CN113234695A

CN113234695A - Gh61多肽变体以及编码其的多核苷酸

Info

Publication number: CN113234695A
Application number: CN202110499079.7A
Authority: CN
Inventors: J·林; D·博安; M·马兰塔; L·贝雷斯福德; M·拉姆萨; M·斯威尼; M·沃顾里斯; E·兹纳梅罗斯基; F·W·拉斯马森
Original assignee: Novozymes AS; Novozymes Inc
Current assignee: Novozymes AS; Novozymes Inc
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2013-04-26
Publication date: 2021-08-10
Also published as: EP2841567B1; EP3279320B1; DK3279320T3; DK2841567T3; CN104245926A; US20240110169A1; US20220307002A1; EP2841567A2; US11345905B2; US20190153414A1; US20150082493A1; EP3279320A2; CA2868308A1; US10227579B2; WO2013163590A3; BR112014026625A2; CN104245926B; WO2013163590A2; US11891637B2; EP3279320A3

Abstract

本发明涉及GH61多肽变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

GH61多肽变体以及编码其的多核苷酸

本申请是申请日为2013年4月26日、申请号为201380021502.6、发明名称为“GH61多肽变体以及编码其的多核苷酸”的发明专利申请的分案申请。

序列表的引用

本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及GH61多肽变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。

相关技术说明

纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价连接的一种聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在任意位置消化纤维素聚合物，使其打开而被纤维二糖水解酶攻击。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序释放纤维二糖分子。纤维二糖是葡萄糖的一种水溶性β-1，4-连接二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。

将木质纤维素原料转化成乙醇具有如下优点，即易于获得大量原料、避免燃烧或填埋材料的期望性、以及乙醇燃料的清洁性。现在认为木材、农业残余物、草本作物、和城市固体废物是生产乙醇的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦木质纤维素被转化成可发酵糖，例如葡萄糖，则这些可发酵糖可以容易地由酵母发酵为乙醇。

WO 2005/074647、WO 2008/148131、以及WO 2011/035027披露了来自太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2005/074656和WO 2010/065830披露了来自金黄色嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2007/089290和WO 2012/149344披露了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、以及WO 2009/085868披露了来自嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2010/138754披露了来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2011/005867披露了来自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2011/039319披露了来自嗜热子囊菌属物种(Thermoascus sp)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2011/041397披露了来自青霉属物种(Penicillium sp)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2011/041504披露了来自甲壳嗜热子囊菌(Thermoascuscrustaceus)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2012/030799披露了来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2012/113340披露了来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2012/122477披露了来自Aurantiporus alborubescens、囊状长毛盘菌(Trichophaea saccata)、以及托姆青霉(Penicillium thomii)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2012/135659披露了来自柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2012/146171披露了来自特异腐质霉(Humicola insolens)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2012/101206披露了来自樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)、Talaromycesleycettanus、以及嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2013/043910披露了来自梭孢端梗霉(Acrophialophorafusispora)以及瘤孢棒囊孢壳(Corynascus sepedonium)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。

WO 2012/044835和WO 2012/044836披露了具有纤维素分解增强活性连同改善的热活性和热稳定性的GH61多肽变体。

在本领域中存在对具有纤维素分解增强活性连同增加的热稳定性的GH61多肽的需求，用作木质纤维素在高温下的降解中使用的酶组合物的组分。

本发明提供了具有增加的热稳定性的GH61多肽变体。

发明概述

本发明涉及分离的GH61多肽变体，其包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249、以及250相对应的一个或多个(例如若干个)位置处的取代，其中这些变体具有纤维素分解增强活性。

本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。

本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：在本发明的GH61多肽变体的存在下，用酶组合物处理该纤维素材料。在一个方面，这些方法进一步包括回收降解的或转化的纤维素材料。

本发明还涉及产生发酵产物的方法，包括：(a)在本发明的GH61多肽变体的存在下，用酶组合物使纤维素材料糖化；(b)用一种或多种(例如若干种)发酵微生物发酵糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；以及(c)从发酵中回收该发酵产物。

本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种(例如若干种)发酵微生物发酵该纤维素材料，其中该纤维素材料在本发明的GH61多肽变体的存在下用酶组合物糖化。在一个方面，发酵纤维素材料产生发酵产物。在另一个方面中，这些方法进一步包括从发酵中回收该发酵产物。

本发明还涉及以下项目：

1.一种GH61多肽变体，其包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置138、219、26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、222、234、246、249、以及250相对应的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性，并且其中该变体与亲本GH61多肽的氨基酸序列具有至少60％，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％的序列一致性。

2.如项目1中任一项所述的变体，该变体是亲本GH61多肽的一种选自下组的变体，该组由以下各项组成：

(a)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽具有至少60％序列一致性的一种多肽；

(b)由多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在至少低严谨度条件下与以下各项杂交：(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体；

(c)由与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码的一种多肽；以及

(d)SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽的一个片段,其具有纤维素分解增强活性。

3.如项目2所述的变体，其中该亲本GH61多肽包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽，或由其组成。

4.如项目1-3中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽具有至少60％，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％的序列一致性。

5.如项目1-4中任一项所述的变体，该变体包括选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：S26I；G32E,S；Y34F；V40A；N41T；Q42I,E,V；S47E,L,R；S56C,E,T；S72Q,T；T102K,P；A123R；Q138C,E,G,K,L,M；V149I；D152S；T163E,F,V；V164C,L；I166L；S169R,C；S186F,K,T,Y；F200I,V；G207P；S213E；S219E,M,Q,C；K222R；S234G,K；A246P；N249Q,R,C以及A250C。

6.如项目1至5中任一项所述的变体，该变体进一步包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置111、152、155、162、96、98、200、202、204、105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性。

7.如项目6所述的变体，该变体包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：L111V、D152S、M155L、A162W、I96V、F98L、F200I、I202L、I204V、E105P,K；E154L；G188A,W；N189K；A216L,Y；以及A229W,H,I,Y。

8.如项目1-7中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少1.01倍，例如至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少50倍、至少75倍、或至少100倍的增加的热稳定性。

9.一种编码如项目1-8中任一项所述的变体的分离的多核苷酸。

10.一种包括如项目9所述的多核苷酸的重组宿主细胞。

11.一种产生GH61多肽变体的方法，该方法包括：在适于该变体表达的条件下培养如项目10所述的重组宿主细胞。

12.用如项目9所述的多核苷酸转化的一种转基因植物、植物部分或植物细胞。

13.一种产生如项目1-8中任一项所述的变体的方法，该方法包括：在有助于该变体产生的条件下培养包含编码该变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。

14.一种用于获得GH61多肽变体的方法，该方法包括：在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置138、219、26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、222、234、246、249、以及250相对应的一个或多个位置处将取代引入亲本GH61多肽，其中该变体具有纤维素分解增强活性；并且回收该变体。

15.一种用于降解或转化纤维素材料的方法，该方法包括：在如项目1-8中任一项所述的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料。

16.一种用于产生发酵产物的方法，该方法包括：(a)在如项目1-8中任一项所述的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的存在下，用一种酶组合物使一种纤维素材料糖化；(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；并且(c)从该发酵中回收该发酵产物。

17.一种发酵纤维素材料的方法，该方法包括：用一种或多种发酵微生物发酵该纤维素材料，其中在如项目1-8中任一项所述的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的存在下，用一种酶组合物糖化该纤维素材料。

18.一种包括如项目1-8中任一项所述的变体的组合物。

19.一种全培养液配制品或细胞培养组合物，包含如项目1-8中任一项所述的变体。

20.一种洗涤剂组合物，包含一种表面活性剂和如项目1-8中任一项所述的变体。

附图简要说明

图1示出编码具有纤维素分解增强活性的GH61B多肽的烟曲霉基因的基因组DNA序列(SEQ ID NO:29)和推断的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)。

图2示出pMMar44的限制性图谱。

图3示出pMMar49的限制性图谱。

图4示出pMMar45的限制性图谱。

图5示出pDFng113的限制性图谱。

图6示出pDFng153-4的限制性图谱。

图7示出pDFng154-17的限制性图谱。

图8示出pDFng155-33的限制性图谱。

图9示出pDFng156-37的限制性图谱。

图10示出pDFng157-51的限制性图谱。

图11示出pBGMH16的限制性图谱。

定义

乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”的意思是一种羧酸酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基自聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α-萘基乙酸酯、和对硝基苯基乙酸酯的水解。为了本发明的目的，用0.5mM对硝基苯基乙酸酯作为底物，在含有0.01％TWEEN^TM 20(聚氧乙烯山梨醇酐月桂酸酯)的50mM乙酸钠(pH 5.0)中，对乙酰木聚糖酯酶的活性进行测定。一个单位的乙酰基木聚糖酯酶被定义为，在pH 5，25℃，每分钟能够释放1μmol对硝基酚根阴离子的酶的量。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是静默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3.2.1.55)，其催化α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶、或α-L-阿拉伯聚糖酶。出于本发明的目的，使用每ml的100mM乙酸钠(pH 5)中5mg的中等粘度小麦阿拉伯糖基木聚糖(麦格酶国际爱尔兰股份有限公司(Megazyme International Ireland,Ltd.)，爱尔兰威克洛郡布瑞公司(Bray,Co.Wicklow,Ireland)以总体积200μl在40℃下持续30分钟，接着通过

HPX-87H柱色谱(伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)，美国加州赫拉克勒斯(Hercules,CA,USA)进行阿拉伯糖分析来测定α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。

α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”是指可催化α-D-葡萄糖苷酸水解成为D-葡萄糖醛酸酯和醇的一种α-D-葡萄糖苷酸葡萄糖醛酸水解酶(EC3.2.1.139)。出于本发明的目的，根据de Vries(德弗里斯)，1998，J.Bacteriol.(细菌学杂志)180:243-249确定α-葡糖醛酸糖苷酶活性。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH 5、40℃下每分钟释放1微摩尔的葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶的量。

β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指一种β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。出于本发明的目的，根据文丘里(Venturi)等人，2002，基础微生物学杂志(J.Basic Microbiol.)42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来测定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH 4.8下，在含有0.01％

20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。

β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指一种β-D-木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)-木寡糖的外水解，以从非还原性末端去除连续的D-木糖残基。为了本发明的目的，用1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物，在含有0.01％TWEEN^TM20的100mM柠檬酸钠(pH 5，40℃)中，优选地对β-木糖苷酶的活性进行测定。一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH 5下，在含有0.01％

20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。

cDNA:术语“cDNA”是指可以通过得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指一种1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含有β-1,4-连接葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从而从链的还原性末端(纤维二糖水解酶I)或非还原性末端(纤维二糖水解酶II)释放纤维二糖(泰里(Teeri)，1997，生物技术趋势(Trends in Biotechnology)15:160-167；泰里等人，1998，生物化学学会会刊(Biochem.Soc.Trans.)26:173-178)。优选地根据由Lever(莱韦尔)等人，1972，Anal.Biochem.(分析生物化学)47:273-279；van Tilbeurgh(范泰白勒夫)等人，1982，FEBSLetters(欧洲生化学会联合会快报)，149:152-156；范泰白勒夫和Claeyssens(克莱伊森)，1985，欧洲生化学会联合会快报，187:283-288；以及Tomme(多姆)等人，1988，Eur.J.Biochem.(欧洲生物化学杂志)170:575-581描述的程序确定纤维二糖水解酶活性。

纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”(或“纤维素酶”是指可对纤维素材料进行水解的一种或多种(例如若干种)酶。这类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或它们的组合。用于测量纤维素分解酶活性的两种基本方法包括：(1)测定总纤维素分解酶活性，以及(2)测定个体纤维素分解酶活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如在张(Zhang)等人，2006，Biotechnology Advances(生物技术进展)24：452-481中所述的。通常使用不溶性底物对总纤维素分解活性进行测定，包括沃特曼一号(Whatman№1)滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经过预处理的木质纤维素等。最常用的总纤维素分解活性测定法是使用沃特曼一号滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)建立的(高斯(Ghose)，1987，Pure Appl.Chem.(纯粹与应用化学)59：257-68)。

出于本发明的目的，通过测量在以下条件下由一种或多种纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来测定纤维素分解酶活性：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g于PCS中的纤维素(或其他预处理的纤维素材料)，在适合的温度(如40℃-80℃，例如50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃)和适合的pH(如4-9，例如，5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0)下持续3-7天，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的预处理的玉米秸秆(PCS)，5％不溶性固形物，50mM乙酸钠(pH 5)，1mM MnSO₄，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过

HPX-87H柱(伯乐实验室有限公司，美国加州赫拉克勒斯)进行的糖分析。

纤维素材料：术语“纤维素材料”意指含有纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁中的主要多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素，而第三丰富的是果胶。细胞停止生长后产生的次生细胞壁也包含多糖，并且它通过与半纤维素共价交联的聚合木质素得到强化。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是一种线性β-(l-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如具有一系列取代基以复杂支链结构存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多态的，但发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键合至纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。

纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮、以及穗轴，或树的叶、枝、以及木材中。纤维素材料可以是，但不限于，农业残余物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆与造纸厂残余物、废纸、和木材(包括林业废弃物)(参见例如，Wiselogel(维塞劳格尔)等人，1995，在Handbook on Bioethanol(生物乙醇手册)(Charles E.Wyman(查尔斯E.怀曼)，编辑)，第105-118页，Taylor(泰勒)&Francis(弗朗西斯)，华盛顿；怀曼，1994，BioresourceTechnology(生物资源技术)50:3-16；Lynd(林德)，1990，Applied Biochemistry andBiotechnology(应用生物化学与生物技术)24/25:695-719；Mosier(莫西尔)等人，1999，Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics(木质纤维素生物转化的最新进展)，Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology(生化工程/生物技术进展)，T.Scheper(斯科皮尔)，总编辑，第65卷，第23-40页，Springer-Verlag(施普林格出版社)，纽约)中)。在此应该理解的是，纤维素可以处于木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素、和半纤维素的植物细胞壁材料的形式。在一个优选方面中，该纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选方面中，该纤维素材料是木质纤维素，该木质纤维素包括纤维素、半纤维素、以及木质素。

在一个方面中，该纤维素材料是农业残余物。在另一个方面中，该纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一个方面中，该纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面中，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一个方面中，纤维素材料是废纸。在另一个方面中，纤维素材料是木材(包括林业废弃物)。

在另一个方面中，纤维素材料是芦竹。在另一个方面中，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面中，纤维素材料是竹子。在另一个方面中，纤维素材料是玉米芯。在另一个方面中，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面中，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面中，纤维素材料是芒草。在另一个方面中，纤维素材料是橘皮。在另一个方面中，纤维素材料是稻草。在另一个方面中，纤维素材料是柳枝稷。在另一个方面中，纤维素材料是小麦秆。

在另一个方面中，纤维素材料是山杨。在另一个方面中，纤维素材料是桉树。在另一个方面中，纤维素材料是冷杉。在另一个方面中，纤维素材料是松树。在另一个方面中，纤维素材料是杨树。在另一个方面中，纤维素材料是云杉。在另一个方面中，纤维素材料是柳树。

在另一个方面中，纤维素材料是海藻纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是棉短绒。在另一个方面中，纤维素材料是滤纸。在另一个方面中，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是经过磷酸处理过的纤维素。

在另一个方面中，纤维素材料是一种水生生物质。如在此所用的，术语“水生生物质(Aquatic Biomass)”是指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。水生生物质可以是藻类、挺水植物、浮叶植物、或沉水植物。

纤维素材料可以按原样使用或可以使用本领域已知的常规方法进行预处理，如在此所描述。在一个优选方面，纤维素材料进行了预处理。

编码序列：术语“编码序列”意指一种多核苷酸，该多核苷酸直接规定了一种变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指为编码本发明的一种变体的一种多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或者外源的(即，来自不同基因)，或者相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指一种内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键和混合β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的减小，或通过还原糖测定确定还原端增加来确定内切葡聚糖酶活性(张等人，2006，生物技术进展24:452-481)。出于本发明的目的，根据高斯，1987，纯粹与应用化学59:257-268的程序，在pH 5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物，确定内切葡聚糖酶活性。

表达：术语“表达”包括涉及一种变体的产生的任何步骤，包括(但不限于)转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种变体的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

家族61糖苷水解酶：术语“家族61的糖苷水解酶(Family 61GlycosideHydrolase)”或“家族GH61”或“GH61”是指属于根据亨利萨塔(Henrissat)，1991，生物化学期刊(Biochem.J.)280：309-316，以及亨利萨塔和巴洛赫(Bairoch)，1996，生物化学期刊，316：695-696的糖苷水解酶家族61的一种多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中测量到的非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性而被分类为糖苷水解酶家族。最近，已经将GH61分类为溶解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase)(昆兰(Quinlan)等人，2011，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)208:15079-15084；菲利普斯(Phillips)等人，2011，ACS化学生物学(ACS Chem.Biol.)6:1399-1406；林(Lin)等人，2012，结构(Structure)20:1051-1061)。

阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰基)基团从酯化的糖(其在天然生物质底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸酯(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸酯)。阿魏酸酯酶(FAE)也被称为阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I、或FAE-II。为了本发明的目的，使用0.5mM对硝基苯阿魏酸酯作为底物在50mM乙酸钠中在pH 5.0对阿魏酰酯酶的活性进行测定。一个单位的阿魏酸酯酶等于，在pH 5，25℃，每分钟能够释放1μmol的对硝基酚根阴离子的酶的量。

片段：术语“片段”意指一种多肽，该多肽中不存在其成熟多肽的氨基和/或羧基末端的一个或多个(例如若干个)氨基酸，其中该片段具有纤维素分解增强活性。在一个方面，片段含有GH61多肽的成熟多肽的至少85％的氨基酸残基，例如至少90％的氨基酸残基、或至少95％的氨基酸残基。

半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”是指水解半纤维素材料的一种或多种(例如若干种)酶。参见例如，沙鲁姆(Shallom)和Shoham(沙哈姆)，微生物学当前观点(Current Opinion In Microbiology)，2003，6(3):219-228)。半纤维素酶是在植物生物质的降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不局限于乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。这些酶的底物——半纤维素——是支链和直链多糖的异质性组，其可通过氢键与植物细胞壁中的纤维素微纤维相结合，交联成坚固的网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于它们一级序列的同源性，可以被分配到GH和CE家族中。具有总体上相似的折叠的某些家族可被分成族，按字母顺序进行标记(例如GH-A)。在碳水化合物活性酶(CAZY)数据库中可得到这些酶以及碳水化合物活性酶的最翔实和更新的分类。根据高斯(Ghose)和比赛亚(Bisaria)，1987，纯粹与应用化学(Pure&AppI.Chem.)59:1739-1752，在合适的温度，例如，40℃-80℃，例如50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃，以及合适的pH例如4-9，例如5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0，可以测量半纤维素分解酶活性。

高严谨度条件：术语“高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹(Southern blotting)程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的一种多核苷酸的一种核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

改进的特性：术语“改进的特性”意指与一种变体相关的相对于亲本有所改进的特征。这种改进的特性包括但不限于增加的热稳定性。

增加的热稳定性：术语“增加的热稳定性”意指相对于亲本，GH61多肽变体在某一温度下孵育一段时期之后纤维素分解增强活性的保留较高。变体相对于亲本的热稳定性增加可以例如在一个或多个(例如若干个)温度的条件下评估。例如，该一个或多个(例如若干个)温度可以是45℃至95℃范围内的任何一个温度或多个温度，例如，45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、或95℃(或在此之间，例如62℃、68℃、72℃，等等)，在一个或多个(例如若干个)pH下，该一个或多个pH在3至9的范围内，例如3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、或9.0(或在此之间)，持续合适时期(时间)的孵育，例如1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、或60分钟(或在此之间，例如23分钟、37分钟，等等)，这样使得该变体保留残余活性。然而，也可以使用更长时期的孵育。术语“增加的热稳定性”能够与“改善的热稳定性”可互换地使用。

变体相对于亲本的增加的热稳定性可以通过差示扫描量热法(DSC)使用本领域中的标准方法来确定(参见，例如，斯特蒂文特(Sturtevant)，1987，物理化学年评(AnnualReview of Physical Chemistry)38:463-488；实例9)。变体相对于亲本的热稳定性增加还可以使用蛋白质热解折叠分析来测定(参见，例如，在此的实例10)。变体相对于亲本的热稳定性增加还可以使用本领域中已知的用于具有纤维素分解增强活性的针对GH61多肽的任何酶测定以测量温度处理后的残余活性来测定。参见例如，WO 2005/074647、WO 2008/148131、WO 2005/074656、WO 2010/065830、WO 2007/089290、WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868、以及WO 2008/151043，它们通过引用结合在此。可替代地，变体相对于亲本的热稳定性增加可以使用其中将变体的性能与亲本相比较的用于该变体的任何应用测定来测定。例如，可以使用实例5中所描述的应用测定。

分离的：术语“分离的”意指处于非天然存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)任何物质，包括但不局限于从与其性质上相关的一种或多种或所有天然发生的组分至少部分除去的任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然中发现的物质，由人手工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。

低严谨度条件：术语“低严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(如N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等)之后呈其最终形式的一种多肽。在一个方面，基于预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至19是信号肽的SignalP3.0程序(本特森(Bendtsen)等人，2004，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)340:783-795)，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸20至326。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:4的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸18至239。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:6的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:6的氨基酸20至258。在另一个方面，基于预测SEQ IDNO:8的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:8的氨基酸19至226。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:10的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:10的氨基酸20至304。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:12的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:12的氨基酸16至317。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:14的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:14的氨基酸22至249。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:16的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:16的氨基酸20至249。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:18的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:18的氨基酸18至232。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:20的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQID NO:20的氨基酸16至235。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:22的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:22的氨基酸19至323。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:24的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:24的氨基酸16至310。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:26的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:26的氨基酸20至246。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:28的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:28的氨基酸22至354。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:30的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ IDNO:30的氨基酸22至250。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:32的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:32的氨基酸22至322。在另一个方面，基于预测SEQ IDNO:34的氨基酸1至23是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:34的氨基酸24至444。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:36的氨基酸1至25是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:36的氨基酸26至253。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:38的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:38的氨基酸18至246。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:40的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:40的氨基酸20至334。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:42的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:42的氨基酸18至227。在另一个方面，基于预测SEQ IDNO:44的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:44的氨基酸20至223。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:46的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:46的氨基酸22至368。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:48的氨基酸1至24是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:48的氨基酸25至330。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:50的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:50的氨基酸17至236。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:52的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:52的氨基酸19至250。在另一个方面，基于预测SEQ IDNO:54的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:54的氨基酸23至478。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:56的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:56的氨基酸17至230。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:58的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:58的氨基酸20至257。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:60的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:60的氨基酸23至251。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:62的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:62的氨基酸19至349。在另一个方面，基于预测SEQ IDNO:64的氨基酸1至23是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:64的氨基酸24至436。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:66的氨基酸1至23是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:66的氨基酸21至344。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:68的氨基酸1至25是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:68的氨基酸26至400。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:70的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:70的氨基酸21至389。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:72的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:72的氨基酸22至406。在另一个方面，基于预测SEQ IDNO:74的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:74的氨基酸20至427。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:76的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:76的氨基酸18至267。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:78的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:78的氨基酸21至273。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:80的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:80的氨基酸21至322。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:82的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:82的氨基酸18至234。在另一个方面，基于预测SEQ IDNO:84的氨基酸1至23是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:84的氨基酸24至233。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:86的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:86的氨基酸17至237。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:88的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:88的氨基酸20至484。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:90的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:90的氨基酸22至320。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:92的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:92的氨基酸23至272。在另一个方面，基于预测SEQ IDNO:94的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:94的氨基酸22至327。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:96的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:96的氨基酸23至274。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:98的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:98的氨基酸18至227。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:100的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:100的氨基酸17至257。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:102的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:102的氨基酸20至246。在另一个方面，基于预测SEQID NO:104的氨基酸1至27是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:104的氨基酸28至265。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:106的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:106的氨基酸16至310。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:108的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:108的氨基酸21至354。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:110的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ IDNO:110的氨基酸22至267。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:112的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:112的氨基酸16至237。在另一个方面，基于预测SEQID NO:114的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:114的氨基酸20至234。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:116的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:116的氨基酸18至226。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:118的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:118的氨基酸17至231。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:120的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ IDNO:120的氨基酸22至248。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:122的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:122的氨基酸18至233。在另一个方面，基于预测SEQID NO:124的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:124的氨基酸21至243。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:126的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:126的氨基酸21至363。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:128的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:128的氨基酸20至296。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:130的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ IDNO:130的氨基酸16至318。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:132的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:132的氨基酸19至259。在另一个方面，基于预测SEQID NO:134的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:134的氨基酸20至325。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:136的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:136的氨基酸19至298。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:138的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:138的氨基酸20至298。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:140的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ IDNO:140的氨基酸22至344。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:142的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:142的氨基酸20至330。在另一个方面，基于预测SEQID NO:144的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:144的氨基酸19至216。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:146的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:146的氨基酸18至490。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:148的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:148的氨基酸21至306。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:150的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ IDNO:150的氨基酸22至339。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:152的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:152的氨基酸23至334。在另一个方面，基于预测SEQID NO:154的氨基酸1至23是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:154的氨基酸24至366。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:156的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:156的氨基酸21至364。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:158的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:158的氨基酸22至344。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:160的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ IDNO:160的氨基酸20至252。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:162的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:162的氨基酸20至344。在另一个方面，基于预测SEQID NO:164的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:164的氨基酸22至347。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:166的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:166的氨基酸20至342。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:168的氨基酸1至26是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:168的氨基酸27至254。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:409的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ IDNO:409的氨基酸23至272。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:411的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:411的氨基酸23至272。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。

成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有纤维素分解增强活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，基于预测SEQ ID NO:1的核苷酸330至387编码信号肽的SignalP 3.0程序(本特森等人，2004，同上)，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的388至1332。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:3的核苷酸47至97编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的核苷酸98至821。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:5的核苷酸69至125编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:5的核苷酸126至978。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:7的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:7的核苷酸55至678或其基因组DNA序列。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:9的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:9的核苷酸58至912或其基因组DNA序列。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:11的核苷酸1至45编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:11的核苷酸46至951或其基因组DNA序列。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:13的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:13的核苷酸64至796。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:15的核苷酸20至76或其基因组DNA序列编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:15的核苷酸77至766。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:17的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:17的核苷酸52至921。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:19的核苷酸1至45编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:19的核苷酸46至851。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:21的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:21的核苷酸55至1239。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:23的核苷酸1至45编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:23的核苷酸46至1250。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:25的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:25的核苷酸58至811。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:27的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:27的核苷酸64至1112。在另一个方面，基于预测SEQ IDNO:29的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:29的核苷酸64至859。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:31的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:31的核苷酸64至1018。在另一个方面，基于预测SEQID NO:33的核苷酸1至69编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:33的核苷酸70至1483。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:35的核苷酸1至75编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:35的核苷酸76至832。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:37的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:37的核苷酸52至875。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:39的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:39的核苷酸58至1250。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:41的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQID NO:41的核苷酸52至795。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:43的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:43的核苷酸58至974。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:45的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:45的核苷酸64至1104。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:47的核苷酸1至72编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:47的核苷酸73至990。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:49的核苷酸1至48编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:49的核苷酸49至1218。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:51的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:51的核苷酸55至930。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:53的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:53的核苷酸67至1581。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:55的核苷酸1至48编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:55的核苷酸49至865。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:57的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:57的核苷酸58至1065。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:59的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:59的核苷酸67至868。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:61的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:61的核苷酸55至1099。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:63的核苷酸1至69编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:63的核苷酸70至1483。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:65的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:65的核苷酸61至1032。在另一个方面，基于预测SEQ IDNO:67的核苷酸1至75编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:67的核苷酸76至1200。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:69的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:69的核苷酸61至1167。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:71的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:71的核苷酸64至1218。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:73的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:73的核苷酸58至1281。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:75的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:75的核苷酸52至801。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:77的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:77的核苷酸61至819。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:79的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:79的核苷酸61至966。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:81的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:81的核苷酸52至702或其基因组DNA序列。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:83的核苷酸1至69编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:83的核苷酸70至699或其基因组DNA序列。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:85的核苷酸1至48编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:85的核苷酸49至711或其基因组DNA序列。在另一个方面，基于预测SEQ IDNO:87的核苷酸1至75编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:87的核苷酸76至1452。或在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:89的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:89的核苷酸64至1018。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:91的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:91的核苷酸67至869。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:93的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:93的核苷酸64至1036。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:95的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQID NO:95的核苷酸67至878。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:97的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:97的核苷酸52至818。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:99的核苷酸1至48编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:99的核苷酸49至1117。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:101的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:101的核苷酸58至875。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:103的核苷酸1至81编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:103的核苷酸82至1064。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:105的核苷酸1至45编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:105的核苷酸46至1032。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:107的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:107的核苷酸61至1062。在另一个方面，基于预测SEQ IDNO:109的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:109的核苷酸64至801。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:111的核苷酸1至45编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:111的核苷酸46至840。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:113的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQID NO:113的核苷酸58至702。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:115的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:115的核苷酸52至750。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:117的核苷酸1至48编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:117的核苷酸49至851。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:119的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:119的核苷酸64至860。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:121的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:121的核苷酸52至830。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:123的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:123的核苷酸61至925。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:125的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:125的核苷酸61至1089。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:127的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:127的核苷酸58至1083。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:129的核苷酸1至45编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:129的核苷酸46至1029。在另一个方面，基于预测SEQID NO:131的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:131的核苷酸55至1110。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:133的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:133的核苷酸58至1100。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:135的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQID NO:135的核苷酸55至1036。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:137的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:137的核苷酸58至1022。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:139的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:139的核苷酸64至1032。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:141的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:141的核苷酸58至1054。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:143的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:143的核苷酸55至769。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:145的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:145的核苷酸52至1533。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:147的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:147的核苷酸61至918。在另一个方面，基于预测SEQ IDNO:149的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:149的核苷酸64至1089。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:151的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:151的核苷酸67至1002。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:153的核苷酸1至69编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQID NO:153的核苷酸70至1098。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:155的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:155的核苷酸61至1088。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:157的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:157的核苷酸64至1086。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:159的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:159的核苷酸58至756。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:161的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:161的核苷酸58至1032。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:163的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:163的核苷酸64至1041。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:165的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:165的核苷酸58至1026。在另一个方面，基于预测SEQID NO:167的核苷酸1至78编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:167的核苷酸79至762。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:408的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:408的核苷酸67至881。在另一个方面，基于预测SEQ ID NO:410的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQID NO:410的核苷酸67至882。术语“成熟多肽编码序列”在此应理解为包括基因组DNA序列的cDNA序列或cDNA序列的基因组DNA序列。

中严谨度条件：术语“中严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。

中-高严谨度条件：术语“高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹(Southern blotting)程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。

突变体：术语“突变体”意指编码一种变体的多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包括一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指一种配置，其中一个控制序列相对于一种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指引编码序列的表达。

亲本或亲本GH61多肽：术语“亲本”或“亲本GH61多肽”是指一种GH61多肽，在一个或多个(例如若干个)位置对其进行改变，即取代、插入、和/或缺失，以产生本发明的GH61多肽变体。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。

具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指通过具有纤维素分解活性的酶，即，纤维素酶催化纤维素材料的增强的水解的GH61多肽或其变体。出于本发明的目的，通过在以下条件下测量来自由纤维素分解酶水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性：1-50mg的总蛋白/g的预处理的玉米秸秆(PCS)中的纤维素，其中总蛋白包括50-99.5％w/w纤维素分解酶蛋白和0.5-50％w/wGH61多肽的蛋白或其变体，在适合的温度(例如40℃-80℃，如50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃)和适合的pH(例如，4-9，如4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、或8.5)下持续1-7天，与不具有纤维素分解增强活性的相等的总蛋白负载的对照水解(1-50mg的纤维素分解蛋白/g的PCS中的纤维素)进行比较。在一个方面，GH61多肽增强活性使用以下来测量：在占总蛋白重量2％-3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014，在米曲霉中重组产生)或占总蛋白重量2％-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 02/095014中所述，在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载的存在下，

1.5L(诺维信公司，

丹麦)的混合物被用作纤维素分解活性的来源。

用于测定GH61多肽或其变体的纤维素分解增强活性的另一种测定是在40℃下将GH61多肽或变体与0.5％磷酸溶胀纤维素(PASC)、100mM乙酸钠(pH5)、1mM MnSO₄、0.1％没食子酸、0.025mg/ml的烟曲霉β-葡糖苷酶、以及0.01％

X100一起孵育24-96小时，然后测定从PASC释放的葡萄糖。

具有纤维素分解增强活性的GH61多肽或其变体通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.01倍，例如，至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解。

预处理的玉米秸杆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸杆”意指通过热和稀硫酸处理、碱预处理、中性预处理、或本领域已知的任何预处理从玉米秸杆得到的纤维素材料。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来测定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼和翁施，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

子序列:术语“子序列”意指从成熟多肽编码序列的5'和/或3'端缺失一个或多个(例如若干个)核苷酸的多核苷酸，其中该子序列编码具有纤维素分解增强活性的片段。在一个方面，一个子序列含有GH61多肽的成熟多肽编码序列的至少85％的核苷酸，例如至少90％的核苷酸或至少95％的核苷酸。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如若干个)位置上包含改变，即取代、插入、和/或缺失的具有纤维素分解增强活性的多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸替换不同的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。本发明的变体具有其亲本GH61多肽的纤维素分解增强活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。

非常高严谨度条件：术语“非常高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。

非常低严谨度条件：术语“非常低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。

野生型GH61多肽：术语“野生型”GH61多肽意指由微生物天然产生的GH61多肽，这些微生物如在自然界中发现的细菌、酵母、或丝状真菌。

含有木聚糖的材料：术语“含有木聚糖的材料”意指包含含有β-(1-4)连接的木糖残基主链的植物细胞壁多糖的任何材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-吡喃木糖主链的杂聚物，该主链由短的碳水化合物链分支。它们包括D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚、L-阿拉伯糖、和/或不同的低聚糖，这些低聚糖由D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖、以及D-葡萄糖构成。可以将木聚糖类型的多糖分成同源木聚糖(homoxylan)和异源木聚糖(heteroxylan)，包括葡糖醛酸木聚糖、(阿拉伯糖)葡糖醛酸木聚糖、(葡糖醛酸)阿糖基木聚糖、阿糖基木聚糖、以及复杂的异源木聚糖。参见例如，艾柏林格劳威(Ebringerova)等人，2005，聚合物科学进展(Adv.Polym.Sci.)186:1-67。

在本发明的方法中，可以使用含有木聚糖的任何材料。在一个优选方面，含有木聚糖的材料是木质纤维素。

木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含有木聚糖的材料的生物活性。用于测量木聚糖分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总木聚糖分解活性，以及(2)测量单独的木聚糖分解活性(例如木聚糖内切酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡糖醛酸酯酶)。木聚糖分解酶的测定的最近进展总结于若干出版物中，这些出版物包括别雷(Biely)和普查德(Puchard)，2006，食品与农业科学杂志(Journal of the Science ofFood and Agriculture)86(11):1636-1647；斯帕尼克娃(Spanikova)和别雷，2006，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)580(19):4597-4601；赫尔曼(Herrmann)等人，1997，生物化学杂志B(iochemical Journal)321:375-381。

总木聚糖降解活性可以通过测定由不同类型的木聚糖(包括例如燕麦(oatspelt)木聚糖、山毛榉木木聚糖、以及落叶松木木聚糖)形成的还原糖，或通过光度法测定从不同共价染色的木聚糖释放的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定基于由聚合4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生的还原糖，如描述于别雷，别雷，Poutanen(坡泰恩)，1992，Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity(用于木聚糖酶活性测定的多个实验室测试方法)，Journal of Biotechnology(生物技术杂志)23(3):257-270中。木聚糖酶活性还可以在37℃下在0.01％

X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来测定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下在200mM磷酸钠(pH6)中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白。

出于本发明的目的，通过测量在以下典型条件下由一种或多种木聚糖降解酶引起的桦木木聚糖(西格玛化学有限公司(Sigma Chemical Co.,Inc.)，美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO,USA))水解的增加来确定木聚糖降解活性：1ml的反应物，5mg/ml的底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白/g底物，50mM的醋酸钠(pH 5)，50℃，24小时，使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法的糖分析，如莱韦尔(Lever)，1972，分析生物化学(Anal.Biochem.)47：273-279中所述的。

木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。出于本发明的目的，在37℃下在0.01％

X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来测定木聚糖酶活性。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下在200mM磷酸钠(pH 6)中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白。

变体命名惯例

出于本发明的目的，使用在SEQ ID NO:30中披露的成熟多肽来确定另一个GH61多肽中相对应的氨基酸残基。将另一个GH61多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:30中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，可以使用如EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，遗传学趋势16:276-277)(优选5.0.0版或更高版本)的尼德尔程序中所实现的尼德尔曼-文施算法(尼德尔曼和文施，1970，分子生物学杂志48：443-453)来确定与SEQ ID NO:30中所披露的成熟多肽中任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。氨基酸位置的编号是基于SEQ ID NO:30的全长多肽(例如，包括信号肽)，其中位置1是信号肽的第一个氨基酸(即，Met)并且位置22是SEQ ID NO:30的His。

例如，与烟曲霉GH61多肽(SEQ ID NO:30)中的位置105相对应的位置是埃默森青霉(Penicillium emersonii)GH61多肽(SEQ ID NO:36)中的位置109、金黄色嗜热子囊菌GH61多肽(SEQ ID NO:14)中的位置105、以及棘孢曲霉GH61多肽(SEQ ID NO:68)中的位置103；与烟曲霉GH61多肽中的位置188相对应的位置是埃默森青霉GH61多肽中的位置192、金黄色嗜热子囊菌GH61多肽中的位置188、以及棘孢曲霉GH61多肽中的位置186；与烟曲霉GH61多肽的位置154相对应的位置是棘孢曲霉GH61多肽中的位置152；并且与烟曲霉GH61多肽中的位置189相对应的位置是埃默森青霉GH61多肽中的位置193以及棘孢曲霉GH61多肽中的位置187。

可以使用若干计算机程序通过多种多肽序列的比对来确定在另一种GH61多肽中的对应氨基酸残基的鉴定，这些计算机程序包括，但不限于：MUSCLE(multiple sequencecomparison by log-expectation(基于日志-期望值的多序列比较)；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(Nucleic Acids Research)32:1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新版本；卡托赫(Katoh)和库玛(Kuma)，2002，核酸研究，30:3059-3066；卡托赫等人，2005，核酸研究，33:511-518；卡托赫和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；卡托赫等人，2009，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)537:39-64；卡托赫和都，2010，生物信息学，26:1899-1900)，以及利用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更新版本；汤普森(Thompson)等人，1994，核酸研究)22:4673-4680)，使用它们各自的缺省参数。

当另一个GH61多肽与SEQ ID NO:30的成熟多肽分歧，这样使得传统的基于序列的比较无法检测出它们的关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛氟松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志295:613-615)，可以使用其他配对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲线)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过一个迭代数据库搜索过程来产生多个特征曲线并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序(例如GenTHREADER)(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志287:797-815；麦谷芬(McGuffi)和琼斯，2003，生物信息学19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST，二级结构预测、结构比对特征曲线、以及溶剂化可能性)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定这类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。使用多种算法(例如距离比对矩阵(赫尔姆(Holm)和桑德尔(Sander)，1998，蛋白杂志(Proteins)33:88-96)或者组合扩展(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程学11:739-747))可以比对两个或更多个蛋白结构，并且可以另外地利用这些算法的实施来随所感兴趣的结构查询结构数据库以便发现可能的结构同源物(例如，赫尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学16:566-567)。

在描述本发明的GH61多肽变体时，为了方便参照起见，采用了以下所述的命名法。使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或者“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处，甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代以及丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。

缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195*”或者“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或者“G195GK”。多重氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Glyl95GlyLysAla”或“G195GKA”。

在这类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：

<u>亲本：</u>	<u>变体：</u>
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

多个取代。包括多个取代的变体由加号标记(“+”)分隔，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表对应地在位置170和195处精氨酸和甘氨酸被酪氨酸和谷氨酸取代。

不同的取代。在可以在一个位置处引入不同取代时，不同取代由一个逗点分隔，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170处精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

发明详细说明

变体

在一个实施例中，该变体与亲本GH61多肽的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％的序列一致性。

在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％的序列一致性。

在一个方面，本发明的变体中的取代的数目是1-28个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27和28个取代。

在另一个方面，变体在对应于位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的两个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的三个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的四个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的五个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的六个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的七个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的八个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的九个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十一个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十二个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十三个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十四个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十五个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十六个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十七个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十八个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十九个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的二十个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的二十一个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的二十二个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的二十三个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的二十四个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的二十五个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的二十六个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的二十七个位置处包括取代。在另一个方面，变体在对应于位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的每一个位置处包括取代。

在另一个方面，变体包括在对应于位置26的位置处的取代或由其组成。在另一方面，对应于位置26的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ile取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代S26I或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置32的位置处的取代或由其组成。在另一方面，与位置32相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Glu或Ser取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代G32E或G32S或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置34的位置处的取代或由其组成。在另一方面，对应于位置34的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Phe取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代Y34F或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置40的位置处的取代或由其组成。在另一方面，对应于位置40的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ala取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代V40A或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置41的位置处的取代或由其组成。在另一方面，对应于位置41的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Thr取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代N41T或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置42的位置处的取代或由其组成。在另一方面，与位置42相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ile、Glu、或Val取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代Q42I、Q42E、或Q42V或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置47的位置处的取代或由其组成。在另一方面，与位置47相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Glu、Leu、或Arg取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代S47E、S47L、或S47R或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置56的位置处的取代或由其组成。在另一方面，与位置56相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Cys、Glu、或Thr取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代S56C、S56E、或S56T或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置72的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置72的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选是被Gln、或Thr取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代S72Q或S72T或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置102的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置102的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选是被Lys或Pro取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代T102K或T102P或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置123的位置处的取代或由其组成。在另一方面，对应于位置123的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Arg取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代A123R或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置138的位置处的取代或由其组成。在另一方面，与位置138相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Cys、Glu、Gly、Lys、Leu、或Met取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代Q138C、Q138E、Q138G、Q138K、Q138L、或Q138M或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置149的位置处的取代或由其组成。在另一方面，对应于位置149的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ile取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代V149I或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置152的位置处的取代或由其组成。在另一方面，对应于位置152的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ser取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代D152S或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置163的位置处的取代或由其组成。在另一方面，与位置163相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Glu、Phe、或Val取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代T163E、T163F、或T163V或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置164的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置164相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Cys或Leu取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代V164C或V164L或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置166的位置处的取代或由其组成。在另一方面，对应于位置166的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Leu取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I166L或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置169的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置169相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Arg或Cys取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代S169R或S169C或由其组成。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:36的成熟多肽的取代S173C或由其组成。青霉属物种(埃默森青霉)GH61成熟多肽中对应于烟曲霉GH61成熟多肽中的位置169的位置是位置173。

在另一个方面，变体包括在对应于位置186的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置186相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Phe、Lys、Thr、或Tyr取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代S186F、S186K、S186T、或S186Y或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置200的位置处的取代或由其组成。在另一方面，与位置200相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ile、或Val取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代F200I或F200V或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置207的位置处的取代或由其组成。在另一方面，对应于位置207的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Pro取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代G207P或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置213的位置处的取代或由其组成。在另一方面，对应于位置213的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Glu取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代S213E或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置219的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置219的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选是被Glu、Met、Gln、或Cys取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代S219E、S219M、S219Q、或S219C或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置222的位置处的取代或由其组成。在另一方面，对应于位置222的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Arg取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代K222R或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置234的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置234相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Gly或Lys取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代S234G或S234K或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置246的位置处的取代或由其组成。在另一方面，对应于位置246的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Pro取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代A246P或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置249的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，与位置249相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Gln、Arg或Cys取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代N249Q、N249R、或N249C或由其组成。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:36的成熟多肽的取代F253C或由其组成。青霉属物种(埃默森青霉)GH61成熟多肽中对应于烟曲霉GH61成熟多肽中的位置249的位置是位置253。

在另一个方面，变体包括在对应于位置250的位置处的取代或由其组成。在另一方面，对应于位置250的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Cys取代。在另一方面，变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代A250C或由其组成。

另一方面，在此描述的其他GH61多肽中，变体包括在与SEQ ID NO:30的成熟多肽相对应的位置处的一个或多个(例如若干个)取代或由其组成，这个或这些取代选自下组，该组由以下各项组成：S26I、G32E,S、Y34F、V40A、N41T、Q42I,E,V、S47E,L,R、S56C,E,T、S72Q,T、T102K,P、A123R、Q138C,E,G,K,L,M、V149I、D152S、T163E,F,V、V164C,L、I166L、S169R,C、S186F,K,T,Y、F200I,V、G207P、S213E、S219E,M,Q,C、K222R、S234G,K、A246P、N249Q,R,C、以及A250C；或包括选自下组的一个或多个(例如，若干个)取代或由其组成，该组由以下各项组成：S26I、G32E,S、Y34F、V40A、N41T、Q42I,E,V、S47E,L,R、S56C,E,T、S72Q,T、T102K,P、A123R、Q138C,E,G,K,L,M、V149I、D152S、T163E,F,V、V164C,L、I166L、S169R,C、S186F,K,T,Y、F200I,V、G207P、S213E、S219E,M,Q,C、K222R、S234G,K、A246P、N249Q,R,C、以及A250C。

在以下各方面中，在此描述的其他GH61多肽中，变体包含在与SEQ ID NO:30相对应的位置处的一个或多个(例如若干个)以下描述的取代，或由其组成。

在另一方面，变体包括SEQ ID NO:36的成熟多肽的取代S173C+F253C或由其组成。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+Q138K+K229W，或由其组成。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+S47E+K229W，或由其组成。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+S56A+K229W，或由其组成。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+T102K+K229W，或由其组成。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+S186T+K229W，或由其组成。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+K229W+S234G，或由其组成。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+T102K+E105K+K229W，或由其组成。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+Q138K+G188F+K229W，或由其组成。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+Q138K+V149I+G188F+K229W，或由其组成。在另一个方面，变体包含SEQ IDNO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+S169C+G188F+K229W+A250C，或由其组成。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+S72T+Q138K+V149I+G188F+K229W，或由其组成。在另一个方面，变体包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+Q138K+V149I+G188F+G207P+K229W，或由其组成。

这些变体可以进一步包含在一个或多个(例如，若干个)其他位置处的一个或多个另外的改变，例如，取代、插入、或缺失。

这些氨基酸变化可以具有微小性质，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代或者插入；典型地1至30个氨基酸的小缺失；小氨基或羧基末端扩展，如氨基末端甲硫氨酸残基；高达20至25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一种功能来促进纯化的小扩展，如一个多组氨酸束(tract)、一个抗原表位或者一个结合结构域。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。总体上不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且例如由H.诺伊拉特(H.Neurath)和R.L.希尔(R.L.Hill)1979年描述于蛋白质(TheProteins)中，学术出版社(Academic Press)，纽约。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质:改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。

本发明的变体可以进一步或甚至进一步包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置111、152、155、以及162相对应的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代，其中这些变体具有纤维水解酶活性(WO 2012/044835)。

在一个方面，本发明的变体中上述另外的取代的数目是1-4个，如1、2、3、或4个取代。

在另一个方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置111、152、155、以及162相对应的一个或多个(例如若干个)位置处的取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置111、152、155、以及162中的任何相对应的两个位置处的取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置111、152、155、以及162中的任何相对应的三个位置处的取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置111、152、155、以及162相对应的每个位置处的取代。

在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置111相对应的位置处的取代。在另一方面，对应于位置111的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Val取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V。

在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置152相对应的位置处的取代。在另一方面，对应于位置152的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ser取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代D152S。

在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置155相对应的位置处的取代。在另一方面，对应于位置155的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Leu取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代M155L。

在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置162相对应的位置处的取代。在另一方面，对应于位置162的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Trp取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代A162W。

在另一个方面，在此描述的其他GH61多肽中，变体进一步或甚至进一步包含一个或多个(例如若干个)取代，这个或这些取代选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:30的成熟多肽的L111V、D152S、M155L、以及A162W；或选自下组的一个或多个(例如若干个)取代，该组由以下各项组成：在相对应于SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置处的L111V、D152S、M155L、以及A162W。

本发明的变体可以进一步或甚至进一步包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置96、98、200、202、以及204相对应的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代，其中这些变体具有纤维素分解增强活性(WO 2012/044836)。

在一个方面，本发明的变体中上述另外的取代的数目是1-5个，如1、2、3、4、或5个取代。

在另一个方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置96、98、200、202、以及204相对应的一个或多个(例如若干个)位置处的取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置96、98、200、202、以及204中的任何相对应的两个位置处的取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置96、98、200、202、以及204中的任何相对应的三个位置处的取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置96、98、200、202、以及204中的任何相对应的四个位置处的取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置96、98、200、202、以及204相对应的每个位置处的取代。

在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置96相对应的位置处的取代。在另一方面，对应于位置96的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Val取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I96V。

在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置98相对应的位置处的取代。在另一方面，对应于位置98的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Leu取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代F98L。

在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置200相对应的位置处的取代。在另一方面，对应于位置200的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ile取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代F200I。

在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置202相对应的位置处的取代。在另一方面，对应于位置202的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Leu取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I202L。

在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置204相对应的位置处的取代。在另一方面，对应于位置204的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Val取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代I204V。

在另一个方面，在此描述的其他GH61多肽中，变体进一步或甚至进一步包含在与SEQ ID NO:30相对应的位置处的选自下组的一个或多个(例如若干个)取代，该组由以下各项组成的：I96V、F98L、F200I、I202L、以及I204V；或选自下组的一个或多个(例如若干个)取代，该组由以下各项组成的：I96V、F98L、F200I、I202L、以及I204V。

本发明的变体可以进一步或甚至进一步包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代，其中这些变体具有纤维素分解增强活性。

在一个方面，本发明的变体中上述另外的取代的数目是1-6个，如1、2、3、4、5、或6个取代。

在另一个方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个(例如若干个)位置处的取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置105、154、188、189、216、以及229中的任何相对应的两个位置处的取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置105、154、188、189、216、以及229中的任何相对应的三个位置处的取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置105、154、188、189、216、以及229中的任何相对应的四个位置处的取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置105、154、188、189、216、以及229中的任何相对应的五个位置处的取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置105、154、188、189、216、以及229相对应的每个位置处的取代。

在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置105相对应的位置处的取代。在另一个方面，与位置105相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Pro或Lys取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E105P或E105K。

在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置154相对应的位置处的取代。在另一方面，对应于位置154的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Leu取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代E154L。

在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置188相对应的位置处的取代。在另一方面，与位置188相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ala或Trp取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代G188A或G188W。

在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置189相对应的位置处的取代。在另一方面，对应于位置189的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Lys取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代N189K。

在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置216相对应的位置处的取代。在另一个方面，与位置216相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Leu或Tyr取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代A216L或A216Y。

在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含在与位置229相对应的位置处的取代。在另一个方面，与位置229相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Trp、His、Ile或Tyr取代。在另一方面，变体进一步或甚至进一步包含SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代A229W、A229H、A229I、或A229Y。

在另一个方面，在此描述的其他GH61多肽中，变体进一步或甚至进一步包含选自下组的一个或多个(例如若干个)取代，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:30的成熟多肽的E105P,K、E154L、G188A,W、N189K、A216L,Y、以及A229W,H,I,Y，或选自下组的一个或多个(例如若干个)取代，该组由以下各项组成：在与SEQ ID NO:30的成熟多肽相对应的位置处的E105P,K、E154L、G188A,W、N189K、A216L,Y、以及A229W,H,I,Y。

这些变体可以由相对应的亲本GH61多肽的成熟多肽的至少85％的氨基酸残基，例如至少90％的氨基酸残基或至少95％的氨基酸残基组成。

可以根据本领域已知的程序来鉴定多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁安(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一技术中，在分子中的每个残基中引入单个丙氨酸突变，并且针对纤维素分解增强活性测试所得突变分子，以鉴定对于该分子的活性关键的氨基酸残基。还参见希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例如德福斯(de Vos)等人，科学255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；沃勒达尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴别必需氨基酸。GH61多肽中的必需氨基酸与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置22、107、194、和/或196相对应。

在一个实施例中，与其亲本GH61多肽相比，变体具有增加的热稳定性。

在一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.0和95℃下测定。

在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH3.5和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 3.5和95℃下测定。

在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.0和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.0和95℃下测定。

在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH4.5和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 4.5和95℃下测定。

在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.0和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.0和95℃下测定。

在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH5.5和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 5.5和95℃下测定。

在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.0和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.0和95℃下测定。

在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH6.5和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 6.5和95℃下测定。

在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.0和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.0和95℃下测定。

在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH7.5和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 7.5和95℃下测定。

在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.0和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.0和95℃下测定。

在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.5和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.5和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.5和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.5和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.5和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.5和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.5和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.5和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.5和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.5和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.5和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH8.5和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.5和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 8.5和95℃下测定。

在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 9.0和45℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 9.0和50℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 9.0和55℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 9.0和60℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 9.0和62℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 9.0和65℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 9.0和68℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 9.0和70℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 9.0和72℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 9.0和75℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 9.0和80℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH9.0和85℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 9.0和90℃下测定。在另一个方面，变体相对于亲本的热稳定性在pH 9.0和95℃下测定。

在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育1分钟来测定。在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育5分钟来测定。在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育10分钟来测定。在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育15分钟来测定。在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育20分钟来测定。在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育25分钟来测定。在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育30分钟来测定。在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育45分钟来测定。在以上各方面中，变体相对于亲本的热稳定性可以通过将该变体和该亲本孵育60分钟来测定。也可以使用比60分钟更长的时间段。

在一个方面，与亲本相比，具有纤维素分解增强活性的变体的热稳定性增加至少1.01倍，例如至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少50倍、至少75倍、或至少100倍，更加热稳定。

亲本GH61多肽

亲本GH61多肽可以是具有纤维素分解增强活性的任何GH61多肽。

亲本GH61多肽可以是(a)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽具有至少60％的序列一致性的一种多肽；(b)由多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在至少低严谨度条件下与以下各项杂交：(i)SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体；或(c)由与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码的一种多肽。

在一个方面，该亲本与具有纤维素分解增强活性的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在一个实施例中，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽有至多10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的不同。

在另一个实施例中，该亲本包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的氨基酸序列或由其组成。

在另一个实施例中，该亲本包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽，或由其组成。

在另一个实施例中，该亲本是含有GH61多肽的成熟多肽的至少85％的氨基酸残基，例如至少90％的氨基酸残基或至少95％的氨基酸残基的片段。

在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽的等位变体。

在另一个方面，该亲本由在非常低严谨度条件下、低严谨度条件下、中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下与以下杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410的成熟多肽编码序列、或其全长互补体(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆(Molecular Cloning)实验室手册(A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港(Cold SpringHarbor)，纽约(New York))。

SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410的多核苷酸、或其子序列，以及SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的多肽、或其片段可以用来设计核酸探针，以根据本领域中熟知的方法鉴定和克隆对来自不同属或种的菌株的亲本进行编码的DNA。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别和分离其中的对应基因。这样的探针可以大大短于整个序列，但是长度应该为至少15个，例如至少25个、至少35个或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针都可使用。典型地将探针进行标记，用于检测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白)。本发明涵盖此类探针。

可以针对与上文所述的探针杂交并编码一个亲本的DNA，来筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410、或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。

出于本发明的目的，杂交指示多核苷酸在极低至非常高严谨度条件下与对应于以下各项的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410；(ii)其成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列。在这些条件下与该核酸探针杂交的分子可以使用例如X射线薄膜或本领域中已知的任何其他检测手段进行检测。

在一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410的成熟多肽编码序列。

在另一个实施例中，该核酸探针是编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的多肽；其成熟多肽；或其片段的多核苷酸。

在另一个实施例中，该核酸探针是SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410。

在另一个方面中，该亲本由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

该亲本可以是其中一个多肽的一个区域融合在另一个多肽的一个区域的N-末端或C-末端的一种杂交多肽。

该亲本可以是一种融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一个多肽融合在本发明的多肽的N末端或C末端。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学266:776-779)。

融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森(Rasmussen)-威尔逊(Wilson)等人，1997，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；华德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯(Collins)-莱斯(Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能和遗传学(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。

该亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个实施例中，该亲本是胞外分泌的。

该亲本可以是一种细菌GH61多肽。例如，亲本可以是革兰氏阳性菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)GH61多肽，或是革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺旋杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、或脲原体属(Ureaplasma)GH61多肽。

在一个实施例中，亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)GH61多肽。

该亲本可以是一种真菌GH61多肽。例如，该亲本可以是一种酵母GH61多肽，如假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属或耶氏酵母属(Yarrowia)GH61多肽；或一种丝状真菌GH61多肽，如一种枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、家白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属、隐丛赤壳属(Cryphonectria)、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢菌属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小球腔菌属(Leptospaeria)、稻瘟菌属、马兰诺菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉属、裂褶菌属、柱霉属(Scytalidium)、踝节菌属、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳菌属、弯颈霉菌、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属或炭角菌属GH61多肽。

在另一个实施例中，该亲本是一种卡尔斯伯酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母或卵形酵母GH61多肽。

在另一个实施例中，该亲本是一种解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、迟缓曲霉(Aspergillus lentulus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、因奥普斯金孢子菌属(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、莫达瑞姆金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带多金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、雪白芬尼菌(Fennellia nivea)、杆孢状镰孢菌(Fusariumbactridioides)、谷类镰孢菌、库威镰孢菌(Fusarium crookwellense)、黄色镰孢菌、禾谷镰孢菌、禾赤镰孢菌(Fusarium graminum)、异孢镰孢菌、合欢木镰孢菌、尖孢镰孢菌、多枝镰孢菌、粉红镰孢菌、接骨木镰孢菌、肤色镰孢菌、拟分枝孢镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢菌(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌、灰腐质霉、特异腐质霉、柔毛腐质霉、白囊耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、埃默森青霉菌、绳状青霉、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、Talaromyces leycettanus、金黄色嗜热子囊菌、无色梭孢壳菌(Thielavia achromatica)、阿波梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳菌(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳菌(Thielavia australeinsis)、菲美蒂梭孢壳菌(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳菌(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳菌(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳菌(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳菌(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳菌(Thielaviaspededonium)、亚嗜热梭孢壳菌(Thielavia subthermophila)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉、康氏木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉GH61多肽。

将理解的是，对于上述种类而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态两者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而无论已知的它们的种类名称如何。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些物种的株系可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可从其他来源鉴别并得到亲本，这些来源包括使用上述探针从大自然(例如土壤、堆肥、水等)中分离的微生物或从天然物质(例如土壤、堆肥、水等)中直接得到的DNA样本。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样本的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测了编码一种亲本的一种多核苷酸后，可以将多核苷酸通过利用本领域普通技术人员已知的技术来分离或克隆(参见例如萨姆布鲁克等人，1989，同上)。

变体的制备

本发明还涉及用于获得具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的方法，这些方法包括：(a)在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249、以及250相对应的一个或多个(例如若干个)位置处将取代引入亲本GH61多肽，其中该变体具有纤维素分解增强活性；以及(b)回收该变体。在一个方面，这些方法进一步或甚至更进一步包含在与SEQID NO:30的成熟多肽的位置111、152、155、以及162相对应的一个或多个(例如若干个)位置处将取代引入亲本GH61多肽，其中该变体具有纤维素分解增强活性。在另一个方面，这些方法进一步或甚至更进一步包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置96、98、200、202、以及204相对应的一个或多个(例如若干个)位置处将取代引入亲本GH61多肽，其中该变体具有纤维素分解增强活性。在另一个方面，这些方法进一步或甚至更进一步包含在与SEQ IDNO:30的成熟多肽的位置105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个(例如若干个)位置处将取代引入亲本GH61多肽，其中该变体具有纤维素分解增强活性。

可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。

定点诱变是一种技术，其中在编码亲本的多核苷酸中的一个或更多个定义的位点上引入一个或更多个(例如若干个)突变。在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。

通过涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的使用的PCR可以体外实现定点诱变。还可以通过以下方式在体外进行定点诱变：涉及由一种限制性内切酶在包含编码该亲本的多核苷酸的质粒的一个位点处进行切割的盒式诱变，并且随后连接一种包含该多核苷酸中的突变的寡核苷酸。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制性内切酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如谢雷尔(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究，18:7349-4966。

还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如美国专利申请公开号2004/0171154；斯托西(Storici)等人，2001，自然生物技术19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及卡利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学通讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。

位点饱和诱变在一个或多个(例如，若干个)特定位置处将多肽编码序列系统性地替代为编码全部19个氨基酸的序列(帕里克(Parikh)和松村(Matsumura)，2005，分子生物学杂志352:621-628)。

合成基因构建需要体外合成一种设计的多核苷酸分子以编码一种所感兴趣的多肽。可以利用多种技术进行基因合成，例如由田(Tian)等人(2004，自然(Nature)432:1050-1054)描述的基于多重微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流体芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson(瑞德哈尔-奥尔森)和Sauer(萨奥尔)，1988，科学241:53-57；Bowie(鲍依)和萨奥尔，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)86:2152-2156；WO 95/17413；或者WO 95/22625所描述的那些。可以使用的其他方法包括：易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比希尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯等人，1999，自然生物技术17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的一个过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的GH61多肽变体的分离的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包含编码本发明的GH61多肽变体的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列上，该一个或多个控制序列在合适的宿主细胞中在与该控制序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用多种方式操纵该多核苷酸，以提供GH61多肽变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的变体的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子含有介导GH61多肽变体的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

在细菌宿主细胞中，适合指导本发明的核酸构建体转录的启动子的实例是获得自以下各项的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖斯(Agaisse)和里瑞克拉斯(Lereclus)，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因)69:301-315)，天蓝色链霉菌琼脂酶基因(dagA)、和原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡玛诺夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊75:3727-3731)、连同tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。另外的启动子描述于“来自重组细菌的有用蛋白(Useful proteins from recombinant bacteria)”，吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)，242:74-94；以及萨姆布鲁克等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。

在丝状真菌宿主细胞中，适合指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下各项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶–样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢菌Daria(达莉亚)(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(奎恩)(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶I、里氏木霉葡聚糖内切酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶III、里氏木霉葡聚糖内切酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、里氏木霉翻译延长因子，连同NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中非翻译前导子已经用来自一种曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的非翻译前导子替换；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中非翻译前导子已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的非翻译前导子替换)；及其突变型、截短型、和杂交型启动子。其他启动子描述于美国专利号6,011,147中。

在一个酵母宿主中，有用的启动子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接至编码该GH61多肽变体的多核苷酸的3’末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。

用于细菌宿主细胞的优选终止子获得自克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因。

用于丝状真菌宿主细胞的优选的终止子是从以下各项的基因中获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶–样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶I、里氏木霉葡聚糖内切酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶III、里氏木霉葡聚糖内切酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、和里氏木霉翻译延长因子。

酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸去氢酶。Romanos(罗马诺斯)等人，1992，同上，描述了酵母宿主细胞的其他有用的终止子。

该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是一个前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子可操作地连接至编码该GH61多肽变体的多核苷酸的5’末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导子。

丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从以下各项的基因中获得的：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

酵母宿主细胞的适合的前导子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3磷酸去氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，其是可操作地连接至GH61多肽变体编码序列的3’末端的序列，并且在转录时，被宿主细胞识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA上的信号。在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可以使用。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

可用于酵母宿主细胞的聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中有过描述。

控制序列还可以是信号肽编码区，其编码连接至GH61多肽变体的N末端的信号肽，并且指导该变体进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列的5’末端可以固有地含有信号肽编码序列，该信号肽编码序列与编码该变体的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。可替代地，编码序列的5’端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增加变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB 11837麦芽淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对酵母宿主细胞有用的信号肽是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，同上，描述了其他有用的信号肽编码序列。

控制序列还可以是前肽编码序列，其编码位于GH61多肽变体N末端的前肽。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽和前肽序列二者均存在的情况下，前肽序列的位置紧接着GH61多肽变体的N末端，并且信号肽序列的位置紧接着前肽序列的N末端。

还可能希望添加调节序列，其相对于宿主细胞的生长来调节GH61多肽变体的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。在原核系统中的调节序列包括lac、tac、以及trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子、和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将可操作地连接至该调节序列。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，该重组表达载体包含编码本发明的GH61多肽变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生表达载体时，编码序列是位于该载体中，以使得该编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。

该载体可以是一种自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，该载体的复制与染色体复制无关，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。

细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不局限于adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。优选在木霉细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph、和pyrG基因。

选择性标记可以是在WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

为了整合到宿主细胞基因组中，载体可以依赖编码GH61多肽变体的多核苷酸序列或载体的用于通过同源或非同源重组整合到基因组中的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”是指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。

细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems(格姆斯)等人，1991，Gene(基因)98:61-67；Cullen(卡伦)等人，1987，Nucleic Acids Res.(核酸研究)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO00/24883披露的方法完成。

可以将一个以上拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中，以增加GH61多肽变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸的可扩增的选择性标记基因可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其中通过在适当选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通技术人员而言是熟知的(参见，例如萨拉布鲁克等人，1989，同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的GH61多肽变体的多核苷酸，其可操作地连接至指导本发明变体的产生的一个或多个控制序列。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在GH61多肽变体的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺旋杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单孢菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌的细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌的细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属的细胞，包括但不限于似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种的细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不局限于不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌以及变铅青链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学Gen.Genet.(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔等人，1988，核酸研究16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如贡(Gong)等人，2004，Folia微生物学(Folia Microbiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用环境微生物学71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用环境微生物学65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用，“真菌”包括子囊菌门、担子菌门、壶菌门以及接合菌门连同卵菌门和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi(安斯沃思和拜斯比真菌词典)，第8版，1995，CAB International(国际应用生物科学中心)，University Press(大学出版社)，英国剑桥中进行定义的)。

该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用，“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母以及属于半知菌类(芽生菌)的酵母。由于酵母的分类未来可能改变，故出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast(酵母生物学与活性)(斯金纳(Skinner)，帕斯莫(Passmore)及达文波特(Davenport)编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium(应用细菌学学会)，第9辑，1980)中所描述进行定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母、汉逊酵母、克鲁维酵母菌、毕赤酵母、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔斯伯酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁维酵母酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞菌属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰刀菌属、腐质霉属、稻瘟菌属、毛霉菌属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、白腐菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳菌属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属的细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛云芝菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射纹革菌、杏鲍菇、埃默森篮状菌、土生梭孢壳、长绒毛栓菌、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉的细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉和木霉宿主细胞的合适程序描述于EP238023，Yelton(约尔顿)等人，1984，美国国家科学院院刊81:1470-1474，以及Christensen(克里斯滕森)等人，1988，Bio/Technology(生物/技术)6:1419-1422中。Malardier(马拉迪耶)等人，1989，Gene(基因)78:147-156和WO96/00787描述了用于转化镰刀菌物种的合适方法。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及伊嫩(Hinnen)等人，1978，美国科学院院刊75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生一种GH61多肽变体的方法，这些方法包括：(a)在有益于产生该变体的条件下培养本发明的重组宿主细胞；并且可任选地(b)回收该变体。

使用本领域中已知的方法在适合于产生该GH61多肽变体的营养培养基中培养该宿主细胞。例如，可以通过多孔板(例如，24、48、或96孔板)、摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。合适的培养基从商业供应商处可获得，或者可根据公开的组成(例如，在美国模式培养物保藏所目录中)来制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。

可以使用本领域中已知的对于该变体是特异性的方法来检测该GH61多肽变体。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定该变体的活性。用于测定GH61蛋白的一种特异性测定是在40℃下将GH61多肽变体与0.5％磷酸溶胀纤维素(PASC)、100mM乙酸钠(pH 5)、1mM MnSO₄、0.1％没食子酸、0.025mg/ml的烟曲霉β-葡糖苷酶、以及0.01％

X100一起孵育24-96小时，然后通过测定这个反应从而确定从PASC释放的葡萄糖。参见，在实例5中所描述的测定。

GH61多肽变体可以使用本领域中已知的方法回收。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。在一方面，回收了包含本发明的变体的全发酵液。

可以通过本领域已知的多种程序来纯化GH61多肽变体，以获得基本上纯的变体，这些程序包括，但不局限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如蛋白纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。

在一个替代方面，不回收GH61多肽变体，而是使用表达该变体的本发明的宿主细胞作为该变体的来源。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包含本发明的变体的一种发酵液配制品或一种细胞组合物。发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的变体的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生该变体)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀死的细胞和/或细胞碎片、以及培养基的细胞杀死全培养液。

如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养株在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞的酶表达)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳受限的条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包括在例如通过离心除去微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)后存在的耗尽的培养基和细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含耗尽的细胞培养基、胞外酶、以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括一种第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及一种第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物。

在一方面，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步包含杀死的细胞和/或细胞碎片。一个实施例中，从细胞杀死全培养液中去除这些杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含一种防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨糖醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。

发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含多种酶活性，例如一种或多种(例如若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、扩张蛋白、漆酶、木质素分解酶、果胶酶(pectinase)、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀素(swollenin)。发酵液配制品或细胞组合物还可以包含一种或多种(例如若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂合酶、氧化还原酶、或一种转移酶，例如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、甲壳酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、葡聚糖内切酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶(pectinolytic enzyme)、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

细胞杀死全培养液或组合物可以含有在发酵结束时衍生的发酵材料的未分级的内容物。典型地，细胞杀死全培养液或组合物含有微生物细胞(例如丝状真菌细胞)生长至饱和或存在的耗尽的培养基，在限碳条件下孵育以允许蛋白合成(例如表达纤维素酶和/或一种或多种葡糖苷酶)。在一些实施例中，细胞杀死全培养液或组合物含有耗尽的细胞培养基、胞外酶、和杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知方法来使细胞杀死全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶组分，例如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和或一种或多种不溶的酶。在一些实施例中，可以除去不溶组分以提供澄清的液体组合物。

可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。

以下给出了本发明的组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。

酶组合物

本发明还涉及包含本发明的一种变体的组合物。优选地，这些组合物富集这种变体。术语“富集”表明该组合物的纤维素分解增强活性，例如，增加了以至少1.1的富集因子。

这些组合物可以包含本发明的一种变体作为主要酶组分，例如一种单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包含多种酶活性，例如一种或多种(例如若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、半纤维素酶、GH61多肽、酯酶、扩张蛋白、漆酶、木质素分解酶、果胶酶(pectinase)、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀素(swollenin)。这些组合物还可以包括一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。

下面给出了本发明的组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。

用途

本发明还针对使用具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体、或其组合物的以下方法。

本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：在本发明的GH61多肽变体的存在下，用酶组合物处理该纤维素材料。在一个方面，这些方法进一步包括回收降解的或转化的纤维素材料。该纤维素材料的降解或转化的可溶性产物可以使用本领域中已知的方法与不溶性纤维素材料分离，例如像离心、过滤、或重力沉降。

本发明的方法可以用于将纤维素材料糖化为可发酵糖，并且将可发酵糖转化为多种有用的发酵产物，例如燃料(乙醇、正丁醇、异丁醇、生物柴油、喷气燃料)和/或平台化合物(例如酸、醇、酮、气体、油、等)。从纤维素材料产生希望的发酵产物典型地涉及预处理、酶水解(糖化)、和发酵。

根据本发明的纤维素材料的加工可以使用本领域常规的方法来完成。此外，本发明的方法可以使用被配置成根据本发明来操作的任何常规生物质加工设备来实施。

分开或同时的水解(糖化)和发酵包括但不限于：分开水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、杂合的水解和发酵(HHF)、分开水解和共发酵(SHCF)、杂合的水解和共发酵(HHCF)，以及直接微生物转化(DMC)，有时还被称为合并的生物加工(CBP)。SHF使用分开的处理步骤，以首先将纤维素材料酶促水解为可发酵糖(例如，葡萄糖、纤维二糖、以及戊糖单体)，并且然后将可发酵糖发酵为乙醇。在SSF中，将纤维素材料的酶水解和糖向乙醇的发酵合并在一个步骤中(Philippidis(菲利皮迪斯)，G.P.,1996,Cellulose bioconversion technology(纤维素生物转化技术)，在Handbook onBioethanol:Production and Utilization(生物乙醇：生产与利用手册)中，Wyman(怀曼)，C.E.,编辑，Taylor(泰勒)&Francis(弗朗西斯)，华盛顿特区，179-212)。SSCF涉及多种糖的共发酵(希恩(Sheehan)和希默尔(Himmel)，1999，生物技术进展(Biotechnol.Prog.)15:817-827)。HHF涉及一个分开的水解步骤，并且另外涉及一个同时糖化和水解步骤，这些步骤可以在同一反应器中进行。在HHF过程中的步骤可以在不同温度下进行，即高温酶促糖化，随后是在发酵菌株可以忍受的较低温度下的SSF。DMC在一个或多个(例如，若干个)步骤中合并了所有的三个过程(酶生产、水解、和发酵)，其中使用相同的生物生产用于将纤维素材料转化为可发酵糖的酶并且用于将可发酵糖转化为终产物的酶(Lynd(林德)等人，2002，Microbiol.Mol.Biol.Reviews(微生物学与分子生物学评论)66:506-577)。在此应理解的是，本领域中已知的包括预处理、酶水解(糖化)、发酵、或其组合的任何方法，可以用于实施本发明的方法。

常规的装置可以包括一个分批补料搅拌反应器、一个批式搅拌反应器、一个具有超滤作用的连续流搅拌反应器、和/或一个连续活塞流柱式反应器(continuous plug-flowcolumn reactor)(德卡斯特胡斯克拉兹(de Castilhos Corazza)等人，2003，技术学报(Acta Scientiarum.Technology)25:33-38；古萨考瓦(Gusakov)和斯尼特森(Sinitsyn)，1985，酶学与微生物学技术(Enz.Microb.Technol.)7:346-352)、一个碾磨反应器(刘(Ryu)和李(Lee)，1983，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)25:53-65)。另外的反应器类型包括：用于水解和/或发酵的流化床反应器、升流层(upflow blanket)反应器、固定化反应器、以及挤出机型反应器。

预处理。在实践本发明的工艺中，可以使用本领域中已知的任何预处理工艺来破坏纤维素材料的植物细胞壁组分(钱德拉(Chandra)等人，2007，生化工程/生物技术进展(Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.)108:67-93；盖尔贝(Galbe)和赛琪(Zacchi)，2007，生化工程/生物技术进展，108:41-65；亨德里克斯(Hendriks)和塞曼(Zeeman)，2009，生物资源技术(Bioresource Technol.)100:10-18；莫西尔(Mosier)等人，2005，生物资源技术96:673-686；泰和拉德(Taherzadeh)和卡里米(Karimi)，2008，分子科学国际杂志(Int.J.ofMol.Sci.)9:1621-1651；杨(Yang)和怀曼，2008，生物燃料，生物产品和生物精制Biofpr.(Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.)2:26-40)。

在使用本领域已知的方法进行预处理之前，纤维素材料还可以经受颗粒尺寸减缩、筛分、预浸泡、湿润、洗涤和/或调理。

常规预处理包括但不局限于蒸汽预处理(用或不用爆发)、稀酸预处理、热水预处理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆发、氨纤维爆发、有机溶剂预处理、和生物预处理。另外的预处理包括氨渗透、超声、电穿孔、微波、超临界CO₂、超临界H₂O、臭氧、离子液体、和γ辐射预处理。

可以在水解和/或发酵前预处理纤维素材料。优选在水解前进行预处理。可替代地，可以同时用酶水解进行预处理，以释放可发酵糖，例如葡萄糖、木糖、和/或纤维二糖。在多数情况下，预处理步骤自身导致将生物质转化为可发酵糖(即使在没有酶的情况下)。

蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁组分，包括木质素、半纤维素、和纤维素以使纤维素和其他级分，例如半纤维素可接近酶。纤维素材料经过或穿过反应容器，将蒸汽注入该反应容器以增加温度至所需温度和压力，并且将蒸汽保持在其中持续希望的反应时间。优选在140℃-250℃，例如160℃-200℃或170℃-190℃进行蒸汽预处理，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的任选添加。蒸汽预处理的停留时间优选是1-60分钟，例如1-30分钟、1-20分钟、3-12分钟、或4-10分钟，其中最适停留时间取决于温度和化学催化剂的任选添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，这样使得纤维素材料在预处理过程中通常仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的爆发放料(explosive discharge)合并，这被称为蒸汽爆发，即，快速急骤蒸发至大气压和材料的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff(迪福)和Murray(默里)，1996，生物资源技术855:1-33；盖尔贝和赛琪，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.(应用微生物学与生物技术)59:618-628；美国专利申请号2002/0164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基被裂解，并且所得到的酸自催化半纤维素部分水解成单糖和寡糖。仅在有限的程度上去除木质素。

化学预处理：术语“化学处理”是指能促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。这种预处理可以将结晶纤维素转化为无定形纤维素。适合的化学预处理工艺的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿法氧化、氨纤维/冷冻膨胀(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子液体、以及有机溶剂预处理。

经常在蒸汽预处理之前添加一种化学催化剂(例如H₂SO₄或SO₂)(典型地是0.3至5％w/w)，该催化剂减少时间并降低温度、增加回收率、并改进酶水解(Ballesteros(巴列斯特罗斯)等人，2006，应用生物化学与生物技术129-132:496-508；Varga(瓦尔加)等人，2004，应用生物化学与生物技术113-116:509-523；Sassner(塞斯尼尔)等人，2006，EnzymeMicrob.Technol.(酶与微生物技术)39:756-762)。在稀酸预处理中，纤维素材料与稀酸(典型地是H₂SO₄)和水混合，以形成浆料，由蒸汽加热至希望的温度，并且在停留时间后急骤蒸发至大气压。可采用多种反应器设计来进行稀酸预处理，例如活塞流反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(达夫(Duff)和默里(Murray)，1996，同上；谢尔(Schell)等人，2004，生物资源技术(Bioresource Technology)91：179-188；李(Lee)等人，1999，生物化学工程/生物技术进展(Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.)65：93-115)。

还可以使用在碱性条件下的几种预处理方法。这些碱性预处理包括但不限于：氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)、以及氨纤维/冷冻膨胀(AFEX)预处理。

用氧化钙或氢氧化钙在温度85℃-150℃下进行石灰预处理，停留时间是从1小时至数天(怀曼等人，2005，生物资源技术(Bioresource Technol.)96：1959-1966；莫西尔等人，2005，生物资源技术，96：673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900、以及WO 2006/110901披露了使用氨的预处理方法。

湿式氧化法是典型地在加入如过氧化氢等氧化试剂或过压的氧气、在180℃-200℃下进行5-15分钟的热预处理(施密特(Schmidt)和汤姆森(Thomsen)，1998，生物资源技术，64：139-151；帕隆恩(Palonen)等人，2004，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)117：1-17；瓦尔加(Varga)等人，2004，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)88：567-574；马丁(Martin)等人，2006，化学技术和生物技术杂志(J.Chem.Technol.Biotechnol.)81：1669-1677)。优选在1％-40％干物质，例如2％-30％干物质或5％-20％干物质进行预处理，并且通常通过添加碱，例如碳酸钠提高初始pH。

湿氧化预处理方法的修改，称为湿爆发(湿氧化与蒸汽爆发组合)可以处理高达30％的干物质。在湿爆发中，在某一停留时间后，在预处理期间引入氧化剂(oxidizingagent)。然后通过急骤蒸发至大气压结束预处理(WO 2006/03228)。

氨纤维膨胀(AFEX)涉及用液体或气体氨在适中的温度(例如90℃-150℃)和高压(例如17-20巴)处理纤维素材料，持续5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％(戈拉帕里(Gollapalli)等人，2002，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)98:23-35；丘恩达瓦特(Chundawat)等人，2007，生物技术和生物工程(Biotechnol.Bioeng.)96:219-231；阿里扎德(Alizadeh)等人，2005，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)121:1133-1141；泰莫里(Teymouri)等人，2005，生物资源技术(Bioresource Technol.)96:2014-2018)。在AFEX预处理过程中，纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-碳水化合物复合物被裂解。

有机溶剂预处理可通过使用乙醇水溶液(40％-60％ethanol)在160℃-200℃下萃取30-60分钟使纤维素材料去木质化(潘(Pan)等人，2005，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)90：473-481；潘等人，2006，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)94：851-861；酷比(Kurabi)等人，2005，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)121：219-230)。通常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素和木质素被去除。

适合的预处理方法的其他实例由谢尔等人，2003，应用生物化学与生物技术105-108:69-85，和莫西尔等人，2005，生物资源技术96:673-686，以及美国专利申请2002/0164730进行描述。

在一方面，化学预处理优选作为稀酸处理，并且更优选作为连续稀酸处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢、或其混合物。优选在1-5，例如1-4或1-2.5的pH范围进行温和的酸处理。在一个方面中，酸浓度在优选从0.01至10wt.％的酸的范围内，例如0.05至5wt.％的酸或0.1至2wt.％的酸。酸与纤维素材料接触，并且优选在温度140℃-200℃的范围内，例如165℃-190℃，进行1到60分钟范围的时间。

在另一方面，预处理在水性浆料中进行。在优选的方面，在预处理期间存在的纤维素材料是以优选10-80wt％的量，例如20-70wt％或30-60wt％，例如约40wt％。可以使用本领域已知的任何方法不洗涤或洗涤预处理的纤维素材料，例如用水洗涤。

机械预处理或物理预处理：术语“机械预处理”或“物理预处理”是指促进颗粒尺寸减缩的任何预处理。例如，这样的预处理可以涉及不同类型的研磨或碾磨(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。

可对该纤维素材料进行物理(机械)和化学预处理。机械或物理预处理可配合汽蒸/蒸汽爆发、水热解、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、照射(例如微波照射)，或它们的组合。在一个方面，高压是指优选在约100至约400psi的范围内的压力，例如约150至约250psi。在另一个方面中，高温意指温度在大约100℃至大约300℃，例如大约140℃至大约200℃的范围内。在一个优选的方面，使用蒸汽枪水解器系统，按分批法进行机械的或物理的预处理，该蒸汽枪水解器系统使用如以上定义的高压和高温，例如从顺智公司(SundsDefibrator)AB公司，瑞典可得的顺智(Sunds)水解器。这些物理预处理和化学预处理可以根据需要顺序地进行或同时进行。

因此，在一个优选方面，使纤维素材料经受物理(机械)或化学预处理、或其任何组合，以促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放。

生物预处理：术语“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从纤维素材料中分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见例如，Hsu(舒)，T.-A.,1996,Pretreatmentof biomass(生物质的预处理)，在生物乙醇：生产与利用手册中，怀曼，C.E.，编辑，泰勒&弗朗西斯，华盛顿特区，179-212；Ghosh(高希)和Singh(辛格)，1993，Adv.Appl.Microbiol.(应用微生物学进展)39:295-333；McMillan(麦克米伦)，J.D.,1994,Pretreating lignocellulosic biomass:areview(预处理木质纤维素生物质：评论)，在Enzymatic Conversion of BiomassforFuels Production(用于燃料生产的生物质的酶转化)中，Himmel(西默尔)，M.E.,Baker(贝克)，J.O.，和Overend(欧沃尼)，R.P.，编辑，ACS SymposiumSeries(研讨会丛刊)566，美国化学学会，华盛顿特区，第15章；Gong(宫)，C.S.,Cao(曹)，N.J.,Du(杜)，J.,和Tsao(查奥)，G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources(从可再生资源生产乙醇)，在Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology(生化工程/生物技术进展)中，Scheper(斯卡皮尔)，T.,编辑，Springer-Verlag(施普林格出版社)柏林海德堡，德国，65:207-241；Olsson(奥尔森)和Hahn-Hagerdal(哈恩-海格达尔)，1996，Enz.Microb.Tech.(酶与微生物技术)18:312-331；以及Vallander(瓦兰德)和Eriksson(埃里克森)，1990,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.(生化工程/生物技术进展)42:63-95)。

糖化。在水解步骤，还称为糖化中，纤维素材料(例如预处理的)被水解，来分解纤维素和/或半纤维素为可发酵糖，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶寡糖。水解由酶组合物在本发明的GH61多肽变体的存在下酶促进行。这些组合物的酶可以同时或依次添加。

酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下、在合适的含水环境中执行。在一方面，水解在适合于一种或多种酶的活性，即对于该一种或多种酶来说最佳的条件下进行。水解可以作为进料分批过程或连续过程进行，其中将纤维素材料逐渐进料至例如含酶的水解溶液中。

糖化通常在受控的pH、温度以及混合条件下在搅拌釜反应器或发酵罐中进行。适合的处理时间、温度以及pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续高达200小时，但是典型地优选进行约12至约120小时，例如约16至约72小时或约24至约48小时。优选温度是在约25℃至约70℃的范围内，例如约30℃至约65℃、约40℃至约60℃、或约50℃至约55℃。优选pH是在约3至约8的范围内，例如约3.5至约7、约4至约6、或约5至约5.5。优选干固体含量是在约5至约50wt％的范围内，例如约10至约40wt％或约20至约30wt％。

这些酶组合物可以包含有用于降解纤维素材料的任何蛋白。

在一个方面中，该酶组合物包括或进一步包括选自下组的一种或多种(如，若干种)蛋白质，该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、酯酶、扩张蛋白、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶、以及膨胀素。在另一个方面中，纤维素酶优选是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。在另一个方面中，半纤维素酶优选是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡萄糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。在另一个方面中，氧化还原酶优选是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：过氧化氢酶、漆酶、以及过氧化物酶。

在另一个方面中，酶组合物包括一种或多种(例如若干种)纤维素分解酶。在另一个方面中，酶组合物包括或进一步包括一种或多种(例如若干种)半纤维素分解酶。在另一个方面中，酶组合物包括一种或多种(例如若干种)纤维素分解酶、以及一种或多种(例如若干种)半纤维素分解酶。在另一个方面中，酶组合物包括选自于下组的一种或多种(例如若干种)酶：纤维素分解酶和半纤维素分解酶。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶。在另一方面，该酶组合物包含一种纤维二糖水解酶。在另一方面，该酶组合物包含一种β-葡糖苷酶。在另一方面，该酶组合物包含一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶和一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一方面，该酶组合物包含一种纤维二糖水解酶和一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一方面，该酶组合物包含一种β-葡糖苷酶和一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶和一种纤维二糖水解酶。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶和一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II一种组合。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶和一种β-葡糖苷酶。在另一方面，该酶组合物包含一种β-葡糖苷酶和一种纤维二糖水解酶。在另一方面，该酶组合物包含一种β-葡糖苷酶和一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II一种组合。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶、一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、以及一种纤维二糖水解酶。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶、一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、和一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II一种组合。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一方面，该酶组合物包含一种β-葡糖苷酶、一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、以及一种纤维二糖水解酶。在另一方面，该酶组合物包含一种β-葡糖苷酶、一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、和一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II一种组合。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶和一种纤维二糖水解酶。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶和一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II一种组合。在另一个方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶、一种纤维二糖水解酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶、一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、和一种纤维二糖水解酶I、一种纤维二糖水解酶II、或纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II一种组合。

在另一方面，该酶组合物包含一种乙酰甘露聚糖酯酶。在另一方面，该酶组合物包含一种乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种阿拉伯聚糖酶(例如，α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一个方面中，该酶组合物包括一种阿拉伯呋喃糖苷酶(例如，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一个方面中，该酶组合物包括一种香豆酸酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种阿魏酸酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一个方面中，该酶组合物包括一种葡糖醛酸糖苷酶(例如，α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一个方面中，该酶组合物包括一种葡萄糖醛酸酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种甘露聚糖酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种甘露糖苷酶(例如，β-甘露糖苷酶)。在另一个方面中，该酶组合物包括一种木聚糖酶。在一个优选方面中，该木聚糖酶是一种家族10木聚糖酶。在另一个优选方面，该木聚糖酶是一种家族11木聚糖酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种木糖苷酶(例如，β-木糖苷酶)。

在另一个方面中，该酶组合物包括一种酯酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种扩张蛋白。在另一方面，该酶组合物包含一种木质素分解酶。在一个优选方面，该木质素分解酶是一种锰过氧化物酶。在另一个优选方面，该木质素分解酶是一种木质素过氧化物酶。在另一个优选方面中，该木质素分解酶是一种产H₂O₂酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种果胶酶。在另一个方面中，该酶组合物包括一种氧化还原酶。在另一个优选方面，该氧化还原酶是一种过氧化氢酶。在另一个优选方面，该氧化还原酶是一种漆酶。在另一个优选方面，该氧化还原酶是一种过氧化物酶。在另一方面，该酶组合物包含一种蛋白酶。在另一方面，该酶组合物包含一种膨胀蛋白。

在本发明的方法中，可以在糖化、糖化和发酵、或发酵之前或期间添加该一种或多种酶。

酶组合物的一种或多种(例如若干种)组分可以是原生蛋白、重组蛋白或天然蛋白与重组蛋白的组合。例如，一种或多种(例如若干种)组分可以是细胞的原生蛋白，该细胞可被用作宿主细胞来重组地表达酶组合物的一种或多种(例如若干种)其他组分。在此应理解的是，重组蛋白对于宿主细胞可以是异源的(例如，外源的)以及原生的。可以作为单组分生成酶组合物的一种或多种(例如若干种)组分，然后将它们组合以形成酶组合物。酶组合物可以是多组分和单组分蛋白制剂的组合。

在本发明的方法中使用的酶可以是以任何适于使用的形式存在的，例如发酵液配制品或细胞组合物、有或没有细胞碎片的细胞裂解物、半纯化或纯化的酶制剂、或作为酶的来源的宿主细胞。酶组合物可以是干粉或颗粒、非尘颗粒、液体、稳定化的液体、或稳定化的受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加如糖、糖醇或其它多元醇等稳定剂和/或乳酸，对液体酶制剂进行稳定化。

酶和GH61多肽变体的最佳量取决于若干因素，包括但不限于：纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合物、纤维素材料、纤维素材料的浓度、纤维素材料的一种或多种预处理、温度、时间、pH、以及发酵生物体(例如，用于同时糖化和发酵)的纳入。

在一个方面中，纤维素分解酶或半纤维素分解酶对于纤维素材料的有效量是每克纤维素材料大约0.5至大约50mg，例如大约0.5至大约40mg、大约0.5至大约25mg、大约0.75至大约20mg、大约0.75至大约15mg、大约0.5至大约10mg、或大约2.5至大约10mg。

在另一个方面，GH61多肽变体对纤维素材料的有效量是每g纤维素材料约0.01至约50.0mg，例如，约0.01至约40mg、约0.01至约30mg、约0.01至约20mg、约0.01至约10mg、约0.01至约5mg、约0.025至约1.5mg、约0.05至约1.25mg、约0.075至约1.25mg、约0.1至约1.25mg、约0.15至约1.25mg、或约0.25至约1.0mg。

在另一个方面，GH61多肽变体对纤维素分解酶或半纤维素分解酶的有效量是每g纤维素分解酶或半纤维素分解酶约0.005至约1.0g，例如，约0.01至约1.0g、约0.15至约0.75g、约0.15至约0.5g、约0.1至约0.5g、约0.1至约0.25g、或约0.05至约0.2g。

具有纤维素分解酶活性或半纤维素分解酶活性的多肽以及有用于降解纤维素材料的其它蛋白/多肽(在下文中统称为“具有酶活性的多肽”)可以从任何合适的来源衍生或获得，包括古细菌、细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。术语“获得”在此还指的是采用在此所述的方法已经在宿主生物体中重组生成该酶，其中重组生成的酶对宿主生物体可以是原生的或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如具有一个或多个(例如若干个)被缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组生成的酶，它是原生氨基酸序列的一种突变体和/或片段，或是由本领域已知的核酸改组过程中生成的酶。原生酶的含义中涵盖天然变体，而外源酶的含义中涵盖如通过定点诱变或改组获得的变体。

具有酶活性的多肽可以是一种细菌多肽。例如，该多肽可以是具有酶活性的革兰氏阳性细菌多肽，例如芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽抱杆菌属、热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)、嗜酸栖热菌属(Acidothermus)、Thermobifidia或海洋芽抱杆菌属(Oceanobacillus)多肽；或具有酶活性的革兰氏阴性细菌多肽，例如大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺旋杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属、或脲原体属多肽。

具有酶活性的多肽还可以是真菌多肽，并且更优选是酵母多肽，例如具有酶活性的假丝酵母属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、亚罗酵母属多肽；或更优选是丝状真菌多肽，例如具有酶活性的支顶孢属、落叶松蕈属、支链孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属菌属、家白蚁属、棒囊孢壳菌属、栗疫属菌属、隐球酵母属、壳色单隔孢属、黑耳属、线黑粉酵母属、镰刀菌属、赤霉菌属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、香菇属、小球腔菌属、大毁壳属菌属、黑果菌属菌(Melanocarpus属)、亚灰树花菌属、毛霉菌属、蚀丝霉属菌属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属菌属、青霉菌属、平革菌属、梨囊鞭菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉属、裂褶菌属、柱顶孢霉属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳菌属、弯颈霉属、木霉属菌属、长毛盘菌属、轮枝孢属菌属、小包脚菇属、或炭角菌属多肽。

在一个方面，多肽是具有酶活性的卡尔斯伯酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁费酵母、诺地酶母、或卵形酵母多肽。

在另一个方面，多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、Chrysosporiumlucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporium merdarium、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、带纹金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、灰腐质酶、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白囊耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、无色梭孢壳、Thielavia albomyces、白毛梭孢壳(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳、卵孢梭孢壳、秘鲁梭孢壳(Thielavia peruviana)、瘤孢梭孢壳、毛梭抱壳、耐热梭孢壳、太瑞斯梭孢壳霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉、或囊状长毛盘菌多肽。

还可以使用具有酶活性的多肽的化学修饰的或蛋白工程化的突变体。

酶组合物的一种或多种(例如若干种)组分可以是重组组分，即通过克隆编码单一组分的DNA序列，并且随后用该DNA序列转化细胞，并且随后在宿主中表达而产生(参见例如WO 91/17243和WO 91/17244)。优选宿主是异源宿主(酶对于宿主而言是异源的)，但是在某些条件下，宿主还可以是同源宿主(酶对于宿主而言是原生的)。还可以通过纯化来自发酵液的这样一种蛋白来制备单组分纤维素分解蛋白。

在一个方面，一种或多种(例如若干种)纤维素分解酶包括商业纤维素分解酶制剂。适用于本发明的商业纤维素分解酶制剂的实例包括例如：

CTec(诺维信A/S公司(Novozymes A/S))、

CTec2(诺维信A/S公司)、

CTec3(诺维信A/S公司)、CELLUCLAST^TM(诺维信A/S公司)、NOVOZYM^TM 188(诺维信A/S公司)、SPEZYME^TM CP(杰能科国际(Genencor Int.))、ACCELERASE^TM TRIO(杜邦公司(DuPont))、

NL(DSM公司)；

S/L 100(DSM公司)、ROHAMENT^TM 7069W(罗姆公司(

GmbH))、或

CMAX3^TM(Dyadic国际有限公司(Dyadic International,Inc.))。加入的纤维素酶的有效量是固体从大约0.001至大约5.0wt.％，例如固体的大约0.025至大约4.0wt.％，或固体的大约0.005至大约2.0wt.％。

可在本发明的方法中使用的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO 93/15186；美国专利申请号5,275,944；WO 96/02551；美国专利申请号5,536,655，WO 00/70031，WO 05/093050)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(萨里拉赫蒂(Saarilahti)等人，1990，基因(Gene)90:9-14)、嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)、以及嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶V(WO05/093050)。

可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：里氏木霉内切葡聚糖酶I(彭蒂莱(Penttila)等人，1986，基因45:253-263，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GenBank:M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(萨洛黑莫(Saloheimo)等人，1988，基因63:11-22)，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GenBank:M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(奥卡达(Okada)等人，1988，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64:555-563，GenBank:AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(萨洛黑莫等人，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)l3:219-228，GenBank:Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(黄(Ooi)等人，1990，核酸研究l8:5884)；白曲霉(Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(坂元(Sakamoto)等人，1995，当代遗传学(Current Genetics)27:435-439)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GenBank:L29381)；灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermoidea)内切葡聚糖酶(GenBank:AB003107)；热白丝菌(Melanocarpus albomyces)内切葡聚糖酶(GenBank:MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GenBank:XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶；金黄色嗜热子囊菌内切葡聚糖酶I(GenBank:AF487830)；以及里氏木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GenBank:M15665)。

可用在本发明中的纤维二糖水解酶的实例包括但不限于：棘孢曲霉纤维二糖水解酶II(WO 2011/059740)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶II、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维二糖水解酶I、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)纤维二糖水解酶II(WO2009/042871)、Penicillium occitanis纤维二糖水解酶I(GenBank:AY690482)、埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I(GenBank:AF439936)、Thielavia hyrcanie纤维二糖水解酶II(WO2010/141325)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)纤维二糖水解酶II(CEL6A，WO2006/074435)、里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶I、里氏木霉(Trichodermareesei)纤维二糖水解酶II、以及囊状长毛盘菌(Trichophaea saccata)纤维二糖水解酶II(WO 2010/057086)。

可用于本发明的β-葡糖苷酶的实例包括，但不限于来自以下各项的β-葡糖苷酶：棘孢曲霉(Kawaguchi(川口)等人，1996，基因173:287-288)、烟曲霉(WO 2005/047499)、黑曲霉(Dan(丹)等人，2000，生物化学杂志275:4973-4980)、米曲霉(WO 02/095014)、巴西青霉(Penicillium brasilianum)IBT20888(WO 2007/019442和WO 2010/088387)、太瑞斯梭孢壳霉(WO 2011/035029)、以及囊状长毛盘菌(WO 2007/019442)。

β-葡糖苷酶可以是一种融合蛋白。在一个方面中，β-葡糖苷酶是一种米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白(WO 2008/057637)或一种米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。

其他有用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶在采用根据下述文献的分类的很多糖基水解酶家族中披露：亨利萨塔(Henrissat)，1991，生物化学期刊(Biochem.J.)280：309-316，以及亨利萨塔和巴洛赫(Bairoch)，1996，生物化学期刊(Biochem.J.)316：695-696。

可以用于本发明的其他纤维素分解酶描述于以下文献中：WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025847、WO 99/031255、WO2002/101078、WO 2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO 2006/074005、WO2006/117432、WO 2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、美国专利号5,457,046、美国专利号5,648,263、以及美国专利号5,686,593。

在本发明的方法中，具有纤维素分解增强活性的任何GH61多肽都可以用作酶组合物的组分。

可用在本发明方法中的GH61多肽的实例包括但不限于来自于以下各项的GH61多肽：太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)(WO 2005/074647、WO 2008/148131和WO2011/035027)、金黄色嗜热子囊菌(WO 2005/074656和WO 2010/065830)、里氏木霉(Trichoderma reesei)(WO 2007/089290)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)(WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、和WO 2009/085868)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(WO 2010/138754)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)(WO2011/005867)、嗜热菌属(Thermoascus sp.)(WO 2011/039319)、青霉属(Penicilliumsp.)(WO 2011/041397)、甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceous)(WO 2011/041504)、棘孢曲霉(WO 2012/125925)、疏棉状嗜热丝孢菌(WO 2012/113340、WO 12/129699、以及WO2012/130964)、Aurantiporus alborubescens(WO 2012/122477)、囊状长毛盘菌(WO 2012/122477)、托姆青霉(WO 2012/122477)、柄篮状菌(WO 2012/135659)、特异腐质霉(WO 2012/146171)、樟绒枝霉(WO 2012/101206)、Talaromyces leycettanus(W2012/101206)、和嗜热毛壳菌(WO 2012/101206)。

在一个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体和GH61多肽在根据WO2008/151043的可溶性活化二价金属阳离子(例如锰或铜)的存在下使用。

在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体和GH61多肽在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物、或从预处理的纤维素材料(如预处理的玉米秸杆)获得的液体的存在下使用(WO 2012/021394、WO 2012/021395、WO2012/021396、WO 2012/021399、WO 2012/021400、WO 2012/021401、WO 2012/021408、以及WO 2012/021410)。

在一个方面中，这样一种化合物以该化合物对纤维素的葡糖基单位的如下摩尔比率添加：大约10^-6至大约10，例如大约10^-6至大约7.5，大约10^-6至大约5，大约10^-6至大约2.5，大约10^-6至大约1，大约10^-5至大约1，大约10^-5至大约10^-1，大约10^-4至大约10^-1，大约10^-3至大约10^-1，或大约10^-3至大约10^-2。在另一个方面中，这样一种化合物的有效量是约0.1μM至约1M，例如约0.5μM至约0.75M、约0.75μM至约0.5M、约1μM至约0.25M、约1μM至约0.1M、约5μM至约50mM、约10μM至约25mM、约50μM至约25mM、约10μM至约10mM、约5μM至约5mM、或约0.1mM至约1mM。

术语“液体(liquor)”意指在如在此所描述的条件下，由处理浆料中的木质纤维素和/或半纤维素材料、或其单糖(例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖等)所产生的溶液相(水相、有机相抑或其组合)、以及其可溶性内容物。可以通过对木质纤维素或半纤维素材料(原料)加热和/或加压进行处理，任选地是在一种例如酸等催化剂存在下、任选地是在有机溶剂的存在下、和任选地与材料的物理破坏相结合，然后将溶液与残余固形物分离，来生成一种用于加强GH61多肽纤维分解的液体。在由纤维素酶制剂对纤维素底物的水解过程中，从液体与GH61多肽的组合中可得到纤维素分解增强的程度是由这类条件决定的。可以使用本领域的标准方法，如过滤、沉淀或离心，而将液体与经过处理的材料进行分离。

在一个方面中，液体对于纤维素的有效量是每克纤维素大约10^-6至大约10g，例如，每克纤维素大约10^-6至大约7.5g，大约10^-6至大约5g，大约10^-6至大约2.5g，大约10^-6至大约1g，大约10^-5至大约1g，大约10^-5至大约10^-1g，大约10^-4至大约10^-1g，大约10^-3至大约10^-1g，或大约10^-3至大约10^-2g。

在一个方面中，一种或多种(例如若干种)半纤维素分解酶包括商业半纤维素分解酶制剂。适用于本发明的商业半纤维素分解酶制剂的实例包括，例如，SHEARZYME^TM(诺维信公司A/S)、

HTec(诺维信公司A/S)、

HTec2(诺维信公司A/S)、

HTec3(诺维信公司A/S)、

(诺维信公司A/S)、

(诺维信公司A/S)、

HC(诺维信公司A/S)、

木聚糖酶(杰能科)、

XY(杰能科)、

XC(杰能科)、

TX-200A(AB酶制剂公司(AB Enzymes))、HSP 6000木聚糖酶(帝斯曼)、DEPOL^TM 333P(生物催化剂有限公司(Biocatalysts Limit)，英国威尔士(Wales,UK))、DEPOL^TM 740L。(生物催化剂有限公司，英国威尔士)以及DEPOL^TM 762P(生物催化剂有限公司，英国威尔士)，ALTERNAFUEL 100P(Dyadic公司)，以及ALTERNA FUEL 200P(Dyadic公司)。

在本发明的方法中有用的木聚糖酶的实例包括但不限于来自以下的木聚糖酶：棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(基因SeqP：AAR63790；WO94/21785)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(WO 2006/078256)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)(WO2011/041405)、青霉属(Penicillium sp.)(WO2010/126772)、疏棉状嗜热丝孢菌GH11(WO2012/130965)、嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus)GH11(WO 2012/13095)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)NRRL 8126(WO 2009/079210)、以及囊状长毛盘菌(Trichophaea saccata)GH10(WO 2011/057083)。

在本发明的方法中有用的β-木糖苷酶包括但不限于来自以下的β-木糖苷酶：粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(SwissProt:Q7SOW4)、里氏木霉(Trichoderma reesei)(UniProtKB/TrEMBL:Q92458)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)(SwissProt:Q8X212)、以及嗜热篮状菌GH11(WO 2012/13095)。

在本发明的方法中有用的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于来自以下的乙酰木聚糖酯酶：棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO 2010/108918)，球毛壳菌(Chaetomium globosum)(UniProt:Q2GWX4)，细丽毛壳(Chaetomium gracile)(GeneSeqP:AAB82124)，特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800(WO 2009/073709)，红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)(WO 2005/001036)，嗜热毁丝菌(Myceliophtera thermophila)(WO2010/014880)，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(UniProt:q7s259)，颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)(UniProt:Q0UHJ1)，以及太瑞斯梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)NRRL 8126(WO 2009/042846)。

在本发明的方法中有用阿魏酰酯酶(阿魏酸酯酶)是实例包括但不限于来自以下的阿魏酰酯酶：特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800(WO 2009/076122)，费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)(UniProt:A1D9T4)，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(UniProt:Q9HGR3)，黄灰青霉(Penicillium aurantiogriseum)(WO 2009/127729)，以及太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)(WO 2010/053838和WO 2010/065448)。

在本发明的方法中有用的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于来自以下的阿拉伯呋喃糖苷酶：黑曲霉(Aspergillus niger)(GeneSeqP:AAR94170)，特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800(WO 2006/114094和WO 2009/073383)，以及巨多孔菌(M.giganteus)(WO 2006/114094)。

在本发明的方法中有用的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于来自以下的α-葡糖醛酸糖苷酶：棒曲霉(Aspergillus clavatus)(UniProt:alcc12)，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(SwissProt:Q4WW45)，黑曲霉(Aspergillus niger)(UniProt:Q96WX9)，土曲霉(Aspergillus terreus)(SwissProt:Q0CJP9)，特异腐质霉(Humicolainsolens)(WO 2010/014706)，黄灰青霉(WO 2009/068565)，埃默森篮状菌(UniProt:Q8X211)，以及里氏木霉(Trichoderma reesei)(UniProt:Q99024)。

在本发明的方法中有用的氧化还原酶的实例包括但不限于：烟曲霉过氧化氢酶、Aspergillus lentilus过氧化氢酶、黑曲霉过氧化氢酶、米曲霉过氧化氢酶、特异腐质霉过氧化氢酶、粗糙脉孢菌过氧化氢酶、埃默森青霉过氧化氢酶、嗜热色串孢(Scytalidiumthermophilum)过氧化氢酶、柄篮状菌过氧化氢酶、金黄色嗜热子囊菌过氧化氢酶、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)漆酶、嗜热毁丝霉漆酶、Polyporus pinsitus漆酶、鲜红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)漆酶、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)漆酶、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)漆酶、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)过氧化物酶、大豆过氧化物酶、以及王棕(Royal palm)过氧化物酶。

用于本发明的工艺中的具有酶活性的多肽可以通过在含有适合的碳源和氮源以及无机盐的营养培养基上，使用本领域已知的程序发酵上面指出的微生物菌株来产生(参见例如，Bennett(班尼特)，J.W.和LaSure(拉素尔)，L.(编辑)，More Gene Manipulationsin Fungi(真菌中的更多基因操作)，Academic Press(学术出版社)，加州，1991)。合适的培养基从商业供应商处可获得，或者可根据公开的组成(例如，在美国模式培养物保藏所目录中)来制备。适于生长和酶生产的温度范围和其他条件在本领域中是已知的(参见例如，Bailey(贝利)，J.E.，和Ollis(奥利斯)，D.F.，Biochemical Engineering Fundamentals(生化工程基础)，McGraw-Hill Book Company(麦格劳-希尔图书公司)，纽约，1986)。

发酵可以是导致酶或蛋白质的表达或分离的培养细胞的任何方法。所以，可以将发酵理解为包括摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并且在允许表达或分离该酶的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)。通过上述方法产生的所得酶可以从发酵培养基回收并且通过常规程序纯化。

发酵。可以用一种或多种(例如若干种)能够直接或间接将糖发酵成希望的发酵产物的发酵微生物，对从水解的纤维素材料获得的可发酵糖进行发酵。“发酵”或“发酵过程”是指任何发酵过程或包括发酵步骤的任何过程。发酵过程还包括用于消费性醇工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工业(例如发酵奶制品)、皮革工业、以及烟草工业的发酵过程。发酵条件取决于所希望的发酵产物和发酵生物体，并且可以由本领域的普通技术人员容易地确定。

在发酵步骤中，通过发酵有机体，例如酵母，作为预处理和酶水解步骤的结果，从纤维素材料释放的糖被发酵为产物，例如乙醇。水解(糖化)和发酵可以是分开的或同时的。

在实践本发明的发酵步骤中可以使用任何适合的水解的纤维素材料。该材料一般是基于经济学，即，每当量糖势的成本，以及对酶致转变的难降解性而进行选择。

术语“发酵培养基”在此可理解为指在添加一种或多种发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及在同时糖化和发酵过程(SSF)中使用的培养基。

“发酵微生物”是指适用于所希望的发酵过程以产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是己糖和/或戊糖发酵生物体、或其组合。己糖和戊糖发酵生物体二者均是本领域中所熟知的。适合的发酵微生物能够将糖(例如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或低聚糖)直接或间接地发酵(即，转化)为所希望的发酵产物。生产乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例由Lin(林)等人，2006，应用微生物学与生物技术69:627-642进行了描述。

可以发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，例如酵母。酵母包括以下各项的菌株：假丝酵母属、克鲁维酵母属、以及酵母菌属，例如萨纳瑞西斯假丝酵母(Candida sonorensis)、马克斯克鲁维酵母、以及酿酒酵母。

可以发酵处于其原生状态的戊糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，例如一些酵母。发酵木糖的酵母包括假丝酵母属的菌株，优选是休哈塔假丝酵母(C.sheatae)或萨纳瑞西斯假丝酵母(C.sonorensis)；以及毕赤酵母属的菌株，例如是树干毕赤酵母，像树干毕赤酵母CBS 5773。发酵戊糖的酵母包括管囊酵母属的菌株，优选是嗜鞣管囊酵母(P.tannophilus)。不能发酵戊糖(如木糖和阿拉伯糖)的生物体可以通过本领域已知方法来进行遗传修饰而发酵戊糖。

例如可以有效发酵己糖和戊糖为乙醇的细菌的实例包括例如凝结芽孢杆菌、丙酮丁醇梭杆菌、热纤梭菌、发酵植物多糖梭菌(Clostridium phytofermentans)、土芽孢杆菌属物种、解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)、以及运动发酵单胞菌(菲力皮迪斯(Philippidis)，1996，同上)。

其他发酵有机体包括芽孢杆菌属的株系，例如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，例如萨纳瑞西斯假丝酵母(C.sonorensis)、甲醇山梨糖假丝酵母(C.methanosorbosa)、迪丹斯假丝酵母、近平滑念珠菌、C.naedodendra、布朗克假丝酵母、C.entomophilia、芸薹假丝酵母、热带假丝酵母、博伊丁假丝酵母(C.boidinii)、产朊假丝酵母、和休哈塔假丝酵母；梭菌属，例如丙酮丁醇梭菌、C.thermocellum、和发酵植物多糖梭菌(C.phytofermentans)；大肠杆菌属，尤其是已经基因改造以改进乙醇产率的大肠杆菌株系；土芽孢杆菌属物种；汉逊酵母属，例如异常汉森酵母；克雷白氏菌属，例如产酸克雷白氏菌；克鲁维酵母菌属，例如马克思克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、耐温克鲁维酵母、和脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；高温厌氧杆菌属，例如解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobactersaccharolyticum)；以及发酵单胞菌，例如运动发酵单胞菌。

适合乙醇生产的可商购酵母包括例如BIOFERM^TM AFT和XR(NABC-北美生物产物公司(North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州，美国)，乙醇红酵母(ETHANOLRED^TM yeast)(Fermentis/Lesaffre公司，美国)，FALI^TM(Fleischmann’s Yeast公司，美国)，FERMIOL^TM(DSM Specialties公司)，GERT STRAND^TM(Gert Strand AB公司，瑞典)，以及SUPERSTART^TM和THERMOSACC^TM新鲜酵母(乙醇技术公司(Ethanol Technology)，威斯康星州，美国)。

在一个方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用木糖的微生物、利用阿拉伯糖的微生物、以及共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。

将异源基因克隆到多种发酵微生物中已经构建出能够将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(陈(Chen)和霍(Ho)，1993，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)39-40:135-147；霍等人，1998，应用与环境微生物学64:1852-1859；科特(Kotter)和西拉塞(Ciriacy)，1993，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)38:776-783；维尔福森(Walfridsson)等人，1995，应用与环境微生物学61:4184-4190；凯珀(Kuyper)等人，2004，欧洲微生物学会联合会酵母研究(FEMS Yeast Research)4:655-664；比尔(Beall)等人，1991，生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)38:296-303；英格拉姆(Ingram)等人，1998，生物技术与生物工程58:204-214；张(Zhang)等人，1995，科学(Science)267:240-243；狄安妲(Deanda)等人，1996，应用与环境微生物学62:4465-4470；WO 2003/062430)。

本领域中熟知的是，以上所描述的生物体还可以用于产生其他物质，如在此所描述。

典型地将发酵微生物添加至降解的纤维素材料或水解产物，并且进行发酵，持续约8至约96小时，例如约24至约60小时。温度典型地在约26℃至约60℃之间，例如约32℃或50℃，并且约pH 3至约pH 8，例如pH 4-5、6、或7。

在一个方面，应用酵母和/或另一种微生物至降解的纤维素材料并且进行发酵，持续约12至约96小时，例如典型地24-60小时。在另一方面，温度优选在约20℃至约60℃之间，例如约25℃至约50℃、约32℃至约50℃、或约32℃至约50℃，并且pH一般是从约pH 3至约pH7，例如约pH 4至约pH 7。然而，一些发酵有机体，例如细菌具有更高的发酵温度最佳条件。优选以约10⁵至10¹²的量，优选是从约10⁷至10¹⁰，尤其是约2x 10⁸个活细胞计数/ml发酵液应用酵母或另一种微生物。关于使用酵母用于发酵的另外指导可以发现于，例如“醇教科书(The Alcohol Textbook)”(编辑：里昂(T.P.Lyons)和凯尔索尔(D.R.Kelsall)，诺丁汉大学出版社(Nottingham University Press)，英国)，将其通过引用特此结合。

发酵刺激剂可以与在此所描述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵方法，特别是改进发酵微生物的性能，如，提高速度和乙醇产率。“发酵刺激剂”是指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。用于生长的优选发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸盐(酯)、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆素、对氨基苯酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E，例如参见阿芬诺尔(Alfenore)等人，“通过在分批补料过程期间维生素进料策略改进乙醇生产和酿酒酵母活力(Improving ethanolproduction and viability of Saccharomyces cerevisia by a vitamin feedingstrategy during fed-batch process)”，施普林格出版社(Springer-Verlag)(2002)，将其通过引用特此结合。矿物质的实例包括可以供应包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu营养素的矿物质和矿物盐。

发酵产物：发酵产物可以是由发酵得到的任何物质。发酵产物可以是，而不局限于一种醇(例如阿拉伯糖醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油(glycerol)、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇[丙二醇]、丁二醇、甘油(glycerin)、山梨糖醇和木糖醇)；一种烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、和十二烷)；一种环烷(例如环戊烷、环己烷、环庚烷、和环辛烷)，一种烯烃(例如戊烯、己烯、庚烯、和辛烯)；一种氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、和苏氨酸)；一种气体(例如甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)、和一氧化碳(CO))；异戊二烯；一种酮(例如丙酮)；一种有机酸(例如乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸、和木糖酸)；以及聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产物的蛋白。

在一个优选的方面，发酵产物是一种醇。将理解，术语“醇”涵盖含有一个或多个羟基部分的物质。醇可以是而不限于：正丁醇、异丁醇、乙醇、甲醇、阿拉伯糖醇、丁二醇、乙二醇、甘油(glycerin)、丙三醇(glycerol)、1,3-丙二醇、山梨糖醇、木糖醇。参见例如，宫(Gong)等人，1999,Ethanol production from renewable resources(由可再生资源生产乙醇)，在生化工程/生物技术进展中，斯卡皮尔，T.，编辑，施普林格出版社柏林海德堡，德国，65:207-241；西尔维拉(Silveira)和乔纳斯(Jonas),2002，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)59:400-408；尼加姆(Nigam)和辛格，1995，加工生物化学(Process Biochemistry)30(2):117-124；埃塞吉(Ezeji)等人，2003，微生物与生物技术世界杂志(World Journal of Microbiology and Biotechnology)19(6):595-603。

在另一个优选方面，发酵产物是一种烷烃。该烷烃可以是非支链或支链烷烃。烷烃可以是而不限于：戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、或十二烷。

在另一个优选方面，发酵产物是一种环烷烃。环烷烃可以是而不限于：环戊烷、环己烷、环庚烷或环辛烷。

在另一个优选方面，发酵产物是一种烯烃。该烯烃可以是非支链或支链烯烃。烯烃可以是而不限于：戊烯、己烯、庚烯或辛烯。

在另一个优选方面，发酵产物是一种氨基酸。有机酸可以是而不限于：天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、或苏氨酸。参见例如理查德(Richard)和马加里蒂(Margaritis)，2004，生物技术和生物工程(Biotechnology and Bioengineering)87(4):501-515。

在另一个优选方面，发酵产物是一种气体。气体可以是而不限于：甲烷、H₂、CO₂、或CO。参见例如，片冈(Kataoka)等人，1997，水科学与技术(Water Science and Technology)36(6-7):41-47；以及古纳森兰(Gunaseelan)，1997，生物质与生物能源(Biomass andBioenergy)13(1-2):83-114。

在另一个优选方面，发酵产物是异戊二烯。

在另一个优选方面，发酵产物是一种酮。应理解的是，术语“酮”涵盖包含一个或多个酮部分的物质。酮可以是而不限于：丙酮。

在另一个优选方面，发酵产物是有机酸。有机酸可以是而不限于：乙酸、醋酮酸(acetonic acid)、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸(glucaric acid)、葡糖酸(gluconic acid)、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸(malonic acid)、草酸、丙酸、琥珀酸、或木质酸(xylonic acid)。参见，例如，陈(Chen)和李(Lee)，1997，生物化学与生物技术(Biochem.Biotechnol.)63-65:435-448。

在另一个优选方面，发酵产物是聚酮化合物。

回收。可以使用本领域中已知的任何方法可任选地从发酵培养基回收一种或多种发酵产物，这些方法包括但不限于，色谱法、电泳程序、差别溶解度、蒸馏、或萃取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料中分离和纯化醇。可以获得具有高达约96vol.％的纯度的乙醇，这可以用作例如燃料乙醇、引用乙醇，即饮用中性乙醇、或工业乙醇。

洗涤剂组合物

本发明还涉及包含本发明的GH61多肽变体和表面活性剂的洗涤剂组合物。本发明的GH61多肽变体可以添加至洗涤剂组合物中并且因此变成洗涤剂组合物的组分。

本发明的洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。在一个方面，本发明还涉及用于清洁或洗涤硬表面或衣物的方法，该方法包括使该硬表面或该衣物与本发明的洗涤剂组合物相接触。

在一个特定方面，本发明提供包含本发明的GH61多肽变体的洗涤剂添加剂。该洗涤剂添加剂以及该洗涤剂组合物可以包含一种或多种(例如，若干种)选自由以下各项组成的组的酶：淀粉酶、阿拉伯糖酶、角质酶、碳水化合物酶、纤维素酶、半乳聚糖酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及木聚糖酶。

一般说来，所选择的一种或多种酶的特性应与所选择的涤剂添相容(即最佳pH，与其他酶的和非酶的成分的相容性等)，并且这一种或多种酶应以有效量存在。

纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳菌属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰刀菌产生的真菌纤维素酶。

尤其适合的纤维素酶是具有颜色保护益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，例如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中描述的那些。

可商购获得的纤维素酶包括CELLUZYME^TM和CAREZYME^TM(诺维信公司)、CLAZINASE^TM和PURADAX HA^TM(杰能科国际有限公司)、以及KAC-500(B)^TM(花王株式会社(KaoCorporation))。

蛋白酶：适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选微生物来源。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，尤其是衍生自芽孢杆菌的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279中)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和描述于WO 89/06270与WO 94/25583中的镰刀菌蛋白酶。

有用的蛋白酶的实例是如WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946所描述的变体，特别是在下述位置中的一个或多个处发生取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。

优选的商业上可得的蛋白酶包括ALCALASE^TM、SAVINASE^TM、PRIMASE^TM、DURALASE^TM、ESPERASE^TM、和KANNASE^TM(诺维信公司)、MAXATASE^TM、MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、PROPERASE^TM、PURAFECT^TM、PURAFECT OXP^TM、FN2^TM、以及FN3^TM(杰能科国际)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些脂肪酶。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自以下各项的脂肪酶：来自腐质霉属(与嗜热霉属同义)，例如来自如EP 258 068和EP 305 216描述的疏棉状腐质霉(细毛嗜热霉)或来自如WO 96/13580中描述的特异腐质霉的脂肪酶；假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(EP 331 376)、施氏假单胞菌(GB 1,372,034)、萤光假单胞菌、假单胞菌属物种菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(WO 96/12012)；芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(达图瓦(Dartois)等人，1993，生物化学与生物物理学报(Biochemica et Biophysica Acta)，1131:253-360)，嗜热脂肪芽抱杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)。

脂肪酶变体的其他实例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079以及WO 97/07202中描述的那些。

优选的可商购获得的脂肪酶包括：LIPOLASE^TM和LIPOLASE ULTRA^TM(诺维信公司)。

淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌，例如地衣芽孢杆菌的特定菌株的α-淀粉酶，更加详细地描述于GB 1,296,839中。

有用的淀粉酶的实例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、以及WO 97/43424中描述的变体，尤其是在一个或多个以下位置上具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、以及444。

可商购获得的淀粉酶为DURAMYL^TM、TERMAMYL^TM、FUNGAMYL^TM和BAN^TM(诺维信公司)，RAPIDASE^TM和PURASTAR^TM(来自杰能科国际公司)。

过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞菌，例如灰盖鬼伞的过氧化物酶及其变体，如描述于WO 93/24618、WO 95/10602、和WO 98/15257中的那些。

可商购获得的过氧化物酶包括GUARDZYME^TM(诺维信公司)。

一种或多种洗涤剂酶可以通过添加含有一种或多种(例如，若干种)酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合的添加剂而包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即独立添加剂或组合添加剂，可以被配制为，如颗粒、液体、浆料等。优选的洗涤剂添加剂配制品为颗粒，尤其是非尘颗粒；液体，尤其是稳定化的液体；或浆料。

可以产生非尘颗粒，例如像在US 4,106,991和4,661,452中所披露的，并且可以任选地通过本领域已知方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中该醇含有12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、以及甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP238,216中披露的方法制备。

本发明的洗涤剂组合物可以呈任何便利的形式，例如条、片、粉末、颗粒、糊、或液体。液体洗涤剂可以是水性的，典型地含有至多70％的水和0-30％的有机溶剂，或可以是非水性的。

该洗涤剂组合物包含一种或多种(例如，若干种)表面活性剂，其可以是非离子型(包括半极性型)和/或阴离子型和/或阳离子型和/或兼性离子型。这些表面活性剂典型地以按重量计0.1％至60％的水平存在。

当其中包括阴离子型表面活性剂时，该洗涤剂将通常含有约1％至约40％的阴离子型表面活性剂，如线性烷基苯磺酸盐、α-烯基磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲基酯、烷基或烯基琥珀酸、或皂类。

当其中包括非离子型表面活性剂时，该洗涤剂将通常含有约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，如醇乙氧化物、壬基苯酚乙氧化物、烷基聚糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧化脂肪酸单乙醇胺、脂肪酸单乙醇胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

该洗涤剂可以含有0-65％洗涤剂助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐、或层状硅酸盐(例如，来自赫斯特(Hoechst)的SKS-6)。

该洗涤剂可以包含一种或多种(例如，若干种)聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯)、马来酸/丙烯酸共聚物、以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可以包含漂白系统，其可以包含H₂O₂源，如过硼酸或过碳酸，其可以与形成过酸的漂白活化剂(如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐)组合。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺、或砜型的过氧酸。

可以使用常规稳定剂使本发明的洗涤剂组合物中的一种或多种酶稳定化，这些稳定剂例如为多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰苯基硼酸))，并且该组合物可以如(例如)WO 92/19709和WO 92/19708中所述进行配制。

该洗涤剂还可以含有其他常规洗涤剂成分，例如像织物调理剂，包括黏土、泡沫促进剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、悬污剂、抗污物再沉积剂、染料、杀细菌剂、光学增亮剂、助水溶剂、晦暗抑制剂、或香料。

在洗涤剂组合物中，任何酶的添加量可以对应于每升洗液0.01-100mg酶蛋白，优选每升洗液0.05-5mg酶蛋白，尤其是每升洗液0.1-1mg酶蛋白。

在洗涤剂组合物中，具有纤维素分解增强活性的本发明的GH61多肽变体的添加量可以对应于每升洗液0.001-100mg蛋白质、优选0.005-50mg蛋白质、更优选0.01-25mg蛋白质、甚至更优选0.05-10mg蛋白质、最优选0.05-5mg蛋白质，并且甚至最优选0.01-1mg蛋白质。

本发明的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体还可以结合到WO97/07202(通过引用由此结合)中披露的洗涤剂配制品中。

植物

本发明还涉及分离的植物，例如，转基因植物、植物部分、或植物细胞，其包含本发明的多核苷酸，以便以可回收的量表达和产生GH61多肽变体。该变体可以从植物或植物部分回收。可替代地，含有该变体的植物或植物部分可以按原样用于改善食品或进料的质量，例如，改善营养价值、可口性以及流变特性，或用以破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草例如草地早熟禾(蓝草，早熟禾属)，饲草例如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)，温带草例如剪股颖属(Agrostis)和谷物例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱、和玉蜀黍(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugarbeet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(familyBrassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模型生物拟南芥)。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。

同样包含于本发明范围内的是这类植物、植物部分以及植物细胞的子代。

表达变体的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法来构建。简而言之，通过如下方法构建该植物或植物细胞：将编码变体的一个或多个表达构建体并入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达构建体宜为包括编码变体的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。而且，表达构建体可包含用于鉴别整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。

例如，基于希望在何时、何处、以及如何表达该变体来确定对调节序列如启动子和终止子序列和任选的信号或转运序列的选择(斯蒂克伦(Sticklen)，2008，自然评论(Nature Reviews)9:433-443)。例如，编码变体的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分，如种子或叶。调节序列是例如由塔格(Tague)等人，1988，植物生理学(Plant Physiology)86:506描述的。

对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉蜀黍泛素1、或水稻肌动蛋白1启动子(Franck(弗兰克)等人，1980,Cell(细胞)21:285-294；Christensen(克里斯滕森)等人，1992,Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)18:675-689；Zhang(张)等人，1991,Plant Cell(植物细胞)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织(例如种子、马铃薯块茎、和果实)(Edwards(爱德华兹)和Coruzzi(科鲁兹)，1990,Ann.Rev.Genet.(遗传学年鉴)24:275-303)，或来自代谢库组织(例如分生组织)(Ito(伊藤)等人，1994,Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)24:863-878)，种子特异性启动子，例如来自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu(吴)等人，1998,Plant CellPhysiol.(植物与细胞生理学)39:885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(Conrad(康拉德)等人，1998,J.Plant Physiol.(植物生理学杂志)152:708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen(陈)等人，1998,Plant Cell Physiol.(植物与细胞生理学)39:935-941)，来自欧洲油菜的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，例如来自水稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka(京冢)等人，1993,Plant Physiol.(植物生理学))，102:991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra(密特拉)和Higgins(希金斯)，1994,Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)26:85-93)，来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya(加贺)等人，1995,Mol.Gen.Genet.(分子和普通遗传学)248:668-674)，或伤口可诱导的启动子，例如马铃薯pin2启动子(Xu(徐)等人，1993,PlantMol.Biol.(植物分子生物学)22:573-588)。同样，启动子可通过非生物处理，例如温度、干旱、或盐度变化来诱导，或通过外源施加激活启动子的物质(例如乙醇，雌激素，植物激素例如乙烯、脱落酸、和赤霉酸，以及重金属)来诱导。

启动子增强子元件也可以用于实现变体在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子与编码变体的多核苷酸之间的内含子。例如Xu(徐)等人，1993，同上披露了使用水稻肌动蛋白1基因的第一内含子来增强表达。

该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。

可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(Gasser(加塞尔)等人，1990,Science(科学)244:1293；Potrykus(波特里库斯)，1990,Bio/Technology(生物/技术)8:535；Shimamoto(岛本)等人，1989,Nature(自然)338:274)。

根癌农杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物(有关评述，参看霍伊卡(Hooykas)和斯查珀特(Schilperoort)，1992，Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)19:15-38)和用于转化单子叶植物的方法，尽管其他转化方法也可以用于这些植物。一种用于产生转基因单子叶植物的方法是胚性愈伤组织或发育的胚的粒子轰击(用转化DNA包衣的微观金或钨颗粒)(Christou(克里斯托)，1992,Plant J.(植物杂志)2:275-281；Shimamoto(岛本)，1994,Curr.Opin.Biotechnol.(生物技术新见)5:158-162；Vasil(瓦西尔)等人，1992,Bio/Technology(生物/技术)10:667-674)。如Omirulleh(奥米如列)等人，1993,Plant Molecular Biology(植物分子生物学)21:415-428中所述，单子叶植物转化的替代方法是基于原生质体转化。另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204(两者都通过引用以其全文结合于此)中所描述的那些。

在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型外，还可以通过使具有该构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物进行杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码变体的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此类后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204中。

植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包含被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。

可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。

本发明还涉及产生本发明的变体的方法，这些方法包括：(a)在有益于产生该变体的条件下培养包含编码该变体的多核苷酸的一种转基因植物或一种植物细胞；并且任选地(b)回收该变体。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。

实例

菌株

使用米曲霉菌株PFJO218(amy^-、alp^-、Npl^-、CPA^-、KA^-、pyrG^-、ku70^-；美国专利申请20100221783)作为GH61多肽变体的表达宿主。

还使用米曲霉菌株COLs1300作为GH61多肽变体的表达宿主。通过缺失启动子以及亚硝酸盐还原酶(niiA)基因和硝酸盐还原酶(niaD)基因二者的5'部分而从米曲霉PFJ0220(EP 2 147 107B1)产生黑曲霉COLs1300(amyA、amyB、amyC、alpA、nprA、kusA、niaD、niiA、amdS+)。

培养基和试剂

AMG痕量金属溶液由以下构成：14.3g的ZnSO₄·7H₂O、2.5g的CuSO₄·5H₂O、0.5g的NiCl₂·6H₂O、13.8g的FeSO₄·7H₂O、8.5g的MnSO₄·H₂O、3g的柠檬酸，以及去离子水补足1升。

COLs1300原生质体化培养基由100ml的蔗糖培养基和1ml的1M尿素构成。

COLs1300原生质体化溶液由以下构成：80mg的

(诺维信公司，丹麦鲍斯韦(Bagsvaerd,Denmark))、0.5mg/ml的壳多糖酶(西格玛化学有限公司，美国密苏里州圣路易斯)、10ml的1.2M MgSO₄、以及100μl的1M NaH₂PO₄(pH 5.8)。

COVE-N-Gly平板由以下构成：50ml的COVE盐溶液、218g的山梨糖醇、10g的甘油、2.02g的KNO₃、25g的诺布尔(Noble)琼脂、以及去离子水补足至1升。

具有10mM尿苷的COVE-N-Gly平板由以下构成：50ml的COVE盐溶液、218g的山梨糖醇、10g的甘油、2.02g的KNO₃、25g的诺布尔琼脂、以及去离子水补足至1升；然后以10mM的浓度向各个平板中添加尿苷。

COVE盐溶液由以下构成：26g的KCl、26g的MgSO₄·7H₂O、76g的KH₂PO₄、50ml的COVE痕量元素溶液、以及去离子水补足至1升。

COVE痕量元素溶液由40mg的Na₂B₄O₇·10H₂O、0.4g的CuSO₄·5H₂O、1.2g的FeSO₄·7H₂O、0.7g的MnSO₄·H₂O、0.8g的Na₂MoO₂·2H₂O、10g的ZnSO₄·7H₂O及补足到1升的去离子水构成。

LB琼脂由5g淀粉(默克公司(Merck)，怀特豪斯，新泽西州，美国(WhitehouseStation,NJ,USA))、37g LB琼脂(西格玛化学有限公司(Sigma Chemical Co.,Inc.)，美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO,USA))及补足到1升的去离子水构成。

LB+Amp琼脂平板由以下构成：每ml补充有150μg氨苄青霉素的LB琼脂。

M400培养基由以下构成：50g的麦芽糖糊精、2g的MgSO₄·7H₂O、2g的KH₂PO₄、4g的柠檬酸、8g的酵母提取物、2g的尿素、0.5ml的AMG痕量金属溶液、0.5g的CaCl₂、以及去离子水补足至1升；用NaOH调节至pH 6。在pH调节之后，添加0.7ml的消泡剂。

豪华培养液(Magnificent Broth)由以下构成：50g的豪华培养液粉(麦克康纳尔研究公司(MacConnell Research Corp.)美国加州圣迭戈(San Diego,CA,USA))以及去离子水补足至1升。

MaltV1培养基由以下构成：20g的麦芽糖、10g的细菌蛋白胨、1g的酵母提取物、1.45g的(NH₄)₂SO₄、2.08g的KH₂PO₄、0.28g的CaCl₂、0.42g的MgSO₄·7H₂O、0.42ml的木霉痕量金属溶液、0.48g的柠檬酸、19.52g的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、以及去离子水补足至1升；用NaOH调节至pH 5.5。

MDU2BP培养基(pH 5.0)由以下构成：135g的麦芽糖、3g的MgSO₄·7H₂O、3g的NaCl、6g的K₂SO₄、36g的KH₂PO₄、21g的酵母提取物、6g的尿素、1.5ml的AMG痕量金属溶液、以及去离子水补足至1升。

PEG溶液由以下构成：6g的聚乙二醇4000(PEG 4000)、100μl的1M Tris(pH 7.5)、100μl的1M CaCl₂、以及去离子水补足至10ml。

原生质体化培养基由以下构成：92ml的转化蔗糖培养基、2ml的1M尿苷、1ml的1MNaNO₃、以及10ml的YP培养基。

原生质体化溶液由以下构成：15ml的1.2M MgSO₄、150μl的1M NaH₂PO₄(pH 5.8)、100mg的

(诺维信公司，丹麦鲍斯韦)、以及10mg的壳多糖酶(西格玛化学有限公司，美国密苏里州圣路易斯)。

ST溶液由以下构成：1.5ml的2M山梨糖醇、500μl的1M Tris(pH 7.5)、以及去离子水补足至5ml。

STC溶液由以下构成：60ml的2M山梨糖醇、1ml的1M Tris(pH 7.5)、1ml的1MCaCl₂、以及去离子水补足至100ml。

蔗糖培养基由以下构成：20ml的COVE盐溶液、342g的蔗糖、以及去离子水补足至1升。

蔗糖琼脂平板由以下构成：20ml的木霉痕量金属溶液、20g的诺布尔琼脂、342g的蔗糖、以及去离子水补足至1升。

TAE缓冲液由以下构成：40mM的2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇、20mM的冰醋酸、以及2mM乙二胺四乙酸(pH 8.0)。

TBE缓冲液由以下构成：10.8g的Tris碱、5.5g的硼酸、以及0.74g的EDTA(pH 8)于补足至1升的去离子水中。

TE缓冲液由以下构成：10mM Tris-0.1mM EDTA(pH 8)。

顶层琼脂由以下构成：500ml的蔗糖培养基、5g的低熔点琼脂糖、以及10ml的20mMTris(pH 7.5)。

转化蔗糖培养基由以下构成：70ml的1M蔗糖以及20ml的COVE盐溶液。

木霉痕量金属溶液由以下构成：216g的FeCl₃·6H₂O、58g的ZnSO₄·7H₂O、27g的MnSO₄·H₂O、10g的CuSO₄·5H₂O、2.4g的H₃BO₃、336g的柠檬酸、以及去离子水补足至1升。

2XYT琼脂平板由以下构成：16g的胰蛋白胨、10g的酵母提取物、5g的NaCl、15g的细菌琼脂(Bacto agar)、以及去离子水补足至1升。

2XYT+Amp琼脂平板由以下构成：每ml补充有100μg氨苄青霉素的2XYT琼脂。

YP培养基由以下构成：10g细菌酵母提取物、20g的细菌蛋白胨、以及去离子水补足至1升。

实例1：表达载体pMMar44、pMMar49、pMMar45、以及pDFng113的构建

如下所述构建质粒pMMar44，以表达烟曲霉GH61B多肽并且生成突变体基因文库。此外，如下所述构建质粒pMMar49、pMMar45、以及pDFng113，以分别表达烟曲霉GH61B多肽变体(WO 2012/044835)、青霉属物种(埃默森)GH61A多肽(下文埃默森青霉GH61A多肽)、以及金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽，并且生成变体。

用Bam HI和Not I消化含有用于在曲霉菌属中自主维持的AMA序列的质粒pENI2376(美国专利申请20060234340)，以使该质粒线性化并且去除一个8bp片段。使用PCR纯化试剂盒(凯杰有限公司(QIAGEN Inc.)，美国加州瓦伦西亚(Valencia,CA,USA))纯化消化的质粒。

使用表1中示出的引物从以下描述的源质粒扩增烟曲霉GH61B多肽编码序列(图1；SEQ ID NO:29[基因组DNA序列]和SEQ ID NO:30[推导的氨基酸序列])、突变的烟曲霉GH61B多肽编码序列(WO 2012/044835)、埃默森青霉GH61A多肽编码序列(SEQ ID NO:35[基因组DNA序列]和SEQ ID NO:36[推导的氨基酸序列])、以及金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列(SEQ ID NO:13[基因组DNA序列]和SEQ ID NO:14[推导的氨基酸序列])。粗体字母代表编码序列。其余序列与pENI2376的插入位点同源用于表达GH61多肽编码序列。

表1

以下描述含有烟曲霉GH61B多肽编码序列的质粒pMMar44的构建。使用表1中示出的具有被设计来克隆到质粒pENI2376中的突出端的引物、从质粒pAG43(WO 2010/138754)扩增烟曲霉GH61B多肽编码序列。

将五十皮摩尔的表1中列出的每种引物用于最终体积为50μl的由以下构成的PCR：90ng的pAG43、1X

2PCR缓冲液(科隆达实验室有限公司(ClontechLaboratories,Inc.)，美国加州山景城(Mountain View,CA,USA))、1μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及1X

2DNA聚合酶混合物(科隆达实验室有限公司，美国加州山景城)。使用

5333(艾本德科技有限公司(Eppendorf Scientific,Inc.)，美国纽约韦斯特伯里(Westbury,NY,USA))执行扩增，其被编程为：1个循环，在95℃下持续1分钟；30个循环，每个循环在95℃下持续30秒、60℃下持续30秒、以及72℃下持续1分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。然后将加热块转到4℃浸泡循环。

将反应产物通过使用TBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中将大约862bp的PCR产物条带从凝胶切离，并且使用

凝胶提取试剂盒(凯杰有限公司，美国加州瓦伦西亚)进行提取。

使用IN-FUSION^TM

PCR克隆试剂盒(科隆达实验室有限公司，美国加州山景城)将862bp PCR产物与消化的pENI2376的同源末端连接在一起。将总共63ng的862bp PCR产物和200ng的Bam HI/Not I消化的pENI2376用于最终体积为20μl的由以下构成的反应：4μl的5X IN-FUSION^TM反应缓冲液(科隆达实验室有限公司，美国加州山景城)以及2μl的IN-FUSION^TM酶(科隆达实验室有限公司，美国加州山景城)。将该反应在37℃下孵育15分钟，其后在50℃下15分钟，并且接着置于冰上。用TE缓冲液将反应体积增加至100μl，并且根据制造商的说明将2μl的反应转化到大肠杆菌

超级感受态细胞(Stratagene公司，美国加州拉霍亚(La Jolla,CA,USA))中。在2XYT+Amp琼脂平板上对大肠杆菌转化体进行选择。使用

9600(QIAGEN公司，瓦伦西亚(Valencia)，加利福尼亚州，美国)制备来自若干生成的大肠杆菌转化体的质粒DNA。烟曲霉GH61B多肽编码序列插入物用3130xL型遗传分析器(Applied

生命技术公司(LifeTechnologies)，格兰德岛，纽约，美国)，以及来自

终止子v3.1循环测序试剂盒(Applied

生命技术公司)的染料终止子化学，通过DNA测序来证实。用于基因插入物和序列的验证的测序引物在以下示出。

引物996271：

ACTCAATTTACCTCTATCCACACTT(SEQ ID NO:179)

引物pALLO2 3’：

GAATTGTGAGCGGATAACAATTTCA(SEQ ID NO:180)

选择含有正确的烟曲霉GH61B多肽编码序列的质粒并且命名为pMMar44(图2)。

以下描述质粒pMMar49的构建，该质粒含有八个碱基对改变，导致烟曲霉GH61B多肽的四个氨基酸突变(WO 2012/044835)。使用表1中示出的具有被设计来克隆到质粒pENI2376中的突出端的引物,从质粒pTH230扩增突变的烟曲霉GH61B多肽编码序列(WO2012/044835)。

将五十皮摩尔的表1中列出的每种引物用于最终体积为50μl的由以下构成的PCR：100ng的pTH230、1X

5333执行扩增，其被编程为：1个循环，在95℃下持续1分钟；30个循环，每个循环在95℃下持续30秒、60℃下持续30秒、以及72℃下持续1分钟；以及最终延长，在72℃下持续7分钟。接着将加热块进行4℃浸泡循环。

凝胶提取试剂盒进行提取。

使用IN-FUSION^TM

PCR克隆试剂盒将862bp PCR产物与消化的pENI2376的同源末端连接在一起。将总共90ng的862bp PCR产物和220ng的Bam HI/Not I消化的pENI2376用于最终体积为20μl的由以下构成的反应：4μl的5X IN-FUSION^TM反应缓冲液以及2μl的IN-FUSION^TM酶。将该反应在37℃下孵育15分钟，其后在50℃下15分钟，并且接着置于冰上。用TE缓冲液将反应体积增加至100μl，并且根据制造商的说明将2μl的反应转化到大肠杆菌

超级感受态细胞中。在2XYT+Amp琼脂平板上对大肠杆菌转化体进行选择。使用

9600从若干所得大肠杆菌转化体制备质粒DNA。突变的烟曲霉GH61B多肽编码序列插入物用3130xL型遗传分析器以及来自

终止子v3.1循环测序试剂盒的染料终止子化学，通过DNA测序来证实。测序引物996271和pALLO2 3’用于基因插入物和序列的验证。

选择含有正确的突变型烟曲霉GH61B多肽编码序列的质粒并且命名为pMMar49(图3)。

以下描述含有埃默森青霉GH61A多肽编码序列的质粒pMMar45的构建。使用表1中示出的具有被设计来克隆到质粒pENI2376中的突出端的引物、从含有埃默森青霉GH61A多肽编码序列的质粒pDM286扩增埃默森青霉GH61A多肽编码序列。

根据以下方案构建质粒pDM286。使用PHUSION^TM高保真度热启动DNA聚合酶(Finnzymes Oy公司，芬兰埃斯波(Espoo,Finland))以及以下示出的基因特异性正向和反向引物，从质粒pGH61D23Y4(WO 2011/041397)扩增埃默森青霉GH61A多肽基因。处于斜体的区域代表与插入位点同源的载体。

正向引物：

5'-CGGACTGCGCACCATGCTGTCTTCGACGACTCGCAC-3'(SEQ ID NO:181)

反向引物：

5'-TCGCCACGGAGCTTATCGACTTCTTCTAGAACGTC-3'(SEQ ID NO:182)

扩增反应含有30ng的质粒pGH61D23Y4、50皮摩尔的以上列出的每种引物、1μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的10mM共混物、1X PHUSION^TM高保真度热启动DNA聚合酶缓冲液(Finnzymes Oy公司，芬兰埃斯波)以及1个单位的PHUSION^TM高保真度热启动DNA聚合酶，最终体积为50μl。

扩增反应在

5333epgradient S(艾本德科技有限公司，美国纽约韦斯特伯里)中孵育，其被编程为：1个循环，在98℃下持续30秒；35个循环，每个循环在98℃下持续10秒、60℃下持续30秒、以及72℃下持续30秒；以及1个循环，在72℃下持续10分钟。

PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳进行分离。将0.87kb的片段从凝胶切离并且使用

提取II试剂盒(Macherey-Nagel有限公司，美国宾夕法尼亚州伯利恒(Bethlehem,PA,USA))进行提取。

用Nco I和Pac I消化质粒pMJ09(US 2005/0214920 A1)，并且在消化之后，通过使用TBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离消化的载体，其中将大约7.1kb的片段从凝胶切离并且使用

凝胶提取试剂盒进行提取。使用IN-FUSION^TM

PCR克隆试剂盒根据制造商的方案将0.87kb PCR产物插入Nco I/Pac I消化的pMJ09中。IN-FUSION^TM反应由以下构成：1X IN-FUSION^TM反应缓冲液、180ng的Not I/Pac I消化的质粒pMJ09、108ng的0.87kb PCR产物、以及1μl的IN-FUSION^TM酶，反应体积为10μl。该反应在37℃下孵育15分钟，并且接着在50℃下持续15分钟。向该反应中添加40μl的TE，并且使用2μl来根据制造商的方案转化ONE

TOP10感受态细胞(英杰公司(Invitrogen)，美国加州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA,USA))。在2XYT+Amp琼脂平板上对大肠杆菌转化体进行选择。使用

9600从若干所得大肠杆菌转化体制备质粒DNA。插入物用3130xL型遗传分析器以及来自

终止子v3.1循环测序试剂盒的染料终止子化学，通过DNA测序来证实。鉴定出含有插入物而没有PCR错误的一个克隆并命名为质粒pDM286。可以用Pme I消化质粒pDM286，以生成用于里氏木霉转化的大约5.4kb片段。这个5.4kb片段含有表达盒[里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶(CBHI)启动子、埃默森青霉糖基水解酶61A(GH61A)基因、里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶(CBHI)终止子]以及构巢曲霉乙酰胺酶(amdS)基因。

为了构建pMMar45，将50皮摩尔的表1中列出的每种引物用于最终体积为50μl的由以下构成的PCR：120ng的pDM286、1X

PCR缓冲液(罗氏诊断产品有限公司(RocheDiagnostics,Inc.)，美国印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,IN,USA))、1μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及1X

DNA聚合酶混合物(罗氏诊断产品有限公司，美国印第安纳州印第安纳波利斯)。使用

5333执行扩增，其被编程为：1个循环，在95℃下持续1分钟；30个循环，每个循环在95℃下持续30秒、60℃下持续30秒、以及72℃下持续1分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行4℃浸泡循环。

将反应产物通过使用TBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中将大约762bp的PCR产物条带从凝胶切离，并且使用

凝胶提取试剂盒进行提取。

使用IN-FUSION^TM

PCR克隆试剂盒将762bp PCR产物与Bam HI/Not I消化的pENI2376的同源末端连接在一起。将总共90ng的762bp PCR产物和200ng的消化的pENI2376用于最终体积为20μl的由以下构成的反应：4μl的5X IN-FUSION^TM反应缓冲液以及2μl的IN-FUSION^TM酶。将该反应在37℃下孵育15分钟，其后在50℃下15分钟，并且接着置于冰上。用TE缓冲液将反应体积增加至100μl，并且根据制造商的说明将2μl的反应转化到大肠杆菌

9600从若干所得大肠杆菌转化体制备质粒DNA。埃默森青霉GH61A多肽编码序列插入物用3130xL型遗传分析器以及来自

选择含有正确的埃默森青霉GH61A多肽编码序列的质粒并且命名为pMMar45(图4)。

以下描述含有金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列的质粒pDFng113的构建。使用表1中示出的具有被设计来克隆到质粒pENI2376中的突出端的引物,从质粒pDZA2(WO2005/074656)扩增金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列。

将五十皮摩尔的表1中列出的每种引物用于最终体积为50μl的由以下构成的PCR：100ng的pDZA2、1X

PCR缓冲液、1μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及1X

DNA聚合酶混合物。使用

5333执行扩增反应，其被编程为：1个循环，在94℃下持续2分钟；30个循环，每个循环在94℃下持续15秒、59.9℃下持续30秒、以及72℃下持续1分钟；以及最终延长，在72℃下持续7分钟。然后将加热块转到4℃浸泡循环。

将反应产物通过使用TBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中将大约822bp的PCR产物条带从凝胶切离，并且使用

凝胶提取试剂盒进行提取。

使用IN-FUSION^TM

PCR克隆试剂盒将822bp PCR产物与Bam HI/Not I消化的pENI2376的同源末端连接在一起。将总共37ng的799bp PCR产物和200ng的消化的pENI2376用于最终体积为20μl的由以下构成的反应：4μl的5X IN-FUSION^TM反应缓冲液以及2μl的IN-FUSION^TM酶。将该反应在37℃下孵育15分钟，其后在50℃下15分钟，并且接着置于冰上。用TE缓冲液将反应体积增加至50μl，并且根据制造商的说明将2μl的反应转化到大肠杆菌

超感受态细胞(Stratagene公司，美国加州拉霍亚(La Jolla,CA,USA))中。在2XYT+Amp琼脂平板上对大肠杆菌转化体进行选择。使用

9600自若干所得大肠杆菌转化体制备质粒DNA。金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列插入物用3130xL型遗传分析器以及来自

选择含有正确的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列的质粒并且命名为pDFng113(图5)。

实例2：烟曲霉GH61B多肽位点饱和文库的构建

烟曲霉GH61B多肽编码序列的位点饱和文库由GeneArt AG(德国雷根斯堡(Regensburg,Germany))合成。对于总共165个残基，除去最保守残基，平均每个位置合成16.8个突变，得到总共2768种突变体。含有具有已知突变的突变质粒的大肠杆菌DH10B(英杰，美国加州卡尔斯巴德)菌株阵列化在96孔平板中作为50μl甘油原种，并且在-80℃下储存。

通过使用无菌96孔复制器将GeneArt平板压印到含100μg/ml的氨苄青霉素的2XYT琼脂平板上，从解冻的GeneArt平板产生DNA。该琼脂平板在37℃下孵育过夜。从该琼脂平板所得的克隆被用于接种96深孔块，其中每孔含有补充有400μg氨苄青霉素(每ml)的1ml豪华培养液。用气孔可透气盖覆盖该块并且接着在加湿箱中在37℃、350rpm下过夜。在1100x g下将该块离心10分钟并且弃去上清液。使用

9600从细胞沉淀中提取质粒。

实例3：烟曲霉GH61B多肽和埃默森青霉GH61A多肽的野生型与变体在米曲霉PFJO218中的表达

将米曲霉PFJO218在具有10mM尿苷的COVE-N-Gly平板上孵育并且在34℃下孵育直到合生。通过用8ml的0.01％

20洗涤从该平板收集孢子。将1ml的孢子悬浮液用于接种500ml聚碳酸盐摇瓶中的103ml的原生质体化培养基。将该摇瓶在30℃下孵育，并且在180rpm下振荡17-20小时。通过衬有

(Calbiochem，美国加州拉霍亚)的漏斗过滤菌丝体并且用200ml的0.6M MgSO₄洗涤。将洗涤的菌丝体在125ml无菌聚碳酸盐摇瓶中的15ml的原生质体化溶液中重悬并且在冰上孵育5分钟。向摇瓶中添加12mg牛血清白蛋白/ml去离子水的溶液1ml，并且接着将该摇瓶在37℃下、在70rpm下混合孵育1-3小时，直到原生质体化完成。通过衬有

的漏斗将菌丝体/原生质体混合物过滤到50ml锥形管中，并且用5ml的ST溶液覆盖。在低加速/减速下将该50ml锥形管在1050x g下离心15分钟。离心后，液体被分成3相。将含有原生质体的中间相转移到新的50ml锥形管。向原生质体中添加两体积的STC溶液，随后在1050x g下简短离心5分钟。弃去上清液。用20ml的STC洗涤原生质体两次,其中重悬原生质体沉淀、在1050x g下离心10分钟、并且每次撇出上清液。在最终撇出后，在STC中在1x 10⁸/ml浓度下重悬原生质体沉淀。将原生质体冰冻于-80°直到转化。

在其中每孔有3.5μl的PEG溶液的24孔平板中，使用1.3μl体积的每种突变质粒转化3.5μl的米曲霉PFJO218原生质体。还如上将质粒pMMar44、或pMMar45(表1)转化到米曲霉PFJO218原生质体中，以提供包含烟曲霉或埃默森青霉野生型GH61多肽的培养液。将该24孔平板在37℃下静止孵育30分钟，其后添加28.6μl的含有10mM NaNO₃和14.3μl的STC的转化蔗糖培养基。然后将该24孔平板置于加湿箱中在37℃下静止持续7天。在第7天，向每孔添加1ml的MaltV1培养基。将该平板返回加湿箱中在39℃下静止并且再孵育5天。使用移液管收获至少550μl的每种变体或野生型烟曲霉或埃默森青霉GH61多肽的培养液，以去除菌丝体面并且吸出液体，用于使用PASC作为底物进行测定。产生具有使用PASC测定(实例5)的改善的热稳定性的变体的突变质粒被再次转化并且使用上述方案重新测试。

对一些变体进行孢子纯化用于进一步特征化。在7天的转化孵育之后并且在添加1ml的MaltV1表达培养基之前，将一个环在来自转化的初始生长上碰擦以收集孔中的孢子。然后将孢子在COVE-N-Gly平板上划线并且在37℃下孵育大约36小时。将单个单独的转化体从平板上切除并且转移到新鲜的COVE-N-Gly平板上。将这些平板储存在34℃下直到合生。一旦合生，则将浸泡在0.01％

20中的环在孢子上碰擦，其接着用于接种24孔平板，其中每孔含有1ml的MaltV1表达培养基。将该24孔平板置于39℃下的加湿箱中。在第五天，通过去除菌丝体面并且用移液管向上吸取培养液来收获样品。

实例4：烟曲霉β-葡糖苷酶的制备

根据WO 2005/047499使用米曲霉作为宿主重组制备烟曲霉NN055679Cel3Aβ-葡糖苷酶(SEQ ID NO:169[DNA序列]和SEQ ID NO:170[推导的氨基酸序列])。

用20％乙酸钠将过滤的培养液调节至pH 8.0，这使得该溶液浑浊。为了除去混浊，将该溶液进行离心(20000x g，20分钟)，并且通过0.2μm过滤装置(耐洁公司(Nalgene)，罗切斯特，纽约，美国)过滤上清液。用去离子水稀释滤液，以达到与50mM Tris/HCl(pH 8.0)相同的传导率。将调节的酶溶液施加到用50mM Tris-HCl(pH 8.0)平衡的Q

Fast Flow柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，美国新泽西州皮斯卡特维(Piscataway,NJ,USA))中，并且用0至500mM氯化钠的线性梯度洗脱。合并各部分并且用1％(w/v)活性炭处理，以从β-葡糖苷酶池去除颜色。由通过0.2μm过滤装置(耐洁公司，美国纽约罗切斯特)过滤悬浮液去除炭。将滤液用20％乙酸调节至pH 5.0并且用去离子水稀释10倍。将调节的滤液施加到用10mM琥珀酸(pH 5.0)平衡的SP

Fast Flow柱(通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)中，并且用0至500mM氯化钠的线性梯度洗脱。使用微平板BCA^TM蛋白质测定试剂盒(赛默飞世尔科技(Thermo FischerScientific)，美国麻萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA,USA))来测定蛋白质浓度，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准。

实例5：烟曲霉GH61B和埃默森青霉GH61A多肽变体文库的筛选

使用具有

热循环器(伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)，美国加州里士满(Richmond,CA,USA))的

FX实验室自动工作站(贝克库曼特(Beckman Coulter)，美国加州富尔顿(Fullerton,CA,USA))，将来自MaltV1培养基(实例3)中生长的烟曲霉GH61B变体和亲本(野生型)多肽的文库平板的80μl的每种培养液样品与20μl的1M乙酸钠-10mM MnSO₄ pH 5.0缓冲液混合。取决于文库，然后将这些样品在62℃、65℃、68℃、72℃、或75℃下热激发20分钟并且与环境温度对照相比较。在热激发之后，在2mM MnSO₄-200 mM乙酸钠(pH 5)中将这些培养液样品稀释1.25、2.5、6.25、以及15.625倍，并且接着将12.5μl的稀释液转移到384孔聚丙烯测定平板中，该平板含有25μl的1％磷酸膨胀纤维素(PASC)和12.5μl的辅因子溶液(400mM乙酸钠(pH 5)、4mM MnSO₄、0.4％没食子酸、0.1mg/ml的烟曲霉β-葡糖苷酶、以及0.04％

X100)。使用ALPS-300^TM(阿博基因公司(Abgene)，英国埃普索姆(Epsom,United Kingdom))用塑料板将这些板热密封并且在40℃下孵育4天。

缓冲液处理的培养液样品的背景葡萄糖浓度在孵育之前通过每升使用以下试剂执行葡萄糖测定进行测定：0.9951g的ATP、0.5176g的NAD、0.5511g的MgSO₄·7H₂O、20.9g的MOPS、1000单位的己糖激酶、1000单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、以及0.01％

X-100(pH 7.5)。

FX实验室自动工作站用于这个测定。使用水作为稀释剂在384孔聚苯乙烯平板中执行四个2倍连续稀释。向新的384孔聚苯乙烯平板中添加5μl的稀释液，其后添加60μl的以上试剂。将该平板在环境温度(22℃±2℃)下孵育30至45分钟。在360nm的激发和465nm的发射下使用DTX 880平板读取器(贝克库曼特，美国加州富尔顿)测定相对荧光单位(RFU)，并且与在与样品相同的平板中稀释的葡萄糖标准(1mg/ml和0.125mg/ml)相比较。在第四天末，使用上述葡萄糖测定针对葡萄糖浓度对40℃孵育的PASC平板进行分析。从适当样品中减去任何背景葡萄糖，并且然后通过将环境样品处理的PASC测定中释放的葡萄糖与热激发样品的PASC测定中释放的葡萄糖相比较来计算残余活性。在计算中仅使用拟合曲线中的线性部分的数据(定义为在含有5mg/ml PASC的测定中产生小于或等于1mg/ml葡萄糖)。用于计算热处理的残余活性的公式如下：(热处理样品产生的mg/ml葡萄糖/环境处理样品产生的mg/ml葡萄糖)x 100％。改进的变体是与来自处于至少一种热处理条件的MaltV1培养基的野生型烟曲霉GH61A多肽培养液相比，具有较高残余活性％的那些。全部计算使用

(微软公司(Microsoft Corporation)，美国华盛顿州雷德蒙德(Redmond,WA,USA))。

实例6：通过热处理后的残余活性测量的烟曲霉GH61B变体的热稳定性

基于如实例5中描述的残余活性比，在之前实例中构建的文库的筛选产生表2中列出的结果。

表2示出在62℃、65℃、或68℃下处理后(来自每种变体和野生型对照的3-5个样品)的平均残余活性％。当温度从62℃增加至65℃至68℃时，亲本烟曲霉GH61B多肽对应地显示出56％、35％、以及12％的降低的残余活性。与野生型烟曲霉GH61多肽相比，烟曲霉GH61B多肽变体的热稳定性的增加在62℃处理下在从1.02至1.3倍增加范围内、在65℃处理下在1.06至1.7倍增加范围内、并且在68℃处理下在1.3至3.8倍增加范围内。这些结果显示在68℃处理时的改善最显著。

表2.在62℃、65℃、以及68℃处理下具有改善的热稳定性的变体

实例7：烟曲霉GH61B多肽组合变体的热稳定性

构建质粒pLSBF09-3作为后续烟曲霉GH61B组合变体的模板。使用

II XL定点诱变试剂盒(Stratagene，美国加州拉霍亚(La Jolla,CA,USA))，在pMMar49(实例1)上执行单一定点诱变反应来构建这一质粒。设计两种致突变引物以插入所希望的突变。最终体积为50μl的PCR由以下各项构成：每种引物125ng、大致25ng的模板质粒、1X

反应缓冲液(Stratagene公司，美国加州拉霍亚)、3μl的

(Stratagene公司，美国加州拉霍亚)、1μl的XL dNTP混合物、以及1μl的2.5U/μl Pfu ULTRA^TM酶(Stratagene公司，美国加州拉霍亚)。使用

循环变温器执行扩增反应，其被编程为：95℃热启动；1个循环，在95℃下持续1分钟；18个循环，每个循环在95℃下持续50秒、60℃下持续50秒、以及68℃下持续10分钟；以及在4℃下保持。向扩增反应中直接添加一微升的Dpn I，并且在37℃下孵育1小时。根据制造商的说明，使用2μl体积的DpnI消化的反应来转化大肠杆菌XL

超感受态细胞。在2XYT+Amp琼脂平板上对大肠杆菌转化体进行选择。具有所希望的突变的克隆之一命名为pLSBF09-3。使用pLSBF09-3作为模板，构建两种另外的组合质粒。如上所述对质粒pDFng146和pDFng148各自进行诱变处理。在这些反应中使用的引物示于表3中。

表3

通过使用

II XL定点诱变试剂盒在pLSBF09-3或pDFng148之上添加单氨基酸突变来构建烟曲霉GH61B的七种变体(pLSBF15、17、18、20、22、53、和pDFNG145)。上述定点诱变法还用在这些突变的构建中。在这些反应中使用的引物示于表4中。

通过使用

快速多定点诱变试剂盒(Stratagene公司，美国加州拉霍亚)，经由pDFng146或pDFng148的多定点诱变来构建烟曲霉GH61B的四种另外的变体(pLSBF47、48、49、和54)。针对每种所希望的突变设计一种突变引物。在PCR中使用一百ng的每种引物(表4)，最终体积为25μl的该PCR包含以下各项：大致100ng的模板质粒、1X

快速多缓冲液(Stratagene公司，美国加州拉霍亚)、0.5μl的

(Stratagene公司，美国加州拉霍亚)、1μl的dNTP混合物、以及1μl的

快速多酶共混物(Stratagene公司，美国加州拉霍亚)。使用

循环变温器执行扩增反应，其被编程为：95℃热启动；1个循环，在95℃下持续2分钟；30个循环，每个循环在95℃下持续20秒、55℃下持续30秒、以及65℃下持续5分钟；1个循环，在65℃下持续5分钟；以及在4℃下保持。向扩增反应中直接添加一微升的Dpn I，并且在37℃下孵育5分钟。根据制造商的说明，将1.5μl体积的DpnI消化的反应物转化入大肠杆菌XL

超感受态细胞。在2XYT+Amp琼脂平板上对大肠杆菌转化体进行选择。使用

9600自若干所得大肠杆菌转化体制备质粒DNA。插入物用3130xL型遗传分析器以及来自

终止子v3.1循环测序试剂盒的染料终止子化学，通过DNA测序来证实。具有所希望的突变的克隆之一命名为以下列出的每种质粒。根据实例3中描述的程序来执行使用米曲霉PFJO218作为宿主表达烟曲霉GH61A多肽变体。

表4

基于根据实例5测定的残余活性比，在之前实例中构建的文库的筛选产生表5中列出的结果。表5示出在65℃、68℃、72℃、或75℃下处理后的平均残余活性％(针对每种组合变体的2-199个样品，以及针对野生型GH61多肽的34-179个样品)。

当处理温度从65℃增加至68℃至72℃至75℃时，亲本野生型烟曲霉GH61多肽对应地显示出40％、24％、35％、0％、以及0％的降低的残余活性。与野生型烟曲霉GH61多肽相比，烟曲霉GH61B多肽组合变体的热稳定性在65℃下在从0.8倍(下降)至1.4倍(增加)范围内、在68℃下在从无增加至2倍增加范围内。由于野生型GH61多肽在72℃无残余活性，将其他变体(L111V、D152S、M155L、A162W)用于在72℃和75℃下的比较。在这些情况下，这些变体范围是在72℃从无增加至4.4倍增加，在75℃从4倍至33倍增加。这些结果表明对于在75℃下测量的那些，在75℃下处理改善最显著，否则的话它们在72℃下(在此情况下，野生型不具有可测量的残余活性)最显著。

表5.在65℃、68℃、72℃、或75℃处理下具有改善的热稳定性的烟曲霉GH61B多肽变体

实例8：烟曲霉GH61B和埃默森青霉GH61多肽变体的纯化

如之前在WO 2012/044835中所描述对野生型烟曲霉GH61B和埃默森青霉GH61多肽进行表达和纯化。

将如在实例7和11中所述产生的、表达烟曲霉GH61B和埃默森青霉GH61多肽变体的菌株培养在摇瓶中以产生如下所述用于纯化的材料。在分离单克隆之后，将米曲霉PFJO218转化体在34℃下在COVE-N-Gly平板上培养4天，以制备更大规模的发酵。使用0.01％

20从每个平板回收孢子。将每种孢子悬浮液(500μl)接种到125ml塑料摇瓶中的25ml的M400培养基中。在150rpm振荡下将这些转化体在39℃下发酵3天，并且收集培养液并使用0.22μm过滤器过滤。然后使用

100 5kDa MWCO离心浓缩装置(赛多利斯(Sartorius Stedim)，德国哥廷根(Goettingen,Germany))通过离心超滤将过滤的培养液浓缩，并且接着缓冲液交换为20mM Tris-HCl(pH 8.0)。

浓缩的并且缓冲液交换的烟曲霉GH61B和埃默森青霉GH61多肽变体通过一种或多种色谱方法进一步纯化。在一种方法中，该浓缩的并且缓冲液交换的培养液接着各自被施加到用20mM Tris-HCl(pH 8.0)平衡的MONO

HR 16/10柱(通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)。结合的蛋白质用20mM Tris-HCl(pH 8.0)中的0-500mM氯化钠的线性梯度洗脱。各部分使用

无染色Tris-HCl 8％-16％SDS-PAGE凝胶(伯乐实验室有限公司，美国加州赫拉克勒斯)通过SDS-PAGE进行分析,基于约25kDa条带的丰度而池化,并且使用

5kDa MWCO离心浓缩装置(通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)浓缩。可替代地，该浓缩并且脱盐的培养液接着各自被施加到用20mM Tris-HCl(pH8.0)和150mM NaCl平衡过的

26/60

75(通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)尺寸排阻柱。使用20mM Tris-HCl(pH 8.0)和150mM NaCl作为流动相等度洗脱施加的蛋白质。各部分使用

无染色Tris-HCl 8％-16％SDS-PAGE凝胶通过SDS-PAGE进行分析,基于约25kDa条带的丰度而池化,并且使用

5kDaMWCO离心浓缩装置浓缩，并且然后缓冲液交换成20mM MES(pH 6.0)。

使用微平板BCA^TM蛋白质测定试剂盒来测定蛋白质浓度，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准。

实例9：通过差式扫描量热法测定烟曲霉野生型GH61B多肽和烟曲霉GH61B多肽变体的Tm(解链温度)

如在实例8中所述进行纯化的烟曲霉野生型GH61B多肽和烟曲霉GH61B多肽变体的热稳定性使用VP差示扫描量热计(微凯尔有限公司(MicroCal Inc.)，通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)通过差示扫描量热法(DSC)来测定。将解链温度Tm(℃)记为以恒定编程的加热速率加热1mg蛋白质每ml的50mM乙酸钠(pH 5.0)、100μM CuSO₄中的酶溶液、或1mg蛋白质每ml的50mM乙酸钠(pH 5.0)、10mM EDTA(pH 5.0)中的酶溶液之后获得的热谱图(Cp相对于T)中的顶部变性峰值(主热吸收峰)。1ml的样品和参比溶液在装载量热计的样品和参比池之前在25℃下使用ThermoVac(微凯尔有限公司，通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)进行脱气。将样品和参比(参比：脱气的水)溶液手动装载到DSC中并且进行热预平衡至25℃之后以90K/小时的扫描速率从25℃至95℃执行DSC扫描。以大约+/-1℃的精确度测定变性温度。烟曲霉GH61B多肽变体的热稳定性测定的结果在表6中示出。

表6.如通过差示扫描量热法测定的烟曲霉GH61B多肽和烟曲霉GH61B多肽的变体的解链温度(℃)

实例10：通过蛋白质热解折叠分析测定烟曲霉野生型GH61B多肽和烟曲霉GH61B多肽变体的Tm(解链温度)

烟曲霉GH61B多肽变体的蛋白质热解折叠使用宝石橙蛋白染色试剂(

Orange Protein Stain)(英杰，丹麦奈鲁姆(Naerum,Denmark))、使用StepOnePlus^TM实时PCR系统(应用生物系统有限公司，美国加州福斯特市)进行监测。在96孔白色PCR平板中，将100mM乙酸钠(pH 5.0)中的15μl蛋白质样品(如实例8中所述进行制备)与20mM EDTA中的宝石橙(所得浓度＝10X；储备溶液＝DMSO中5000X)混合(1:1)。用光学PCR密封件密封该平板。PCR仪被设置扫描速率为76℃每小时，在25℃下开始，并且在96℃下完成。每20秒使用内置LED蓝光进行激发并且使用ROX过滤器(610nm，发射)来监测荧光。Tm值计算为一阶导数(dF/dK)的最大值(格雷戈里(Gregory)等人，2009，生物分子筛选杂志(J.Biomol.Screen.14:700))。热稳定性测定的结果在表7中示出。

表7.通过热解折叠分析测定的烟曲霉GH61B多肽和变体的解链温度(℃)

突变	Tm
		野生型	59
Q138E	61
		Q138L	62
D152S	65

实例11：埃默森青霉GH61A多肽变体的构建

使用

II XL定点诱变试剂盒，通过在pMMar45(实例1)上的两个连续单定点诱变反应来构建变体质粒pLSBF10。针对每种所希望的突变设计两种突变引物。将总计125ng的每种引物用于最终体积为50μl的含有以下各项的PCR中：大约25ng的模板质粒、1X

反应缓冲液、3μl的

1μl的XL dNTP混合物(提供于

II XL定点诱变试剂盒中)、以及1μl的2.5U/μl Pfu超酶。使用

循环变温器执行PCR，其被编程为：95℃热启动；1个循环，在95℃下持续1分钟；18个循环，每个循环在95℃下持续50秒、60℃下持续50秒、以及68℃下持续10分钟；以及在4℃下保持。向扩增反应中直接添加一微升的Dpn I，并且在37℃下孵育1小时。根据制造商的说明，使用2μl体积的DpnI消化的反应来转化大肠杆菌XL

终止子v3.1循环测序试剂盒的染料终止子化学，通过DNA测序来证实。具有所希望的2个突变的克隆之一命名为pLSBF10。在该反应中使用的引物可以发现于下表8中。

用于定点诱变的引物以及获得的变体(S173C、F253C)的汇总在表8中示出。

使用

9600制备所得突变质粒DNA。使用3130xl遗传分析器对每种突变质粒进行测序以验证取代。测序引物996271和pALLO2 3’用于验证。

表8

根据实例3中描述的程序来执行使用米曲霉PFJO218作为宿主表达埃默森青霉GH61A多肽变体。

实例12：埃默森青霉野生型GH61A多肽和埃默森青霉GH61A多肽变体的热稳定性

基于根据实例5测定的残余活性比，在之前实例中构建的文库的筛选产生表9中列出的结果。表9示出在65℃、68℃、72℃、或75℃任一处理后(来自每种组合变体的2-14个样品和野生型的14个样品)的平均残余活性％。

当处理温度从65℃增加至72℃至75℃时(68℃未进行试验)，亲本野生型埃默森青霉GH61A多肽对应地显示出45％、18％和1％的降低的残余活性。与75℃下野生型埃默森青霉GH61A多肽相比，埃默森青霉GH61A多肽组合变体(S173C、F253C)的热稳定性在72℃下在从0.8倍(下降)至2.2倍(增加)以及30倍范围内。

表9.在65℃、68℃、72℃、或75℃处理下具有改善的热稳定性的埃默森青霉GH61A多肽变体

实例13：通过差式扫描量热法测定埃默森青霉野生型GH61A多肽和埃默森青霉GH61A多肽变体的Tm(解链温度)

如在实例8中所述进行纯化的埃默森青霉野生型GH61A多肽和埃默森青霉GH61A多肽变体(S173C、F253C)的热稳定性使用如在实例9中所述的VP差示扫描量热计通过差示扫描量热法(DSC)来测定。埃默森青霉GH61A多肽变体的热稳定性测定的结果在表10中示出。

表10.如通过差示扫描量热法测定的埃默森青霉野生型GH61A多肽和埃默森青霉GH61A多肽以及埃默森青霉GH61A多肽的变体的解链温度(℃)

实例14：通过蛋白质热解折叠分析测定埃默森青霉野生型GH61A多肽和埃默森青霉GH61A多肽变体的Tm(解链温度)

埃默森青霉GH61A多肽变体(S173C、F253C)的蛋白质热解折叠使用

橙蛋白染色进行监测并且如实例10中所述使用StepOnePlus^TM实时PCR系统执行。如实例11中所述的制备埃默森青霉GH61A野生型多肽和埃默森青霉GH61A多肽变体的培养液。热稳定性测定的结果在表11中示出。

表11.通过蛋白质热解折叠分析得到的埃默森青霉GH61A多肽变体的解链温度(℃)

突变	Tm
		野生型	64
S173C、F253C	69

实例15：表达载体pDFng153-4、pDFng154-17、pDFng155-33、pDFng156-37、以及pDFng157-51的构建

如下所述构建质粒pDFng153-4(图6)、pDFng154-17(图7)、pDFng155-33(图8)、以及pDFng156-37(图9)、和pDFng157-51(图10)，分别用于表达金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽、埃默森青霉GH61A多肽、棘孢曲霉GH61多肽、嗜松青霉GH61多肽、和太瑞斯梭孢壳霉GH61多肽，并且变体的产生列于表12中。使用质粒pBGMH16(图11)构建这些质粒。

根据以下所述的方案构建质粒pBGMH16。用以下所示引物对BGMH24和BGMH25，其后进行基于尿嘧啶特异性切除试剂USER^TM的克隆(纽英伦生物技术(New England BioLabs)，美国麻萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich,MA,USA))通过PCR来去除pUC19中的Nb.BtsI识别位点。质粒pUC19在杨尼斯-佩龙(Yanisch-Perron)等人，1985，基因(Gene)3(1):103-19中描述。

引物BGMH24：

ATGCAGCGCUGCCATAACCATGAGTGA(SEQ ID NO:217)

引物BGMH25：

AGCGCTGCAUAATTCTCTTACTGTCATG(SEQ ID NO:218)

加下划线的序列用于PCR片段的USER^TM辅助融合，从而产生pBGMH13。USER^TM(尿嘧啶特异性切除试剂)酶(纽英伦生物技术，美国麻萨诸塞州伊普斯威奇)在尿嘧啶的位置处生成单一核苷酸缺口。USER^TM酶是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物。UDG催化尿嘧啶碱基的切除，从而形成无碱基(脱嘧啶)位点，而保持磷酸二酯骨架的完整。内切核酸酶VIII的裂解酶活性在碱基位点的3′和5′侧裂解磷酸二酯骨架，这样使得释放无碱基的脱氧核糖。

最终体积为50μl的扩增反应由以下构成：100ng的每种引物、10ng的pUC19、1X

Cx反应缓冲液(Stratagene，美国加州拉霍亚)、2.5μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及2.5单位的

C_x热启动DNA聚合酶(Stratagene，美国加州拉霍亚)。使用

5333执行反应，其被编程为：1个循环，在95℃下持续2分钟；32个循环，每个循环在95℃下持续30秒、55℃下持续30秒、以及72℃下持续3分钟；以及最终延长，在72℃下持续7分钟。添加5μl的10XNEBuffer 4(纽英伦生物技术有限公司，美国麻萨诸塞州伊普斯威奇)和20单位的Dpn I，并且在37℃下孵育1小时。在80℃下持续20分钟使Dpn I失活。将总体积为10μl的总共100ng的PCR产物和1单位的USER^TM酶在37℃下孵育20分钟，接着在25℃下20分钟。将10μl转化到ONE

TOP10感受态细胞中。在LB+Amp琼脂平板上选择大肠杆菌转化体并且使用

SpinMiniprep试剂盒(凯杰有限公司，美国加州瓦伦西亚)制备质粒DNA。所得质粒pBGMH13通过使用一种采用3.1版BIG-DYE^TM终止子化学的应用生物系统公司3730XL型自动DNA测序仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems,Inc.)，美国加州福斯特市(Foster City,CA,USA))进行测序来证实。

质粒pBGMH14含有作为载体骨架的pBGMH13的部分和一个Pac I/Nt.BbvCI USER^TM盒(汉森(Hansen等人，2011，应用与环境微生物学77(9):3044-51)，该盒在一侧侧接米曲霉niaD基因的部分并且在另一侧侧接米曲霉niiA基因的部分。可以用Pac I和Nt.BbvCI使PacI/Nt.BbvCI USER^TM盒线性化，并且具有相容的突出端的PCR产物可以克隆到这个位点(纽英伦生物技术有限公司，美国麻萨诸塞州伊普斯威奇)。

使用下文所示引物BGMH27和BGMH29生成米曲霉niiA片段。下文所示的引物对BGMH28和BGMH32用于扩增米曲霉niaD基因区，而下文所示的引物对BGMH30和BGMH31用于扩增质粒骨架区。

引物BGMH 27：

AATTAAGUCCTCAGCGTGATTTAAAACGCCATTGCT(SEQ ID NO:219)

引物BGMH 28：

ACTTAATUAAACCCTCAGCGCAGTTAGGTTGGTGTTCTTCT(SEQ ID NO:220)

引物BGMH 29：

AGCTCAAGGAUACCTACAGTTATTCGAAA(SEQ ID NO:221)

引物BGMH 30：

ATCCTTGAGCUGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC(SEQ ID NO:222)

引物BGMH 31：

ATCTCCTCUGCTGGTCTGGTTAAGCCAGCCCCGACAC(SEQ ID NO:223)

引物BGMH 32：

AGAGGAGAUAATACTCTGCGCTCCGCC(SEQ ID NO:224)

加下划线的序列用于三种片段的USER^TM辅助融合。以粗体标记的序列用于在niiA与niaD片段之间引入PacI/Nt.BbvCI USER^TM盒(汉森等人，2011，同上)。

来自米曲霉BECH2的基因组DNA(WO 00/39322)使用FASTDNA^TM2ml SPIN土壤用试剂盒(Kit for Soil)(安倍生物医疗(MP Biomedicals)，美国加州圣安娜(Santa Ana,California,USA))进行纯化。

每个PCR最终体积为50μl，由以下构成：100ng的每种引物、模板DNA(pBGMH13或米曲霉BECH2基因组DNA)、1X

C_x反应缓冲液、2.5μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及2.5单位的

C_x热启动DNA聚合酶。使用

5333执行PCR，其被编程为：1个循环，在95℃下持续2分钟；32个循环，每个循环在95℃下持续30秒、55℃下持续30秒、以及72℃下持续4分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。在模板DNA为质粒的情况下，添加5μl的10X NEBuffer 4和20单位的Dpn I，并且在37℃下孵育1小时。在80℃下持续20分钟使Dpn I失活。将总体积为10μl的总共50ng的每种PCR产物和1单位的USER^TM酶在37℃下孵育20分钟，接着在25℃下20分钟。接着将10μl转化到ONE

TOP10感受态细胞中。通过基于尿嘧啶特异性切除试剂的克隆融合这三种片段(努尔-埃尔丁(Nour-Eldin)等人，2010，分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)643:185-200)。在LB+Amp琼脂平板上选择大肠杆菌转化体并且使用

Spin Miniprep试剂盒制备质粒DNA。质粒pBGMH14通过使用一种采用3.1版BIG-DYE^TM终止子化学的应用生物系统公司3730XL型自动DNA测序仪进行测序来证实。启动子P13amy是来自pJaL676(WO 2003/008575)的NA2-tpi启动子的衍生物。使用的黑曲霉AMG终止子由克里斯滕森等人，1988，自然生物技术(Nature Biotechnology)6:141-1422描述。将P13amy启动子和AMG终止子克隆到pBGMH14中的Pac I/Nt.BbvCI USER^TM盒中。设计下文所示的引物，以使在启动子和终止子之间引入Asi SI/Nb.BtsI USER^TM盒(汉森等人，2011，同上)。

引物BGMH 49：

GGGTTTAAUCCTCACACAGGAAACAGCTATGA(SEQ ID NO:225)

引物BGMH 50：

AGTGTCTGCGAUCGCTCTCACTGCCCCCAGTTGTGTATATAGAGGA(SEQ ID NO:226)

引物BGMH 51：

ATCGCAGACACUGCTGGCGGTAGACAATCAATCCAT(SEQ ID NO:227)

Primer BGMH 52:

GGACTTAAUGGATCTAAGATGAGCTCATGGCT(SEQ ID NO:228)

加下划线的序列用于两种片段到PacI/Nt.BbvCI消化的pBGMH14中的USER^TM辅助的融合。以粗体标记的序列用于在启动子与终止子之间引入AsiSI/Nb.BtsI USER^TM盒(汉森等人，2011，同上)。

引物对BGMH49和BGMH50用以扩增启动子P13amy并且引物对BGMH51和BGMH52用以扩增AMG终止子。最终体积为50μl的PCR由以下构成：100ng的每种引物、模板DNA、1X

Cx反应缓冲液、2.5μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及2.5单位的Pfu

Cx热启动DNA聚合酶。使用

5333执行反应，其被编程为：1个循环，在95℃下持续2分钟；32个循环，每个循环在95℃下持续30秒、55℃下持续30秒、以及72℃下持续45秒；以及最终延长，在72℃下持续3分钟。然后添加5μl的10X NEBuffer 4和20单位的Dpn I，并且在37℃下孵育1小时。在80℃下持续20分钟使Dpn I失活。

这两种片段通过基于USER^TM的克隆方法，在总体积为10μl的由10ng的PacI/Nt.BbvCI消化的pBGMH14、50ng的两种PCR产物中的每一种、以及1单位的USER^TM酶构成的反应中融合到PacI/Nt.BbvCI消化的pBGMH14中。将该反应在37℃下孵育20分钟，接着在25℃下孵育20分钟。接着将10μl转化到ONE

Spin Miniprep试剂盒制备质粒DNA。通过测序证实质粒pBGMH16。

通过使用一种采用3.1版BIG-DYE^TM终止子化学的应用生物系统公司3730XL型自动DNA测序仪进行桑格测序(Sanger sequencing)来验证DNA序列。用于BGMH16中的niiA、niaD、P13amy启动子、AsiSI/Nb.BtsI USER^TM盒、以及AMG终止子序列的验证的测序引物在以下示出。

BGMH 36	ACGCCATTGCTATGATGCTTGAAG(SEQ ID NO:229)
		BGMH 37	TGGTGAGGTGCTATCGTCCTT(SEQ ID NO:230)
BGMH 38	CTTCCTGTAGGTGCACCGAAG(SEQ ID NO:231)
		BGMH 39	ACAGAACGATATCGGACCTCG(SEQ ID NO:232)
BGMH 40	TCGTTATGTTAAGTCTTCTATCA(SEQ ID NO:233)
		BGMH 41	AGAGCTCGAAGTTCCTCCGAG(SEQ ID NO:234)
BGMH 42	TATCACGAGGCCCTTTCGTCTC(SEQ ID NO:235)
		BGMH 43	TCCGTCGGCTCCTCTCCTTCGT(SEQ ID NO:236)
BGMH 44	TGCATATCCTCTGACAGTATATGA(SEQ ID NO:237)
		BGMH 45	CAGTGAAGAGGGCAGTCGATAGT(SEQ ID NO:238)
BGMH 46	ACGAGGAACATGGCTATCTGGA(SEQ ID NO:239)
		BGMH 47	TCAGCTCATTCTGGGAGGTGGGA(SEQ ID NO:240)
BGMH 48	ACTCCAGGATCCTTTAAATCCA(SEQ ID NO:241)
		BGMH 53	ACTGGCAAGGGATGCCATGCT(SEQ ID NO:242)
BGMH 54	TGATCATATAACCAATTGCCCT(SEQ ID NO:243)
		BGMH 55	AGTTGTGTATATAGAGGATTGA(SEQ ID NO:244)
BGMH 56	TGGTCCTTCGCTCGTGATGTGGA(SEQ ID NO:245)
		BGMH 57	AGTCCTCAGCGTTACCGGCA(SEQ ID NO:246)
BGMH 58	ACCCTCAGCTGTGTCCGGGA(SEQ ID NO:247)
		BGMH 59	TGGTATGTGAACGCCAGTCTG(SEQ ID NO:248)

质粒pBGMH16含有设计成修复米曲霉COLs1300中的niiA基因和niaD基因的侧翼区。用Asi Si和Nb Bts I消化质粒pBGMH16，以使该质粒线性化并且产生单链突出端，这样使得具有相容突出端的PCR产物可以通过USER^TM克隆(纽英伦生物技术有限公司，美国麻萨诸塞州伊普斯威奇)克隆到这个位点。使用DNA纯化试剂盒(凯杰有限公司，美国加州瓦伦西亚)根据制造商的说明纯化消化的质粒。

使用表12中示出的引物从以下描述的源质粒扩增金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列(SEQ ID NO:13[基因组DNA序列]和SEQ ID NO:14[推导的氨基酸序列])、埃默森青霉GH61A多肽编码序列(SEQ ID NO:35[基因组DNA序列]和SEQ ID NO:36[推导的氨基酸序列])、棘孢曲霉GH61多肽编码序列(SEQ ID NO:67[基因组DNA序列]和SEQ ID NO:68[推导的氨基酸序列])、嗜松青霉GH61多肽编码序列(SEQ ID NO:31[基因组DNA序列]和SEQ IDNO:32[推导的氨基酸序列])、和太瑞斯梭孢壳霉GH61多肽编码序列(SEQ ID NO:45[基因组DNA序列；在此使用cDNA]和SEQ ID NO:46[推导的氨基酸序列])。粗体字母代表编码序列。插入到每个引物中的单个脱氧尿苷(U)残基是使用USER^TM酶(纽英伦生物技术有限公司，美国麻萨诸塞州伊普斯威奇)从PCR产物切除的U，以获得用于插入位点的突出端。加下划线的字母代表His标签。其余序列与pBGMH16的插入位点同源用于表达GH61多肽。

表12

以下描述含有金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列的质粒pDFng153-4的构建。使用表12中示出的具有被设计用于克隆到质粒pBGMH16中的突出端的引物,从质粒pDFng113扩增金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列。最终体积为50μl的扩增由以下构成：100ng的在表12中列出的每种引物、30ng的pDFng113、1X Pfu

Cx热启动DNA聚合酶。使用

5333执行PCR，其被编程为：1个循环，在95℃下持续2分钟；30个循环，每个循环在95℃下持续30秒、57.7℃下持续30秒、以及72℃下持续1.5分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。然后将加热块转到10℃浸泡循环。

通过使用TBE缓冲液的0.7％琼脂糖凝胶电泳对PCR溶液进行分析，其中观察到约894bp PCR产物条带。接着用1μl的Dpn I和4.5μl的NEBuffer 4在37℃下将PCR溶液消化过夜并且使用

纯化试剂盒根据制造商的说明进行纯化。

在由含有894bp PCR产物的10μl的PCR、1μl的Asi SI和Nb.BtsI消化的pBGMH16、以及1μl的USER^TM酶构成的反应中将894bp PCR产物以及Asi SI和Nb.BtsI消化的pBGMH16的同源末端连接在一起。该反应在37℃下孵育15分钟，接着在25℃下15分钟。根据制造商的说明将10μl的反应转化到大肠杆菌XL10-

终止子v3.1循环测序试剂盒的染料终止子化学，通过DNA测序来证实。以下示出的测序引物用于基因插入物和序列的验证。

引物TaGH61seqF：

CCCAGTTATCAACTACCTTG(SEQ ID NO:259)

引物pBGMH16seqF：

CTCAATTTACCTCTATCCAC(SEQ ID NO:260)

引物pBGMH16seqR：

TATAACCAATTGCCCTCATC(SEQ ID NO:261)

选择含有正确的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽编码序列的质粒并且命名为pDFng153-4。

以下描述含有埃默森青霉GH61A多肽编码序列的质粒pDFng154-17的构建。使用表12中示出的具有被设计用于克隆到质粒pBGMH16中的突出端的引物,从质粒pMMar45扩增埃默森青霉GH61A多肽编码序列。最终体积为50μl的扩增由以下构成：100ng的在表12中列出的每种引物、30ng的pMMar45、1X Pfu

C_x反应缓冲液、2.5μl的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP的共混物(各以10mM)、以及2.5单位的Pfu

C_x热启动DNA聚合酶。使用

5333执行扩增，其被编程为：1个循环，在95℃下持续2分钟；30个循环，在95℃下持续30秒、64.1℃下持续30秒、以及72℃下持续1.5分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃浸泡循环。

通过使用TBE缓冲液的0.7％琼脂糖凝胶电泳对PCR溶液进行分析，其中观察到约930bp PCR产物条带。接着用1μl的Dpn I和4.5μl的NEBuffer 4在37℃下将PCR溶液消化过夜并且使用

纯化试剂盒根据制造商的说明进行纯化。

在由含有930bp PCR产物的10μl的PCR溶液、1μl的Asi SI和Nb.BtsI消化的pBGMH16、以及1μl的USER^TM酶构成的反应中将930bp PCR产物以及Asi SI和Nb.BtsI消化的pBGMH16的同源末端连接在一起。该反应在37℃下孵育15分钟，接着在25℃下15分钟。根据制造商的说明将10μl的反应转化到大肠杆菌XL10-

9600自若干所得大肠杆菌转化体制备质粒DNA。埃默森青霉GH61A多肽编码序列插入物用3130xL型遗传分析器以及来自

终止子v3.1循环测序试剂盒的染料终止子化学，通过DNA测序来证实。测序引物pBGMH16seqF和pBGMH16seqR以及以下示出的引物PeGH61seqF用于基因插入物和序列的验证。

PeGH61seqF：

GCACCGTCGAGCTGCAGTGG(SEQ ID NO:261)

选择含有正确的埃默森青霉GH61A多肽编码序列的质粒并且命名为pDFng154-17。

以下描述含有棘孢曲霉GH61A多肽编码序列的质粒pDFng155-33的构建。使用表12中示出的具有被设计用于克隆到质粒pBGMH16中的突出端的引物,从质粒Xyz1566(WO2012/030799，实例3)扩增棘孢曲霉GH61A多肽编码序列。最终体积为50μl的扩增反应由以下构成：100ng的在表12中列出的每种引物、30ng的质粒Xyz1566、1X Pfu

C_x热启动DNA聚合酶。使用

5333(艾本德科技有限公司)执行扩增，其被编程为：1个循环，在95℃下持续2分钟；30个循环，每个循环在95℃下持续30秒、63.4℃下持续30秒、以及72℃下持续1.5分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。然后将加热块转到10℃浸泡循环。

通过使用TBE缓冲液的0.7％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物溶液进行分析，其中观察到约1.3kb PCR产物条带。接着用1μl的Dpn I和4.5μl的NEBuffer 4在37℃下将PCR产物溶液消化过夜并且使用

纯化试剂盒根据制造商的说明进行纯化。

在由含有1.3kb PCR产物的10μl的PCR、1μl的消化的pBGMH16、以及1μl的USER^TM酶构成的反应中将1.3kb PCR产物以及消化的pBGMH16的同源末端连接在一起。该反应在37℃下孵育15分钟，接着在25℃下15分钟。根据制造商的说明将10μl的反应转化到大肠杆菌

9600自若干所得大肠杆菌转化体制备质粒DNA。棘孢曲霉GH61A多肽编码序列插入物用3130xL型遗传分析器以及来自

终止子v3.1循环测序试剂盒的染料终止子化学，通过DNA测序来证实。测序引物pBGMH16seqF和pBGMH16seqR以及以下示出的引物AaGH61seqF用于基因插入物和序列的验证。

引物AaGH61seqF：

CCTTGCCAACTGCAATGGTG(SEQ ID NO:263)

选择含有正确的棘孢曲霉GH61A多肽编码序列的质粒并且命名为pDFng155-33。

质粒pSMai215用于提供嗜松青霉GH61A基因的DNA模板，用于构建pDFng156-37。如下所述构建质粒pSMai215。设计如下所示两种合成寡核苷酸引物以PCR扩增嗜松青霉GH61A多肽基因。使用IN-FUSION^TM PCR克隆试剂盒将该片段直接克隆进表达载体pMJ09中(WO2005/047499)中。粗体字母代表编码序列。剩余的序列与pMJ09的插入位点是同源的。

正向引物：

5’-GGACTGCGCACCATGCCTTCTACTAAAG-3’(SEQ ID NO:264)

反向引物：

5’-GCCACGGAGCTTAATTAATCAAAGGACAGTAGTG-3’(SEQ ID NO:265)

将五十皮摩尔的各以上引物用于如下PCR中，该PCR由以下构成：10ng的pPin7、具有MgCl₂的1X

高保真PCR缓冲液(罗氏诊断产品有限公司(Roche DiagnosticsCorporation)，美国印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,IN,USA))、各0.25mM的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP、以及2.6单位的

高保真酶混合物(罗氏诊断产品有限公司，美国印第安纳州印第安纳波利斯)，最终体积为50μl。使用

5333epgradient S执行扩增，其被编程为：1个循环，在98℃下持续3分钟；30个循环，每个循环在98℃下持续30秒、59℃下持续30秒、以及72℃下持续1分钟；以及最终延长，在72℃下持续15分钟。然后将加热块转到4℃浸泡循环。通过TAE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶电泳对反应产物进行分离，其中在凝胶上观察到约1.05kb产物条带。使用

凝胶提取试剂盒对PCR产物溶液进行纯化。

用Nco I和Pac I消化质粒pMJ09(WO 2005/047499)，通过TAE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离，从凝胶切离并且根据制造商的说明，使用

使用IN-FUSION^TM PCR克隆试剂盒(克罗泰克实验室有限公司(ClontechLaboratories,Inc.)，美国加利福尼亚州山景城(Mountain View,CA,USA))将1.05kb基因片段与消化的载体连接在一起，从而产生pSMai215。连接反应(20μl)由以下构成：1X IN-FUSION^TM缓冲液、1X BSA、1μl的IN-FUSION^TM酶(稀释为1:10)、100ng凝胶纯化的Nco I/PacI消化的pMJ09、以及42ng经纯化的1.05kb PCR产物。将反应在37℃下孵育15分钟，并且然后在50℃下孵育15分钟。稀释之后，将该反应与50μl的TE缓冲液(pH 8)混合，将2.5μl的反应转化到大肠杆菌XL10

Gold超感受态细胞中。将大肠杆菌转化反应涂布在_2XYTamp琼脂平板上。通过限制酶切消化检测包含pSMai215的大肠杆菌转化体并且使用

9600制备质粒DNA。通过DNA测序来证实pSMai215中的嗜松青霉GH61A插入物。

以下描述含有嗜松青霉GH61A多肽编码序列的质粒pDFng156-37的构建。使用表12中示出的具有被设计用于克隆到质粒pBGMH16中的突出端的引物，从质粒pSMai215扩增嗜松青霉GH61A多肽编码序列。最终体积为50μl的扩增反应由以下构成：100ng的在表12中列出的每种引物、30ng的质粒pSMai215、1X Pfu

Cx热启动DNA聚合酶。使用

5333执行PCR，其被编程为：1个循环，在95℃下持续2分钟；30个循环，每个循环在95℃下持续30秒、61.2℃下持续30秒、以及72℃下持续1.5分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。然后将加热块转到10℃浸泡循环。

通过使用TBE缓冲液的0.7％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物溶液进行分析，其中观察到约1.1kb PCR产物条带。接着用1μl的Dpn I和4.5μl的NEB4缓冲液在37℃下将PCR产物溶液消化过夜并且使用

纯化试剂盒进行纯化。

在由含有1.1kb PCR产物的10μl的PCR、1μl的消化的pBGMH16、以及1μl的USER^TM酶构成的反应中将1.1kb PCR产物以及消化的pBGMH16的同源末端连接在一起。将该反应在37℃下孵育15分钟，接着在25℃下孵育15分钟。根据制造商的说明将10μl的反应转化到大肠杆菌

9600自若干所得大肠杆菌转化体制备质粒DNA。嗜松青霉GH61A多肽编码序列插入物用3130xL型遗传分析器以及来自

终止子v3.1循环测序试剂盒的染料终止子化学，通过DNA测序来证实。测序引物pBGMH16seqF和pBGMH16seqR以及以下示出的引物PpGH61seqF用于基因插入物和序列的验证。

引物BGMH25：

CAATGGCAATTGTTCTACCG(SEQ ID NO:266)

选择含有正确的嗜松青霉GH61A多肽编码序列的质粒并且命名为pDFng156-37。

以下描述含有太瑞斯梭孢壳霉GH61多肽编码序列的质粒pDFng156-37的构建。使用表12中示出的具有被设计用于克隆到质粒pBGMH16中的突出端的引物,从质粒pAG68扩增太瑞斯梭孢壳霉GH61多肽编码序列。最终体积为50μl的扩增反应由以下构成：100ng的在表12中列出的每种引物、30ng的质粒pAG68、1XPfu

Cx热启动DNA聚合酶。使用

通过使用TBE缓冲液的0.7％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物溶液进行分析，其中观察到约1.2kb PCR产物条带。接着用1μl的Dpn I和4.5μl的NEB4缓冲液在37℃下将PCR产物溶液消化过夜并且使用

纯化试剂盒根据制造商的说明进行纯化。

在由含有1.2kb PCR产物的10μl的PCR、1μl的消化的pBGMH16、以及1μl的USER^TM酶构成的反应中将1.1kb PCR产物以及消化的pBGMH16的同源末端连接在一起。将该反应在37℃下孵育15分钟，接着在25℃下孵育15分钟。根据制造商的说明将10μl的反应转化到大肠杆菌XL10-

9600自若干所得大肠杆菌转化体制备质粒DNA。太瑞斯梭孢壳霉GH61A多肽编码序列插入物用3130xL型遗传分析器以及来自

终止子v3.1循环测序试剂盒的染料终止子化学，通过DNA测序来证实。测序引物pBGMH16seqF和pBGMH16seqR以及以下示出的引物TtGH61seqF用于基因插入物和序列的验证。

引物TtGH61seqF：

CGACGGCAGCTCGGCGCCCG(SEQ ID NO:267)

选择含有正确的太瑞斯梭孢壳霉GH61多肽编码序列的质粒并且命名为pDFng157-51。

实例16：金黄色嗜热子囊菌GH61多肽变体的构建

通过SOE-PCR(通过突出端延伸聚合酶链式反应剪接)用质粒pDFng153-4构建金黄色嗜热子囊菌GH61多肽变体。简单地说，第一PCR使用了正向引物EbZn NiaD Fwd和突变特异性反向引物(表13)。第二PCR使用了反向引物EbZn NiiA Rev和含有编码改变的氨基酸的序列的突变特异性正向引物(表13)。突变特异性正向和反向引物含有15-20个重叠核苷酸。第三PCR使用了重叠核苷酸来共同剪接第一和第二反应中产生的片段。最后，使用巢式正向引物BGMH110V2F和巢式反向引物BGMH109V2R，通过PCR扩增剪接的片段。

引物EbZn NiaD Fwd：

5’-GCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGG-3’(SEQ ID NO:268)

引物EbZn NiiA Rev：

5’-GCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCG-3’(SEQ ID NO:269)

引物BGMH110V2F：

5’-CCAGACCAGCAGAGGAGATAATACTCTGCG-3’(SEQ ID NO:270)

引物BGMH109V2R：

5’-CAAGGATACCTACAGTTATTCGAAACCTCCTG-3’(SEQ ID NO:271)

用于金黄色嗜热子囊菌GH61多肽变体的最终反应体积为50μl的第一PCR含有0.2皮摩尔的EbZn NiaD Fwd引物、0.2皮摩尔的在表13中列出的反向引物、10ng的模板(pDFng153-4)、1纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、1X

高保真度缓冲液、以及0.7单位的

高保真度DNA聚合酶。使用

Gradient(艾本德科技有限公司，美国纽约韦斯特伯里)执行扩增，其被编程为：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，每个循环在98℃下持续25秒、66℃下持续30秒、以及72℃下持续5分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃保持阶段。

用于金黄色嗜热子囊菌GH61变体的最终反应体积为50μl的第二SOE-PCR含有0.2皮摩尔的在表13中列出的正向引物、0.2皮摩尔的EbZn NiiA Rev引物、10ng的模板(pDFng153-4)、1纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、1X

高保真度缓冲液、以及0.7单位的

高保真度DNA聚合酶。使用

Gradient执行扩增，其被编程为：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，每个循环在98℃下持续25秒、66℃下持续30秒、以及72℃下持续5分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃保持阶段。

每种PCR产物通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖电泳进行分析，其中观察到一个4.1至5.3kb(如表13中指明)PCR产物条带，指示正确扩增。接着将剩余的45微升用10单位的Dpn I和1X NEB4进行处理，以去除剩余的野生型模板。该反应在37℃下孵育4小时并且接着使用

96UF纯化试剂盒(凯杰有限公司，美国加州瓦伦西亚)进行纯化。将纯化的PCR产物重悬于去离子水中，补足至等于20μl的最终体积。每种片段的浓度使用NanoDrop2000(塞默科技(Thermo Scientific)，美国北卡罗来纳州威尔明顿(Wilmington,DE,USA))进行测量。

用于金黄色嗜热子囊菌GH61变体的最终反应体积为50μl的第三SOE-PCR含有50至100ng的在第一和第二PCR中产生的每种片段、1纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、1X

高保真度缓冲液、以及0.7单位的

高保真度DNA聚合酶。使用

Gradient执行扩增，其被编程为：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，每个循环在98℃下持续15秒、68℃下持续30秒、以及72℃下持续10分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃保持阶段。在第五循环的退火/延长步骤期间添加引物BGMH110V2F引物(0.2皮摩尔)和引物BGMH109V2R(0.2皮摩尔)，以允许在扩增之前重叠核苷酸剪接。

使用类似于第三PCR的条件产生野生型片段。最终反应体积为50μl的该反应由以下构成：10ng的模板(pDFng153-4)、0.2皮摩尔的引物BGMH110V2F、0.2皮摩尔的引物BGMH109V2R、1纳摩尔dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、1X

高保真度缓冲液、以及0.7单位

高保真度DNA聚合酶。使用

Gradient执行扩增，其被编程为：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，每个循环在98℃下持续15秒、68℃下持续30秒、以及72℃下持续10分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃保持阶段。

通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖电泳对每种SOE-PCR产物进行分析，其中观察到大约8kb PCR产物条带，指示正确扩增。接着使用

96UF纯化试剂盒纯化剩余的45μl的每种SOE-PCR产物。将纯化的PCR产物重悬于去离子水中，补足至等于20μl的最终体积。每种片段的浓度使用NanoDrop 2000进行测量。然后如实例21中所述将整个体积转化到米曲霉COLs1300菌株中。

表13

实例17：埃默森青霉GH61多肽变体的构建

通过SOE-PCR(通过突出端延伸聚合酶链式反应剪接)用质粒pDFng154-17构建埃默森青霉GH61多肽变体。简单地说，第一PCR使用了正向引物EbZn NiaD Fwd和突变特异性反向引物(表14)。第二PCR使用了反向引物EbZn NiiA Rev和含有编码改变的氨基酸的序列的突变特异性正向引物(表14)。突变特异性正向和反向引物含有15-20个重叠核苷酸。第三PCR使用了重叠核苷酸来共同剪接第一和第二反应中产生的片段。最后，使用巢式正向引物BGMH110V2F和巢式反向引物BGMH109V2R，通过PCR扩增剪接的片段。

用于埃默森青霉GH61多肽变体的最终反应体积为50μl的第一PCR含有0.2皮摩尔的EbZn NiaD Fwd引物、0.2皮摩尔的在表14中列出的反向引物、10ng的模板(pDFng154-17)、1纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、1X

高保真度缓冲液、以及0.7单位的

高保真度DNA聚合酶。使用

5333执行扩增，其被梯度编程为：1个循环，在98℃下持续2分钟；35个循环，每个循环在98℃下持续25秒、66℃下持续30秒、以及72℃下持续5分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃保持阶段。

用于埃默森青霉GH61变体的最终反应体积为50μl的第二PCR含有0.2皮摩尔的在表14中列出的正向引物、0.2皮摩尔的EbZn NiiA Rev引物、10ng的模板(pDFng154-17)、1纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、1X

高保真度缓冲液、以及0.7单位的

高保真度DNA聚合酶。使用

每种PCR产物通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖电泳进行分析，其中观察到一个4.2至5.2kb(如表14中指明)PCR产物条带，指示正确扩增。接着将剩余的45微升用10单位的Dpn I和1X NEB4进行处理，以去除剩余的野生型模板。该反应在37℃下孵育4小时并且接着使用

96UF纯化试剂盒进行纯化。将纯化的PCR产物重悬于去离子水中，补足至等于20μl的最终体积。每种片段的浓度使用NanoDrop 2000进行测量。

用于埃默森青霉GH61变体的最终反应体积为50μl的第三SOE-PCR含有50至100ng的在第一和第二PCR中产生的每种片段、4纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、1X

GC-熔融缓冲液(克罗泰克实验室有限公司(Clontech Laboratories,Inc.)，美国加利福尼亚州山景城(Mountain View,CA,USA))、以及2.5单位的

GC基因组LA聚合酶(克罗泰克实验室有限公司，美国加利福尼亚州山景城)。使用

Gradient执行扩增，其被编程为：1个循环，在94℃下持续1分钟；35个循环，每个循环在94℃下持续30秒、66℃下持续30秒、以及72℃下持续10分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃保持阶段。在第五循环的退火/延长步骤期间添加引物BGMH110V2F引物(0.4皮摩尔)和引物BGMH109V2R(0.4皮摩尔)，以允许在扩增之前重叠核苷酸剪接。

使用类似于第三PCR的条件产生野生型片段。最终反应体积为50μl的该反应由以下构成：10ng的模板(pDFng154-17)、0.4皮摩尔的引物BGMH110V2F、0.4皮摩尔的引物BGMH109V2R、1纳摩尔dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、

GC-熔融缓冲液、以及2.5单位

GC基因组LA聚合酶。使用

Gradient执行扩增，其被编程为：1个循环，在94℃下持续1分钟；35个循环，每个循环在94℃下持续30秒、66℃下持续30秒、以及72℃下持续10分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃保持阶段。

表14

实例18：棘孢曲霉GH61多肽变体的构建

通过SOE-PCR(通过突出端延伸聚合酶链式反应剪接)用质粒pDFng155-33构建棘孢曲霉GH61多肽变体。简单地说，第一PCR使用了正向引物EbZn NiaD Fwd和突变特异性反向引物(表15)。第二PCR使用了反向引物EbZn NiiA Rev和含有编码改变的氨基酸的序列的突变特异性正向引物(表15)。突变特异性正向和反向引物含有15-20个重叠核苷酸。第三PCR使用了重叠核苷酸来共同剪接第一和第二反应中产生的片段。最后，使用巢式正向引物BGMH110V2F和巢式反向引物BGMH109V2R，通过PCR扩增剪接的片段。

用于棘孢曲霉GH61多肽变体的最终反应体积为50μl的第一PCR含有0.2皮摩尔的EbZn NiaD Fwd引物、0.2皮摩尔的在表15中列出的反向引物、10ng的模板(pDFng155-33)、1纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、1X

高保真度缓冲液、以及0.7单位的

高保真度DNA聚合酶。使用

用于棘孢曲霉GH61变体的最终反应体积为50μl的第二PCR含有0.2皮摩尔的在表15中列出的正向引物、0.2皮摩尔的EbZn NiiA Rev引物、10ng的模板(pDFng155-33)、1纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、1X

高保真度缓冲液、以及0.7单位的

高保真度DNA聚合酶。使用

每种PCR产物通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖电泳进行分析，其中观察到一个4.6至5.1kb(如表15中指明)PCR产物条带，指示正确扩增。接着将剩余的45微升用10单位的Dpn I和1X NEB4进行处理，以去除剩余的野生型模板。该反应在37℃下孵育4小时并且接着使用

用于棘孢曲霉GH61变体的最终反应体积为50μl的第三SOE-PCR含有50至100ng的在第一和第二PCR中产生的每种片段、1纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、1X

高保真度缓冲液、以及0.7单位的

高保真度DNA聚合酶。使用

使用类似于第三PCR的条件产生野生型片段。最终反应体积为50μl的该反应由以下构成：10ng的模板(pDFng155-33)、0.2皮摩尔的引物BGMH110V2F、0.2皮摩尔的引物BGMH109V2R、1纳摩尔dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、1X

高保真度缓冲液、以及0.7单位

高保真度DNA聚合酶。使用

表15

实例19：嗜松青霉GH61多肽变体的构建

通过SOE-PCR(通过突出端延伸聚合酶链式反应剪接)用质粒pDFng156-37构建嗜松青霉GH61多肽变体。简单地说，第一PCR使用了正向引物EbZn NiaD Fwd和突变特异性反向引物(表16)。第二PCR使用了反向引物EbZn NiiA Rev和含有编码改变的氨基酸的序列的突变特异性正向引物(表16)。突变特异性正向和反向引物含有15-20个重叠核苷酸。第三PCR使用了重叠核苷酸来共同剪接第一和第二反应中产生的片段。最后，使用巢式正向引物BGMH110V2F和巢式反向引物BGMH109V2R，通过PCR扩增剪接的片段。

用于嗜松青霉GH61多肽变体的最终反应体积为50μl的第一PCR含有0.2皮摩尔的EbZn NiaD Fwd引物、0.2皮摩尔的在表16中列出的反向引物、10ng的模板(pDFng156-37)、1纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、1X

高保真度缓冲液、以及0.7单位的

高保真度DNA聚合酶。使用

用于嗜松青霉GH61变体的最终反应体积为50μl的第二PCR含有0.2皮摩尔的在表16中列出的正向引物、0.2皮摩尔的EbZn NiiA Rev引物、10ng的模板(pDFng156-37)、1纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、1X

高保真度缓冲液、以及0.7单位的

高保真度DNA聚合酶。使用

每种PCR产物通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖电泳进行分析，其中观察到一个4.1至5.5kb(如表16中指明)PCR产物条带，指示正确扩增。接着将剩余的45微升用10单位的Dpn I和1X NEB4进行处理，以去除剩余的野生型模板。该反应在37℃下孵育4小时并且接着使用

用于嗜松青霉GH61变体的最终反应体积为50μl的第三SOE-PCR含有50至100ng的在第一和第二PCR中产生的每种片段、1纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、1X

高保真度缓冲液、以及0.7单位的

高保真度DNA聚合酶。使用

使用类似于第三PCR的条件产生野生型片段。最终反应体积为50μl的该反应由以下构成：10ng的模板(pDFng156-37)、0.2皮摩尔的引物BGMH110V2F、0.2皮摩尔的引物BGMH109V2R、1纳摩尔dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、1X

高保真度缓冲液、以及0.7单位

高保真度DNA聚合酶。使用

表16

实例20：太瑞斯梭孢壳霉GH61多肽变体的构建

通过SOE-PCR(通过突出端延伸聚合酶链式反应剪接)用质粒pDFng157-51构建太瑞斯梭孢壳霉GH61多肽变体。简单地说，第一PCR使用了正向引物EbZn NiaD Fwd和突变特异性反向引物(表17)。第二PCR使用了反向引物EbZn NiiA Rev和含有编码改变的氨基酸的序列的突变特异性正向引物(表17)。突变特异性正向和反向引物含有15-20个重叠核苷酸。第三PCR使用了重叠核苷酸来共同剪接第一和第二反应中产生的片段。最后，使用巢式正向引物BGMH110V2F和巢式反向引物BGMH109V2R，通过PCR扩增剪接的片段。

用于太瑞斯梭孢壳霉GH61多肽变体的最终反应体积为50μl的第一PCR含有0.2皮摩尔的EbZn NiaD Fwd引物、0.4皮摩尔的在表17中列出的反向引物、10ng的模板(pDFng157-51)、4纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、

GC-熔融缓冲液、以及2.5单位

GC基因组LA聚合酶。使用

Gradient执行扩增，其被梯度编程为：1个循环，在94℃下持续1分钟；35个循环，每个循环在94℃下持续30秒、66℃下持续30秒、以及72℃下持续5分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃保持阶段。

用于太瑞斯梭孢壳霉GH61变体的最终反应体积为50μl的第二PCR含有0.2皮摩尔的在表17中列出的正向引物、0.4皮摩尔的EbZn NiiA Rev引物、10ng的模板(pDFng157-51)、4纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、

GC-熔融缓冲液、以及2.5单位

GC基因组LA聚合酶。使用

每种PCR产物通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖电泳进行分析，其中观察到一个4.1至5.6kb(如表17中指明)PCR产物条带，指示正确扩增。接着将剩余的45微升用10单位的Dpn I和1X NEB4进行处理，以去除剩余的野生型模板。该反应在37℃下孵育4小时并且接着使用

用于太瑞斯梭孢壳霉GH61变体的最终反应体积为50μl的第三SOE-PCR含有50至100ng的在第一和第二PCR中产生的每种片段、4纳摩尔的dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、

GC-熔融缓冲液、以及2.5单位

GC基因组LA聚合酶。使用

Gradient执行扩增，其被梯度编程为：1个循环，在94℃下持续1分钟；35个循环，每个循环在94℃下持续30秒、66℃下持续30秒、以及72℃下持续10分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃保持阶段。在第五循环的退火/延长步骤期间添加引物BGMH110V2F引物(0.4皮摩尔)和引物BGMH109V2R(0.4皮摩尔)，以允许在扩增之前重叠核苷酸剪接。

使用类似于第三PCR的条件产生野生型片段。最终反应体积为50μl的该反应由以下构成：10ng的模板(pDFng157-51)、0.4皮摩尔的引物BGMH110V2F、0.4皮摩尔的引物BGMH109V2R、1纳摩尔dATP、dTTP、dGTP、以及dCTP中的每一个、1X

GC-熔融缓冲液、以及2.5单位

GC基因组LA聚合酶。使用

Gradient执行扩增，其被梯度编程为：1个循环，在94℃下持续1分钟；35个循环，每个循环在94℃下持续30秒、66℃下持续30秒、以及72℃下持续10分钟；以及最终延长，在72℃下持续10分钟。接着将加热块进行10℃保持阶段。

通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖电泳对每种SOE-PCR产物溶液进行分析，其中观察到大约8kb PCR产物条带，指示正确扩增。接着使用

96UF纯化试剂盒纯化剩余的45μl的每种SOE-PCR产物。将纯化的PCR产物重悬于去离子水中，补足至等于20μl的最终体积。每种片段的浓度使用NanoDrop2000进行测量。然后如实例21中所述将整个体积转化到米曲霉COLs1300菌株中。

表17

实例21：金黄色嗜热子囊菌GH61A、埃默森青霉GH61A、棘孢曲霉GH61、嗜松青霉GH61、以及太瑞斯梭孢壳霉GH61多肽变体在米曲霉COLs1300中的表达

将米曲霉COLs1300在含有10mM尿苷的COVE-N-Gly平板上接种并且在34℃下孵育直到合生。通过用10ml的YP培养基洗涤从该平板收集孢子。将全部孢子悬浮液用于接种500ml聚碳酸盐摇瓶中的100ml的COL1300原生质体化培养基。将该摇瓶在30℃下孵育连同在200rpm下振荡16-20小时。通过衬有

的漏斗过滤菌丝体并且用200ml的0.6M MgSO₄洗涤。将洗涤的菌丝体在125ml无菌聚碳酸盐摇瓶中的20ml的COLs1300原生质体化溶液中重悬并且在室温下孵育3分钟。向摇瓶中添加12mg BSA/ml去离子水的溶液1ml，并且接着将该摇瓶在37℃下、在以65rpm混合下孵育100-150小时，直到原生质体化完成。通过衬有

的漏斗将菌丝体/原生质体混合物过滤到50ml锥形管中，并且用5ml的ST溶液覆盖。在低加速/减速下将该50ml锥形管在1050x g下离心15分钟。离心后，液体被分成3相。将含有原生质体的中间相转移到新的50ml锥形管。向原生质体中添加两体积的STC溶液，随后在1050x g下离心5分钟。弃去上清液，并且用5ml的STC溶液洗涤原生质体两次,其中重悬原生质体沉淀、在1050x g下离心5分钟、并且每次撇出上清液。在最终撇出后，在STC溶液中在5x10⁷/ml浓度下重悬原生质体沉淀。将原生质体冰冻于-80℃直到转化。

如实例16-20中所述，将15μl体积的每种突变片段用于转化15ml圆底管中的100μl米曲霉COLs1300原生质体。在室温下初始孵育15分钟之后，向含有转化混合物的15ml圆底管中添加300μl的PEG溶液。该反应在室温下再孵育15分钟。向该反应中添加6ml的熔化的顶层琼脂并且将全部混合物均匀地倒在补充有10mM NaNO₃的蔗糖琼脂平板上，并且留放在室温下直到顶层琼脂凝固。将这些平板在37℃下孵育4-6天。使用无菌接种环挑取所得的转化体并且转移到含有COVE-N-gly培养基的平板上，并且在34℃下孵育将近4天(直到孢子形成)。将孢子接种到含有0.5ml的MDU2BP培养基的深孔48孔板中，在34℃下在加湿箱中静止孵育3天。在第三天，通过去除菌丝体面收获样品。

实例22：通过蛋白质热解折叠分析测定金黄色嗜热子囊菌GH61A、埃默森青霉GH61A、棘孢曲霉GH61、嗜松青霉GH61、以及太瑞斯梭孢壳霉GH61变体的Tm(解链温度)

金黄色嗜热子囊菌GH61A、埃默森青霉GH61A、棘孢曲霉GH61、嗜松青霉GH61、以及太瑞斯梭孢壳霉GH61变体的蛋白质热解折叠通过根据实例10中所述的蛋白质热解折叠分析进行测定。如实例21中所述的制备这些变体及其野生型多肽的培养液。针对每种变体，确定来自一至五种转化体的一式三份培养液的平均读数，并且每种变体的Tm增加示于表18中。

表18.通过蛋白质热解折叠分析测定的金黄色嗜热子囊菌GH61A、埃默森青霉GH61A、棘孢曲霉GH61、嗜松青霉GH61、以及太瑞斯梭孢壳霉GH61多肽变体的解链温度(℃)相比野生型多肽的增加

通过以下编号的段落进一步描述本发明：

[1]一种GH61多肽变体，其包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249、以及250相对应的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性，并且其中该变体与亲本GH61多肽的氨基酸序列具有至少60％，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％的序列一致性。

[2]如段落1所述的变体，其中该亲本GH61多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽具有至少60％序列一致性的一种多肽；(b)由多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在至少低严谨度条件下与以下各项杂交：(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体；(c)由与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码的一种多肽；以及(d)SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽的一个片段,其具有纤维素分解增强活性。

[3]如段落2所述的变体，其中该亲本GH61多肽与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽具有至少60％，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

[4]如段落2所述的变体，其中该亲本GH61多肽由在低严谨度条件下、中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下、或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体。

[5]如段落2所述的变体，其中该亲本GH61多肽由与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410的成熟多肽编码序列具有至少60％，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的一种多核苷酸编码。

[6]如段落2所述的变体，其中该亲本GH61多肽包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽，或由其组成。

[7]如段落2所述的变体，其中该亲本GH61多肽是SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽的一个片段，其中该片段具有纤维素分解增强活性。

[8]如段落1-7中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽具有至少60％，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％的序列一致性。

[9]如段落2-8中任一项所述的变体，其中该变体的片段由该亲本GH61多肽的成熟多肽的至少85％的氨基酸残基，例如至少90％的氨基酸残基或至少95％的氨基酸残基组成。

[10]如段落1-9中任一项所述的变体，其中取代的数目是1-29个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28个取代。

[11]如段落1-10中任一项所述的变体，该变体包含在与位置26相对应的位置处的取代。

[12]如段落11所述的变体，其中该取代是Ile。

[13]如段落1-12中任一项所述的变体，该变体包含在与位置32相对应的位置处的取代。

[14]如段落13所述的变体，其中该取代是Glu或Ser。

[15]如段落1-14中任一项所述的变体，该变体包含在与位置34相对应的位置处的取代。

[16]如段落15所述的变体，其中该取代是Phe。

[17]如段落1-16中任一项所述的变体，该变体包含在与位置40相对应的位置处的取代。

[18]如段落17所述的变体，其中该取代是Ala。

[19]如段落1-18中任一项所述的变体，该变体包含在与位置41相对应的位置处的取代。

[20]如段落19所述的变体，其中该取代是Thr。

[21]如段落1-20中任一项所述的变体，该变体包含在与位置42相对应的位置处的取代。

[22]如段落21所述的变体，其中该取代是Ile、Glu、或Val。

[23]如段落1-22中任一项所述的变体，该变体包含在与位置47相对应的位置处的取代。

[24]如段落23所述的变体，其中该取代是Glu、Leu、或Arg。

[25]如段落1-24中任一项所述的变体，该变体包含在与位置56相对应的位置处的取代。

[26]如段落25所述的变体，其中该取代是Cys、Glu、或Thr。

[27]如段落1-26中任一项所述的变体，该变体包含在与位置72相对应的位置处的取代。

[28]如段落27所述的变体，其中该取代是Gln或Thr。

[29]如段落1-28中任一项所述的变体，该变体包含在与位置102相对应的位置处的取代。

[30]如段落29所述的变体，其中该取代是Lys或Pro。

[31]如段落1-30中任一项所述的变体，该变体包含在与位置123相对应的位置处的取代。

[32]如段落31所述的变体，其中该取代是Arg。

[33]如段落1-32中任一项所述的变体，该变体包含在与位置138相对应的位置处的取代。

[34]如段落33所述的变体，其中该取代是Cys、Glu、Gly、Lys、Leu、或Met。

[35]如段落1-34中任一项所述的变体，该变体包含在与位置149相对应的位置处的取代。

[36]如段落35所述的变体，其中该取代是Ile。

[37]如段落1-36中任一项所述的变体，该变体包含在与位置152相对应的位置处的取代。

[38]如段落37所述的变体，其中该取代是Ser。

[39]如段落1-38中任一项所述的变体，该变体包含在与位置163相对应的位置处的取代。

[40]如段落39所述的变体，其中该取代是Glu、Phe、或Val。

[41]如段落1-40中任一项所述的变体，该变体包含在与位置164相对应的位置处的取代。

[42]如段落41所述的变体，其中该取代是Cys或Leu。

[43]如段落1-42中任一项所述的变体，该变体包含在与位置166相对应的位置处的取代。

[44]如段落43所述的变体，其中该取代是Leu。

[45]如段落1-44中任一项所述的变体，该变体包含在与位置169相对应的位置处的取代。

[46]如段落45所述的变体，其中该取代是Arg或Cys。

[47]如段落1-46中任一项所述的变体，该变体包含在与位置173相对应的位置处的取代。

[48]如段落47所述的变体，其中该取代是Cys。

[49]如段落1-48中任一项所述的变体，该变体包含在与位置186相对应的位置处的取代。

[50]如段落49所述的变体，其中该取代是Phe、Lys、Thr、或Tyr。

[51]如段落1-50中任一项所述的变体，该变体包含在与位置200相对应的位置处的取代。

[52]如段落51所述的变体，其中该取代是Ile或Val。

[53]如段落1-52中任一项所述的变体，该变体包含在与位置207相对应的位置处的取代。

[54]如段落53所述的变体，其中该取代是Pro。

[55]如段落1-54中任一项所述的变体，该变体包含在与位置213相对应的位置处的取代。

[56]如段落55所述的变体，其中该取代是Glu。

[57]如段落1-56中任一项所述的变体，该变体包含在与位置219相对应的位置处的取代。

[58]如段落57所述的变体，其中该取代是Glu、Met、Gln、或Cys。

[59]如段落1-58中任一项所述的变体，该变体包含在与位置222相对应的位置处的取代。

[60]如段落59所述的变体，其中该取代是Arg。

[61]如段落1-60中任一项所述的变体，该变体包含在与位置234相对应的位置处的取代。

[62]如段落61所述的变体，其中该取代是Gly或Lys。

[63]如段落1-62中任一项所述的变体，该变体包含在与位置246相对应的位置处的取代。

[64]如段落63所述的变体，其中该取代是Pro。

[65]如段落1-64中任一项所述的变体，该变体包含在与位置249相对应的位置处的取代。

[66]如段落65所述的变体，其中该取代是Gln、Arg、或Cys。

[67]如段落1-66中任一项所述的变体，该变体包含在与位置250相对应的位置处的取代。

[68]如段落67所述的变体，其中该取代是Cys。

[69]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的两个位置处包括取代。

[70]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的三个位置处包括取代。

[71]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的四个位置处包括取代。

[72]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的五个位置处包括取代。

[73]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的六个位置处包括取代。

[74]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的七个位置处包括取代。

[75]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的八个位置处包括取代。

[76]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的九个位置处包括取代。

[77]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十个位置处包括取代。

[78]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十一个位置处包括取代。

[79]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十二个位置处包括取代。

[80]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十三个位置处包括取代。

[81]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十四个位置处包括取代。

[82]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十五个位置处包括取代。

[83]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十六个位置处包括取代。

[84]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十七个位置处包括取代。

[85]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十八个位置处包括取代。

[86]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的十九个位置处包括取代。

[87]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的二十个位置处包括取代。

[88]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的二十一个位置处包括取代。

[89]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的二十二个位置处包括取代。

[90]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的二十三个位置处包括取代。

[91]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的二十四个位置处包括取代。

[92]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的二十五个位置处包括取代。

[93]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的二十六个位置处包括取代。

[94]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于任意位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的二十七个位置处包括取代。

[95]如段落1-68中任一项所述的变体，该变体在对应于位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249以及250中的每一个位置处包括取代。

[96]如段落1-95中任一项所述的变体，该变体包括选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：S26I；G32E,S；Y34F；V40A；N41T；Q42I,E,V；S47E,L,R；S56C,E,T；S72Q,T；T102K,P；A123R；Q138C,E,G,K,L,M；V149I；D152S；T163E,F,V；V164C,L；I166L；S169R,C；S186F,K,T,Y；F200I,V；G207P；S213E；S219E,M,Q,C；K222R；S234G,K；A246P；N249Q,R,C以及A250C。

[97]如段落1-96中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:36的成熟多肽的取代S173C+F253C。

[98]如段落1-96中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+Q138K+K229W。

[99]如段落1-96中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+S47E+K229W。

[100]如段落1-96中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+S56A+K229W。

[101]如段落1-96中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+T102K+K229W。

[102]如段落1-96中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+S186T+K229W。

[103]如段落1-96中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+K229W+S234G。

[104]如段落1-96中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+T102K+E105K+K229W。

[105]如段落1-96中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+Q138K+G188F+K229W。

[106]如段落1-96中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+Q138K+V149I+G188F+K229W。

[107]如段落1-96中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+S169C+G188F+K229W+A250C。

[108]如段落1-96中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+S72T+Q138K+V149I+G188F+K229W。

[109]如段落1-96中任一项所述的变体，该变体包括SEQ ID NO:30的成熟多肽的取代L111V+D152S+M155L+A162W+Q138K+V149I+G188F+G207P+K229W。

[110]如段落1-109中任一项所述的变体，该变体进一步包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置111、152、155、以及162相对应的位置处的取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性。

[111]如段落110所述的变体，其中另外的取代的数目为1-4个，例如，1、2、3、或4个取代。

[112]如段落110或111所述的变体，该变体包含在与位置111相对应的位置处的取代。

[113]如段落112所述的变体，其中该取代是Val。

[114]如段落110-113中任一项所述的变体，该变体包含在与位置152相对应的位置处的取代。

[115]如段落114所述的变体，其中该取代是Ser。

[116]如段落110-115中任一项所述的变体，该变体包含在与位置155相对应的位置处的取代。

[117]如段落116所述的变体，其中该取代是Leu。

[118]如段落110-117中任一项所述的变体，该变体包含在与位置162相对应的位置处的取代。

[119]如段落118所述的变体，其中该取代是Trp。

[120]如段落110-119中任一项所述的变体，该变体包含在与任意位置111、152、155、以及162相对应的两个位置处的取代。

[121]如段落110-119中任一项所述的变体，该变体包含在与任意位置111、152、155、以及162相对应的三个位置处的取代。

[122]如段落110-119中任一项所述的变体，该变体包含在与位置111、152、155、以及162相对应的每个位置处的取代。

[123]如段落110-119中任一项所述的变体，该变体包含选自下组的一个或多个取代,该组由以下各项组成：L111V、D152S、M155L、以及A162W。

[124]如段落1-123中任一项所述的变体，该变体进一步包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置96、98、200、202、以及204相对应的位置处的取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性。

[125]如段落124所述的变体，其中另外的取代的数目为1-5个，例如，1、2、3、4、或5个取代。

[126]如段落124或125所述的变体，该变体包含在与位置96相对应的位置处的取代。

[127]如段落126所述的变体，其中该取代是Val。

[128]如段落124-127中任一项所述的变体，该变体包含在与位置98相对应的位置处的取代。

[129]如段落128所述的变体，其中该取代是Leu。

[130]如段落124-129中任一项所述的变体，该变体包含在与位置200相对应的位置处的取代。

[131]如段落130所述的变体，其中该取代是Ile。

[132]如段落124-131中任一项所述的变体，该变体包含在与位置202相对应的位置处的取代。

[133]如段落132所述的变体，其中该取代是Leu。

[134]如段落124-133中任一项所述的变体，该变体包含在与位置204相对应的位置处的取代。

[135]如段落134所述的变体，其中该取代是Val。

[136]如段落124-135中任一项所述的变体，该变体包含在与任意位置96、98、200、202、以及204相对应的两个位置处的取代。

[137]如段落124-135中任一项所述的变体，该变体包含在与任意位置96、98、200、202、以及204相对应的三个位置处的取代。

[138]如段落124-135中任一项所述的变体，该变体包含在与任意位置96、98、200、202、以及204相对应的四个位置处的取代。

[139]如段落124-135中任一项所述的变体，该变体包含在与位置96、98、200、202、以及204相对应的每个位置处的取代。

[140]如段落124-135中任一项所述的变体，该变体包含选自下组的一个或多个取代,该组由以下各项组成：I96V、F98L、F200I、I202L、以及I204V。

[141]如段落1-140中任一项所述的变体，该变体进一步包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置105、154、188、189、216、以及229相对应的位置处的取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性。

[142]如段落141所述的变体，其中另外的取代的数目为1-6个，例如，1、2、3、4、5、或6个取代。

[143]如段落141或142所述的变体，该变体包含在与位置105相对应的位置处的取代。

[144]如段落143所述的变体，其中该取代是Pro或Lys。

[145]如段落141-144中任一项所述的变体，该变体包含在与位置154相对应的位置处的取代。

[146]如段落145所述的变体，其中该取代是Leu。

[147]如段落141-146中任一项所述的变体，该变体包含在与位置188相对应的位置处的取代。

[148]如段落147所述的变体，其中该取代是Ala或Trp。

[149]如段落141-148中任一项所述的变体，该变体包含在与位置189相对应的位置处的取代。

[150]如段落149所述的变体，其中该取代是Lys。

[151]如段落141-150中任一项所述的变体，该变体包含在与位置216相对应的位置处的取代。

[152]如段落151所述的变体，其中该取代是Leu或Tyr。

[153]如段落141-152中任一项所述的变体，该变体包含在与位置229相对应的位置处的取代。

[154]如段落153所述的变体，其中该取代是Trp、His、Ile、或Tyr。

[155]如段落141-154中任一项所述的变体，该变体包含选自下组的一个或多个取代,该组由以下各项组成：E105P,K；E154I,L；G188F,M,A,W；N189H,K；A216L,Y；以及A229W,H,I,Y。

[156]如段落1-155中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少1.01倍，例如至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少50倍、至少75倍、或至少100倍的增加的热稳定性。

[157]一种分离的多核苷酸，其编码如段落1-156中任一项所述的变体。

[158]一种核酸构建体，其包含如段落157所述的多核苷酸。

[159]一种表达载体，其包含如段落157所述的多核苷酸。

[160]一种重组宿主细胞，包含如段落157所述的多核苷酸。

[161]一种产生GH61多肽变体的方法，包括：在适于该变体表达的条件下培养如段落160所述的宿主细胞。

[162]如段落161所述的方法，进一步包括回收该变体。

[163]一种用如段落157所述的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。

[164]一种产生如段落1-156中任一项所述的变体的方法，包括：在有助于该变体产生的条件下培养包含编码该变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。

[165]如段落164所述的方法，进一步包括回收该变体。

[166]一种用于获得GH61多肽变体的方法，该方法包括：在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249、以及250相对应的一个或多个位置处将取代引入亲本GH61多肽，其中该变体具有纤维素分解增强活性；并且回收该变体。

[167]如段落166所述的方法，进一步包括在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置111、152、155、以及162相对应的一个或多个位置处将取代引入亲本GH61多肽，其中该变体具有纤维素分解增强活性。

[168]如段落166或167所述的方法，进一步包括在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置96、98、200、202、以及204相对应的一个或多个位置处将取代引入亲本GH61多肽，其中该变体具有纤维素分解增强活性。

[169]如段落166-168中任一项所述的方法，进一步包括在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个位置处将取代引入亲本GH61多肽，其中该变体具有纤维素分解增强活性。

[170]一种用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：在如段落1-156中任一项所述的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的存在下，用酶组合物处理该纤维素材料。

[171]如段落170所述的方法，其中该纤维素材料经过了预处理。

[172]如段落170或171所述的方法，进一步包括回收该降解的纤维素材料。

[173]如段落170-172中任一项所述的方法，其中该酶组合物包含选自下组的一种或多种酶,该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、扩张蛋白、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀素。

[174]如段落173所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。

[175]如段落173所述的方法，其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。

[176]如段落170-175中任一项所述的方法，其中该降解的纤维素材料是糖。

[177]如段落176所述的方法，其中该糖选自下组,该组由以下各项组成：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、以及阿拉伯糖。

[178]一种用于产生发酵产物的方法，该方法包括：(a)在如段落1-156中任一项所述的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的存在下，用一种酶组合物使一种纤维素材料糖化；(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；并且(c)从该发酵中回收该发酵产物。

[179]如段落178所述的方法，其中对该纤维素材料进行了预处理。

[180]如段落178或179所述的方法，其中该酶组合物包含选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、扩张蛋白、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀素。

[181]如段落180所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。

[182]如段落180所述的方法，其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。

[183]如段落178-182中任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)是在同时的糖化和发酵中同时执行。

[184]如段落178-183中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸、或聚酮化合物。

[185]一种发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种发酵微生物发酵该纤维素材料，其中在如段落1-156中任一项所述的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的存在下，用酶组合物糖化该纤维素材料。

[186]如段落185所述的方法，其中该纤维素材料在糖化之前经过了预处理。

[187]如段落185或186所述的方法，其中该酶组合物包含选自下组的一种或多种酶,该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、扩张蛋白、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀素。

[188]如段落187所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。

[189]如段落187所述的方法，其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。

[190]如段落185-189中任一项所述的方法，其中该纤维素材料的发酵产生发酵产物。

[191]如段落190所述的方法，进一步包括从发酵中回收该发酵产物。

[192]如段落190或191所述的方法，其中该发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸、或聚酮化合物。

[193]一种包括段落1-156中任一项所述的变体的组合物。

[194]一种全培养液液配制品或细胞培养组合物，包含如段落1-156中任一项所述的变体。

[195]一种洗涤剂组合物，包含表面活性剂和如段落1-156中任一项所述的变体。

[196]如段落195所述的组合物，进一步包含选自下组的一种或多种酶,该组由以下各项组成：淀粉酶、阿拉伯糖酶、角质酶、碳水化合物酶、纤维素酶、半乳聚糖酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及木聚糖酶。

[197]如段落195或196所述的组合物，该组合物被配制为条、片、粉末、颗粒、糊、或液体。

[198]一种用于清洁或洗涤硬表面或衣物的方法，该方法包括使该硬表面或该衣物与如段落195-197中任一项所述的组合物相接触。

在此描述并且要求的本发明不限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面意图作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims

1.一种GH61多肽变体，其在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249、以及250相对应的一个或多个位置处进行1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，或28个取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性，并且其中该变体与亲本GH61多肽的氨基酸序列具有至少80％、但少于100％的序列一致性；其中在对应于位置26的取代为Ile，在对应于位置32的取代为Glu或Ser；在对应于位置34的取代为Phe；在对应于位置40的取代为Ala；在对应于位置41的取代为Thr；在对应于位置42的取代为Ile，Glu或Val；在对应于位置47的取代为Glu，Leu或Arg；在对应于位置56的取代为Cys，Glu或Thr；在对应于位置72的取代为Gln或Thr；在对应于位置102的取代为Lys或Pro；在对应于位置123的取代为Arg；在对应于位置138的取代为Cys，Glu，Gly，Lys，Leu或Met；在对应于位置149的取代为Ile；在对应于位置152的取代为Ser；在对应于位置163的取代为Glu，Phe或Val；在对应于位置164的取代为Cys或Leu；在对应于位置166的取代为Leu；在对应于位置169的取代为Arg或Cys；在对应于位置186的取代为Phe，Lys，Thr或Tyr；在对应于位置200的取代为Ile或Val；在对应于位置207的取代为Pro；在对应于位置213的取代为Glu；在对应于位置219的取代为Glu，Met，Gln或Cys；在对应于位置222的取代为Arg；在对应于位置234的取代为Gly或Lys；在对应于位置246的取代为Pro；在对应于位置249的取代为Gln,Arg或Cys；在对应于位置250的取代为Cys。

2.如权利要求1所述的变体，其中亲本GH61多肽的变体选自下组，该组由以下各项组成：(a)与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽具有至少80％序列一致性的一种多肽；(b)由多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在高严谨度条件下与以下各项的全长互补链杂交：(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410的成熟多肽编码序列，其中所述的高严谨度条件是指在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交，并使用0.2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟；(c)由与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码的一种多肽。

3.如权利要求2所述的变体，其中该亲本GH61多肽与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

4.如权利要求2所述的变体，其中该亲本GH61多肽由在高严谨度条件下与以下各项的完全互补链杂交的多核苷酸编码：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410的成熟多肽编码序列，其中所述的高严谨度条件是指在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交，并使用0.2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

5.如权利要求2所述的变体，其中该亲本GH61多肽由与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、408、或410的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性的一种多核苷酸编码。

6.如权利要求2所述的变体，其中该亲本GH61多肽包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽，或由其组成。

7.如权利要求1-6中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、56、158、160、162、164、166、168、409、或411的成熟多肽具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％的序列一致性。

8.如权利要求1-7中任一项所述的变体，该变体进一步包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置111、152、155、以及162相对应的位置处1，2，3或4个取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性；其中在对应于位置111的取代为Val；在对应于位置152的取代为Ser；在对应于位置155的取代为Leu；在对应于位置162的取代为Trp。

9.如权利要求1-8中任一项所述的变体，该变体进一步包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置96、98、200、202、以及204相对应的位置处1，2，3,4,5或6个取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性；其中在对应于位置96的取代为Val；对应于位置98的取代为Leu；对应于位置200的取代为Ile；对应于位置202的取代为Leu；对应于位置204的取代为Val。

10.如权利要求1-9中任一项所述的变体，该变体进一步包含在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置105、154、188、189、216、以及229相对应的位置处1，2，3，4，5或6个的取代，其中该变体具有纤维素分解增强活性；其中在对应于位置105的取代为Pro或Lys；在对应于位置154的取代为Leu；在对应于位置188的取代为Ala或Trp；在对应于位置189的取代为Lys；在对应于位置216的取代为Leu或Tyr；在对应于位置229的取代为Trp，His，lie或Tyr。

11.如权利要求1-10中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少1.01倍的增加的热稳定性。

12.如权利要求11中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少1.05倍的增加的热稳定性。

13.如权利要求11中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少1.1倍的增加的热稳定性。

14.如权利要求11中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少1.2倍的增加的热稳定性。

15.如权利要求11中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少1.4倍的增加的热稳定性。

16.如权利要求11中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少1.5倍的增加的热稳定性。

17.如权利要求11中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少1.8倍的增加的热稳定性。

18.如权利要求11中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少2倍的增加的热稳定性。

19.如权利要求11中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少5倍的增加的热稳定性。

20.如权利要求11中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少10倍的增加的热稳定性。

21.如权利要求11中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少20倍的增加的热稳定性。

22.如权利要求11中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少25倍的增加的热稳定性。

23.如权利要求11中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少30倍的增加的热稳定性。

24.如权利要求11中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少50倍的增加的热稳定性。

25.如权利要求11中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少75倍的增加的热稳定性。

26.如权利要求11中任一项所述的变体，该变体具有与该亲本相比至少100倍的增加的热稳定性。

27.一种分离的多核苷酸，其编码如权利要求1-26中任一项所述的变体。

28.一种核酸构建体，其包含如权利要求27所述的多核苷酸。

29.一种表达载体，其包含如权利要求27所述的多核苷酸。

30.一种转化了权利要求27所述多核苷酸的重组宿主细胞。

31.一种产生GH61多肽变体的方法，包括：在适于该变体表达的条件下培养如权利要求30所述的重组宿主细胞。

32.如权利要求31所述的方法，进一步包括回收该变体。

33.一种产生如权利要求1-26中任一项所述的变体的方法，包括：在有助于该变体产生的条件下培养包含编码该变体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。

34.如权利要求33所述的方法，进一步包括回收该变体。

35.一种用于获得GH61多肽变体的方法，该方法包括：在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置26、32、34、40、41、42、47、56、72、102、123、138、149、152、163、164、166、169、186、200、207、213、219、222、234、246、249、以及250相对应的一个或多个位置处将取代引入亲本GH61多肽，其中该变体具有纤维素分解增强活性；并且其中该变体与亲本GH61多肽的氨基酸序列具有至少80％、但少于100％的序列一致性；其中在对应于位置26的取代为Ile，在对应于位置32的取代为Glu或Ser；在对应于位置34的取代为Phe；在对应于位置40的取代为Ala；在对应于位置41的取代为Thr；在对应于位置42的取代为Ile，Glu或Val；在对应于位置47的取代为Glu，Leu或Arg；在对应于位置56的取代为Cys，Glu或Thr；在对应于位置72的取代为Gln或Thr；在对应于位置102的取代为Lys或Pro；在对应于位置123的取代为Arg；在对应于位置138的取代为Cys，Glu，Gly，Lys，Leu或Met；在对应于位置149的取代为Ile；在对应于位置152的取代为Ser；在对应于位置163的取代为Glu，Phe或Val；在对应于位置164的取代为Cys或Leu；在对应于位置166的取代为Leu；在对应于位置169的取代为Arg或Cys；在对应于位置186的取代为Phe，Lys，Thr或Tyr；在对应于位置200的取代为Ile或Val；在对应于位置207的取代为Pro；在对应于位置213的取代为Glu；在对应于位置219的取代为Glu，Met，Gln或Cys；在对应于位置222的取代为Arg；在对应于位置234的取代为Gly或Lys；在对应于位置246的取代为Pro；在对应于位置249的取代为Gln,Arg或Cys；在对应于位置250的取代为Cys并且回收该变体。

36.如权利要求35所述的方法，进一步包括在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置111、152、155、以及162相对应的一个或多个位置处将1，2，3或4个取代引入亲本GH61多肽，其中该变体具有纤维素分解增强活性；其中在对应于位置111的取代为Val；在对应于位置152的取代为Ser；在对应于位置155的取代为Leu；在对应于位置162的取代为Trp。

37.如权利要求35或36所述的方法，进一步包括在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置96、98、200、202、以及204相对应的一个或多个位置处将1，2，3，4，5或6个取代引入亲本GH61多肽，其中该变体具有纤维素分解增强活性；其中在对应于位置96的取代为Val；对应于位置98的取代为Leu；对应于位置200的取代为Ile；对应于位置202的取代为Leu；对应于位置204的取代为Val。

38.如权利要求35-37中任一项所述的方法，进一步包括在与SEQ ID NO:30的成熟多肽的位置105、154、188、189、216、以及229相对应的一个或多个位置处将1，2，3，4，5或6个取代引入亲本GH61多肽，其中该变体具有纤维素分解增强活性；其中在对应于位置105的取代为Pro或Lys；在对应于位置154的取代为Leu；在对应于位置188的取代为Ala或Trp；在对应于位置189的取代为Lys；在对应于位置216的取代为Leu或Tyr；在对应于位置229的取代为Trp，His，lie或Tyr。

39.一种用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：用含有如权利要求1-26中任一项所述的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的酶组合物处理该纤维素材料。

40.如权利要求39所述的方法，其中该纤维素材料经过了预处理。

41.如权利要求39或40所述的方法，进一步包括回收该降解的或转化的纤维素材料。

42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中该酶组合物进一步包含选自下组的一种或多种酶,该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、以及蛋白酶。

43.如权利要求39-42中任一项所述的方法，其中该酶组合物进一步包含扩张蛋白和/或膨胀素。

44.如权利要求42中任一项所述的方法，其中所述木质素分解酶是漆酶。

45.如权利要求42所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。

46.如权利要求42所述的方法，其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。

47.如权利要求39-46中任一项所述的方法，其中该降解或转化的纤维素材料是糖。

48.如权利要求47所述的方法，其中该糖选自下组,该组由以下各项组成：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、以及阿拉伯糖。

49.一种用于产生发酵产物的方法，该方法包括：(a)用含有如权利要求1-26中任一项所述的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的酶组合物使一种纤维素材料糖化；(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；并且(c)从该发酵中回收该发酵产物。

50.如权利要求49所述的方法，其中对该纤维素材料进行了预处理。

51.如权利要求49或50所述的方法，其中该酶组合物包含选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、以及蛋白酶。

52.如权利要求49-51中任一项所述的方法，其中该酶组合物进一步包含扩张蛋白和/或膨胀素。

53.如权利要求51中任一项所述的方法，其中所述木质素分解酶是漆酶。

54.如权利要求51所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。

55.如权利要求51所述的方法，其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。

56.如权利要求49-55中任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)是在同时的糖化和发酵中同时执行。

57.如权利要求49-56中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、气体、酮、有机酸、或聚酮化合物。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述有机酸为氨基酸。

59.如权利要求57所述的方法，其中所述烯烃为异戊二烯。

60.一种发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种发酵微生物发酵该纤维素材料，其中用含有如权利要求1-26中任一项所述的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽变体的酶组合物糖化该纤维素材料。

61.如权利要求60所述的方法，其中该纤维素材料在糖化之前经过了预处理。

62.如权利要求60或61所述的方法，其中该酶组合物包含选自下组的一种或多种酶,该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、以及蛋白酶。

63.如权利要求60-62中任一项所述的方法，其中该酶组合物进一步包含扩张蛋白和/或膨胀素。

64.如权利要求62中任一项所述的方法，其中所述木质素分解酶是漆酶。

65.如权利要求62所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。

66.如权利要求62所述的方法，其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。

67.如权利要求60-66中任一项所述的方法，其中该纤维素材料的发酵产生发酵产物。

68.如权利要求67所述的方法，进一步包括从发酵中回收该发酵产物。

69.如权利要求67或68所述的方法，其中该发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、气体、酮、有机酸、或聚酮化合物。

70.如权利要求69所述的方法，其中所述有机酸为氨基酸。

71.如权利要求69所述的方法，其中所述烯烃为异戊二烯。

72.一种包括权利要求1-26中任一项所述的变体的组合物。

73.一种全培养液液配制品或细胞培养组合物，包含如权利要求1-26中任一项所述的变体。

74.一种洗涤剂组合物，包含表面活性剂和如权利要求1-26中任一项所述的变体。

75.如权利要求74所述的组合物，进一步包含选自下组的一种或多种酶,该组由以下各项组成：淀粉酶、阿拉伯糖酶、角质酶、碳水化合物酶、纤维素酶、半乳聚糖酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及木聚糖酶。

76.如权利要求74或75所述的组合物，该组合物被配制为条、片、粉末、颗粒、糊、或液体。

77.一种用于清洁或洗涤硬表面或衣物的方法，该方法包括使该硬表面或该衣物与如权利要求74-76中任一项所述的组合物相接触。