体。
另外，它们可以具有均一的物理状态，可以制备它们，例如它们可以由分散在连续水相的薄层微滴构成，例如在EP-A-346 995(Unilever)中描述的(本文一并参考)包括具有亲水骨架和至少一条疏水侧链的悬浮聚合物。后面这些液体是多相的，并且可以含有悬浮的固体颗粒(如以下提到的助洗剂物质颗粒)。
对粉未状洗涤剂组合物而言，这种组合物只包含本发明以上的任何方面的任何一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或者与任何一种包括进组合物的常规组分组合，这种组分是本领域技术人员熟知的。
这样的组分包括助洗剂(例如磷酸盐或者沸石助洗剂)、表现活性剂(如阴离子、阳离子、非离子或两性离子型的表面活性剂)、聚合物(如丙烯酸的或等价的聚合物)、漂白体系(如过硼酸盐或含氨基的漂白前体物或催化剂)、结构物(如硅酸盐结构物)、调节pH的碱或酸、湿润剂和/或中性无机盐。
而且，在本发明的组合物中通常存在许多其它的组分，如：
A.辅助表面活性剂
B.酒石酸盐丁二酸盐助洗剂
C.中和系统
D.泡沫抑制剂
E.其它酶
F.其它可有可无的组分
阴离子表面活性剂和非离子表面活性的比值优选的是1∶1至5∶1。组合物10％(重量比)的水溶液在20℃的pH的值为7.0至9.0，临界微胶粒浓度小于或等于200ppm，在临界微胶粒浓度下在35℃的蒸馏水中空气/水表面张力小于等于32达因/cm。组合物最好是澄清、均质和相稳定的，并且具有良好的洗涤性能和酶稳定性。各种组分：
1.阴离子表面活性剂
本发明的组合物含有从大约10％至50％(重量比)的天然或合成的阴离子表面活性剂，优选的阴离子表面活性剂的含量为大约15％至50％，更优选的为大约20％至40％，最优选的从20％至大约30％，合适的天然或合成的阴离子表面活性剂是如肥皂和如在美国专利4,285,841和美国专利3,929,678中公开的物质。
有用的阴离子表面活性剂包括下列酸的水溶性盐，特别是碱金属、铵和烷基醇铵(例如一乙醇铵和三乙醇铵)盐：在分子结构中含有大约10至20个碳原子的烷基和磺酸或硫酸酯基团的无机硫酸反应产物。(芳基的烷基部分包括在术语“烷基”中)。合成的表面活性剂的基团的例子是烷基硫酸酯，特别是通过高级醇(C8-C18碳原子)的硫酸化作用获得的基团，如通过还原动物脂或椰子油甘油酯产生的基团；烷基苯磺酸酯，其中的烷基基团含有直链或支链结构的大约9至15个碳原子，例如在美国专利2,220,099和2,477,383中描述的那些类型。尤其有价值的是线性直链的烷基苯磺酸酯，其中在烷基基团中碳原子的平均数为大约11至14。
本文的其它的阴离子表面活性剂是水溶性的盐：含有8至24个(优选的大约12至18个)碳原子的石蜡磺酸酯；烷基甘油醚磺酸酯，尤其那些C8-C18醇醚(例如比动物脂和椰子油中分离出来的)；每个分子含有1至4个单位的环氧乙烷和在烷基基团中含有8至12个碳原子的烷基苯酚环氧乙烷醚硫酸酯；每个分子含有1至4个单位的环氧乙烷和在烷基基团中有10至20个碳原子的烷基环氧乙烷醚硫酸酯。
其它有用的阴离子表面活性剂包括在脂肪酸基团中含有6至20个碳原子和在酸基团中含有1至10碳原子的a-磺化的脂肪酸酯的水溶性盐；在烷基基团中含有2至9个碳原子和在烷烃方面含有9至23个碳原子的2-酰氧-烷烃-1-磺酸的水溶性盐；含有12至14个碳原子的石蜡磺酸酯的水溶性盐，在烷基基团含有1至3个碳原子和在烷烃部分含有8至20个碳原子的b-烷氧基烷烃磺酸酯。
优选的阴离子表面活性剂是肥皂、C10-C18烷基硫酸酯和每mol烷基硫酸酯分子平均含有4个环氧乙烷单位的烷基乙氧基硫酸酯、C11-C13线性烷基苯磺酸酯和它的混合物。
2.非离子表面活性剂
另一种选择性组分是2％至14％(重量比)、优选的是2％至8％、更优选的是3％至5％的乙氧基化的非离子表面活性剂。天然或合成的阳离子表面活性剂(在酸的基础上的)和非离子表面活性剂的重量比从1∶1至5∶1，优选的从2∶1至5∶1，更优选的从3∶1至4∶1。这能保证在空气/水的界面形成和吸收足够硬度的表面活性剂以便很好地除去脂/油污物。
可以选择的乙氧基化的阴离子表面活性剂具有分子式R1(OC2H4)nOH，其中R1是C10-C16的烷基基团或者C8-C12的烷基苯基基团，n从3至9，所说的离子表面活性剂具有从6至16的HLB(疏水-亲水平衡)，优选的具有10至13的HLB。这些表面活性剂在美国专利4,285,841和4,284,532中已有详细描述，尤其优选的是C12-C15的醇每摩尔与3至8摩尔的环氧乙烷的缩合产物，例如每摩尔C12-C13醇与大约6.5摩尔的环氧乙烷的缩合产物。要提到的其它非离子表面活性是APG、EGE和葡糖酰胺表面活性剂。
3.洗涤助洗剂
可以以常规量存在于本发明的洗涤剂组合物的常规洗涤组分如下：所述组合物可以是复配的或非复配的，并且其可以是0-P型(也就是不含有任何含磷助剂)。因此，组合物可以总共含有例如1-50％(重量)的一种或多种有机的和/或无机的助洗剂，如至少大约5％，通常多达30-40％。助洗剂典型的例子包括那些以上提到的物质，更广义一些包括碱金属正磷酸盐、焦磷酸盐、三磷酸盐、碱金属碳酸盐，单独的或与方解石、碱金属柠檬酸盐、碱金属次氮基三乙酸盐、羧甲基氧琥珀酸盐、沸石、聚乙缩醛羧酸盐等。
更具体地，本发明的组合物含有5％至20％(重量)、优选的为10％至15％的洗涤剂助洗剂，助洗剂可以是含有10-18个碳原子的脂肪酸和/或聚羧酸盐、沸石、聚膦酸盐和/或磷盐助洗剂。优选的是0-10％(更优选的是3％至10％)(重量)的含有12至14个碳原子的饱和脂肪酸和0-10％(优选的是2％-8％、更优选的是2％至5％)(重量)的聚羧酸盐(更优选柠檬酸)助洗剂，两者的重量比为1∶1至3∶1。
由于当助洗剂和水的硬度比接近于1时，相对于其它酶本文的蛋白水解酶似乎提供了最佳贮存稳定性，因此，组合物优选含有足够的助洗剂以便螯合每加仑2至10，优选的是3-8格令/加仑的硬度。
可以从天然来源，如植物或动物酯(例如棕榈核油、棕榈油或椰子油)或通过合成制备获得饱和脂肪酸(如通过石油的氧化或通过一氧化碳经Fisher Fropsoh方法的氢化作用)。用于本发明的合适的饱和脂肪酸的例子包括癸酸、月桂酸、十四烷酸、椰子和棕榈核脂肪酸。优选的是饱和的椰子脂肪酸；月桂酸和十四烷酸的5∶1至1∶1(优选的是大约3∶1)(重量)混合物；以上提到的脂肪酸和少量(如1％-30％总脂肪酸)油酸的混合物；和棕榈核脂肪酸。
而且本文的组合物优选含有在美国专利4,284,532中描述的聚羧酸盐、聚膦磷酸盐和聚磷酸盐助洗剂，水溶性的聚羧酸盐助洗剂(特别是柠蒙酸)在这一组中是优选的。合适的聚羧酸盐助洗剂包括各种氨基聚羧酸盐、环烷聚羧酸盐、醚聚羧酸盐、烷基聚羧酸盐、环氧聚羧酸盐、四氢呋喃聚羧酸盐、苯聚羧酸盐和多缩醛聚羧酸盐。
这样的聚羧酸盐助洗剂的例子包括：乙二胺四乙酸钠和钾；次氮基三乙酸钾和钠、植酸的水溶性盐(如美国专利1,739,942中公开的植酸钠和钾，在美国专利3,364,103中描述的聚羧酸盐物质)；聚羧酸盐聚合物的水溶性盐和在美国专利3,308,067中描述的共聚物。
其它有用的洗涤助剂包括具有以下结构和物理性状的聚合脂肪聚羧酸的水溶性盐：(a)以酸的形式计算，最小分子量大约为350；(b)以酸的形式计算，当量为50至80；(c)至少45摩尔百分比的单体具有由不多于2个碳原子相互分隔的至少2个羧基；(d)任何含羧基基团的聚合物链的连接位点，其与下一个含羧基基团连接位点被沿聚合物链的三个以下的碳原子隔开。这样的助洗剂的具体的例子是衣康酸、阿康酸、马来酸、中康酸、富马酸、亚甲丙二酸、柠康酸的聚合物和共聚物。
其它合适的聚羧酸盐助剂包括水溶性盐，特别是苯六羧酸、柠檬酸、焦苯六羧酸、苯五羧酸、氧化双乙酸、羧甲基氧琥珀酸、羧甲基氧丙二酸、顺环己烷六羧酸、顺环戊烷四羧酸和氧化双琥珀酸的钠和钾盐。
其它的聚羧酸盐是美国专利4,144,226和4,146,495中描述的聚缩醛羧酸盐。其它的洗涤助剂包括沸石，例如在美国专利4,405,483中描述的硅铝酸盐离子交换物质。
其它优选的助洗剂是通式为R CH(COOH)CH2(COOH)的物质，即琥珀酸的衍生物，其中的R是C10-C20(优选的是C12-C16)烷基或链烯基，或者其中的R可以用羟基、磺基、亚砜或砜取代基取代。这些琥珀酸盐助洗剂最好以它们水溶性盐的形式使用，包括钠、钾和烷醇铵盐。琥珀酸盐助洗剂的具体例子包括：十二烷基琥珀酸盐、十四烷基琥珀酸盐、十六烷基琥珀酸盐、2-十二碳烯基琥珀酸盐等。
4.蛋白水解酶
本发明的酶可以以已知的标准量用于洗涤剂组合物中。使用量的范围很大，例如大约每克洗涤剂组合物0.0002-0.1或大约0.005-0.05Anson单位。以另一种单位表示，所说的组合物中所包含的蛋白酶的量在每毫克洗涤剂制剂大约0.1至100 GU(例如1-50，特别是5-20GU/mg)的水平上，或者以大约0.01-4(例如每克洗涤剂制剂0.1-0.4)KNPU为中心的宽范围的量。
例如以每升洗涤液用大约0.25mg的蛋白酶(相当于每升0.08 KNPU水平的酶活性)来使用本发明的酶是合适的。相应的洗涤剂制剂可以含有例如0.1-0.4KNPU/g数量级的酶量。
以不同的方式表示，本发明的组合物含有大约0.01％至大约5％，优选的是大约0.1％至大约2％(重量)的本发明的蛋白水解酶。
包含在组合物中的所描述的蛋白水解酶优选地是每克组合物含有足以提供0.05至大约1.0，更优选的从0.1至0.75，最优选地从大约0.125至大约0.5mg的活性酶的量。
可以以任何方便的形式(如溶液、浆、LDP浆或晶体)向其它组分中加入所说的酶组分。
5.酶稳定系统
本发明的液体洗涤剂可以含有一种酶稳定系统，其包含钙离子、硼酸、丙二醇和/或短链羧酸。所说的酶稳定系统包含大约0.5％至大约15％(重量)的组合物。
优选地，每升组合物包含从大约0.01至大约50，优选地从大约0.1至大约30，更优选地从大约1至20毫摩尔的钙离子。应该选择钙离子水平，以便在与组合物中的助洗剂等混合后，对酶而言总有某些可利用的最小水平。可以使用任一水溶性钙盐作为钙离子源，其中包括氯化钙、甲酸钙、醋酸钙。在组合物中，也经常存在少量的钙离子(一般为0.05至0.4毫摩尔/升)，这是由于酶悬浮液和水中存在钙的缘故。大约0.03％至大约0.6％的甲酸钙是优选的。
第二种优选的酶稳定剂是只含有碳、氢和氧原子的多元醇。这些多元醇优选地含有2至6个碳原子和2至6个羟基。例子包括丙二醇(1，2-丙二醇是尤其优选的)、乙二醇、甘油、山梨醇、甘露糖醇和葡萄糖。多元醇一般以组合物重量的大约0.5％至15％、优选地大约1.5％至8％(重量)的量存在。优选地，多元醇和任何加入的硼酸的重量比为至少1，更优选地为至少1.3。
优选地，组合物也包含在美国专利4,318,818中描述的水溶性短链羧酸盐。甲酸盐是优选的，并且以组合物重量的大约0.05％至大约5％，优选地从大约0.2％至大约2％，最优选地从大约0.4％至1.5％(重量)的量使用。甲酸钠是优选的。
本文的组合物也可以包含或不包含大约0.25％至大约5％，更优选地从大约0.5％至大约3％量(重量)的硼酸。硼酸可以(但不是优选的)由在组合物中能够形成硼酸的化合物来形成。虽然其它化合物如含硼的氧化物、硼砂和其它碱金属硼酸盐(例如原硼酸钠、偏硼酸钠、焦硼酸钠和五硼酸盐)是合适的，但硼酸是优选的。取代的硼酸(如苯基硼酸、丁烷硼酸和对溴苯基硼酸)也可以取代硼酸。
6.水
本发明的液态组合物可以是含水的液体或不含水的液体。当是含水的液体时，其含有大约15％至大约60％，优选地含有大约25％至大约45％(重量)的水。可有可无的其它组分
A.辅助表面活性剂
可有可无的与上述的非离子表面活性剂一起使用的辅助表面活性剂包括下式的酰胺其中的R1是含有8至20个碳原子的烷基、羟烷基或链烯基基团，R2和R3选自由下列基团组成的组：氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、2-羟乙基、2-羟丙基、3-羟丙基，所说的基团还含有最多5个环氧乙烷单元，条件是R2和R3至少之一含有羟基基团。
优选的酰胺是C8-C20脂肪酸烷基醇酰胺，其中每个烷基醇基团含有1至3个碳原子，还可以含有多达2个的环氧乙烷单元。尤其优选的是C12-C16脂肪酸的一乙醇酰胺和二乙醇酰胺。
如果使用的话，酰胺优选的是以这样的水平存在，即使得上述的乙氧基非离子表面活性剂和酰胺表面活性剂的重量比达到4∶1至1∶4，优选的是3∶1至1∶3。
优选地并且可以任选地以0.15％至1％的水平使用的辅助表面活性剂是美国专利4,507,219中描述的季铵、胺和胺氧化物。
综上所述，C10-C14烷基三甲铵盐是优选的，例如癸烷基三甲铵甲基硫酸盐、十二烷基三甲铵氯化物、十四烷基三甲铵溴化物和椰子烷基三甲铵氯化物和甲基硫酸盐。大约0.2％至0.8％的一烷基三甲铵氯化物是优选的。
B.酒石酸盐丁二酸盐助洗剂
本文的组合物最好包含0至大约10％、优选的是0至大约6％(以酸为基础的重量)的酒石酸盐丁二酸盐助洗剂物质，这种物质选自由下列物质组成的组：
i)
Figure A9619373300381
其中的X是形成盐的阳离子；
Figure A9619373300382
其中的X是形成盐的阳离子；
iii)它们的混合物。
美国专利4,463,071中描述了这里使用的酒石酸盐丁二酸盐化合物。
C.中和系统
每100克组合物中也可以包含或不包含0至大约0.04摩尔，优选的是大约0.01至0.035摩尔，更优选的是大约0.015至大约0.03摩尔的烷醇胺，所说的烷醇胺选自由下列物质组成的组：一乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺和它们的混合物。低级烷醇胺，特别是一乙醇胺是优选的，以便增加产物的稳定性、洗涤性能和气味。然而，为了更好地和氯漂白剂兼容，应该最大限度地减少烷醇胺的量。
此外，组合物含有钠离子，优选的是钾离子，其水平足以平衡阴离子，并提供所需的产物pH。
D.泡沫抑制剂
另一种可有可无用于液体洗涤剂的组分是0至大约1.5％，优选的是大约0.5％至大约1.0％(重量)的以聚硅氧烷为基础的泡沫抑制剂。人们已经十分熟知聚硅氧烷，并且知道把它用作泡沫控制剂。例如，美国专利3,435,839涉及通过加入少量的聚二甲基硅氧烷液体使水溶液脱泡的组合物和方法。
例如，有用的控制泡沫的聚硅氧烷是如德国专利申请DOS2,124,52中描述的聚硅氧烷和硅烷化二氧化硅的混合物。
如在美国专利3,933,672和美国专利4,652,392中所述的通过使用聚硅氧烷去泡沫剂和抑泡沫剂不受洗涤剂表面活性剂的破坏，已经成功地把它们加入到粒状洗涤剂组合物中。
本文所使用的以聚硅氧烷为基础的优选的泡沫抑制剂是泡沫抑制量的泡沫抑制剂，其实质上含有下列物质：
i)在25℃具有大约20cs.至大约1500cs.粘度的聚二甲基硅氧烷液体；
ii)每100份(重量)(i)大约5至50份的聚硅氧烷树脂，这种硅氧烷树脂由比例为大约0.6∶1至大约1.2∶1的(CH3)3SiO1/2单位和SiO2单位组成。
iii)每100份(重量)(i)大约1至大约20份的固体硅胶。
“泡沫抑制量”的意思是组合物的配制人可以选择的把泡沫控制到所需程度的泡沫控制剂的量。控制泡沫的剂量随着选择的洗涤剂表面活性剂的变化而异。例如，和低泡沫表面活性剂相比，使用高泡沫表面活性剂，就应使用相对更多的泡沫控制剂以达到所需要的泡沫控制程度。
E.其它的酶
本发明的洗涤剂组合物也可以包含其它的酶。
例如，可以以带有载体物质的脂解酶的溶液或悬浮液的形式有用地加入脂酶(例如，EP专利公开号258,068(Novo Nordisk A/s))。
加入的脂酶量可以在大的范围内选择，例如每克表面活性剂体系或洗涤剂组合物中加入50至30,000LU/g，经常使用的是至少100LU/g，非常有用的是至少500LU/g，有时优选的是1000、2000LU/g以上或4000LU/g以上或者更多一些，因此经常在50-4000LU/g的范围内，并且尽可能地在200-1000LU/g范围内。在本说明书中，脂酶的单位是按照EP专利公开号258,068定义的。
可以在广泛的脂酶范围内选择脂解酶。特别地，以下专利说明书描述的脂酶：EP专利公开号214,761(Novo Nordisk A/S)、258,068，尤其是与抗Thermomyces lanuginosus ATCC 22070脂酶的抗血清表现出免疫交叉反应的脂酶；EP专利公开号205,208和206,390，尤其是与抗Chromobacterviscosum var lipolyticum NRRL B-3673脂酶或抗产碱菌属(Alcaligenes)PL-679、ATCC 31371和FERM-P 3783脂酶的抗血清表现出免疫交叉反应的脂酶；以及WO 87/00859的说明书(Gist-Brocades)和EP专利公开号204,284(Sappora Breweries)描述的脂酶。具体地说，以下市售的脂酯制剂是合适的：LipolaseNovo Nordisk A/S，Amano脂酶CE、P、B、AP、M-AP、AML和CES和Meito脂酶MY-30、OF和FL，以及EsteraseMM(Novo Nordisk A/S)、Lipozym、SP225、SP285，(均为NovoNordisk A/S产品)，Saiken脂酶，Enzeco脂酶，Toyo Jozo脂酶和Diosynth脂酶(商标)，Lumafast(Genencor公司)，Lipomax(Gist-Brocades N.V.)和WO 94/03578描述的脂酶(Unilever)。
如果需要，例如可以使用淀粉酶，使用的量为每克洗涤剂组合物中大约1至大约100MU(麦芽糖单位)(或0.014-1.4，例如0.07-0.7KNU/g(Novo单位))。例如，合适的淀粉酶是Termamyl和BAN(Novo Nordisk A/S)。需要时可以使用纤维素酶，使用的量为每克洗涤剂组合物中含有大约0.3至大约35CEVU单位。合适的纤维素酶例如Celluzyme和Carezyme(NovoNordisk A/S)。
本发明考虑使用的其它酶是氧化酶和过氧化物酶。
F.可有可无的其它组分
用于本发明的液体洗涤剂中的其它可有可无的组分包括污物排除剂、污物释放聚合物、抗再沉积剂如四亚乙基乙氧基戊胺(从大约0.5％至3％，优选地从大约1％至大约3％(重量))、泡沫调节物、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、粘土和水浮助剂(如异丙基苯磺酸钠)、遮光剂、抗氧化剂、杀菌剂、染色剂、芳香剂和本领域熟知的增白剂。这些任选的组分一般占组合物重量的大约15％以下，优选的是大约0.5％至10％，更优选的是大约1％至大约10％。
所说的组合物可以含有0％至大约8％、优选地从0％至大约5％(重量)的C12-C14链烯基琥珀酸或它的盐。这些物质的通式为RCH(COOX)CH2(COOX)，其中的R是C12-C14链烯基基团，每个X是H或合适的阳离子，例如钠、钾、铵或者烷醇铵(例如一、二、三乙醇胺)。
具体的例子是2-十二碳烯基琥珀酸盐(优选的)和2-十四碳烯基琥珀酸盐。
本发明的组合物任选地含有大约0.1％至大约1％，优选的是大约0.2％至大约0.6％(重量)的乙二胺四亚甲基膦酸、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸、乙二胺四乙酸(优选的)或二亚乙基三胺五乙酸(最优选的)的水溶性盐，以便在预处理织物时提高洗涤性能。
并且，洗涤剂组合物可以含有1-35％的漂白剂或漂白剂前体或者含有漂白剂和/或带有自身激活物的前体的体系。
还可以任选的组分是泡沫促进剂、抗腐蚀剂、污物悬浮剂、螯合剂和抗污物再沉积剂等。
本发明组合物优选含有至多约10％的乙醇。
6.其它性质
在20℃10％(重量)的本发明组合物的水溶液中，其通常具有大约7.0至9.0的pH，优选地从8.0至8.5的pH。
本发明的组合物也具有小于或等于200ppm的临界胶束浓度(CMC)，而且35℃时在高于CMC的蒸馏水中，空气/水界面的张力小于或等于32，优选地小于或等于30达因/厘米。在“界面张力和表面张力的测量-实践者的一般评述”C.Weser，GIT Fachzeitschrift fur das Laboratorium，24(1980)642-648和734-742，FIT Verlag Ernst Giebeler，Darmstad，和＂界面现象-平衡和动力效应＂，C.A.Miller和P.Neogi，第1章，pp.29-36(1985)(Marcel Dekker公司，New York.)中描述了这种测量方法。
本发明的组合物也可以用于洗涤纺织材料，尤其是(但不限于)棉以及以聚酯为基础的纺织品及它们的混合物。例如在大约60-65℃或更低温度(如大约30-35℃或更低一些)下进行的洗涤过程是特别合适的。如果必须的话，虽然能使用低一些或高一些的浓度，但在洗涤液体中使用足以提供大约0.4-0.8g/L的表面活性剂的组合物比例是合适的。在没有限制时，当制剂基本上是如实施例中的制剂时，例如可以提出使用比例为洗涤制剂大约1至10g/l，如为大约3-6g/l是合适的。
在这一方面本发明尤其涉及：
a)一种配制成含水的洗涤液的洗涤剂组合物，其包含阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、湿润剂、有机酸、苛性碱，其pH值调整为9至10。
b)一种配制成不含水的洗涤液的洗涤剂组合物，其包含液态的非离子表面活性剂(实质上由线性的烷氧基化伯醇组成、甘油三乙酸酯、三磷酸钠、苛性碱、过硼酸盐一水合物漂白前体和叔胺漂白激活物，其pH值调整为大约9和10之间。
c)一种配制的酶液体洗涤剂组合物，当以相当于0.4-0.8g/l表面活性剂的比例使用时，其能给洗涤液提供9或更低的pH值。
d)一种配制的酶液体洗涤剂组合物，当以相当于0.4-0.8g/l表面活性剂的比例使用时，其能给洗涤液提供8.5或更高的pH值。
e)一种配制的酶液体洗涤剂组合物，当以相当于0.40.8g/l表面活性剂的比例使用时，其能给洗涤液提供0.03或更低(例如0.02或更低)的离子强度。
f)一种配制的酶液体洗涤剂组合物，当以相当于0.4-0.8g/l表面活性剂的比例使用时，其能给洗涤液提供0.01或更高(例如0.02或更高)的离子强度。
发现本发明的枯草酶变体可以加入到以条状、片状、棒状和以类似的方式直接应用到织物、硬表面或其它任何表面上的洗涤剂组合物中。具体地说，它们可以加入到条状形式的肥皂或肥皂/合成组合物中，在这些物质中，它们表现出较好的酶稳定性。南非专利93/7274描述了直接应用的条状、片状、棒状和其它形式的洗涤剂组合物(本文一并参考)。
因此，除了枯草酶变体，本发明优选的条状洗涤剂组合物包含：
i)25-80％，更优选的是25至70％(重量)的活性洗涤剂(以无水的形式计)，这种活性洗涤剂是肥皂或肥皂与合成活性洗涤剂的混合物；
ii)0％至50％，更优选的是10％至30％(重量)的水；
iii)0至35％，更优选的是0.1至30％(重量)的填充物。
一般地，包含在本发明的组合物中的枯草酶变体的量是相当于0.1至100GU/mg组合物，优选的是0.5至20GU/mg，更优选的是1.0至10GU/mg的蛋白酶解活性的量，其中的GU/mg是甘氨酸单位/毫克。在枯草酶基因中产生突变的方法
许多把突变引入基因的方法在本领域是已知的。在有关克隆枯草酶基因的简短讨论后，将讨论在枯草酶基因的随机位点和特定位点产生突变的方法。克隆枯草酶基因
可以通过各种本领域公知的方法从表1所示的任何生物体中克隆编码枯草酶的基因，尤其是利用革兰氏阳性细菌或真菌。首先必须利用能产生所要研究的枯草酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组和/或cDNA的DNA文库。然后，如果枯草酶的氨基酸序列是已知的，可以合成同源的标记的寡核苷酸探针，并利用它们从细菌DNA基因组文库或cDNA文库鉴定编码枯草酶的克隆。另外，含有另一种细菌或生物体菌株枯草酶的同源序列的标记寡核苷酸探针可以在较低严格度的杂交和洗涤条件下作为鉴别编码枯草酶克隆的探针。
目前，另一种用于鉴定产生枯草酶的克隆的方法包括：将基因组DNA片段插入到表达载体(如一种质粒)中；用得到的基因组DNA文库转化蛋白酶阴性细菌，然后将转化的细菌在含有枯草酶底物(如脱脂奶)的琼脂上接种。由于排出的枯草酶对脱脂奶的消化，那些包含带有枯草酶的质粒的细菌将产生由清晰的琼脂晕圈围绕的菌落。枯草酶基因中随机突变的产生
一旦将枯草酶基因克隆到适合载体(例如质粒)中，就可以利用几种方法在基因中引入随机突变。
一种方法是将克隆的枯草酶基因作为可回收载体的一部分掺入到大肠杆菌的突变菌株上。
另一个方法包括产生枯草酶基因的一种单链形式，然后将含有此枯草酶基因的DNA片段和另一个DNA片段退火，这样枯草酶基因的一部分仍然是单链。然后可以将所说的不连续的单链区暴露在众多诱变剂的任何一种中，这些诱变剂包括但不限于：亚硫酸氢钠、羟胺、亚硝酸、蚁酸或肼苯哒嗪。Shortle和Nathans描述了将这种方法用于产生随机突变的特定例子(1978，美国科学院学报，75 2170-2174)。根据Shortle和Nathans的方法，将携带枯草酶基因的质粒用在此基因内切割的限制酶切口。利用DNA聚合酶I的外切核酸酶作用将此切口扩展成缺口。然后利用以上提及的任何一种诱变剂诱变所形成的单链缺口。另外，可以将芽孢杆菌属的各个种的包括天然启动子和其它控制序列的枯草杆菌蛋白酶基因克隆到这样一种载体中，这种载体包含大肠杆菌和枯草杆菌的复制子、可选择的表型标记、在辅助噬菌体IR1重复感染的基础上用于产生单链质粒DNA的M13复制起点。分离包含克隆的枯草杆菌蛋白酶基因的单链质粒DNA，并与包含非枯草杆菌蛋白酶基因编码区的载体序列的DNA片段退火，结果形成有缺口的双螺旋分子。利用亚硫酸氢钠、亚硝酸或蚁酸，或者通过如上所述在大肠杆菌突变体菌株中进行复制而将突变引入到枯草杆菌蛋白酶基因中。因为亚硫酸氢钠专一地与单链DNA中的胞嘧啶反应，所以以这种诱变剂产生的突变只限制在编码区。在不同的实验中变化反应时间和亚硫酸氢钠浓度，这样在每个枯草杆菌蛋白酶基因上平均产生一至五个突变。将10毫克的缺口双螺旋DNA在4M亚硫酸氢钠(pH6.0)中，37℃下温育9分钟，反应体积为400毫升，结果使单链区的大约1％的胞嘧啶脱去氨基。成熟的枯草杆菌蛋白酶的编码区包含大约200个胞嘧啶，取决于所说的DNA链。有利的是，反应时间在大约4分钟(产生约200分之1的突变频率)到大约20分钟(约200分之5)之间变化。
诱变后，体外利用DNA聚合酶I(克列诺片段)处理缺口分子，以便获得完全的双链分子并固定突变。然后利用突变的DNA转化感受态的大肠杆菌，以便产生突变枯草杆菌蛋白酶扩增文库。也可以通过在大肠杆菌Mut D菌株中繁殖所说的质粒DNA来产生扩增突变体文库，由于它的错误作用于DNA聚合酶，这种文库增加了突变的范围。
也可以利用诱变剂亚硝酸和蚁酸产生突变体文库。因为这些化学药品与亚硫酸氢钠不同，对于单链DNA不是特定的，所以按照下列方法进行诱变反应。在M13噬菌体中通过标准方法克隆枯草杆菌蛋白酶基因的编码部分，并制备单链噬菌体DNA。然后使单链DNA与1M亚硝酸(pH4.3)在23℃下反应15-60分钟，或者与2.4M的蚁酸在23℃下反应1-5分钟。这些范围的反应时间产生千分之一至千分之五的突变频率。在诱变之后，将通用引物与M13 DNA退火，利用诱变的单链DNA作为模板合成双螺旋DNA，这样枯草杆菌蛋白酶基因的编码部分成为完全双链。因此可以利用限制酶从M13载体上切割编码区，并将其连接到非诱变的表达载体上，这样突变仅在限制片段中发生(Myers等，科学229 242-257(1985))。枯草酶基因中点突变的产生
一旦克隆了枯草酶基因，鉴定了所需突变位点，并确定了取代原来残基的残基，就可以利用合成的寡核苷酸引进这些突变。这些寡核苷酸包含位于所需突变位点两侧的核苷酸序列；在寡核苷酸合成期间插入了突变体核苷酸。在更为理想的方法中，在含有枯草酶基因的载体中产生DNA的单链缺口(桥连枯草酶基因)。然后将含有所期望突变的合成核苷酸与所说的单链DNA的同源部分退火。然后通过DNA聚合酶I(克列诺片段)填补余下的缺口，并利用T4连接酶连接构建体。Morinaga等描述了此方法的具体例子(1984，生物技术2 646-639)。按照Morinaga等的方法，利用限制性核酸内切酶除去基因中的片段。然后使此时含有缺口的载体/基因变性，并与一个不含有缺口的，由另一个限制性核酸内切酶在所说的缺口区外的位点上切割的载体/基因杂交。然后可以得到用于与突变的寡核苷酸杂交的所说的基因的单链区，通过DNA聚合酶I的克列诺片段填补余下的缺口，由T4DNA连接酶连接所说的插入物，并且在一个复制循环后，产生含有期望突变的双链质粒。Morinaga方法排除了构建新的限制位点的额外操作，并且有助于在多位点产生突变。在Estell等的美国再公告专利34,606(1994年5月10日发布)中，通过将所说的盒进行较少的改变能够引进含有多个突变的寡核苷酸，而利用Morinaga的方法在任何时间都可以引进更多的突变，这是因为可以引进多种不同长度的寡核苷酸。枯草酶突变体的表达
按照本发明，通过上文描述的方法或本领域任何已知的其它方法产生的突变的枯草酶基因可以在表达载体中以酶的形式表达。因为表达载体通常包含典型的克隆载体的组分(即一种在微生物中使得所说的载体能够独立于这种微生物的基因组而进行自主复制的元件)和用于选择目的的一种或多种表型标记，所述表达载体一般落在克隆载体的定义范围内。表达载体包括编码启动子的控制序列、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号、及可以包含也可以不包含阻遏物基因或者各种激活物基因。为了分泌表达的蛋白，可以在所说的基因的编码序列前插入编码“信号序列”的核苷酸。为了在控制序列的指导下进行表达，可操作地将按照本发明处理的靶基因与合适读框中的控制序列连接。可以组合在质粒载体中的并且能够支持突变枯草酶基因转录的启动子序列包括但不限于原核生物β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff，等(1978)美国科学院学报75 3727-3731)和tac启动子(DeBoer，等(1983)美国科学院学报80 21-25)。从“来自重组细菌的有用蛋白质”(Seientific American(1980)242 74-94)中可以找到其它的参考文献。
按照一个实施方案，通过含有突变的DNA的表达载体转化枯草杆菌。如果表达将发生在一种分泌微生物(如枯草杆菌)中，信号序列就可以在翻译起始信号之后，而在目标DNA序列之前。信号序列的作用是将表达产物运输到细胞壁，在此通过分泌从所说的产物中切除信号序列。上文限定的术语＂控制序列＂意欲包括信号序列(当其存在时)。
也考虑了技术人员已知的其它宿主系统用于本发明蛋白酶变体的表达和产生。这些宿主系统包括真菌(包括丝状真菌)、植物、鸟类和哺乳动物细胞等。
                    材料和方法菌株：
枯草杆菌309和147是迟缓芽孢杆菌的变体，保藏在NCIB，保藏号为NCIB 10309和10147，并且在美国专利3,723,250(本文一并参考)中有描述。
大肠杆菌MC 1000(M.J.Casadaban和S.N.Cohen(1980)；分子生物学杂志138 179-207)由常规方法制成r-，m+，在美国专利申请039,298中有此大肠杆菌的描述。蛋白酶解活性
在本发明中以Kilo NOVO蛋白酶单位(KNPU)表示蛋白酶解活性。相对于酶标准物(SAVINASE)确定所说的活性，并且这种测定是以在标准条件(即50℃，pH 8.3，9分钟反应时间，3分钟测量时间)下所说的蛋白酶对二甲基酪蛋白(DMC)溶液的消化作用为基础的。可以向Novo Nordisk A/S(丹麦)索取卷宗220/1，因此参考文献包括了所说的卷宗。
GU是甘氨酸单位，限定为蛋白酶解酶活性，即在标准条件下，在40℃中经过15分钟温育，以N-乙酰酪蛋白作为底物，产生相当于1毫摩尔甘氨酸的NH2基的量。
也可以利用PNA测定，按照与可溶底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯酚的反应测量酶活性，在美国石油化学家协会杂志，Rothgeb，T.M.，Goodlander，B.D.，Garrison，P.H.，和Smith，L.A.，(1988)描述了这种方法。
                         实施例
用与WO 89/06279(Novo Nordisk A/S)；EP 130,756(Genentech)；EP 479,870(Novo Nordisk A/S)；EP 214,435(Henkel)；WO 87/04461(Amgen)；WO 87/05050(Genex)；EP申请87303761(Genentech)；EP260,105(Genencor)；WO 88/06624(Gist-Brocades NV)；WO 88/07578(Genentech)；WO 88/08028(Genex)；WO 88/08033(Amgen)；WO 88/08164(Genex)；Thomas等(1985)自然，318 375-376；Thomas等(1987)分子生物学杂志，193，803-813；Russel和Fersht(1987)自然328 496-500中描述的同样的材料和方法产生按照本发明的酶变体。也可以采用本领域已成熟的其它方法。
                          实施例1酶变体的构建和表达
构建了适合于编码枯草酶309和其突变体的合成基因的载体。其实质上是pUC 19质粒[Yanish-Perron和Messing(1985)基因；33 103-119]，其中已由一个接头取代了多克隆位点，这种接头含有用于分离组成此基因的5个亚片段的限制位点。将这种新的接头插入到EcoRI-HindIII切割的pUC19中，进而破坏了这些位点。WO 92/19729的25-26页和其图1(图1/7-7/7)描述了此构建的细节，因此其内容包括在这里作为参考。
每个亚片段由6至12寡核苷酸组成。在自动DNA合成仪上利用氨基亚磷酸酯化学在控制的玻璃支持物上合成这些寡核苷酸[Beaucage和Carruthers(1981)；四面体通讯(Tetrahedron Letters)22 1859-1869]。
在2％琼脂糖凝胶上分离五个亚片段，并将其插入到pSX191中。通过双脱氧核苷酸测序法证实所说的序列。分离了片段A-E，并与KpnI-BamHI切割的pSX191连接在一起。利用连接混合物转化感受态大肠杆菌MC1000r-，m+，进行氨苄青霉素抗性选择。然后用850 bp KpnI-BamHI片段(此片段组成了编码所说酶的成熟部分的枯草杆菌蛋白酶309基因的部分)取代pSX212中的野生型基因，产生pSX222，将该质粒转化进感受态枯草杆菌菌株中。在转化的菌株发酵和所说的酶纯化后，所得的产物和野生型产物无法区别。
通过利用在需要突变的位置上具有改变的序列的寡核苷酸(如具有下文给出的序列)，并将它们和适于合成基因的其它寡核苷酸混合来制备来源于合成基因的蛋白酶变体。利用变体材料以不类似于以上所述的方式进行所说的变体基因的装配。在Agarval等(1970)；自然；227 27-34中可以获得有关合成基因的其它信息。
将KpnI位点引入到编码此酶成熟部分的枯草酶309合成基因的起点处。所用的方法称为寡核苷酸引导的双链断裂修复诱变法，Mandecki(1986)在美国科学院学报83 7177-7181中描述了这种方法。由NcoI在枯草酶309基因成熟部分的起点处切开pSX172，并与寡核苷酸NOR 789混合(参见92/19729)，加热到100℃，冷却到0℃，并转化大肠杆菌。再转化后，利用32-P-标记的NOR 789通过菌落杂交筛选重组体。在筛选期间证明是阳性的重组体具有通过改变两个碱基而不改变氨基酸序列正好引入在NcoI前的KpnI位点。EP专利公开号405 901描述了pSX172。将如此产生的KpnI位点以400-bp PvnI-NheI片段插入到pSX120中，产生pSX212。在EP专利公开号405 901中也描述了pSX120。
将合成基因插入到pSX212的KpnI和BamHI之间，产生pSX222。
寡核苷酸的突变和相应序列的例子如下：R170L(片段D1)
5′-AATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCGCTCTAT-3′
        ||||||||||||||||||||||||||||||*||||
   5′- GTCCACGTCCGAGTTAGTCGATAGGCCGCGAGATACGCTTG-3′R170I(片段D1)
5′-AATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCGATCTAT-3′
        |||||||||||||||||||||||||||||**||||
    5′-GTCCACGTCCGAGTTAGTCGATAGGCCGCTAGATACGCTTG-3′S57P片段(B1)
5′-AGCTTTGTACCAGGGGAACCGCCGACTCAAGATGGG-3′
        |||||||||||||||||*||||||||||||||
    3′-AACATGGTCCCCTTGGCGGCTGAGTTCTACCCTTACCC-5′
这些寡核苷酸与没有改变的合成基因的其余寡核苷酸组合。
                         实施例2酶变体的纯化
此方法涉及10升体积的枯草杆菌蛋白酶147酶、枯草杆菌蛋白酶309酶或者它们的变体的发酵液的纯化。
将大约8升发酵液在1升烧杯中以5000rpm离心35分钟。用10％醋酸将上清液调至pH6.5，并在Seitz Supra S100过滤平板上过滤。
利用装备有Amicon S1Y10 UF柱体的Amicon CH2A UF装置浓缩滤液至大约400毫升。在室温下吸附到杆菌肽亲和柱(pH7)上之前，离心并过滤UF浓缩液。在室温下用25％2-丙醇和1M氯化钠缓冲液(由0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化钙调至pH7)从杆菌肽柱中洗脱蛋白酶。
将从杆菌肽纯化步骤中得到的具有蛋白酶活性的流份合并，并加到750毫升Sephadex G25柱上(直径5cm)，此柱用含有0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙的缓冲液(调至pH6.5)平衡过。
合并由Sephadex G25柱中得到的具有蛋白酶解活性的流份，并将其加到150毫升CM Sepharose CL 6B阳离子交换柱(直径5厘米)，此柱用含有0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙的缓冲液(调至pH6.5)平衡过。
用在2升同样的缓冲液中的0-0.1M氯化钠线性梯度(对于枯草杆菌蛋白酶147使用0-0.2M氯化钠)洗脱蛋白酶。
在最后的纯化步骤中，将从CM Sepharose柱中得到的含有蛋白酶的流份合并，并在装备有GR81PP膜(来自丹麦食糖工厂公司)的Amicon超滤池中浓缩。
通过利用实施例1的构建技术和上述分离方法，产生和分离了下列枯草杆菌蛋白酶309变体：A：    G159IB：    S164IC：    Y167ID：    R170IE：    R170LF：    R170MG：    R170FH：    G195FI：    S57P+R170LJ：    R170L+N218SK：    S57P+R170L+N218SL：    R170L+N218S+M222AM：    S57P+R170L+S188P+A194PN：    Y167I+R170LO：    S57P+R170L+Q206EP：    R170L+Q206EQ：    Y167I+R170L+Q206ER：    Y167I+R170L+A194PS：    Y167I+R170L+N218ST：    Y167I+R170L+A194P+N218SU：    Y167I+Y171IV：    R170GW：    R170CX：    Y171IY：    Y167I+R170L+N218S
                          实施例3含有酶变体的洗涤剂组合物的稳定性
实施例D1：
配制含有下列组分的按照本发明的一个实施方案的含水(各向同性的)洗涤液：
组分      ％
NaLAS     8.0
Neodol 25-9     8.0
AES25-3S     14.0
柠檬酸钠·2H2O     5.0
丙二醇     5.0
山梨醇     4.5
F-染料Tinopal UNPA-GX     0.15
Lytron614遮光剂     0.03
Kathon防腐剂     0.0003
酸性蓝80     0.00117
酸性紫48     0.0033
SAVINASE16L     0.25
LIPOLASE100L     0.70
香味剂     0.15
水 加足至100.0
将pH调至7.1。表III含有BLS309变体S57P+R170L+N218S的实施例D1在37℃贮存后的残留酶活性(以原有活性的百分比表示)
贮存时间(天)     野生型     S57P+R170L+N218S
   0               100            100
   3               44             74
   7               11             50
   10              5              36
   14              7              27
从表III可以很明显地看出，在这种类型洗涤剂中变体S57P+R170L+N218S显示出显著改善的稳定性。此外，变体S57P+R170L+N218S与脂酶具有极好的相容性。表IV含有BLS309变体S57P+R170L+N218S和LIPOLASE的实施例D1在37℃贮存后的残留脂酶活性(以原有活性的百分比表示)贮存时间(天)LIPOLASE加：    野生型      S57P+R170L+N218S
0              100              100
3              38               67
7              24               44
  10        22         33
  14        21         27
从上表IV明显地看出，除了蛋白酶的稳定性外，蛋白酶的相容性也得到改善。
实施例D2：
利用由4.9mol/mol环氧乙烷和2.7mol/mol环氧丙烷烷氧基化的38.5％C13-C15线性伯醇、5％甘油三乙酸酯、30％三磷酸钠、4％小苏打灰、包含少量氧化硼酸盐的15.5％过硼酸钠一水合物、4％TAED、0.25％EDTA(其1％为膦酸)、0.6％二氧化硅气凝胶、1％SCMC和0.6％蛋白酶配制按照本发明一个实施方案的不含水的洗涤液。将pH调至9-10之间，例如大约9.8。
实施例D3：
复配液体洗涤剂除含本文所描述的蛋白酶之外，例如可以包含2-15％非离子表面活性剂、5-40％总表面活性剂(包含非离子和可有可无的阴离子表面活性剂)、5-35％包含磷酸盐或者非磷酸盐的助洗剂、0.2-0.8％聚合物增稠剂(如分子量超过106的交联丙烯酸聚合物)、至少10％硅酸钠(例如中性水玻璃)，用碱(例如含钾的碱)调整至所需的pH，优选的是9-10或更高(如pH11)，并且阳离子钠和阴离子硅酸盐(以游离二氧化硅计)的(重量)比小于0.7∶1，粘度为0.3-30 Pas(20℃和203-1)。
合适的例子包含大约5％的非离子表面活性剂C13-15醇(由每摩尔大约5个EO基团和每摩尔大约2.7个PO基团烷氧基化)、15-23％的中性水玻璃(二氧化硅和氧化钠之间的重量比为3.5)、13-19％的KOH、8-23％的STPP、0-11％的碳酸钠、0.5％的Carbopol 941(TM)。
蛋白酶可以以例如0.5％的量掺合。
实施例D4：
(解耦聚合物液体)Priolene 6907                              4.5KOH                                        10乙氧基化醇.7EO(SynperonicA7)               4.5乙氧基化醇.3EO(SynperonicA3)               4.5沸石4A                                     15荧光剂Tinopal CBS-X                           0.08Narlex DC1                                    1柠檬酸                                        8.23防泡剂聚硅氧烷DB100                           0.3LAS酸                                         16.5香味剂                                        0.5加水至                                        100表V含有BLS309的R170L变体的实施例D4在37℃贮存后的残留酶活性(以原有活性的百分比表示)贮存时间(天)          R170L            野生型
0                   100               100
2                   98                73
4                   96                66
10                  94                46
33                  87                8
81                  78                2.1
101                 71                0
从表V明显地看出，R170L变体在这种类型洗涤剂中显示出显著改善的稳定性。
表VI
贮存(天)  酶   WT   R170M   S57P+R170L+Q206E  Y167I+R170L+N218S
    0  100     100     100     100
    0.1  90.2     78     97     94
    1    58     53     95     68
    2    40     34     87     55
    5    16     27     75     29
    6    12     22     73     24
    8     8     19     77     17
    14     2     11     52     4
从表VI可以看出，在这种类型洗涤剂中，所实验的变体与野生型相比，显示出提高的稳定性。
实施例D5：
(解耦聚合物液体)Priolene 6907                           4.5KOH                                     10乙氧基化醇.7EO(SynperonicA7)            4.5乙氧基化醇.3EO(SynperonicA3)            4.5沸石4A                                  15荧光剂Tinopal CBS-X                     0.08Narlex DC1                              1柠檬酸                                  8.23防泡剂聚硅氧烷DB100                     0.3LAS酸                                   16.5Lipolase100L                         0.6香味剂                                  0.5加水至                                  100表VII含有BLS309变体S57P+R170L+N218S的实施例D5在37℃贮存后的残留酶活性(以原有活性的百分比表示)贮存时间       残留的蛋白酶活性      残留的脂酶活性(天)  S57P+R170L+N218S  野生型  R170L  S57P+R170L+N218S
0            100       100    100        100
2             -         27     41         94
5             97         9     15         76
8             87         4      7         71
12            91       2.4     12         78
  28          100           2.4     12         70
从表VII明显地看出，在这种类型洗涤剂中变体S57P+R170L+N218S显示出显著改善的稳定性。此外，变体S57P+R170L+N218S与脂酶具有极好的相容性。
实施例D6：
产生包含49.7wt.80/20牛羊脂/椰子肥皂、49.0％水、20％柠檬酸钠、1.0％柠檬酸和0.031％蛋白酶的肥皂条。制备后，将肥皂条贮存在环境温度下，一定时间后，取出样品并测量其蛋白酶活性。下表给出稳定性数据：
表VIII
  贮存(天) 酶   WT    R170L   R170L+N218S+S57P   R170L+Y167I
    0    100     100     100     100
    1     50     100     97     94
    2     25     91     100     83
    3     -     100     94     80
    6     -     98     89     90
    10     0     100     94     71
    17     -     93     80     73
    27     -     95     86     70
从上表明显地看出，在这种类型洗涤剂中枯草酶变体R170L，R170L+N218S+S57P和R170L+Y167I显示出显著改善的稳定性。
实施例D7：
产生包含63.88％80/20牛羊脂/椰子肥皂、1％椰子脂肪酸、25.1％水、10％钠柠檬酸和0.021％蛋白酶的肥皂条。将该洗衣肥皂条在37℃贮存，一定时间后，取出样品并测量其蛋白酶活性。表IX，稳定性数据
贮存(天)   酶     WT   R170L+N218S+S57P
    0     100      100
    10     10     90.1
    14     -     81.5
    20     0     91.4
    31     -     72.8
    35     -     79
    45     -     78
从上表明显地看出，在这种类型洗涤剂中枯草酶变体R170L+N218S+S57P显示出显著改善的稳定性。
                       实施例4包含酶变体的洗涤剂组合物的洗涤性能
下列例子提供了在所指出的实验条件下进行的大量洗涤实验的结果。实验条件表X：用于评价枯草杆菌蛋白酶309变体的实验条件
洗涤剂 蛋白酶型洗涤剂′95
洗涤剂量 3g/l
pH 9.5
洗涤时间 15分钟
温度 15℃
水硬度 9°dH～1.61 mM Ca2+/Mg2+
酶 下文所列的枯草杆菌蛋白酶309变体
酶浓度 0；0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，2.0，3.0mg/l
实验系统 带有搅拌杆的150毫升烧杯
布料/体积 5块布料(φ2.5cm)/50毫升洗涤剂溶液
布料 草汁弄脏的棉布
洗涤后，布料在自来水下冲洗并风干。
上述类型的洗涤剂是一种简单洗涤剂制剂。其最典型的特征是使用了STP作为助洗剂，并且阴离子表面活性剂(LAS)的含量很高。另外，pH被调至9.5，对于粉沫洗涤剂来说，这种pH是较低的。表XI此类型洗涤剂的组分如下：25％      STP(Na5P3O10)25％      Na2SO410％      Na2CO320％      LAS(Nansa 80S)5％       NI(Dobanol 25-7)5％       Na2Si2O50.5％     羧甲基纤维素(CMC)9.5％     水剂量：3g/lpH调至9.5
在460nm用Elrepho 2000光度计(没有UV)完成了实验材料的反射(remission)(R)测定。测定值用于下式： ΔR = a · Δ R max · c Δ R max + a · c 通过利用曲线的初始斜率计算改善因子： IF = a a ref
DR是以反射单位表示的酶的洗涤效果。
a     是适配曲线的初始斜率(c0)。
arer 是参考酶的初始斜率。
c     是以毫克/升表示的酶浓度。
DRmax 是以反射单位表示的酶的洗涤效果的理论最大值(cY)。表XII：枯草杆菌蛋白酶309的变体和改善因子
    名称     变体     IF
  S003*   R170Y    2.8
  S004*   R170Y+G195E    2.6
  S012*   R170Y+G195E+K251E    1.6
    G     R170F     3.3
    E     R170L     3.8
    F     R170M     2.4
    D     R170I     4.1
    I     S57P+R170L     3.9
    J     R170L+N218S     1.6
    K     S57P+R170L+N218S     2.3
    N     Y167I+R170L     6.2
    P     R170L+Q206E     2.6
    V     R170G     2.0
    W     R170C     3.4
    O     S57P+R170L+Q206E     2.9
    Q     Y167I+R170L+Q206E     2.4
    R     Y167I+R170L+A194P     5.1
    X     Y171I     1.2
    Y     Y167I+R170L+N218S     4.0
    T     Y167I+R170I+A194P+N218S     3.6
*WO 91/00345中描述的
从表XII可以看出，本发明所有的枯草杆菌蛋白酶309变体在洗涤性能方面都有改善。表XIII：如实施例D4所描述的洗涤剂中的枯草杆菌蛋白酶309的变体和改善因子
  名称     变体     IF
    S003*     R170Y     1.5
    F     R170M     1.2
    O     S57P+R170L+Q206E     5.0
    X     Y171I     4.2
    R     Y167I+R170L+A194P     1.2
    T     Y167I+R170L+A194P+N218S     2.0
    Y     Y167I+R170L+N218S     2.3
*WO 91/00345中描述的
从表XIII可以看出，本发明所有的枯草杆菌蛋白酶309变体在洗涤性能方面都有改善。

Claims (26)

1.一种在洗涤剂中具有改善的贮存稳定性和改善的性能的枯草杆菌蛋白酶变体，其中位于亲本枯草酶疏水区中或者其邻近区中的一个或多个氨基酸残基已由一种比原来的残基更为疏水的氨基酸所取代，所说的疏水区包括相应于BLS309(按BASBPN编号)的残基P129、P1 31、1165、Y167、Y171的残基，所说的疏水区邻近区中的残基包括相应于BLS309(按BASBPN编号)的残基E136、G159、S164、R170、A194和G195的残基，但BABP92的R170M、R170I和R170V变体和BLS309的R170Y变体除外。
2.权利要求1的变体，其中所说的变体在液态洗涤剂中显示出改善的稳定性。
3.权利要求1的变体，其中所说的变体在成形的固体形式的洗涤剂中显示出改善的稳定性。
4.权利要求1的变体，其中所说的变体表现出改善的洗涤性能。
5.权利要求1至4任一之变体，其中所说的原来的氨基酸残基被增加其疏水性的任何其它氨基酸残基所取代，这里被取代的残基优选地选自包括Val(v)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)和Trp(W)的组，特别是Val、Ile或Leu。
6.权利要求1至5任一之变体，其中所说的亲本枯草酶选自I-S1亚组。
7.权利要求6的变体，其中所说的亲本枯草酶选自包括ABSS168、BASBPN、BSSDY和BLSCAR的组。
8.权利要求1至5任一之变体，其中所说的亲本枯草酶选自I-S2亚组。
9.权利要求8的变体，其中所说的亲本枯草酶选自包括BLS147、BLS309、BAPB92和BYSYAB的组。
10.权利要求8的变体，其中所说的的亲本枯草酶是TVTHER。
11.权利要求1至10任一之变体，其中所说的取代与任何其它位置的取代、插入或缺失相结合。
12.权利要求11的变体，其中所说的取代与36、222、218、76任一位置上的取代、插入或缺失相结合。
13.权利要求1至12任一之变体，其可以是下列任一变体：
T129V，T129I，T129L，T129M，T129F
A129V，A129I，A129L，A129M，A129F
G131V，G131I，G131L，G131M，G131F
K136V，K136I，K136L，K136M，K136F，
S159V，S159I，S159L，S159M，S159F，
T164V，T164I，T164L，T164M，T164F，
K170V，K170I，K170L，K170M，K170F，
Q136V，Q136I，Q136L，Q136M，Q136F，
T159V，T159I，T159L，T159M，T159F，
A164V，A164I，A164L，A164M，A164F，
Y170V，Y170I，Y170L，Y170M，Y170F，
Y171A，Y171H，Y171N，Y171P，Y171C，Y171W，
Y171Q，Y171S，Y171T，Y171G
Y171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171F
S194V，S194I，S194L，S194M，S194F，
E136V，E136I，E136L，E136M，E136F，
G159V，G159I，G159L，G159M，G159F，
G164V，G164I，G164L，G164M，G164F，
S164V，S164I，S164L，S164M，S164F，
Y167A，Y167H，Y167N，Y167P，Y167C，Y167W，
Y167Q，Y167S，Y167T，Y167G
Y167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167F
R170A，R170H，R170N，R170P，R170C，R170W
R170Q，R170S，R170T，R170Y，R170G
R170V，R170I，R170L，R170M，R170F，
A194V，A194I，A194L，A194M，A194F，
P194V，P194I，P194L，P194M，P194F，
E195V，E195I，E195L，E195M，E195F，
G195V，G195I，G195L，G195M，G195F，
14.权利要求1至13任一之变体，其中所说的变体进一步地与下列一个或多个位置上的取代、缺失和/或插入相结合：27、36、57、76、97、101、104、120、123、206、218、222、224、235和274。
15.权利要求14的变体，其中所说的枯草酶属于I-S2亚组，并且所说的进一步的改变选自包括K27R、*36D、S57P、N76D、G97N、S101G、V104A、V104N、V104Y、H120D、N123S、A194P、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A的组。
16.权利要求15的变体，这种变体包含任何一种或两种下列取代以及权利要求1至15之任一中所提到的任何一种或多种其它的取代、缺失和/或插入：X167V、X167M、X167F、X167L、X167I、X170V、X170M、X170F、X170L和/或X170I。
17.权利要求15的变体，这种变体包括任何一种下列变体或者这些突变(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V1D4A)与权利要求1至15之任一中提到的任何一种或多种取代、缺失和/或插入的其它组合体：V104N+S101G、K27R+V104Y+N123S+T274A或者N76D+V104A。
18.权利要求15或16的变体，这种变体选自包括下列变体的组：a)      S57P+R170La′)    S57P+R170Ib)      R170L+N218Sb′)    R170I+N218Sc)      S57P+R170L+N218Sc′)    S57P+R170I+N218Sc＂)    S57P+V104Y+R170L+N218Sc)    S57P+V104Y+R170I+N218Sd)      R170L+N218S+M222Ad′)    R170I+N218S+M222Sd＂)    R170L+N218S+M222Ad)    R170I+N218S+M222Se)      S57P+R170L+S188P+A194Pe′)    S57P+R170I+S188P+A194Pf)      Y167L+R170Lf′)    Y167L+R170Ig)      Y167I+R170Lg′)    Y167I+R170Ih)      N76D+R170L+N218Sh′)    N76D+R170I+N218Si)      S57P+N76D+R170L+N218Si′)    S57P+N76D+R170I+N218Sj)      N76D+R170L+N218S+M222Aj′)    N76D+R170I+N218S+M222Sj＂)    N76D+R170L+N218S+M222Aj)    N76D+R170L+N218S+M222Sk)      S57P+R170I+S188P+A194P+N218Sk′)    S57P+R170I+S188P+A194P+N218S1)      *36D+N76D+H120D+R170L+G195E+K235L1′)    *36D+N76D+H120D+R170I+G195E+K235L1＂)    *36D+N76D+H120D+Y167I+R170L+G195E+K235L1)    *36D+N76D+H120D+Y167I+R170I+G195E+K235Lm)      N76D+H120D+R170L+G195E+K235Lm′)    N76D+H120D+R170I+G195E+K235Lm＂)    N76D+H120D+Y167I+R170L+G195E+K235Lm)    N76D+H120D+Y167I+R170I+G19SE+K235Ln)      *36D+G97N+V104Y+H120D+R170L+A194P+G195E+K235Ln′)    *36D+G97N+V104Y+H120D+R170I+A194P+G195E+K235Lo)      S57P+R170L+Q206Eo′)    S57P+R170I+Q206Ep)      R170L+Q206Ep′)    R170I+Q206Eq)      Y167I+R170L+Q206Eq′)    Y167I+R170I+Q206Er)      Y167F+R170Lr′)    Y167F+R170It)      Y167I+R170L+A194Pt′)    Y167I+R170I+A194Pt＂)    Y167L+R170L+A194Pt)    Y167L+R170I+A194Pu)      Y167I+R170L+N218Su′)    Y167I+R170I+N218Su＂)    Y167L+R170L+N218Su)    Y167L+R170I+N218Sv)      Y167I+R170L+A194P+N218Sv′)    Y167I+R170I+A194P+N218Sv＂)    Y167L+R170L+A194P+N218S
v)    Y167L+R170I+A194P+N218S
x)      R170L+P131V
x′)    R170I+P131V
y)      *36D+Y167I+R170L
y′)    *36D+Y167I+R170I
z)      Y167I+Y171I
aa)     Y167V+R170L
aa′)   Y167V+R170I
bb)     R170L+Y171I
bb′)   R170I+Y171L
bb＂)   R170L+Y171L
bb)   R170I+Y171I
cc)     Y167I+Y171L+N218S
cc′)   Y167I+Y171I+N218S
19.一种方法，该方法包括在编码枯草酶或者其前酶或前酶原的DNA的一个或多个位点上实施突变，并试验在洗涤剂中改善的贮存稳定性和/或洗涤性能，在所述突变中，在亲本枯草酶疏水区中或者其邻近区中的所述位点上的氨基酸残基由一种比原来的残基更为疏水的氨基酸所取代，所说的疏水区包括BLS309的残基P129、P131、I165、Y167、Y171的残基，所说的疏水区邻近区中的残基对BLS309是E136、G159、S164、R170、A194和G195，但BABP92的R170M、R170I和R170V变体除外。
20.一种方法，该方法包括在按照权利要求19的方法对这种酶进行鉴定后，制造具有所需改善的贮存稳定性或洗涤性能的突变枯草酶。
21.一种编码权利要求1至18任一之枯草酶变体的DNA序列。
22.一种包含权利要求21的DNA序列的载体。
23.用权利要求22的载体转化的微生物宿主。
24.权利要求23的微生物宿主，这种宿主是一种细菌，优选的是芽孢杆菌属的细菌。
25.权利要求23的微生物宿主，这种宿主是一种真菌或者酵母菌，优选的是丝状真菌，尤其是曲霉属的真菌。
26.一种用于产生权利要求1至18任一之变体的方法，其中在有助于表达和分泌所说的变体的条件下，培养权利要求23至25任一之宿主，并回收所说的变体。
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