CN117904083A - 蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸。本发明还涉及蛋白酶变体以及用于获得蛋白酶变体的方法。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
本申请是申请日为2015年12月18日、优先权日为2014年12月19日、申请号为201580068936.0、发明名称为“蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸”的发明专利申请的分案申请。
序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及相对于亲本蛋白酶在一种或多种特性中展示出改变的新颖蛋白酶变体，所述特性包括：清洗性能、洗涤剂稳定性和/或储存稳定性。本发明的变体适合用于在清洁过程和洗涤剂组合物中使用，如洗衣组合物和餐具清洗组合物，包括手洗和自动餐具清洗组合物。本发明还涉及编码这些变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞以及用于产生和使用本发明的蛋白酶变体的方法。
相关技术说明
酶作为清洗配制品的部分已经在洗涤剂工业使用了数十年。从商业视角看，蛋白酶在这样的配制品中是最相关的酶，而其他酶(包括脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶或多种酶的混合物)也是通常使用的。为了改进蛋白酶的成本和/或性能，对具有改变的特性，如在低温下增加的活性、增加的稳定性、在给定的pH下增加比活性、改变的Ca2+依赖性、在其他洗涤剂成分(例如漂白剂、表面活性剂等)的存在下增加的稳定性等的蛋白酶进行着持续搜寻。广泛用于洗涤剂中的一个蛋白酶家族是枯草杆菌酶。这个家族先前已经进一步由西埃泽恩(Siezen)RJ和洛因伊森(Leunissen)JAM，1997，蛋白质科学(ProteinScience)，6，501-523被分组为6个不同亚组。这些亚组之一是枯草杆菌蛋白酶家族，它包括枯草杆菌酶，如BPN’、枯草杆菌蛋白酶309(诺维信公司(Novozymes A/S))、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)(/>诺维信公司)、枯草杆菌蛋白酶41(来自嗜冷的南极芽孢杆菌TA41的一种枯草杆菌酶，戴韦尔(Davail)S等人1994，生化杂志(TheJournal of Biological Chemistry)，269(26)，99.17448-17453)和枯草杆菌蛋白酶39(来自嗜冷的南极芽孢杆菌TA39的一种枯草杆菌酶，纳林克斯(Narinx)E等人1997，蛋白质工程(Protein Engineering)，10(11)，第1271-1279页)。TY-145蛋白酶是来自芽孢杆菌属物种TY-145(NCIMB 40339)的一种枯草杆菌酶，其首次描述于WO 92/17577(诺维信公司)以及后来的申请WO 2004/067737(诺维信公司)(披露了三维结构和使用蛋白质工程来改变一种TY-145枯草杆菌酶的功能性)。
发明概述
本发明进一步涉及包括一个或多个选自下组的取代的蛋白酶变体，该组由以下各项组成：Q70F、Q70A、Q70N、S111R、S111E、S111D、S114A、S114Q、S144R、A145E、K146T、K146N、K146W、K146F、K146A、I150A、I150N、I150N、I150S,A151R、N176Y、I178Y、I178F、I178P、G182A、L184F、L184Y、L184F、L184Y、L184W、L184D、R224D、R224G、R224S、以及Y240R，其中这些位置对应于SEQ ID NO:3的位置，其中该变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列一致性，并且其中该变体具有蛋白酶活性。
本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生这些变体的方法。
序列表综述
SEQ ID NO:1＝是从芽孢杆菌属物种分离的TY-145蛋白酶的DNA序列。
SEQ ID NO:2＝是如从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3＝是成熟TY-145蛋白酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4＝是TY-145蛋白酶+S173P+S175P的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5＝是TY TY-145蛋白酶+S173P+S175P+F180Y的氨基酸序列。
定义
术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。它包括属于EC 3.4酶组的任何酶(包括其13个亚类中的每一种http://en.wikipedia.org/wiki/Category:EC_3.4)。EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈(San Diego)的NC-IUBMB学术出版社(AcademicPress)的1992年酶命名法，分别包括出版于欧洲生物化学期刊(Eur.J.Biochem.)1994，223，1-5、欧洲生物化学期刊1995，232，1-6、欧洲生物化学期刊1996，237，1-5、欧洲生物化学期刊1997，250，1-6、以及欧洲生物化学期刊1999，264，610-650的增刊1-5。术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森等人，蛋白质工程学(Protein Engng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚组。另外，枯草杆菌酶(以及丝氨酸蛋白酶)的特征为除了丝氨酸以外，具有两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸和天冬氨酸残基。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶(Lantibiotic peptidase)家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC 3.4)。本发明的蛋白酶是内肽酶(EC 3.4.21)。出于本发明的目的，根据以下“材料与方法”所述的程序确定蛋白酶活性。本发明的这些蛋白酶变体具有SEQ ID NO:3的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的蛋白酶活性。
术语“亲本”、“蛋白酶亲本”、或“前体蛋白酶”意指蛋白酶，对其进行了改变以产生本发明的酶变体。因此，亲本是具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置处不具有改变的一种蛋白酶。应理解的是，在上下文中的“具有一致的氨基酸序列”的表达涉及100％序列一致性。该亲本可以是天然存在的(野生型)多肽。在具体实施例中，该亲本是与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少70％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％,至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性的蛋白酶。
术语“蛋白酶变体”意指具有蛋白酶活性的相比于其亲本在一个或多个(或一个或若干个)位置处包括一个改变即取代、插入、和/或缺失(优选取代)的蛋白酶，该亲本是具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有所述改变的蛋白酶。取代意指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸替换；缺失意指除去占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在与占据一个位置的氨基酸相邻处添加氨基酸，例如1至10个氨基酸，优选1至3个氨基酸。优选地，变体是经过人为修饰的。在一方面，该变体是至少1％纯的，例如至少5％纯的、至少10％纯的、至少20％纯的、至少40％纯的、至少60％纯的、至少80％纯的、以及至少90％纯的，如通过SDS PAGE所确定的。
术语“分离的多核苷酸”意指通过人工修饰的多核苷酸。在一方面，如通过琼脂糖电泳法确定的，该分离的多核苷酸是至少1％纯的，例如至少5％纯的、至少10％纯的、至少20％纯的、至少40％纯的、至少60％纯的、至少80％纯的、至少90％纯的、以及至少95％纯的。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的、或其任意组合。
术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽方面无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
术语“基本上纯的变体”意指包含按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽材料的制剂，这些其他多肽材料是与其天然或重组地相关的。优选地，该变体按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的这些变体优选以基本上纯的形式存在。例如，这可通过经由众所周知的重组方法或经由经典的纯化方法制备变体来完成。
术语“野生型蛋白酶”意指由天然存在的有机体(如在自然界中发现的细菌、古生菌、酵母、真菌、植物或动物)表达的蛋白酶。野生型蛋白酶的实例是TY-145蛋白酶。
术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N末端加工、C末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，该成熟多肽对应于具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列。
术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，基于预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至81是信号肽的SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程学10:1-6)]，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸331至1263。
术语“cDNA”意指可以通过从得自原核或真核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子反转录来制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
术语“编码序列”意指直接指明其多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架确定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组的多核苷酸。
术语“核酸构建体”意指从天然存在的基因中分离的、或以自然界中不会另外存在的方式被修饰成包含核酸片段的、或合成的单链或双链的核酸分子。当核酸构建体包含表达本发明编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”含义相同。
术语“可操作地连接”意指一种配置，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，这样使得控制序列指引编码序列的表达。
术语“控制序列”意指对于表达编码本发明变体的多核苷酸所必需的所有组分。每个控制序列对于编码变体的多核苷酸可以是天然的或外源的，或者彼此可以是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于：前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有接头。
术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
术语“表达载体”意指包括编码变体的多核苷酸并可操作地连接至提供其表达的额外核苷酸的线性或环形DNA分子。
术语“转录启动子”用于指为促进特定基因的转录的一个DNA区域的启动子。转录启动子典型地位于它们所调节的基因附近，在相同链上并且在上游(朝向有义链的5'区域)。
术语“转录终止子”用于指标记基因结束的基因序列区段或者用于转录的基因组DNA上的操纵子。
术语“宿主细胞”意指对于用包括本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等是易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不一致的亲本细胞的任何后代。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性程度。所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)替代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％ SDS将载体材料清洗三次，每次15分钟。
术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％ SDS将载体材料清洗三次，每次15分钟。
术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％ SDS将载体材料清洗三次，每次15分钟。
术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精子DNA和或者35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％ SDS将载体材料清洗三次，每次15分钟。
术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃下使用2X SSC、0.2％ SDS将载体材料清洗三次，每次15分钟。
术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％ SDS将载体材料清洗三次，每次15分钟。
术语“改进的特性”意指与变体有关的特征，该变体相比于亲本、或者相比于具有SEQ ID NO:3的蛋白酶、或者相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有改变的蛋白酶有所改进。此类改进的特性包括但不限于：清洗性能、蛋白酶活性、热活性曲线、热稳定性、pH活性曲线、pH稳定性、底物/辅因子特异性、改进的表面特性、底物特异性、产物特异性、增加的稳定性、在储存条件下的改进的稳定性、以及化学稳定性。
术语“改进的蛋白酶活性”在此被定义为例如通过增加的蛋白质转化而通过增加的蛋白质转化，相对于(或相比于)亲本蛋白酶、或相比于具有SEQ ID NO:3的蛋白酶、或者相对于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置处不具有改变的蛋白酶的活性展示活性改变的蛋白酶变体的改变的蛋白酶活性(如上文所定义的)。
术语“稳定性”包括储存稳定性和在使用过程中的稳定性，例如在清洗过程中的稳定性，并且反应了作为时间函数的根据本发明的蛋白酶变体的稳定性，例如当蛋白酶变体置于溶液中时，尤其是在洗涤剂溶液中时，能够保留多少活性。该稳定性受到许多因素的影响，例如pH、温度、洗涤剂组合物，例如助洗剂、表面活性剂的量等。术语“改进的稳定性”和“增加的稳定性”包括“改进的化学稳定性”、“洗涤剂稳定性”或“改进的洗涤剂稳定性”。
术语“改进的化学稳定性”在此定义为变体酶在一种或多种化学品存在下表现为在孵育一段时间之后仍保留酶活性，这种或这些种化学品是天然存在的或是合成的，可降低亲本酶的酶活性。改进的化学稳定性还可使得这些变体在这类化学品存在下能更好地催化反应。术语“改进的热活性”意指变体在特定温度下相对于亲本或相对于具有SEQ ID NO:3的蛋白酶的温度依赖的活性曲线展示改变的温度依赖的活性曲线。
在一个实施例中，相比于该亲本酶，根据本发明的这些蛋白酶变体具有改进的抑制剂结合。在一个具体实施例中，相比于亲本，例如相比于SEQ ID NO 3，本发明的这些蛋白酶变体具有改进的抑制剂的抑制作用。在另一个具体实施例中，相比于如在此材料与方法的实例2中所述的相同抑制剂对TY-145蛋白酶(SEQ ID NO 3)的抑制，本发明的这些蛋白酶变体具有增加的蛋白酶抑制剂的抑制。
不可逆抑制剂导致酶的共价修饰，这样使得它的活性被永久减少。本发明的这些蛋白酶变体与适用于本发明的这些蛋白酶变体的抑制剂之间的相互作用是优选可逆的，因此通过去除该抑制剂将该抑制剂的效果逆转。抑制剂常数Ki是抑制剂的效力的指示，并且它是获得最大抑制的一半所需的浓度。Ki是抑制特定功能的有效性的量度。在这种情况下，抑制或稳定本发明的蛋白酶变体的有效性。相比于亲本蛋白酶，通过比对应的亲本蛋白酶由合适的抑制剂更多的抑制或稳定，本发明的这些蛋白酶变体是改进的，因此根据本发明的蛋白酶变体的Ki比对应于亲本的Ki更低。
术语“改进的清洗性能”在此被定义为根据本发明的蛋白酶变体在相关测定(如AMSA)测量时，相对于亲本蛋白酶的清洗性能、相对于具有SEQ ID NO:3的蛋白酶或者相对于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有改变的蛋白酶展示改进的清洗性能。术语“清洗性能”包括在洗衣并且例如在手清洗和餐具清洗方面的清洗性能。清洗性能可以被量化，如在此的“改进的清洗性能”定义下所描述的。术语“低温性能”在此被定义为如上述在20℃或低于20℃具有清洗性能的根据本发明的蛋白酶变体。
除非另有说明，术语“洗涤剂组合物”包括颗粒或粉末形式的全效或重垢清洗剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊形式的全效清洗剂，尤其是所谓的重垢液(HDL)类型；液体细薄织物洗涤剂；手洗餐具清洗剂或轻垢餐具清洗剂，尤其是高泡沫型的那些；机洗餐具清洗剂，包括用于居家及机构使用的多种片剂型、颗粒型、液体型以及冲洗助剂型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁棒、皂棒、漱口液、义齿清洁剂、汽车或地毯清洁剂、浴室清洁剂；洗发香波和护发素；沐浴凝胶、沐浴露；金属清洗剂；以及清洁助剂，如漂白剂添加剂和“去污棒”或预处理类型。就预期用于弄脏的物体清洁的清洗介质中的混合物而言，使用术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配制品”。在一些实施例中，就洗涤织物和/或衣服而言，使用该术语(例如，“洗衣洗涤剂”)。在替代性实施例中，该术语是指如用于清洁餐具、刀具等的那些的其他洗涤剂(例如“餐具清洗洗涤剂”)。它并不意图使本发明限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。术语“洗涤剂组合物”不旨在限于包含表面活性剂的组合物。其意图是，除了根据本发明的变体以外，该术语涵盖了可能包含以下各项的洗涤剂：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。
术语“织物”涵盖任何纺织材料。因此，其意图是，该术语涵盖衣服，连同织物、纱线、纤维、非编织材料、天然材料、合成材料以及任何其他纺织材料。
术语“纺织品”是指编织织物，连同适于转化为或用作纱线、编织、针织以及非编织织物的短纤维和长丝。该术语涵盖制自天然以及合成(例如，制造的)纤维的纱线。术语“纺织材料”是纤维、纱线中间体、纱线、织物以及制自纤维的产品(例如，衣服以及其他物品)的通用术语。
术语“非织物洗涤剂组合物”包括非纺织品表面洗涤剂组合物，包括但不限于用于硬表面清洁的组合物，如餐具清洗洗涤剂组合物(手动餐具清洗组合物)、口服洗涤剂组合物、义齿洗涤剂组合物以及个人清洁组合物。
术语“酶的有效量”是指在特定应用中，例如在定义的洗涤剂组合物中达到所需的酶活性所必需的酶量。此类有效量可以由本领域的普通技术人员容易地确定并且基于多种因素，如使用的具体酶、清洁应用、洗涤剂组合物的特定组成以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒、棒)组合物等。术语蛋白酶变体的“有效量”是指例如在定义的洗涤剂组合物中达到希望水平的酶活性的在上文描述的蛋白酶变体量。
如在此使用的术语“水硬度”或“硬度”或“dH”或“°dH”是指德国硬度。一度被定义为10毫克氧化钙/升水。
在此使用术语“相关清洗条件”指示在洗涤剂细分市场中实际用于家用的条件，具体是清洗温度、时间、清洗力学、洗涤剂浓度、洗涤剂类型以及水硬度。
术语“辅料”意指针对希望的具体类型的洗涤剂组合物和产品形式(例如，液体、颗粒、粉末、棒、糊、喷雾、片剂、凝胶或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料也优选地与用于该组合物中的蛋白酶变体酶可相容。在一些实施例中，颗粒组合物处于“压缩”形式，而在其他实施例中，液体组合物处于“浓缩”形式。
如在此使用的术语“污渍去除酶”描述帮助从织物或硬表面去除污渍或污垢的酶。污渍去除酶对特定底物起作用，例如蛋白酶对蛋白质起作用、淀粉酶对淀粉起作用、脂肪酶和角质酶对脂质(脂肪和油)起作用、果胶酶对果胶起作用并且半纤维素酶对半纤维素起作用。污渍通常是具有不同组分的复杂混合物的沉积物，这导致材料自身局部变色或这在物体上留下粘性表面，该粘性表面可以吸引溶解于清洗液中的污垢从而导致染污的区域变色。当酶对存在于污渍中的其特定底物起作用时，该酶降解或部分降解其底物，从而帮助在清洗过程中去除与底物相关的污垢和污渍组分。例如，当蛋白酶作用于血液污渍时它会降低血液中的蛋白质组分。
在此背景下，术语“减少的量”意指在其他方面相同的条件下，该组分的量小于将用于参照过程中的量。
术语“低洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在清洗水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。亚洲(例如，日本)洗涤剂典型地被认为是低洗涤剂浓度系统。
术语“中洗涤剂浓度”系统包括以下洗涤剂，其中在清洗水中存在约800ppm与约2000ppm之间的洗涤剂组分。北美洲洗涤剂通常被认为是中洗涤剂浓度系统。
术语“高洗涤剂浓度”系统包括以下洗涤剂，其中在清洗水中存在大于约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高洗涤剂浓度系统。
变体命名规则
出于本发明的目的，在SEQ ID NO:3中披露的成熟多肽用于确定另一种蛋白酶中相对应的氨基酸残基。将另一种蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:3中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，遗传学趋势16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志48:443-453)来确定与SEQ IDNO:3中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种蛋白酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(NucleicAcids Research)32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)537:39-64；加藤和都，2010，生物信息学26:1899-1900)以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究(Nucleic Acids Res.)22:4673-4680)。
当其他酶与SEQ ID NO:3的成熟多肽相背离，这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲线)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，可获取若干工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或组合延伸(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学16:566-567)。
在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于引用方便。采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。氨基酸位置表示为#1、#2等。
取代：对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置#1处的丝氨酸被色氨酸取代表示为“Ser#1Trp”或“S#1W”。多个突变通过加号(“+”)或逗号(，)分开，例如，“Ser#1Trp+Ser#2Pro”或“S#1W，S#2P”，分别代表位置#1和#2的丝氨酸(S)取代为色氨酸(W)，以及脯氨酸(P)。如果在给定位置可以取代多于一种氨基酸，那么这些氨基酸被列于括号内，如[X]或{X}。因此，如果根据本发明Trp和Lys两者都可以被取代，代替占据位置#1的氨基酸，这被表示为X#1{W，K}或X#2[W，K]，其中X表明根据本发明的不同蛋白酶的氨基酸残基可以是亲本，例如像SEQ ID NO:3的蛋白酶或与其具有至少70％一致性的蛋白酶。因此，在一些情况下，这些变体表示为#1{W,K}或X#2P，表示待取代的氨基酸取决于亲本而变化。由于将SEQ ID NO:3用于为根据本申请的取代编号，可以用存在于SEQ ID NO:3中的相对应位置的氨基酸表示。
缺失：对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，在位置#1处的丝氨酸的缺失表示为“Ser#1*”或“S#1*”。多重缺失通过加号(“+”)或逗号分开，例如，“Ser#1*+Ser#2*”或“S#1*，S#2*”。
插入：另外的氨基酸残基的插入，例如像在G#1之后插入赖氨酸可表示为：Gly#1GlyLys或G#1GK。可替代地，额外的氨基酸残基的插入，如在G#1后插入赖氨酸可以表示为：*#1aL。当插入多于一个的氨基酸残基，例如像在#1后插入Lys和Ala时，这种插入可以表示为：Gly#1GlyLysAla或G#1GKA。在此类情况下，还可以通过将小写字母添加到在插入的氨基酸残基前的氨基酸残基位置号处来对插入的氨基酸残基进行编号，在这个实例中：*#1aK*#1bA。
多种改变：包括多种改变的变体由加号(“+”)或由逗号(，)分开，例如“Ser#1Trp+Ser#2Pro”或者“S#1W，S#2P”代表在位置#1和#2处的丝氨酸分别如以上所描述的被色氨酸和脯氨酸取代。
不同改变：可以在一个位置上引入不同的改变时，这些不同的改变由逗号分开，例如“Ser#1Trp，Lys”或S#1W，K代表在位置#1上的丝氨酸被色氨酸或赖氨酸取代。因此，“Ser#1Trp，Lys+Ser#2Asp”表示以下变体：“Ser#1Trp+Ser#2Pro”、“Ser#1Lys+Ser#2Pro”、或S#1W，K+S#2D。
发明详述
本发明提供了从芽孢杆菌属获得的新颖的蛋白酶变体，特别是芽孢杆菌属TY-145。本发明的这些蛋白酶变体与具有SEQ ID NO 3的多肽具有至少60％序列一致性，并且相比于具有SEQ ID NO:3的蛋白酶，包括至少一个氨基酸位置的取代，该至少一个氨基酸位置选自下组，该组由以下位置组成：70、111、114、144、145、146、146、150、151、176、178、182、184、224、以及240。本发明的一个实施例涉及蛋白酶变体，这些蛋白酶变体与SEQ ID NO 3具有至少60％一致性，具有蛋白水解活性，并且包括一个或多个选自下组的取代，该组由以下各项组成：Q70F、Q70A、Q70N、S111R、S111E、S111D、S114A、S114Q、S144R、A145E、K146T、K146N、K146W、K146F、K146A、I150A、I150N、I150N、I150S,A151R、N176Y、I178Y、I178F、I178P、G182A、L184F、L184Y、L184F、L184Y、L184W、L184D、R224D、R224G、R224S、以及Y240R，其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置。在优选的实施例中，该蛋白酶变体包括一个或多个选自下组的取代，该组由以下各项组成：Q70F、Q70A、Q70N、S111R、S111E、S111D、S114A、S114Q、S144R、A145E、K146T、K146N、K146W、K146F、K146A、I150A、I150N、I150N、I150S,A151R、N176Y、I178Y、I178F、I178P、G182A、L184F、L184Y、L184F、L184Y、L184W、L184D、R224D、R224G、R224S、以及Y240R，其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置，并且其中该变体与SEQ ID NO:3具有至少60％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6，但小于100％的序列一致性。
酶已经长期应用于清洁组合物中。酶是有益的，因为每种酶具有特异性底物特异性，其允许去除各种污渍。蛋白酶作用于蛋白质污渍，并添加蛋白酶有助于去除包括蛋白质如椰子、血液、和蛋污渍的污渍。然而，在清洁组合物中特别是在液体清洁组合物中通常遇到的蛋白酶的问题是通过在该组合物的其他酶和蛋白酶本身的蛋白酶的降解。这可能导致组合物中蛋白酶和其他酶的稳定性降低，并且在清洁组合物中酶的总体性能降低。通过添加蛋白酶抑制剂或稳定剂，可以改进酶在清洁组合物中的储存稳定性，这些蛋白酶抑制剂或稳定剂是具有蛋白酶活性(例如丝氨酸蛋白酶活性)的可逆性抑制剂。因此，通过蛋白酶抑制剂(优选地通过可逆蛋白酶抑制剂)稳定蛋白酶是有利的。在本领域中已经描述了若干蛋白酶抑制剂，并且包括蛋白酶抑制剂，如肽醛、硼酸(boric acid)或硼酸(boronicacid)；或这些的任一者的衍生物。一些抑制剂包括但不限于：硼酸或其衍生物；优选地，苯硼酸或其衍生物。具有以下式的苯硼酸衍生物：
其中R选自下组，该组由以下各项组成：氢、羟基、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烯基、以及取代的C1-C6烯基。优选地，R是氢、CH3、CH3CH2、或CH3CH2CH2。该蛋白酶抑制剂(苯基硼酸衍生物)为4-甲酰基-苯基-硼酸(4-FPBA)。该蛋白酶抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：
噻吩-2硼酸、噻吩-3硼酸、乙酰胺苯基硼酸、苯并呋喃-2硼酸、萘-1硼酸、萘-2硼酸、2-FPBA、3-FBPA、4-FPBA、1-噻蒽硼酸、4-二苯并呋喃硼酸、5-甲基噻吩-2硼酸、硫茚硼酸(thionaphthene boronic acid)、呋喃-2硼酸、呋喃-3硼酸、4,4联苯-二硼酸(4,4biphenyl-diborinic acid)、6-羟基-2-萘(6-hydroxy-2-naphtalene)、4-(甲硫基)苯基硼酸、4(三甲基-甲硅烷基)苯基硼酸、3-溴代噻吩硼酸、4-甲基噻吩硼酸、2-萘基硼酸、5-溴噻吩硼酸(5-bromothiphene boronic acid)、5-氯代噻吩硼酸、二甲基噻吩硼酸、2-溴代苯基硼酸、3-氯代苯基硼酸、3-甲氧基-2-噻吩、对-甲基-苯乙基硼酸、2-噻蒽硼酸、二苯并噻吩硼酸、4-羧基苯基硼酸、9-蒽基硼酸、3,5二氯苯基硼酸、二苯基硼酸酐、邻-氯代苯基硼酸、对-氯代苯基硼酸、间-溴代苯基硼酸、对-溴代苯基硼酸、对-氟代苯基硼酸、对-甲苯基硼酸、邻-甲苯基硼酸、辛基硼酸、1,3,5三甲基苯基硼酸、3-氯代-4-氟代苯基硼酸、3-氨基苯基硼酸、3,5-二-(三氟甲基)苯基硼酸、2,4二氯代苯基硼酸、4-甲氧基苯基硼酸。
适于作为清洁组合物中的蛋白酶抑制剂的其他硼酸衍生物描述于US 4,963,655、US 5,159,060、WO 95/12655、WO 95/29223、WO 92/19707、WO 94/04653、WO 94/04654、US5442100、US 5488157以及US 5472628中。
该蛋白酶抑制剂还可以是一种具有式X-B1-B0-H的肽醛，其中这些基团具有以下意义：
a)H是氢；
b)B0是单个氨基酸残基，具有L-或D-构型并且具有式：NH-CHR’-CO；
c)B1是一种单个氨基酸残基；并且
d)X由一个或多个氨基酸残基构成(优选一个或两个)，任选地包括一种N-末端保护基团。NH-CHR'-CO(B0)是一种L-或D-氨基酸残基，其中R'可以是一种脂肪族或芳香族侧链，例如芳烷基，如苄基，其中R'可以是任选取代的。更具体地，该B0残基可以是庞大的、中性的、极性、疏水性和/或芳香性的。实例是D-或L-型的Tyr(对酪氨酸)、间酪氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸、Phe、Val、Met、正缬氨酸(Nva)、Leu、Ile或正亮氨酸(Nle)。在上式X-B1-B0-H中，B1残基可以是特别小、脂肪性的、疏水性的和/或中性的。实例是丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、正缬氨酸(Nva)和正亮氨酸(Nle)，特别是丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸。
具体地，X可以是一个或两个氨基酸残基，带有一种任选的N-末端保护基团(即该化合物是一种三-或四肽醛，具有或没有保护基团)。因此，X可以是B2、B3-B2、Z-B2或Z-B3-B2，其中B3和B2各自代表一个氨基酸残基，并且Z是一种N-末端保护基团。B2残基可以是特别小、脂肪酸和/或中性，例如Ala、Gly、Thr、Arg、Leu、Phe或Val。具体地，B3残基可以是庞大的、疏水性的、中性和/或芳香性的，例如Phe、Tyr、Trp、苯基甘氨酸、Leu、Val、Nva、Nle或Ile。
N-末端保护基团Z(如果存在的话)可以选自甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、三氟乙酰基、氟甲氧基羰基、甲氧基琥珀酰基、芳香族的和脂肪族的尿烷保护基团、苄氧基羰基(Cbz)、叔丁氧羰基、金刚烷基氧基羰基、对甲氧苄基羰基(MOZ)、苄基(Bn)、对甲氧苄基(PMB)或对甲氧苯基(PMP)、甲氧羰基(Moc)；甲氧基乙酰基(Mac)；氨基甲酸甲酯或甲基氨基羰基/甲基脲基团。在具有一种保护基团的三肽醛(即X＝Z-B2)的情况下，Z优选是一种小的脂肪族基团，例如甲酰基、乙酰基、氟甲氧基羰基、叔丁氧羰基、甲氧羰基(Moc)；甲氧基乙酰基(Mac)；氨基甲酸甲酯或甲基氨基羰基/甲基脲基团。在具有保护基团的三肽醛(即，X＝Z-B3-B2)的情况下，Z优选是一种庞大的芳香族基团，如苯甲酰基、苄氧基羰基、对甲氧苄基羰基(MOZ)、苄基(Bn)、对甲氧苄基(PMB)或对甲氧苯基(PMP)。
合适的肽醛描述于WO 94/04651、WO 95/25791、WO 98/13458、WO 98/13459、WO98/13460、WO 98/13461、WO 98/13461、WO 98/13462、WO 2007/141736、2007/145963、WO2009/118375、WO 2010/055052以及WO 2011/036153中。更具体地，该肽醛可以是Cbz-RAY-H、Ac-GAY-H、Cbz-GAY-H、Cbz-GAL-H、Cbz-VAL-H、Cbz-GAF-H、Cbz-GAV-H、Cbz-GGY-H、Cbz-GGF-H、Cbz-RVY-H、Cbz-LVY-H、Ac-LGAY-H、Ac-FGAY-H、Ac-YGAY-H、Ac-FGAL-H、Ac-FGAF-H、Ac-FGVY-H、Ac-FGAM-H、Ac-WLVY-H、MeO-CO-VAL-H、MeNCO-VAL-H、MeO-CO-FGAL-H、MeO-CO-FGAF-H、MeSO2-FGAL-H、MeSO2-VAL-H、PhCH2O(OH)(O)P-VAL-H、EtSO2-FGAL-H、PhCH2SO2-VAL-H、PhCH2O(OH)(O)P-LAL-H、PhCH2O(OH)(O)P-FAL-H、或MeO(OH)(O)P-LGAL-H。在这里，Cbz是苄氧基羰基，Me是甲基，Et是乙基，Ac是乙酰基，H是氢，并且其他字母表示由标准的单个字母标示(例如，F＝Phe，Y＝Tyr，L＝Leu)而指代的氨基酸残基。
可替代地，该肽醛可以具有WO 2011/036153中所描述的式：
P-O-(Ai-X')n-An+1-Q
其中Q是氢、CH3、CX”3、CHX”2、或CH2X”，其中X”是一种卤素原子；其中一个X'是“双N-封端基团”CO、CO-CO、CS、CS-CS或CS-CO，最优选是urido(CO)，并且其他X’为空，其中n＝1-10，优选是2-5，最优选是2，其中每个Ai和An+1是具有以下结构的氨基酸残基：
对于至X'＝-CO-的右侧的残基而言，是-NH-R”-CO-，或
对于至X'＝-CO-的左侧的残基而言，是-CO-CR”-NH-
其中R”是H-或可任选地取代的烷基或烷芳基基团，该烷芳基基团能可任选地包括杂原子并且能可任选地被连接至N原子，并且其中P是氢或任何C-末端保护基团。此类肽醛的实例包括α-MAPI、β-MAPI、F-脲-RVY-H、F-脲-GGY-H、F-脲-GAF-H、F-脲-GAY-H、F-脲-GAL-H、F-脲-GA-Nva-H、F-脲-GA-Nle-H、Y-脲-RVY-H、Y-脲-GAY-H、F-CS-RVF-H、F-CS-RVY-H、F-CS-GAY-H、抗痛素、GE20372A、GE20372B、糜蛋白酶抑素A、糜蛋白酶抑素B、以及糜蛋白酶抑素C。肽醛的另外的实例披露于特此通过引用而结合的WO 2010/055052和WO 2009/118375、WO 94/04651、WO 98/13459、WO 98/13461、WO 98/13462、WO 2007/145963中。
可替代地，对于肽醛，该蛋白酶抑制剂可以是具有式X-B1-NH-CHR-CHOH-SO3M的次硫酸盐加合物，其中X、B1和R如以上定义，并且M是H或一种碱性金属，优选Na或K。
该肽醛可以通过与重亚硫酸钠的反应被转化成水溶性次硫酸盐加合物，如在教科书，例如马奇，J.(March,J.)高等有机化学(Advanced Organic Chemistry)，第四版，威利国际科学出版社(Wiley-Interscience)，美国1992，第895页中所描述。
该重亚硫酸盐加合物的水溶液可以通过将对应的肽醛与重亚硫酸钠(亚硫酸氢钠，NaHSO3)、重亚硫酸钾(KHSO3)的水溶液通过已知方法进行反应来制备，例如在WO 98/47523；US 6,500,802；US 5,436,229；美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)(1978)100，1228；有机合成文集(Org.Synth.,Coll.)第7卷：361中所描述。
上述肽醛(或次硫酸盐加合物)与该蛋白酶的摩尔比可以是至少1:1或1.5:1，并且它可以小于1000:1，更优选小于500:1，甚至更优选从100:1至2:1或从20:1至2:1，或最优选，摩尔比是从10:1至2:1。
甲酸盐(例如，甲酸钠)和甲酸也示出了作为蛋白酶活性抑制剂的良好作用。甲酸盐可以与上述蛋白酶抑制剂协同使用，如在WO 2013/004635中所示。甲酸盐以至少0.1％w/w或0.5％w/w，例如至少1.0％、至少1.2％或至少1.5％的量存在于该洗涤剂组合物中。该盐的量值典型地低于5％w/w、低于4％或低于3％。
WO 2007/141736、WO 2007/145963、和WO 2007/145964披露了可逆的肽蛋白酶抑制剂稳定液体洗涤剂组合物的用途。US2003/157088描述了包含用抑制剂稳定的酶的组合物。
本发明提供了由蛋白酶抑制剂(如上文提及的那些)稳定的蛋白酶变体。
因此，本发明的具体实施例涉及亲本蛋白酶的变体，其中蛋白酶变体与SEQ ID NO3具有至少60％一致性，该变体具有蛋白水解活性，并且包括一个或多个选自下组的取代，该组由以下各项组成：Q70F、Q70A、Q70N、S111R、S111E、S111D、S114A、S114Q、S144R、A145E、K146T、K146N、K146W、K146F、K146A、I150A、I150N、I150N、I150S,A151R、N176Y、I178Y、I178F、I178P、G182A、L184F、L184Y、L184F、L184Y、L184W、L184D、R224D、R224G、R224S、以及Y240R，其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置，并且其中相比于亲本或相比于SEQID NO 3，这些蛋白酶变体具有增强的与抑制剂的结合。如在此实例2中所述来测量抑制剂的结合。本发明的另一个具体实施例涉及亲本蛋白酶的变体，其中蛋白酶变体与SEQ ID NO3具有至少60％一致性，该变体具有蛋白水解活性，并且包括一个或多个选自下组的取代，该组由以下各项组成：Q70F、Q70A、Q70N、S111R、S111E、S111D、S114A、S114Q、S144R、A145E、K146T、K146N、K146W、K146F、K146A、I150A、I150N、I150N、I150S,A151R、N176Y、I178Y、I178F、I178P、G182A、L184F、L184Y、L184F、L184Y、L184W、L184D、R224D、R224G、R224S、以及Y240R，其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的位置，并且其中相比于亲本或相比于SEQ ID NO3，这些变体具有增强的与抑制剂的结合，当如在实例2中所述测量时。
在一些另外的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO 3具有至少60％序列一致性的蛋白酶变体，并且当如在实例2中测试这些蛋白酶变体时，这些变体具有Ki低于1，如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9；如在0.1和0.5之间、或在0.2和0.7之间、或在0.3和0.9之间、或在0.4和0.9之间。
本发明的另一个具体实施例涉及亲本蛋白酶的变体，其中蛋白酶变体与SEQ IDNO 3具有至少60％一致性，该变体具有蛋白水解活性，并且包括一个或多个选自下组的取代，该组由以下各项组成：Q70F、Q70A、Q70N、S111R、S111E、S111D、S114A、S114Q、S144R、A145E、K146T、K146N、K146W、K146F、K146A、I150A、I150N、I150N、I150S,A151R、N176Y、I178Y、I178F、I178P、G182A、L184F、L184Y、L184F、L184Y、L184W、L184D、R224D、R224G、R224S、以及Y240R，其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置，并且其中当如在实例2中所述进行测量时，相比于具有SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5的蛋白酶，这些蛋白酶变体具有增强的与抑制剂的结合。
在另一方面，根据本发明该蛋白酶变体包括在对应于位置70、111、114、144、145、146、146、150、151、176、178、182、184、224、以及240的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代。在另一方面，变体包括在对应于任何位置70、111、114、144、145、146、146、150、151、176、178、182、184、224、以及240的两个位置处的改变。在另一方面，变体包括在对应于任何位置70、111、114、144、145、146、146、150、151、176、178、182、184、224、以及240的三个位置处的改变。在另一方面，变体包括在对应于位置70、111、114、144、145、146、146、150、151、176、178、182、184、224、以及240的每个位置处的改变。
在另一方面，该蛋白酶变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置114的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置114的位置处的氨基酸被Gln取代。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代S114Q，或由其组成。
在另一方面，该蛋白酶变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置146的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置146的位置处的氨基酸被Asn、Trp、Phe、或Ala，如被Asn、如被Trp、如被Phe、或如被Ala取代。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代K146N，或由其组成。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代K146W，或由其组成。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代K146F，或由其组成。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代K146A，或由其组成。
在另一方面，该蛋白酶变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置150的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置150的位置处的氨基酸被Ala、Asn、或Arg，如被Ala，如被Asn或如被Arg取代。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代I150A，或由其组成。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代I150N，或由其组成。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代I150R，或由其组成。
在另一方面，该蛋白酶变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置151的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置151的位置处的氨基酸被Arg取代。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代S151R，或由其组成。
在另一方面，该蛋白酶变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置176的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置176的位置处的氨基酸被Tyr取代。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代N176Y或由其组成。
在另一方面，该蛋白酶变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置178的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置178的位置处的氨基酸被Tyr、Phe、或Pro，如被Tyr、如被Phe、或如被Pro取代。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代I178Y，或由其组成。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代I178F，或由其组成。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代I178P，或由其组成。
在另一方面，该蛋白酶变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置184的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置184的位置处的氨基酸被Phe、Tyr、Trp、或Asp，如被Phe、如被Tyr、如被Trp，或如被Asp取代。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代L184F，或由其组成。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代L184Y，或由其组成。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代L184W，或由其组成。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代L184D，或由其组成。
在另一方面，该蛋白酶变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置224的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置224的位置处的氨基酸被Asp、Gly、或Ser，如被Asp、如被Gly、或如被Ser取代。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代R224D，或由其组成。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代R224G，或由其组成。在一方面，该变体包括具有SEQ ID NO:3的多肽的取代R224S，或由其组成。
在另一方面，根据本发明的这些蛋白酶变体包括一个或多个(例如若干个)选自下组的取代，该组由以下各项组成：Q70F、Q70A、Q70N、S111R、S111E、S111D、S114A、S114Q、S144R、A145E、K146T、K146N、K146W、K146F、K146A、I150A、I150N、I150N、I150S,A151R、N176Y、I178Y、I178F、I178P、G182A、L184F、L184Y、L184F、L184Y、L184W、L184D、R224D、R224G、R224S、以及Y240R，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代S114Q，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代Q70F，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代Q70A，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代Q70N，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代S111R，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代S111E，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代S111D，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代S114A，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代K146T，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代S144R，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代A145E，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代I150N，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代I150S，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代G182A，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代L184F，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代L184Y，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代Y240R，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代K146T，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代K146N，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代K146W，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代K146F，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代K146A，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代I150A，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代I150N，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代A151R，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代N176Y，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代I178Y，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代I178F，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代I178P，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代L184F，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代F184Y，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ IDNO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代L184W，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代L184D，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代R224D，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代R224G，或由其组成。
本发明的一方面涉及蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中亲本蛋白酶是具有SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的多肽，或与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的多肽，并且其中相比于该亲本蛋白酶，该蛋白酶变体包括取代R224S，或由其组成。
本发明还涉及清洁组合物，如包括本发明的蛋白酶变体的洗涤剂组合物。在一个实施例中，该清洁组合物为液体或粉末洗衣洗涤剂，适合例如在高温和/或高pH下的清洗，如在或高于40℃和/或在或高于pH 8下。在一个实施例中，该清洁组合物为液体或粉末洗衣洗涤剂，适合例如在低温和/或低pH下的清洗，如在或低于20℃和/或pH 6下。该洗涤剂也可被配制成单位剂量洗涤剂和/或任选具有最少的水或无水的致密洗涤剂。该洗涤剂也可以是餐具清洗洗涤剂，它优选是无磷的。该清洁组合物可以进一步包括至少一种额外的酶，如碳水化合物活性酶，像碳水化物酶、果胶酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、或蛋白酶如金属蛋白酶、脂肪酶、角质酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。
通常，用于制造变体的蛋白酶内的位置是如下的那些位置，其中如相比于未改变的蛋白酶，至少一个取代会导致展示出改进的特征的变体。这些变体在一个或多个(例如，若干个)其他位置上可以进一步包括一个或多个另外的改变。在特别优选的实施例中，本发明的蛋白酶变体进一步包括在对应于SEQ ID NO:3的位置171、173、175、179或180的一个或多个位置的取代，其中该变体与SEQ ID NO:3具有至少60％序列一致性，并且该变体具有蛋白酶活性。在甚至更优选的实施例中，在对应于SEQ ID NO:3的位置171的位置的氨基酸选自下组，该组由以下各项组成：Trp、Lys、Glu、Asn和/或在对应于SEQ ID NO:3的位置173的位置的氨基酸是Pro，和/或在对应于SEQ ID NO:3的位置175的位置的氨基酸是Ala、Val、Pro，和/或在对应于SEQ ID NO:3的位置179的位置的氨基酸选自下组，该组由以下各项组成：Cys、Val、Gln、Ser、Thr、Glu、His、Lys、Met、Asn、Tyr和Ala和/或在对应于SEQ ID NO:3的位置180的位置的氨基酸是Tyr。在另一个优选实施例中，本发明的蛋白酶变体进一步包括在对应于SEQ ID NO:3的位置171、173、175、179或180的两个或更多个位置的取代，其中该变体与SEQ ID NO:3具有至少60％且小于100％序列一致性，并且该变体在对应于位置171、173、175、179和180中任一个的两个位置具有蛋白酶活性。在本发明优选实施例中，本发明的这些变体包括如在SEQ ID NO 4中示出的突变S173P+S175P。在另一个优选实施例中，本发明的蛋白酶变体包括如在SEQ ID NO 5中示出的突变S173P+S175P+F180Y。
在本发明的具体实施例中，相比于SEQ ID NO 3，本发明的蛋白酶变体包括以下取代：
S114Q、S173P、S175P、F180Y
K146T、S173P、S175P、F180Y
K146N、S173P、S175P、F180Y
K146W、S173P、S175P、F180Y
K146F、S173P、S175P、F180Y
K146A、S173P、S175P、F180Y
I150A、S173P、S175P、F180Y
I150N、S173P、S175P、F180Y
S27K、I150N、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、Q198E、T297P
S27K、K146P、S148R、A151R、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、Q198E、N199K、T297P
S173P、S175P、N176Y、F180Y
S173P、S175P、I178Y、F180Y
S173P、S175P、I178F、F180Y
S173P、S175P、I178F、F180Y
S173P、S175P、I178P、F180Y
S173P、S175P、F180Y、L184F
S173P、S175P、F180Y、L184F
S27K、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、L184F、Q198E、T297P
S27K、I121V、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、L184F、Q198E、T297P
S27K、Q70N、G107N、I121V、E127Q、S173P、S175P、F180Y、L184F、Q198E、T297P
S27K、S173P、G174K、S175P、F180Y、L184F、Q198E、N199K、T297P
S27K、S173P、G174K、S175P、F180Y、L184F、Q198E、N199R、T297P
S173P、S175P、F180Y、L184Y
S27K、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、L184Y、Q198E、T297P
S27K、S173P、G174K、S175P、F180Y、L184Y、Q198E、N199K、T297P
S27K、S173P、G174K、S175P、F180Y、L184Y、Q197K、Q198E、T297P
S173P、S175P、F180Y、L184W
S27K、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、L184W、Q198E、T297P
S173P、S175P、F180Y、L184D
S173P、S175P、F180Y、R224D
S173P、S175P、F180Y、R224G
S27K、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、Q198E、N199K、R224G、T297P
S173P、S175P、F180Y、R224S
S27K、I121V、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、Q198E、R224S、T297P
S27K、S171D、S173P、G174R、S175P、G182A、L184F、Q198E、N199K、R224G、T297P
S27K、S171D、S173P、G174R、S175P、G182A、L184F、Q198E、N199K、T297P
S27K、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、G182A、L184F、Q198E、N199K、R224G、T297P
S27K、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、G182A、L184F、Q198E、N199K、T297P
S27K、V162T、S173P、G174K、S175P、F180Y、L184F、Q197K、Q198E、T297P
S27K、V162T、S173P、G174K、S175P、F180Y、Q197K、Q198E、T297P
Q70F
Q70A
Q70N
S111R
S111E
S111D
S114A
S144R
A145E
I150N
I150S
G182A
L184F
L184Y
R224G或
Y240R
这些变体在一个或多个(例如，若干个)其他位置上可进一步包括一个或多个另外的改变。氨基酸改变可以具有次要性质，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-5个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸残基；位于氨基或羧基末端的至多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列、抗原性表位或结合结构域。
保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见的取代包括：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Asn/Gln、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Glu/Gln、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu以及Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定多肽中的必需氨基酸(康宁汉(Cunningham)和韦尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见，例如德沃斯(de Vos)等人，1992，科学255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。对于TY-145蛋白酶(SEQ ID NO:3)，包括氨基酸D35、H72以及S251的催化三联体对于酶的蛋白酶活性是必需的。
在实施例中，相比于亲本酶，该变体具有改进的催化活性。
两个氨基酸序列之间的同源性是在出于本发明的目的由参数“一致性”描述的背景下，两个氨基酸序列之间的一致性程度是使用如上所述的尼德曼-翁施算法来确定的。来自程序的结果除了氨基酸比对之外还计算两个序列之间的“百分比一致性”。
基于本描述，对于本领域的技术人员而言，鉴别可以根据本发明来修饰的适当同源蛋白酶是相当简单的。
基本上同源的亲本蛋白酶变体可以具有一个或多个(若干个)氨基酸取代、缺失和/或插入，在此背景下，术语“一个或多个”与术语“若干个”是互换使用的。这些改变优选地具有微小的性质，即，不会显著地影响蛋白或多肽的三维折叠或活性的如上所述的保守氨基酸取代以及其他取代；小的缺失，典型的是1至约30个氨基酸的缺失；以及小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸残基、包括最多约20-25个残基的小接头肽、或有利于纯化的小延伸(亲和标记物)，如聚组氨酸序列(tract)或蛋白A(尼尔逊(Nilsson)等人，1985，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)4:1075；尼尔逊等人，1991，酶学方法(MethodsEnzymol.)198:3。通常还参见福特(Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化(ProteinExpression and Purification)2:95-107。
尽管如上所述的这些改变优选地具有微小的性质，这类改变还可以是实质性的，如均作为氨基末端或羧基末端延伸的最多达300个氨基酸或更多个氨基酸的较大的多肽的融合。
亲本蛋白酶可以包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其等位基因变体、或其具有蛋白酶活性的片段，或由其组成。在一方面，该亲本蛋白酶包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成。
该亲本蛋白酶可以是(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％序列一致性的一种多肽；(b)由在中或高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码SEQ IDNO:2的成熟多肽的序列、或者(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的多核苷酸编码的一种多肽；或者(c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码的一种多肽。
在一方面，该亲本蛋白酶与具有SEQ ID NO:3的多肽具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或至少99％序列一致性。
在一方面，该亲本蛋白酶的氨基酸序列与具有SEQ ID NO:3的多肽相差不多于15个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个氨基酸。
在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至311，或由其组成。
在一方面，该亲本蛋白酶的氨基酸序列与具有SEQ ID NO:4的多肽相差不多于15个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个氨基酸。
在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或由其组成。
在一方面，该亲本蛋白酶的氨基酸序列与具有SEQ ID NO:5的多肽相差不多于15个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个氨基酸。
在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或由其组成。
在另一方面，该亲本蛋白酶是由在非常低严格条件下、低严格条件下、中严格条件下、或高严格条件下、或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列、或者(iii)(i)或(ii)的全长补体杂交的多核苷酸编码的(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)，第2版，冷泉港，纽约)。
可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:3的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或物种的菌株的亲本进行编码的DNA。具体地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针长度是至少100个核苷酸，例如长度至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测对应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以针对与上文所述的探针杂交并编码亲本的DNA来筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其他适合的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1杂交的克隆或DNA或其子序列，在DNA印迹中使用载体材料。
出于本发明的目的，杂交指示该多核苷酸与和(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列；(iv)其全长补体；或者(v)其子序列相对应的标记的核酸探针在非常低至非常高严格条件下杂交。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。
在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一方面，该核苷酸探针是SEQ ID NO:1的80至1140个核苷酸长片段，例如90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或1100个核苷酸长。在另一方面，该核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽、其成熟多肽、或其片段的多核苷酸。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1或编码SEQID NO:2的成熟多肽的序列。
在另一个实施例中，该亲本由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列具有至少60％，如至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％，至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
该亲本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内，并且融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。也可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中以翻译后方式产生融合多肽(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学266:776-779)。
融合多肽可以进一步包括两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；Collins-Racie等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能和遗传学(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；和史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。
该亲本可以从任何属的有机体中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，该亲本是胞外分泌的。
该亲本可以是细菌蛋白酶。例如，该亲本可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、或链霉菌属蛋白酶；或一种革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门菌属或脲原体属蛋白酶。
在一方面，该亲本是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌蛋白酶。
在一方面，该亲本是芽胞杆菌属物种蛋白酶，例如具有SEQ ID NO:3的蛋白酶或SEQ ID NO:2的成熟多肽。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于直接地从自然生活环境分离微生物和DNA的技术是本领域中熟知的。然后可通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨姆布鲁克等人，1989，见上文)。
变体的制备
本发明还涉及用于获得相比于SEQ ID NO 3具有至少一种改进的特性的蛋白酶变体的方法，该方法包括
a)向与SEQ ID NO:3具有至少60％一致性的亲本蛋白酶中引入一个或多个以下取代：Q70F、Q70A、Q70N、S111R、S111E、S111D、S114A、S114Q、S144R、A145E、K146T、K146N、K146W、K146F、K146A、I150A、I150N、I150N、I150S,A151R、N176Y、I178Y、I178F、I178P、G182A、L184F、L184Y、L184F、L184Y、L184W、L184D、R224D、R224G、R224S、以及Y240R，其中该变体具有与SEQ ID NO:3至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％一致的氨基酸序列；并且
b)回收该变体。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
本发明的这些变体还可以通过程序，如以下提到的那些来制备。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过使用涉及包含所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，以允许该质粒的粘性端以及插入片段彼此连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；和巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0171154；斯托西(Storici)等人，2001，自然生物技术(Nature Biotechnol.)19:773-776；凯伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及卡里萨诺(Calissano)和曼奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学通讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。
合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然(Nature)432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用已知的诱变、重组和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国科学院院刊86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学30:10832-10837；US 5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(奈斯(Ness)等人，1999，自然生物技术17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可以是令人希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins from recombinantbacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO99/43835中。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是信号肽编码区域，编码与变体的N-端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替换天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌鈣-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。其他信号序列由西莫宁(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述。
该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子的基因获得前肽编码序列。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。
表达载体
本发明还涉及包括编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环形质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标志物。选择性标志物是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标志物的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标志物。
载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。在另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标志物基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标志物基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在重组产生变体中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌菌、梭杆菌菌、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见，例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(Folia Microbiol.)(布拉格)49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见，例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见，例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
生产方法
本发明还涉及产生一种变体的方法，这些方法包括：(a)在适合于该变体的表达的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生该变体的一种营养介质中培养这些宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的介质中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养介质中发生，该介质包括碳和氮来源及无机盐。适合的介质可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养介质中，则该变体可直接从该介质中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。
使用本领域已知的对具有蛋白酶活性的变体特异的方法可以检测该变体。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该变体的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养介质中回收该变体，这些常规程序包括但不限于：收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在可替代的方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的来源。
组合物
除了酶，这些洗涤剂组合物可以包括其他组分。另外的组分的选择在普通技术人员技术内并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的织物的类型、弄脏的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。
本发明的洗涤剂组合物
可以将本发明的蛋白酶变体以对应于以下各项的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升清洗液0.001-100mg的蛋白质，如0.01-100mg的蛋白质，优选是0.005-50mg的蛋白质，更优选是0.01-25mg的蛋白质，甚至更优选是0.05-10mg的蛋白质，最优选是0.05-5mg的蛋白质，并且甚至最优选是0.01-1mg的蛋白质。
洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的，或其混合物。在具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且包括本领域中已知的任何常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％，如从约5％至约30％(包括从约5％至约15％)、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES、也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)、二甲基双十八烷基氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、以及其组合、烷基季铵化合物、烷氧基化的季铵(AQA)。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)(如烷基二甲基氧化胺)、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、以及磺基甜菜碱、及其组合。
本发明的这些组合物还可以包括这样一种助水溶剂，它是将疏水化合物溶解于水溶液中(或相反地，将极性物质溶剂于非极性环境中)的化合物。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)(2007)的综述，胶体&界面科学新见(Current Opinion in Colloid&Interface Science)，12:121-128。助水溶剂并不显示临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他明确定义的中间相。相反，许多助水溶剂示出连续类型的聚集过程，其中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。助水溶剂常规地在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，如相分离或高粘度。
该洗涤剂可以包含按重量计0％-5％，如约0.5％至约5％，或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。
洗涤剂组合物可以包含按重量计约0％-65％，如约5％至约50％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂，或其混合物。在餐具清洗洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性络合物的螫合剂。可以利用本领域中已知的用于在洗衣、ADW和硬表面清洁洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性例子包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐如碳酸钠、可溶性硅酸盐如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)、乙醇胺如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚氨基二乙醇(DEA)和2,2’,2”-次氮基三乙醇(TEA)、和羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。
洗涤剂组合物还可以包含按重量计0％-65％，如约5％至约40％的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以只包括共助洗剂，或结合助洗剂，例如沸石助洗剂。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2',2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N、N-二乙酸(SLDA)、氨基乙磺酸-N、N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
洗涤剂可以包含按重量计0％-10％，如大约1％至大约5％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在洗衣、ADW和硬表面清洁洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预成型过酸及其混合物。适合的预成型过酸包括但不限于：过氧羧酸及盐、过碳酸及盐、过亚氨酸(perimidic acid)及盐、过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))，及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，这些系统可以包括例如与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。漂白活化剂在此意指与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰乙二胺(TAED)、3,5,5三甲基己酰氧基苯磺酸钠、双过氧化十二酸、4-(十二烷基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(3,5,5-三甲基己酰氧基)苯磺酸盐(ISONOBS)、四乙酰乙二胺(TAED)和4-(壬酰氧基)苯磺酸盐(NOBS)，和/或WO 98/17767中披露的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且该家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像特雷森(Triacin))具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三乙酸甘油酯在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺、或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，如6-(酞酰基氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：
(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R1独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R1独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三烷基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259、WO 2007/087242中。合适的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。
该清洁组合物可以包含按重量计0％-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％、或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(乙烯亚胺)、羧甲基菊糖(CMI)、和聚羧化物，如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰的CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯和聚氧乙烯对苯二甲酸乙二酯的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。
这些清洁组合物还可以包括织物调色剂，如当配制在洗涤剂组合物中时，可以在织物与包括所述洗涤剂组合物的清洗液体接触时沉积在所述织物上从而通过可见光吸收/反射来改变所述织物色彩的染料或色素。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP 1876226中(将其通过引用而特此结合)。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。合适的着色剂还披露于例如WO 2007/087257、WO2007/087243中。
在一个实施例中，将根据本发明的变体与一种或多种酶，如至少两种酶，更优选是至少三种、四种或五种酶组合。优选地，这些酶具有不同的底物特异性，例如蛋白质分解活性、淀粉分解活性、脂质分解活性、溶半纤维活性或溶果胶活性。
洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可以包括一种或多种额外的酶，如碳水化合物活性酶，像碳水化物酶、果胶酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、或蛋白酶、脂肪酶、角质酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。
一般而言，所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等)，并且该酶应以有效量存在。
纤维素酶：
适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质工程化的变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳菌属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢属产生的真菌纤维素酶。
特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO 99/001544中的那些纤维素酶变体。
其他纤维素酶是具有以下序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与WO 2002/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％一致性，或家族44木葡聚糖酶，该木葡聚糖酶具有以下序列，该序列与WO 2001/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60％一致性。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(诺维信公司)、CarezymePremiumTM(诺维信公司)、CellucleanTM(诺维信公司)、Celluclean ClassicTM(诺维信公司)、CellusoftTM(诺维信公司)、WhitezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM和Puradax HATM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(KaoCorporation))。
甘露聚糖酶：
适合的甘露聚糖酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或遗传修饰的变体。该甘露聚糖酶可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。它可以是一种来自芽孢杆菌属或腐质霉属的野生型，特别是粘琼脂芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌或特异腐质霉。合适的甘露聚糖酶在WO 1999/064619中进行了描述。一种可商购的甘露聚糖酶是Mannaway(诺维信公司)。
蛋白酶：
适合的另外的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选微生物来源。包括经化学修饰的或蛋白质工程化的变体。它可以是碱性蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森等人，蛋白质工程4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶迟缓(lentus)、枯草杆菌蛋白酶诺和(Novo)、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及来源于纤维单胞菌属(Cellumonas)的糜蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。
进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在例如WO95/23221中所述)、及其变体(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶，如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是描述于WO 92/19729、WO 96/034946、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264中的变体，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’编号。更优选的蛋白酶变体可以包括以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN'编号)。
适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：DuralaseTm、DurazymTm、/> 和(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些：/> 和/>(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
脂肪酶和角质酶：
适合的脂肪酶和角质酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如如描述于EP 258068和EP305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO 10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。
其他实例是脂肪酶变体，如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中的那些。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(最初来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(最初来自吉斯特-博克德斯公司(Gist-Brocades))。
再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。
淀粉酶：
可以与本发明的蛋白酶变体一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括经化学修饰的或蛋白质工程化的变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。
合适的淀粉酶包括具有在WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或与SEQ IDNO:3具有90％序列一致性的其变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，如在一个或多个以下位置处具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。
不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或与SEQID NO:6具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
其他适合的淀粉酶是包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。这一杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
另外的合适的淀粉酶是具有在WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或与SEQID NO:6具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。
能被使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304、以及476，使用WO 96/023873的SEQ ID 2用于编号。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置上具有缺失的那些，如181和182、182和183、或位置183和184。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选淀粉酶变体是在位置183和184具有缺失并在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个具有取代的那些。
其他能被使用的淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO:2、WO 01/66712的SEQID NO:10的淀粉酶或与WO 08/153815的SEQ ID NO:2或WO 01/66712的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的其变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或与SEQ IDNO:2具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:2的优选变体是具有C末端截短和/或在以下一个或多个位置具有取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在以下位置：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K的一个或多个中具有取代，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183中具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C末端截短的并且任选地进一步包括在位置243的取代和/或在位置180和/或位置181的缺失。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 13184577的SEQ ID NO:1的淀粉酶或与SEQ IDNO:1具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:1的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：K176、R178、G179、T180、G181、E187、N192、M199、I203、S241、R458、T459、D460、G476和G477。SEQ ID NO:1的更优选变体是在以下位置：K176L、E187P、N192FYH、M199L、I203YF、S241QADN、R458N、T459S、D460T、G476K和G477K中的一个或多个中具有取代和/或在位置R178和/或S179或T180和/或G181处具有缺失的那些。SEQ IDNO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
E187P+I203Y+G476K
E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K、
其中这些变体任选地进一步在位置241处包括取代和/或在位置178和/或位置179处包括缺失。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 10104675的SEQ ID NO:1的淀粉酶或与SEQ IDNO:1具有90％序列一致性的其变体。SEQ ID NO:1的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：N21、D97、V128、K177、R179、S180、I181、G182、M200、L204、E242、G477和G478。SEQ ID NO:1的更优选变体是在以下位置：N21D、D97N、V128I、K177L、M200L、L204YF、E242QA、G477K和G478K中的一个或多个中具有取代和/或在位置R179和/或S180或I181和/或G182处具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N21D+D97N+V128I
其中这些变体任选地进一步在位置200处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。
其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12的一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174、R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314、R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的变体，并且另外在一个或多个选自下组的位置处具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置处具有取代的变体。
其他的实例是淀粉酶变体，如在WO 2011/098531、WO 2013/001078、和WO 2013/001087中描述的那些。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、特妙淀粉酶TM、FungamylTM、StainzymeTM、StainzymePlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X及BANTM(来自诺维信公司)，以及RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase、Preferenz S1000、Preferenz S100及Preferenz S110(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(Genencor International Inc./DuPont))。
过氧化物酶/氧化酶：
适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质工程化的变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。
可商购的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
其他酶：
根据本发明的蛋白酶变体还可以与另外的酶如果胶裂解酶(例如PectawashTM)、叶绿素酶等组合。本发明的蛋白酶变体可以与任何另外的酶混合。
该洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂配制品为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。
非尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中该醇包含从12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯以及甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP238,216中披露的方法来制备。
辅料
还可以利用本领域中已知的用于在洗衣洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐蚀剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物调理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢悬浮剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在洗衣洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术范围内。
分散剂这些洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包括分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉状洗涤剂(Powdered Detergents)，表面活性剂科学系列(Surfactant Science Series)，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)。
染料转移抑制剂-这些洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。当在受试组合物中存在时，染料转移抑制剂可以按该组合物的重量计以从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％的水平存在。
荧光增白剂-洗涤剂组合物还将优选地包含另外的组分，这些组分可以给正清洁的物品着色，如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在该组合物中可以使用适合在洗衣洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙胺基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐以及2-(芪基(stilbyl)-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴-嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学品(Paramount Mineralsand Chemicals)，孟买，印度供应。适合使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。
适合的荧光增白剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
污垢释放聚合物-该洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些污垢释放聚合物帮助从织物，如棉或聚酯基织物上除去污垢，特别是从聚酯基织物上除去疏水污垢。污垢释放聚合物可以例如是基于非离子型或阴离子型对苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司。另一种类型的污垢释放聚合物是包括核心结构和连接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO 2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，任意接枝共聚物是适合的污垢释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856以及WO 2006/113314中(将其通过引用而特此结合)。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，如修饰的纤维素衍生物，如EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用结合在此)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
抗再沉积剂-这些洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污垢释放聚合物下描述的基于纤维素的聚合物还可以用作抗再沉积剂。
其他适合的辅料包括但不限于：防缩剂、防皱剂、杀菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂(sodsuppressor)、溶剂、用于液体洗涤剂的结构化剂(structurants)和/或结构弹性剂(elasticizing agent)。
洗涤剂产品的配制品
该洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如棒，均匀的片剂，具有两层或更多层的片剂，规则的或压缩的粉末，颗粒，糊，凝胶，或规则的、压缩或浓缩的液体。
洗涤剂配制品形式：层(相同或不同的相)、袋、对比用于机器给药单位的形式。
可以将小袋配置为单室或多室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。该袋由水溶性薄膜制成，它包含了一个内部体积。所述内部体积可以分成袋的室。优选的薄膜是高分子材料，优选被制成薄膜或薄片的形式的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选的是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物，该共混物组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参照M8630下，如由美国印第安纳州盖里(Gary,Ind.,US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris CraftIn.Prod.)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体洗衣清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与包含固体的室不同。参考：(US2009/0011970 A1)
可以由水可溶袋中的或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分彼此物理分离因此，可以避免组分间的不良的储存相互作用。在清洗溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
这些形式的定义/特征：
非单位给药的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且高达95％的水，如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包含从0％-30％的有机溶剂。
液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
方法和用途
可以将本发明的这些蛋白酶变体添加到洗涤剂组合物中，并且因此成为洗涤剂组合物的组分，其中所述的变体包括SEQ ID NO:3的一个或多个以下的取代：Q70F、Q70A、Q70N、S111R、S111E、S111D、S114A、S114Q、S144R、A145E、K146T、K146N、K146W、K146F、K146A、I150A、I150N、I150N、I150S,A151R、N176Y、I178Y、I178F、I178P、G182A、L184F、L184Y、L184F、L184Y、L184W、L184D、R224D、R224G、R224S、以及Y240R，其中该变体与SEQ ID NO:3具有至少60％，如至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％,至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
洗涤剂组合物通常用于清洁过程中，如洗衣和/或硬表面清洁，例如餐具清洗。
本发明的一个实施例涉及洗涤剂组合物，如洗衣或餐具清洗组合物，这些组合物包括与SEQ ID NO 3具有至少60％一致性的蛋白酶亲本的蛋白酶变体，其中所述变体包括至少一个选自下组的取代，该组由以下各项组成：Q70F、Q70A、Q70N、S111R、S111E、S111D、S114A、S114Q、S144R、A145E、K146T、K146N、K146W、K146F、K146A、I150A、I150N、I150N、I150S,A151R、N176Y、I178Y、I178F、I178P、G182A、L184F、L184Y、L184F、L184Y、L184W、L184D、R224D、R224G、R224S、以及Y240R。
洗涤剂组合物可以包括至少一个蛋白酶变体，其中所述变体包括SEQ ID NO:3的一个或多个以下的取代：Q70F、Q70A、Q70N、S111R、S111E、S111D、S114A、S114Q、S144R、A145E、K146T、K146N、K146W、K146F、K146A、I150A、I150N、I150N、I150S,A151R、N176Y、I178Y、I178F、I178P、G182A、L184F、L184Y、L184F、L184Y、L184W、L184D、R224D、R224G、R224S、以及Y240R，其中该蛋白酶变体与SEQ ID NO:3具有至少60％的序列一致性，如与SEQID NO:3具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％,至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％,至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性，并且该变体具有蛋白酶活性。该至少一种蛋白酶变体优选地具有如在“材料和方法”下所述的增加的抑制剂的抑制作用。
洗涤剂组合物可以配制为例如手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理有染污的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具清洗操作。
清洁过程或纺织品护理过程可以例如是洗衣过程、餐具清洗过程或清洁硬质表面如浴室瓷砖、地板、桌面、下水道、洗涤槽和洗脸盆。洗衣过程可以例如是家用洗衣，但是它也可以是工业洗衣。用于洗涤织物和/或衣服的过程可以是如下的一个过程，该过程包括用包含洗涤剂组合物和至少一种蛋白酶变体的清洗溶液处理织物。例如，可以在机器清洗过程中或者在手动清洗过程中进行清洁过程或纺织品保养过程。清洗溶液可以例如是包含洗涤剂组合物的水洗溶液。
经过清洗、清洁或者纺织品保养过程的织物和/或衣服可以是常规的可清洗衣服，例如家庭洗衣。优选地，洗衣的主要部分是衣服和织物，包括针织品、编织物、斜纹粗棉布、非编织物、毛毡、纱线、以及毛布巾。这些织物可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻、亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维；或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括纤维胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。这些织物还可以是非纤维素基的，如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛或丝；或者合成聚合物，如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯以及斯潘德克斯弹性纤维(spandex)/弹性纤维；或其共混物以及纤维素基和非纤维素基纤维的共混物。共混物的例子是棉和/或人造丝/纤维胶与一种或几种伴随材料的共混物，该伴随材料如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/纤维胶、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。
最近几年，人们对替换洗涤剂中的组分的兴趣逐渐增加，这源于用可再生生物组分如酶和多肽替换石油化学品而不损害清洗性能。当洗涤剂组合物的组分改变新酶活性或者相比于常用洗涤剂酶(如蛋白酶)具有替代和/或改进的特性的新酶时，需要脂肪酶和淀粉酶来实现与传统洗涤剂组合物比较时类似或改进的清洗性能。
蛋白酶及其变体可用于蛋白质性质污渍去除过程。蛋白质污渍可能是如食品污渍等污渍，如婴儿食品、皮脂、可可、蛋、血液、牛奶、墨水、草、或其组合。
典型的洗涤剂组合物包括除酶之外的各种组分，这些组分具有不同的作用，一些组分像表面活性剂降低洗涤剂的表面张力，这允许正清洁的污渍被提起和分散并随后被清洗出来，其他组分像漂白系统通常通过氧化除去颜色并且很多漂白剂还具有强杀菌特性，并且用于消毒和灭菌。再其他组分像助洗剂和螯合剂例如通过从液体中除去金属离子来软化清洗水。
这些酶组合物可以进一步包括以下中至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、洗衣或餐具清洗中的漂白系统或漂白组分。
表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量相比于在未添加本发明的蛋白酶变体情况下使用的表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量可以有所减小。优选地，作为表面活性剂、增效剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的该至少一种组分以以下量存在：比在不添加本发明的蛋白酶变体的情况下组分在系统中的量(如，此组分的常规的量)少1％，如少2％、如少3％、如少4％、如少5％、如少6％、如少7％、如少8％、如少9％、如少10％、如少15％、如少20％、如少25％、如少30％、如少35％、如少40％、如少45％、如少50％。洗涤剂组合物还可以是如下的组合物，该组合物不含至少一种组分，该组分是表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分和/或聚合物。
清洗方法
洗涤剂组合物理想地适用于在洗衣应用中使用。这些方法包括用于洗涤织物的方法。该方法包括将有待洗涤的织物与包括一种洗涤剂组合物的清洁洗衣溶液接触的步骤。织物可以包括能够在常规消费者使用条件下被洗涤的任何织物。该溶液优选具有从约5.5至约11.5的pH。可在溶液中按以下浓度使用组合物：从约100ppm，优选500ppm至约15,000ppm。水温的范围典型地是从约5℃至约95℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃以及约90℃。水与织物之比典型地是从约1:1至约30:1。
在具体实施例中，在以下pH下执行该清洗方法：从约5.0至约11.5、或者从约6至约10.5、约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5.至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9、或者约7至约8、约8至约11、约8至约10、约8至约9、约9至约11、约9至约10、约10至约11，优选约5.5至约11.5。
在具体实施例中，在以下硬度下执行该清洗方法：从约0°dH至约30°dH，如约1°dH、约2°dH、约3°dH、约4°dH、约5°dH、约6°dH、约7°dH、约8°dH、约9°dH、约10°dH、约11°dH、约12°dH、约13°dH、约14°dH、约15°dH、约16°dH、约17°dH、约18°dH、约19°dH、约20°dH、约21°dH、约22°dH、约23°dH、约24°dH、约25°dH、约26°dH、约27°dH、约28°dH、约29°dH、约30°dH。在典型欧洲清洗条件下，硬度是约16°dH，在典型美国清洗条件下，是约6°dH，并且在典型亚洲清洗条件下，是约3°dH。
用于在上述方法中使用的组合物可进一步包括至少一种如以上“其他酶”部分列出的额外的酶，如选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶(如蛋白酶)、脂肪酶和角质酶、碳水化物酶(如淀粉酶)、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、以及果胶酶或其组合。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例
材料与方法
蛋白酶活性测定
1)Suc-AAPF-pNA活性测定：
蛋白水解活性可以通过采用Suc-AAPF-pNA底物的方法来确定。Suc-AAPF-pNA是N-琥珀酰基-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺的缩写，并且它是可以通过内切蛋白酶切割的一种封闭肽。在切割后，一个游离pNA分子被释放出来，并且它具有黄色颜色并且因此可以通过可见光分光光度法在波长405nm下进行测量。该Suc-AAPF-PNA底物由巴亨公司(Bachem)(目录号L1400，溶解于DMSO中)来制造。
待分析的蛋白酶样品被稀释在残余活性缓冲液中(100mM Tris pH8.6)。通过转移30μl的稀释的酶样品至96孔微量滴定板并添加70μl底物工作溶液(0.72mg/ml于100mMTris pH 8.6中)进行该测定。将该溶液在室温下混合并且在OD 405nm下经5分钟每20秒测量吸收。在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的蛋白酶的活性成正比例。应该将蛋白酶样品稀释至其中斜率为线性的水平。
实例1：通过定点诱变构建TY145变体
定点变体是构建自包括根据本发明的具体的取代的TY145蛋白酶(SEQ ID NO:3)。这些变体是通过传统的克隆DNA片段制得(萨姆布鲁克等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，1989)，使用PCR连同正确地设计的诱变寡核苷酸，这些寡核苷酸在所得序列中引入了所希望的突变。
对应于希望的突变位点侧翼的DNA序列设计的诱变的寡核苷酸，其由限定插入/缺失/取代的DNA碱基对分离，并且购自寡核苷酸供应商，如生命技术公司(LifeTechnologies)。以此方式，构建并产生下表1中所列的变体。
为了测试本发明的TY145蛋白酶变体，将包括本发明的变体的突变DNA转化到一个感受态枯草芽孢杆菌菌株并使用标准方案发酵(液体介质，3-4天，30℃)。将培养液离心(26000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余的芽孢杆菌宿主细胞。将0.2μm滤液以1:1与3.0M(NH4)2SO4混合，并且将该混合物施加到苯基-琼脂糖FF(高载量(high sub))柱(来自GE医疗公司(GEHealthcare))，该柱以100mM H3BO3、10mM MES/NaOH、2mM CaCl2、1.5M(NH4)2SO4(pH 6.0)平衡。在用平衡缓冲液清洗该柱之后，将蛋白酶用100mM H3BO3、10mM MES、2mM CaCl2(pH6.0)进行逐步洗脱。收集洗脱峰(包含蛋白酶活性)，并且施加至在100mM H3BO3、10mM MES、2mM CaCl2(pH 6.0)中平衡的杆菌肽琼脂糖柱(来自Upfront层析公司(Upfrontchromatography))上。在用平衡缓冲液充分地清洗该柱之后，将蛋白酶用具有25％(v/v)2-丙醇的100mM H3BO3，10mM MES，2mM CaCl2，1M NaCl(pH 6)洗脱。将该洗脱峰(包含蛋白酶活性)转移至在G25葡聚糖凝胶柱(来自GE医疗公司)上的20mM MES、2mM CaCl2(pH6.0)。经G25转移的峰是纯化的制剂，并且将其用于进一步实验。
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实例2：抑制剂的结合常数的确定
将经纯化的蛋白酶变体预稀释在稀释缓冲液中至大约0.2mg/ml。然后将40μl经稀释的蛋白酶与40μl抑制剂溶液(Z-Gly-Ala-NHCH(CH2C6H4pOH)C(OH)(SO3Na)-H，其中Z是苄氧基羰基)或40μl 4-FPBA溶液在96孔微量滴定板(Nunc F 96-MTP)的孔中混合。针对每个蛋白酶变体，测试8种浓度的抑制剂溶(600μM、200μM、67μM、22μM、7.4μM、2.47μM、0.82μM、以及0μM)液和8种浓度的4-FPBA(120mM、40mM、13.3mM、4.44mM、1.48mM、0.494mM、0.164mM、以及0mM)。在室温下将蛋白酶和抑制剂混合10min后，将30μl的混合物转移至在孔中具有270μl标准B洗涤剂的微量滴定板(Nunc U96 PP 0.5ml)中，导致0-30μM的抑制剂浓度和0-6000μM的4-FPBA浓度。使用磁棒将蛋白酶、抑制剂、和洗涤剂混合1小时，在室温下保持1小时以达到平衡。然后将20μl转移至微量滴定板(Nunc F 96-MTP)中。添加100μl底物溶液，并且5sec混合后，在SpectraMax Plus读取器上每20sec持续5min测量405nm处的吸收值。使用来自在405nm处的吸光值的初始增加的线性回归的斜率来计算表观结合常数。
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Ki的计算
假设蛋白酶和抑制剂根据以下方程反应：
其中E是蛋白酶，I是抑制剂，并且EI是蛋白酶-抑制剂复合物。进一步假设，在标准B中的1小时孵育期间，达到了蛋白酶、抑制剂、以及蛋白酶-抑制剂复合物之间的平衡，并且在用于线性回归的测量时间期间，底物溶液的添加不会导致该平衡的显著改变。然后将在洗涤剂溶液中的酶-抑制剂的浓度由如下给出：
其中Etot是总蛋白浓度([Etot]＝[E]+[EI])，Itot是总抑制剂浓度([Itot]＝[I]+[EI])，并且Ki是针对该反应的平衡结合常数。所测量的斜率V由如下给出：
V＝V0 ＊(1[EI]/[Etot])＝V0 ＊(1-(([Etot]+[Itot]+Ki-sqrt(([Etot]+[Itot]+Ki)^2-4＊[Etot]＊[Itot]))/2[Etot])
其中V0是没有添加抑制剂的斜率。为了计算表观结合常数Ki，以Ki和V0作为变量来进行所测量斜率在各种抑制剂浓度下对该方程的最小二乘方拟合。
如上所述，计算针对该亲本蛋白酶和针对每个变量的Ki。
针对每个变体具有Ki，如果数据对于至少两个区别仅在于突变的变体是可用时，则计算单突变的效果是有可能的。在这种情况下，将针对突变的相对Ki计算为：
较低的Ki是所期望的，因为在较低抑制剂浓度下可以获得令人满意的抑制作用，因此有益突变具有相对Ki<1.0
以下表显示这种相对Ki突变。每行显示：
·突变(柱1：“突变”)
·一种包括来自柱1(柱2：“具有突变的变体”)的突变的蛋白酶变体(相对于SEQID NO:2)
·另一种蛋白酶变体(相对于SEQ ID NO:2)，其与柱2中的蛋白酶变体不同之处仅在于不具有在柱1(柱3：“不具有突变的变体”)中的突变
·在柱3中的变体的上下文中，标准B洗涤剂中所测量的柱1中突变的相对Ki突变(柱4：“标准B中的抑制剂结合”)
·在柱3中的变体的上下文中，在pH 8的Tris缓冲液中所测量的柱1中突变的相对Ki突变(柱5：“Tris缓冲液(pH 8)中的抑制剂结合”)
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实例4：在标准B洗涤剂中结合常数的确定
如在实例3中所述计算Ki。实验条件示出在表5中。针对抑制剂NNIC和4-FPBA的改进因子(IF)或相对示出在表6和7中。
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Claims (15)

1.一种蛋白酶变体，其包括一个或多个选自下组的取代，该组由以下各项组成：Q70F、Q70A、Q70N、S111R、S111E、S111D、S114A、S114Q、S144R、A145E、K146T、K146N、K146W、K146F、K146A、I150A、I150N、I150N、I150S、A151R、N176Y、I178Y、I178F、I178P、G182A、L184F、L184Y、L184F、L184Y、L184W、L184D、R224D、R224G、R224S、以及Y240R，其中这些位置对应于SEQ ID NO:3的位置，其中该变体与SEQ ID NO:3具有至少70％序列一致性，并且其中该变体具有蛋白酶活性。
2.如权利要求1所述的蛋白酶变体，相比于该亲本或相比于具有SEQ ID NO:3的蛋白酶，该蛋白酶变体具有减少的Ki。
3.如权利要求1-2中任一项所述的蛋白酶变体，其中该变体选自下组，该组由以下各项组成：
a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性的多肽；
b)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中或高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列、或(iii)(i)或(ii)的全长补体杂交；
c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或者编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列具有至少75％一致性的多核苷酸编码的多肽；和
d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性
e)蛋白酶变体，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性，并且包括选自下组的改变，该组由以下各项组成
S114Q、S173P、S175P、F180Y
K146T、S173P、S175P、F180Y
K146N、S173P、S175P、F180Y
K146W、S173P、S175P、F180Y
K146F、S173P、S175P、F180Y
K146A、S173P、S175P、F180Y
I150A、S173P、S175P、F180Y
I150N、S173P、S175P、F180Y
S27K、I150N、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、Q198E、T297P
S27K、K146P、S148R、A151R、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、Q198E、N199K、T297P
S173P、S175P、N176Y、F180Y
S173P、S175P、I178Y、F180Y
S173P、S175P、I178F、F180Y
S173P、S175P、I178F、F180Y
S173P、S175P、I178P、F180Y
S173P、S175P、F180Y、L184F
S173P、S175P、F180Y、L184F
S27K、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、L184F、Q198E、T297P
S27K、I121V、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、L184F、Q198E、T297P
S27K、Q70N、G107N、I121V、E127Q、S173P、S175P、F180Y、L184F、Q198E、T297P
S27K、S173P、G174K、S175P、F180Y、L184F、Q198E、N199K、T297P
S27K、S173P、G174K、S175P、F180Y、L184F、Q198E、N199R、T297P
S173P、S175P、F180Y、L184Y
S27K、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、L184Y、Q198E、T297P
S27K、S173P、G174K、S175P、F180Y、L184Y、Q198E、N199K、T297P
S27K、S173P、G174K、S175P、F180Y、L184Y、Q197K、Q198E、T297P
S173P、S175P、F180Y、L184W
S27K、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、L184W、Q198E、T297P
S173P、S175P、F180Y、L184D
S173P、S175P、F180Y、R224D
S173P、S175P、F180Y、R224G
S27K、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、Q198E、N199K、R224G、T297P
S173P、S175P、F180Y、R224S
S27K、I121V、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、Q198E、R224S、T297P
S27K、S171D、S173P、G174R、S175P、G182A、L184F、Q198E、N199K、R224G、T297P
S27K、S171D、S173P、G174R、S175P、G182A、L184F、Q198E、N199K、T297P
S27K、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、G182A、L184F、Q198E、N199K、R224G、T297P
S27K、S171N、S173P、G174R、S175P、F180Y、G182A、L184F、Q198E、N199K、T297P
S27K、V162T、S173P、G174K、S175P、F180Y、L184F、Q197K、Q198E、T297P
S27K、V162T、S173P、G174K、S175P、F180Y、Q197K、Q198E、T297P
Q70F
Q70A
Q70N
S111R
S111E
S111D
S114A
S144R
A145E
I150N
I150S
G182A
L184F
L184Y
R224G以及
Y240R。
4.如权利要求1-3中任一项所述的蛋白酶变体，其中该变体与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性。
5.如权利要求1-4中任一项所述的蛋白酶变体，其中相比于SEQ ID NO:3的改变的总数是1-20个，例如1-10个和1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个改变。
6.一种洗涤剂组合物，其包括根据权利要求1至5中任一项所述的蛋白酶变体。
7.如权利要求6所述的洗涤剂组合物，其进一步包括一种或多种洗涤剂组分。
8.根据权利要求6-7中任一项所述的洗涤剂组合物，其进一步包括一种或多种选自下组的另外的酶，该组由以下各项组成：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶、或其任何混合物。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的洗涤剂组合物，其处于棒，均匀的片剂，具有两层或更多层的片剂，具有一个或多个室的袋，规则的或压缩的粉末，颗粒，糊，凝胶，或规则的、压缩的或浓缩的液体的形式。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的洗涤剂组合物在清洁过程如洗衣或硬表面清洁如餐具清洗中的用途。
11.一种用于获得蛋白酶变体的方法，该方法包括向亲本蛋白酶中引入一个或多个以下的取代：SEQ ID NO 3的Q70F、Q70A、Q70N、S111R、S111E、S111D、S114A、S114Q、S144R、A145E、K146T、K146N、K146W、K146F、K146A、I150A、I150N、I150N、I150S、A151R、N176Y、I178Y、I178F、I178P、G182A、L184F、L184Y、L184F、L184Y、L184W、L184D、R224D、R224G、R224S、以及Y240R，其中该变体具有与SEQ ID NO:3至少60％一致的氨基酸序列，并且回收该变体。
12.如权利要求11所述的方法，其中该变体包括对应于SEQ ID NO:3的成熟多肽的位置114、146、150、151、176、178、184、或224的两个、三个、四个或五个取代。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的方法，其中该蛋白酶变体与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中该亲本蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：
a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性的多肽；
b)由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中或高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列、或(iii)(i)或(ii)的全长补体杂交；
c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或者编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列具有至少60％一致性的多核苷酸编码的多肽；和
d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中该亲本蛋白酶与SEQ ID NO:3具有至少75％，如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性。
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