SU614113A1 - Способ выделени внутриклеточной аминопептидазы - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ АМИНОПЕПТИДАЗЫ ИЗ Bacl8 us sufati2ia

Изобретение относитс  к области энзимологии , а именно к выделению внутриклеточных ферментов, и может быть использовано в ферментной и микробиоле ической промышленности .

14звестен способ выделени  внутриклеточных ферментов, например аминопептидазы, включающий отделение клеток от культуральной жидкости, разрушение клеток, центрифугирование оставшейс  массы на высокоскоростной центрифуге, осаждение ферментов .суль-. фатом аммони , диализ и выделение ферментов методом адсорбции при рН 5,8-6.5 {.

Однако этот способ трудоемкий, поскольку затруднено центрифугирование, а диализ занимает около 60 ч, выход ферментов низкий.

Целью изобретени   вл етс  повышение выхода выдел емой внутриклеточной аминопептидазы .

Поставленна  цель достигаетс  тем, что в полученный после центрифугировани  экстракт добавл ют соль или смесь солей алкилтриметнламмони  с числом атомов углерода в av ифaтической цепи от 10 до 16 по 0,4-0,5 г на t г белка, экстракт подвергают повторному центрифугированию и в на осадочпую жидкость добавл ют На 1 г белка по 0.07-0,3 г неионного детергента с гидрофильно-липофильиым балансом 12- 7.

Предлагаемый способ выделени  внутриклеточной амииопептидазы из Bacillus subtilis заключаетс  в отделении клеток от культуральной жидкости, разрушении клеток, центрифугировании экстракта, в который добавл ют соль или смесь солей алкилтриметиламмони  с числом атомов углерода в алифатической 10 цепи от 10 до б по 0,4-0.5. г на 1 г белка, повторном центрифугировании экстракта, добавлении в надосадочную .жидкость на I г белка по 0,07-0,3 г неионного детергента с гидрофильно-липофильным балансом .12-17 и адсорбции целевого продукта при рН 5,8- 5 6,5.

В качестве со-пи алкилтриметиламмони  предпочтительно используют цетилтриметиламмоний бромистый.

Пример. Биомассу Bacillns subtilis отдел ют от внеклеточных примесей, взвесь промыты;х 0,04/Л NaCI клеток обрабатывают ультразвуком дл - разрушени  клеток. Полученные 7470. мл гомогената центрифугируют при 4000«g в течение 20 мин дл  удалени  крупных взвешенных частиц, при помощи 2М NaOH рН довод т до 6,5, охлаждают до 4°С и добавл ют при перемешивании 58 г цетилтри метиламмони  бромистого, предварительно раство: реиного в 200 мл теплой дистиллированной воды . Смесь перемешивают 10 мин, оставл ют на 30 мин при 4°С и центрифугируют при 4000х% в течение 30 мин. Полученную прозрачную надосадочную жидкость коричневиго цвета фильтруют. Получают 4950 мл фильтрата, со.держащего 118 г белка и 25800Е аминопептидазной активности (удельна  активность 0,22 Е/мг).

К фильтрату добавл ют 200 мл 5/о-ного раствора синтанола ДС-10. 5150 мл полученного раствора пропускают двум  порци ми по 2575 мл через две колонки диаметром 70 мм и высотой 210 мм, заполненных диэтиламиноэтилцеллюлозой , уравновешенной фосфатным буфером, рН которого 6,5 и ионна  сила 0,02 М, содержащим 0,03 М NaCI. После сорбции каждую колонку промывают 3 л фосфатного буфера , содержащего 0,05 М NaCI, а аминопептидазу элюируют фосфатнымбуфером, содержащим 0,2 М jsfaCI. Получают 1618 мл активного элюата, содержащего 3,1 г белка и I8I60E аышюпептидазной активности (удельна  активность 5,9 Е/мг. Выход по активности 70,4%. Вместо цет лтриметиламмони  бромистого можно нсйользовать соли или смеси солей алкилтриметН (Чаммони  с числом атомов углерода в алифатической цепи от 10 до 6, а вместо сннтанола ДС-10 ;- другие неионные детергенты с гидрофнльно-лнпофильаым балансом 12- 17.

Активность аминопепгидазы определ ют по расщеплению 0,5 мл раствора лейцил-2-нафтиламида при 37°С в 0,05 М цитратвероналовом буфере {рН 8,1), содержащем 0,0-45 М кобальта азотнокислого. Количество образующегос  2-нафтиламина опредс.м ют с помощью красител  Гранатового прочного ГБЦ. За еднпи1,у активности (Е) принимают количество фермента , расщепл ющего за I мин 1 мкмоль лейцил-2-нафтиламида . Концентрацию белка определ ют биуретовым методом.

По сравнению с известны.м способом выход увеличиваетс  на 30-40/о.

Claims (1)

1. N. Minamura, J. Matsumura, Т. Jamamoto , J. Fukurnoto, .« IntraceJlular Peptid se of Bacillus subtilis, J. Agr. Biol. Chem, № 533, 653, 1969.