JP2001503269A

JP2001503269A - ズブチラーゼ変異体及び、組成物

Info

Publication number: JP2001503269A
Application number: JP52096198A
Authority: JP
Inventors: デルオステン，クラウスボン; ハルキエル，トルベン; アンデルセン，カルステン; バウディツ，ペテル; カンプハンセン，ペテル
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-11-04
Filing date: 1997-11-04
Publication date: 2001-03-13
Also published as: CN1136311C; CN1530443A; US20020102702A1; WO1998020116A1; KR100591553B1; KR20000053071A; ATE409743T1; US6300116B1; BR9712878A; CA2270180C; CA2270180A1; JP3756926B2; CN1235637A; EP0932667B1; US7098017B2; JP2005160490A; AU4773197A; EP0932667A1; DE69739020D1

Abstract

(57)【要約】多くのズブチラーゼのための遺伝子を突然変異誘発し、そしてその突然変異誘発された遺伝子を適切な宿主において発現することによって生成される酵素が示される。前記酵素は、野生型親酵素に比較して、改良された自己タンパク質加水分解安定性を示す。

Description

【発明の詳細な説明】ズブチラーゼ変異体及び、組成物技術分野本発明は、洗剤組成物を配合することにおいて、及び高められた自己タンパク質分解安定性を示すことにおいて有用な新規変異体プロテアーゼ酵素又は酵素変異体；前記酵素を含む洗浄及び洗剤組成物；適切な宿主細胞又は生物中に挿入される場合、前記酵素の発現をコードする突然変異誘発された遺伝子；及びそれにより形質転換され、そして前記酵素変異体を発現することができる宿主細胞に関する。発明の背景洗剤産業においては、酵素は、30年以上もの間、洗浄配合物に付与されて来た。そのような配合物に使用される酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、及び他の酵素、又はそれらの混合物を包含する。商業的に最とも重要な酵素は、プロテアーゼである。プロテアーゼは、30年以上もの間、洗剤産業において使用されて来たが、それらの酵素が、たとえば洗剤組成物に存在する基質及び／又は他の物質といかにして相互作用するかについての詳細はほとんど未知のままである。プロテアーゼの特定の残基に関係し、そしてプロテアーゼの一定の性質、たとえば酸化及び熱安定性に影響を与えるいくつかの因子が解明されて来たが、しかし見出されるべき多くの因子が残存する。また、物理的又は化学的特徴が、特定の洗剤組成物におけるプロテアーゼの良好な洗浄性能又は安定性を担当するかは、まだ正確には知られていない。現在使用されているプロテアーゼは、多くの場合、天然からプロテアーゼを単離し、そして洗剤配合物においてそれらを試験することによって見出されて来た。現在、少なくとも次のプロテアーゼが商業的に利用できることが知られており、そしてそれらの多くは、世界の多くの国々において多量に市販されている：ズブチリシンBPN'又はNovo（たとえばSIGMA，St．Louis，USAかバシラスレンタス(Bacillus lentus)ズブチリシン、すなわち市販される； NOVO NORDISK A/Sにより市販されるズブチリシン147；多くの商業的に使用されるプロテアーゼ、たとえば天然に存在するプロテアーゼのタンパク質操作された変異体、たとえばDURAZYM al，Inc.）。従って、本発明の目的は、特に洗剤産業への使用のための改良されたタンパク質操作されたプロテアーゼ変異体を供給することである。プロテアーゼタンパク質基質におけるアミド架橋を切断する酵素は、プロテアーゼ又は（交換可能的には）ペプチダーゼとして分類される（Walsh，1979，Enzymotic React son Mechanisms．W.H．Freeman and Comyany，San Francisco，Chapter 3を参照のこと）。バシラス属の種の細菌は、２種の細胞外タイプのプロテアーゼ、すなわち中性プロテアーゼ（又はメタロプロテアーゼ）、及びアルカリプロテアーゼを分泌し、それらの中で、最とも重要なものは、セリン・エンドペプチダーゼであり、そして通常、ズブチリシンとしても言及される。セリンプロテアーゼセリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、そして活性部位で必須セリン残基が存在する酵素である（White，Handler and Smith，1973“Prin ciples of Biochemistry”，Fifth Edition，McGraw-Hill Book Company，NY，P P．271-272）。細菌セリンプロテアーゼは、20,000〜45,000ドルトンの分子量を有する。それらは、ジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害される。それらは単純な末端エステルを加水分解し、そして真核キモトリプシン、又はセリンプロテアーゼに対し、活性において類似している。サブグループを包含するより狭い用語、アルカリプロテアーゼは、pH9.O〜11.Oのいくつかのセリンプロテアーゼの高いp H最適性を反映している（総説として、Priest（1977）Bacteriological Rev．41 ：711-753を参照のこと）。ズブチラーゼセリンプロテアーゼのサブグループ、すなわち仮りに命名されたズブチラーゼは、Siezenなど.，Protein Engng．4（1991）719-737により提案されている。それらは、ズブチリシン様プロテアーゼとして前に言及されたセリンプロテアーゼの40個以上のアミノ酸配列の相同性分析により定義される。ズブチリシンは、グラム−陽性細菌又は真菌類により生成されるセリンプロテアーゼとしてこれまで定義されており、そしてSiezenなどによれば、現在、ズブチラーゼのサブグループである。広範囲の種類のズブチラーゼが同定されており、そして多くのズブチラーゼのアミノ酸配列が決定されている。それらは、バシラス株からの次のような６個以上のズブチリシンを包含する：ズブチリシン168、ズブチリシンBPN'、ズブチリシンCarlsberg、ズブチリシンＹ、ズブチリシンアミロサッカリチカス、及びメセンテリコペプチダーゼ(Kuriharaなど．(1972)J．Biol ．Chem．247：5629-5631；Wellsなど．(1983)Nucleic Acids Res．11：7911-792 5；Stahl and Ferrari（1984）J．Bucteriol．159：811-819，Jacobsなど．(198 5)Nucl．Acid Res．13：8913-8926；Nedkovなど．(1985)Biol．Chem．Hoppe-Sey ler 366：421-430：Svendsenなど．(1986)FEBS Lett．196：228-232)、アクチノミセタレス(Actinomycetales)からの１つのズブチリシン、サーモアクチノミセス・バルガリス(Thermoactionomyces vulgaris)からのサーミターゼ(Melounなど．(1985)FEBS Lett．198：195-200)、及び１つの真菌類ズブチリシン、すなわちトリチラキウム・アルブム（Tritirachium album）からのプロテアーゼＫ（Jony and Mayer（1985）Biol．Chem．Hoppe-Seyler 366：584-492）；さらなる参照のためには、Siezenなど．からの表Ｉが下記に再現されている。ズブチリシンは、物理的及び化学的に十分に特徴づけられている。それらの酵素の一次構造（アミノ酸配列）の知識の他に、基質の結合、遷移状態、生成物、少なくとも３種の異なったプロテアーゼインヒビターを明確にし、そして自然の変動に関する構造関係を定義する、ズブチリシンの50 以上の高い分解Ｘ−線構造が決定されている（Kraut（1977）Ann．Rev．Biochem ．46：331-358）。ズブチラーゼの１つのサブグループ、Ｉ−Ｓ１は、“従来の”ズブチリシン、たとえばズブチリシン168、ズブチリシンBPN'、ズブチリシンDYを包含する。ズブチラーゼＩ−Ｓ２の追加のサブグループは、Siezenなど.(前記)により認識されている。サブグループＩ−Ｓ２プロテアーゼは、より高いアルカリズブチリシンとして記載されており、そして酵ターゼYaBを包含する。ズブチラーゼ遺伝子のランダム及び部位特定突然変異誘発は、酵素の物理的及び化学的性質の知識から発生し、そしてズブチラーゼの触媒活性、基質特異性、三次構造、等に関する情報に寄与して来た（Wellsなど．(1987)Proc．Natl．Aca d．Sci．USA，84：1219-1223；Wellsなど．(1986)Phil．Trans．R．Soc．Lond． A．317：415-423；Hwang and Warshel（1987）Biochem．26：2669-2673；Raoなど.，(1987)Nature 328：551-554）。この分解を包含するより最近の出版物は、基質における特定の標的配列を切断する（位置24及び64）変異体の企画を言及する、Carterなど．(1989)Proteins 6 ：240-248；多くの前に公開された結果を議論する、Graycarなど．(1992)Annals of the New York Academy of Sciences 672：71-79；及び前の結果をまた再考する、 Takagi（1993）Int．J．Biochem．25：307-312である。特に、ズブチリシン遺伝子の部位特定突然変異誘発がより注意を引きつけ、そして種々の突然変異が下記の特許出願及び特許記載されている。すでに特徴づけられたプロテアーゼ変異体多くの参考資料がプロテアーゼ変異体の構成を記載する。全体の従来技術状態の概観の獲得をより容易にするために、それらの参考資料が２種のセクションに整理される。セクション１は、本発明に開示される変異体に関連されるとは現在思われないプロテアーゼ変異体の技術的背景及び同定を記載する参考資料を扱う。それらの参考資料は主に、異なった目的のためのプロテアーゼ変異体の構成における当業界の状態を要約するために包含される。セクション２は、本発明の変異体にいくらか関連していると思われるプロテアーゼ変異体の同定を記載する参考資料を扱う。技術的状態を要約する参考資料（セクション１）： “カルボニルヒドロラーゼ”における部位特異的又はランダムに生成された突然変異、及び種々の性質、たとえばKcat／Ka比、pH−活性プロフィール、及び酸化安定性についての突然変異誘発された酵素の続くスクリーニングに関するヨーロッパ特許第130756号（GENENTECH）(アメリカ再発行特許第34,606号（GENENC OR）に対応する)。この出版物は、変更された性質を示す酵素を供給するために、一定の特定された位置、すなわち^-1Tyr，³²Asp，¹⁵⁵Asn，¹⁰⁴Tyr，²²²Met，¹⁶ ⁶ Gly，⁶⁴His，¹⁶⁹Gly，¹⁸⁹Phe，³³Ser，²²¹Ser，²¹⁷Tyr，¹⁵⁶Glu又は¹⁵²PlaにおけるズブチリシンBPN'の部位特異的突然変異を開示する。位置−１を除くすべてのそれらの位置は、前記出願の出願の前、酵素の機能に関連されていることが知られているので、この出願は、特定の所望する性質を有する酵素を得るために突然変異を導入する位置を決定する問題を解決することに寄与しない。ズブチリシンCarlsberg及びその２つの変異体のクローニング及び発現に関するヨーロッパ特許第214435号（HENKEL）。この出願においては、¹⁵⁸Aspの¹⁵⁸Ser への及び¹⁶¹Serの¹⁶¹Aspへの突然変異のための理由が提供されていない。 WO87/04461(AMGEN)において、改良されたpH及び熱安定性を示す突然変異誘発された酵素を得るために親酵素に存在するAsn-Gly配列の数を減じることが提案されており、この出願においては、ズブチリシンBPN'における¹⁰⁹Asp及び²¹⁸Asn 残基の除去、突然変異誘発又は修飾が強調されている。実施例には、いづれの欠失又はGly-残基の修飾も提供されていない。 WO87/05050号(GENEX)は、ランダム突然変異、及び改良された性質についてズブチリシンBPN'の多くの変異体の続くスクリーニングを開示する。この出願においては、突然変異は、位置²¹⁸Asn，¹³¹Gly，²⁵⁴Thr，¹⁶⁶Gly，¹¹⁶Ala，¹⁸⁸Ser，¹²⁶ Leu、及び⁵³Serに記載されている。ヨーロッパ特許第260105号（GENENCOR）は、触媒トリアド(triad)を含む酵素のある性質を、前記触媒トリアドから約15Å内のアミノ酸残基を選択し、そしてその選択されたアミノ酸残基を他の残基により置換することによって修飾することを記載する。この明細書に記載されるズブチラーゼタイプの酵素は、触媒三元体を含む酵素の種類に属するものとして特別に言及されている。ズブチリシンにおいては、位置222及び217が置換のための好ましい位置として示されている。また、ズブチリシンBPN'における⁹⁹Aspの⁹⁹Serへの変換が酵素のpH依存性を変更することが、Thomas，Russell，and Fersht（1985）Nature 31 8：375-376により示されている。続く文献（1987）J．Mol．Biol．193：803-813においては、同じ著者がまた、¹⁵⁶ Glnに代わる¹⁵⁶Serの置換も論じている。それらの両突然変異は、活性⁶⁴Hisから約15Åの距離内に存在する。 Nature 328：496-500（1987）において、Russel and Fershtは、それらの実験の結果、及び表面の電荷の変化を得るために酵素を突然変異誘発することによってpH−活性プロフィールを変更するための規則を論じている。 WO88/08028(Genex)及びWO88/08033(Amgen)の両者は、ズブチリシンBPN'のカルシウム結合部位におけるアミノ酸残基の修飾に関する。前記酵素は、より陰性に荷電された残基を元の残基と置換することによって安定化されると言われる。 WO95/27049(SOLVAY S.A.)は、次の突然変異を有するズブチリシン390タイププロテアーゼを記載する：N43R＋N116R＋N117R（BPN’番号付け）。データは、その対応する変異体が、野生型に比較して、改良された安定性を有することを示す。 WO95/30011，WO95/30010及びWO95/29979（PROCTER & GAMBLE COMPANY）は、表面結合されたよごれへの酵素の吸着を変える（すなわち、低める）よう企画される、ズブチリシンBPN'及びズブチリシン309の両者における６個の領域、特に位置199−200（BPN’番号付け）を記載する。基質への酵素による、低められた吸着はより良好な洗剤洗浄性剤をもたらすことが提案されている。いづれかの変異体に対するデータ又は特定の洗剤洗浄性能のデータは提供されていない。本発明に関連するこれまでに特徴づけられたプロテアーゼ変異体（セクション２）：ヨーロッパ特許第251446号（GENENCOR）において、それは、一次及び三次構造レベルでの相同体考慮が、保存されているか又は否かにかかわらず、同等のアミノ酸残基を同定するためにいかにして適用され得るかを記載する。ズブチリシン BPN'の三次構造の発明者の知識と共にこの情報が、変更された性質を有する変異体の獲得の期待を供って、突然変異に対して敏感な多くの位置の選択を発明者に導びくことが主張されている。そのような同定される位置は次のものである：¹² ⁴ Met，²²²Met，¹⁰⁴Tyr，¹⁵²Aln，¹⁵⁶G1u，¹⁶⁶Gly，¹⁶⁹Gly，¹⁸⁹Phe，²¹⁷Tyrさらに、¹⁵⁵Asn，²¹Tyr，²²Thr，²⁴Ser，³²Asp，³³Ser，³⁶Asp，⁴⁶Gly，⁴⁸Ala，⁴⁹Se r，⁵⁰Met，⁷⁷Asn，⁸⁷Ser，⁹⁴Lys，⁹⁵Va1，⁹⁶Leu，¹⁰⁷Ile，¹¹⁰Gly，¹⁷⁰Lys，¹⁷¹ Tyr，¹⁷²Pro，¹⁹⁷Asp，¹⁹⁹Met，²⁰⁴Ser，²¹³Lys及び²²¹Serの位置が、酵素の種々の性質に影響を及ぼすことが予測されるものとして同定されている。また、多くの突然変異がそれらの提案を支持するために例示されている。それらの位置における単一の突然変異の他に、発明者はまた、多くの複数突然変異を実施した。さらに、発明者は、²¹⁵Gly，⁶⁷His，¹²⁶Leu，¹³⁵Leu、及び興味あるものとして、セグメント97−103，126−129，213−215及び152−172内のアミノ酸残基を同定しているが、しかしそれらの位置のいづれかにおける突然変異は例示されていない。本発明の目的のために特に興味あるものとして、ヨーロッパ特許第251446号の発明者は、¹⁷⁰Lys（ズブチリシンBPN'における、タイプＩ−Ｓ１）を置換することを示唆しており、特に彼らは、Glu又はArgを元のLysに導入することを提案している。Glu変異体が生成されたことは明らかであり、そして自己分解性分解に対してひじょうに敏感であることが見出された（ページ48，121，123（表ＸＸＩは明白な誤りを包含するが、しかし86分から13分への自己分解半減期の低下を示す）及び図32を参照のこと） WO89/06279（NOVO NORDISK A/S）においては、位置170が興味あるものとして示されており、そして存在する残基をTyrにより置換することが提案されている。しかしながら、そのような変異体に関するデータは与えられていない。WO91/0 0345（NOVO NORDISK A/S）においては、同じ提案が存在し、そしてズブチリシン 309(タイプＩ−Ｓ２)における位置170のTyr変異体が約８のpHで、洗剤における改良された洗浄性能を示すことが見出されている（表III，IV，Ｖ，VI，VIII，Ｘにおける変異体S003）。他の位置における他の置換と組合せての同じ置換がまた、前記出願の遺伝子概念に従って、改良された洗浄性能を示す（同じ表及び表 VIIにおけるS004，S011−S014，S022−S024，S019，S020，S203，S225，S227）。ヨーロッパ特許第525610A1号（SOLVAY）においては、その一定の表面領域における疎水性を低めることによって、イオン性テンジド（tenside）に対しての酵素（ズブチリシンPB92に密接に関連するタイプＩ−Ｓ２ズブチラーゼ）の安定性を改良することが提案されている。位置164(BPN’番号付けを用いる場合、170) におけるArgをGlnと置換することが提案されている。この置換を包含する変異体はこの出願には開示されていない。 WO94/02618（GIST-BROCADES N.V.）においては、Ｉ−Ｓ２タイプのズブチリシンPB92の多くの位置164(BPN’番号付けを用いる場合、170)変異体が記載されている。元のArgをMet，Val，Tyr及びIleにより置換を示す例が提供されている。変異体の粉末洗剤における洗浄性能試験は、わずかな改良点を示す。特に、カカオに対するIle変異体洗浄性能試験に関しては、約20〜30％の改良点が示される。安定性データは提供されていない。 PCT/DK96/00207（まだ公開されていない）においては、改良された洗浄性能及び／又は貯蔵安定性を有する多くのプロテアーゼ変異体が記載されている。改良された洗浄性能を有するズブチラーゼ変異体が、元の残基よりもより疎水性のアミノ酸残基により親ズブチラーゼの疎水性ドメインに位置するか又は隣接する１又は複数のアミノ酸残基を置換することによって得られることが見出され、ここで前記疎水性ドメインはBLS3O9の残基1165，Y167，Y171（BASBPN番号付け）に対応する残基を含んで成り、そして前記隣接する残基はBLS309の残基E136， G159，S164，R170，A194及びG195（BASBPN番号付けによる）に対応する残基を含んで成る（PCT/DK96/00207）。アメリカ特許第5,543,302号は、異なる野生型プロテアーゼ（MI 質加水分解切断部位の同定を記載する。本発明は、本発明者の係属中の特許出願PCT/DK96/00207に記載されるグループのプロテアーゼ変異体における自己タンパク質加水分解切断部位の位置に影響を及ぼす特定のプロテアーゼ変異体に集中している。本発明の変異体は、アメリカ特許第5,543,302号における対応する野生型プロテアーゼについて記載される自己タンパク質加水分解パターンに比較して、変更された自己タンパク質加水分解パターンを示すことが見出された。発明の要約 BLS309の残基P129，P131，E136，G159，S164，1165，Y167，R170，Y171（BASB PN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数のアミノ酸残基に修飾を有するズブチラーゼ変異体が、その対応する野生型に比較して、変更された自己タンパク質加水分解パターンを有することが、今や驚くべきことには、見出された。その主要変更は、残基132〜133（BASBPN番号付けによる）間に位置するらしい自己分解性切断部位である。して強力なインキュベーションに基づいて、多くの部位で、それ自体、自己切断するであろう。しかしながら、初期の１〜５の切断部位（一次部位）は、ズブチラーゼプロテアーゼの産業的用途のために最高に適切なものである。残基132−133間に位置する前記自己分解性切断部位は、新規の一次自己タンパク質加水分解切断部位であると現在、思われる。これは、現在、この自己タンパク質加水分解切断部位がズブチラーゼプロテアーゼ酵素において、一次自己タンパク質加水分解切断部位として同定されている最初であると思われる。さらなる詳細に関しては、本明細書における実施例（下記参照のこと）に言及される。従って、第１の観点において、本発明は、残基132と133（BASBPN番号付けによる）との間に自己タンパク質加水分解切断部位を有する前駆体ズブチラーゼ酵素から誘導されることによって特徴づけられ、そしてBLS309の残基129，130，131 ，132，133，134，135，136（BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する残基での又は１又は複数の残基における置換、挿入又は欠失によりさらに修飾されているズブチラーゼ酵素変異体に関し；それにより前記変異体は前記前駆体ズブチラーゼ酵素に対して高められた自己タンパク質加水分解安定性を示す。第２の観点において、本発明は、BLS309の残基G159，S164，I165，Y167，R170 ，Y171（BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数のアミノ酸残基における修飾を有する前駆体ズブチラーゼ酵素変異体から誘導されることにより特徴づけられ；そしてさらに、残基129，130，131，132，133，134，135，136（BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する残基での又は１又は複数の残基における置換、挿入又は欠失により修飾されているズブチラーゼ酵素変異体に関し；それにより、前記変異体は前記位置129〜136のいづれかで修飾されていない前記前駆体ズブチラーゼ変異体に比べて高められた自己タンパク質加水分解安定性を示す。間に位置する自己タンパク質加水分解切断部位を有することを教示し、そして高められた自己タンパク質加水分解安定性を有する変異体を得るためにこの部位の囲りの広い領域（残基180〜210間）において修飾を行なうことを提案している。本発明者は、BLS309の残基P129，P131，E136，G159，S164，I165，Y167，R170 ，Y171（BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位号付けによる）間にこの自己タンパク質加水分解部位を確かめた。本発明者は、残基192〜193（BASBPN番号付けによる）間の自己タンパク質加水分解部位付近に特定の修飾（突然変異）、たとえばS190P及びG193A（BASBPN番号付けによる）を示唆する。そのような特定の突然変異はアメリカ特許第5,543,302号において論じられても又は示唆されてもおらず、ここでは、かなり広い領域（残基180〜210間）が単に記載されており、そして高められた自己タンパク質加水分解安定性をもたらす特異的突然変異はアメリカ特許第5,543,302号には開示されていない。さらなる詳細に関しては、本明細書における実施例（下記参照のこと）に言及されている。従って、第３の観点においては、本発明は、残基192と192（BAS BPN番号付けによる）との間に自己タンパク質加水分解切断部位を有する前駆体ズブチラーゼ酵素から誘導されることにより特徴づけられ、そしてさらに、残基 189，190，191，192，193，194，195，196（BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する残基での又は１又は複数の残基における置換、挿入又は欠失により修飾されているズブチラーゼ酵素変異体に関し；それにより、前記変異体は前記前駆体ズブチラーゼ酵素に対して高められた自己タンパク質加水分解安定性を示す。第４の観点において、本発明は、BLS309の残基P129，P131，E136，G159，S164 ，1165，Y167，R170，Y171（BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数のアミノ酸残基において修飾を有する前駆体ズブチラーゼ酵素変異体から誘導されることによって特徴づけられ、そしてさらに、BLS309の残基189，1 90，191，192，193，194，195，196（BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する残基での又は１又は複数の残基における置換、挿入又は欠失により修飾されているズブチラーゼ酵素変異体に関し；それにより、前記変異体は、前記位置189〜196のいづれかで修飾されていない前駆体ズブチラーゼ変異体に対して高められた自己タンパク質加水分解安定性を示す。さらなる観点において、本発明は、縮主細胞中に適切な態様で挿入され、続いて第１の観点のズブチリシン酵素を発現するようにされる、本発明の酵素を発現することができるDNA構造体に関する。さらなる観点において、本発明は、第２の観点のDNA構造体を適切な宿主中に挿入し、所望のズブチラーゼ酵素を発現するよう前記宿主を培養し、そして前記酵素生成物を回収することによって、本発明のズブチリシン酵素を製造することに関する。本発明は、上記に示されるように、ズブチラーゼサブグループＩ −Ｓ２酵素及びその対応する酵素変異体を発現する遺伝子の変異体に一部関するが、但しそれらだけには制限されない。本発明により包含される他のズブチラーゼ遺伝子変異体は、たとえばズブチラーゼサブグループＩ−Ｓ１、たとえばズブチリシンBPN'の変異体、及びズブチリシンCarlsberg遺伝子及び続く変異体ズブチリシンBPN'、プロテアーゼＫ及びズブチリシンCarlsberg酵素（濃液体洗剤において改良された安定性を示す）である。本発明により包含されるさらに追加のズブチラーゼ遺伝子変異体は、たとえばプロテアーゼＫ及び他の遺伝子及び続く変異体プロテアーゼＫ、及び他のズブチラーゼ酵素（濃液体洗剤において改良された安定性を示す）である。本発明に従って修飾され得る親ズブチラーゼ酵素の他の例は、表Ｉに列挙される。さらに、本発明は、洗浄組成物への変異体酵素の使用、変異体酵素を含んで成る洗浄組成物、特に変異体ズブチリシン酵素を含んで成る洗剤組成物に関する。本発明によれば、そのような洗剤組成物はさらに、１又は複数の他の酵素、たとえばリパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、等を含むことができる。略語アミノ酸Ａ＝ Ala ＝アラニンＶ＝ Val ＝バリンＬ＝ Leu ＝ロイシンＩ＝ Ile ＝イソロイシンＰ＝ Pro ＝プロリンＦ＝ Phe ＝フェニルアラニンＷ＝ Trp ＝トリプトファンＭ＝ Met ＝メチオニンＧ＝ Gly ＝グリシンＳ＝ Ser ＝セリンＴ＝ Thr ＝トレオニンＣ＝ Cys ＝システインＹ＝ Tyr ＝チロシンＮ＝ Asn ＝アスパラギンＱ＝ Gln ＝グルタミンＤ＝ Asp ＝アスパラギン酸Ｅ＝ Glu ＝グルタミン酸Ｋ＝ Lys ＝リジンＲ＝ Arg ＝アルギニンＨ＝ His ＝ヒスチジンＸ＝ Xaa ＝いづれかのアミノ酸核酸塩基Ａ＝アデニンＧ＝グアニンＣ＝シトシンＴ＝チミン（DNAにおいてのみ）Ｕ＝ウラシル（RNAにおいてのみ）変異体本発明に従って製造され、又は設計される種々の酵素変異体を説明する場合、次の命名法が参照の容易さのために適応されて来た：元のアミノ酸：位置：置換されるアミノ酸。これによれば、位置195におけるグルタミン酸によるグリシンの置換は次のように示されて： Gly195Glu又はG195E；同じ位置でのグリシンの欠失は次の通りであり： Gly195^*又はG195^*；そして追加のアミノ酸残基、たとえばリジンの挿入は次の通りである： Gly195GlyLys又はG195GK。番号付けのために使用される配列との比較における欠失が示される場合、位置 36におけるアスパラギン酸の挿入に関して、そのような位置における挿入は次のように示される： * 36 Asp 又は * 36 D。複数の突然変異は、次のように＋により分離され： Arg170Tyr＋Gly195Glu又はR170Y＋G195E、ここでそれらは、それぞれアルギニン及びグリシンをチロシン及びグルタミン酸により置換する、位置170及び195における突然変異を示す。位置本出願及び付随する請求の範囲において変異体を説明する場合、Siezenなど., 前記におけるように種々のズブチラーゼの整列(alignment)が使用される。ズブチラーゼに関連する他の出版物においては、特定酵素の他の整列(alignment)又は番号付けが使用されて来た。本明細書に使用される番号付けにより特定残基の位置を確立することは、当業者にとって日常のことである。多数のズブチラーゼと共に本発明の対応する残基の整列(alignment)を示す図１を参照のこと。多くのズブチラーゼと共に本発明の対応する残基の整列(alignment)を示すWO91/0034 5の表Ｉも参照のこと。表Ｉのために使用される文献：が括弧で示される): ARB172 Kamekura and Seno，(1990)Biochem．Cell Biol．68：352-359（成熟プロテアーゼ残基１〜35のアミノ酸配列決定；残基14は決定されなかった）。 BSS168 Stahl．and Ferrari．(1984)J．Bacteriol．158：411-418（KO1988）。 Yoshimoto，Oyamaなど．(1488)J．Blochem．103：1060-1065（Ｂ．サブチリスvar．アミロサカリチカスからの成熟サブチリシンは、T130S及び T162Sを有することにおいて異なる）。Svendsen，など．(1986)FEBSLet t．196：228-232（PIR A23624；アミノ酸配列決定；Ｂ．メセンテリカスからの成熟アルカリメセンテリコペプチダーゼはS85A，A88S，S89A，S183A及びN259Sを有することにおいて異なる）。 BASBPN Wells,など．(1983)Nucl．Acids Res．11 7911-7925（X00165）。Vasan thaなど.，(1984)J．Bacteriol．159：811-814(K02496)。 BSSDY Nedkov et al．(1983)Hoppe-Seyler's Z．Physiol．Chem．364：1537-1 540（PIR A00969；アミノ酸配列決定）。 BLSCAR Jacobs et al．(1985)Nucleic Acids Res．13 8913-8926（X03341）。S mith et al．(1968)J．Biol．Chem．243：2184-2191（PIRA00968：アミノ酸配列決定；成熟プロテアーゼ配列は、T103S，P129A，S158N，N161S 及びS212Nを有することにおいて異なる）。 BLS147 Hastrupなど．(1989)PCT Patent Appl．WO 8906279，Pu など．(1990)Appl．Microbiol．Biotechnol.，33：519-523（バシラスs p．no．AH-101からの成熟アルカリプロテアーゼ残基１〜20のアミノ酸配列決定；この配列はN15Sを有することにおいてBLS147とは異なる）。 BABP92 van der Laanなど．(1991)Appl．Environ．Microbiol．5 特許出願WO8906279，Pub．13．Jaly 1989。（Ｂ．レンタを有することにおいてのみ異なる）。Godetteなど．(1991)Abstracts 5 th Protein Society Symposium，June 6，Baltimore：abstract M8（Ｂ．レンタスからの高アルカリプロテアーゼは、N87S，S99D，S101R，S10 3A，V104I及びG159Sを有することにおいて異なる）。 BPSM48 Rettenmsierなど．（1990）PCT Patent Appl．wo 90/04022。Publ．Apr il19，1990。 BYSYAB Kanakoなど．（1989）J．Bacteriol．171：5232-5236（M28537）。 BSEPR Slomaなど．（1988）J．Bacteriol．170：5557-5563（M22407）。Bruck ner（1990）Mol．Gen．Genet．221：486-490（X53307）。 BSBPF Slomaなど．（1990）J．Bacteriol．172：1470-1477（M29035；証正された）。Wuなど．（1990）J．Biol．Chem．265：6845-6850（JO5400：この配列は、フレームシフトのために、A169V及び586以下のＣ−末端残基を有することにおいて異なる）。 BSISP1 Koideなど．（1986）J．Bacteriol．167：110-116（M13760）。 BSAIA50 Stronginなど．（1978）J．Bacteriol．133：1401-1411（成熟プロテアーゼ残基１〜54のアミノ酸配列決定；残基３，39，40，45，46，49及び 50は決定されなかった）。 BTFIN1 Chestukhinaなど．（1985）Biokhimiya 50：1724-1730（Ｂ．スリンギエンシスの変種のイスラエリエンシスからの成熟プロテアーゼ残基１〜 14、及び変種フィニチマスからの残基１〜16及び223〜243のアミノ酸配列決定）。Kunitakeなど．（1989）Agric．Biol．Chem．53：3251-3256 （変種クルスタキ。BTKUKSからの成熟プロテアーゼ残基６〜20のアミノ酸配列決定）。 BCESPR Chestukhinaなど．（1985）Biokhimlya 50：1724-1730（成熟残基１〜1 6及び223〜243のアミノ酸配列決定）。 NDAPII Tsujiboなど．（1980）Agric．Biol．Clem．54：2177-21 79（成熟残基１〜26のアミノ酸配列決定）。 TVTHER Meloumなど．（1985）FEBS Lett．183：195-200（PIR A00973：成熟プロテアーゼ残基１〜274のアミノ酸配列決定）。 EFCYLA Segarraなど．（1991）Infect．Immun．59：1239-1246。 SEEPIP Schnellなど．（1991）personal communication（Siezenなど.(前記)）。 SPSCPA Chenなど．（1990）J．Biol．Chem．265：3161-3167(JO5224)。 DNEBPR Korttなど．（1991）Abstracts 5th Protein Society Symposium，June 22-26，Baltimore。abstract 576。 LLSK11 Vosなど．（1989）J．Biol．Chem．264：13579-13585(J04962)。Kokなど．（1988）Appl．Environ．Microbiol．54：231-238（M24767；Wg2株からの配列は44の位置、たとえばプロテアーゼドメインにおける18の差異及び残基1617〜1676の欠失において異なる）。Kiwakiなど．（1989） Mol．Microbiol.，3：359-369（X14130；NCD0763株からの配列は、46の位置、たとえばプロテアーゼドメインにおける22の差異及び残基1617〜 1676の欠失において異なる）。 XCEXPR Liuなど．（1990）Mol．Gen．Genet：220：433-440。 SMEXSP Yanagidaなど．（1986）J．Bacteriol．166：937-994（M13469）。 TAAQUA Teradaなど．（1990）J．Biol．Chem．265：6576-6581(J05414)。 TRAT41A McHaleなど．（1990）Abstracts 5th Eur．Congr．Biotechn．Christia nsen，Munck and Villadsen(eds)，Munksgaa rd Int．Publishers，Copenhagen。 VAPROA Deaneなど．（1989）Gene 76：281-288（M25499）。 SRESPD Lavrenovaなど．（1984）Biochemistry USSR．49：447-454（残基１〜2 3のアミノ酸配列；残基13，18及び19は決定されなかった）。 AVPRCA Makdenerなど．（1991）Mol．Gen．Genet．225：113-120(公開された配列は、フレーフシフト読取り誤差のために位置200〜210近くで28個の未知の残基を有する)。 TAPROK Gunkel and Gassen（1989）Eur．J．Biochem．179：185−194（XI4688/ XI4689）。Janyなど．（1986）J．Biol．Chem．Hoppe-Seyler 367：87 （PIR A24541；アミノ酸配列；成熟プロテアーゼはS745G，SILST204-28 0DSL及びVNLL264−267FNLを有することにおいて異なる）。 TAPROR Samalなど．（1990）Mol．Microbiol．4：1789-1792（X56116）。 TAPROT Samalなど．（1989）Gene 85：329-333。 AOALPR Tatsumiなど．（1989）Mol．Gen．Genet．219：33-38。 Cheevadhanarahなど．（1991）EMBL Data Library（X54726）。 MPTHMY Gaucher and Stevenson（1976）Nethods Enzymol．45：4I5-433（残基１〜28、及び活性部位セリンを有するヘキサペプチドLSGTSMのアミノ酸配列決定）。 ACALPR Isogaiなど．（1991）Agric．Biol．Chem．55：471-477。 Stepanovなど．（1986）Int．J．Biochem．18：369-375（残基１〜27のアミノ酸配列決定；成熟プロテアーゼはH131]Q，R13[2]N及びS13[6]Aを有することにおいて異なる）。 KLKEX1 Tanguy-Rougeau，Wesolowski-Louvel and Fukuhara（1988)FEBS lett． 234：464-470（X07038）。 SCKEX2 Mizunoなど．（1988）Biochem．Biophys．Res．Commun．156：246-254( M24201)。 SCPRB1 Moehleなど．（1987）Mol．Cell．Blol．7：4390-4399(MI8097)。 YLXYPR2 Davidowなど．（1987）J．Bacteriol．169：4621-4629（M17741）。Mat obaなど．（1988）Mol．Cell Biol．8：4904-4916（M23353）。 CEBL14 Peters and Rose（1991）The Worm Breeder's Gazette 11：28。 DMFUR1 Roebroekなど．（1991）FEBS Lett．289：133-137(X59384)。 DMFUR2 Roebroekなど．（1992）267：17208-17215。 CMCUCU Kanedaなど．（1984）J．Biochem．95：825-829(活性部位セリンを有するオクタペプチドNIISGTSMのアミノ酸配列決定)。 HSFURI van den Ouwelandなど．（1990）Nucl．Acids Res．18：664（XO4329）（マウスフリンの配列は、51の位置、たとえば触媒ドメインにおける５の位置、すなわちA15E，Y21F，F223F，A232V及びN258[21D]において異なる。Misumiなど．（1990）Nucl．Acids Res．18：6719（X5566O；ラットフリンの配列は、49の位置、たとえば触媒ドメインにおける３つの位置、すなわちA15E，Y21F，H24Rにおいて異なる）。 HSIPC2 Smoekens and Steiner（1990）J．Biol．Chem．265：2997-3000（J0525 2）。Seidahなど．（1990）DNA Cell Biol． 9：415-424(マウス下垂体PC2プロテアーゼの配列は、23の位置、たとえばプロテアーゼドメインにおける７つの位置、すなわち14F，342[2]Y， E45D，N76S，D133E，V134L及びＧ²³⁹[1]Dにおいて異なる）。 MMPPC3 Swoekensなど．（1991）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：340-344（M5 8507）。Seidahなど．（1990）DNA Cell Biol．9：415-424（M55668/M5 5669；部分的配列）。 HSTPP Tomkinson and Jonsson（1991）Biochemistry 30：168-174（J05299）。図面の簡単な説明図１は、表１に示される多くのズブチラーゼの一列配列を示す。定義：本発明を詳細に論じる前、次の用語がまず定義されるであろう。 “変更された自己分解安定性” この用語“変更された自己分解安定性”又は“変更する自己分解安定性”とは、元のプロテアーゼの活性に比較して、自己分解安定性を高めること又は低めることを意味する。 “変更された自己タンパク質加水分解切断部位” 用語“変更された自己タンパク質加水分解切断部位”とは、元のプロテアーゼの部位に対しての変更された自己タンパク質加水分解切断部位を意見する。変更は、元のプロテアーゼにおける完全に新たな部位の形成又は前記プロテアーゼにおける部位の除去であり得る。用語“変更された自己タンパク質加水分解切断部位”はまた、切断パターンの変更の後、元のプロテアーゼにおける一次又は二次切断部位でない自己タンパク質加水分解部位が一次又は二次自己タンパク質加水分解部位になることが判明している変更を意味する。 “自己タンパク質加水分解切断部位” 用語“自己タンパク質加水分解切断部位”は、プロテアーゼの自己タンパク質加水分解が起こると思われるプロテアーゼの部位を示すために用いられる。この部位は、アミノ酸残基ＸとＹとの間に位置するよう定義され得る。切断部位は、プロテアーゼの水溶液を調製し；自己分解により生成されるペプチドフラグメントの進行性切断を妨げるために前記プロテアーゼを急速に不活性化し；前記プロテアーゼの再活性化を妨げる条件下で前記ペプチドフラグメントを分離し；そして前記分離されたフラグメントのＮ−末端アミノ酸を同定することによって同定され得る。さらなる詳細のためには、本明細書における実施例（下記参照のこと）を参照のこと。用語“自己タンパク質加水分解切断部位”は、他方では、“自己タンパク質加水分解分裂部位”とも呼ばれる。 “一次自己タンパク質加水分解切断部位” 用語“一次自己タンパク質加水分解切断部位”とは、プロテアーゼ自体が自己切断する初めの１〜５の初期切断部位を意味する。 “ズブチラーゼ変異体の修飾” 本明細書に記載されるようなズブチラーゼ変異体の修飾に関して使用される用語“修飾”とは、自己分解速度を遅くするための化学的修飾及び遺伝子操作を包含するよう定義される。前記修飾は、注目のアミノ酸における又はそのようなアミノ酸での置換、欠失及び／又は挿入による。用語“修飾”が自己分解開裂部位近くで又はその付近における置換、欠失及び／又は挿入に関して使用される場合、それは自己分解の速度を遅くするための修飾を包含するよう定義される。修飾は、それらのアミノ酸の感受性（susceptive ）ポリペプチド結合を含んで成るアミノ酸近くで又はその近くにおいて生じるべきである。用語“〜の近くにおいて”とは、感受性結合を形成するアミノ酸から３個上流又は下流の範囲内のアミノ酸を意味することが本明細書において定義される。 “ランダム突然変異誘発” 用語“ランダム突然変異誘発”とは、従来の態様で理解されること、すなわち親酵素のランダム位置での１又は複数の突然変異の導入、又は親酵素の選択された位置又は領域におけるランダムアミノ酸残基の導入を示すことを意味する。ランダム突然変異誘発は通常、親酵素と比較して、改良された性質を有する突然変異誘発された酵素の選択を可能にするスクリーニングにより達成される。ランダム突然変異を導入するための及び改良された性質をスクリーニングするための適切な技法は、本明細書においてさらに詳細に論じられる。 “洗浄性能” たとえば洗浄の間、清浄されるべき目的物上に存在する種々の天然に存在する基質の分解を触媒する酵素の能力がしばしば、その洗浄能力、洗浄力又は洗浄性能として言及される。この明細書を通して、用語、洗浄性能とは、この性質を包含するために使用されるであろう。、B．Lentusからのズブチリシン309であり、そしてN87Sを有することにおいてのみ、BABP92と異なる。 “前駆体ズブチラーゼ” 用語“前駆体ズブチラーゼ”は、Siezenなど．（Protein Engineering ４：71 9-737（1991））により定義されるズブチラーゼである。さらなる詳細のためには、本明細書に記載される“ズブチラーゼ”の項を参照のこと。前駆体ズブチラーゼはまた、天然源から単離され、これに続きズブチラーゼの特徴を保持しながら修飾されているズブチラーゼでもあり得る。 “基質” プロテアーゼのための基質に関連して使用される用語“基質”とは、ズブチリシンプロテアーゼによる加水分解を受けやすい少なくとも１つのペプチド結合を含む化合物を含んで成るものとして、その広範な形で解釈されるべきである。 “生成物” プロテアーゼ酵素反応に由来する生成物に関して使用される用語“生成物”は、ズブチリシンプロテアーゼを包含する加水分解反応の生成物を包含することが、本発明において解釈されるべきである。生成物は、続く加水分解反応において基質であり得る。 “ズブチラーゼ変異体” 本発明の情況において、用語ズブチラーゼ変異体又は突然変異誘発されたズブチラーゼとは、元の遺伝子又は親遺伝子を有しそして対応する親酵素を生産していた親微生物に由来する変異体遺伝子を発現する生物により生成されたズブチラーゼを意味し、ここで前記親遺伝子は、前記突然変異誘発されたズブチラーゼプロテアーゼが適切な宿主において発現される場合に使用される前記変異体遺伝子を生成するために突然変異誘発されている。発明の特定の記載変更された自己タンパク質加水分解パターンを有するズブチラーゼ変異体：本発明によれば、残基132〜133（BASBPN番号付けによる）に、又はその近くに位置する一次自己タンパク質加水分解部位を有するいづれかの前駆体ズブチラーゼが、残基132〜133（BASBPN番号付けによる）間に位置する前記自己分解切断部位での又はその近く（残基129〜136間）での置換により修飾されることによって、高められた自己分解安定性を示すであろう。本発明によれば、残基132〜133（BASBPN番号付けによる）間に位置するそのような一次自己分解切断部位を有する前駆体ズブチラーゼは、ズブチラーゼ変異体又は野生型ズブチラーゼであり得る。野生型ズブチラーゼは、上記切断部位を有する、表Ｉに示されるそれらのいづれかであり得る。ズブチラーゼ変異体は、表 IIで論ぜられる変異体であり得るが、但しそれらだけには制限されない。表IIで論ぜられる変異体以外の他のズブチラーゼ変異体もまた、残基132と133（BASBPN 番号付けによる）との間に位置する一次自己分解開裂部位を有すると現在思われる。本発明によれば、下記１又は複数のアミノ酸残基に修飾を有するズブチラーゼ変異体（表IIを参照のこと）は、変更された自己タンパク質加水分解部位、好ましくは残基132〜133（BASBPN番号付けによる）に位置するか又はそれに隣接する変更された自己分解部位、好ましくは新たな一次自己タンパク質加水分解部位をもたらす。本発明によれば、表IIに示されるアミノ酸残基のいづれかに１又は複数の修飾を有するズブチラーゼ変異体は、残基132〜133（BASBPN番号付けによる）間に位置する前記自己分解切断部位における又はその近く（残基129〜136間）における置換により修飾されることによって、高められた自己分解安定性を示すであろう。表IIに示されるアミノ酸酸基のいづれかにおける１又は複数の修飾を有するズブチラーゼ変異体は、残基192〜193（BASBPN番号付けによる）間に位置する自己分解切断部位における又はその近く（残基190〜196間）における置換により修飾されることによって、高められた自己分解安定性も示すであろうし、そして本発明によれば、相互利益が、132〜133及び192〜193間の両自己タンパク質加水分解部位のまわりの近くに修飾を組合すことによって得られる。表IIは、図１に示される一列配列を用いて構成された。他のズブチラーゼをカバーする類似するか又はより大きな表は、当業者により容易に生成され得ることが明らかである。さらに、表IIIは、残基132〜133（BASBPN番号付けによる）間に位置する言及された自己分解切断部位の近くに特定のアミノ酸を示す。他のズブチラーゼをカバーする類似するか又はより大きな表は、当業者により容易に生成され得ることが明らかである。表IIIは、図１に示される一列配列を用いて構成された。残基192〜193間に位置する自己タンパク質加水分解部位の近くにおける残基を示す類似する表は、当業者により容易に作られ得る。従って、本発明は、アミノ酸配列が、位置132〜133（BASBPN番号付けによる）間に位置する自己タンパク質加水分解部位の近く（すなわち位置129，130，131 ，132，133，134，135，136）の１又は複数のアミノ酸残基でさらに修飾されている、表IIに示される１又は複数のアミノ酸残基に修飾を有するズブチラーゼ変異体；又は位置192〜193（BASBPN番号付けによる）間に位置する自己タンパク質加水分解部位の近く（すなわち、位置190，191，192，193，194，195，196)でさらに修飾されている、表IIに示される１又は複数のアミノ酸残基に修飾を有するズブチラーゼ変異体；又はすぐ上で言及された２つの自己タンパク質加水分解部位の両者の近くでさらに修飾されている、表IIに示される１又は複数のアミノ酸残基に修飾を有するズブチラーゼ変異体に関する。本発明によれば、位置132〜133及び192〜193（BASBPN番号付けによる）間に位置する自己タンパク質加水分解部位の両者、又は前記部位の個々の近くでの多くの特定の修飾が、ズブチラーゼの高められた自己タンパク質加水分解安定性を提供するであろう。原則として、修飾は、得られる変異体の高められた自己タンパク質加水分解安定性をもたらす他の19個の可能なアミノ酸残基のいづれかによる、切断部位の近くに位置するアミノ酸残基の置換であり得る。修飾は、得られる変異体の高められた自己タンパク質加水分解安定性をもたらす切断部位の近くの20個の可能なアミノ酸残基の１又は複数のいづれかの残基の挿入であり得る。さらに、修飾は、得られる変異体の高められた自己タンパク質加水分解安定性をもたらす切断部位近くに位置するアミノ酸のいづれかの欠失であり得る。高められた自己タンパク質加水分解安定性を生ぜしめる特定の修飾を同定するための方法は、前記部位の１方及び／又は前記部位の両者の近くの全領域における局在化されたランダム突然変異誘発（たとえば129〜136及び／又は189〜196間のすべての残基における局在化されたランダム突然変異誘発）、高められた安定性を生ぜしめる特定の修飾を同定するための続くスクリーニングアッセイを行なうことである。この方法の例示のためには、本明細書における実施例（下記参照のこと）を参照のこと。高められた自己タンパク質加水分解安定性を生ぜしめる多くの特定の突然変異が本明細書に示される（下記セクション“Ｂ”及び“Ｃ”を参照のこと）。たとえば表II又はIIIを調べ、そして本発明の原理を適用することによって、高められた自己タンパク質加水分解安定性を有するズブチラーゼ変異体のための多くの候補体が明らかになる。残基132〜133（BASBPN番号付けによる）間の自己タンパク質加水分解分裂部位を有する、BASBPN及びBLSCARの両前駆体ズブチラーゼ変異体のためには、高められた自己タンパク質加水分解安定性を有する変異体を製造するために、この自己タンパク質加水分解部位の近くの位置のいづれかで置換を行なうことが高く評価される。本発明においては、ズブチラーゼは、Siezenなど.(前記)に従って定義される。本発明の多くの態様に適用できるより狭い態様においては、興味あるズブチラーゼは、サブグループＩ−Ｓ１及びＩ−Ｓ２に属するものである。より特定の態様においては、本発明の多くの態様は、上記表Ｉに列挙されるズブチラーゼと、それらの一次構造において実質的に明確な相同性にされ得るグラム−陽性細菌のセリンプロテアーゼに関する。本発明はまた、親酵素のアミノ酸配列に対するいづれか他の置換、欠失又は付加と組合して、上記位置におけるいづれか１又は複数の置換を含んで成る。特に、酵素に改良された性質を提供することが知られている他の置換との組合せが認識される。そのような組合せは、位置：222(酸化安定性を改良する)、218(熱安定性を改良する)、酵素を安定化するCa−結合部位、たとえば位置76における置換、及び従来の技術から明らかな多くの他のものを含んで成る。さらに、ヨーロッパ特許第405901号に言及される変異体との組合せがまた、特に企画される。変異体Ａ：位置132〜133（BASBPN番号付けによる）間に変更された自己タンパク質加水分解切断部位を有する単一変異体単一変異体は、下記に示される１又は複数の突然変異を含んで成る：ズブチリシンBPN'、ズブチリシンCarlsberg、ズブチリシン168、及びズブチリシンDY変異体： A129V，A129I，A129L，A129M，A129F G131V，G131I，G131L，G131M，G131F K136V，K136I，K136L，K136M，K136F， S159V，S159I，S159L，S159M，S159F， T164V，T164I，T164L，T164M，T164F， Y167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167F K170V，K170I，K170L，K170M，K170F， Y171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171F サーミターゼ変異体： A129V，A129I，A129L，A129M，A129F G131V，G131I，G131L，G131M，G131F Q136V，Q136I，Q136L，Q136M，Q136F， T159V，T159I，T159L，T159M，T159F， A164V，A164I，A164L，A164M，A164F， Y167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167F Y171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171F Y170V，Y170I，Y170L，Y170M，Y170F ズブチリシン309、ズブチリシン147及びバシラスPB92プロテアーゼ変異体： T129V，T129I，T129L，T129M，T129F G131V，G131I，G131L，G131M，G131F E136V，E136I，E136L，E136M，E136F， G159V，G159I，G159L，G159M，G159F， G164V，G164I，G164L，G164M，G164F，（BLS147） S164V，S164I，S164L，S164M，S164F，（BLS309及びBAPB92） Y167A，Y167H，Y167N，Y167P，Y167C，Y167W， Y167Q，Y167S，Y167T，Y167G，Y167V，Y167I，Y167L，Y167M， Y167F R170W，R170A，R170H，R170N，R170P，R170Q，R170S，R170T，R170Y（BLS309のためには否認された），R170V（BAPB92のためには否認された），R170I（BAPB92 については除かれる），R170L，R170M（BAPB92については除かれる），R170F，R 170G，R170C，Y171A，Y171H，Y171N，Y171P，Y171C，Y171W，Y171Q，Y171S，Y17 1T，Y171G，Y171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171F Ｂ：位置132〜133間に位置する自己タンパク質加水分解切断部位の近くで修飾された変異体次の突然変異の１又は複数のいづれかを、さらに含んで成る上記セクション“ Ａ”のもとに言及される単一変異体のいづれか： P129D，P129E，P129A（BLS309） S130D，S130E，S130A（BLS309） P131G，P131D，P131A（BLS309） S132C，S132A，S132P（BLS309） A133P（BLS309） T134C，T134P，T134A（BLS309） L135P，L135A（BLS309） E136A，E136P，L136K（BLS309） V104C+S132C（BLS309） V104C+T134C（BLS309） A108C+T134C（BLS309）Ｃ：位置192〜193間に位置する自己タンパク質加水分解切断部位の近くで修飾された変異体次の突然変異の１又は複数のいづれかをさらに含んで成る上記セクション“Ａ ”のもとに言及される単一変異体のいづれか： F189A，F189G，F189D，F189R，F189Y，F189E，F189N（BLS309） S190P，S190D，S190T（BLS309） Q191S，Q191T，Q191N，Q191A，Q191L，Q191D，Q191W（BLS309） Y192A，Y192P，Y192D，Y192E，Y192V（BLS309） G193A，G193N，G193P（BLS309） A194P，A194D（BLS309） G195E（BLS309） L196A（BLS309）Ｄ：位置132〜133及び192〜193間に位置する両自己タンパク質加水分解部位の近くで修飾された変異体セクション“Ｂ”下に言及される１又は複数の突然変異のいづれか及び／又は上記セクション“Ｃ”のもとに言及される１又は複数の突然変異のいづれかの組合せをさらに含んで成る、上記セクション“Ａ”のもとに言及される単一変異体のいづれか。Ｅ：さらなる組合せ変異体：セクション“Ｂ”，“Ｃ”、及び／又は“Ｄ”のもとに言及される上記変異体のいづれかは、次の位置のいづれかにおいて他の突然変異と組合される場合、好都合であることが予期される：27，36，57，76，97，101，104，120，123，206 ，218，222，224，235、及び274。特に、次のBLS309及びBAPB92変異体における突然変異が、組合せのために適切であると思われる：K27R，^*36D，S57P，N76D，G97N，S101G，V104A，V104N，V10 4Y，H120D，N123S，A194P，Q206E，N218S，M222S，M222A，T224S，K235L及びT27 4A。また、上記に言及された１又は複数の他の置換、欠失及び／又は挿入のいづれかと組合してのいづれか１又は２つの置換X167V，X167M，X167F，X 167L，X1671，X170V，X170M，X170F，X170L、及び／又はX170Iを含んで成るそのような変異体は、セクション“Ａ”，“Ｂ”、及び／又は“Ｃ”のもとに言及された突然変異のいづれかと組合すことが好都合であると思われる。さらに、“Ａ”，“Ｂ”、及び／又は“Ｃ”として上記に言及される１又は複数の置換、欠失及び／又は挿入のいづれかと組合して、突然変異V104N-S101G，K 27R+V104Y+N123S+T274A又はN76D+V104A又はそれらの突然変異の他の組合せ（V10 4N，S101G，K27R，V104Y，N123S，T274A，N76D，V104A）のいづれかを含んで成る変異体は、改良された性質を示すと思われる。言及されるべき特定の組合せは、次の通りである：Ａ：Y167I+R170L+A133P Ｂ：Y167I+R170L+T134P Ｃ：Y167I+R170L+A133P+T134P Ｄ：Y167I+R170L+V104C+S132C Ｅ：Y167I+R170L+A108C+T134C Ｆ：Y167A+R170S+F189A Ｇ：Y167A+R170S+Y192A Ｈ：Y167A+R170S+Y192P Ｉ：Y167A+R170S+Y192A+A194P Ｊ：Y167A+R170S+Y192P+A194P Ｋ：Y167A+R170S+F189G Ｌ：Y167A+R170S+F189E Ｍ：Y167A+R170S+F189R Ｎ：Y167I+R170L Ｍ：Y167I+R170L+A194P Ｏ：Y167A+R170S+A194P Ｐ：Y167A+R170L+A194P Ｑ：Y167A+R170N+A194P Ｒ：V104C+S132C+Y167I+R170L Ｓ：A108C+T134C+Y167I+R170L Ｔ：V104C+S132C+Y167A+R170S Ｕ：V104C+S132C+Y167A+R170L Ｖ：V104C+S132C+Y167A+R170N Ｘ：A133D+Y167I+R170L Ｙ：P129K+Y167I+R170L Ｚ：A133P+Y167A+R170S+A194P AA：T134P+Y167A+R170S+A194P BB：A133P+Y134P+Y167A+R170S+A194P CC：A133P+Y167A+R170N+A194P DD：T134P+Y167A+R170N+A194P EE：A133P+T134P+Y167A+R170N+A194P FF：A133P+Y167A+R170L GG：P129K+P131H+Y167I+R170L HH：A133P+Y167A+R170S II：A133P+Y167A+R170N JJ：Y167A+R170S+F189K KK：V104C+T134C+Y167A+R170Sズブチラーゼ遺伝子における突然変異の生成方法遺伝子中に突然変異を導入するための多くの方法は、当業界において良く知られている。ズブチラーゼ遺伝子のクローニングの手短な議論の後、ズブチラーゼ遺伝子内のランダム部位及び特定の部位に突然変異を生成するための方法が論じられるであろう。ズブチラーゼ遺伝子のクローニングズブチラーゼをコードする遺伝子は、表Ｉに示される生物のいづれか、特にグラム−陽性細菌又は真菌類から、当業界において良く知られている種々の方法によりクローン化され得る。第１に、DNAのゲノム及び／又はcDNAライブラリーが、研究されるべきズブチラーゼを生産する生物からの染色体DNA又はメッセンジャーRNAを用いて構成されるべきである。次に、そのズブチラーゼのアミノ酸配列が知られている場合、相同のラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが合成され、そして細菌DNAのゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーからのズブチリシン−コードクローンを同定するために使用され得る。他方では、細菌又は生物の他の株からのズブチラーゼに対して相同の配列を含むラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが、低い緊縮性のハイブリダイゼーション又は洗浄条件を用いて、ズブチラーゼ−コードクローンを同定するために使用され得た。ズブチラーゼ−生成クローンを同定するためのさらにもう１つの方法は、発現ベクター、たとえばプラスミド中にゲノムDNAのフラグメントを挿入し、得られるゲノムDNAライブラリーによりプロテアーゼ陰性細菌を形質転換し、そして次に、ズブチラーゼのための基質、たとえば脱脂乳を含む寒天上に前記形質転換された細菌をプレートすることを含む。ズブチラーゼ−生成プラスミドを含むそれらの細菌は、分泌されたズブチラーゼによる脱脂乳の消化のために、透明な寒天の輪により取り囲まれるコロニーを生成するであろう。ズブチラーゼ遺伝子におけるランダム突然変異の生成ズブチラーゼ遺伝子が適切なベクター、たとえばプラスミド中にクローン化されると、いくつかの方法がその遺伝子中にランダム突然変異を導入するために使用され得る。たとえば、ランダム突然変異誘発は、適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の使用により、適切なオリゴヌクレオチドの使用により、又はDNA配列をPCR生成された突然変異誘発にゆだねることにより実施され得る。さらに、ランダム突然変異誘発は、それらの突然変異誘発剤のいづれかの組合せの使用により実施され得る。突然変異誘発剤は、たとえばトランジション、トランスバーション、逆位、スクランブリング、欠失及び／又は挿入を誘発する剤であり得る。本発明のために適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の例は、紫外線（UV）、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ MNNG）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ EMS）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチド類似体を包含する。そのような剤が使用される場合、突然変異誘発は、典型的には、突然変異誘発が起こる適切な条件下で、選択の突然変異誘発剤の存在下で突然変異誘発されるべき親酵素をコードするDNA配列をインキュベートし、そして所望の性質を有する突然変異誘発されたDNAを選択することによって実施される。突然変異誘発がオリゴヌクレオチドの使用により実施される場合、オリゴヌクレオチドは、変更されることが所望される位置でのオリゴヌクレオチドの合成の間、３個の非親ヌクレオチドによりドーピング又はスパイキングされ得る。ドーピング又はスパイキングは、不所望のアミノ酸についてのコドンが回避されるよう実施され得る。ドーピング又はスパイキングされたオリゴヌクレオチドは、たとえばPCR，LCR又はいづれかのDNAポリメラーゼ及びリガーゼを用いて、いづれかの公開された技法によりプロテアーゼ酵素をコードするDNA中に導入され得る。 PCR生成される突然変異誘発が使用される場合、親プロテアーゼ酵素をコードする化学的に処理された又は処理されていない遺伝子が、ヌクレオチドの誤った組込みを高める条件下でPCRにゆだねられる（Deshler 1992，Leungなど．1989）。Ｅ．コリ（Fowlerなど．1974）。Ｓ．セレビシアエ又は他のいづれかの微生物のミューテーター株は、親酵素を含むプラスミドを用いて前記ミューテーター株を形質転換し、前記プラスミドを含むミューテーター株を増殖せしめ、そして前記ミューテーター株から突然変異誘発されたプラスミドを単離することによって、プロテアーゼ酵素をコードするDNAのランダム突然変異誘発のために使用され得る。続いて突然変異誘発されたプラスミドを用いて、発現生物を形質転換することができる。突然変異誘発されるDNA配列は便利には、親プロテアーゼ酵素を発現する生物から調製されたゲノム又はcDNAライブラリーに存在することができる。あるいは、そのDNA配列は、突然変異誘発剤と共にそれ自体インキュベートされ得、又は他の方法として、適切なベクター、たとえばプラスミド又はバクテリオファージ上に存在させ、これらのベクターを暴露することができる。突然変異誘発される DNAはまた、前記細胞のゲノムに組込まれることによって、又は細胞に含まれるベクター上に存在することによって、宿主細胞に存在させることができる。最終的に、突然変異誘発されるDNAは、単離された形で存在することができる。ランダム突然変異にゆだねられるDNA配列は好ましくは、cDNA又はゲノムDNA配列である。ランダム突然誘発は好都合には、問題の親プロテアーゼの一部に位置することができる。これは、たとえば酵素の一定の領域が酵素の所与の性質のために特に重要なものであることが同定されている場合、好都合であり、そしてこれは、修飾される場合、改良された性質を有する変異体をもたらすことが予測される。そのような領域は通常、親酵素の三次構造が解明されそして酵素の機能と関連付けられる場合に同定され得る。局在化されたランダム突然変異誘発は、便利には、上記のようなPCR生成突然変異誘発技法又は当業界において知られているいづれか他の適切な技法の使用により実施される。他方では、修飾されるべきDNA配列の一部をコードするDNA配列は、たとえば適切なベクター中に挿入されることによって単離され得、そして前記一部は続いて、上記突然変異誘発方法のいづれかの使用により突然変異誘発にゆだねられ得る。局在化されたランダム突然変異誘発は、１又は複数のそれらの領域において実施され得、そして好ましくは、少なくとも２つの前記領域において実施される。ズブチラーゼ遺伝子における特定部位の突然変異誘発の生成ズブチラーゼ遺伝子がクローン化され、そして同定される突然変異のための所望する部位及び元の残基を置換するための残基が決定されると、それらの突然変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入され得る。それらのオリゴヌクレオチドは所望する突然変異部位を端に有するヌクレオチド配列を含み；変異体ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成の間、挿入される。好ましい態様においては、部位特定突然変異誘発は、Dengなど．（Anal．Biochem．200：81-88(1992)）及びMarkvardsenなど．（BioTechniques 18（3）：371-372(1995)）によりそれぞれ記載される“ユニーク部位排除(USE)”又は“ウラシル−USE”により実施される。組換え発現ベクター本発明の酵素をコードするDNA構造体を含んで成る組換えベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられ得るいづれかのベクターであり得、そしてベクターの選択はしはしば、それが導入される予定である宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自主的に複製するベクター、すなわちその複製が染色体複製と独立している、染色体外存在物として存在するベクター、たとえばプラスミドであり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞中に一部又は完全に組込まれ、そしてそれが導入される染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。ベクターは好ましくは、本発明の酵素をコードするDNA配列がそのDNAの転写のために必要とされる追加のセグメントに作用可能に連結されている発現ベクターである。一般的に、発現ベクターは、プラスミド又はウィルスDNAに由来し、又は両要素を含むことができる。用語“作用可能に連結される”とは、セグメントが、それらの意図された目的と協調して機能し、たとえば転写がプロモーターにより開始され、そして酵素をコードするDNA配列を通して進行するよう配置されることを示す。プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示すいづれかのDNA配列であり得、そして宿主細胞に対して相同であるか又は異種であるかいづれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。細菌宿主細胞への使用のための適切なプロモーターの例は、バシラス・ステアロサーモフィラス・マルトース生成（maltogenic）アミラーゼ遺伝子、バシラス・リケニホルミス α−アミラーゼ遺伝子、バシラス・アミロリケファシエンス α−アミラーゼ遺伝子、バシラス・スブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子、又はバシラス・プミラスキシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又はファージλＰ_R又はＰ_Lプロモーター又はＥ．コリlac，trp又はtacプロモーターを包含する。本発明の酵素をコードするDNA配列はまた、必要なら、適切なプロモーターに作用可能に連結され得る。本発明の組換えベクターはさらに、問題の宿主細胞においてそのベクターの複製を可能にするDNA配列を含むことができる。ベクターはまた、選択マーカー、たとえば宿主細胞における欠陥を補足する生成物の遺伝子、又はたとえば抗生物質、たとえばカナマイシン、クロラムフェニコール、エリトロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン又は同様のものに対する耐性、又は重金属又は除草剤に対する耐性をコードする遺伝子を含むことができる。本発明の酵素を宿主細胞の分泌路中に方向づけるためには、分泌シグナル配列（また、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、組換えベクターに供給され得る。分泌シグナル配列は、酵素をコードするDNA配列に、正しい読取り枠を整合して連結される。分泌シグナル配列は通常、酵素をコードするDNA配列の５’側に位置する。分泌シグナル配列は、酵素と通常関連する配列であり得、又はもう１つの分泌されたタンパク質をコードする遺伝子からのものでもあり得る。本発明の酵素をコードするDNA配列、プロモーター及び任意には、ターミネーター及び／又は分泌シグナル配列とそれぞれ連結するために、又は適切なPCR増幅スキムによりそれらの配列をアセンブルするために、及びそれらを、複製又は組込みのために必要な情報を含む適切なベクター中に挿入するために使用される方法は、当業者に良く知られている（たとえば、Sambrookなど.,前記を参照のこと）。宿主細胞宿主細胞中に導入される本発明の酵素をコードするDNA配列は、問題の宿主に対して同種性（homologous）か又は異種性（heterologous）のいづれかであり得る。宿主細胞に対して同種性である場合、すなわち宿主細胞により天然に生産される場合、それは典型的には、もう１つのプロモーター配列に、又は適用できるなら、その天然の環境におけるよりも他の分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に作用可能に連結されるであろう。用語“同種性”とは、問題の宿主生物に対して生来の酵素をコードするDNA配列を含めることを意図する。用語“ 異種性”とは、天然において宿主細胞により発現されないDNA配列を含めることを意図する。従って、前記DNA配列は、他の生物からであり得、又はそれは合成配列であり得る。本発明のDNA構造体又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、本発明の酵素を生成することができるいづれかの細胞であり、そして細菌、酵母、菌類及び高等真核細胞を包含する。培養に基づいて、本発明の酵素を生成することができる細菌宿主細胞の例は、グラム−陽性細菌、たとえばバシルスの株、たとえば、Ｂ．スブチリス、Ｂ．リケニルホルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケニファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ラウタス、Ｂ．メガセリウム又はＢ．スリンギエンシス又はストレプトミセス（Streptomyces）属の株、たとえばＳ．リビダンス(S．li vidans)又はＳ．ムリナス（S．murinus）、又はグラム−陰性細菌、たとえばＥ．コリ(E．coli)である。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、接合により、又はそれ自体知られている態様でコンピテント細胞を用いることによりもたらされ得る（Sanlbrookなど.,前記を参照のこと）。細菌、たとえばＥ．コリにおいて酵素を発現する場合、酵素は細胞質に、典型的には不溶性顆粒（封入体としても知られている）として保持され得、又は細菌分泌配列によりペリプラズム空間に向けられ得る。前者の場合、細胞が溶解され、そして顆粒が回収され、そして変性され、その後、酵素が変性剤を希釈することによって再生される。後者の場合、ペリプラズム空間の内容物を放出するために、たとえば音波処理又は浸透ショックにより細胞を破壊し、そして酵素を回収することによって、酵素がペリプラズム空間から回収され得る。グラム陽性細菌、たとえばバシルス又はストレプミセス株において酵素を発現する場合、酵素は細胞質に保持され得、又は細菌分泌配列により細胞外培地に向けられ得る。後者の場合、酵素は下記のようにして培地から回収され得る。ズブチラーゼの製造方法本発明は、本発明に従って、単離された酵素を製造するための方法を提供し、ここで酵素をコードするDNA配列により形質転換された適切な宿主細胞が酵素の生成を可能にする条件下で培養され、そしてその得られる酵素が培養物から回収される。本明細書において定義される場合、単離されたポリペプチド（たとえば酵素）は、SDS−PAGEにより決定される場合、他の非ズブチラーゼポリペプチドを実質的に有さない、たとえば少なくとも約20％の純度、好ましくは少なくとも約40％の純度、より好ましくは約60％の純度さらにより好ましくは約80％の純度、最とも好ましくは約90％の純度及びさらに最とも好ましくは約95％の純度のポリペプチドである。用語“単離されたポリペプチド”とは、代わりに、“精製されたポリペプチド”とも称する。酵素をコードするDNA配列を含んで成る発現ベクターが異種宿主細胞を形質転換する場合、本発明の酵素の異種組換え体生成を可能にすることができる。それにより、同種性不純物を有さないことを特徴とする高度に精製されたズブチラーゼ組成物を製造することが可能である。この場合、同種性不純物とは、本発明の酵素が始め得られる同種性細胞に起因するいづれかの不純物（たとえば、本発明の酵素以外のポリペプチド）を意味する。形質転換された宿主細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主細胞を増殖するために適切ないづれかの従来の培地であり得る。発現されたズブチラーゼは便利には、培養培地中に分泌され得、そしてそれから、培養培地から細胞を遠心分離又は濾過により分離し、硫酸アンモニウムのような塩により培地のタンパク質成分を沈殿せしめ、続いて、クロマトグラフィー方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又は同様の方法を用いることを包含する良く知られた方法により回収され得る。変異体酵素を含んで成る洗剤組成物本発明はまた、洗浄及び洗剤組成物及び変異体ズブチリシン酵素を含んで成るそのような組成物への本発明の変異体酵素の使用を包含する。そのような洗浄及び洗剤組成物は、下記にさらに詳細に記載される。洗剤の開示及び例：界面活性剤系本発明の洗剤組成物は、界面活性剤系を含んで成り、ここで前記界面活性剤は、非イオン性及び／又はアニオン性、及び／又はカチオン性、及び／又は両性、及び／又は両性イオン性、及び／又は半極性界面活性剤から選択され得る。界面活性剤は典型的には、0.1〜60重量％のレベルで存在する。界面活性剤は好ましくは、組成物に存在する酵素成分と適合できるように配合される。液体又はゲル組成物においては、界面活性剤は、最とも好ましくは、それがそれらの組成物におけるいづれかの酵素の安定性を促進し、又は少なくとも低下せしめないような手段で配合される。本発明に従って使用されるべき好ましいシステムは、本明細書に記載される１又は複数の非イオン性及び／又はアニオン性界面活性剤を界面活性剤として含んで成る。アルキルフェノールの酸化ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリブチレン縮合物は、本発明の界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のために適切であり、そしてポリエチレンオキサイド縮合物が好ましい。それらの化合物は、直鎖又は枝分れ鎖形状に約６〜約14個の炭素原子、好ましくは約８〜約14個の炭素原子を有するアルキルフェノールとアルキレンオキサイドとの縮合生成物を包含する。好ましい態様においては、エチレンオキサイドは、アルキルフエノール１モル当たり約２〜約25モル、より好ましくは約３〜約15モルのエチレンオキサイドに等しい量で存在する。このタイプの市販の非イオン性界面活性剤は、GA F Corporationにより市販されるIgepal^TMCO-630；及びRohm & Haas Companyにより市販されるTriton^TMX-45，X-114，X-100及びX-102を包含する。それらの界面活性剤は、アルキルフェノールアルコキシレート（たとえばアルキルフェノールエトキシレート）として通常言及される。約１〜約25モルのエチレンオキサイドと第一及び第二脂肪族アルコールとの縮合生成物は、本発明の非イオン性界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のために適切である。脂肪族アルコールのアルキル鎖は、直鎖又は枝分れ鎖、第１又は第２のいづれかであり得、そして一般的には、約８〜約22個の炭素原子を含む。アルコール１モル当たり約２〜約10モルのエチレンオキサイドと、約８〜約20個の炭素原子、より好ましくは約10〜約18個の炭素原子を含むアルキル基を有するアルコールとの縮合生成物が好ましい。アルコール１モル当たり、約２〜約７モルのエチレンオキサイド及び最とも好ましくは２〜５モルのエチレンオキサイドが前記縮合生成物に存在する。このタイプの市販の非イオン性界面活性剤の例は、 Tergitol^TM15−Ｓ−９（Ｃ₁₁−Ｃ₁₅の直鎖状アルコールと９モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）、Tergitol^TM24−Ｌ−６NMW(Ｃ₁₂−Ｃ₁₄第一アルコールと狭い分子量分布を有する６モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物)（両者ともUnion Carbide Corporationにより市販されている）；Neodol^TM45−９（Ｃ₁ ₄ −Ｃ₁₅直鎖状アルコールと９モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）、Neo dol^TM23−３（Ｃ₁₂−Ｃ₁₃直鎖状アルコールと3.0モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）、Neodol^TM45−７（Ｃ₁₄−Ｃ₁₅直鎖状アルコールと７モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物）、Neodol^TM45−５（Ｃ₁₄−Ｃ₁₅直鎖状アルコールと５モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物（Shell Chemical Companyにより市販されている）；Kyro^TMEDB（Ｃ₁₃−Ｃ₁₅アルコールと９モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物（Procter & Gamble Companyにより市販されている）；及びGenapol LA050(Ｃ₁₂−Ｃ₁₄アルコールと５モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物)（Hoechstにより市販されている）を包含する。それらの生成物における HLBの好ましい範囲は、８〜11及び最とも好ましくは８〜10である。約６〜約30個の炭素原子、好ましくは約10〜約16個の炭素原子を含む疎水性基を有する、アメリカ特許第4,565,647号に開示されるアルキルポリサッカリド、及び約1.3〜約10、好ましくは約1.3〜約３、最とも好ましくは約1.3〜約2.7のサッカリド単位を含む親水性基を有するポリサッカリド、たとえばポリグリコシドは、本発明の界面活性剤系中の非イオン性界面活性剤としても有用である。５又は６個の炭素原子を含むいづれかの還元サッカリド、たとえばグルコース、ガラクトースが使用され得、そしてガラクトシル成分はグルコシル成分と置換され得る（任意には、疎水性基は、２−，３−，４−、等の位置で結合され、従って、グルコシド又はガラクトシドに対立するものとして、グルコース又はガラクトースを付与する）。追加のサッカリド単位の１つの位置と、前のサッカリド単位上の２−，３−，４−、及び／又は６−位置との間にサッカリド間結合が存在することができる。好ましいアルキルポリグリコシドは、下記式： R²O(C_nH_2nO)_t(グリコシル)_x 〔式中、Ｒ²はアルキル、アルキルフェニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルフェニル、及びそれらの混合物から成る群から選択され、ここで前記アルキル基は約10〜約18、好ましくは約12〜約14個の炭素原子を含み；ｎは２又は３、好ましくは２であり；ｔは０〜約10、好ましくは０であり，そしてｘは約1. 3〜約10、好ましくは約1.3〜約10、最とも好ましくは約1.3〜約2.7である〕を有する。それらの化合物を調製するためには、アルコール又はアルキルポリエトキシアルコールが最初に形成され、そして次に、グルコース、又はグルコース源と反応せしめられ、グルコシド（１−位置での結合）が形成される。次に、追加のグリコシル単位が、それらの１−位置と前のグリコシル単位の２−，３−，４− 、及び／又は６−位置、好ましくは、有力的には２−位置との間に結合され得る。プロピレンオキサイドとプロピレングリコールとの縮合により形成される疎水性塩基とエチレンオキサイドとの縮合生成物はまた、本発明の追加の非イオン性界面活性剤系として使用するためにも適切である。それらの化合物の疎水性部分は、好ましくは約1500〜約1800の分子量を有し、そして水不溶性を示すであろう。この疎水性部分へのポリオキシエチレン成分の付加は、全体として分子の水溶解性を高める傾向があり、そして生成物の液体性質が、ポリオキシエチレン含有率が、約40モルまでのエチレンオキサイドとの縮合に対応する、縮合生成物の合計重量の約50％である点まで保持される。このタイプの化合物の例は、BASFにより市販されるPluronic^TM界面活性剤を包含する。プロピレンオキサイド及びエチレンジアミンの反応に起因する生成物とエチレンオキサイドとの縮合生成物は、本発明の非イオン性界面活性剤系中の非イオン性界面活性剤として使用のためにも適切である。それらの生成物の疎水性成分は、エチレンジアミン及び過剰のプロピレンオキサイドの反応生成物から成り、そして一般的には、約2500〜約3000の分子量を有する。この疎水性成分は、縮合生成物が約40〜約80重量％のポリオキシエチレンを含み、そして約5,000〜約11,00 0の分子量を有する程度までエチレンオキサイドにより縮合される。このタイプの非イオン性界面活性剤の例は、BASFにより市販されているTetronic^TM化合物を包含する。アルキルフェノールの酸化ポリエチレン縮合物、第一及び第二脂肪族アルコールと約１〜約25モルのエチレンオキサイドとの縮合生成物、アルキルポリサッカリド、及びそれらの混合物は、本発明の界面活性剤系中の非イオン性界面活性剤として使用するために好ましい。３〜15個のエトキシ基を有するＣ₈−Ｃ₁₈アルキルフェノールエトキシレート、及び２〜10個のエトキシ基を有するＣ₈−Ｃ₁₈ アルコールエトキシレート（好ましくは平均Ｃ₁₀）、及びそれらの混合物が、最とも好ましい。ひじょうに好ましい非イオン性界面活性剤は、下記式：〔式中、Ｒ¹はＨであり、又はＲ¹はＣ_1-4ヒドロカルビル、２−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシプロピル又はそれらの混合物であり、Ｒ²はＣ_5-31ヒドロカルビルであり、そしてＺは線状ヒドロカルビル鎖に直接的に結合される少なくとも３個のヒドロキシルを有する前記ヒドロカルビル鎖を有するポリヒドロキシヒドロカルビル、又はそのアルコキシル化された誘導体である〕で表わされるポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤である。好ましくは、Ｒ¹はメチルであり、Ｒ²は直鎖Ｃ_11-15アルキル又はＣ_16-18アルキル、又はアルケニル鎖、たとえばココナッツアルキル、又はそれらの混合物であり、そしてＺは、還元性アミノ化反応において、還元糖、たとえばグルコース、フルクトース、マルトース又はラクトースから誘導される。ひじょうに好ましいアニオン性界面活性剤は、アルキルアルコキシル化スルフェート界面活性剤を包含する。その例は、式RO(A)_mSO₂M（ここでＲは、Ｃ₁₀−Ｃ₂₄ アルキル成分を有する置換されていないＣ₁₀−Ｃ₂₄アルキル又はヒドロキシアルキル基、好ましくはＣ₁₂−Ｃ₂₀アルキル又はヒドロキシアルキル、より好ましくはＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキル又はヒドロキシアルキルであり、Ａはエトキシ又はプロポキシ単位であり、ｍはゼロよりも大きく、典型的には約0.5〜約６、より好ましくは約0.5〜約３であり、そしてＭはＨ、又はカチオン、たとえば金属カチオン（たとえば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、等）、アンモニウム又は置換されたアンモニウムカチオンである）で表わされる水溶性塩又は酸である。アルキルエトキシル化スルフェート及びアルキルプロポキシル化スルフェートは、本発明において企画される。置換されたアンモニウムカチオンの特定の例は、メチル−、ジメチル−、トリメチル−アンモニウムカチオン及び第四アンモニウムカチオン、たとえばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペリジニウムカチオン、及びアルキルアミン、たとえばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、それらの混合物及び同様のものに由来するそれらのカチオンを包含する。典型的な界面活性剤は、Ｃ₁₂−Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート(1.0)スルフェート（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈Ｅ(1.0)Ｍ）、Ｃ₁₂−Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート（2.25）スルフェート（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈Ｅ（2.25）Ｍ）、及びＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート(3.0)スルフェート（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈Ｅ( 3.0)Ｍ）、並びにＣ₁₂−Ｃ₁₈アルキルポリエトキシレート(4.0)スルフェート（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈Ｅ(4.0)Ｍ）（ここでＭは便利には、ナトリウム及びカリウムから選択される）である。使用される適切なアニオン性界面活性剤は、アルキルエステルスルホネート界面活性剤、たとえば“The Journal of the American Oil Chemists Society”， 52(1975)，pp．323-329に従って気体SO₃によりスルホネート化されるＣ₈−Ｃ₂₀ カルボン酸（すなわち、脂肪酸）の線状エステルである。適切な出発材料は、牛脂、ヤシ油、等から遊導されるような天然の脂肪界面活性剤を包含する。特に、洗濯用途のための好ましいアルキルエステルスルホネート界面活性剤は、下記構造式：〔式中、Ｒ³はＣ₈−Ｃ₂₀ヒドロカルビル、好ましくはアルキル又はそれらの組合せであり、Ｒ⁴はＣ₁−Ｃ₈ヒドロカルビル、好ましくはアルキル又はそれらの組合せであり、そしてＭはアルキルエステルスルホネートと水溶性塩を形成するカチオンである〕で表わされるアルキルエステルスルホネート界面活性剤を包含する。適切な塩−形成カチオンは、金属、たとえばナトリウム、カリウム及びリチウム、及び置換された又は置換されていないアンモニウムカチオン、たとえばモノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンを包含する。好ましくは、Ｒ³はＣ₁₀−Ｃ₁₆アルキルであり、そしてＲ⁴はメチル、エチル又はイソプロピルである。Ｒ³がＣ₁₀−Ｃ₁₆アルキルであるメチルエステルスルホネートが特に好ましい。他の適切なアニオン性界面活性剤は、式ROSO₃M〔式中、Ｒは好ましくはＣ₁₀− Ｃ₂₄ヒドロカルビル、好ましくはＣ₁₀−Ｃ₂₀アルキル成分、より好ましくはＣ₁₂ −Ｃ₁₈アルキル又はヒドロキシアルキルを有するアルキル又はヒドロキシアルキルであり、そしてＭはＨ又はカチオン、たとえばアルキル金属カチオン（たとえば、ナトリウム、カリウム、リチウム）、又はアンモニウム又は置換されたアンモニウム（たとえばメチル−、ジメチル−、及びトリメチル−アンモニウムカチオン及び第四アンモニウムカチオン、たとえばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペルジニウムカチオン、及びアルキルアミン、たとえばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、及びそれらの混合物、及び同様のものに由来する第四アンモニウムカチオン）である〕で表わされる、水溶性塩又は酸であるアルキルスルフェート界面活性剤を包含する。典型的には、Ｃ₁₂−Ｃ₁₆のアルキル鎖は、低い洗浄温度（たとえば約50℃以下）のために好ましく、そしてＣ₈ −Ｃ₂₀アルキル鎖は、高い洗浄温度（たとえば約50℃以上）のために好ましい。洗浄目的のために有用な他のアニオン性界面活性剤はまた、本発明の洗濯洗剤組成物に含まれ得る。それらは、石鹸の塩（たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、及び置換されたアンモニウム塩、たとえばモノ−、ジ−及びトリエタノールアミン塩）、Ｃ₈−Ｃ₂₂一次又は二次アルカンスルホネート、Ｃ₈−Ｃ₂₄オレフィンスルホネート、イギリス特許第1,082,179号明細書に記載されるような、アルカリ土類金属シトレートの熱分解された生成物のスルホン化により調製されたスルホン化されたポリカルボン酸、Ｃ₈−Ｃ₂₄アルキルポリグリコールエーテルスルフェート（10モルまでのエチレンオキサイドを含む）；アルキルグリセロールスルホネート、脂肪アシルグリセロールスルホネート、脂肪オレイルグリセロールスルフェート、アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルフェート、パラフィンスルホネート、アルキルホスフェート、イソチオネート、たとえばアシルイソチオネート、Ｎ−アシルタルトレート、アルキルスクシネート及びスルホスクシネート、スルホスクシネートのモノエステル（特に、飽和及び不飽和Ｃ₁₂−Ｃ₁₈モノエステル）及びスルホスクシネートのジエステル（特に、飽和及び不飽和Ｃ₆−Ｃ₁₂ジエステル）、アシルサルコシネート、アルキルポリサッカリドのスルフェート、たとえばアルキルポリグリコシドのスルフェート（下記に記載される非イオン性のスルフェート化されていない化合物）、枝分れされた一次アルキルスルフェート、及びアルキルポリエトキシカルボキシレート、たとえば式RO(CH₂CH₂O)_k−CH₂COO−Ｍ⁺〔式中、ＲはＣ₉−Ｃ₂₂アルキルであり、ｋは1〜10の整数であり、そしてＭは可溶性塩形成カチオンである〕で表わされるカルボキシレートを包含する。樹脂酸及び水素添加された樹脂酸、たとえばロジン、水素添加されたロジン、及びタル油に存在するか又はタル油に由来する樹脂酸及び水素添加された樹脂酸がまた適切である。アルキルベンゼンスルホネートが、ひじょうに好ましい。線状（直鎖）アルキルベンゼンスルホネート（LAS）(ここで、アルキル基は好ましくは、10〜18個の炭素原子を含む)が特に好ましい。さらなる例は、“Surface Active Agents and Defergents”(Schwarts，Perry and BerchによるVol.Ｉ及びII）に記載される。種々のそのような界面活性剤がまた、アメリカ特許第3,929,678号（第23欄、第58行〜第29欄、第23行；引用により本明細書に組込まれる）に開示される。そこに含まれる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、約１〜約40重量％、好ましくは約３〜約20重量％のそのようなアニオン性界面活性剤を含んで成る。本発明の洗濯洗剤組成物は、また本明細書にすでに記載された界面活性剤以外のカチオン性、両性、両性イオン性、及び単一極性界面活性剤も含むことができる。本発明の洗濯洗剤組成物への使用のために適切なカチオン性洗浄剤界面活性剤は、１つの長鎖のヒドロカルビル基を有するものである。そのようなカチオン性界面活性剤の例は、アンモニウム界面活性剤、たとえばアルキルトリメチルアンモニウムハロゲニド、及び下記式：〔R₂(OR³)_y〕〔R⁴(OR³)_y〕₂R⁵Ｎ＋Ｘ^- 〔式中、Ｒ²は、アルキル鎖に約８〜約18個の炭素原子を有するアルキル又はアルキルベンジル基であり、個々のＲ³は−CH₂CH₂−，−CH₂CH(CH₃)−，−CH₂CH(C H₂OH)−，−CH₂CH₂CH₂−及びそれらの混合物から成る群から選択され；個々のＲ⁴ はＣ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄ヒドロキシアルキル、２つのＲ⁴基を連結することによって形成されるベンジル環構造体、−CH₂CHOHCHOHCOR⁶CHOHCH₂OH（ここでＲ⁶は約1000以下の分子量を有するヘキソース又はヘキソースポリマーである）、及び水素（ｙがゼロでない場合）から成る群から選択され；Ｒ⁵はＲ⁴と同じであり、又はアルキル鎖であり、ここで炭素原子の合計数又はＲ²＋Ｒ⁵は約12よりも多くなく；個々のｙは０〜約10であり；そしてｙ値の合計は０〜約15であり；そしてＸはいづれかの適合できるアニオンである〕を有するそれらの界面活性剤を包含する。ひじょうに好ましいカチオン性界面活性剤は、下記式： R₁R₂R₃R₄N⁺X^- （ｉ）〔式中、Ｒ₁はＣ₈−Ｃ₁₆アルキルであり、Ｒ₂，Ｒ₃及びＲ₄の個々は独立して、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄ヒドロキシアルキル、ベンジル、及び(C₂H₄₀)_xH（ここでｘは２〜５の値を有する）であり、そしてＸはアニオンである〕を有する本発明の組成物において有用な水溶性第四アンモニウム化合物である。多くても１つのＲ₂，Ｒ₃又はＲ₄はベンジルであるべきである。Ｒ₁のための好ましいアルキル鎖長は、特に、アルキル基がココナッツ又はヤシ種の脂肪に由来する鎖長の混合物であるか、又はオレフィン構築又はOXOアルコール合成により合成的に誘導される場合、Ｃ₁₂−Ｃ₁₅である。Ｒ₂Ｒ₃及びＲ₄のための好ましい基は、メチル及びヒドロキシエチル基であり、そしてアニオンＸはハロゲン化物、メトスルフェート、アセテート及びホスフェートイオンから選択され得る。本発明における使用のための式（ｉ）の適切な第四アンモニウム化合物の例は次のものである：ココナッツトリメチルアンモニウムクロリド又はブロミド；ココナッツメチルジヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド；デシルトリエチルアンモニウムクロリド；デシルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド；Ｃ₁₂−Ｃ₁₅ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド；ココナッツジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド又はブロミド；ミリスチルトリメチルアンモニウムメチルスルフェート；ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロリド又はブロミド；ラウリルジメチル（エテノキシ）₄アンモニウムクロリド又はブロミド；コリンエステル（式（ｉ）の化合物、ここでＲ₁はＲ₄はメチルである）；ジ−アルキルイミダゾリン〔式（ｉ）の化合物〕。本発明において有用な他のカチオン性界面活性剤はまた、アメリカ特許第4,22 8,044号及びヨーロッパ特許000224号にも記載されている。そこに含まれる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約25重量％、好ましくは約１〜約８重量％のそのようなカチオン性界面活性剤を含んで成る。両性界面活性剤はまた、本発明の洗濯洗剤組成物への使用のためにも適切である。それらの界面活性剤は、第二又は第三アミンの脂肪族誘導体、又は脂肪族基が直鎖又は枝分れ鎖であり得る、複素環式第二及び第三アミンの脂肪族誘導体として広く記載され得る。脂肪族置換基の１つは、少なくとも約８個の炭素原子、典型的には約８〜約18個の炭素原子を含み、そして少なくとも１つはアニオン性水−溶解基、たとえばカルボキシ、スルホネート、スルフェートを含む。両性界面活性剤の例のためには、アメリカ特許第3,929,678号（第19欄、第18〜35行）を参照のこと。そこに含まれる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、約0.2〜約15重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような両性界面活性剤を含んで成る。両性イオン界面活性剤はまた、洗濯洗剤組成物への使用のためにも適切である。それらの界面活性剤は、第二及び第三アミンの誘導体、複素環式第二及び第三アミンの誘導体、又は第四アンモニウム、第四ホスホニウム又は第三スルホニウム化合物の誘導体として広く記載され得る。両性イオン界面活性剤の例のためには、アメリカ特許第3,929,678号（第19欄、第38行〜第22欄、第48行）を参照のこと。そこに含まれる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は、典型的には、0.2〜約15重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような両性イオン性界面活性剤を含んで成る。半−極性非イオン性界面活性剤は、約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された２つの成分及び約10〜約18 個の炭素原子の１つのアルキル成分を含む水溶性アミンオキシド；約10〜約18個の炭素原子の１つのアルキル成分、及び約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された２つの成分を含む水溶性ホスフィンオキシド；及び約10〜約18個の炭素原子の１つのアルキル成分、及び約１〜約３個の炭素原子のアルキル及びヒドロキシアルキル成分から成る群から選択された成分を含む水溶性スルホキシドを含む非イオン性界面活性剤の特別なカテゴリーである。半一極性非イオン性洗剤界面活性剤は、下記式：〔式中、Ｒ³は約８〜約22個の炭素原子を含む、アルキル、ヒドロキシアルキル又はアルキルフェニル基、又はそれらの混合物であり；Ｒ⁴は約２〜約３個の炭素原子を含むアルキレン又はヒドロキシアルキレン基、又はそれらの混合物であり；ｘは０〜約３であり；そして個々のＲ⁵は、約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル又はヒドロキシアルキル基、又は約１〜約３個のエチレンオキサイド基を含むポリエチレンオキシドである〕を有する酸化アミン界面活性剤を含む。Ｒ⁵ 基は、環構造を形成するために、たとえば酸素又は窒素原子を通してお互いに対して結合され得る。それらのアミンオキシド界面活性剤は特に、Ｃ₁₈アルキルジメチルアミンオキシド及びＣ₈−Ｃ₁₂アルコキシエチルジヒドロキシエチルアミンオキシドを包含する。そこに含まれる場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約15重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような半一極性非イオン性界面活性剤を含んで成る。ビルダー系本発明の組成物は、さらにビルダー系を含むことができる。いづれかの従来のビルダー系、たとえばアルミノシリケート材料、シリケート、ポリカルボキシレート及び脂肪酸、材料、たとえばエチレンジアミンテトラアセテート、金属イオン封鎖剤、たとえばアミノポリホスホネート、特にエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸及びジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸が、本発明への使用のために適切である。明確な環境理由のためにはほとんど好ましくはないが、ホスフェートビルダーはまた、本発明においても使用され得る。適切なビルダーは、無機イオン交換材料、通常、水和化された無機アルミノシリケート材料、より特別には、水和化された合成ゼオライト、たとえば水和化されたゼオライトＡ，Ｘ，Ｂ，HS又はMAPであり得る。他の適切な無機ビルダー材料は、積層されたシリケート、たとえばSKS−６(Ho echst)である。SKS−６は、硅酸ナトリウム（Na₂Si₂O₅）から成る積層された結晶性シリケートである。カルボキシ基を含む適切なポリカルボキシレートは、ベルギー特許第831,368 号、第821,369号及び第821,370号に開示されるような乳酸及びグリコール酸の塩、並びにそれらのエーテル誘導体を包含する。２つのカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、琥珀酸、マロン酸、（エチレンジオキシ）二酢酸、マレイン酸、ジグリコール酸、酒石酸、タルトロン酸及びフマル酸の水溶性塩、並びにドイツ特許第2,446,686号及び第2,446,487号、アメリカ特許第3,935,257号に記載されるエーテルカルボキシレート、及びベルギー特許第840,623号に記載されるスルフィニルカルボキシレートを包含する。３個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは特に、水溶性シトレート、アコニトレート及びシトラコネート、並びにスクシネート誘導体、たとえばベルギー特許第1,379,241号に記載されるカルボキシメチルオキシスクシネート、及びオキシポリカルボキシレート材料、たとえばイギリス特許第1,387,447号に記載される２−オキサー１，１，３−プロパントリカルボキシレートを包含する。４個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、イギリス特許第1,261,82 9号に開示されるオキシジスクシネート、１，１，２，２−エタンテトラカルボキシレート、スルホ置換基を含む１，１，３，３−プロパンテトラカルボキシレート、たとえばイギリス特許第 1,398,421号及び第 1,398,422号、及びアメリカ特許第 3,936,448号に開示されるスルホスクシネート、及びイギリス特許第 1,082,179号に記載されるスルホネート化された、熱分解されたシトレートを包含し、そしてホスホン置換基を含むポリカルボキシレートがイギリス特許第 1,439,000号に開示されている。脂環式及び複素環式ポリカルボキシレートは、シクロペンタンーシス；シス− シス−テトラカルボキシレート；シクロペンタジエニド；ペンタカルボキシレート；２，３，４，５−テトラヒドロフラン−シス、シス、シス−テトラカルボキシレート；２，５−テトラヒドロフラン−シス；ジスカルボキシレート、２，２，５，５−テトラヒドロフラン−テトラカルボキシレート；１，２，３，４，５，６−ヘキサン−ヘキサカルボキシレート；及び多価アルコール、たとえばソルビトール、マンニトール及びキシリトールのカルボキシメチル誘導体を包含する。芳香族ポリカルボキシレートは、イギリス特許第 1,425,343号に開示される、メリット酸、ピロメリット酸、及びフタル酸誘導体を包含する。上記のうち、好ましいポリカルボキシレートは、分子当たり３個までのカルボキシ基を含むヒドロキシカルボキシレート、より特定には、シトレートである。本発明の組成物への使用のための好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノシリケートビルダー、たとえばゼオライトＡ、又は積層されたシリケート（SKS− ６）、及び水溶性カルボキシレートキレート化剤、たとえばクエン酸の混合物を含む。本発明の洗剤組成物への包含のための適切なキレート化剤は、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二琥珀酸（EDDS）、又はそのアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、又は置換されたアンモニウム塩、又はそれらの混合物である。好ましいEDDS化合物は、遊離酸形及びそのナトリウム又はマグネシウム塩である。EDDSのそのような好ましいナトリウム塩の例は、Na₂EDDS及びNa₄EDDSを包含する。EDDSのそのような好ましいマグネシウム塩の例は、MgEDDS及びMg₂EDDSを包含する。マグネシウム塩は、本発明の組成物への包含のために最とも好ましいものである。好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノシリケートビルダー、たとえばゼオライトＡ及び水溶性カルボキシレートキレート化剤、たとえばクエン酸の混合物を包含する。顆粒組成物への使用のためのビルダー系の一部を形成することができる他のビルダー材料は、無機材料、たとえばアルカリ金属の炭酸塩、炭酸水素塩、珪酸塩、及び有機材料、たとえば有機ホスホネート、アミノポリアルキレンホスホネート、及びアミノポリカルボキシレートを包含する。他の適切な水溶性有機塩は、ホモ又はコポリマー酸又はそれらの塩であり、ここでポリカルボン酸は２つよりも多くない炭素原子によりお互いから分離される少なくとも２つのカルボキシル基を含んで成る。このタイプのポリマーは、GB−Ａ−1,596,756に開示される。そのような塩の例は、MW 2000〜5000のポリアクリレート、及び無水マレイン酸とのそれらのコポリマーであり、そのようなコポリマーは20,000〜70,000）特に約40,000の分子量を有する。洗剤ビルダー塩は通常、組成物中に５〜80重量％の量で含まれる。液体洗剤のためのビルダーの好ましいレベルは、３％〜30％である。酵素本発明の酵素調製物の他に、好ましい洗剤組成物は、清浄性能及び／又は布保護の利点を付与する他の酵素を含んで成る。そのような酵素は、他のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ（たとえばラッカーゼ）を包含する。プロテアーゼ：アルカリ溶液への使用のために適切ないづれか他のプロテアーゼが使用され得る。適切なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物起源のものを包含する。微生物起源が好ましい。化学的に又は遺伝子的に修飾された突然変異体が包含される。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ、又はトリプシン様プロテアーゼであり得る。アルカリプロテアーゼの例は、ズブチリシン、特にバシルスに由来するもの、たとえばズブチリシンNovo、ズブチリシンCarlsberg、ズブチリシン309、ズブチリシン147及びズブチリシン168である（WO89/06279号に記載される）。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（たとえばブタ又はウシ起源の）及びWO89/06270号に記載されるフサリウム（Fusarium）プロテアーゼである。好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、Novo Nordisk A/S(デンマーク）により商標Alcalase，Savinase，Primase，Durazym、及びEsperaseとして市販されるもの、Genencor Internationalにより商標Maxatase，Maxacal，Maxapem，Properas e，Purafect及びPurafect OXPとして市販されるもの、及びSolvay Enzymesにより商標Opticlean及びOptimaseとして市販されるものを包含する。プロテアーゼ酵素は、本発明の組成物中に、組成物中の酵素タンパク質の0.00001〜２重量％のレベルで、好ましくは0.0001〜１重量％のレベルで、より好ましくは0.001〜0 .5重量％のレベルで、さらにより好ましくは、0.01〜0.2重量％のレベルで導入され得る。リパーゼ：アルカリ溶液への使用のために適切ないづれかのリパーゼが使用され得る。適切なリパーゼは、細菌又は菌類起源のものを包含する。化学的又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。有用なリパーゼの例は、ヨーロッパ特許第258068号及び第305216号に記載のようなヒューミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa）リパーゼ、ヨーロッパ特許第238023号に記載のようなリゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、ヨ一ロッパ特許第214761号に記載のようなカンジダ（Candida）リパーゼ、たとえばＣ．アンタルクチカ（C．antarctica）リパーゼ、たとえばＣ．アンタルクチカリパーゼＡ又はＢ、ヨーロッパ特許第218272号に記載のようなプスードモナス（Pseudomonas）リパーゼ、たとえばＰ．アルカリゲネスＰ．alcaligen es及びＰ．プスードアルカリゲネス（P．pseudoalcaligenes）リパーゼ、ヨーロッパ特許第311376号に記載のようなＰ．セパシア（P．cepacia）リパーゼ、イギリス特許第1,372,O34号に開示されるようなＰ．スツツゼリ（P．stutzeri）リパーゼ、Ｐ．フルオレスセンス（P．fluorescens）リパーゼ、バシルスリパーゼ、たとえばＢ．スブチリスリパーゼ(Dartoisなど．，(1993),Biocliemica et Biop hysica acta 1131，253-260)、Ｂ．ステアロサーモフィラス(B．stearothermoph ilus)リパーゼ（JP64/744992号）及びＢ．プミラス（B．pamilus）リパーゼ（WO 91/16422号）を包含する。さらに、次のような多くのクローン化されたリパーゼが有用である：Yamaguch iなど．，(1991)，Gene 103，61-67により記載されるペニシリウム・カメムベルチ（Penicillium camembertii）リパーゼ、ゲオトリカム・カンジダム（Geotric um candidum）リパーゼ（Schimada，Y.など．，(1989)，Ｊ．Biochem.，106，38 3-388）、及び種々のリゾパス（Rhizopus）リパーゼ、たとえばＲ．デレマル（R ．ｄelemar）リパーゼ(Hass，M.J.など.，(1991)，Gene 109，117-113 )，Ｒ．ニベウス（R．niveus）リパーゼ(Kugimiyaなど．，(1992)，Biosci．Bio tech．Biochem.，56，716-719)、及びＲ．オリザエ（R.oryzae）リパーゼ。他のタイプの脂肪分解酵素、たとえばグチナーゼ、たとえばWO88/09367号に記載のようなブスードモナス・メンドシナ（Pseudomonasmendocina）に由来するクチナーゼ、又はフサリウム・ソラニpisi（Fusarium solani pisi）に由来するクチナーゼ（たとえばWO90/09446号に記載される）もまた有用である。特に適切なリパーゼは、リパーゼ、たとえばＭ１ Lipase^TM，Luma fast^TM及びLipomax^TM（Genencor)，Lipolase^TM及びLipolase Ultra^TM(Novo Nordisk A/S) 及びLipase P“Amano”(Amano Pharmaceutlcal Co．Ltd.）である。リパーゼは通常、洗剤組成物に、組成物中の酵素タンパク質の0.00001〜2重量％のレベル、好ましくは0.0001〜1重量％のレベル、より好ましくは0.001〜0.5 重量％のレベル、さらにより好ましくは0.01〜0.2重量％のレベルで導入される。アミラーゼ：アルカリ溶液への使用のために適切ないづれかのアミラーゼ（α 及び／又はβ）は、細菌又は菌類起源のものを包含する。化学的又は遺伝子的に修飾された突然変異体が包含される。たとえば、アミラーゼは、イギリス特許第 1,296,839号により詳細に記載されるＢ．リケニホルミスの特定株から得られる α−アミラーゼを包含する。市販のアミラーゼは、Duramyl^TM，Termamyl^TM，Fun gamyl^TM及びBAN^TM（Novo Nordisk A/Sから入手できる）、及びRapidase^TM及びMa xamyl P^TM(Genencorから入手できる）である。アミラーゼは通常、洗剤組成物に、組成物中の酵素タンパク質の0.00001〜２重量％のレベル、好ましくは0.0001〜1重量％のレベル、より好ましくは0.001〜 0.5重量％のレベル、さらにより好ましくは0.01〜0.2重量％のレベルで組込まれる。セルラーゼ：アルカリ溶液への使用のために適切ないづれかのセルラーゼが使用され得る。適切なセルラーゼは、細菌又は菌類起源のものを包含する。化学的又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。適切なセルラーゼは、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）から生成される菌類セルラーゼを開示するアメリカ特許第4,435,307号に開示される。特に適切なセルラーゼは、色彩保護の利点を有するセルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、ヨーロッパ特許出願第0495257号に記載されるセルラーゼである。市販のセルラーゼは、ヒューミコラ・インソレンスの株により生成されるCell uzyme^TM（Novo Nordisk A/S）及びKAC-500(B)^TM(Kao Corporation)を包含する。セルラーゼは通常、洗剤組成物に、組成物中の酵素タンパク質の0.00001〜２重量％のレベル、好ましくは0.0001〜１重量％のレベル、より好ましくは0.001 〜0.5重量％のレベル、さらにより好ましくは0.01〜0.2重量％のレベルで導入される。ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：ペルオキシダーゼ酵素は、過酸化水素又はその源（たとえば過炭酸塩、過硼酸塩又は過硫酸塩）と組合して使用される。オキシダーゼ酵素は、酸素と組合して使用される。両タイプの酵素は、“溶液漂白 ”するために、すなわち染色された布から他の布への、前記布が洗浄液体において一緒に、好ましくは、たとえばWO94/12621号及びWO95/01426号に記載されるような増強剤と一緒に洗浄される場合、織物染料の移行を妨げるために使用される。適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類起源のものを包含する。化学的又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。ペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼ酵素は、通常、洗剤組成物に、組成物中の酵素タンパク質の0.00001〜２重量％のレベル、好ましくは０.0001〜１重量％のレベル、より好ましくは0.001〜0.5重量％のレベル、さらにより好ましくは0.01〜0.2重量％のレベルで導入される。上記言及された酵素の混合物、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ及び／又はセルラーゼの混合物が、本明細書に包含される。洗剤組成物に導入される、本発明の酵素又はいづれか他の酵素は通常、洗剤組成物に、前記組成物中の酵素タンパク質の0.00001〜２重量％のレベル、好ましくは0.0001〜１重量％のレベル、より好ましくは0.001〜0.5重量％のレベル、さらにより好ましくは0.01〜0.2重量％のレベルで導入される。漂白剤：本発明の洗剤組成物に含まれ得るさらなる任意の洗剤成分は、漂白剤、たとえば400〜800ミクロンの粒度を有するPB１，PB４及び過炭酸塩を包含する。それらの漂白剤成分は、１又は複数の漂白剤、及び選択される漂白剤に依存して、１又は複数の漂白活性化剤と包含することができる。存在する場合、酸素漂白化合物は典型的には、約１％〜約25％のレベルで存在するであろう。一般的に、漂白化合物は、非液体配合物、たとえば粒状洗剤における任意の添加される成分である。本発明に使用するための漂白剤成分は、酸素漂白剤及び当業界において知られている他のものを含む洗剤組成物のために有用な漂白剤のいづれかであり得る。本発明のために適切な漂白剤は、活性化された又は活性化されていない漂白剤であり得る。使用され得る１つのカテゴリーの酸素漂白剤は、過カルボン酸漂白剤及びその塩を包含する。この種類の剤の適切な例は、マグネシウムモノペルオキシフタレート六水和物、メタ−クロロ過安息香酸のマグネシウム塩、４−ノニルアミノ−４−オキソペルオキシ酪酸及びジペルオキシドデカンジオン酸を包含する。そのような漂白剤は、アメリカ特許第4,483,781号、アメリカ特許第740 ,446号、ヨーロッパ特許第0133354号及びアメリカ特許第4,412,934号に開示される。ひじょうに好ましい漂白剤は、また、アメリカ特許第4,634,551号に記載されるような６−ノニルアミノ−６−オキソペルオキシカプロン酸を包含する。使用され得るもう１つのカテゴリーの漂白剤は、ハロゲン漂白剤を包含する。次亜ハロゲン化物の例は、トリクロロイソシアヌル酸及びナトリウム及びカリウムジクロロイソシアヌレート、及びＮ−クロロ及びＮ−ブロモアルカンスルホンアミドを包含する。そのような材料は通常、最終製品の0.5〜10重量％、好ましくは１〜５重量％で添加される。過酸化水素開放剤は、漂白活性化剤、たとえばテトラアセチルエチレンジアミン（TAED）、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS；アメリカ特許第4, 412,934号に記載される）、３，５−トリメチルヘキサノールオキシベンゼンスルホネート（ISONOBS；ヨーロッパ特許第120591号に記載される）、又はペンタアセチルグルコース（PAG）（それらは、活性漂白種として過酸を形成するために過加水分解され、改良された漂白効果を導びく）と組合して使用され得る。さらに、漂白活性化剤Ｃ８（６−オクタンアミド−カプロイル）オキシベンゼン− スルホネート、Ｃ９（６−ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンカルホネート、及びＣ10（６−デカンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート、又はそれらの混合物は、ひじょうに適切である。また適切な活性化剤は、たとえばヨーロッパ特許出願第91870207.7号に開示されるようなアシル化されたシトレートエステルである。有用な漂白剤、たとえばペルオキシ酸、及び本発明の洗浄組成物への使用のための漂白活性化剤及び過酸素漂白化合物を含んで成る漂白システムがUSSN 08/13 6,626に記載されている。過酸化水素はまた、洗浄及び／又はすすぎ工程の開始で又はその間、過酸化水素を発生することができる酵素システム（すなわち、酵素及びそのための基質）を添加することによっても存在することができる。そのような酵素システムは、ヨーロッパ特許出願第0537381号に開示される。酸素漂白剤以外の漂白剤はまた当業界において知られており、そして本発明に使用され得る。特に興味ある１つのタイプの非酸素漂白剤は、光活性化された漂白剤、たとえばスルホン化された亜鉛及び／又はアルミニウムフタロシアニンを包含する。それらの材料は洗浄工程の間、支持体上に沈着され得る。酸素の存在下で、たとえば布を乾かすために日光につるすことによる日光による照射に基づいて、スルホン化された亜鉛フタロシアニンが活性化され、そして結果的に、支持体が漂白される。好ましい亜鉛フタロシアニン及び光活性化された漂白工程は、アメリカ特許第4,033,718号に記載されている。典型的には、洗剤組成物は、約0.025〜約1.25重量％のスルホン化された亜鉛フタロシアニンを含むであろう。漂白剤はまた、マンガン触媒を含むことができる。マンガン触媒は、“Effici ent mangunese catalysts for low-temperature bleaching”，Nature 369，199 4，pp．637-639に記載される化合物の１つであり得る。石鹸水の泡抑制剤：もう１つの任意の成分は、シリコーン、及びシリカ−シリコーン混合物により例示される石鹸水の泡抑制剤である。シリコーンは一般的に、アルキル化されたポリシロキサン材料により示され、そしてシリカは通常、シリカエーロゲル及びキセロゲル、及び種々のタイプの疎水性シリカにより例示される細かく分割された形で使用される。それらの材料は粒状物として導入され得、ここで石鹸水の泡抑制剤が水溶性又は水分散性の実質的に非界面活性の洗剤不浸透性のキャリヤーに、好都合には、開放できるように導入される。他方では、石鹸水の泡抑制剤は、液体キャリヤーに溶解され又は分散され、そして１又は複数の他の成分上に噴霧することによって適用される。好ましいシリコーン石鹸水の泡調節剤は、アメリカ特許第3,933,672号に開示される。他の特に有用な石鹸水の泡抑制剤は、ドイツ特許出願DTOS第2,646,126 号に記載される、自己乳化性シリコーン石鹸水の泡抑制剤である。そのような化合物の例は、シロキサン−グリコールコポリマーである、Dow Corningから市販されているDC−544である。特に好ましい石鹸水の泡抑制剤は、シリコーン油及び２−アルキル−アルカノールの混合物を含んで成る石鹸水の泡抑制剤システムである。適切な２−アルキル−アルカノールは、商標Isofol 12Rとして市販されている２−ブチル−オクタノールである。そのような石鹸水の泡抑制剤は、ヨーロッパ特許出願第0593841号に記載される。特に好ましいシリコーン石鹸水の泡調節剤は、ヨーロッパ特許出願第92201649 .8号に記載される。前記組成物は、非多孔性ヒュームドシリカ、たとえばAerosi l^Rと組合して、シリコーン／シリカ混合物を含むことができる。上記石鹸水の泡抑制剤は通常、組成物の0.001〜２重量％のレベル、好ましくは0.01〜1重量％のレベルで使用される。他の成分：洗剤組成物に使用される他の成分、たとえば土壌−沈殿防止剤、土壌−開放剤、螢光増白剤、石磨剤、殺菌剤、曇り阻止剤、着色剤、及び／又は封入された又は封入されていない香料が使用され得る。特に適切な封入材料は、イギリス特許第1,464,616号に記載されるような、ポリサッカリド及びポリヒドロキシ化合物のマトリックスから成る水溶性カプセルである。他の適切な水溶性封入材料は、アメリカ特許第3,455,838号に記載されるような、置換されたジカルボン酸のゲル化されていないスターチ酸エステルに由来するデキストリンを含んで成る。それらの酸−エステルデキストリンは好ましくは、ロウ質のトウモロコシ、ロウ質のモロコシ、サブ、タピオカ及びジャガイモのようなスターチから調製される。前記封入材料の適切な例は、National Starch により製造されるＮ−Lokを包含する。そのＮ−Lok封入材料は、変性されたトウモロコシスターチ及びグルコースから成る。そのスターチは、一官能置換された基、たとえばオクテニル無水琥珀酸を添加することによって変性される。本発明において適切な再沈着防止剤及び土壌沈殿防止剤は、セルロース誘導体、たとえばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、及びヒドロキシエチルセルロース、及びホモ−又はコポリマー性ポリカルボン酸又はそれらの塩を包含する。このタイプのポリマーは、ポリアクリレート、及びビルダーとして前で言及された無水マレイン酸−アクリル酸コポリマー、並びに無水マレイン酸とエチレン、メチルビニルエーテル又はメタクリル酸とのコポリマー（前記無水マレイン酸はコポリマーの少なくとも20モル％を構成する）を包含する。それらの材料は、通常、組成物の0.5〜10重量％のレベル、より好ましくは0.75〜８重量％のレベル、最とも好ましくは１〜６重量％のレベルで使用される。好ましい螢光増白剤は、アニオン特性のものであり、その例は、ニナトリウム４，４’−ビス−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン− ６−イルアミノ）スチルベン−２：２’−ジスルホネート、二ナトリウム４，４ ’−ビス−（２−モルホリノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ −スチルベン−２：２’−ジスルホネート、二ナトリウム４，４’−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２’− ジスルホネート、一ナトリウム４’，４”−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ− トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２−スルホネート、二ナトリウム４，４’−ビス−（２−アニリノ−４−（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２’−ジスルホネート、二ナトリウム４，４’−ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、二ナトリウム−４，４’−ビス−（２−アニリノ−４−（１−メチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート、ナトリウム−２−スチルビル−４”−（ナフト−１’，２’：４，５）−１，２，３−トリアゾール−２”−スルホネート、及び４，４’−ビス（２−スルホスチリル）ビフェニルである。他の有用なポリマー材料は、ポリエチレングリコール、特に1000〜10000の分子量、より好ましくは2000〜8000の分子量及び最とも好ましくは約4000の分子量のものである。それらは、0.20〜５重量％のレベル、より好ましくは0.25〜2.5 重量％のレベルで使用される。それらのポリマー及び前に言及されたホモー又はコポリマー性ポリカルボキシレート塩は、遷移金属不純物の存在下で粘土、タンパク質性及び酸化できる土壌に対する白色度維持、布への灰分沈着、及び洗浄性能を改良するために価値がある。本発明の組成物において有用な土壌開放剤は便利には、テレフタル酸と種々の組合せでのエチレングリコール及び／又はプロピレングリコール単位とのコポリマー又はターポリマーである。そのようなポリマーの例は、アメリカ特許第4,11 6,885号及び第4,711,730号、及びヨーロッパ特許第0270033号に開示される。ヨーロッパ特許第0272033号による特に好ましいポリマーは、下記式： (CH₃(PEG)₄₃)_0.75(POH)_0.25[T-PO]_2.8(T-PEG)_0.4]T(POH)_0.25((PEG)₄₃CH₃)_0.7 ₅ 〔式中、PEGは−(OC₂H₄)O−であり、POは（OC₃H₆O）であり、そしてＴは(POOC₆H₄ CO)である〕を有する。ジメチルテレフタレート、ジメチルスルホイソフタレート、エチレングリコール及び１，２−プロパンジオールのランダムコポリマーのような変性されたポリエステルがまたひじょうに有用であり、ここで末端基は主に、スルホベンゾエート、及び第二に、エチレングリコール及び／又は１，２−プロパンジオールのモノエステルから成る。目標は、“主に”スルホベンゾエートにより両末端でキャップされたポリマーを得ることであり、本発明においては、本明細書における前記コポリマーのほとんどが、スルホベンゾエート基により末端キャップされるであろう。しかしながら、いくつかのコポリマーは、十分にキャップされず、そして従って、それらの末端基は、エチレングリコール及び／又は１，２−プロパンジオールのモノエステルから成り、その理由から、“第二に”そのような種から成ることができる。本明細書における選択されたポリエステルは、約46重量％のジメチルテレフタル酸、約16重量％の１，２−プロパンジオール、約10 重量％のエチレングリコール、約13重量％のジメチルスルホ安息香酸及び約15重量％のスルホイソフタル酸を含み、そして約3,000の分子量を有する。ポリエステル及びそれらの調製方法は、ヨーロッパ特許第311342号に詳細に記載されている。軟化剤：希釈化剤はまた、本発明に従って洗濯洗剤組成物中に導入され得る。それらの剤は無機又は有機タイプのものであり得る。無機軟化剤は、GB−Ａ−１ 400898及びアメリカ特許第5,019,292号に開示されるスメクタイト粘土により例示される。有機軟化剤は、GB−Ａ１ 514276及びヨーロッパ特許第0011340号に開示されるような水不溶性第三アミン、及びEP−Ｂ−0026528号に開示されるようなモノＣ₁₂−Ｃ₁₄第四アンモニウム塩とのそれらの組合せ、並びにヨーロッパ特許第0242919号に開示されるようなジ−長鎖アミドを包含する。布軟化システムの他の有用な有機成分は、ヨーロッパ特許第0299575号及び第0313146号に開示されるような高分子量ポリエチレンオキシド材料を包含する。スメクタイト粘土のレベルは通常、5〜15重量％、より好ましくは8〜12重量％の範囲で存在し、そしてその材料は、配合物の残りに乾燥混合された成分として添加される。布用有機軟化剤、たとえば水不溶性第三アミン又はジ−長鎖アミド材料は、0.5〜５重量％、通常１〜３重量％のレベルで導入され、ところが高分子量ポリエチレンオキシド材料及び水溶性カチオン性材料は0.1〜２重量％、通常0.15〜1.5重量％のレベルで添加される。それらの材料は通常、組成物の噴霧乾燥された部分に添加されるが、但し、いくつかの場合、組成物の他の固体成分上に、それらを乾燥混合された粒状物として添加し、又はそれらを溶融された液体として噴霧することがより便利である。ポリマー染料−移行阻害剤：本発明の洗剤組成物はまた、0.001 〜10重量％、好ましくは0.01〜２重量％、より好ましくは0.05〜１重量％のポリマー染料−移行阻害剤を含むことができる。前記ポリマー染料−移行阻害剤は通常、洗剤組成物により洗浄される布上への着色された布からの染料の移行を阻害するために洗剤組成物中に導入される。それらのポリマーは、染料が洗浄において他の製品に付着するようになる機会を有する前、染色された布から洗浄される不堅牢染料を複合体化し、又は吸収する能力を有する。特に適切なポリマー染料−移行阻害剤は、ポリマーＮ−オキシドポリマー、Ｎ −ビニルピロリドン及びＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール又はそれらの混合物である。そのようなポリマーの添加はまた、本発明の酵素の性能を増強する。本発明の洗剤組成物は、液体、ペースト、ゲル、棒状又は顆粒形で存在し得る。非ダスチング粒質物は、たとえばアメリカ特許第4,106,991号及び第4,661,452 号（両者ともNovo Industri A/Sによる）に開示されるようにして生成され得る、そして任意には、当業界において知られている方法により被覆され得る。ロウ質被覆材料の例は、1000〜2000の平均分子量を有するポリ（エチレンオキサイド）生成物（ポリエチレングリコール、PEG)，16〜50個のエチレンオキサイド単位を有するエトキシル化されたノニルフェノール，アルコールが12〜20個の炭素原子を含み、そして15〜80個のエチレンオキサイド単位が存在するエトキシル化された脂肪アルコール；脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドである。流動層技法による適用のために適切なフィルム−形成被覆材料の例は、イギリス特許第1483591号に与えられている。本発明の粒状組成物はまた、“圧縮形”でも存在でき、すなわちそれらは従来の顆粒状洗剤よりも比較的高い密度、すなわち550〜950ｇ／ｌの密度を有することができ；そのような場合、本発明の粒状洗剤組成物は、従来の粒状洗剤に比較して、低い量の“無機充填剤塩”を含むだろうし；典型的な充填剤塩はスルフェート及びクロリドのアルカリ土類金属塩、典型的には硫酸ナトリウムであり；“ 圧縮”洗剤は典型的には、10％よりも高くない充填剤塩を含んで成る。本発明の液体組成物はまた、“濃縮された形”でも存在することができ、そのような場合、本発明の液体洗剤組成物は、従来の液体洗剤に比較して、低い量の水を含むであろう。典型的には、濃縮された液体洗剤の水含有率は、洗剤組成物の30重量％以下、より好ましくは20重量％以下、最とも好ましくは10重量％以下である。たとえば、本発明の組成物は、手動及び機械用洗濯洗剤組成物、たとえば洗濯用添加組成物及び染色された布の前処理への使用のために適切な組成物、添加されるすすぎ用布軟化剤組成物、及び一般的な家庭用硬質表面洗浄操作及び皿洗操作への使用のための組成物として配合され得る。次の例は、本発明のために組成物を例示するものであって、本発明の範囲を必ずしも制限し、又は定義するものではない。洗剤組成物においては、略された成分の識別は次の意味を有する： LAS：ナトリウム線状Ｃ₁₂アルキルベンゼンスルホネート TAS：ナトリウム牛脂アルキルスルホネート、 XYAS：ナトリウムＣ_IX−Ｃ_IYアルキルスルフェート SS：式２−ブチルオクタン酸の二次石鹸界面活性剤 25EY：平均Ｙモルのエチレンオキサイドにより縮合されるＣ₁₂−Ｃ₁₅の主に線状の第一アルコール 45EY：平均Ｙモルのエチレンオキサイドにより縮合されるＣ₁₄−Ｃ₁₅の主に線状の第一アルコール XYEZS：１モル当たり平均Ｚモルのエチレンオキサイドにより縮合されるＣ_IX− Ｃ_IYナトリウムアルキルスルフェート非イオン性：BASF Gmbhにより商標Plurafax LF404として市販されている、平均3 .8のエトキシル化の程度及び平均4.5のプロポキシル化の程度を有するＣ₁₃−Ｃ₁ ₅ の混合されたエトキシル化／プロポキシル化脂肪アルコール CFAA：Ｃ₁₂−Ｃ₁₄アルキルＮ−メチルグルカミド TFAA：Ｃ₁₆−Ｃ₁₈アルキルＮ−メチルグルカミドシリケート：非晶性珪酸ナトリウム（SiO₂：Na₂Oの比=2.0） NaSKS−６：式δ−Na₂Si₂O₅の結晶性積層シリケートカーボネート：無水炭酸ナトリウムホスフェート：ナトリウムトリポリホスフェート MA／AA：約80,000の平均分子量を有する、マレイン酸／アクリル酸（１：４）コポリマーポリアクリレート：BASF Gmbhにより商標PA30として市販されている、8,000の平均分子量を有するポリアクリレートホモポリマーゼオライトＡ：１〜10μｍの範囲での一次粒度を有する、式Na₁₂(Al0₂SiO₂)₁₂・ 27H₂Oの水和化されたナトリウムアルミノシリケートシトレート：クエン酸三ナトリウム・2H₂O クエン酸（citric）：クエン酸過硼酸塩：実験式NaBO₂・H₂Oを有する非晶性過硼酸ナトリウム・１H₂O漂白剤 PB4：非晶性過硼酸ナトリウム・4H₂O 過炭酸塩：実験式２Na₂CO₃・３H₂O₂を有する非晶性過炭酸ナトリウム漂白剤 TAED：テトラアセチルエチレンジアミン CMC：ナトリウムカルボキシメチルセルロース DETPMP：商標Dequest 2060としてMonsontoにより市販されているジエチレントリアミン五（メチレンホスホン酸） PVP：ポリビニルピロリドンポリマー EDDS：エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二琥珀酸、ナトリウム塩の形での〔Ｓ，Ｓ〕異性体洗濯水の泡抑制剤・50℃のMptの25％パラフィンワックス、17％疎水性シリカ、5 8％パラフィン油粒状洗濯水の泡抑制剤：粒状形での12％シリコーン／シリカ、18％ステアリルアルコール、70％スターチスルフェート：非晶性硫酸ナトリウム HMWPEO：高分子量ポリエチレンオキシド TAE25：牛脂アルコールエトキシレート（25）洗剤例１本発明の布用粒状洗浄組成物を次のようにして調製することができる：洗剤例II 本発明の布用圧縮粒状洗浄組成物（密度800ｇ／ｌ）を次のようにして調製することができる：洗剤例III 着色された布の洗濯において特に有用である本発明の布用粒状洗浄組成物を次のようにして調製した：洗剤例IV “洗浄を通しての軟化”能力を提供する本発明の布用粒状洗浄組成物を次のようにして調製することができる：洗剤例Ｖ本発明の重質液体布用洗浄組成物を次のようにして調製することができる：材料及び方法株：Ｂ．レンタス309及び147は、NCIBに寄託され、そして受託番号NCIB 10309及び 10147を与えられた、バシラスレンタスの特定株であり、そして引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第３,723,250号に記載される。Ｅ．コリMC1000（M.J．Casadaban and S.N．Cohen（1980）；J.Mol．Biol．13 8：179-207）を、従来の方法によりｒ^-，ｍ⁺にし、そしてそれはまた、アメリカ特許出願号039,298号にも記載される。プラスミド： pJS3：ズブチラーゼ309をコードする合成遺伝子を含む、Ｅ．コリ−Ｂ．スブチリスシャトルベクター．（Jacob Schiodtなど.，Ｐroten and Peptide letter s ３：39-44(1996)により記載される）。 pSX222：Ｂ．スブチリス発現ベクター（WO96/34946号に記載される）。一般的分子生物学法：特にことわらない限り、DNA操作及び形質転換は、分子生物学の標準方法を用いて実施した(Sambrookなど．（1989）Molecular cloning：A laboratory manua l，Cold Spring Horbor Lab.，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M．など．（eds.）“Current Protocols in Molecular Blology”，John Wiley and Sons ，1995；Harwood，C.R.，and Cutting，S.M．（eds.）“Molecular Biological Methods for Bacillus”，John Wiley and Sons，1990)。DNA操作のための酵素は、供給者の規格に従って使用された。 DNA操作のための酵素：特にことわらない限り、DNA操作のためのすべての酵素、たとえば制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、等は、New England Biolabs，Inc．から得られる。ランダム突然変異誘発されたライブラリーの構成：局在化されたランダム突然変異誘発の実施：突然変異誘発されるべきアミノ酸コドンに対応するヌクレオチドを除いて、突然変異されるべきDNA配列の一部に対応する突然変異誘発プライマー（オリゴヌクレオチド）を合成する。続いて、その得られる突然変異誘発プライマーを、適切な対抗するプライマーとのPCR反応に使用する。得られるPCRフラグメントを精製し、そしてシャトルベクター中にクローン化する。他方では、及び必要なら、その得られるPCRフラグメントを、消化、及びシャトルベクター中への前記突然変異誘発されたプライマーのクローニングを可能にするために第２の適切な対抗するプライマーと共にプライマーとして第２のPCR 反応に使用する。そのPCR反応は、通常の条件下で実施される。タンパク質分解活性：本発明において、タンパク質分解活性は、Kilo Novoプロテアーに対して相対的に決定され、その決定は、タンパク質分解酵素によりジメチルカゼイン(DMC)溶液を次の標準条件下で消化することに基づかれている：50℃，pH8 .3，９分、９分の反応時間、３分の測定時間。フォルダーAF 220／1が、Novo No rdisk A/S，Denmarkの要求に基づいて利用でき、ここでそのフォルダーは引用により組込まれる。 GUは、標準条件下で、40℃での15分間のインキュベーションの間、基質としてＮ−アセチルカゼインを用いて、１ｍモルのグリシンに等しい量のNH₂−基を生成するタンパク質分解酵素活性として定義されるグリシン単位である。酵素活性はまた、Journal of American 0il Chemists Socienty，Rothgeb，T. M.，Goodlander，B.D.，Garrison，P.H．，and Smith，L.A.，（1988）に記載される、可溶性基質、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニル−アラニン−パラニトロフェノールとの反応に従って、PNAアッセイを用いても測定され得る。発酵：ズブチラーゼ酵素の発酵は、100mlのBPX培地を含む500mlのバッフル三角フラスコにおいて30℃で５日間、回転振盪テーブル(30 0r.p.m.)上で行なわれた。結果的に、たとえば２ｌのブイヨンを製造するためには、20個の三角フラスコが同時に発酵された。高められた自己タンパク質加水分解安定性を有するプロテアーゼについて試験するためのアッセイ：プロテアーゼを含むサンプルを、マイクロタイタープレート又は振盪フラスコのいづれかにおいてプロテアーゼの発現を可能にする適切な培地において、対照株を包含する株を増殖することによって製造する。プロテアーゼを含む個々のサンプルから、アリコートを取り、これに、１／１ 0体積の２Ｍのグリシン−NaOH緩衝液を添加し、pHを10.0にし、そしてそのアリコートを、それぞれ４℃及び55℃で３時間インキュベートする。インキュベーションの後、プロテアーゼ活性を、次の緩衝液における0.6ｇ／ｌでの基質スクシニル−アラニン−アラニン−パラ−ニトロフェノール(Suc-Ala -Ala-pNA)を用いて決定する：150mMのKCl，50mMのNa₂B₄O₇（pHは9.0に調節される）。 20μｌのサンプル及び180μｌの基質を、96−ウェルマイクロタイタープレートのウェルにおいて混合する。色の進行を、マイクロプレートリーダーにおいて405nmで追跡する。サンプルの残留活性を、４℃でインキュベートされるアリコートのプロテアーゼ活性に対する55℃でインキュベートされるアリコートのプロテアーゼ活性として百分率で計算する。高められた残留活性を示すプロテアーゼを同定する。培地：BPX：組成（１ｌ当たり）：培地中のスターチが、α−アミラーゼにより液化され、そして培地が120℃で4 5分間、加熱することによって殺菌される。殺菌の後、培地のpHが、NaHCO₃を0.1 Ｍまで添加することによって、９に調節される。例本発明の酵素変異体の生成のためには、次に記載されるのと同じ材料及び方法を参照のこと．WO89/06279（Novo Nordisk A/S）、ヨーロッパ特許第130,756号( Genentech)、ヨーロッパ特許第479,870号（Novo Nordisk A/S）、ヨーロッパ特許第214,435号（Henkel）、WO87/04461(Amgen)、WO87/05050(Genex)、ヨーロッパ特許出願第87303761号(Genentech)、ヨーロッパ特許第260,105号（Genencor）、WO88/06624（Gist-Brocades NV）、WO88/07578（Genentech)、WO88/08028(Gen ex)、WO88/08033(Amgen)、WO88/08164(Genex)、Thomasなど．（1985）Nature，3 18：375-376；Thomasなど．（1987）J．Mol．Biol.，193：803-813；Russel and Fersht（1987）Nature 328：496-500。当業界において広く確立された他の方法がまた、使用され得る。例１．酵素変異体の構成及び発現：ズブチラーゼ309特定部位変異体を、それぞれDengなど．（Anal．Biochem．20 0：21-88(1992)）及びMarkvardsenなど．（BioTechniques 18（3）：371-372(19 95)）により記載される、“Unique s ite elimination（USE）”又は“Uracil-USE”技法により製造した。鋳型プラスミドは、pJS3、又はズブチラーゼ309の変異体を含むその類似体であった。USE突然変異を、構造体R170L変異体に対して指図されたオリゴヌクレオチドと共にY167A変異体をコードする遺伝子を含むpJS3類似体に対して実施し、最終Y167A+R170Lズブチラーゼ309変異体をもたらした。次に、pJS3に構成されたズブチラーゼ309変異体を、制限酵素KpnＩ及びM1u2を用いて、Ｂ．スブチリスpSX222発現プラスミド中にサブクローン化した。この構造体を用いて、コンピテントＢ．スブチリス株を形質転換し、そしてプロテアーゼを精製するために、10μｇ／mlのクロラムフェニコール(CAM)を含む培地において上記のようにして発酵した。例２．酵素変異体の精製：この方法は、ズブチリシン147酵素、ズブチリシン309酵素又はその変異体の２ｌ規模の発酵の精製に関する。約1.6ｌの発酵ブイヨンを、1ｌのビーカーにおいて35分間、5000rpmで遠心分離した。上清液を10％酢酸を用いて、pHを6.5に調節し、そしてSeitz Supra S10 0フィルタープレート上で濾過した。濾液を、Amicon S1Y10 UF遠心分離機を備え付けられたAmicon CH2A UFユニットを用いて、約400mlに濃縮した。UF濃縮物を、遠心分離し、そして濾過し、その後、pH７でBacitracin親和性カラム上で室温で吸収した。プロテアーゼを、室温でBacitracinカラムから、pH７に調節された、0.01Ｍのジメチルグルタル酸、 0.1Ｍの硼酸及び0.002Ｍの塩化カルシウムを含む緩衝溶液中、25％の２−プロパノール及び１Ｍの塩化ナトリウムを用いて溶離した。 Bacitracin精製段階からのプロテアーゼ活性を有する画分を組合し、そしてpH 6.5に調節された、0.01Ｍのジメチルグルタル酸、0.2Ｍの硼酸及び0.002Ｍの塩化カルシウムを含む緩衝液により平衡化された750mlのSephadex G25カラム（５c mの直径）に適用した。 Sephadex G25カラムからのタンパク質分解活性を有する画分を組合し、そして pH6.5に調節された、0.01Ｍのジメチルグルタル酸、0.2Ｍの硼酸及び0.002Ｍの塩化カルシウムを含む緩衝液により平衡化された150mlのCM Sepharose CL 6Bカチオン交換カラム（５cmの直径）に適用した。プロテアーゼを、２ｌの同じ緩衝液（ズブチリシン147の場合、０〜0.2Ｍの塩化ナトリウム）における０〜0.1Ｍの塩化ナトリウムの線状グラジエントを用いて溶離した。最終精製段階においては、CM Sepharoseカラムの、プロテアーゼ含有画分を組合し、そしてGR81PP膜（Danish Sugar Factories Inc．からの）を備えたAmicon 限外濾過セルにおいて濃縮した。前記構成及び上記単離方法について例１の技法を用いることによって、次のズブチリシン309変異体を生成し、そして単離した：Ａ：Y167I+R170L+A133P Ｂ：Y167I+R170L+T134P Ｃ：Y167I+R170L+A133P+T134P Ｄ：Y167I+R170L+V104C+S132C Ｅ：Y167I+R170L+A108C+T134C Ｆ：Y167A+R170S+F189A Ｇ：Y167A+R170S+Y192A Ｈ：Y167A+R170S+Y192P Ｉ：Y167A+R170S+Y192A+A194P Ｊ：Y167A+R170S+Y192P+A194P Ｋ：Y167A+R170S+F189G Ｌ：Y167A+R170S+F189E Ｍ：Y167A+R170S+F189R Ｎ：Y167I+R170L Ｍ：Y167I+R170L+A194P Ｏ：Y167A+R170S+A194P Ｐ：Y167A+R170L+A194P Ｑ：Y167A+R170N+A194P Ｒ：V104C+S132C+Y167I+R170L Ｓ：A108C+T134C+Y167I+R170L 例３．自己分解切断部位の同定：）は、SDS−PAGE分析により、自己分解分解にたぶん起因する２つのバンドを含むことが見出された。前記バンドはそれぞれ、12KDa及び10KDaのMrを伴って移動した。それらの２つのバンドを構成するペプチドのＮ−末端アミノ酸配列を、SD S−PAGE、及びPVDF膜上へのエレクトロブロットに従って決定した。 Mr12KDaを伴って移動するバンドのＮ−末端アミノ酸配列は、Ｎ：Y167I+R170L のＮ−末端アミノ酸配列に対して同一であるAla-Gln-Ser-Val-Pro-Trp-Gly-Ile- Ser-であることが見出された。 Mr10KDaを伴って移動するＮ−末端アミノ酸配列は、Ｎ：Y167I+R170Lにおけるアミノ酸残基187〜195(BPN’番号付けによる残基193〜201)のアミノ酸配列に対して同一であるGly-Ala-Gly-Leu-Asp-Ile-Val-Ala-Pro-であることが見出された。これは、Ｎ：Y167I+R170Lにおけるアミノ酸残基186及び187(BPN’番号付けによる残基192及び193)間のペプチド結合を、自己分解切断部位として同定する。前記画分のマトリックス助力レーザー脱着イオン化time-of-flight質量分光学（Matrix assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectr ometry）は、２種の成分の質量がそれぞれ、12,997.5KDa±BKDa及び8,397.8KDa ±８KDaであることを示した。Ｎ：Y167I+R170Lにおけるアミノ酸残基187〜269(BPN’番号付けによる残基193 〜275)から成る自己分解フラグメントの理論的質量は、8,397.3KDaであり、それにより、他の自己分解切断部位が残基186側Ｃ−末端で生じなかったことを確かめた。より大きなフラグメント(12,997.5KDa)の質量値を用いて、他の自己分解切断がＮ：Y167I+R170Lにおけるアミノ酸残基130及び131(BPN’番号付けによる残基1 32及び133)間に生じることを推定することが可能である。Ｎ：Y167I+R170Lにおけるアミノ酸残基１〜300(BPN’番号付けによる残基１〜132)から成る自己分解フラグメントの理論的質量は、12,699.1KDaである。Ｎ：Y167I+R170Lにおける自己分解切断部位のそれらの発見を実証するために、プロテアーゼを、0.1Mのリン酸ナトリウム(pH7.5)において37℃で、２mg／ml の濃度でインキュベートした。０分〜６時間までの種々の時点で、インキュベーション混合物の20μｌアリコートを取り、そして１％ TFA 80μｌを添加し、Ｎ：Y167I+R170Lのタンパク質加水分解活性の不可逆的阻害をもたらす。マトリックス助力レーザ脱着time-of-flight質量分光計による分析まで、サンプルをフリーザーに保持した。質量分光計の結果は、それぞれ12,698.9KDa±13KDa及び8,396.1KDa±８KDaの質量を有するフラグメントの量の定常上昇、及び26,607.0KDa±26KDaの質量を有する成分の定常減少を明確に示した。例４．ランダムプロテアーゼ変異体の構成３個のランダムライブラリーを、自己タンパク質加水分解切断部位132〜133の近くで構成した。３個のライブラリーの個々において、BLS309変異体Y167I+R170 Lを鋳型として使用した。アミノ酸(aa)１）129〜131，２）132〜133，３）134〜135の３個のライブラリーの構成を、上記材料及び方法セクションに記載のようにして調製した。突然変異誘発されることが所望されるアミノ酸コドンで第１及び第２塩基における４個々の塩基の個々25％を有する１つのオリゴヌクレオチドを合成した。１又は２個のコドンを有するアミノ酸への変更のためのより大きな見込みを付与するために50％Ｇ／50％Ｃを有する、コドンにおける第３ヌクレオチド（wobble塩基）を合成した。突然変異誘発プライマーを、鋳型として、適切な対抗プライマー及びプラスミドpJS3：(Y167I+R170L)とのPCR反応に使用した。得られるPCRフラグメントを精製し、そしてその得られるPCRフラグメントを、第２の適切な対抗プライマーと共にプライマーとして第２のPCR反応に使用した。この段階は、突然変異誘発された領域を消化し、そしてpJS3シャトルベクター中にクローン化できるために好都合であった。 10,000〜80,000クローン／ライブラリーを含む、領域129〜131，132〜133，13 4〜135のライブラリーを調製した。 10個のランダムに選択されたクローンを配列決定し、企画された突然変異を確かめた。例５．高められた自己タンパク質加水分解活性を有するプロテアーゼ変異体の同定例４に記載のようにして構成された個々のライブラリーにおけるクローンを、上記のようにして、自己タンパク質加水分解安定性について試験する。個々のライブラリーのために、500個の個々のクローンを、10μｇ／mlのクロラムフェニコール(CAM)を有するLB培地200mlにおいて37℃で一晩、マイクロタイタープレートにおいてインキュベートする。的に高められた自己タンパク質加水分解安定性を有する変異体：Ｘ：A133D+Y167 I+R170L，Ｙ：P129K+Y167I+R170L、及びGG：P129K+P131H+Y167I+R170Lを同定した。これは、132〜133間に位置する自己タンパク質加水分解切断部位の近くの置換 (P129K，P131H，A133P)が高められた自己タンパク質加水分解安定性を提供することを示す。例６．高められたタンパク質加水分解安定性を有する変異体による比較的発酵実験 3間に位置する自己タンパク質加水分解分裂部位の近くにA194P置換を有さないその前駆体変異体“Ｎ：Y167I+R170L”と、発酵実験において比較した。両変異体を、pSX222発現ベクターバックグラウンドにおいてクローン化し、そして10μｇ／mlのCAMを含む100mlのBPX培地において、上記のようにして発酵した。５日間の発酵の後、BPX発酵培地15mlを遠心分離し、そして上清液を、上記のようにして、タンパク質加水分解活性（KPNU）を測定するために使用した。 “Ｍ：Y167I+R170L+A194P”を含む発酵培地は、“Ｎ：Y167I+R170L”変異体を含む発酵培地に比較して、有意に高いレベルのタンパク質加水分解活性を有した。両変異体が同じ比活性を有すると現在思われており、そして従って、“Ｍ：Y1 67I+R170L+A194P”変異体を含む発酵培地における高いタンパク質加水分解活性は、A194P置換を有さない“Ｎ：Y167I+R170L”前駆体変異体に比較して、“Ｍ： Y167I+R170L+A194P”における相対的に高められた自己タンパク質加水分解安定性のためであると現在思われる。類似する結果が、A194P突然変異を有さないそれらの対応する前駆体変異体と比較して、変異体Ｏ：Y167A+R170S+A194P，Ｐ：Y167A+R170L+A194P及びＱ：Y167 A+R170N+A194Pにより得られた。さらに、類似する結果が、A133P突然変異を有さないその対応する前駆体変異体と比較して、変異体HH：Ａ133P+Y167A+R170Sにより得られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (31)優先権主張番号０２８４／９７ (32)優先日平成９年３月14日(1997．3．14) (33)優先権主張国デンマーク（ＤＫ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者アンデルセン，カルステンデンマーク国，デーコー―2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ (72)発明者バウディツ，ペテルデンマーク国，デーコー―2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ (72)発明者ハンセン，ペテルカンプデンマーク国，デーコー―2880 バグスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ

Claims

【特許請求の範囲】１．残基132及び133（BASBPN番号付けによる）間に自己タンパク質加水分解性分裂部位を有し、そしてさらに、BLS309の残基129，130，131，132，133，134， 135，136（BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数の残基での又は残基における置換、挿入又は欠失により修飾されている前駆体ズブチラーゼ酵素から誘導されることによって特徴づけられ；それにより、前記前駆体ズブチラーゼ酵素に比べて高められた自己タンパク質加水分解安定性を示すズブチラーゼ酵素変異体。２．BLS309の残基G159，S164，1165，Y167，R176，Y171（BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数のアミノ酸残基に修飾を有し、そしてさらに、残基129，130，131，132，133，134，135，136（BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数の残基での又は残基における置換、挿入又は欠失により修飾されている前駆体ズブチラーゼ酵素変異体から誘導されることによって特徴づけられ；それにより、前記位置129〜136のいづれかの位置で修飾されていない前駆体ズブチラーゼ変異体に比べて高められた自己タンパク質加水分解安定性を示すズブチラーゼ酵素変異体。３．残基192及び193（BASBPN番号付けによる）間に自己タンパク質加水分解性分裂部位を有し、そしてさらに、残基189，190，191，192，193，196（BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数の残基での又は残基における置換、挿入又は欠失により修飾されている前駆体ズブチラーゼ酵素から誘導されることによって特徴づけられ；それにより、前記前駆体ズブチラーゼ酵素に比べて高められた自己タンパク質加水分解安定性を示すズブチラーゼ酵素変異体。４．BLS309の残基P129，P131，E136，G159，S164，1165，Y167，R170，Y171（ BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数のアミノ酸残基に修飾を有し、そしてさらに、BLS309の残基189，190，191，192，193，194，195 ，196（BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置するは１又は複数の残基での又は残基における置換、挿入又は欠失により修飾されている前駆体ズブチラーゼ酵素変異体から誘導されることによって特徴づけられ；それにより、前記位置189〜196のいづれかで修飾されていない前駆体ズブチラーゼ変異体に比べて高められた自己タンパク質加水分解安定性を示すズブチラーゼ酵素変異体。５．前記前駆体ズブチラーゼ酵素が、ｉ）残基129，130，131，132，133，134，135，136（BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数の残基で、及び ii）BLS309の残基189，190，191，192，193，194，195，196（BASBPN番号付けによる）に対応する位置に位置する１又は複数の残基で修飾されている請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載のズブチラーゼ酵素変異体。６．前記前駆体ズブチラーゼがサブグループ・Ｉ−Ｓ１から選択される請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載の変異体。７．前記前駆体ズブチラーゼがABSS168，BASBPN，BSSDY、及びBLSCAR、又はサブグループＩ−Ｓ１の特徴を保持しているそれらの機能的変異体から成る群から選択される請求の範囲第６項記載の変異体。８．前記前駆体ズブチラーゼがサブグループＩ−Ｓ２から選択される請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載の変異体。９．前記前駆体ズブチラーゼがBLS147，BLS309，BAPB92及びBYSY AB、又はサブグループＩ−Ｓ２の特徴を保持しているそれらの機能的変異体から成る群から選択される請求の範囲第８項記載の変異体。 10．前記親ズブチラーゼが、TVTHER、又はサブグループＩ−Ｓ２の特徴を保持しているその機能的変異体である請求の範囲第８項記載の変異体。 11．前記置換が、少なくとも１つの他の位置における置換、挿入又は欠失と組合される請求の範囲第１〜10のいづれか１項記載の変異体。 12．前記置換が、位置36，222，218，76のいづれか１又は複数の位置における置換、挿入又は欠失と組合される請求の範囲第11項記載の変異体。 13．次の位置：129，130，131，132，133，134，135，136（BASBPN番号付けによる）のいづれか１又は複数の位置における修飾と組合して、次の修飾： T129V，T129I，T129L，T129M，T129F A129V，A129I，A129L，A129M，A129F G131V，G131I，G131L，G131M，G131F K136V，K136I，K136L，K136M，K136F， S159V，S159I，S159L，S159M，S159F， T164V，T164I，T164L，T164M，T164F， K170V，K170I，K170L，K170M，K170F， Q136V，Q136I，Q136L，Q136M，Q136F， T159V，T159I，T159L，T159M，T159F， A164V，A164I，A164L，A164M，A164F， Y170V，Y170I，Y170L，Y170M，Y170F， Y171A，Y171H，Y171N，Y171P，Y171C，Y171W， Y171Q，Y171S，Y171T，Y171G Y171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171F E136V，E136I，E136L，E136M，E136F， G159V，G159I，G159L，G159M，G159F， G164V，G164I，G164L，G164M，G164F， S164V，S164I，S164L，S164M，S164F， Y167A，Y167H，Y167N，Y167P，Y167C，Y167W， Y167Q，Y167S，Y167T，Y167G Y167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167F R170A，R170H，R170N，R170P，R170C，R170W R170Q，R170S，R170T，R170Y，R170G R170V，R170I，R170L，R170M，R170F，のいづれかの組合せである請求の範囲第１〜12のいづれか１項記載の変異体。 14．次の位置：189，190，191，192，193，194，195，196（BASBPN番号付けによる）のいづれか１又は複数の位置における修飾と組合せて、次の修飾： T129V，T129I，T129L，T129M，T129F A129V，A129I，A129L，A129M，A129F G131V，G131I，G131L，G131M，G131F K136V，K136I，K136L，K136M，K136F， S159V，S159I，S159L，S159M，S159F， T164V，T164I，T164L，T164M，T164F， K170V，K170I，K170L，K170M，K170F， Q136V，Q136I，Q136L，Q136M，Q136F， T159V，T159I，T159L，T159M，T159F， A164V，A164I，A164L，A164M，A164F， Y170V，Y1701，Y170L，Y170M，Y170F， Y171A，Y171H，Y171N，Y171P，Y171C，Y171W， Y171Q，Y171S，Y171T，Y171G Y171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171F E136V，E1361，E136L，E136M，E136F， G159V，G159I，G159L，G159M，G159F， G164V，G164I，G164L，G164M，G164F， S164V，S164I，S164L，S164M，S164F， Y167A，Y167H，Y167N，Y167P，Y167C，Y167W， Y167Q，Y167S，Y167T，Y167G Y167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167F R170A，R170H，R170N，R170P，R170C，R170W R170Q，R170S，R170T，R170Y，R170G R170V，R170I，R170L，R170M，R170F，のいづれかの組合せである請求の範囲第１〜12のいづれか１項記載の変異体。 15．次の位置：ｉ）130，131，132，133，134，135，136（BASBPN番号付けによる）、及び ii）190，191，192，193，194，195，196（BASBPN番号付けによる）のいづれか１又は複数の位置における修飾と組合せて、次の修飾： T129V，T129I，T129L，T129M，T129F A129V，A129I，A129L，A129M，A129F G131V，G131I，G131L，G131M，G131F K136V，K136I，K136L，K136M，K136F， S159V，S159I，S159L，S159M，S159F， T164V，T164I，T164L，T164M，T164F， K170V，K170I，K170L，K170M，K170F， Q136V，Q136I，Q136L，Q136M，Q136F， T159V，T159I，T159L，T159M，T159F， A164V，A164I，A164L，A164M，A164F， Y170V，Y170I，Y170L，Y170M，Y170F， Y171A，Y171H，Y171N，Y171P，Y171C，Y171W， Y171Q，Y171S，Y171T，Y171G Y171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171F E136V，E136I，E136L，E136M，E136F， G159V，G159I，G159L，G159M，G159F， G164V，G164I，G164L，G164M，G164F， S164V，S164I，S164L，S164M，S164F， Y167A，Y167H，Y167N，Y167P，Y167C，Y167W， Y167Q，Y167S，Y167T，Y167G Y167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167F R170A，R170Π，R170N，R170P，R170C，R170W R170Q，R170S，R170T，R170Y，R170G R170V，R170I，R170L，R170M，R170F，のいづれかの組合せである請求の範囲第１〜12のいづれか１項記載の変異体。 16．前記変異体が、位置：27，36，57，76，97，101，104，120，123，206，2 18，222，224，235、及び274のいづれか１又は複数の位置における追加の置換、欠失及び／又は挿入と組合される請求の範囲第１〜15のいづれか１項記載の変異体。 17．前記ズブチラーゼＩ−Ｓ２サブグループに属し、そして前記さらなる変更が、K27R，^*36D，S57P，N76D，G97N，S101G，V104A， V104N，V104Y，H120D，N123S，Q206E，N218S，M222S，M222A，T224S，K235L及び T274Aから成る群から選択される請求の範囲第16項記載の変異体。 18．請求の範囲第１〜17のいづれか１項記載のいづれか１又は複数の置換、欠失及び／又は挿入と組合せて、変異体V104N+S101G，K27R+V104Y+N123S+T274A、もしくはN76D+V104A、又はそれらの突然変異の他の組合せ（V104N，S101G，K27R ，V104Y，N123S，T274A，N76D，V104A、のいづれかを含んで成る請求の範囲第17 項記載の変異体。 19．少なくとも次の突然変異：Ａ：Y167I+R170L+A133P Ｂ：Y167I+R170L+T134P Ｃ：Y167I+R170L+A133P+T134P Ｄ：Y167I+R170L+V104C+S132C Ｅ：Y167I+R170L+A108C+T134C Ｆ：Y167A+R170S+F189A Ｇ：-Y167A+R170S+Y192A Ｈ：Y167A+R170S+Y192P Ｉ：Y167A+R170S+Y192A+A194P Ｊ：Y167A+R170S+Y192P+A194P Ｋ：Y167A+R170S+F189G Ｌ：Y167A+R170S+F189E Ｍ：Y167A+R170S+F189R Ｎ：Y167I+R170L Ｍ：Y167I+R170L+A194P Ｏ：Y167A+R170S+A194P Ｐ：Y167A+R170L+A194P Ｑ：Y167A+R170N+A194P Ｒ：V104C+S132C+Y167I+R170L Ｓ：A108C+T134C+Y167I+R170L Ｔ：V104C+S132C+Y167A+R170S Ｕ：V104C+S132C+Y167A+R170L Ｖ：V104C+S132C+Y167A+R170N Ｘ：A133D+Y167I+R170L Ｙ：P129K+Y167I+R170L Ｚ：A133P+Y167A+R170S+A194P AA：T134P+Y167A+R170S+A194P BB：A133P+T134P+Y167A+R170S+A194P CC：133P+Y167A+R170N+A194P DD：T134P+Y167A+R170N+A194P EE：A133P+T134P+Y167A+R170N+A194P FF：A133P＋Y167A＋R170L GG：P129K+P131Π+Y167I+R170L HH：A133P＋Y167A＋R170S II：133P+Y167A+R170N JJ：Y167A+R170S+F189K KK：V104C+T134C+Y167A+R170S を含んで成る変異体の群から選択される請求の範囲第１〜12のいづれか１項記載の変異体。 20．自己タンパク質加水分解安定性を示すプロテアーゼ変異体の同定方法であって、 BLS309のアミノ酸P129，P131，E136，G159，S164，1165，Y167，R170，Y171（ BASBPN番号付けによる）に対応する１又は複数の位置で、ズブチラーゼ酵素又はそのプレー又はプレプロ酵素をコードするDNAの突然変異をもたらし；前記突然変異誘発されたDNAによりバシラス株を形質転換し；そのようなプロテアーゼ変異体を生成する株を選択し；そのような株を発酵し／増殖せしめ；前記プロテアーゼ変異体を回収し；そして洗剤における改良された貯蔵安定性及び／又は洗浄性能について試験することを含んで成る方法。 21．変異体ズブチラーゼ酵素の生成方法であって、請求の範囲第20項記載の方法に従っての同定に続いて、所望する高められた自己タンパク質加水分解安定性を有する変異体ズブチラーゼ酵素を製造することを含んで成る方法。 22．請求の範囲第1〜19のいづれか１項記載のズブチラーゼ変異体をコードするDNA配列。 23．請求の範囲第22項記載のDNA配列を含んで成るベクター。 24．請求の範囲第23項記載のベクターにより形質転換された微生物宿主細胞。 25．細菌、好ましくはバシラス、特にＢ．レンタスである請求の範囲第24項記載の微生物宿主細胞。 26．菌類又は酵母、好ましくは糸状菌、特にアスペルギラスである請求の範囲第24項記載の微生物宿主細胞。 27．請求の範囲第1〜19のいづれか１項記載の変異体の生成方法であって、請求の範囲第24〜26のいづれか１項記載の宿主を、前記変異体の発現及び分泌の助けとなる条件下で培養し、そして前記前駆体を回収することを含んで成る方法。 28．請求の範囲第１〜19のいづれか１項記載のズブチラーゼ変異体を含んで成る組成物。 29．セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、他のプロテアーゼ又はアミラーゼをさらに含んで成る請求の範囲第28項記載の組成物。 30．洗剤組成物である請求の範囲第28又は29項記載の組成物。 31．洗濯用及び／又は皿洗い用洗剤への請求の範囲第１〜19のいづれか１項記載のズブチラーゼ変異体又は請求の範囲第28〜30のいづれか１項記載の酵素組成物の使用。 32．１又は複数の突然変異A194P及び／又はA133Pと組合して、少なくとも下記突然変異： R170A R170C R170F R170G R170H R170I R170L R170N R170M R170P R170Q R170S R170T R170V R170Y Y167A+R170A Y167C+R170A Y167F+R170A Y167G+R170A Y167H+R170A Y167I+R170A Y167L+R170A Y167M+R170A Y167N+R170A Y167P+R170A Y167Q+R170A Y167S+R170A Y167T+R170A Y167V+R170A Y167A+R170C Y167C+R170C Y167F+R170C Y167G+R170C Y167H+R170C Y167I+R170C Y167L+R170C Y167M+R170C Y167N+R170C Y167P+R170C Y167Q+R170C Y167S+R170C Y167T+R170C Y167V+R170C Y167A+R170F Y167C+R170F Y167F+R170F Y167G+R170F Y167H+R170F Y167I+R170F Y167L+R170F Y167M+R170F Y167N+R170F Y167P+R170F Y167Q+R170F Y167S+R170F Y167T+R170F Y167V+R170F Y167A+R170G Y167C+R170G Y167F+R170G Y167G+R170G Y167H+R170G Y167I+R170G Y167L+R170G Y167M+R170G Y167N+R170G Y167P+R170G Y167Q+R170G Y167S+R170G Y167T+R170G Y167V+R170G Y167A+R170H Y167C+R170H Y167F+R170H Y167G+R170H Y167H+R170H Y167I+R170H Y167L+R170H Y167M+R170H Y167N+R170H Y167P+R170H Y167Q+R170H Y167S+R170H Y167T+R170H Y167V+R170H Y167A+R170I Y167C+R170I Y167F+R170I Y167G+R170I Y167H+R170I Y167I+R170I Y167L+R170I Y167M+R170I Y167N+R170I Y167P+R170I Y167Q+R170I Y167S+R170I Y167T+R170I Y167V+R170I Y167A+R170L Y167C+R170L Y167F+R170L Y167G+R170L Y167H+R170L Y167I+R170L Y167L+R170L Y167M+R170L Y167N+R170L Y167P+R170L Y167Q+R170L Y167S+R170L Y167T+R170L Y167V+R170L Y167A+R170M Y167C+R170M Y167F+R170M Y167G+R170M Y167H+R170M Y167I+R170M Y167L+R170M Y167M+R170M Y167N+R170M Y167P+R170M Y167Q+R170M Y167S+R170M Y167T+R170M Y167V+R170M Y167A+R170N Y167C+R170N Y167F+R170N Y167G+R170N Y167H+R170N Y167I+R170N Y167L+R170N Y167M+R170N Y167N+R170N Y167P+R170N Y167Q+R170N Y167S+R170N Y167T+R170N Y167V+R170N Y167A+R170P Y167C+R170P Y167F+R170P Y167G+R170P Y167H+R170P Y167I+R170P Y167L+R170P Y167M+R170P Y167N+R170P Y167P+R170P Y167Q+R170P Y167S+R170P Y167T+R170P Y167V+R170P Y167A+R170Q Y167C+R170Q Y167F+R170Q Y167G+R170Q Y167H+R170Q Y167I+R170Q Y167L+R170Q Y167M+R170Q Y167N+R170Q Y167P+R170Q Y167Q+R170Q Y167S+R170Q Y167T+R170Q Y167V+R170Q Y167A+R170S Y167C+R170S Y167F+R170S Y167G+R170S Y167H+R170S Y167I+R170S Y167L+R170S Y167M+R170S Y167N+R170S Y167P+R170S Y167Q+R170S Y167S+R170S Y167T+R170S Y167V+R170S Y167AfR170T Y167C+R170T Y167F+R170T Y167G+R170T Y167H+R170T Y167I+R170T Y167L+R170T Y167M+R170T Y167N+R170T Y167P+R170T Y167Q+R170T Y167S+R170T Y167T+R170T Y167V+R170T Y167A+R170V Y167C+R170V Y167F+R170V Y167G+R170V Y167H+R170V Y167I+R170V Y167L+R170V Y167M+R170V Y167N+R170V Y167P+R170V Y167Q+R170V Y167S+R170V Y167T+R170V Y167V+R170V Y167A+R170Y Y167C+R170Y Y167F+R170Y Y167G+R170Y Y167H+R170Y Y167I+R170Y Y167L+R170Y Y167M+R170Y Y167N+R170Y Y167P+R170Y Y167Q+R170Y Y167S+R170Y Y167T+R170Y Y167V+R170Y を含んで成る変異体の群から選択される請求の範囲第１〜12のいづれか１項記載の変異体。