CN117551667B - Rbb1基因在制备水稻类病斑材料和调控水稻抗病菌感染能力中的应用 - Google Patents
Rbb1基因在制备水稻类病斑材料和调控水稻抗病菌感染能力中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种RBB1基因在制备水稻类病斑材料和调控水稻抗病菌感染能力中的应用，涉及生物技术领域。本发明提供了一个新的水稻类病斑基因RBB1，经发明人研究发现，RBB1基因突变后，水稻表现为类病斑叶，回补后，类病斑消失，因此，RBB1基因能够用于水稻类病斑材料的制备。经发明人研究发现，RBB1基因突变后，水稻抗病菌感染能力增强，因此，RBB1基因能够用于水稻抗病菌感染能力的调控，研究人员还发现由于RBB1的遗传损伤，导致水稻UDP‑GlcNAc合成减少，可用于水稻抗病菌感染能力的检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种RBB1基因在制备水稻类病斑材料和调控水稻抗病菌感染能力中的应用。
背景技术
水稻类病斑是水稻叶片或叶鞘上出现不同颜色、大小和形状的斑点，属于自发形成的一类坏死斑叶色突变体。类病斑突变体广泛存在于植物的各个物种中，在水稻、玉米、拟南芥、大麦中均有报道。植物为应对各种生物胁迫形成了一整套复杂而又被精密调控的天然免疫系统(Innateimmunity)。当植物遭受病原菌攻击时，在侵染位点发生超敏反应(Hypersensitive response, HR)，激活系统获得性抗性，从而快速阻止病原菌的进一步侵染和扩张。细胞程序性死亡(Programmed cell death, PCD)在植物抗病反应过程中发挥重要作用并被一系列元件精密调控着。当此类负调控元件发生突变后，植株叶片等部位会形成类病斑，其本质是PCD失控的一种表现形式。类病斑基因作用十分广泛，涉及包括生长、发育、衰老、死亡等很多生理生化过程。类病斑突变体通常伴随着抗病性提高、抗病反应相关物质的组成性表达，如防御反应相关基因的激活、胼胝质的积累、水杨酸含量的升高、活性氧(ROS)的积累、抗病相关基因的表达上调等现象，最后表现为植株对白叶枯病、稻瘟病等病菌抗性的增强。因此，类病斑材料是研究细胞程序性死亡，植物防卫应激反应机制的良好材料，发掘新的水稻类病斑基因对增强水稻抗病性和抗病反应的认知具有重要意义，对水稻品种改良和抗病性的研究意义重大。
通过分析已克隆的类病斑基因生物学功能发现，影响水稻类病斑发生的途径主要有3类。（1）抗性基因的改变或过量表达启动超敏反应，造成类病斑的形成。NLS1、NPR1等水杨酸介导的抗病反应的调控因子都会产生类病斑表型。（2）类病斑是细胞死亡的一种表现形式，因此PCD相关的任何因素都可能引发类病斑的形成。SPL11、OsCUL3a和SPL35等泛素复合体成员的变异会产生类病斑表型并提高抗病性。（3）代谢途径紊乱导致类病斑形成。四吡咯生物合成途径、脂肪酸代谢途径、尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺生物合成途径、柠檬酸代谢途径等相关酶活性的改变都会产生类病斑表型。在水稻中，通过正、反向遗传学方法，目前已有超过20个类病斑基因被克隆，且大多数类病斑突变体抗病性显著提高。克隆的类病斑基因虽多，但它们行使的功能都不尽相同，这在一定程度上说明影响类病斑突变分子机制的复杂性，因此，需要挖掘新的类病斑基因，完善类病斑形成的分子机理，为水稻抗病分子育种提供理论依据，有助于水稻品种改良和抗病性的研究。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供RBB1基因在制备水稻类病斑材料中的应用，以解决上述问题中的至少一种。
本发明的第二目的在于提供一种水稻类病斑材料。
本发明的第三目的在于提供RBB1基因在调控水稻抗病菌感染能力中的应用。
本发明的第四目的在于提供一种水稻抗病菌感染能力相关的标志物。
本发明的第五目的在于提供用于检测上述标志物的试剂在检测水稻抗病菌感染能力中的应用。
本发明的第六目的在于提供一种检测水稻抗病菌感染能力的试剂。
第一方面，本发明提供了RBB1基因在制备水稻类病斑材料中的应用，所述RBB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
制备类病斑材料的方法包括将水稻的RBB1基因突变。
第二方面，本发明提供了一种水稻类病斑材料，所述水稻类病斑材料为RBB1基因突变的水稻；
所述RBB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为进一步技术方案，RBB1基因突变后，突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4中的任一项所示。
第三方面，本发明提供了RBB1基因在调控水稻抗病菌感染能力中的应用，所述RBB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
突变RBB1基因，水稻抗病菌感染能力增强。
作为进一步技术方案，所述病菌包括白叶枯细菌或稻瘟病菌。
第四方面，本发明提供了一种水稻抗病菌感染能力相关的标志物，所述标志物选自a-c中的任一项：
a.RBB1基因的突变基因；
b.RBB1基因的突变基因转录的RNA；
c.RBB1基因的突变基因表达的蛋白；
所述RBB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为进一步技术方案，所述RBB1基因的突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4中的任一项所示。
第五方面，本发明提供了用于检测上述标志物的试剂在检测水稻抗病菌感染能力中的应用。
第六方面，本发明提供了一种检测水稻抗病菌感染能力的试剂，所述试剂用于检测所述的标志物；
所述标志物选自a或b。
作为进一步技术方案，所述试剂包括用于扩增RBB1基因的突变基因的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
和/或，所述试剂包括用于扩增RBB1基因的突变基因转录的RNA的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一个新的水稻类病斑基因RBB1，经发明人研究发现，RBB1基因突变后，水稻表现为类病斑，回补后，类病斑消失，因此，RBB1基因能够用于水稻类病斑材料的制备。
经发明人研究发现，RBB1基因突变后，水稻抗病菌感染能力增强，因此，RBB1基因能够用于水稻抗病菌感染能力的调控，研究人员还发现由于RBB1的遗传损伤，导致水稻UDP-GlcNAc（尿苷二磷酸-N-乙酰基葡萄糖胺）合成减少，可用于水稻抗病菌感染能力的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为野生型水稻和突变体水稻的表型图；
图2为水稻9311和突变体rbb1及回补株系中LOC_Os02g48650基因测序结果；
图3为不同水稻株系表型图；
图4为野生型水稻和基因编辑水稻表型图；
图5为野生型水稻9311和突变体rbb1中MDA和H2O2含量；
图6为野生型水稻9311和突变体rbb1接种白叶枯及稻瘟病菌结果；
图7为水稻不同株系接种白叶枯及稻瘟病菌表型图；
图8为野生型与突变体蛋白的酶活测定；
图9为水稻野生型与突变体中糖蛋白检测。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供了RBB1基因在制备水稻类病斑材料中的应用，所述RBB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
制备类病斑材料的方法包括将水稻的RBB1基因突变。
RBB1基因的核苷酸序列如下：
ATGGCATCCACCTCGCCGGAACCCTCCACCGCCGCCGCCGTCGCGGAGACCGGCTGTTCCGTCCAAATCCGTCGCCTGGAGGCGACAGACCACGAGAAGGGATTCGTGGCCCTCCTCTCGCAGCTCTCCGCCTGCCCGGACCTCACCGCGTCCGAGTTCGCCGCGTGCTTCGCCGACCTCGCGGCCCTCGGCGACGACCACGTCATCCTCGTGGCCGAGGACCCCGCCGCCCCGGAGAGTCGGATCCTCGCCACGGGGTGCCTCTTCGTGGAGCGCAAGTTCCTGCGCGGCGGCGGGAAGGTGGGGCACGTGGAGGACGTCGTGGTCGACGCCGCCGCGCGCGGCCGCGGGCTCGGGCTCCGCGTCGTGCGTCGCCTCGTGGAGATCGCCAAGGAGGCCGGATGCTACAAGGTCATCCTCGACTGCACGCCCGAGCTACGCGCGTACTATGCCAAGTGCGGATTCGTGGAGAAGGGGGTTCAGATGGCAATCTACTTCTGA（SEQ ID NO.1）。
经发明人研究发现，RBB1基因突变后，水稻表现为类病斑，回补后，类病斑消失，因此，RBB1基因能够用于水稻类病斑材料的制备。
本发明中，所述突变包括敲除突变、点突变或插入突变。
第二方面，本发明提供了一种水稻类病斑材料，所述水稻类病斑材料为RBB1基因突变的水稻；
所述RBB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供的水稻类病斑材料能够用于水稻品种改良以及抗病性等方面的研究。
本发明中，所述突变包括敲除突变、点突变或插入突变。
在一些可选的实施方式中，RBB1基因突变后，突变基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4中的任一项所示。
突变基因依次命名为rbb1、rbb1-1和rbb1-2。
rbb1的核苷酸序列如下：
ATGGCATCCACCTCGCCGGAACCCTCCACCGCCGCCGCCGTCGCGGAGACCGGCTGTTCCGTCCAAATCCGTCGCCTGGAGGCGACAGACCACGAGAAGGGATTCGTGGCCCTCCTCTCGCAGCTCTCCGCCTGCCCGGACCTCACCGCGTCCGAGTTCGCCGCGTGCTTCGCCGACCTCGCGGCCCTCGGCGACGACCACGTCATCCTCGAGGCCGAGGACCCCGCCGCCCCGGAGAGTCGGATCCTCGCCACGGGGTGCCTCTTCGTGGAGCGCAAGTTCCTGCGCGGCGGCGGGAAGGTGGGGCACGTGGAGGACGTCGTGGTCGACGCCGCCGCGCGCGGCCGCGGGCTCGGGCTCCGCGTCGTGCGTCGCCTCGTGGAGATCGCCAAGGAGGCCGGATGCTACAAGGTCATCCTCGACTGCACGCCCGAGCTACGCGCGTACTATGCCAAGTGCGGATTCGTGGAGAAGGGGGTTCAGATGGCAATCTACTTCTGA（SEQ ID NO.2）。
rbb1-1的核苷酸序列如下：
ATGGCATCCACCTCGCCGGAACCCTCCACCGCCGCCGCCGGCGGAGACCGGCTGTTCCGTCCAAATCCGTCGCCTGGAGGCGACAGACCACGAGAAGGGATTCGTGGCCCTCCTCTCGCAGCTCTCCGCCTGCCCGGACCTCACCGCGTCCGAGTTCGCCGCGTGCTTCGCCGACCTCGCGGCCCTCGGCGACGACCACGTCATCCTCGTGGCCGAGGACCCCGCCGCCCCGGAGAGTCGGATCCTCGCCACGGGGTGCCTCTTCGTGGAGCGCAAGTTCCTGCGCGGCGGCGGGAAGGTGGGGCACGTGGAGGACGTCGTGGTCGACGCCGCCGCGCGCGGCCGCGGGCTCGGGCTCCGCGTCGTGCGTCGCCTCGTGGAGATCGCCAAGGAGGCCGGATGCTACAAGGTCATCCTCGACTGCACGCCCGAGCTACGCGCGTACTATGCCAAGTGCGGATTCGTGGAGAAGGGGGTTCAGATGGCAATCTACTTCTGA（SEQ ID NO.3）。
rbb1-2的核苷酸序列如下：
ATGGCATCCACCTCGCCGGAACCCTCCACCGCCGCCGCCGTTCGCGGAGACCGGCTGTTCCGTCCAAATCCGTCGCCTGGAGGCGACAGACCACGAGAAGGGATTCGTGGCCCTCCTCTCGCAGCTCTCCGCCTGCCCGGACCTCACCGCGTCCGAGTTCGCCGCGTGCTTCGCCGACCTCGCGGCCCTCGGCGACGACCACGTCATCCTCGTGGCCGAGGACCCCGCCGCCCCGGAGAGTCGGATCCTCGCCACGGGGTGCCTCTTCGTGGAGCGCAAGTTCCTGCGCGGCGGCGGGAAGGTGGGGCACGTGGAGGACGTCGTGGTCGACGCCGCCGCGCGCGGCCGCGGGCTCGGGCTCCGCGTCGTGCGTCGCCTCGTGGAGATCGCCAAGGAGGCCGGATGCTACAAGGTCATCCTCGACTGCACGCCCGAGCTACGCGCGTACTATGCCAAGTGCGGATTCGTGGAGAAGGGGGTTCAGATGGCAATCTACTTCTGA（SEQ ID NO.4）。
第三方面，本发明提供了RBB1基因在调控水稻抗病菌感染能力中的应用，所述RBB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
突变RBB1基因，水稻抗病菌感染能力增强。
本发明中，所述突变包括敲除突变、点突变或插入突变。
经发明人研究发现，RBB1基因突变后，水稻抗病菌感染能力增强，因此，RBB1基因能够用于水稻抗病菌感染能力的调控，也可用于水稻抗病菌感染能力的检测。
其中，所述病菌包括白叶枯细菌或稻瘟病菌。
第四方面，本发明提供了一种水稻抗病菌感染能力相关的标志物，所述标志物选自a-c中的任一项：
a.RBB1基因的突变基因；
b.RBB1基因的突变基因转录的RNA；
c.RBB1基因的突变基因表达的蛋白；
所述RBB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
由于RBB1基因突变后，水稻抗病菌感染能力增强，因此可以根据RBB1基因的突变基因和RBB1基因的突变基因转录的RNA的序列，以及RBB1基因的突变基因表达的蛋白的活性检测水稻抗病菌感染能力。
本发明中，所述突变包括敲除突变、点突变或插入突变。
在一些可选的实施方式中，所述RBB1基因的突变基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4中的任一项所示。
第五方面，本发明提供了用于检测上述标志物的试剂在检测水稻抗病菌感染能力中的应用。
第六方面，本发明提供了一种检测水稻抗病菌感染能力的试剂，所述试剂用于检测所述的标志物；
所述标志物选自a或b。
由于RBB1的遗传损伤，导致水稻抗病性增强，因此通过检测RBB1基因的突变基因和RBB1基因的突变基因转录的RNA的序列，能够实现对水稻抗病菌感染能力的检测。
在一些可选的实施方式中，所述试剂包括用于扩增RBB1基因的突变基因的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
引物F：agctcggtacccggggatccAAGCAGACGAAGTGGGAGTAGAC（SEQ ID NO.5）；
引物R:ttgcatgcctgcaggtcgacTTGTTGCTTCTCCTTGTGCTACC（SEQ ID NO.6）。
所述试剂包括用于扩增RBB1基因的突变基因转录的RNA的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
引物F：gtgccgcgcggcagccatatgATGGCATCCACCTCGCCGGAA（SEQ ID NO.7）；
引物R：gctttgttagcagccggatccTCAGAAGTAGATTGCCATCTGAAC（SEQ ID NO.8）。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
1.rbb1的克隆
我们在已有的EMS突变体库中发现一株类病斑水稻植株，该水稻植株在三叶期叶片开始出现点状类病斑（图1中的a）且一直持续到整个生长周期（图1中的b），bar=5cm。
通过图位克隆和测序分析，确定了野生型水稻9311中基因LOC_Os02g48650的单碱基T-A突变（图2）导致了类病斑表型的形成，确定了新的水稻类病斑基因LOC_Os02g48650，序列如SEQ ID NO.1所示，野生型命名为RBB1，突变体命名为rbb1，序列如SEQ ID NO.2所示。利用CTAB法提取水稻9311的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，引物用F：agctcggtacccggggatccAAGCAGACGAAGTGGGAGTAGAC（SEQ ID NO.5）和R:ttgcatgcctgcaggtcgacTTGTTGCTTCTCCTTGTGCTACC（SEQ ID NO.6）进行PCR扩增，扩增出起始密码子ATG前约2 kb及终止密码子TGA下游约1.5 kb的RBB1基因，通过同源重组酶将其连至双元表达载体pCAMBIA1300，再通过农杆菌介导的转化方法将p1300-RBB1导入rbb1突变体中，对回补单株进行基因型测序，突变位点碱基由A变为杂合T/A（图2）。
观察野生型、突变体及回补转基因植株（命名为rbb1-C）的表型，发现只有突变体存在类病斑表型，回补株系类病斑表型消失（图3）。
在RBB1的外显子上选择两个靶点，按照植物Cas9/gRNA质粒构建试剂盒(Catalog.No. VK005-01)设计靶点引物，分别为：
gRNA-1F:cagACAGCCGGTCTCCGCGACGG（SEQ ID NO.9）；
gRNA-1R:aacCCGTCGCGGAGACCGGCTGT（SEQ ID NO.10）；
gRNA-2F:cagCCACGTCATCCTCGTGGCCG（SEQ ID NO.11）；
gRNA-2R:aacCGGCCACGAGGATGACGTGG（SEQ ID NO.12）；
将合成的oligo靶点引物分别稀释成10μM，按照如下比例混合：
Target-F5μL；
Target-R5μL；
H2O15μL；
Total25μL。
混匀后，按照程序:95℃ 3min，将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温。按照步骤：
Cas9/gRNA Vector1μL；
oligo 二聚体1μL；
Solution 1 1μL；
Solution2 1μL；
H2O 6μL；
Total10μL；
16℃反应 2 小时。
取最终产物5-10μL加入到刚解冻的100μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30分钟，42℃热激90秒，冰上静置2分钟，加入500微升无抗LB，置于37℃恒温摇床中，180转，复苏一小时后涂卡纳抗性（Kana+）的平板。挑3至5个白色菌落摇菌，进行测序，挑选测序正确的菌落提质粒转化农杆菌EHA105，利用农杆菌介导的植株转化法，基因编辑野生型的RBB1基因，观察纯合敲除植株后代表型，发现与突变体一致（图4），bar=2cm。其中，9311和NIP为正常水稻叶片，rbb1为基因突变后叶片，rbb1-C为回补后表型恢复正常的水稻叶片，rbb1-1和rbb1-2为CRISPR/Cas9基因编辑纯合后代。
2.rbb1的抗病性
利用试剂盒测定野生型和突变体rbb1叶片中丙二醛（MDA）含量，称取0.5g新鲜水稻叶片，剪刀剪碎后加5% 三氯乙酸（TCA） 5 ml，用预冷的研钵置于冰上研磨至匀浆状，倒入10 ml离心管中；4℃ 3,000 rpm离心10 min，取上清液2 ml至新的10 ml离心管中，加入0.67% 硫代巴比妥酸（TBA） 2 ml，混合后在100 ℃沸水中煮30 min，室温自然冷却后取1.5ml上清至新1.5 ml离心管中，室温12,000 rpm离心后取上清；用分光光度计分别测定上清液在450 nm、532 nm和600 nm处的吸光度值；并按公式C/μmol/L = 6.45 (A532-A600) -0.56 A450算出MDA浓度，再算出单位鲜重组织中的MDA含量(μmol/g)（A450、A532、A600分别代表450 nm、532 nm和600 nm波长下的吸光度值）。突变体rbb1中MDA含量显著高于野生型（图5中的a）。H2O2采用硫酸钛比色法进行测量，具体操作方法见过氧化氢检测试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）。结果表明，突变体中H2O2的含量显著高于野生型（图5中的b）。
在WF-P培养基和燕麦培养基中分别培育白叶枯病和稻瘟病菌株。采用剪叶法对水稻植株接种白叶枯病Xoo。将白叶枯两种菌株PXO99A和PXO341分别悬浮在蒸馏水中，并调节至109个活细胞/mL（OD600＝1）。将剪刀浸入细菌悬浮液中，然后剪去完全伸展的叶片的远端（5cm）。每个品系接种至少三株，每株三个叶片。受感染的植物在28℃温室中生长，光周期为14小时光照（452 mmol/m2/s），10小时黑暗。15天后测量叶片病变长度来评估水稻感染白叶枯的情况，结果如图6中的a（PXO99A和PXO341感染15天后，野生型和突变型叶片的外观）、图6中的b（PXO99A和PXO341感染15天后，野生型和突变型叶片病变长度）、图7中的a（PXO99A和PXO341感染15天后，野生型9311、突变型和回补株系叶片的外观）和图7中的b（PXO99A和PXO341感染15天后，野生型NIP、敲除株系rbb1-1、rbb1-2叶片的外观）所示。稻瘟病菌株的接种采取离体接种法，刮取稻瘟病菌菌株HZD和RB22孢子，悬浮在蒸馏水中，并调节至5×105个孢子/mL。剪取6cm长水稻叶片，用移液器吸头间隔2cm搓伤叶片，然后滴加5ul孢子液在伤口上，再将叶片漂浮在添加蒸馏水的培养皿中，将接种的植物转移到温度为25℃、相对湿度为80%、光照12小时、黑暗12小时的培养箱中。5天后测量病变面积和真菌生物量，结果如图6中的c（HZD感染5天后，野生型和突变型叶片的外观）、图6中的d（HZD感染5天后，野生型和突变型叶片病变面积）、图7中的c（HZD感染5天后，野生型、突变型和回补株系叶片的外观）和图7中的d（RB22感染5天后，野生型NIP、敲除株系rbb1-1、rbb1-2叶片的外观）所示。实验发现，突变体rbb1相比野生型9311对白叶枯菌和稻瘟病菌的抗性显著增强（图6），bar=2cm。敲除株系rbb1-1、rbb1-2的白叶枯和稻瘟病抗性也比对照显著增强，而回补株系rbb1-C的白叶枯和稻瘟病抗性水平与对照一样（图7），bar=2cm。
3. 酶活测定
通过基因注释和进化分析发现RBB1具有葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性，TRizo法分别提取RBB1和rbb1的RNA，使用TOYOBO反转录试剂盒反转录得cDNA。
合成引物F：gtgccgcgcggcagccatatgATGGCATCCACCTCGCCGGAA（SEQ ID NO.7）；
R：gctttgttagcagccggatccTCAGAAGTAGATTGCCATCTGAAC（SEQ ID NO.8）；
以反转cDNA为模板扩增，扩增产物纯化后与NdeI/BamHI双酶切的pGET-15b重组转化，重组载体定义为pOsRBB1和pOsrbb1。将pOsRBB1和pOsrbb1转化大肠杆菌BL21菌株，并在Luria Bertani培养基上生长。将过夜培养物接种到稀释度为1:100的新鲜培养基中，并在37℃下生长，直到OD600达到0.6，向培养物中加入0.5mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），并在28℃下再孵育5小时。通过离心收集细胞，并将其悬浮在二十分之一培养体积的超声缓冲液（50mM Tris醋酸盐、10mM EDTA和5mM 二硫苏糖醇(DTT)，pH 7.5）中，在冰上超声处理4分钟（打开1秒，关闭2秒）。将细胞裂解物在15000g下离心30分钟，并使用SDS-PAGE进行电泳分析。OsRBB1-His和Osrbb1-His融合蛋白在自然条件下使用Ni-NTA柱纯化。
为了检测rbb1是否能乙酰化GlcN-6-P，使用0.1μg纯化蛋白、200μM乙酰辅酶a（acety-CoA）和不同量的GlcN-6-P进行酶活测定，酶反应在50µL反应混合物中进行，反应混合物含有50 mM Tris-HCl、pH 7.5、5 mM MgCl2、200 µM GlcN-6-P、200 µM乙酰辅酶a、10%（v/v）甘油和约0.1 µg纯化的重组蛋白。在30℃下孵育不同时间，通过加入50µL含有50 mMTris-HCl（pH 7.5）、6.4 M胍盐酸盐的停止溶液，然后加入50 µL含有50 mM-Tris-HCl、pH7.5、1 mM EDTA和20 µM 2-硝基苯甲酸的溶液，终止反应。纯化的重组蛋白产生的CoA的量通过4-硝基硫代酚盐估计，并在412 nm的最佳密度下测量，结果发现：His-OsRBB1表现出GlcN-6-P AT活性，而His-Osrbb1蛋白则没有（图8中的a）。使用0.1μg纯化蛋白，200μM乙酰辅酶a（acety-CoA），在相同的10分钟内使用不同量的GlcN-6-P进行酶活测定，结果发现：His-OsRBB1表现出GlcN-6-P AT活性，而His-Osrbb1蛋白则没有（图8中的b）。UDP-GlcNAc稳态水平的分析显示，rbb1突变体的UDP-GlcNAc水平低于野生型（图8中的d、f），表明RBB1依赖性途径是水稻UDP-GlcNAc的主要来源。在与GlcN-6-P孵育6小时后，野生型植物中UDP-GlcNAc的水平增加，但在rbb1突变体中没有增加（图8中的e，图8中的f（mock为水处理的对照组）），图8中的c为标准品的UDP-GlcNAc稳态水平。结果表明，rbb1中GlcN-6-P的AT活性受损。
4.糖蛋白的测定
所有的N链聚糖和O链聚糖在蛋白质附着位点都具有两个GlcNAc部分。在这些N-聚糖和O-聚糖的生物合成过程中，UDP-GlcNAc是GlcNAcs中不可或缺的供体。糖基化是真核生物中一种高度保守且广泛存在的蛋白质修饰类型。N-糖基化和O-糖基化是两种非常重要的类型。O-GlcNAc修饰的蛋白质包括聚合酶、蛋白酶体、转录因子和RNA加工蛋白，蛋白质O-GlcNA酰化具有重要的生物学功能。N-糖基化修饰在确保分泌蛋白的正确翻译和折叠方面起着至关重要的调节作用。当N-糖基化受到干扰时，内质网腔内的错误折叠蛋白增加，引起内质网应激，从而诱导未折叠蛋白反应。缺乏UDP-GlcNAc可能会干扰正常的N-糖基化修饰蛋白和O-糖基化修饰蛋白合成。基于此，我们对野生型水稻和突变体rbb1中N-糖基化修饰蛋白和O-糖基化修饰蛋白进行测定。
分别取野生型和突变体幼苗的新鲜叶子1 g，液氮预冷后超声粉碎，加入50mMTris-HCl，pH 7.2，4℃，12000 g离心5分钟，收集上清液。向上清液中加入1.2倍体积的甲醇和0.3倍体积的氯仿，4℃，12000 g离心5分钟，用甲醇冲洗沉淀，在室温下干燥10分钟，重悬于含有β-巯基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液中，并在95℃下加热5分钟。用10%丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE分离蛋白质，并将其电印迹到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF膜用含有150mM氯化钠和0.05% Tween20的10 mM Tris-HCl（pH 7.2）洗涤四次，每次10分钟。检测N-糖基化修饰蛋白使用50 µg/ml带HPR的ConA抗体缓冲液A，O-糖基化修饰蛋白使用50µg/ml带HPR的WGA抗体缓冲液A，25℃下孵育1小时。在缓冲液A中浸泡10分钟洗膜，重复三次。用15 mM磷酸钠缓冲液漂洗，然后转移到pH 7.0含有1 mg/mL DAB的15 mM磷酸钠盐缓冲液中，5分钟后，将过氧化氢以5 mM的最终浓度添加到溶液中以检测过氧化物酶活性。
我们发现N-糖基化修饰蛋白和O-糖基化修饰蛋白含量在rbb1突变体中降低（图9，箭头所指示），表明，N-糖基化修饰蛋白和O-糖基化修饰蛋白的损伤是rbb1抗病的主要原因。
以上结果说明RBB1基因在水稻蛋白糖基化修饰中起重要作用，通过影响水稻糖代谢影响水稻抗病性，该结果对增强水稻抗病性和抗病反应的认知具有重要意义，为水稻抗病防治提供新的靶标基因。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (6)
1. 敲除RBB1基因在制备水稻类病斑材料中的应用，其特征在于，所述RBB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述RBB1基因敲除后发生失活。
2.水稻类病斑材料在水稻品种改良中的应用，其特征在于，所述水稻类病斑材料为RBB1基因敲除的水稻；
所述RBB1基因敲除后发生失活；
所述RBB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，RBB1基因敲除突变后，突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4中的任一项所示。
4. 敲除RBB1基因在增强水稻抗病菌感染能力中的应用，其特征在于，所述RBB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述RBB1基因敲除后发生失活；
所述病菌为白叶枯细菌或稻瘟病菌。
5.一种水稻抗病菌感染能力相关的标志物，其特征在于，所述标志物选自a-c中的任一项：
a. RBB1基因的突变基因；
b. RBB1基因的突变基因转录的RNA；
c. RBB1基因的突变基因表达的蛋白；
所述RBB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述RBB1基因的突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4中的任一项所示；
所述病菌为白叶枯细菌或稻瘟病菌。
6.用于检测权利要求5所述的标志物的试剂在检测水稻抗病菌感染能力中的应用；
所述病菌为白叶枯细菌或稻瘟病菌。
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