DE2044866C3 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Peptidoglutaminase I und/oder II und ihre Verwendung in proteinhaltigen Getränken und Nahrungsmitteln - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Peptidoglutaminase 1 und/ oder Peptidoglutaminase II, die Glutamin in Peptiden zu desamidieren vermögen, sowie ihre Verwendung in proteinhaltigen Getränken und Nahrungsmitteln.

Glutaniinase ist ein Enzym, das Glutamin zu Glutaminsäure und Ammoniak /u hydrolysieren vermag. Es ist bekannt, daß die Glutaniinase aus tierischen und pflanzlichen Quellen und Mikroorganismen erhalten werden kann. Diese bekannten Enzyme wirken jedoch spezifisch nur auf freies Glutamin und sind nicht in der Lage, die y-Amidgruppe von peptidisch gebundenem Glutamin zu desamidieren.

Bei der Erzeugung \on Glutaminsäure unter Ver-Wendung von Glutaminase hat man deshalb bisher ein Verfahren angewendet, bei dem das Protein zuerst unter Verwendung von hydrolytischen Enzymen, wie Proteasen oder Peptidasen, abgebaut wird, um Glutamin freizusetzen. Das freigesetzte Glutamin läßt man dann mit Glutaniinase reagieren, um die v-Amidgruppe des freigesetzten Glulamins zu desamidieren, wobei man die gewünschte Glutaminsäure erhält.

Wenn jedoch nach dem vorgenannten Verfahren das Protein zuerst durch die Einwirkung von Proteasen 4'> oder Peptidasen hydrolysiert wird, wird ^fr-:,v;s oder an die Aniinoendgiuppe des Peplids gebundenes Glutamin erzeugt. Derartige Glutamine neigen zur Bildung von geschmacksfrner Pyroglutaminsäure, da sich die γ- und \-Siellungen des Glutaniins miteinander unter Ringschluf! verbinden können. Ist das zuletzt genannte Glutamin an die Aininoendgruppe J.'.·. Pcptids gebunden, so wird dieses Glutamin nicht desamidiert, so: ,ir wenn Glut.urunase gleichzeitig mit vorliegt, sondern es bildet sich daraus Pyroglutaminylpcptid. 5" Dieses Glutamin kann daher nicht in Glutaminsäure umgewandelt werden.

Demgemäß war es bisher bei der Erzeugung von (/c,,dnken und Nahrungsmitteln, wie Sojasoße, Paste aus Reis und Bohnen (vgl. II.-J. R c h in, '»Industrielle Mikrobiologie«, Springer-Verlag, 1967, S. 570) oder Käse, unter Verwendung von Prolein enthüllenden Substanzen als Ausgangsmaterial bekannt, proteolytische Enzyme, ν ^;s Proteasen oder reptidasen, auf das Ausgangsmaterial einwirken zu lassen, um dadurch Peptide oder Aminosäuren zu erhalten. Wenn, wie oben erwähnt, Proteine durch proteolylische linzyme abgebaut werden, um eine höhere Ausbeute • r· Glutaminsäure und den Glulaniyincptiden zu erhalten, wird Glutamin als freies Glutamin in Freiheit ⁶S gesetzt oder wird in Glutaminylpeptide überführt, in denen Glutamin an die Aminoeiulgruppe des Peplids gebunden ist. Derartige Gfuiuinine werden sehr leicht in saurer oder neutraler Lösung in Pyroglutaminsäure überführt, wobei sich die γ- und \-Stellungen schnell miteinander unter Ringschluß verbinden. Ein derartiges Peptidglutamin wird nicht desamidiert, auch nicht in Gegenwart einer üblichen Glutaminase. Insbesondere wird aminoendständig peptidgebundenes Glutamin in peptidgebundene Pyroglutaminsäure überführt, während sie in einem Pepiidglutamin-Zustand verbleibt, und wird geschmacksfrei, da die übliche Glutaminase nur mit freiem Glutamin reagiert.

Wenn ferner Glutamin einmal in Freiheit gesetzt ist, bildet sich sehr rasch Pyroglutaminsäure. Aus diesem Grunde werden vorzugsweise Glutaminylpeptide, so wie sie sind, desamidiert, wodurch sie in Glutamylpeptide überführt werden.

In der Literatur ist trans-Glutaminase als Enzym beschrieben, das mit peptidgebundenem Glutamin reagieren kann; vgl. H. Waelsch et al., Archiv. Biochem. Biophys., Bd. 84 (1959), S. 528, und J.E. Folk und P. W. Cole, J. Biol. Chem., Bd. 240 (1965), S. 295Ί. Dieses Enzym zeigt eine schwache Desamidierungsvsirkung auf die y-Amidgruppe der Glutaminylpeptide. In erster Linie jedoch ist dieses Enzym kein hydrolytisches Enzym wie Glutaminasc. sondern katalysiert die Substitution der y-Amidgruppe von Glutamin in Proteinen oder Peptiden durch primäre Amine. Mit bestimmten Peptiden, wie Glycylglutamin, Glutaminyl-glycin oder Glycylglutaminylglycin, reagiert dieses Enzym überhaupt nicht.

Aus diesem Grunde ist die trans-Glutaminase zur Erzeugung von Glutaminsäure aus Proteinen oder bei der Herstellung von nroteinhaltigen Getränken oder Nahrungsmitteln, bei denen der Gehalt an Glutaminsäure hinsichtlich ihrer Schmackhaftigkeit bedeutsam ist, ungeeignet. Darüber hinaus ist die Zugänglichkeit der trans-Glutaminase begrenzt, da sie aus Meerschwemchenleber gewonnen wird.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Enzym zur Verfugung zu stellen, das in Peptiden, ungeachtet der benachbarten Aminosäuren, die y-Amidgruppe des Glutamins zu desamidieren vermag. Ferner soll mit diesem Enzym eine höhere Ausbeute an Glutaminsäure aus den Proteine enthaltenden Ausgangsmatcrialien ohii«. H;ldung von Pyroglutaminsäure erhalten werden. Ferner soll das Rivvm die Menge der in proteinhaltigen Getränken und Nahrungsmitteln enthaltenen i.-Glutaminsäure oder Giutamylpeptide erhöhen, die durch Hydrolyse der proteinhaltigen Ausgangsmaterialien erzeugt werden und die die erhaltenen Peptide oder Aminosäuren als Teil ihrer geschmacksgebenden Bestandteile enthalten, wobei man die Getränke und Nahrungsmittel auch unmittelbar mit dem Enzym reagieren lassen kann.

Die Erfindung beruht auf dem Befund, daß ein neuer Stamm des Bacillus circulans, der aus einer Bodenprobe isoliert wurde, ein derartiges Enzym zu erzeugen vermag. Dieser Stamm ist bei der American Type Culture Collection, Roekville, Maryland, V.St.A., hinterlegt und unter tier Nummer ATCC 21590 registriert worden. Dieses Enzym reagiert unmittelbar mit peptidgebundenem Glutamin unter Desamidiei ung der y-Amidgruppe des Glutamins, ohne daß die Peptidbindung gespalten wird. Da dieses Enzym bisher noch nicht bekannt gewesen ist, wird es Peptidoglutaniinasc genannt und im folgenden kurz als »PGase« bezeichnet.

Es ist weiter gefunden worden, daß dieses Enzym aus zwei Arten besteht, die auch einzeln isoliert

3 4

werden können. Die eine Art des Enz>ms reagiert Verwertung von Ammoniumsalzen: kann wachsen

nämlich mit an die Carboxvlendgruppe de^ Peptids unter Verwendung \on Ammoniumsulfai und

gebundenem Glutamin, doch greift es im wesentlichen Ammoniumchlorid als Siickstofiquellen.

nicht an der Aminoendgruppe oder im inneren des „ ,· -, ,

Pcpiids gebundenes Glutamin an. Die andere An des : ^{lD) % eraenun}S *^{on Zuckern}

Lnzvms reagiert im wesentlichen nicht mit an der Glucose

Cnrboxylendgruppe des Peptid=, gebundenem Glut- Fructose

.,min, sondern nur mit Glutamin, das an der Amino- Galactose

endgruppe des Peptids oder innerhalb des Peptids Mannose

gebunden vorliegt. Das erstgenannte Enzv m wird : ο Xylose

i .ichstehend als Peptidoglutaminase 1 (PGase-li und Arabinose

oa> letztgenannte als Pept;doglutamina>e Il (PGase-lI) Saccharose

^zeichnet. Lactose

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren Trehalose

•ur biotechnischen Herstellung von Peptidoelut- 15 Raffinose — -

aminase 1 und/oder Peptidogluramhase II, das~da- Maltose

durch gekennzeichnet ist, daß man den Bacillus Mannit -

circular« ATCC 21590 unter aeroben Bedingungen in Glycerin -

einem üblichen Kulturmedium züchtet und die Dextrin - -■

Peptidoglutaminase I und oder Peptidoglutaminase 11 20 Stärke

aus den Zellen und oder aus der Kulturflüssigkeit Inulin -

isoliert. " Glvcogen

Die bakteriologischen Eigenschaften des Bacillus Rhamnose —

circulans ATCC 21590 sind auf der Grundlage der in Salicin

»Manual of Microbiological Methods« (Society of 25 Λ-Meihylglucosid -i -

American Bacteriologists. 1957) beschriebenen Me- Sorbit —

thoden untersucht und danach entsprechend »Bersey"s Bemerkungen:

Manual of Determinative Bacteriolocv... 7. Auflaee. ' ^mch' ^venbar. -- gu« verwertbar

iii<7 .1 X · , j , r f- ^w·, ..." — mäüie verwertbar. —:— sehr gut verwertbar 195/. klassifiziert worden. Auf Grund der L nter-

suchungsergebnisse, daß der Stamm gramnegatK ist, 30 Diese Stämme werden in einem flüssigen Medium Sporen bildet und bei 65 C kein Wachstum zeigt, gezüchtet. Das Kulturmedium kann verschiedene wurde er als zur Gattung Bacillis circulans gehörig Nährstoffquellen enthalten, die üblicherweise bei der eingestuft. Jedoch im Hinblick auf die Tatsache, daß Züchtung von Mikroorganismen verwendet werden, der Stamm ziemlich aerob ist, Kohlenstoffquellen zum Insbesondere verwendet man bei Bacillus circulans Wachstum benötigt und Peptidoglutaminase erzeugt. 35 ATCC 21590 Lactose, Stärke oder Saccharose als wird der Siamm als neuer, zur Gattung Bacillus bevorzugte Kohlenstoffquelien. Glucose ist nicht so circulans gehörender Stamm eingeordnet. bevorzugt. Als Stickstoffquelle kann man beliebige Die bakteriologischen Eigenschaften des Bacillus anorganische und organische Stickstoff enthaltende circulans ATCC 21590 sind nachstellend angegeben. Verbindungen, z. B. Ammoniumsalze, wie Ammo-..._.., . , 40 niumsulfat oder Ammoniumchlorid. Peptuii, Kasein-(A) Zuchtungseigenschaften aminosäuren, Hefeextrakte oder Sojabohnenmehl, ν erFleischbrühe: geringes Wachstum: wenden. Außerdem wurden zweckmäßig noch anor-Fleischbrühe-Agar: Wachstum bei 30"C in ganische Salze, wie Phosphate. Magnesiumsalze und 7 Tagen; oder geringe Mengen anderer Nährstoffe miuer-Lactose-Fleischbrühe-Agar: gutes Wachstum, 45 wendet.

kreisförmig, klebrige Konsistenz, kolonienbildend, Die Züchtungstemperatur liegt bei 25 bis 35"C, vordurchscheinendes Aussehen, farblos: zugsweise um etwa 30°C. Das Optimum des pH-Wer(es Gelatinestich: kein Wachstum; der Züchtung liegt bei etwa 7,0. Die Züchtung wird Pepton-Was^er: geringes Wachstum; nach üblicher. Methoden unter aeroben Bedingungen Lackmusmilch: kein Wachstum. 5° durchgeführt. Besonders bevorzugt ist eine belüftete ,_,. . . . , · . r-· , r Kultur. Wirtschaftlich bevorzugt ist die Anwendung (B) Morpholog.sche Eigenschaften _{ejnes mi( einer} p_e|_üflungs. _und Rührvorrichtung jus-

Form: Stäbchen der Größe 0,4 bis 0,6 · 2,2 bis 4 μ; gerüsteten Fernicntationsgefaßes. Nach 8 bis 20 Stun-Geißeln: umfänglich, mobil; den ist die Züchtung gewöhnlich beendet, doch kaiiii Sporenbildung: positiv. 55 man sie erforderlichenfalls zusätzlich etwa weitere „.„..... 8 Stunden fortsetzen, um den Zellen des Stamms eine (C) Physiologische Eigenschaften SelbsUerdauung zu ermöglichen, wobei das ange-Gramfärbung: negativ; reicherte En/ym aus den Zellen austritt.
Methylrot-Reaktion: negativ; Nach Beendeter Züchtung kann die IVptii'oglut-Indolbildung: negativ; 60 aminase 1 und/oder Peptidoglutaminase Il nach üh-Schwefelwasserstoff: geringe Bildung; liehen Linzymgewinnungsverfahren aus der Kultur-Ammoniak: geringe Bildung; flüssigkeit isoliert werden. Da jedoch die lin/>me in Nitratreduktion: negativ; erster Linie intrazellular vorliegen, wird vorzugsweise Katalase: positiv; das nachstehend beschriebene Verfahren angewendet. Gelatineverflüssigung: negativ: 65 Die Fii/snie werden durch Suspendieren der uesam-Stärkchydrolyse: positiv; Hielten Zellen in einer Pufferlösung, z. B. in einer Milchkoagulierung: negativ; Phosphat-Pufferlösung, und Zerkleinern der Zellen Lackmusmilch-Rcduktion: negativ; mittels einer Mahlvorrichtung, z. B. einem Ultra-

schall-Zerkleinerer, einem Hochdruck-Homogenisator oder einer anderen geeigneten Vorrichtung oder durch Auflösen der Zellen unter Verwendung eines bakteriolytischen Enzyms, wie Lysozym, extrahiert. Man kann die Zellen auch in Gegenwart eines Lösungsmittels, wie Toluol, schütteln, oder eine geeignete Zeitdauer stehen lassen, damit sie sich selbt verdauen und die Enzyme aus den Zellen austreten können. Die erhaltene Lösung wird von den Feststoffen filtriert oder zentrifugiert. Man erhält eine rohe Lösung der Enzyme.

Wenn man die gesamte Kullurbrühe als Enzymprodukt ohne Abtrennung der Zellen, wie vorstehend angegeben, verwendet, wird die Züchiungvorzug^vvrse nochmals etwa 8 Stunden unter Belüftung und Rühren oder stationär fortgesetzt, um die Zellen sich selbst verdauen zu lassen und um die Enzyme aus den Zellen sowcii wie möglich auszuscheiden. Die derart erhaltene rohe Lösung der Enzyme kann als solche oder nach dem Lyophilisieren oder einer Acetonbehandlung als rohes Enzympulver verwendet werden.

Die rohe Lösung der Enzyme wild gegebenem alls mit Streptomycin versetzt, um Nucleinsäuren auszutälien und /u entfernen. Danach werden die Evyine durch Zugabe von Ammoniumsulfat, Alkohol oder Aceton fraktioniert. Die fraktionierten Niederschläge werden gesammelt, gegen Wasser dialysiert und unter vti-nindLTicm Druck Kophilisiert. Auf diese Weise wird ein Standardprodukt des mit Ammoniumsulfat fraktionierten Rohenzyms erhalten.

Das Siandardprodukt des Rohenzyms kann nach den verschiedensten üblichen Verfahren weiter gereinipt werden, um ein hoch gereinigtes Standard-Enzympräparat zu erhalten. Beispiele derartiger Reinigungsverfahren sind die Gelfiltration, l. B. mittels modifizierten Dextrans, dessen Polysaccharidketten dreidimensional verknüpft sind (Wasseraufnahme 2OmIg). ein ,Absorptions- und Elutionsverfahren unter Verwendung von Ionenaustauschern, *ie modifiziertes, dreidimensional vernetzte* Dextran mit Diäth\ laminoäthylgruppen, Triäthylaminoäthykellulose Hydroxylapatit oder eine Elektrophorese unter Verwendung von z. B. Polyacrylamid.

Die Reinigung der durch Züchten von Bacillus circulans ATCC 21590 erhaltenen PGase wird nachstehend an Hand eines Beispiels näher erläutert.

Die rohe Lösung der Enzyme, das die PGase-I und PGase Il enthält, wird mit Ammoniumsulfat, Alkohol oder Aceton fraktioniert. Es wird ein mit Ammoniumsulfat fraktioniertes Enzymgemisch der PGase-1 und PGase-Il erhalten. Dieses Enzymgemisch wird in einer Pufferlösung gelöst, die durch Vermischen einer 0,01molaren Phosphat-Pufferlösung (pH 7,6), 0,1 Mol Kaliumchlorid und 0,002 Mol Äthylendiamintetraacetat hergestellt worden ist. Die erhaltene Lösung des Enzyms wird auf eine Säule gegeben, die zuvor mit in der gleichen Pufferlösung aufgeschlämmten, modifiziertem, dreidimensional vernetzten! Dextran (Wasseraufnahme 20 ml/g) beschickt ist. Dann wird die gleiche Pufferlösung zur Gelfiltration verwendet. Die riaklionen Nr. 5υ bis 70 (jeweils 10 ml) werden gesammelt, wobei ein teilweise gereinigtes Enzymgemisch von PGase-1 und PGase-11 erhalten wird.

Anschließend wird das teilweise gereinigte Enzymgeniisch an einer Säule mit modifiziertem, dreidimensional versetztem Dextran mit Diäthylaminogruppen chromatographiert. Die Säule wurde zuvor mit einer Pufferlösung beschickt, die durch Mischen von 0.01 molarer Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0), 0,1 Mol Kaliumchlorid und 0,002 Mol Älhylendiamintctraacetat hergestellt worden war. Die PGasc-1 und die PGise-II werden am Ionenaustauscher adsorbiert und mit der vorgenannten Pufferlösung mit ansteigender Kaliumchloridkonzentration eluiert. Die PGase-I wird bei einer K.iliumchlorid-Konzen'rntion von 0,17 bis 0,21 Mol und die Pdase-Il bei einer Kaliumchlurid-Konzentration von 0,22 bis 0,27 Mo! eluiert. Die wirksamen Fraktionen der beiden erhaltenen Fluate werden getrennt aufgefangen. Man erhält Lösungen der teilweise gereinigten Enzyme PGase-I und PGase-Il. Anschließend werden die Lösungen der Enzyme an einer mit Hydroxylapatit gefüllten Säule chromatographiert. Die Lösung des teilweise gereinigten Enzyms PGase-1 wird mit O.Olmolarer KaliumhydrogenphosphatlösuiiL' auf den pH-Wert 7,0 eingestellt und dann auf die Säule gegeben, die zuvor mit 0,01 molarer Phosphailösung gepuffert worden war. Die PGase-1 wird adsorbiert und mit der gleichen Pufferlösung in linear ansteigender Konzentration eluiert, mit der die Säule behandelt worden war. Die wirksamen Fraktionen des PGase-1-Eluats werden aufgefangen. Man erhält ein gereinigtes Enzym PGase-1. Die Lösung des teilweise gereinigter Enzyms PGase-Il wird in gleicher Weise gereinigt.

Die Verfahrensstufe der Extraktion, Abtrennung und Reinigung der PGase-I und PGase-Il sind in de: nachstehenden Tabelle zusammen mit den ent sprechenden Ergebnissen zusammengefaßt.

PGase-I

Enthaltene

Enzymmenge

Einheiten

Spezifische

Aktivität*)

Einheiten/

mg Protein*)

Ausbeute

0/
/0

1. Rohe Enzymlösung

2. Ammoniumsulfat-Fraktion (der bei einer Sättigung von 0,38 bis 0,54 gebildete Niederschlag)

3. Gelfiltration an modifiziertem, dreidimensional vernetztem Dextran (Wasseraufnahme 20 mi/g) (hochgereinigte Fraktion)

4. Chromatographie an modifiziertem, dreidimensional vernetztem Dextran mit Diäthylamtnoäthylgruppen (hoch gereinigte Fraktion)

5,;. Chromatographie an Hydroxylapatit {hoch gereinigte Frak-Hbn) ..·..,

- ·') Aklivhätsbcslimmung mit CarboBcnzoxy-glutamin als Substrat.

935
954

540

309
129

0,14
1.00

16,3
64,5

100
102

57

33
13

PCiM-

1. Rohe Enzymlösung 1203

2. Ammoniunisulfat-FrakUon (der bei einer Sättigung von 0.38

bis 0,54 gebildete Niederschlag) 858

3. Gelfiltration an modifiziertem, dreidimensional vernet/i.em Dextran (Wasseraufnahme 20 ml/g) (hoch gereinigte Fraktion) 784

4. Chromatographie an modifiziertem, dreidimensional vcrnctztem Dextran mit Diäthylaminoäth., !gruppen (hoch gereinigte Fraktion) 638

5. Chromatographie an Hydroxylapatit (hoch gereinigte l-'rak- |

tion) ' j 256

*) Akti\itätshcstimmung mit Ciirbobenzoxy-gluUiminyl-prolin ;ils Substrat.

Enthaltene

Enzymmenge

Einheiten

Spezifische

Aktivität

Einheiten/

mg Protein*)

0,18
0,9

33,6
73.2

Ausbeute

0/

/o

100
96

65

53
21

Die Aktivitälsbcstimmimg wird folgendermaßen durchgeführt: Das Substrat wird in einer Konzentration von lOmMol in einer 40molarcn Phosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 7.5 gelöst. Dann fügt man cmc entsprechend verdünnte PGase-Lösung oder eine Suspension von Zellen des Bacillus circtilans ATCC 21590 bis /Mm Gesamtvolumen von 1.0 ml hinzu. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 30'''C inkubiert. Durch Zugabe von 0.1 ml 50°/_oiger Trichloressigsäurclösung wird die Reaktion beendet und das freigesetzte Ammoniak in üblicher Weise wie folgt bestimmt.

0.5 ml des Reaktionsgemisches werden mittels 1 n-NaOH auf den pH-Wert 6,5 ei· -stellt und in ein kleines Glasgefäß gegeben. Nach dem Verfahren von C c d r u η g ο r ο et al., Enzymolegia. Bd. 29 (1965), S. 3 bis 5. wird in das Ghsgeiäß 1 n,i "orat-Pufferlösung vom pll-Werl !".8 gegeben. Das freigesetzte Ammoniak wird in 5 n-Sv-iivvefcUäure absorbiert und das Gemisch mit Nesslers Reagenz versetzt. Die Absorption der entstandenen Farbe wird bei 420 m:x gemessen. Eine Enzymeinheit ist die Menge, die 1 μ.Μο! Ammoniak/Minute unter den vorstehend genannten Reaktionsbedingungen erzeugt. Die spezifische Aktivität wird durch die Anzahl Enzymeinhciten pro Milligramm Protein ausgedrückt In diesem Falle wird die Menge des Proteins nach der Biurcl-Mcthode oder nach der Extinktion im I Mtra- \ iolcU-Absorptionsspektrum (»Methods in Enzymology". Bd. Ill, S. 450 und 451. 1957) bestimmt.

Die in der 5. Reinigungsstufe erhaltenen Enzymfraktionen werden gegen eine Puiicrlösung dialysiert. Das llctcntal wird ivophilisiert und getrocknet, wobei die gereinigte PCase-I und PGasc-l! in Form weißer Pulver erhalten werden. Weiterhin werden diese PGasc-I und PGasc-l 1 an einer Säule mit modifiziertem, dreidimensional vernetzten! Dextran (Wasseraufnahme 10 ml/g) Chromatographien. Beide zeigen ein einziges Maximum.
Die Eigenschaften der PGase-I und der PGase-II, die als neue Enzyme nach dem erlindungsgemäßen Verfahren erhalten worden sind, werden nachstehend erläutert.

Verbindung	Γ A	)ünnschicht-CI Lösungsm (RrW B	romatographic ttelsystem crt) 1J C	η	Elektrophorese -) (Abstand vom Ausgangspunkt der Elektrophorese in cm)
Erhalten durch Reaktion der PGase-I auf CBz-i-GIn . .	0.96 0.83	0,91 0,81	0.44 0.26	0,19 0.08	12,8 9 2
CBz-L-GIn	0,96	0,91	0,44	0,19	12 8
CBz-L-GIuS)	0.80 0,66 0,80	0,85 0,72 0,85	0,13 0.04 0,13	0,03 0.01 0,03	12,6 8,8 12,7
Erhalten durch Reaktion der PGase-I 1 auf CBz-L-GIn-GIy
CBz-L-Gln-Gly
CBz-L-GIu-GIy 4)

Anmerkungen: ') Lösungsmittelsystem:

A: n-Butanol: Essigsäure: Wasser — 4:1:1. B: n-Butanol: Essigsäure: 5%iges wäßriges Ammoniak — 5,5: 3 : 1,5. C: Äthylacetat: Benzol: Essigsäure ■- 50: 50:2.

D: Chloroform: Methanol: Essigsäure — 95 : 5 : 3. -) Elektrophorese:

Pufferlösung: Pyridin: Essigsäure: Wasser ■-= 25:1: 225; 2000V; 70 Minuten. *) CBz-L-GIu: Carbobenzoxy-L-glutaminsäurc. ·) CBz-L-GIu-GIy: Carbobenzoxy-L-glutamyl-glycin.

ίο

(I) Aktivität

Die erfindungsgemäß hergestellten Enzyme können Glutaminylpeptide zu Glutamylpeptiden desamidieren. Von diesen Enzymen kann die PGase-I Glutamin desamidieren, das an die Carboxylendgruppe der Peptide gebunden ist, ohne die Peptidbindung zu spalten. Die PGase-I I andererseits reagiert mir mit der r-Amidgruppe des Glutamins, das an eitu· Amiiioendgruppe des Peptids oder innerhalb der l'eptidkctte gebunden vorliegen kann. Die Aktivitäten der Enzyme werden an Hand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Im Falle der PGase-I wird Carboben/oxyi.-glutamin (im folgenden kurz als »CBz-i.-Ciln« bezeichnet) als Substrat verwendet, während im Falle der PGase-II Carbobenzoxy-i.-glutaminyl-glycin (im folgenden kurz als »CBz-i.-Gln-Gly« bezeichnet) als Substrat dient. Die entsprechenden Aktivitäten werden, wie in der vorstehenden Tabelle gezeigt ist, dadurch bestätigt, daß man die Substrate nach der Umsetzung mit den Enzymen der Dünnschicht-Chromatographie und Papier-Elektrophorese unterwirft.

Die vorstehenden Ergebt isse zeigen, daß CBz-i.-Glu und CBz-i-Glu-Gly erzeugt werden. Da freies Glutamin, freie Glutaminsäure und freies Glycin nicht festgesHIt werden konnten, zeigt dies an. daß sowohl PGase-I als auch PGase-II Glutaminylpeptide zu Glutamylpeptiden desamidieren können.

(II) Substratspezifität

In der nachstehenden Tabelle stellen die Zahlenwerte mMol freigesetztes Ammoniak pro Milligramm En7vm in 1 Minute dar.

	l'Gase-1	PGase-II
Substrat	NH1	NH3
	m Mol/min	m Mol/min
5 Carbobenzoxy-i.-glutamin	62,2	1.7
Glycyl-i.-glutamin	61,2	0.4
i.-Tyrosyl-i.-glutamin	61,0	0,6
N-Acetyl-i.-glutamin	53,8	0,7
ίο Phthaloyl-ni.-glutamin . . .	27,0	0,4
i.-Prolyl-L-glutamin	44,1	0,1
i.-Leucyl-glycyl-i.-glutamin	48,5	0,1
Carbobenzoxy-i.-glut-
aminyl-i.-prolin	0	73,0
15 Carboben/.oxy-i.-glut-
aminyl-glycin	0	52,4
tcrt.-Amyloxycarbonyl-
i.-glutaminyl-i.-prolin	0	39,2
i.-Plienylalanyl-i.-glut-
2o aminyl-glvcin	0	33.S
Pyroglutaminyl-r.-glut-
aminyl-i.-alanin	0	26,2
i.-Glutaminyl-glycin	0,98	27,8
i.-Glutamin .	4,8	1,5
25 i.-Asparagin	0	0
Carbobenzoxy-r.-asparagin	0	0
Glycyl-i.-asparagin	0	0
i.-Leucinamid	0	0
Glycyl-i.-phenyl-alanin-
30 amid	0	0

	pii-Oplimuin	PGase-I	7,0 bis 8,0	PGase-II	6.5 bis 8,0	I 5,0 nach
(MI)	Stabilität im pH-Bereich	6,0 bis 11,4	6,0 bis 11,4
(IV)		(16 Stunden bei 4"C)	(16 Stunden bei 40C)	bei
	Temperaturoptimum	10 bis 45°C	10 bis 4O0C	bei 37°C
(V)	lnaktivierungsbedingungen	vollständig inaktiviert bei pH 2,5	desgl.	bei
(Vl)		nach 16 Stunden bei 41T		bei 500C
		30%ige Inaktivierung bei pH 5,0	5%ige Inaktivierung bei pri	pH 7,6
		nach 16 Stunden bei 4°C	16 Stunden bei 40C	C
		vollständige Inaktivierung bei	vollständige Inaktivierung
		pH 10,8 nach 2 Stunden bei 370C	pH 10,0 nach 2 Stunden
		vollständige Inaktivierung bei	vollständige Inaktivierung
		pH 7,6 nach 10 Minuten bei 55°C	pH 7,6 nach 10 Minuten
		50°/(,igc Inaktivierung bei pH 7,6	40°/0ige Inaktivierung bei
		nach 10 Minuten bei 50' C	nach 10 Minuten bei 45C
	Inhibierung	30- bis 6O°/oige Inaktivierung in Ge	desgl.
(VII)		genwart von Hg- oder Cu-Ionen
		mit20%igerNaCl-LösungbeipH 7,5
		50"/o'ge Inhibierung
	Aktivierung	geringe Aktivierung durch	desgl.
(VIII)		Glutathion
	Stabilität	keine wesentliche Inaktivierung	desgl.
(IX)		durch Lyophilisieren und Lage
		rung bei —20"1C
	M olek ulargewicht	80 000 bis 90 000	130 000 bis 140 000
(X)	bestimmt nach Andrews
	Biochem. J., Bd. 91 (1964),
	S. 222, unter Verwendung
	von modifiziertem, drei
	dimensional vernetztem
	Dextran (Wasseraufnahme
	10 ml/g)

H 12

Bisher sind zahlreiche Enzyme bekanntgeworden, das Produkt in üblicher W»;ise zum Endprodukt ver-

die die y-Amidgruppe des Glutamins hydrolysieren arbeitet.

können. Diese Enzyme werden aus den verschieden- Durch Zugabe der erlindungsgemäß hergestellten

sten tierischen und pflanzlichen Quellen gewonnen. Enzyme in der vorgenannten Weise bildet sich Glut-

/u diesen Enzymen gehört z. B. Glutaminase (»The 5 aminsäure vom Peptidtyp, wodurch das Endprodukt

Lnzymes«, Bd. 4 (1960), S. 285) und trans-Glut- eine bessere Schmackhaftigkeit im Vergleich zu jenen

aminase (J. Biol. Chem.. Bd. 240 (1965), S. 2951). Die Produkten erfährt, die nach üblichen Verfahren

erlindungsgemäß hergestellten Enzyme sind jedoch, erhalten werden, und es ist nicht erforderlich, eine

wie vorstehend gezeigt worden ist, von diesen be- weitergehende Hydrolyse zur Bildung von Amino-

kannten Enzymen hinsichtlich ihrer Substratspezifität ι ο säuren wie im Faüe der Protease durchzuführen.

völlig verschieden. Glutaminase kann keine y-Amid- Die erfindungsgemäß hergestellten Enzyme reagie-

gruppe eines an Peptide gebundenen Glutamins des- ren mit Glutaminyineptiden, die mit Hilfe von Pro-

amidieren. tease aus Proteinen erzeugt werden, unter Bildung von

Die trans-Glutarriinase besitz! zwar eine geringe Glutamylpeptiden, die in Gegenwart von Peptidase Desamidierungswirkung von peptidgebundenem Glut- 15 weiter zu freier Glutaminsäure hydrolysiert werden, amin, doch hat dieses Enzym die spezielle Eigenschaft, Bei der Herstellung von Getränken und Nahrungsein primäres Amin mit der Amidgruppe des Glut- mitteln unter Verwendung eines Proteine mit hohem amins innerhalb des Peptids oder Proteins aus- Molekulargewicht enthaltenden Ausgangsmaterials ist zutauschen. Außerdem ist seine Hydrolyseaktivi'ät die Anwesenheit von Proteinase unerläßlich, um dersehr schwach. Im Gegensatz hierzu besitzen die 20 artige Glutamylpeptide oder freie Glutaminsäure erlindungsgemäß hergestellte PGase-I und die PGase-lI durch die Einwirkung der erfindungsgemäß herkeinerlei Austauschaktivität für ein primäres Amin, gestellten Enzyme zu bilden. Im Falle der Behandlung soiidern zeigen Hydrolyseaktivität und sind in diesen von Getränken und Nahrungsmitteln mit den PGasen vorstehend genannten Punkten offensichtlich von können diese ihre Fähigkeit ausreichend und wirksam trans-Glutaminase verschieden. as zeigen, wenn eine solche Menge Proteinase oder

Trans-Glutaminase reagiert nicht mit den y-Amid- Peptidase, wie sie üblicherweise bei der Erzeugung

gruppen eines peptidgebundenen Glutamins, wie solcher Getränke und Nahrungsmittel verwendet wird,

Glycyl-glutamin, Glutaminylglycin oder Glycyl-glut- vorliegt.

aminyl-glycin. Andererseits reagieren die erfindungs- Um die erfindungsgemäß hergestellten Enzyme wirkgemäß hergestellten Enzyme mit diesen Peptiden mit 3o sam reagieren zu lassen, kann erforderlichenfalls die C-endständig gebundenem Glutamin, N-endständig Zugabe von Peptidase oder Proteinase bsi der Hergebundenem Glutamin und solchem Glutamin im stellung von Getränken und Nahrungsmitteln zweckinneren der Peptidkette sehr stark. Darüber hinaus mißig sein.

benötigt trans-Glutaminase unbedingt Calciumionen Im allgemeinen beträgt die Menge der zuzufügenden

zu seiner Aktivität, während die erfindungsgemäß 35 Enzyme mindestens 0,01 Einheiten je Milliliter oder

hergestellten Enzyme nicht diese Eigenschaft auf- Gramm Ausgangsmaterial,

weisen. Die erfindungsgemäß hergestellten Enzyme können

Weiterhin ist Gegenstand vorliegender Erfindung zur Behandlung beliebiger proteinhaltiger Getränke

die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten und Nahrungsmittel verwendet werden, deren Schmack-

Enzyme in proteinhaltigen Getränken und Nahrungs- 40 haftigkeit auf ihrem Gshalt an Aminosäuren beruht,

mitteln. so daß der Geschmack derartiger Getränke und Nah-

Die zuzusetzende Menge des Enzyms, die zur rungsmittel verbessert wird. Beispiele derartiger GeDurchführung der Enzymreaktion erforderliche Zeit tränke und Nahrungsmittel mit Aminosäuren als und andere Bedingungen hängen von der Art der geschmacksgebende Substanzen sind Würzen, wie proteinhaltigen Produkte ab. Bei der Herstellung von 45 Sojasoße, Essig, Getränke, wie Alkohole, Paste aus Würzen, wie Sojasoße, die als Hauptbestandteil Reis und Bohnen und Käse, die als geschmacks-Aminosäuren, insbesondere Glutaminsäure, enthält gebende Stoffe Aminosäuren zusammen mit Peptiden und bei der ein Proteine enthaltendes Ausgangs- enthalten.

material in an sich bekannter Weise behandelt und In den Zeichnungen gibt F i g. 1 ein Elutionsdas Protein abgebaut wird, werden die erfindungs- 5<> diagramm von PGase-I und PGase-II nach Gelgemäß hergestellten Enzyme unter Rühren dem Aus- titration an modifiziertem, dreidimensional vernetztem gangsmaterial unmittelbar vor oder während der Fer- Dextran mit Diäthylaminoäthylgruppen wieder, wobei mentation und Reifung zugegeben, so daß die Menge ein Kaliumchloridgradient mit steigender Konzender Enzyme, entweder in Form der enzymhaltigen tration als Elutionsmittel verwendet wird. F i g. 2 Zellen eines flüssigen rohen Enzymextraktes oder 55 zeigt die Elutionskurve eines gareinigten Frvymeines gereinigten Enzympräparats, 0,01 bis 100 Ein- präparats von PGase-I und F i g. 3 zeigt die EIu- heiten je Milliliter der Gärmaische betragen kann. tionskurve eines gereinigten Enzympräparats der Anschließend können übliche bei der Herstellung von PGase-II bei Verwendung von modifiziertem, drei-Getränken und Nahrungsmitteln angewendete Ver- dimensional vernetztem Dextran (Wasseraufnahme fahren durchgefühlt werden. 60 10 ml/g).

Bei der Behandlung von festen proteinhaltigen Nah- Die Beispiele erläutern die Erfindung.
rungsmitteln, wie Paste aus Reis und Bohnen oder

Käse, können die erfindungsgemäß hergestellten Beispiel 1

Enzyme in einer der genannten Formen unter gründ- Es wird ein Kulturmedium hergestellt, das 75 g

lichem Vermischen in einer Menge von etwa 0,01 bis 65 Lactose, 150 g Pepton, 45 g Hefeextrakt, 3,4 g Magne-

etwa 100 Einheiten je Gramm festes Ausgangs- siumsuifat, 150 mg Eisen(II)-sulfat, 4,1g Kalium-

material unmittelbar vor oder während der üblichen hydrogenphosphat, 25 g Dina'riumhydrogenphosphat,

Reifungsstufe zugeführt werden. Anschließend wird 10 ml Siliconöl und 151 destilliertes Wasser enthält.

13 14

Es wird auf den pH-Wert 7,2 eingestellt. Das Kultur- worden war. Dann wird mit der gleichen Pufferlösung medium wird dann in ein 301 lassendes Fermen- eluiert. Aus dem Eluat (j^eweils lU-nü-hraktionen) tationsgefäß gefüllt und 15 Minuten bei 120^GC stcri- werden die 50. bis 70. rrakuon gesammelt und hierbei lisiert. Uetrennt hiervon werden in einem 3 1 fassenden die PUase-1 und PCJase-11 erhalten. In diesem halle Erlenmayerkolberi 750 ml eines Mediums der gleichen ₅ sind die wirksamen Fraktionen beider Enzyme beiZusammensetzung wie vorstehend gefüllt und dann nahe identisch. Es werden 200 mg des Enzyms PGase-! der be.cillus circulans ATCC 21590 unter 12stündigem als Protein bzw. 540 Einheiten PGase-1 als Gesamt-Scnütteln bei 30^üC gezüchtet. Das sterilisierte Kultur- enzymgehalt (entsprechend einer Ausbeute von 57',,.. medium wird mit der Anzuchtkultur beimpft. Nach bezogen auf die rohe Enzymlösung) und 200 mg de.-, der beimpfung wird die Züchtung bei 30C unter Be- ₁₀ Enzyms PUase-11 als Protein bzw. 784 Einheiten ah lüftung mit einer Geschwindigkeit von 8 l/min, und Uesamtenzymgehalt erhalten (entsprechend einer Au unter Kühren bei 350 UpM durchgeführt. Nach etwa beute vor. 65%, bezogen auf die rohe Enzymlösuiiii 8 Stunden erreicht das Wachstum des Stammes einen Line Lösung des teilweise gereinigten En;:\ iv

Stauonärzustand, doch wird das Züchten noch weitere gemisches aus PGase-1 und PGase-11, die nach Clτ 8 Stunden fortgesetzt. Nach dieser Zeit erreicht die ₁₅ vorstehend genannten Arbeitsweise erhalten worJc:: Anhäufung der Peptidoglutaminase ein Maximum, war, wird an einer mit modihziertem, dreidimensiur. _: d. h., der Gehalt an Peptrdoglutaminase-l und Pepiido- vernetztem Dextran mit Diäthylaminoäthvigpipp. glutaminase-11 beträgt 0,3; 2 Einheiten bzw. 0,334 Ein- beschickten Säule (.2,0 · 40,0 cm) adsorbiert, die zu... : heiten je Milliliter Kulturflüssigkeit. Die Züchtung mit einer wäßrigen Lösung von 0,01 Mol Phoipii wird beendet, und die Zellen des Stammes werden ₂₀ Pufferlösung vom pH-VVert 8,0, U,l Mol KaIn;;;, abgetrennt. Das Naßgewicht der abgetrennten Zellen chlorid und 0,002 Mol Äthylendiamintetraaceiat beträgt etwa 200 g. Die feuchten Zellen können ent- puffen worden war. Die adsorbierte Enzymlou.: weder in Form eines gemischten Enzympräparats von wird mit ansteigender KCl-Konzentration innen ■:. PGase-1 und PGase-11 oder in Form eines mit Aceton eines Bereiches von 0,1 bis zu 0,5 Mol eluiert. Hie: als 1 rocknungbiiiittel daraus hergestellten Pulvers ver- ₂₅ wird die PGase-1 bei einer KCl-Konzentralion wendel werden. 200 g Zellen enthalten insgesamt 0,17 bis 0,21 Mol und die PGase-11 bei einer KC! ^L 234U Einheiten PGase-1 und 2510 Einheiten PGase-11. zenration von 0,23 bis 0,27 Mol eluiert.

Diese gereinigten Fraktionen weiden gesamir,.:

B e i s ρ i e 1 2 ^{Es VVl}=rden 19 mg PGase-1 als Protein bzw. 309 l r.

₃o heiten als Gesamtenzymgehalt (entsprechend ei.

HOg der feuchten Zellen (1287 Einheiten PGase-1 Ausbeute von 33°/₀, bezogen auf die roue I-n . -,. und 1375 Einheiten PGase-11) werden in einer 0,05mo- lösung) und 19,6 mg PGase-11 als Protein Iv ■-. laren Phosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 7,2 susprn- 638 Einheilen aL üesamtenzymgehalt erhallen (e; d>ert. Die Zellen werden mittels Schall zerstört, und die sprechend einer Ausbeute von 53%). ^D<e Ergcbr. Suspension wird mit sehr hoher Geschwindigkeit 35 dieser Eiution sind in F i g. 1 veranschaulicht, zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird abgetrennt. Aiiscnließend werden die Lösungen d=r iciiwei

Es werden 400 ml rohe Enzymlösung erhalten, die gereinigten Enzyme PGase-I und PGase-11 an en-955 Einheiten PGase-1 und 1203 Einheiten PGase-11 Säule Chromatographien, die mit Hydroylapatii enthält. Dies entspricht einer Ausbeute von 75 bzw. schickt war. Zuvor wird die Lösung des teilweise 88^u _;0 der Theorie. 40 reinigten Enzyms PGase-1 mit einer 0,01mol;r

Die erhaltene Lösung wird allmählich mit einer Phosphat-Pufferlösung auf den pH-Wert 7,0 < Lösung versetzt, die 400 mg Streptomycin enthält. Der gestellt und läuft dann durch die Säule mit Hydro.v gebildete Niederschlag von Nucleinsäuren wird ab- apatit, der zuvor mit 0,01moiarcr Phosphat-Puli getrennt. Eine weitere Ausfällung erfolgt mit Am- lösung vom pH-Wert 7,0 gepuffert worden war. L-, moniumsulfat bei einer Sättigung von 38 bis 54%. Die 45 Enzym wird adsorbiert. Das adsorbierte Enzym *:■■■■■■ ausgefallenen Proteinfraktionen werden abgetrennt. nach der linearen Konzentrationsgradienten-Metluvi Hierbei wird ein Enzym erhalten, das 950 mg PGase-1 unter Verwendung der gleichen Pufferlösung bei (>,·.).; als Protein bzw. 954 Einheiten als Enzym (entsprechend bis 0,04 Mol Phosphatkonzentration eluiert. Es wei <":<· einer Ausbeute von 102^u/₀, bezogen auf die rohe En- 2 mg PGase-1 als Protein bzw. 129 Einheiten als (..;■■ üymlösung) und 954 ng PGase-11 als Prolei., bzw. 50 sainicnzymgehalt (entsprechend einer Ausbeute \nr 858 Einheiten als Enzym(entsprechend einer Ausbeute 13%, bezogen auf die rohe Enzymlösung) erhalten von 98%, bezogen auf die rohe Enzymlösang) enthält. Anschließend wird nach dem gleichen Verfahren be

Dieses Enzym kann als Lösung oder nach der 0,035bisü,05 MolPhc3ph»<.konzentration die PGase-!i Dialyse mit einer geeigneten Pufferlösung und Lyo- eluierl. Es werden 3,5 mg PGase-I L als Protein bzw philisieren in Form eines Pulvers verwendet werden. 55 256 Einheiten als Gesamtenzymgehalt el"^!ert (ent

sprechend einer Ausbeute von 21%, bezogen auf di( Beispiel 3 rohe Enzymlösung).

Die derart erhaltenen Enzyme werden gegen desii)

Das in Beispiel 2 erhaltene, mit Ammoniumsulfat- liertes Wasser dialysiert und unter verminderten lösung wieder gelöste Enzym wird zuerst in einer 60 Druck getrocknet. Es werden Standardprodukte Ac wäßrigen Lösung von 0,01 Mol Phosphal-Puffer vom gereinigten Enzyme PGase-L bzw. PGase-11 in turn pH-Wert 7,6, 0,1 Mol Kaliumchlorid und 0,002 Mol weißer Pulver erhalten. Diese Standardprodukic de Äthylendiamintetraacel gelöst. Die wäßrige Lösung gereinigten Enzyme werden an modilizierlem, die! wird dann auf eine Säule (4 · 90 cm) gegeben, die mil dimensional vernciztem Dextran (Wasscraufnahnr modifiziertem, dreidimensional vernelztem Dextran 65 10 ml/g) Chromatographien.

(Wasseraufnahme 20 ml/g) beschickt war, das zuvor Die 1- i g. 2 und 3 zeigen, daß die einzelnen Prodii'?.'

mit einer Pufferlösung der gleichen Zusammensetzung von PGase-1 bzw. PGase-II jeweils ein einziges Max wie bei der vorstehenden wäßrigen Lösung gepuffert mum zeigen und deshalb homogen sind.

Beispiel 4

5 kg entfettete Sojabohnen, die mit einer Menge von 125 % Wasser versetzt worden sind, werden 40 Minuten bei einem Wasserdampidruck von 1 kg/cm" gekocht. Die gekochten Sojabohnen werden mit 5 kg geröstetem und pulverisiertem Weizen vermischt und mit Sojasoßen-»Koji«-Sporen besprüht. Die Züchtung wird in an sich bekannter Weise 4 Tage durchgeführt, und es werden 12 kg »Koji« von ausgezeichneter Qualität erhalten. Das erhaltene »Koji« wird in 12 1 einer 24°/oigen Kochsalzlösung gegeben und die »Koji«-Salzbrühe in an sich bekannter Weise 3 Monate bei etwa 3O⁰C unter zeitweiliger Belüftung fermentiert und gereift.

Getrennt hiervon wird Bacillus circulans ATCC 21590 in einem Kulturmedium vom pH-Wert 7,2, das durch Zugabe von 0,3 °/„ Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,5% Lactose, 0,025% Magnesiumsulfat, 0,001% Eisen(IT)-sulfat unH 0,17^c,'„ Dikaliumhydrogenphosphat zu 400 1 Wasser hergestellt worden war, 16 Stunden bei 30⁰C unter Belüftung und Rühren gezüchtet. Die Zellen des Bacillus, in denen sich Peptidoglutaminase-1 und Peptiaoglutaminase-II angesammelt haben, werden mittels Schall zerstört und zentrifugiert. Die überstehende Lösung, d. h. die rohe Enzymlösung, wird abgetrennt und allmählich mit einer Streptomycinlösung versetzt. Die ausgefällten Nucleinsäuren werden abgetrennt. Die Lösung wird dann mit Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad von 38 bis 54% versetzt. Die ausgefällte Fraktion wird abgetrennt und lyophilisiert. Es werden 4 g eines rohen Lnzympulvers erhalten, das 4300 Einheiten PGase-I und 3650 Einheiten PGase-II enthält. Die erhaltene pulverförmige Peptidoglutaminase wir.J in einer Menge von 2000 Einheiten PGase-I und 1800 Einheiten PGase-II zu der vorstehend hergestellten »Koji«-Salzbrühe unmittelbar vor der Fermentation und Reifung zugefügt nnd damit vermischt. Nach der Tmonatigen Reifung bei 3O⁰C wird die gereifte Masse abgepreßt. Es werden 23 1 Sojasoße mit einem Ge- «amtstickstoffgehalt von 1,7% und einem Glutamintäuregehalt von 18,9 mg/ml erhalten. Dies»r Glutaminiäuregehalt stellt 10,56% der Sojasoße dar, ent- »prechend dem Verhältnis des GIu:-iminsäure-Stickttoffs zum Gesamtstickstoff.

Bei einer in gleicher Weise hergestellten Sojasoße, jedoch ohne Zusatz von Peptidoglutaminase, beträgt dieses Verhältnis von Glutaminsäure-Stickstoff zu Gesamtstickstoff nur 7,69%· Es ist ersichtlich, daß erfindungsgemäß bedeutend mehr Glutaminsäure-Stickstoff gebildet worden ist.

Beispiel 5

Das Verfahren des Beispiels 4 wird wiederholt, wobei die gleiche »Koji«-Salzbrühe erhalten wird. Getrennt davon wird ein mit Ammoniumsulfat ausgefälltes rohes Enzymgemisch von PGase-1 und PGase-II nach dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 4 hergestellt. Das rohe Enzymgemisch wird ar. einer mit modifiziertem, dreidimensional vernetzten! Dextran (Wasseraufnahme 20 ml/g) beschickten Säule mit einer Pufferlösung Chromatographien, die 0,01 Mol Phosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 7,6, 0,1 Mol ' Kaliumchioiid und 0,002 Mol Äthylendiamintetraacetat enthält. Vom Eluat werden die 50. bis 70. Fraktion aufgefangen, und daraus wird ein Enzymgemisch aus PGase-I und PGase-II erhalten. Das Enzymgemisch wird an einer mit modifiziertem, dreidimensional vernetzten! Dextran mit Diäthylaminogruppen beschickten Säule mit einer Pufferlösung adsorbiert, die 0,01 Mol Phosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 8,0, 0,1 MoI Kaliumchlorid und 0,002 Mo! Äthylendiamintetraacetat enthält. Danach wird das adsorbierte Enzymgemisch unter Verwendung der gleichen Pufferlösung wie vorstehend nach der KCl-Konzentrationsgradienten-Elutionsmethode eluiert, wobei die

ίο KCl-Konzentration 0,1 bis 0,5 MoI beträgt. PGase-I wird bei einer KCl-Konzentration von 0,17 bis 0,21 Mol und PGase-II bei einer KCl-Konzentration von 0,22 bis 0,27 Mol erhalten. Beide Enzyme werden lyophilisiert, und es werden die enlsprechenden gereinigten Enzyme erhalten.

1900 Einheiten des gereinigten Enzyms PGase-I und 1700 Einheiten des gereinigten Enzyms PGase-II werden zu einer »Koji«-Salzbrühe, die wie vorstehend beschrieben hergestellt worden ist, unmittelbar vor der Ferrnentierung und Reifung zugesetzt und damit vermischt. Das Verfahren des Beispiels 4 wird wiederholt, und es wird eine qualitätsmäßig verbesserte Soj.^oiSf- von ausgezeichneter Schmackhaftigkeit erha)t <»n. in diesen Sojasoßen Lvträgt das Verhältnis

*5 von Glutaminsäure-Stickstoff zu Gesamtstickstoff 8,18 bzw. 9,14%. Ohne Zusatz der crfindungsgemäß he gestellten Enzyme beträgt dieses Verhältnis nur 7,69%.

Beispiel 6

100 g Weizengluten werden bis zum Gesamtvolumen von 580 ml mit Leitungswasser vernetzt, verrührt und "*ⁿ Minuten bei einem Druck von 1 kg/cm^a gekocht. Danach wird die Masse mit 5 g

eines proteolytischen Enzyms (ein handelsüblich erhältliches Enzym, das von Aspergill»s oryzae erzeugt wird und teilweise gereinigt ist) und 2,4 g des gemäß Beispiel 4 hergestellten, durch Ammoniumsulfatfällung erhaltenen Peptidoglutaminase-Pulvers versetzt. Das Gemisch wird 3 Tage bei 30⁰C in Gegenwart von Toluol bei einem pH-Wert von 5,0 hydrolysiert.

Nach Beendigung der Hydrolyse wird das Reaktionsgemisch abgepreßt Es werden 360 ml tines Glutenhydrolysats von ausgezeichneter Schmackhaftigkeit erhalten. Die erhaltene flüssige Würze enthält 30 mg/ml Glutaminsäure. Eine gleiche Würze, die jedoch ohne Zusatz von PGase hergestellt worden ist, enthält lediglich 8 mg/ml Glutaminsäure.

Das erhaltene Glutenhydrolysat kann zur Herstellung der verschiedensten Würzen und Suppen entweder als solches oder nach Konzentrierung oder gegebenenfalls Trocknung und Pulverisierung verwendet werden.

Beispiel 7

1,3 kg Sojabohnen, die in an sich bekannter Weise 12 Stunden bei Raumtemperatur in Wasser eingeweicht worden sind, werden bei einem Dampfdruck von 0,3 kg/cm^s 100 Minuten gekocht. Getrennt davun wird 1,5 kg Reis 12 Stunden bei Raumtemperatur in Wasser eingeweicht und bei Normaldruck 90 Minuten gedämpft. Der gedämpfte Reis wird zur Herstellung einer Paste aus Reis und Bohnen mit »Koji«-Sporen besprüht und 60 Tage bei etwa 30⁰C einer Fernientation unterworfen. Das erhaltene Produkt wird mit 400 g Kochsalz vermischt. Dieses Gemisch wi^rd mit 32 g feuchten Zellen versetzt, die in an sich bekannter Weise aus gezüchteten Zellen hergestellt worden sind,

die durch Züchten des Bacillus circulans ATCC 21590 in der gleichen Weise wie im Beispiel 4 erhalten worden sind. Das Ganze wird gründlich gemischt und durch 3monatiges Stehenlassen bei 30° C gereift. Es wird ein verbessertes Produkt erhalten. Dieses Produkt enthält 46% Wasser, 12% rohes Protein, 9,5% Kochsalz und 6,5 mg/g Glutaminsäure. Auf Grund einer organoleptischen Untersuchung werden außerordentlich gute Ergebnisse erhalten. Ein Kontrollprodukt enthält lediglich 5,1 mg/g Glutaminsäure.

Beispiel 8

10 1 Kuhmilch werden in eine Käsebütte gegeben und mit 1% einei Starterlösung (einer Kultur von Milchsäure erzeugenden Streptokokken) bei 30° C nach dem üblichen Verfahren zur Herstellung von Gouda-Käse versetzt. Wenn die Konzentration des Milchsäuregehalts 0,18 bis 0,27% erreicht hat, wird Labferment zugefügt, so daß das Milchkasein in 10 bis 15 Minuten koagulieren kann. Dann wird 1 g eines Peptidoglutaminase-Präparats (mit Ammoniumsulfat gefälltes Pulver) zugegeben. Das Gemisch wird kräftig gerührt. Hierbei koaguliert das Protein. Danach wird die Molke abgetrennt. Der koagulierte Quark wird gesammelt, erwärmt, in an sich bekannter Weise abgepreßt und dann mit Tafelsalz versetzt. Das erhaltene Produkt wird 2 Monate bei 15°C gereift. Es werden 83Og Käse erhalten, der 38,0% Wasser, 25,5% Fett, 28,0% Protein und 3,5 mg/g Glutamin-

säure enthält. Auf Grund einer organoleptischen Untersuchung ist der erhaltene Käse geschmacklich besset als ein Käse, der nach dem üblichen Verfahren hergestellt worden ist.

Vergleichsversuch

Nachstehend wird das gemäß Beispiel 4 hergestellte,

durch Ammoniumsulfatfällung erhaltene PGase-Pulver hinsichtlich seiner Aktivität mit einer aus E. coli

ίο hergestellten, handelsüblichen gereinigten Glutaminase verglichen.

Beispiel 6 wird unter Verwendung von ,Weizengluten als Substrat wiederholt. Im Glutenhydrolysat wird die gebildete Menge an Glutaminsäure bestimmt.

Enzym	Einheiten	Glutamin säure mg/m!
Keines ..	500 1000 250	8,0 13,2 14,8 30,0
E. coli Glutaminase E. coli Glutaminase ... . PGase-Pulver von Beispiel 4

a5 Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß selbst bei Verwendung der vierfachen Menge an handelsüblicher E. coli-Glutaminase die Glutaminsäureausbeute erheblich geringer ist als bei Verwendung des erfindungsgemäß hergestellten PGase-Pulvers.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Peptidoglutaminase I und oder Peptidoglutaminasell. dadurch gekennzeichnet, daß man den Bacillus circulans ATCC 21590 unter aeroben Bedingungen in einem üblichen Kulturmedium züchtet und die Peptidoglutaminase I und oder die Peptidoglutaminase II aus den Zellen und oder aus der Kuiturflüssigkeit isoliert.

2. Verwendung der nach Anspruch 1 erhaltenen Peptidoglutaminase 1 und,oder Peptidoglutaminase II in proteinhaltigen Getränken und Nahrungsmitteln.

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