DE60034885T2

DE60034885T2 - Enzymlauge und verfahren zu deren herstellung, enzymzubereitung, proteasezubereitungen und proteaseproduzierendes bakterium

Info

Publication number: DE60034885T2
Application number: DE60034885T
Authority: DE
Inventors: Hiroko Haguri-gun NAGANO; Zenya Akita-shi SHOJI; Kenichi c/o Amano Enzyme Inc. Kakamigahara-shi HIRANO; KEIICHI c/o Amano Enzyme Inc. Kakamigahara-shi ANDO
Original assignee: Amano Enzyme Inc
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1999-05-27
Filing date: 2000-05-25
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2020-05-26
Also published as: DE60034885D1; EP1186658A1; EP1186658A4; US6767729B1; EP1186658B1; WO2000073429A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Enzymlösung und ein Verfahren zum Herstellen derselben, eine aus der Enzymlösung erhaltene Enzymaufbereitung, eine proteolytische Enzymaufbereitung, die die Enzymlösung oder die Enzymaufbereitung als aktiven Bestandteil enthält und einen die proteolytischen Enzyme erzeugenden Stamm.
Hintergrund der Erfindung
In außerordentlich unterschiedlichen Gebieten der Industrie wurden Verfahren zum Hydrolysieren verschiedener Proteine zu Peptiden oder Aminosäuren weithin verwendet. Die Verfahren wurden zum Beispiel für das Herstellen von medizinischen enterischen Formulierungen und Nahrungsmittelergänzungsmitteln als Nahrungsmaterialien verwendet. Diese Verfahren wurden ebenso zum Steigern der Wirksamkeit der Nahrungsmittelausnutzung eingesetzt, indem die Effizienz beim Hydrolysieren von schwer zu hydrolysierenden Proteinen, die in Sojabohnenprotein und dergleichen enthalten sind, gesteigert wird. Ferner werden die Verfahren zum Herstellen von Aminosäurewürzmitteln aus Proteinen als Rohmaterialien verwendet. Darüber hinaus werden die Verfahren zum Herstellen von Brot, das verstärkt aufgeht, verwendet.
Obwohl chemische Abbauverfahren unter Verwenden von Salzsäure und dergleichen zum Hydrolysieren von Proteinen effizient sind, können diese Verfahren aufgrund der starken Hydrolysebedingungen in der Bildung von ungewünschten Nebenprodukten resultieren. Insbesondere im industriellen Gebiet der Lebensmittel, Würzmittel, Nahrungsmaterialien und dergleichen, die den menschlichen Körper betreffen, werden Verfahren zum Hydrolysieren von Proteinen unter milden Bedingungen bevorzugt (zum Beispiel japanische Patentveröffentlichung Nr. Hei-7-53106 , japanisches offengelegtes Patent Nr. Hei-11-75765 , und dergleichen).
Hierbei wurden proteolytische Enzyme für die industrielle Verwendung für die oben genannten Zwecke bisher hauptsächlich mittels verschiedener Bakterien und Pilze hergestellt. Dennoch wird im Allgemeinen behauptet, dass proteolytische Enzyme, die aus Bakterien erhalten werden und solche, die aus Pilzen erhalten werden, sowohl Vor- als auch Nachteile aufweisen. Tatsächlich waren proteolytische Enzyme, die eine ausreichende Aktivität und Stabilität aufweisen, für die industrielle Verwendung nicht erhältlich.
Mit anderen Worten haben von Bakterien stammende proteolytische Enzyme im Allgemeinen eine gute Wärmebeständigkeit aber eine geringe Peptidaseaktivität zum Hydrolysieren von Protein zu Aminosäuren oder eine geringe Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen in kleinere Moleküle. Aus diesem Grund enthalten die Abbauprodukte, die durch Verwenden von von Bakterien stammenden proteolytischen Enzymen erhalten werden, große Mengen an hochmolekularen Peptiden. Daher besteht bei solchen Produkten der Nachteil, dass deren Bitterkeit als Nahrungsmaterialien, Würzmittel und dergleichen hoch ist und dass die intestinale Absorption derselben als Materialien für die Ernährung langsam ist. Obwohl von Bakterien abgeleitete proteolytische Enzyme eine gute Wärmebeständigkeit aufweisen, wurde selten von einem solchen proteolytischen Enzym mit hoher Wärmebeständigkeit berichtet, das die Peptidaseaktivität zum Beispiel in einem hohen Temperaturbereich von ungefähr 60°C aufrechterhalten kann.
Im Gegensatz dazu sind von Pilzen stammende proteolytische Enzyme im Allgemeinen ausgezeichnet in der Peptidaseaktivität, in der breiten Spaltungsspezifität für eine Peptidbindung, und der Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen in kleinere Moleküle und dergleichen. Dennoch ist zum Beispiel die Wärmebeständigkeit und die Wirksamkeit der Proteinhydrolyse in einem moderaten bis hohen Temperaturbereich von ungefähr 50°C oder höher, schwach. Daher erfordern solche proteolytischen Enzyme im Wesentlichen Schritte der Proteinhydrolyse in einem relativ niedrigen Temperaturbereich, was die Vermehrung von kontaminierten Mikroorganismen leicht ermöglicht.
Wie oben beschrieben wurden keine proteolytischen Enzyme mit hoher Wärmestabilität bereitgestellt, so dass das Enzym in moderaten bis hohen Temperaturbereichen nie inaktiviert wird, und die ebenso eine hohe Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen in kleinere Moleküle aufweisen.
Ferner ist es wünschenswert schwer zu hydrolysierende Proteine wirksam zu hydrolysieren, wie solche, die in Sojabohnen und dergleichen als nützliche Proteinmaterialien enthalten sind. Es ist daher wichtig, dass proteolytische Enzyme eine breite Spaltungsspezifität für Peptidbindungen in Protein aufweisen. Dennoch wurde kein proteolytisches Enzym bereitgestellt, das sowohl Wärmestabilität und eine hohe Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen in kleinere Moleküle aufweist und das zusätzlich eine hohe Wirksamkeit beim Hydrolysieren schwer hydrolysierbarer Proteine aufweist.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfinder kultivierten ein Bakterium der Gattung Bacillus, das aus dem Teig von „Mantou" (eine Art asiatischer Dampfbrötchen) isoliert wurde, eines der traditionellen Lebensmittel im mongolischen Distrikt. Es wurde dann herausgefunden, dass die nachfolgend erhaltene Enzymlösung die oben beschriebenen Enzymeigenschaften aufwies.
Basierend auf diesen Erkenntnissen, stellt die Erfindung eine proteolytische Enzymlösung mit Wärmestabilität in einem moderaten bis hohen Temperaturbereich und ebenso mit einer ausgezeichneten Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen in kleinere Moleküle bereit. Ferner stellt die Erfindung eine proteolytische Enzymlösung bereit, die zusätzlich die Wirksamkeit des wirksamen Hydrolysierens von schwer zu hydrolysierenden Proteinen aufweist. Darüber hinaus stellt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer solchen Enzymlösung bereit. Weiter stellt die Erfindung eine Enzymaufbereitung bereit, die durch Abtrennen des Enzymproteins von der Enzymlösung erhalten wurde. Und noch weiter stellt die Erfindung eine proteolytische Enzymaufbereitung bereit, die die Enzymaufbereitung als aktiven Bestandteil enthält und die für bestimmte Anwendungen verwendet werden kann. Noch weiter stellt die Erfindung einen Stamm bereit, der das proteolytische Enzym zum Herstellen der Enzymlösung und der Enzymaufbereitung herstellt.
Die Enzymlösung der Erfindung ist eine Enzymlösung mit proteolytischer Aktivität, die durch Kultivieren eines Bakteriums der Gattung Bacillus erhalten werden kann und die eine solch hohe hitzebeständige Peptidaseaktivität aufweist, dass deren verbleibende Aktivität nach einer Stunde Wärmebehandlung bei 60°C bis 65°C bei pH 7 im Wesentlichen 100 % beträgt. Die Verwendung der Enzymlösung ermöglicht ein Proteinhydrolysierungs-Verfahren unter Temperaturbedingungen, die die Vermehrung von kontaminierten Mikroorganismen niemals zulassen, zum Beispiel bei 50°C oder höher oder in moderaten bis hohen Temperaturbereichen von 60 bis 65°C. Ferner kann die Peptidaseaktivität eine ausreichende Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen in kleinere Moleküle ermöglichen. Die Peptidaseaktivität ist stärker bevorzugt eine Aminopeptidaseaktivität.
Stärker bevorzugt hat die Enzymlösung der Erfindung zusätzlich eine kombinierte Protease- und Kollagenaseaktivität. Die Proteaseaktivität schließt neutrale Proteaseaktivität mit einem bevorzugten pH innerhalb des neutralen Bereichs und alkalische Proteaseaktivität mit einem bevorzugten pH innerhalb des alkalischen Bereichs ein. Es kann erwartet werden, dass eine solche Enzymlösung eine ausgezeichnetere Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen in kleinere Moleküle und, als allgemeine Eigenschaft der Proteaseaktivität, eine hohe anfängliche Umsatzgeschwindigkeit aufweist. Daher kann die proteolytische Reaktion schnell vorangebracht werden. Zum Zartmachen von Fleisch zum Beispiel, kann das Zartmachen von Fleisch durch die Peptidaseaktivität und die Proteaseaktivität gleichzeitig mit dem Spalten von Kollagen im Bindegewebe durch die Kollagenaseaktivität voranschreiten, so dass sehr schmackhaftes Fleisch hergestellt werden kann. Noch stärker bevorzugt weist die Enzymlösung der Erfindung wenigstens eine der folgenden Eigenschaften 1) bis 4) auf, so dass die unten beschriebenen zusätzlichen Wirkungen bereitgestellt werden.

1) Enzymlösung mit einer Peptidspaltungsstellen-Spezifität, die geeignet ist, Spaltungsstellen von wenigstens 10 von in der Peptidkette eines proteingebundenen Aminosäuretyps zu spalten. Bezüglich eines solch breiten Bereichs an Peptidspaltungsstellen-Spezifität, kann eine Peptidspaltungsstellen-Spezifität, die geeignet ist 10 oder mehr, bevorzugt 12 von an die Carboxylgruppe gebundenen Aminosäuretypen zu spalten, beobachtet werden. Solche Aminosäuretypen schließen insbesondere Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Lysin, Valin, Alanin, Threonin, Glycin, Serin, Glutamin, Asparagin und Arginin ein. Üblicherweise besitzen gewöhnliche proteolytische Enzyme eine Peptidspaltungsstellen-Spezifität, die geeignet ist im Wesentlichen 5 bis 6 oder weniger zu spalten, höchstens weniger als 10 gebundene Aminosäuretypen. Daher deckt die Peptidspaltungsstellen-Spezifität der Enzymlösung einen sehr breiten Bereich ab. Daher kann die Enzymlösung eine sehr hohe Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen in kleinere Moleküle beibehalten. Die Enzymlösung hat wahrscheinlich, in Folge des breiten Bereichs der Peptidspaltungsstellen-Spezifität, eine wirksame proteolytische Aktivität gegenüber Proteinen, wie solchen, die zum Beispiel von Sojabohnen stammen und die bisher schwer zu hydrolysieren waren.
2) Enzymlösung mit einer solchen Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen in kleinere Moleküle, dass eine 17 ständige Hydrolyse unter Verwenden der Enzymlösung von 200 Einheiten auf einer Proteaseaktivitätsbasis pro 1 g Säurecasein, Peptide oder Aminosäuren mit Molekulargewichten von 1000 oder weniger in einer Menge von 50 Gew.-% oder mehr, relativ zum Säurecasein, erzeugt. Bezüglich der Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen in kleinere Moleküle wurde herausgefunden, dass die Menge an erzeugten Peptiden oder Aminosäuren mit Molekulargewichten, die 1000 nicht übersteigen, außerordentlich groß im Vergleich zu den herkömmlichen proteolytischen Enzymen ist. In Folge solcher Eigenschaften der Enzymlösung, kann die Enzymlösung wirksam Peptide oder Aminosäuren mit Molekulargewichten, die 1000 nicht übersteigen, aus Rohprotein-Materialien erzeugen. Folglich können hoch qualitative Aminosäure-Materialien und Aminosäurewürzmittel ohne Bitterkeit hergestellt werden. Ferner können Materialien für Nahrung hergestellt werden, die vom Verdauungstrakt in hohem Maß absorbiert werden.
3) Enzymlösung mit einer Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen in kleinere Moleküle wie oben in 2) beschrieben, die gleichermaßen unter Temperaturbedingungen von 45°C, nahe den relativ moderaten Temperaturbereich, und bei 60°C, in einem ziemlich hohen Temperaturbereich, eingesetzt wird. In Folge solcher Eigenschaften der Enzymlösung, kann das Verfahren des Hydrolysierens von Proteinen zu kleineren Molekülen unter Temperaturbedinungen ablaufen, die die Vermehrung von kontaminierten Mikroorganismen niemals zulassen.
4) Enzymlösung, mit einer 50 %igen oder höheren Solubilisierungsrate von schwer zu hydrolysierendem Sojabohnenprotein unter gegebenen Bedingungen. Es wird erwartet, dass diese proteolytische Aktivität schwer zu hydrolysierende Proteine zu hydrolysieren ebenso für das Hydrolysieren von Proteinen in anderen Spezies wirksam ist, wie zum Beispiel in Bindegewebe von Fleisch. Diese Eigenschaft kann möglicherweise mit dem breiten Bereich an Peptidspaltungsstellen-Spezifität verbunden sein, insbesondere mit der Spaltungsstellen-Spezifität zu gebundenen Stellen von Aminosäuren wie Glycin, Valin und Asparagin, die in herkömmlichen proteolytischen Enzymen nicht gefunden wurden. In Folge einer solchen charakteristischen Eigenschaft kann die Enzymlösung wirksam Sojabohnen, die als Rohprotein-Material nützlich sind, einschließlich ihrem schwer zu hydrolysierenden Protein, in Aminosäuren hydrolysieren.

Die Enzymlösung der Erfindung kann leicht und sicher durch Kultivieren eines gegebenen Bakteriums der Gattung Bacillus erhalten werden. Die Enzymlösung kann zum Beispiel durch Kultivieren des Bacillus subtilis M2-4 Stamms, der international unter dem Budapester Vertrag als FERM BP-7155 hinterlegt ist, erhalten werden. Die Kultivierungsbedingungen hierfür sind nicht besonders beschränkt. Der Stamm kann zufriedenstellend unter Verwenden gewöhnlicher Nährmedien unter gewöhnlichen Bedingungen kultiviert werden, und kann ebenso, wenn nötig, in einem spezifischen Kulturmedium unter spezifischen Kultivierungsbedingungen kultiviert werden.
Als Enzymlösung kann ein flüssiges Kulturmedium verwendet werden, worin der Stamm, ohne Entfernen von Bakterien, kultiviert wird. Ansonsten kann ebenso eine Enzymlösung, die durch Entfernen der Bakterien oder Feststoffe daraus mittels Filtration oder Zentrifugation hergestellt wurde, verwendet werden. Die Enzymlösung kann ferner konzentriert werden, indem milde Hilfsmittel unter Verwenden einer Ultrafiltrationsmembran eingesetzt werden.
Aus den oben beschriebenen Enzymlösungen in Übereinstimmung mit der Erfindung werden mehrere Typen von Proteinfraktionen mit verschiedenen Molekulargewichten durch Säulenchromatographie erhalten. Durch einzelnes Auftrennen der Proteine in diese einzelnen Fraktionen und indem die Protein einem Enzymaktivitätstest unterzogen werden, wurde bestätigt, dass die Enzymlösung Aminopeptidase, neutrale Protease, saure Protease und Kollagenase enthielt. Daher basieren die hohe wärmebeständige Peptidaseaktivität, die Proteaseaktivität, die Kollagenaseaktivität und die oben beschriebenen Merkmale 1) bis 4) im Wesentlichen auf den Wirkungen dieser Enzyme. Dennoch konnte bisher noch nicht genau identifiziert werden, wie und zu welchem Ausmaß jedes dieser Enzyme an den einzelnen oben beschriebenen Eigenschaften 1) bis 4) beteiligt ist.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Herstellen einer Enzymlösung bereit, das das Kultivieren eines Bakteriums der Gattung Bacillus umfasst und den Erhalt einer Enzymlösung der Erfindung aus der Kultur. Das Verfahren zum Herstellen der Enzymlösung ermöglicht schnelles und sicheres Erhalten der Enzymlösung.
Ferner stellt die Erfindung eine durch Abtrennen des Enzymproteins von der Enzymlösung erhaltene Enzymaufbereitung bereit. Zum Abtrennen des Enzymproteins, kann dieses durch bekannte geeignete Verfahren, wie Aussalzen der Enzymlösung unter Sättigung von Amoniumsulfat und Ethanolfällung, abgetrennt werden. Die Enzymaufbereitung kann als Rohenzympulver oder als Formulierungen von Pufferlösungen derselben erhalten werden. Die Enzymaufbereitung ist vorteilhaft darin, dass die hoch qualitative Aufbereitung im Vergleich zu der Enzymlösung leichter hergestellt wird. Diese Enzymaufbereitungen weisen dieselbe Enzymaktivität und dieselben Eigenschaften auf wie die der Enzymlösung.
Noch weiter stellt die Erfindung eine proteolytische Enzymaufbereitung bereit, die die Enzymlösung oder die Enzymaufbereitung als aktiven Bestandteil enthält, der für einen beliebigen Einsatz verwendet werden kann, wie für die Hydrolyse von schwer zu hydrolysierendem Protein, Herstellung von Aminosäurewürzmittel, zur Brotherstellung, als Zartmacher für Fleisch, zur Peptidherstellung, zum Herstellen von Protein mit reduzierter Allergenität und für die Käseherstellung.
Die proteolytische Enzymaufbereitung hat in den oben erwähnten verschiedenen Anwendungen eine hoch wärmebeständige Peptidaseaktivität, eine ausgezeichnete Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen in kleinere Moleküle, Kollagenaseaktivität und dergleichen, was in den herkömmlichen proteolytischen Enzymaufbereitungen nicht gefunden wurde. Für die Verwendung bei der Brotherstellung bewirkt die proteolytische Enzymaufbereitung den Effekt eines Volumenanstiegs (Verstärkung des Aufgehens).
Darüber hinaus stellt die Erfindung einen Stamm bereit, der proteolytisches Enzym herstellt. Der proteolytische Enzyme herstellende Stamm stellt wirksame Mittel zum Herstellen der Auswahl der Enzymlösung, der Enzymaufbereitung und der proteolytischen Enzymaufbereitung bereit. Der proteolytische Enzyme herstellende Stamm gehört zur Gattung Bacillus und ist bevorzugt ein Bakterium der Spezies Subtilis. Der charakteristischste proteolytische Enzyme erzeugende Stamm ist der Bacillus subtilis M2-4 Stamm.
Der Bacillus subtilis M2-4 Stamm wurde als FERM P-17388 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science of Technology, beim Ministerim für Internationalen Handel und Industrie (Adresse: 1-1-3, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) am 12. Mai 1999 hinterlegt. Dann wurde der Stamm in die internationale Hinterlegung als FERM BP-7155 am 11. Mai 2000 unter dem Budapester Vertrag überführt.

Der Bacillus subtilis M2-4 Stamm ist praktisch sehr nützlich, insbesondere unter mehreren proteolytische Enzyme herstellenden Spezies der Stämme, die aus dem Teig von Mantou isoliert werden, einem traditionellen natürlichen fermentierten Weizennahrungsmittel im mongolischen Distrikt. Als Ergebnis des Identifikationstests wurde herausgefunden, dass der M2-4 Stamm den Wachstumsstatus in Tabelle 1 zeigte (die Kultur wurde in gewöhnlichem Agarkulturmedium, hergestellt von Eiken Chemical Co., Ltd., bei 30°C für 48 Stunden kultiviert). Die Bakterienmorphologie in Tabelle 2 wurde ebenso beobachtet. Ferner wurde herausgefunden, dass der Stamm die physiologischen Eigenschaften in Tabelle 3 aufwies. Tabelle 1

Punkt	M2-4 Stamm
Morphologie	rund
Oberfläche	glatt
Rand	gesamt
Höhe	flach
Transparenz	opak
Glanz	matt
Farbe	gelblich-weiß bis cremefarben

Tabelle 2

Punkt	KultivierungsTemperatur	KultivierungsDauer	M2-4 Stamm
Zelle: Morphologie Dimension	30°C	24 Stunden	Stäbchen 2,4 bis 3,0 × ungefähr 0,8 μ
Beweglichkeit	25°C	24 Stunden	hat peritriche Flagellen mit Beweglichkeit
Sporen: Morphologie geschwollenes Sporangium Sporenposition	30°C	48 Stunden	Oval nicht geschwollen zentral oder subterminal bis terminal

Tabelle 3

Punkt	M2-4 Stamm	Punkt	M2-4 Stamm
Gramfärbung	+	Phenylalanin-Deaminase	–
Katalase	+	Reduktion von Nitratsalz	+
Anerobes Wachstum	–	Indolerzeugung	–
Voges-Proskauer-Reaktion	+	Zugabe von Glucose in das Kulturmedium	+
Voges-Proskauer-Reaktion	+	Schwarzes Pigment	–
V-Pfropfpolymer broth		Wachstum bei pH 6,8	+
bei pH unter 6	+	Wachstum bei pH 5,7	+
bei pH über 7	–
Säureerzeugung D-Glucose	+	Wachstum in Kulturmedium mit Natriumchlorid bei
L-Arabinose	+	2 %	+
D-Xylose	+	5 %	+
D-Mannitol	+	7 %	+
Gaserzeugung aus Glucose	–	10 %	+
Hydrolyse Casein	+
Gelatine	+	Wachstumstemperatur 5°C	–
Stärke	+	10°C	–
Verwendung von Zitronensäure	+	30°C	+
Verwendung von Proprionsäure	–	40°C	+
Hydrolyse von Tyrosin	–	50°C	+
Eigelb-Reaktion	–	55°C	–

Basierend auf den oben genannten Gründen, wurde der Bakterienstamm zu „Bacillus subtilis" gehörig identifiziert und wurde „Bacillus subtilis M2-4 Stamm" genannt.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 ist ein Diagramm, das die Peptidbindungsstellen-Spezifitäten der Enzyme zeigt. 2 zeigt ein Chromatogramm des Beispiels. 3 zeigt einen Graphen der Wärmestabilität der Enzyme. 4 zeigt einen Graphen der Molekulargewichts verteilungen von hydrolysierten Produkten. 5 zeigt Graphen von Molekulargewichtsverteilungen von hydrolysierten Produkten.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die beste Ausführungsform der Erfindung wird jetzt unten zusammen mit Vergleichsbeispielen beschrieben. Die Erfindung ist nicht auf diese Ausführungsformen der Erfindung beschränkt.
[Beispiel 1: Herstellen von Enzymlösung und Analyse der Bestandteile]
Ein 1 % Glucose, 1 % Pepton, 0,3 % Gelatine, 0,1 % Hefeextrakt, 0,7 % Dikaliumphosphat, 0,1 % Monokaliumphosphat, 0,05 % Zitronensäure und 0,01 % Magnesiumphosphat umfassendes Kulturmedium wurde hergestellt. 100 ml des Kulturmediums wurden in einen 500 ml Sakaguchi-Kolben, zum Sterilisieren bei 120°C für 20 Minuten, gegeben. Nachfolgend wurde der Bacillus subtilis M2-4 Stamm in das Kulturmedium, zum Kultivieren mit einem Schüttelinkubator bei 30°C für 40 Stunden, eingeimpft. Nach dem Kultivieren mit dem Schüttelinkubator wurde das Kulturmedium in dem Kolben zum Entfernen der Bakterien zentrifugiert, so dass eine Rohenzymlösung hergestellt wurde.
Die Rohenzymlösung wurde einer Chromatographie mit einer „DEAE Sepharose CL6B"-Säule unterzogen. Wie in 2 gezeigt, wurden mehrere Peaks A bis H in den extrahierten, Protein aufweisenden Molekulargewichtsfraktionen beobachtet.
Die Fraktionen, die den einzelnen Peaks entsprachen, wurden einzeln erhalten und verschiedenen Enzymaktivitätstests unterzogen. Somit wurde bestätigt, dass die aus Peak B erhaltene Lösung Kollagenase enthielt. Es wurde bestätigt, dass die aus den Peaks C und D erhaltenen Lösungen alkalische Protease enthielten. Es wurde bestätigt, dass die aus den Peaks E und F erhaltenen Lösungen Aminopeptidase enthielten. Es wurde bestätigt, dass die aus den Peaks G und H erhaltenen Lösungen neutrale Protease enthielten. Die Aktivitäten der Enzyme wurden einzeln mittels den folgenden Verfahren untersucht.
Proteaseaktivität:
1 ml einer aus einer Peakfraktion erhaltenen Lösung wurde zu einem 1 ml 0,75 %iger Milchcaseinlösung (pH 7,0), für die Umsetzung bei 37°C für 60 Minuten, gegeben. Nachfolgend wurden zum Beenden der Enzymreaktion 2 ml 0,4 M Trichloressigsäurelösung zugegeben. Die Lösung wurde bei 37°C für 25 Minuten stehen gelassen und dann durch ein Filterpapier filtriert. 1 ml des Filtrats wurden zu 5 ml 0,4 M gesondert hergestellter Natriumcarbonatlösung gegeben, gefolgt von weiterer Zugabe von 1 ml Folin-Reagenz (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und die resultierende Mischungslösung wurde bei 37°C für 20 Minuten stehen gelassen. Die Absorption der Lösung wurde bei 660 nm gemessen. Bei der Blindprobe umfasste die Umsetzung Zugabe von 2 ml 0,4 M Trichloressigsäurelösung und nachfolgend Zugabe von 1 ml der Lösung, die aus der Fraktion entsprechend den Verfahren, erhalten wurde. Unter den Reaktionsbedingungen wurde die Aktivität eine Aminosäure zu erzeugen, die 0,1 mg Tyrosin in dem Filtrat entsprach, als eine Einheit bestimmt.
Kollagenaseaktivität:
0,1 ml einer aus einer Fraktion erhaltenen Lösung wurde zu 0,4 ml 2,5 %iger Kollagenlösung (ph 7,5) für die Umsetzung bei 30°C für 30 Minuten, gegeben. Nachfolgend wurden 0,5 ml 0,1 M Essigsäure zugegeben. Durch Zentrifugieren der Lösung wurde der Überstand erhalten. Zu 0,1 ml des Überstands wurden 0,9 ml Citratpuffer, pH 5, 0,1 ml Zinnchloridlösung und 2 ml Ninhydrinlösung, zum Erhitzen im kochenden Wasser für 20 Minuten, zugegeben. Nachfolgend wurde Wasser zu der resultierenden Mischung auf 10 ml zugegeben und die Absorption der resultierenden Mischung wurde bei 570 nm untersucht. Für die Blindprobe wurden dieselben Untersuchungsverfahren unter Verwenden der aus der Peakfraktion erhaltenen Lösung, die mit Erhitzen in kochendem Wasser für 5 Minuten behandelt wurde, durchgeführt. Unter den Reaktionsbedingungen wurde die Aktivität eine Aminosäure zu erzeugen, die einem μmol Tyrosin pro einer Minute entspricht, als eine Einheit bestimmt.
Aminopeptidaseaktivität:
0,1 M Trispuffer (pH 7,0) wurde zu 0,8 ml Leucin-p-nitroanilidlösung (0,072 %) gegeben, gefolgt von Zugabe von 0,2 ml einer aus jeder Peakfraktion erhaltenen Lösung, für die Umsetzung bei 37°C für 60 Minuten. Nachfolgend wurden 2 ml 0,7 %ige Salzsäure-/Ethanollösung zugegeben, gefolgt von Zugabe von 2 ml 0,06 %iger p-Dimethylamino Zimtaldehydlösung. 10 Minuten später wurde die Absorption bei 540 nm untersucht. Bei der Blindprobe wurden dieselben Untersuchungsverfahren unter Verwenden der aus der Peakfraktion erhaltenen Lösung, die mit Erhitzen in kochendem Wasser für 5 Minuten behandelt wurde, durchgeführt. Unter den Reaktionsbedingungen, wurde die Aktivität 1 μmol Leucin pro Minute zu erzeugen als eine Einheit bestimmt.
Unter den Lösungen, die aus den Fraktionen, die den einzelnen Peaks entsprachen erhalten wurden, wurden die aus den Peaks E und F erhaltenen Lösungen mit einer UF-Membran auf ein fraktionierendes Molekulargewicht von 3000 (Minitan Platte, hergestellt von Amicon Co., Ltd.), zum Bewerten der Wärmestabilität der Aminopeptidase, konzentriert. Wie in 3 gezeigt, betrug die Restaktivtät der Aminopeptidase nach einer einstündigen Wärmebehandlung bei Temperaturen von 40°C bis 65°C, bei pH 7, in jedem der Fälle nahezu 100 %.
[Beispiel 2: Herstellen einer konzentrierten Enzymlösung]
Der Bacillus subtilis M2-4 Stamm wurde gesondert in 20 Sakaguchi-Kolben eingeimpft, wobei jeder 100 ml eines Kulturmediums derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 1 enthielt. Unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 wurde der Stamm mit einem Schüttelinkubator kultiviert und zum Entfernen der Bakterien zentrifugiert, um dadurch eine Rohenzymlösung herzustellen. Nachfolgend wurden diese Enzymlösungen zusammengegeben (gesamt ungefähr 1900 ml). In der Rohenzymlösung betrug die Aktivität der neutralen Protease 11,0 E/ml; die Aktivität der alkalischen Protease 12,1 E/ml; die Kollagenaseaktivität 4,4 E/ml und die Aminopeptidaseaktivität 0,48 E/ml.
Dann wurden ungefähr 1900 ml der Rohenzymlösung mit einer Minitan-Membranplatte (fraktionierendes Molekulargewicht von 3000) hergestellt von Amicon Co., Ltd., zum Erhalt von ungefähr 90 ml der konzentrierten Enzymlösung, konzentriert. In der Rohenzymlösung betrug die Aktivität der neutralen Protease 166 E/ml; die Aktivität der alkalischen Protease 180 E/ml; die Kollagenaseaktivität 66,4 E/ml und die Aminopeptidaseaktivität 5,9 E/ml.
[Beispiel 3: Herstellen der Enzymaufbereitung]
20 Liter eines Kulturmediums mit derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 1 wurden in einen 30 Liter Glasfermenter gegeben. Dann wurde der Bacillus subtilis M2-4 Stamm für 40 Stunden unter Bedingungen von 30°C, einer Rotationszahl von 250 Upm und einem Belüftungsvolumen von 20 l/mn kultiviert.
Nach dem Kultivieren wurde die Kultur zum Entfernen der Bakterien und zum Erhalt von 18 Litern der resultierenden Lösung zentrifugiert, welche dann mit einer UF-Membran (fraktionierendes Molekulargewicht 13000) hergestellt von Asahi Chemical Industry Co., Ltd., auf 900 ml konzentriert wurde. Das Konzentrat wurde dann durch Sättigen auf 0,8 unter Verwendung von Ammoniumsulfat ausgesalzen. Das erzeugte Präzipitat wurde zum Erhalt einer Enzymaufbereitung, die 75 g des Rohenzympulvers umfasst, gefriergetrocknet.
Die Enzymaktivität der Enzymaufbereitung war wie folgt. Die Aktivität der neutralen Protease betrug 1992 E/ml; die Aktivität der alkalischen Protease 2200 E/ml; die Kollagenaseaktivität 790 E/ml und die Aminopeptidaseaktivität 71 E/ml.
[Beispiel 4: Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen zu kleineren Molekülen]
200 Einheiten (auf Proteaseaktivitätsbasis, pH 7, pro 1 g Säurecasein) der Enzymaufbereitung, die in Beispiel 3 hergestellt wurde, wurden zu 1 %iger Säure caseinlösung, pH 7, gegeben. Zum Vergleich wurden 200 Einheiten (auf Proteaseaktivitätsbasis, pH 7, pro 1 g Säurecasein) der neutralen Protease von Bacillus subtilis, nämlich „Protease N" (hergestellt von Amano Pharmaceutical Company, Ltd.) zu 1 %iger Säurecaseinlösung, pH 7, gegeben. Ferner wurden 200 Einheiten (auf Proteaseaktivitätsbasis, pH 7 pro 1 g Säurecasein) der alkalischen Protease von Bacillus subtilis, nämlich „Proleather" (hergestellt von Amano Pharmaceutical Company, Ltd.) zu 1 %iger Säurecaseinlösung, pH 7, gegeben. Die einzelnen Lösungen der zugegebenen Enzyme wurden einer Hydrolysierungsreaktion bei 45°C für 17 Stunden unterzogen, um die Molekulargewichtsverteilung der resultierenden Reaktionsprodukte zu untersuchen.
Die Untersuchung wurde mittels Gelfiltration, unter Verwenden eines von Amersham hergestellten FPLC Systems und einer von Amersham hergestellten „Superose 12" Analysesäule, durchgeführt. Als Standartsubstanzen für die Molekulargewichte wurden Serumalbumin (Molekulargewicht 67000), Chymotrypsinogen (Molekulargewicht 25000), Cytochrom C (Molekulargewicht 12300), Trypsin-Inhibitor (Molekulargewicht 6500) und Bacitracin (Molekulargewicht 1450) verwendet.
Die Untersuchungsergebnisse mit der Enzymaufbereitung der Beispiele werden in (a) in 4 gezeigt; die Untersuchungsergebnisse mit Proleather werden in (b) in 4 gezeigt; und die Untersuchungsergebnisse mit Protease N werden in (c) in 4 gezeigt.
Wie aus (b) und (c) in 4 ersichtlich wird, schließen die Peptide, die unter Verwenden von Proleather und Protease N erhalten wurden hauptsächlich größere Mengen an hochmolekularen Peptiden, mit Molekulargewichten über 1000 bis 10000, ein und schließen eine kleinere Menge von niedrigmolekularen Peptiden, mit Molekulargewichten von 1000 oder weniger, ein. Auf jeden Fall liegt das Mengenverhältnis X/Y der hochmolekularen Peptide (X) zu den niedrigmolekularen Peptiden (Y) bei ungefähr 4 oder höher.
Wie es in (a) in 4 angegeben wird, bestehen, im Gegensatz dazu, die unter Verwenden der Enzymaufbereitung aus dem Beispiel erhaltenen Peptide hauptsächlich aus niedrigmolekularen Peptiden, mit Molekulargewichten von 1000 oder weniger. Das Mengenverhältnis X/Y der hochmolekularen Peptide (X) zu den niedrigmolekularen Peptiden (Y) betrug 0,7 oder weniger, und das Ergebnis war von den Ergebnissen in (b) und (c) in 4 erheblich unterschiedlich.
Es wird behauptet, dass die niedrigmolekularen Peptide, mit Molekulargewichten von 1000 oder weniger, als medizinische enterische Formulierungen und Nahrungsergänzungsmittel für Nahrungsmaterialien aufgrund ihrer schnellen Absorption durch den Verdauungstrakt wirksam sind. Die Peptide, die unter Verwenden der Enzymaufbereitung des Beispiels erhalten wurden, erfüllen solche Zwecke.
[Beispiel 5: Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen in kleinere Moleküle im hohen Temperaturbereich]
200 Einheiten (auf Proteaseaktivitätsbasis, pH 7, pro 1 g Säurecasein) der in Beispiel 3 hergestellten Enzymaufbereitung wurden zu 1 %iger Säurecaseinlösung, pH 7, gegeben. Zum Vergleich wurden 200 Einheiten (auf Proteaseaktivitätsbasis, pH 7, pro 1 g Säurecasein) der neutralen Protease von Aspergillus oryzae, nämlich „Protease A" (hergestellt von Amano Pharmaceutical Company, Ltd.) zu 1 %iger Säurecaseinlösung, pH 7, gegeben. Die Enzymlösungen wurden gesondert einer Hydrolysierungsreaktion bei 45°C und bei 60°C für 17 Stunden unterzogen, um die Molekulargewichtsverteilung der resultierenden Reaktionsprodukte zu untersuchen. Das Untersuchungsverfahren ist dasselbe wie in Beispiel 4.
Die Untersuchungsergebnisse mit der Enzymaufbereitung aus dem Beispiel werden im Fall der Reaktion bei 45°C und 60°C entsprechend in (a) und (b) in 5 dargestellt. Die Untersuchungsergebnisse mit Protease A im Fall der Reaktion bei 45°C und 60°C werden entsprechend in (c) und (d) in 5 dargestellt.
Wie aus (c) in 5 offensichtlich wird, enthalten die Peptide, die unter Verwenden von Protease A im Fall von 45°C erhalten wurden, eher hochmolekulare Peptide wie in Beispiel 4. Wie es in (d) in 5 gezeigt wird, ist die Tendenz dennoch im Fall von 60°C unterschiedlicher, was eine schwache Verminderung der Aktivität der Protease A in einem so hohen Temperaturbereich nahe legt.
Wie in (a) und (b) in 5 gezeigt, ergaben, im Gegensatz dazu, die Peptide, die unter Verwenden der Enzymaufbereitung des Beispiels erhalten wurden, fast ähnliche Ergebnisse im Fall von 60°C wie die im Fall von 45°C. Mit anderen Worten stellen niedrigmolekulare Peptide, mit Molekulargewichten von 1000 oder weniger, den größten Anteil der resultierenden Peptide dar, wodurch bewiesen wird, dass die Enzymaufbereitung eine ausgezeichnete Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen in kleine Moleküle aufweist, ebenso wie eine hohe Wärmebeständigkeit.
Zum Herstellen von Peptiden unter Verwenden der Enzymaufbereitung des Beispiels in einem industriellen Maßstab ist eine Verfahrenssteuerung bei 55°C oder höher (zum Beispiel 60°C) möglich, während Verfahren bei 50°C oder weniger vermieden werden, wo mikrobielle Kontamination auf Grund der Vermehrung von kontaminierten Mikroorganismen auftreten können. Folglich können enorme industrielle Vorteile erreicht werden.
[Beispiel 6: Hydrolyse von schwer zu hydrolysierendem Protein]
100 g „Newfujipro R" hergestellt von Fuji Oil Co., Ltd. als kommerziell erhältliches Sojabohnenprotein-Isolat wurde in 1000 ml Wasser gelöst. Zu der Lösung wurden jeweils 1 g „Proleather" und „Protease A" für die Hydrolysierungsreaktion bei 50°C für 17 Stunden gegeben. Nachfolgenden wurde die resultierende Lösung zentrifugiert und das durch keine Reaktion mit den Proteasen auftretende Präzipitat wurde abgetrennt und getrocknet, wobei 25 g von wasserunlöslichen Stoffen, das heißt schwer hydrolysierbaren Stoffen, erhalten wurden.
Die Stoffe wurden einer Proteinuntersuchung mit den Kjeldahl-Verfahren unterzogen. Die Stoffe enthielten 20 Gew.-% Protein. 5 g der schwer zu hydrolysierenden getrockneten Stoffe wurden für die Hydrolysierungsreaktion bei 50°C für 17 Stunden in 100 ml Wasser suspendiert, gefolgt von Zugabe von 6 ml der Rohenzymlösung, die wie oben beschrieben in Beispiel 1 erhalten wurde.
Zum Vergleich wurde 0,1 g Proleather zu jeweils 100 ml der Suspensionen der schwer zu hydrolysierenden Stoffe gegeben, die auf dieselbe Weise wie oben beschrieben hergestellt wurden. Auf dieselbe Weise wurde 0,1 g Protease A zum Herstellen einer Mischungslösung zugegeben. Diese Lösungen wurden ebenso, unter denselben Bedingungen wie oben beschrieben, den Hydrolysierungsreaktionen unterzogen.
Nach Beenden der Umsetzungen der einzelnen Beispiele und nachfolgender Zentrifugation wurde das Protein in den Überständen mittels des Kjeldahl-Verfahrens, zum Berechnen der Solubilisierungsrate des schwer zu hydrolysierenden Proteins, untersucht.
Die Solubilisierungsrate des Beispiels mit Proleather betrug 5 %, während die Solubilisierungsrate des Beispiels mit Protease A 4 % betrug. Andererseits betrug die Solubilisierungsrate des Beispiels mit der Rohenzymlösung des Beispiels 70 %.
Die Rohenzymlösung kann daher verwendet werden, um schwer zu hydrolysierendes Protein zu hydrolysieren, für die Peptid- oder Aminosäureherstellung unter Verwenden von Proteinmaterialien, einschließlich solcher Proteine. Folglich kann deren Verwendung die Peptidausbeute verbessern und die Menge an Abfall vermindern.
[Beispiel 7: Peptidspaltungsstellen-Spezifität]
Die in Beispiel 3 hergestellte Enzymaufbereitung, sowie Proleather und Protease N zum Vergleich, wurden für die Hydrolysierungsreaktion entsprechend in gleichen Einheitsmengen zu 1 %iger Säurecaseinlösung, pH 7, gegeben. Nachfolgend wurde Hefe-Carboxypeptidase Y, zum Analysieren der freien Aminosäuren, zu der Reaktionslösung jedes Beispiels gegeben, um so auf die Carboxyltermini der gespalteten Peptide zu schließen.
Wie es mit Pfeilen in den entsprechenden Säulen in 1 dargestellt ist, spaltete Protease N die Carboxylseiten von drei Typen von Aminosäuren, nämlich Leucin, Phenylalanin und Threonin. Proleather spaltete die Carboxylseiten von sechs Typen von Aminosäuren, nämlich Leucin, Phenylalanin, Lysin, Alanin, Serin und Glutamin. Im Gegensatz dazu spaltete die Enzymaufbereitung des Beispiels, als „M2-4" bezeichnet, die Carboxylseiten von 12 Typen von Aminosäuren, nämlich Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Lysin, Valin, Alanin, Threonin, Glycin, Serin, Glutamin, Asparagin und Arginin. Mit anderen Worten wurde herausgefunden, dass in der Enzymaufbereitung des Beispiels eine Spaltungs-Spezifität in einem großen Bereich von Peptidstellen zur Geltung kam.
Es wird angenommen, dass die Spaltungs-Spezifität in dem sehr breiten Bereich von Peptidstellen mit der Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen in kleinere Moleküle und der Wirksamkeit der Hydrolyse von schwer zu hydrolysierenden Protein in Verbindung steht, wie sie durch die Enzymlösung und Enzymaufbereitung der Erfindung zur Geltung kamen.
[Beispiel 8: Herstellen von Aminosäurewürzmittel]
Die in Beispiel 3 hergestellt Aminosäureaufbereitung, sowie Proleather und Protease A zum Vergleich wurden gesondert zu 10 %iger Säurecaseinlösung, pH 7, gegeben, letztlich zu 200 Einheiten auf Proteaseaktivitätsbasis, pH 7, pro 1 g Säurecasein. Nach gesonderten Spaltungsreaktionen bei 55°C für 17 Stunden wurde der Überstand, der mittels Zentrifugation erhalten wurde ferner einer Aminosäureanalyse und einer sensorischen Geschmacksbewertung unterzogen.
Im Beispiel mit Proleather, betrug die Menge an im Überstand erzeugten freien Aminosäuren 15 %, und der Überstand war bitter mit wenig Umami (Köstlichkeit). Im Beispiel mit Protease A, betrug die Menge an im Überstand erzeugten freien Aminosäuren 36 % und der Überstand war leicht bitter mit wenig Umami (Köstlichkeit). Im Beispiel mit der Enzymaufbereitung des Beispiels, war die Menge an im Überstand erzeugten freien Aminosäuren auf 46 % angestiegen, und der Überstand war sehr Umami (köstlich).
[Bespiel 9: Herstellen von chinesischem Mantou (eine Art asiatischer Dampfbrötchen)]
10 g Zucker und 1 g Salz wurden zu 100 g von stark Gluten-haltigem Mehl und 100 g Mehl mit geringem Glutengehalt, gefolgt von Zugabe von 105 ml warmen Wasser bei 30°C, zum innigen Mischen, gegeben. Zu der Mischung wurden 2,0 ml der in Beispiel 1 hergestellten Rohenzymlösung und 4 g einer kommerziell erhältlichen Backhefe (hergestellt von Oriental Yeast Co., Ltd.) für die primäre Fermentation bei 30°C für 4 Stunden gegeben. Dann wurde die Mischung in 20 g Anteile geteilt, die dann für die zweite Fermentation bei 30°C für 4 Stunden geformt wurden. Nachfolgend wurde der resultierende Teig auf einem kochenden Heißwasserbad für 6 Minuten, zum Herstellen des chinesischen Mantou, gedünstet.
Zum Vergleich wurden 4 g der kommerziell erhältlichen Backhefe (hergestellt von Oriental Yeast Co., Ltd.) allein zu der Mischung, zum Herstellen des chinesischen Mantou mit demselben Verfahren, gegeben.
Die Volumina der in Übereinstimmung mit dem Beispiel und dem Vergleichsbeispiel hergestellten Stücke des chinesischen Mantou wurden gemessen. Es wurde herausgefunden, dass das Volumen des chinesischen Mantou mit Zugabe der Enzymlösung des Beispiels ungefähr 15 % größer war als das Volumen des chinesischen Mantou ohne jegliche Zugabe der Enzymlösung zum Vergleich.
[Beispiel 10: Brotherstellung]
100 g Mehl, 50 g Zucker, 20 g Salz, 40 g Fett und 30 g einer kommerziell erhältlichen Backhefe (hergestellt von Oriental Yeast Co., Ltd.) wurden zusammengemischt. Zu der resultierenden Mischung wurden 690 ml Wasser und 50 ml der in Beispiel 1 hergestellten Rohenzymlösung, zum Kneten bei 27 bis 29°C, zugegeben. Nach der 30 minütigen primären Fermentation wurde der resultierende Teig in 450 g Anteile für die zweite Fermentation für 30 Minuten geteilt. Jeder Teig wurde in eine Brotform zum Backen bei 230°C für 25 Minuten gelegt.
Zum Vergleich wurde die Mischung ohne jegliche Zugabe der Enzymlösung einer primären Fermentation unterzogen, einer sekundären Fermentation und Backen mittels derselben Verfahren wie oben beschrieben.
Die Volumina der hergestellten Brote des Beispiels des Vergleichsbeispiels wurden gemessen. Es wurde herausgefunden, dass das Volumen des Brots mit Zugabe der Enzymlösung wie in dem Beispiel mit ungefähr 10 % groß war, verglichen zu dem Volumen des Brots ohne jegliche Zugabe der Enzymlösung.
[Beispiel 11: Anwendung auf Hefeextrakt]
Wasser wurde auf einen Liter zu 100 g einer kommerziell erhältlichen trockenen Backhefe (hergestellt von Oriental Yeast Co., Ltd.) gegeben. Nachdem die resultierende Lösung mittels 2 M Salzsaure auf einen pH von 7 eingestellt wurde, wurde die Lösung bei 90°C für 30 Minuten erhitzt. Zu der resultierenden Lösung wurde 1 g des zelllytischen Enzyms „YL-15" (hergestellt von Amano Pharmaceutical Company, Ltd.) gegeben und die resultierende Mischung konnte unter Schütteln bei 50°C für 16 Stunden reagieren. Nachfolgend wurden die Hefepilze der Lyse unter Erhitzen bei 90°C für 20 Minuten, zum Erhalt der Extraktlösung, unterzogen. Nach der Zentrifugation der Extraktlösung und Gefriertrocknen des Überstands wurde ein Hefeextraktpulver von 70 g erhalten. Der Proteingehalt des Pulvers betrug 35 %.
7 g des erhaltenen Hefeextraktpulvers wurden in 100 ml Wasser gelöst. Die resultierende Lösung wurde mittels 2 M Salzsäure auf einen pH von 7, zum Herstellen einer Hefeextraktlösung eingestellt. Hefeextraktlösung wurde zum Untersuchen des Gehalts an mit der Enzymaufbereitung der Erfindung erzeugten freien Aminosäuren verwendet. Zum Vergleich wurde dieselbe Untersuchung unter Verwenden der Protease N „Amano", wie oben beschrieben, durchgeführt.
Insbesondere wurde eine gegebene Einheitsmenge der Enzymaufbereitung der Erfindung oder Protease N „Amano" zu der Extraktlösung, für die Umsetzung bei 50°C für 17 Stunden und Erwärmen bei 90°C für 20 Minuten, gegeben. Die resultierende enzymbehandelte Lösung wurde zum Berechnen der Erzeugungsrate an freien Aminosäuren einer Aminosäureanalyse unterzogen. Hierbei ist die Menge der zugegebenen Enzymaufbereitung auf einer Proteaseaktivitätsbasis von 1 g Hefeextraktpulver ausgedrückt.

Die Ergebnisse des Vergleichs zwischen der Enzymaufbereitung der Erfindung und der Enzymaufbereitung Protease N „Amano" werden in Tabelle 4 gezeigt. Aus Tabelle 4 wird ersichtlich, dass die mit der Enzymaufbereitung der Erfindung behandelte Gruppe eine hohe Erzeugungsrate an freien Aminosäuren aufwies, sehr Umami (Köstlichkeit) ohne jegliche Bitterkeit war und ausgezeichnete charakteristische Merkmale als Hefeextrakt aufwies. Tabelle 4

Zugegebene Enzymaktivität	Enzymaufbereitung der vorliegenden Erfindung		Protease N „Amano"
Zugegebene Enzymaktivität	Rate (%) an freien Aminosäuren	Geschmack	Rate (%) an freien Aminosäuren	Geschmack
100 Einheiten	60 %	Umami (köstlich) ohne Bitterkeit	20 %	Hohe Bitterkeit
200	68	Umami (köstlich) ohne Bitterkeit	28	Hohe Bitterkeit
300	70	Umami (köstlich) ohne Bitterkeit	30	Hohe Bitterkeit

Industrielle Anwendbarkeit
Wie oben beschrieben, sind die Enzymlösung und die Enzymaufbereitung der Erfindung, wie sie durch Kultivieren des Bacillus subtilis M2-4 Stamms erhalten wurden, ausgezeichnet in der Wärmebeständigkeit, der Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen in kleinere Moleküle und der Wirksamkeit beim Hydrolysieren von schwer zu hydrolysierendem Protein. Daher kann die Enzymlösung und die Enzymaufbereitung der Erfindung günstig für das Herstellen von Aminosäurewürzmittel, zur Brotherstellung, als Zartmacher für Fleisch, für die Hydrolyse von Sojabohnenprotein und dergleichen eingesetzt werden.

Claims

Enzymlösung, erhalten durch Kultivieren eines Bakteriums der Gattung Bacillus subtilis Stamm M2-4 (FERN BP-7155), das eine hohe hitzebeständige Peptidaseaktivität aufweist, derart, dass deren verbleibende Aktivität nach einer Stunde Wärmebehandlung bei 60°C bis 65°C bei pH 7 im Wesentlichen 100 % beträgt, wobei die Enzymlösung eine Pepidspaltungsstellen-Spezifität von Spaltungsstellen von wenigstens 10, bevorzugt 12, von in der Peptidkette eines Proteins gebundenen Aminosäure-Typen aufweist.
Enzymlösung nach Anspruch 1, wobei die Enzymlösung ferner sowohl Proteaseaktivität als auch Collagenaseaktivität aufweist.
Enzymlösung nach Anspruch 2, wobei die Proteaseaktivität eine neutrale Proteaseaktivität und/oder eine alkalische Proteaseaktivität ist.
Enzymlösung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Enzymlösung ferner eine solche Wirksamkeit beim Hydrolysieren von Proteinen zu kleineren Molekülen besitzt, dass eine 17 ständige Hydrolyse unter Verwenden der Enzymlösung von 200 Einheiten auf einer Proteaseaktivitätsbasis pro 1 g Säurekasein Peptide oder Aminosäuren mit Molekulargewichten von 1000 oder geringer in einer Menge von 50 Gewichtsprozent oder mehr, relativ zum Säurekasein, erzeugt.
Enzymlösung nach Anspruch 1, wobei die Enzymlösung in einer Hydrolysierungsreaktion füh 17 Stunden bei 50°C eine 50 %ige oder höhere Solubilisierungsrate von schwer zu hydrolysierendem Sojabohnenprotein zeigt.
Enzymlösung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Enzymlösung für die Hydrolyse von schwer zu hydrolysierendem Proteinen verwendet wird, für die Herstellung von Aminosäurewürzmittel, zur Brotherstellung, als Zartmacher für Fleisch, zur Peptidherstellung, zum Herstellen von Protein mit reduzierter Allergenität und für die Käseherstellung.
Verfahren zum Herstellen einer Enzymlösung, umfassend die Schritte des Kultivierens eines Bakteriums der Gattung Bacillus subtilis Stamm M2-4 (FERM BP-7155) und Erhalten einer Enzymlösung nach Anspruch 1 aus einer resultierenden Kultur, wobei die Enzymlösung als Kulturmedium oder durch Entfernen der Bakterien oder Feststoffe daraus oder durch weitere Konzentration derselben erhalten wird.
Enzymzubereitung, die proteolytische Enzyme umfasst, die durch Separation der proteolytischen Enzyme aus einer Enzymlösung mit proteolytischer Aktivität erhalten wird, die durch Kultivieren eines Bakteriums der Gattung Bacillus subtilis Stamm M2-4 (FERM BP-7155) erhalten wurde, wobei die Enzymlösung eine hohe hitzebeständige Peptidaseaktivität aufweist, derart, dass die verbleibende Aktivität derselben nach einer Stunde Wärmebehandlung bei 60°C bis 65°C bei pH 7 im Wesentlichen 100 % beträgt, wobei sie eine Pepidspaltungsstellen-Spezifität von Spaltungsstellen von wenigstens 10, bevorzugt 12, von in der Peptidkette eines Proteins gebundenen Aminosäure-Typen aufweist.
Enzymzubereitung nach Anspruch 8, wobei die Enzymzubereitung Aminopeptidase, neutrale Peptidase, alkalische Peptidase und Collagenase enthält.
Enzymzubereitung nach Anspruch 8, wobei die Enzymzubereitung für die Hydrolyse von schwer zu hydrolysierendem Protein verwendet wird, für die Herstellung von Aminosäurewürzmittel, zur Brotherstellung, als Zartmacher für Fleisch, zur Peptidherstellung, zum Herstellen von Protein mit reduzierter Allergenität und für die Käseherstellung.
Stamm, der eine proteolytische Enzymzubereitung nach Anspruch 6 herstellt, bei dem es sich um den Bacillus subtilis M2-4 Stamm handelt, der unter der Zugangsnummer FERM BP-7155 hinterlegt ist.