KR101255413B1 - 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101255413B1
KR101255413B1 KR1020097026438A KR20097026438A KR101255413B1 KR 101255413 B1 KR101255413 B1 KR 101255413B1 KR 1020097026438 A KR1020097026438 A KR 1020097026438A KR 20097026438 A KR20097026438 A KR 20097026438A KR 101255413 B1 KR101255413 B1 KR 101255413B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
plant
nucleic acid
plants
delete delete
increased
Prior art date
Application number
KR1020097026438A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20100035688A (ko
Inventor
최양도
이상열
장호희
김옥매
허선미
Original Assignee
재단법인 작물유전체기능연구사업단
크롭디자인 엔.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인 작물유전체기능연구사업단, 크롭디자인 엔.브이. filed Critical 재단법인 작물유전체기능연구사업단
Publication of KR20100035688A publication Critical patent/KR20100035688A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101255413B1 publication Critical patent/KR101255413B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8227—Root-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 일반적으로 분자생물학 분야에 관한 것이며, 대조구 식물에 비해 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 2-Cys PRX (2-cysteine peroxiredoxin)를 암호화하는 핵산 서열의 식물 뿌리에서의 발현을 조절함으로써, 바람직하게는 증가시킴으로써, 또는 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 식물에서의 발현을 조절함으로써 대조구 식물에 비해 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 2-Cys PRX를 암호화하는 핵산 서열의 뿌리에서의 발현이 조절된, 바람직하게는 증가된, 또는 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현이 조절된 식물에 관한 것으로, 상기 식물은 대조구 식물에 비하여 수확량 관련 형질이 향상된 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 유용한 구축물을 제공한다.
2-Cys PRX, ANN 폴리펩티드, 수확량, 발현 조절

Description

향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법{Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same}
본 발명은 일반적으로 분자생물학 분야에 관한 것이며, 대조구 식물에 비해 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 2-Cys PRX (2- cysteine peroxiredoxin)를 암호화하는 핵산 서열의 식물 뿌리에서의 발현을 조절함으로써, 바람직하게는 증가시킴으로써, 또는 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 식물에서의 발현을 조절함으로써 대조구 식물에 비해 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 2-Cys PRX를 암호화하는 핵산 서열의 뿌리에서의 발현이 조절된, 바람직하게는 증가된, 또는 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현이 조절된 식물에 관한 것으로, 상기 식물은 대조구 식물에 비하여 수확량 관련 형질이 향상된 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 유용한 구축물을 제공한다.
세계 인구의 증가와 농업에 유용한 경작지의 감소는 농업의 효율성을 증가시키는 연구에 박차를 가하게 만들었다. 작물 및 원예농업 향상을 위한 전통적인 방식은 바람직한 특성을 갖는 식물체를 동정하기 위하여 선택적 육종기법을 이용한다. 그러나, 상기 선택적 육종기법에는 몇 가지 약점이 있는데, 즉 노동집약적이며 양친으로부터 원하는 형질이 항상 전해지는 것이 아닌 이종의 유전적 요소를 갖는 식물로 귀착된다는 것이다. 분자생물학의 진보는 인간이 동물 및 식물의 유전자원 (germplasm)을 변형하게 허용했다. 식물유전공학은 유전물질 (전형적으로 DNA 또는 RNA 형태)의 분리와 조작 및 이 유전물질을 식물체 내로 도입하게 했다. 상기 기술은 다양한 향상된 경제적, 농업적, 원예적 형질을 갖는 작물 또는 식물을 제공하는 능력이 있다.
특히 경제적으로 중요한 형질은 증가된 수확량이다. 수확량은 보통 작물로부터 경제적 가치의 측정할 수 있는 산물로 정의된다. 이는 양 및/또는 질의 면에서 정의될 수 있다. 수확량은 몇 가지 요인에 직접적으로 의존되는데, 예를 들면 기관의 수와 크기, 식물체 형상 (예를 들면, 가지의 수), 종자 생산, 잎의 노화 등이다. 뿌리 발달, 양분 흡수, 스트레스 내성, 및 초기 활력 또한 수확량 결정에 중요한 요인일 수 있다. 상기 요인들을 최적화하는 것이 작물 수확량 향상에 기여할 수 있다.
많은 식물의 종자는 인간과 동물의 영양에 중요하므로 종자 수확량이 특히 중요한 형질이다. 옥수수, 벼, 밀, 캐놀라 및 대두와 같은 작물이 종자 자체의 직접적인 소비 또는 가공종자로 육성된 육류 소비를 통해서 전체 인간 칼로리 흡수량의 절반 이상을 차지한다. 상기 작물들은 설탕, 기름 및 산업적 가공공정에 사용되는 많은 종류의 대사물의 재료이기도 하다. 종자는 배 (어린 줄기와 뿌리의 근원) 및 배유 (발아 동안 및 실생의 초기 생장 동안 배의 양분의 공급원)를 포함한다. 종자 발달에는 많은 유전자가 관여되며, 뿌리, 잎 및 줄기로부터 생장하는 종자로 대사물의 이동이 필요하다. 특히 배유는 탄수화물, 오일 및 단백질의 대사 전구체를 동화하여, 이들을 알곡을 채우기 위한 저장성 고분자로 합성한다.
많은 작물에 있어 추가로 경제적으로 중요한 형질은 초기 활력 (early vigour)이다. 초기 활력을 향상시키는 것은 온대 및 열대 벼 품종에 있어 현대 벼 육종 프로그램의 중요한 목표이다. 긴 뿌리는 물에 파종하는 벼에서는 적절하게 토양에 박히기 위하여 중요하다. 벼를 직접 논에 파종한 곳에서와 식물이 물 밖으로 급속히 나와야 하는 곳에서는 긴 어린 줄기가 강도와 연관되어 있다. 조파지에서는 긴 중배축과 자엽초가 실생이 나오기에 좋다. 식물체가 초기활력을 갖게 하는 기술은 농업에서 매우 중요하다. 예를 들면, 빈약한 초기 활력은 유럽 연안국의 콘벨트(Corn Belt) 유전자원에 기반한 옥수수 (Zea mays L.) 잡종의 도입에 제한이 되었다.
식물 생물량(biomass)은 알팔파, 청예옥수수 및 건초와 같은 사료작물에 대한 수확량이다. 수확량에 대한 많은 대체물이 곡류 작물에서 사용되어 왔다. 그 중 주요한 것으로는 식물체 크기를 평가하는 것이다. 식물체 크기는 생물종 및 발달 단계에 따라 많은 방식으로 측정될 수 있으나, 총 식물 건량, 지상부 건량, 지상부 생체량, 엽면적, 수간재적(stem volume), 초장, 로제트 직경, 엽장, 근장, 근질량, 분얼수 및 엽수를 포함한다. 많은 생물종은 특정 발달 단계에서 식물체의 각 부분 간의 크기에 일정한 비율을 유지한다. 상기의 상대적인 관계가 한 기관의 측정 크기로 다른 기관의 크기를 추정하는 데 사용된다 (예를 들면, Tittonell et al 2005 Agric Ecosys & Environ 105: 213). 초기 발달 단계에서 식물체의 크기는 전형적으 로 발달 후기의 식물체의 크기와 연관되어 있다. 보다 큰 엽면적을 갖는 보다 큰 식물체가 보다 작은 식물체에 비해 전형적으로 보다 많은 광 및 이산화탄소를 흡수하므로, 동일 기간 내에 보다 큰 중량을 얻을 것이다 (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50:39). 미소환경적 또는 유전적 이점의 잠재적 지속성에 부가하여, 이는 식물체가 초기에 보다 큰 크기를 가져야 하는 이유이다. 식물체의 크기 및 생장 속도에 대한 강력한 유전적 인자가 있으며 (예를 들면, ter Steege et al 2005 Plant Physiology 139:1078), 넓은 범위의 유전인자형에 대해 한 가지 환경조건 하에서의 식물체의 크기는 다른 조건 하에서의 크기와 연관되어 있을 것이다 (Hittalmani et al 2003 Theoretical Applied Genetics 107:679). 이와 같은 방식으로 표준환경이 다양한 시간 및 위치에서 밭작물이 접하는 다양하며 동적인 환경에 대한 대체물로서 사용 가능하다.
지상부 건조 중량에 대한 종자 수확량의 비율인 수확지수는 많은 환경 조건하에서 비교적 안정되어 있어, 식물 크기 및 곡물 수확량 간에 강한 상관관계가 얻어질 수 있다 (예를 들면, Rebetzke 등 (2002) Crop Science 42:739). 곡물 생물량의 대부분은 식물체의 잎 및 줄기에 의한 현재의 또는 저장된 광합성 생산성에 의존하므로 상기 과정들은 본질적으로 연결되어 있다 (Gardener 등 (1985) Physiology of Crops. Iowa State University Press, pp 68-73). 따라서, 발달 초기 단계에 식물체의 크기에 대한 선발은 미래의 잠재적인 수확량에 대한 지표로 사용되어 왔다 (예를 들면, Tittonell 등 (2005) Agric Ecosys & Environ 105: 213). 유전적 차이가 스트레스 내성에 미치는 영향을 점검 시, 토양 특성, 온도, 수분 및 양분 이용성 및 광 강도를 표준화하는 능력이 필드와 비교하여 온실 또는 식물 생장상(growth chamber) 환경의 본질적인 이점이다. 그러나, 바람 또는 곤충의 부재로 인한 빈약한 수분(pollination), 또는 뿌리 생장 또는 수관(canopy) 생장을 위한 불충분한 공간으로 인한 수확량의 인위적인 제한은 수확량 차이의 점검을 위한 상기 통제된 환경의 사용을 제한할 수 있다. 따라서, 생장상 또는 온실의 표준화된 조건하에서 발달 초기에 식물체의 크기를 측정하는 것이 잠재적인 유전적 수확량 이점을 표시하는 표준 방식이다.
중요한 또 다른 형질은 향상된 비생물적 스트레스 내성 형질이다. 비생물적 스트레스가 전세계적으로 작물 손실의 일차적인 원인이며, 대부분의 주요 작물에 대해 평균 수확량을 50% 이상 감소시켰다 (Wang 등, Planta (2003) 218: 1-14). 비생물적 스트레스는 가뭄, 염분, 극단적인 온도, 화학적 독성, 양분의 과다 또는 부족 (대량원소 및/또는 미량원소), 방사 및 산화적 스트레스에 의해 야기될 수 있다. 비생물적 스트레스에 대한 식물체의 내성을 증가시키는 것은 전세계적으로 농부에게 매우 큰 경제적 이점이 있으며, 불리한 조건에서 및 작물 재배가 불가능한 지역에서 작물 재배를 가능하게 한다.
작물 수확량은 따라서 상기 요인들 중 어느 하나를 최적화함으로써 증가시킬 수 있다.
최종 목적에 따라, 임의의 수확량 형질의 변형이 다른 것에 비해 월등히 유리할 수 있다. 사료 또는 목재 생산, 또는 바이오연료 자원과 같은 경우에 적용에 대해 예를 들면, 식물체의 영양기관 부분의 증가가 바람직하며, 곡분, 전분 또는 유지 생산과 같은 경우에는 종자에 관련된 매개변수의 증가가 특히 바람직하다. 종자 매개변수 중에서도 용도에 따라 특정한 일부의 것이 다른 것에 비해 훨씬 중요하다. 종자 크기의 증가 또는 종자 수의 증가의 형태로 다양한 기작이 종자 수확량 증가에 영향을 미칠 수 있다.
식물의 수확량 관련 형질 (예를 들면 수확량 증가, 특히 종자 수확량 및/또는 생물량(biomass))의 향상은 세포 주기 또는 식물 생장 또는 방어 기작에 관련된 다양한 신호전달 경로와 같은 식물의 내재적 생장 기작의 변형을 통해서 가능하다.
놀랍게도, 지금 2-Cys PRX(2- cysteine peroxiredoxin)를 암호화하는 핵산 서열을 식물체의 뿌리에서 발현을 조절, 바람직하게는 증가시키거나, 또는 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현을 식물체에서 조절함으로써, 다양한 식물 수확량 관련 형질이 대조구 식물에 비해 향상될 수 있다는 것이 밝혀졌다,
일 구현예에 따라, 2-Cys PRX(2- cysteine peroxiredoxin)를 암호화하는 핵산 서열을 식물체의 뿌리에서 발현을 조절, 바람직하게는 증가시키거나, 또는 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현을 식물체에서 조절함으로써, 대조구 식물에 비해 다양한 식물 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법이 제공된다.
I. 2- Cys PRX (2- cysteine peroxiredoxin )
티올 PRX (peroxidases)는 환원제로서 촉매성 시스테인 잔기 및 티올 함유 단백질에 의한 페록시아질산염(peroxynitrites) 및 다양한 과산화물의 환원을 촉매하는 편재하는 헴 부재 페록시다아제(heme-free peroxidases)이다. 식물에서는, 보 존된 촉매성 시스테인의 수 및 위치에 따라 5 종류로 구분될 수 있다. 페록시레독신(peroxiredoxins)으로 정의된 4 종류는 이미 계통유전학적 서열 분석에 의해 동정된 바 있는 1-Cys, 2-Cys, type II, 및 type Q 페록시레독신이고, 5 번째는 최근에 식물에서 티오레독신(thioredoxin) 의존성 활성을 갖는 것으로 알려진 글루타치온 페록시다아제(glutathione peroxidases)이다 (Rouhier & Jacquot (2005) Free Radic Biol Med 38(11): 1413-21). 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 게놈 분석은 적어도 티오레독신 의존성 페록시다아제의 17 가지의 이성질형(isoform)이 식물체의 다양한 부위에서 발현된다는 것을 나타낸다.
2-Cys PRX는 세포 증식, 분화, 아포토시스(apoptosis), 및 광합성에 관여하는 단백질 그룹이다. 상기 효소는 H2O2, 페록시아질산염 및 알킬 하이드로퍼록사이드를 전자 공여자로서 티오레독신(Trx)을 이용하여 물 또는 알코올로 각각 환원한다 (Netto 등, (1996) J Biol Chem 271 (26): 15315-15321). 상기 과정을 통해 2-Cys PRXs는 신호전달 경로를 조절하거나 산화적 손상에 대해 고분자를 보호한다. 상기 단백질은 동종이량체이며, 각 서브유닛은 2 개의 보존된 시스테인을 갖는다 (Choi 등, (1998) Nature Struct Biol 5:400-406). 과산화물은 한 서브유닛의 N-말단 시스테인을 설펜산(sulphenic acid)으로 산화하며, 상기 설펜산은 다른 서브유닛의 C-말단 시스테인과 반응하여 분자 내 이황화물을 형성한다. 촉매순환과정을 완성하기 위해 상기 효소는 티올/이황화물 산화환원 반응 교대(redox interchange)를 통해 환원된다 (Chae 등, (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 7017-7021).
2-Cys PRX의 수준이 감소된 형질전환 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 식물 (Baier 등 (2000) Plant Physiol 124(2): 823-32)이 안티센스 억제에 의해 생성되었다. 2-Cys PRX 발현의 억제가 다른 항산화 유전자의 발현을 증가시켰는데, 이는 상기 효소가 엽록체의 항산화 네트워크의 구성 요소를 이루며, 다른 방어계와 기능적으로 상호 연관되어 있다는 증거이다.
국제특허출원 WO05/116082는 구성적 콜리플라워 모자익 바이러스 35S 프로모터를 사용하여 아라비돕시스 2-Cys PRX (BAS1로 명명)를 과발현하는 형질전환 아라비돕시스 식물의 수득을 기재하고 있다. 상기 형질전환 식물은 야생형 식물에 비해 열 충격(heat shock) 및 병원균에 대해 잠재적인 저항성이 보다 높다고 기재하고 있다.
놀랍게도, 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 식물체 뿌리에서의 발현의 조절, 바람직하게는 증가로, 대조구 식물에 비해 수확량 관련 형질이 향상된 식물체로 된다는 것이 발견되었다.
일 구현예에 따라, 2-Cys PRX를 암호화하는 핵산 서열의 식물체 뿌리에서의 발현을 조절, 바람직하게는 증가시키는 단계를 포함하는 대조구 식물에 비해 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법이 제공된다. 상기 향상된 수확량 관련 형질은 하기 중 하나 이상을 포함한다: (i) 향상된 초기 활력; (ii) 증가된 지상부 생물량(biomass); (iii) 증가된 뿌리 (두꺼운 및 가는) 생물량(biomass); (iv) 원추화서당 증가된 꽃의 수; (v) 증가된 종자 충만율(fill rate); (vi) 식물체당 증가된 총 종자 수확량; (vii) 증가된 (충만된) 종자 수; (viii) 증가된 수확 지수; 또는 (ix) 증가된 천립당 중량 (TKW).
II . 애넥신 유사( ANN : Annexin - like )
애넥신은 칼슘 의존성 인지질 결합 단백질의 패밀리를 이루며, 식물 및 동물에서 발견된다. 조사된 모든 식물 종에서 적어도 2 개의 다른 애넥신이 존재함이 밝혀졌다. 구조적으로, 식물 애넥신이 동물 애넥신에 비해 덜 분지되어(divergent) 있다.
비교 연구에서는 식물 애넥신이 적어도 하나의, 보통 4 개 또는 그 이상의, 약 70 개의 아미노산으로 구성된, 보존된 반복서열을 포함하는 핵심 도메인에 있어서는 상당한 상동성을 공유하는 것으로 나타났다. 칼슘-결합 단백질로서, 애넥신은 칼슘 신호전달 경로에 역할을 하는 것으로 추정된다. 비록 애넥신의 구조는 오늘날 잘 알려져 있으나, 기능적으로 잘 밝혀져 있지 않다. 식물에서는, 애넥신이 골지체 매개된 분비, 세포 팽창, 액포 발생, 엽록체막 결합, 세포 주기, 근류착생 신호전달, 스트레스 신호전달에 관련된 것으로 보고된 바 있다.
US20050089872에는 아라비돕시스 탈리아나의 애넥신 1 및 애넥신 4 암호화 유전자 각각에 대한 T-DNA 삽입 돌연변이체 (anx1 및 anx4-1)가 기재되어 있다. 돌연변이체는 염 스트레스 및 삼투 스트레스에 민감하였다. 또한 앱시스산(abscisic acid)은 anx1 및 anx4-1 돌연변이체의 발아 및 생장에 음적인(negative) 효과를 갖는다. 발현 분석에서는 ANX1 단백질이 꽃, 줄기 또는 잎 조직에서는 아니나, 뿌리에서 우세하게 발현되는 것으로 나타났다. ANX1 및 ANX4 단백질이 삼투 스트레스 및 ABA 신호의 변환에 역할을 하는 것으로 추정된다.
놀랍게도, 이제 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현 조절로 대조구 식물에 비해 수확량 관련 형질이 향상된, 특히 수확량이 증가된 식물이 된다는 것이 발견되었다.
일 구현예에 따라, 식물에서 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현 조절을 포함하는, 대조구 식물에 비해 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법이 제공된다. 상기 향상된 수확량 관련 형질은 증가된 종자 수확량을 포함한다.
폴리펩티드(들)/단백질(들)
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본 발명에서 상호 교체 사용되며, 펩티드 결합으로 연결된 임의의 길이의 아미노산의 중합형을 말한다.
폴리뉴클레오티드(들)/핵산(들)/ 핵산서열 (들)/뉴클레오티드 서열(들)
용어 "폴리뉴클레오티드(들)", "핵산서열(들)", "뉴클레오티드 서열(들)", "핵산(들)", "핵산분자(들)"은 본 발명에서 상호 교체 사용되며, 임의의 길이의 미분지된 중합형인, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 양자의 조합인 뉴클레오티드를 말한다.
대조구 식물(들)
적절한 대조구 식물의 선택은 실험 셋업에서는 통상적인 부분이며, 해당 식물의 야생형 또는 목적 유전자가 없는 해당 식물을 포함할 수 있다. 대조구 식물은 전형적으로 평가되는 식물과 동일한 식물 종 또는 동일한 변종이다. 대조구 식물은 또한 평가되는 식물의 공접합자(nullizygote)일 수 있다. 본 발명에 사용된 "대조구 식물"은 전체 식물체뿐 아니라, 종자 및 종자의 일부분을 포함하여 식물체의 일부분도 의미하는 것으로 사용된다,
상동체 (들)
단백질의 "상동체"는 문제의 변형되지 않은 단백질에 대해 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 가지며, 이들이 유래되는 변형되지 않은 단백질과 유사한 생물학적 및 기능적 활성을 갖는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질 및 효소를 포함한다.
결실은 단백질로부터 하나 이상의 아미노산의 제거를 말한다.
삽입은 단백질 내의 예정된 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되는 것을 말한다. 삽입은 하나 또는 다수 아미노산의 서열 내 삽입뿐 아니라 N-말단 및/또는 C-말단 융합을 포함할 수 있다. 일반적으로 아미노산 서열 내 삽입은 N- 또는 C-말단 융합보다 작을 것이며, 약 1 내지 10 개 정도의 잔기이다. N- 또는 C-말단 융합 단백질 또는 펩티드의 예는 효모 two-hybrid 시스템에 사용된 전사 활성제의 결합 도메인 또는 활성화 도메인, 파아지 외피 단백질, (히스티딘)-6-태그, 글루타치온 S-전달효소-태그, 단백질 A, 말토스-결합 단백질, 디히드로폴레이트 환원효소, Tag·100 에피토프, c-myc 에피토프, FLAG
Figure 112009078358116-pct00001
-에피토프, lacZ, CMP (칼모둘린-결합 펩티드), HA 에피토프, 단백질 C 에피토프 및 VSV 에피토프를 포함한다.
치환은 유사한 성질 (유사한 소수성, 친수성, 항원성, 알파 나선 또는 베타 병풍 구조를 형성하거나 파괴하는 경향 같은)을 갖는 다른 아미노산으로 단백질의 아미노산의 치환을 말한다. 아미노산 치환은 전형적으로 한 잔기의 치환이나, 폴리펩티드에 부여된 기능적 제약에 따라 클러스터될 수도 있으며 삽입은 보통 약 1 내지 10 개 정도의 아미노산 잔기가 삽입된다. 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다. 보존적 치환 표는 당업계에 주지되어 있다 (예를 들면, Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company (Eds) 및 하기 표 1 참고).
표 1: 보존된 아미노산 치환의 예
잔기 보존적 치환 잔기 보존적 치환
Ala Ser Leu Ile; Val
Arg Lys Lys Arg; Gln
Asn Gln; His Met Leu; Ile
Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr
Gln Asn Ser Thr; Gly
Cys Ser Thr Ser; Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp; Phe
His Asn; Gln Val Ile; Leu
Ile Leu, Val
아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입은 고체상 펩티드 합성 등과 같은 당업계에 주지된 펩티드 합성 기술을 이용하거나 또는 재조합 DNA 조작에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 단백질의 치환, 삽입 또는 결실 변이체를 제조하기 위한 DNA 서열 조작 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들면, DNA 상의 예정된 위치에 치환 돌연변이를 제조하기 위한 기술은 당업자에게 주지되어 있으며, M13 돌연변이유발, T7-Gen 시험관 내 돌연변이유발 (USB, Cleveland, OH), QuickChange 자리지정 돌연변이유발 (Stratagene, San Diego, CA), PCR-매개된 자리지정 돌연변이유발 또는 다른 자리지정 돌연변이유발 프로토콜을 포함한다.
유도체
"유도체"는 목적 단백질과 같이 자연발생 형태의 단백질의 아미노산 서열에 비교하여, 자연적으로 발생하지 않는 아미노산 잔기로 아미노산의 치환 또는 자연적으로 발생하지 않는 아미노산 잔기의 첨가를 포함할 수 있는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드를 포함한다. 단백질의 "유도체"는 또한 자연발생 형인 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비교하여 자연적으로 발생하는 변형된 (글리코실화, 아실화, 프레닐화, 인산화, 미리스토일화, 황화 등) 또는 자연적으로 발생하지 않는 변형된 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드를 포함한다. 유도체는 또한 원래의 아미노산 서열에 비교하여 하나 이상의 비아미노산의 치환 또는 첨가를 포함할 수 있는데, 예를 들면, 이의 검출을 용이하게 하기 위해 결합되는 리포터 분자와 같은 아미노산 서열에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합한 리포터 분자나 다른 리간드, 및 자연적으로 발생하는 단백질의 아미노산 서열에 대해 비자연적으로 발생하는 아미노산 잔기이다.
오쏘로그 (들)/ 패럴로그 (들)
오쏘로그 및 패럴로그는 유전자의 조상관계를 기재하는데 사용되는 진화적 개념을 포함한다. 패럴로그는 조상 유전자의 복제로 생긴 동일한 종 내의 유전자이고 오쏘로그는 종분화로 인하여 공통 조상 유전자로부터 유래한 다른 생물체의 유전자이다.
도메인
용어 "도메인"은 진화적으로 연관된 단백질의 서열 정렬 시 특정 위치에서 보존된 아미노산의 세트이다. 다른 위치의 아미노산은 상동체들 간에 다양할 수 있는 반면, 특정 위치에서 고도로 보존된 아미노산은 단백질의 구조, 안정성 또는 기능에 필수적일 것인 아미노산을 나타낸다. 단백질 상동체 패밀리의 정렬된 서열상에서 고도로 보존된 부분은 임의의 문제되는 폴리펩티드가 이전에 동정된 폴리펩티드 패밀리에 속하는지를 결정하는 동정부위로 사용될 수 있다.
모티프/일치 서열/시그너처( signature )
용어 "모티프", "일치 서열" 또는 "시그너처"는 진화적으로 연관된 단백질의 서열에 있어 짧은 보존된 영역을 말한다. 모티프는 흔히 도메인의 고도로 보존된 부분뿐만 아니라, 도메인의 일부만을 포함할 수도 있거나 또는 보존된 도메인 외부에 있을 수도 있다 (만일 모티프의 아미노산 모두가 지정된 도메인 외부에 있으면).
혼성화
본 발명에 정의된 용어 "혼성화"는 사실상 상동인 상보적인 뉴클레오티드 서열이 서로 어닐링하는 과정이다. 혼성화 과정은 전적으로 용액 내에서, 즉 상보적인 두 가지 핵산 분자가 용액 내에 있을 때 일어날 수 있다. 혼성화 과정은 또한 상보적인 핵산 분자의 하나가 자성 비드, Sepharose 비드 또는 어떤 다른 수지(resin) 같은 기질에 고정되었을 때도 일어날 수 있다. 혼성화 과정은 더욱이 상보적인 핵산 분자 중의 하나가 니트로셀룰로스 또는 나일론 막 같은 고체 지지체에 고정되었거나 또는 사진석판술에 의하여 규산질의 유리 지지체 (핵산 어레이, 마이크로어레이 또는 핵산 칩이라 알려짐)에 고정되었을 때에도 일어날 수 있다. 혼성화가 일어나게 하기 위하여, 핵산분자는 일반적으로 열적으로 또는 화학적으로 변성되어 이중 가닥을 2개의 단일 가닥으로 녹이고/녹이거나 단일가닥 핵산 분자로부터 헤어핀 또는 기타 이차 구조를 제거한다.
용어 "스트린전시"는 혼성화가 일어나는 조건을 말한다. 혼성화의 스트린전시는 온도, 염 농도, 이온 강도 및 혼성화 완충액 조성 같은 조건의 영향을 받는다. 일반적으로 낮은 스트린전시 조건은 정해진 이온강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 용해점 2-Cys PRXnt (Tm) 보다 약 30℃ 낮은 온도가 선택된다. 중간 스트린전시 조건은 Tm 보다 20℃ 낮은 온도일 때, 높은 스트린전시 조건은 Tm 보다 10℃ 낮은 온도이다. 높은 스트린전시 혼성화 조건은 전형적으로 표적 핵산 서열에 높은 서열 유사성을 갖는 혼성화 서열을 분리하기 위해 사용된다. 그러나, 핵산은 서열 상의 차이가 있더라도 유전암호의 축퇴로 인하여 실제로는 동일한 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 그러므로, 중간 스트린전시 혼성화 조건은 종종 상기 핵산분자를 동정하는데 필요할 수 있다.
Tm은 정해진 이온 강도 및 pH 하에서 표적 서열의 50%가 완벽하게 매치된 탐침에 혼성화하는 온도이다. Tm은 용액 조건, 염기 조성 및 탐침의 길이에 의존적이다. 예를 들면, 보다 긴 서열일수록 보다 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 최대 혼성화율은 Tm보다 약 16℃에서 32℃까지 낮을 때 얻어진다. 1가 양이온이 혼성액에 있으면 두 핵산 가닥 간에 정전기적 반발이 감소하여 혼성화가 촉진되고 이 효과는 0.4M (보다 높은 농도에서는 이 효과가 무시될 수 있다)까지의 나트륨 농도에서 보여진다. 포름아미드는 DNA-DNA 및 DNA-RNA 이중가닥의 용해 온도를 포름아미드 퍼센트 당 0.6 내지 0.7℃ 내리며, 50% 포름아미드의 첨가는 혼성화율은 낮아지더라도 혼성화가 30 내지 45℃에서 일어나게 한다. 염기쌍 미스매치는 혼성화율 및 이중가닥의 온도 안정성을 감소시킨다. 평균적으로 그리고 큰 탐침에 대하여, Tm은 염기 미스매치 % 당 약 1℃ 감소한다. Tm은 혼성체의 유형에 따라 하기의 식으로 계산할 수 있다:
1) DNA-DNA 혼성체 (Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):
Tm=81.5℃+16.6xlog10[Na+]a+0.41x%[G/Cb]-500x[Lc]-1 -0.61x%포름아미드
2) DNA-RNA 또는 RNA-RNA 혼성체:
Tm= 79.8 + 18.5(log10[Na+]a)+0.58(%G/Cb)+11.8(%G/Cb)2-820/Lc
3) 올리고-DNA 또는 올리고-RNAd 혼성체:
20개 뉴클레오티드 미만에 대해: Tm=2(In)
20-35개 뉴클레오티드에 대해: Tm=22+1.46(In)
a 또는 다른 1가 양이온에 대하여, 0.01-0.4 M 범위 내에서만 정확.
b 30% 내지 75% 범위 내에서 %GC에 대하여만 정확.
c L = bp으로 표시된 이중가닥의 길이.
d 올리고, 올리고뉴클레오티드; In,= 효과적인 프라이머 길이 = 2x(G/C의 수)+(A/T의 수).
비특이적 결합은 예를 들면, 단백질 함유 용액으로 막을 차단하고, 혼성화 완충액에 이종의 RNA, DNA, 및 SDS를 첨가하고, RNAse 처리하는 것과 같은 많은 알려진 기술 중 임의의 하나를 사용하여 조절할 수 있다. 비상동 탐침에 대하여, 일련의 혼성화 과정은 (i) 점차적으로 어닐링 온도를 낮추거나 (예를 들면 68℃에서 42℃까지) (ii) 점차적으로 포름아미드 농도를 낮추거나 (예를 들면 50%에서 0%까지) 중 하나를 변화시킴으로써 수행될 수 있다. 당업자는 혼성화 중에 변할 수 있는, 그리고 스트린전시 조건을 유지하거나 바꾸는 다양한 매개변수를 인식하고 있다.
혼성화 조건 외에, 혼성화의 특이성은 또한 전형적으로 혼성화 후 세척 기능에 의존한다. 비 특이적 혼성화로 생기는 백그라운드를 제거하기 위하여, 시료를 묽은 염 용액으로 세척한다. 이런 세척의 결정적인 요인은 최종 세척액의 이온 강도 및 온도를 포함한다: 염 농도가 낮고 세척 온도가 높을수록 세척의 스트린전시는 높아진다. 세척 조건은 전형적으로 혼성화 스트린전시에서 또는 보다 낮게 수행된다. 양성 혼성화는 적어도 백그라운드의 2 배의 신호로 나타난다. 일반적으로 핵산 혼성화 분석이나 유전자 증폭 검출 과정에 적절한 스트린전트 조건은 상기와 같다. 다소 스트린전트한 조건 또한 선택될 수 있다. 당업자는 세척 중에 변할 수 있는, 그리고 스트린전시 조건을 유지하거나 바꾸는 다양한 매개변수를 인식하고 있다.
예를 들면, 50 뉴클레오티드보다 긴 DNA 혼성체에 대한 전형적인 높은 스트린전시 혼성화 조건은 65℃, 1x SSC에서 또는 42℃, 1x SSC 및 50% 포름아미드에서 혼성화 후 65℃, 0.3x SSC에서 세척하는 것이다. 50 뉴클레오티드보다 긴 DNA 혼성체에 대한 중간 스트린전시 혼성화 조건은 50℃, 4x SSC 또는 40℃, 6x SSC 및 50% 포름아미드에서 혼성화 후, 50℃, 2x SSC에서 세척하는 것이다. 혼성체의 길이는 혼성화하는 핵산 분자에 대해 예측된 길이이다. 알려진 서열의 핵산 분자가 혼성화 될 때 혼성체의 길이는 서열을 정렬하고 본 발명에서 기재된 보존된 영역을 동정하면 결정될 수 있다. 1X SSC는 0.15M NaCl 및 15mM 소듐 시트레이트이며 혼성액 및 세척액에는 부가적으로 5x Denhardt's reagent, 0.5-1.0% SDS, 100 ㎍/ml 변성된, 단편화된 연어 정자 DNA, 0.5% 소듐 피로포스페이트가 포함된다.
스트린전시 수준을 결정하기 위해서는 [SambrOoka 등 (2001) Molecular Cloning: laboratory manual, 3rdEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York or to Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989, 매년 개정됨)]을 참조하면 된다.
스플라이스 변이체
본 발명에서 사용된 용어 "스플라이스 변이체"는 선정된 인트론 및/또는 엑손이 절단되거나, 치환되거나, 대체되거나, 부가된, 또는 인트론이 짧아지거나 길어진 핵산 서열의 변이체를 포함한다. 상기 변이체는 단백질의 생물학적 활성이 사실상 보유되며 이는 단백질의 기능적 단편을 선택적으로 보유함으로써 달성될 수 있다. 상기 스플라이스 변이체는 자연계에서 발견되거나 인공적으로 만들 수도 있다. 상기 스플라이스 변이체를 예측하고 분리하는 방법은 당업계에 주지되어 있다 (예를 들면 Foissac and Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25 참고).
대립인자 변이체
대립인자 또는 대립인자 변이체는 동일한 염색체 상에 위치한 해당 유전자의 또 다른 형태이다. 대립인자 변이체는 작은 삽입/결실다형성 (Insertion/Deletion Polymorphisms, INDELs)뿐 아니라 단일염기다형성 (SNPs)을 포함한다. INDELs의 크기는 보통 100 bp 미만이다. SNPs 및 INDELs이 대부분의 생물체의 자연적으로 발생하는 다형 균주에 있어 가장 큰 서열 변이체를 형성한다.
유전자 셔플링 ( shuffling )/방향진화( directed evolution )
유전자 셔플링 또는 방향진화는 DNA 셔플링의 반복에 이은 변형된 생물학적 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산 서열이나 이의 부분의 변이체 생성을 위해 적절한 탐색 및/또는 선발로 구성된다 (Castle 등, (2004) Science 304(5674): 1151-4; 미국 특허 제5,811,238호 및 제6,395,547호).
조절 인자/조절 서열/프로모터
용어 "조절 인자", "조절 서열" 및 "프로모터"는 본 발명에서 상호 호환적으로 사용되며, 결합되는 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 핵산 서열을 말하는 것으로 사용된다. 용어 "프로모터"는 전형적으로 유전자의 전사개시점의 업스트림에 있으며, RNA 중합효소 및 다른 단백질의 인지 및 결합에 관여하여 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 지시하는 핵산 조절 서열을 말한다. 상기 언급한 용어에는 전형적인 진핵세포 게놈 유전자 (CCAAT 박스 서열이 있거나 없이 정확한 전사 개시에 필요한 TATA 박스를 포함) 및 발달 및/또는 외부 자극에 반응하여 또는 조직 특이적 방식으로 유전자 발현을 변경하는 부가적인 조절 인자 (즉, 업스트림 활성화 서열, 인핸서 및 사일런서)로부터 유래한 전사 조절 서열이 포함된다. 또한 상기 용어에는 -35 박스 서열 및/또는 -10 박스 전사 조절 서열을 포함하는 전형적인 원핵생물 유전자의 전사 조절 서열이 포함된다. 용어 "조절인자"는 또한 세포, 조직 또는 기관에 핵산분자의 발현을 하게 하거나 활성화 또는 증가시키는 합성 융합 분자 또는 유도체를 포함한다.
"식물 프로모터"는 식물 세포에 암호화 서열 단편의 발현을 중재하는 조절 인자를 포함한다. 따라서, 식물 프로모터는 식물에서 유래해야 하는 것은 아니며, 예를 들면 식물 세포에 침범하는 바이러스 또는 미생물 기원일 수도 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포, 예를 들면, 본 발명의 방법에서 발현되며, 본 발명에 기재된 핵산 서열로 형질전환된 식물 기원일 수 있다. 이는 또한 "식물" 종결신호 같은 "식물" 조절 신호에도 해당된다. 본 발명의 방법에 유용한 뉴클레오티드 서열의 프로모터 업스트림은 프로모터, 개방형해독틀 (ORF) 또는 종결신호 또는 ORF로부터 떨어져 있는 다른 3' 조절 영역 같은 3'-조절 영역의 기능성 또는 활성을 방해하지 않고 하나 이상의 뉴클레오티드 치환(들), 삽입(들) 및/또는 결실(들)에 의하여 변형될 수 있다. 더욱이 서열의 변형에 의하여 프로모터 활성은 증가될 수 있거나, 또는 보다 활성이 큰 프로모터, 심지어 이종 생물체의 프로모터로 완전히 대체되는 것도 가능하다. 식물체에서의 발현을 위해서는 상기 언급된 것처럼 핵산 서열은 올바른 순간에 요구되는 공간적 발현 양상으로 유전자를 발현하는 적절한 프로모터에 작동가능하게 연결되거나 프로모터를 포함해야 한다.
기능적으로 동등한 프로모터 동정을 위해, 후보 프로모터의 프로모터 강도 및/또는 발현 양상은 예를 들면, 리포터 유전자에 프로모터를 작동하게 연결하여 다양한 식물 조직에서 리포터 유전자의 발현 수준 및 양상을 검정함으로써 분석할 수 있다. 적절한 주지된 리포터 유전자는 예를 들면 베타-글루쿠로니다제 또는 베타-갈락토시다제를 포함한다. 프로모터 활성은 베타-글루쿠로니다제 또는 베타-갈락토시다제의 효소 활성을 측정함으로써 검정된다. 프로모터 강도 및/또는 발현 양상은 기준 프로모터의 것에 비교된다 (본 발명의 방법에 사용된 것과 같은 것). 다르게는, 프로모터 강도는 방사선 사진의 농도계 분석을 이용한 노던 블럿, 정량적 실시간 PCR 또는 RT-PCR 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여, mRNA 수준을 정량화하거나 본 발명의 방법에 사용된 핵산 서열의 mRNA 수준과 18S rRNA 같은 housekeeping 유전자의 mRNA 수준을 비교함으로써 분석될 수 있다 (Heid 등, 1996 Genome Methods 6: 986-994). 일반적으로 "약한 프로모터"는 암호화 서열의 발현을 낮은 수준으로 이끄는 것이다. "낮은 수준"은 세포당 약 1/10,000 전사체 내지 약 1/100,000 전사체, 약 1/500,0000 전사체까지의 수준을 말한다. 역으로, "강력한 프로모터" 는 암호화 서열의 발현을 높은 수준으로 또는 세포당 약 1/10 전사체 내지 약 1/100 전사체 내지 약 1/1000 전사체로 이끄는 것이다.
작동가능하게 연결된
본 발명에서 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 프로모터 서열과 해당 유전자 간의 기능적 연관을 말하는 것으로, 그럼으로써 프로모터 서열이 해당 유전자의 전사를 개시할 수 있다.
구성적 프로모터
"구성적 프로모터"는 반드시 항상은 아니더라도 생장 및 발달의 대부분 기간 중에 그리고 대부분의 환경적 조건 하에서 적어도 하나의 세포, 조직 또는 기관에서 전사적으로 활성인 프로모터를 말한다. 하기 표 2a가 구성적 프로모터의 예이다.
표 2a: 구성적 프로모터의 예
유전자 출처 참고문헌
액틴 McElroy 등, Plant Cell, 2: 163-171, 1990
HMGP WO 2004/070039
CAMV 35S Odell 등, Nature, 313: 810-812, 1985
CaMV 19S Nilsson 등, Physiol. Plant. 100:456-462, 1997
GOS2 de Pater 등, Plant J Nov;2(6):837-44, 1992, WO 2004/065596
유비퀴틴 Christensen 등, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992
벼 사이클로필린 Buchholz 등, Plant Mol Biol. 25(5): 837-43, 1994
옥수수 H3 히스톤 Lepetit 등, Mol. Gen. Genet. 231:276-285, 1992
알팔파 H3 히스톤 Wu 등 Plant Mol. Biol. 11:641-649, 1988
액틴 2 An 등, Plant J. 10(1); 107-121, 1996
34S FMV Sanger 등, Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443
Rubisco small subunit US 4,962,028
OCS Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553
SAD1 Jain 등, Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
SAD2 Jain 등, Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
nos Shaw 등 (1984) Nucleic Acids Res. 12(20):7831-7846
V-ATPase WO 01/14572
Super 프로모터 WO 95/14098
G-box 단백질 WO 94/12015
편재하는 프로모터
편재하는 프로모터는 생물체의 사실상 모든 조직이나 세포에서 활성을 갖는 것이다.
발달적으로 조절된 프로모터
발달적으로 조절된 프로모터는 특정 발달 단계 중에 또는 발달적 변화가 일어나는 식물체의 부위에서 활성을 갖는 것이다.
유도성 프로모터
유도성 프로모터는 화학적 (Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108), 환경적 또는 물리적 자극에 반응하여 전사 개시가 유도되거나 증가되거나 또는 식물이 다양한 스트레스 환경에 노출될 때 "스트레스 유도성", 즉 활성화될 수 있거나 또는, 식물이 다양한 병원균에 노출될 때 "병원균 유도성", 즉 활성화될 수 있다.
기관 특이적/조직 특이적 프로모터
기관 특이적 또는 조직 특이적 프로모터는 잎, 뿌리, 종자조직 등과 같이 특정 기관 또는 조직에서 우선적으로 발현 개시가 가능한 것이다. 예를 들면, "뿌리 특이적 프로모터"는 식물의 다른 부위에 약간 누설된(leaky) 발현을 허용하지만, 사실상 식물의 다른 부위를 제외하고 식물 뿌리에서 우세하게 전사적으로 활성이 있는 프로모터이다. 특정 세포에서만 전사를 개시할 수 있는 프로모터는 본 발명에서 "세포 특이적"이라 한다.
뿌리 특이적 프로모터의 예는 하기 표 2b에 열거된다:
표 2b: 뿌리 특이적 프로모터의 예
유전자 출처 참고문헌
Rice RCc3 Xu et al (1995) Plant Mol Biol 27(2): 237-48
Arabidopsis phosphate transporter PHT1 Kovama et al ., 2005
Medicago phosphate transporter Xiao et al ., 2006
Arabidopsis Pyk10 Nitz et al . (2001) Plant Sci 161(2): 337-346
Tobacco root-specific genes RB7, RD2, RD5, RH12 Conkling et al . (1990) Plant Phys 93(3): 1203-1211
Barley root-specific lectin Lerner & Raikhel (1989) Plant Phys 91: 124-129
Root-specific hydroxy-proline rich protein Keller & Lamb (1989) Genes & Dev 3:1639-1646
Arabidopsis CDC27B/hobbit Blilou et al. (2002) Genes & Dev 16:2566-2575
종자 특이적 프로모터는 종자 조직에서만 반드시 배타적으로는 아니지만 (누설 발현의 경우) 종자조직에서 우세하게 전사적으로 활성인 것이다. 종자 특이적 프로모터는 종자발달 및/또는 발아 중에 활성일 것이다. 종자 특이적 프로모터는 배유, 호분층, 또는 배 중 하나 이상에 특이적일 수 있다. 종자 특이적 프로모터의 예는 하기 표 2c, 2d, 2e, 2f에 제시된다. 종자 특이적 프로모터의 추가적인 예는 Qing Qu 및 Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 1 13-125, 2004)에 제시되며, 이의 개시는 충분히 설명한 것처럼 본 발명에 원용에 의해 포함된다.
표 2c: 종자 특이적 프로모터의 예
유전자 출처 참고문헌
seed-specific genes Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.;
Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.
Brazil Nut albumin Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235-245, 1992.
Legumin Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988.
glutelin (rice) Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986;
Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987.
Zein Matzke et al Plant Mol Biol, 14(3):323-32 1990
NapA Stalberg et al, Planta 199: 515-519, 1996.
wheat LMW and HMW glutenin-1 Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2, 1989
wheat SPA Albani et al, Plant Cell, 9: 171-184, 1997
wheat α,β,γ-gliadins EMBO J. 3:1409-15, 1984
barley Itr1 promoter Diaz et al. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592-8
barley B1, C, D, hordein Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999;
Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996
barley DOF Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998
blz2 EP99106056.7
Synthetic promoter Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998.
rice prolamin NRP33 Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998
rice a-globulin Glb-1 Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998
rice OSH1 Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996
rice a-globulin REB/OHP-1 Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997
rice ADP-glucose pyrophos-phorylase Trans Res 6:157-68, 1997
maize ESR gene family Plant J 12:235-46, 1997
Sorghum α-kafirin DeRose et al., Plant Mol. Biol 32:1029-35, 1996
KNOX Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999
rice oleosin Wu et al, J. Biochem. 123:386, 1998
sunflower oleosin Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992
PRO0117, putative rice 40S ribosomal protein WO 2004/070039
PRO0136, rice alanine aminotransferase 미공개
PRO0147, trypsin inhibitor ITR1 (barley) 미공개
PRO0151, rice WSI18 WO 2004/070039
PRO0175, rice RAB21 WO 2004/070039
PRO005 WO 2004/070039
PRO0095 WO 2004/070039
α-amylase (Amy32b) Lanahan et al, Plant Cell 4:203-211, 1992;
Skriver et al, Proc Natl Acad Sci USA 88:7266-7270, 1991
cathepsin β-like gene Cejudo et al, Plant Mol Biol 20:849-856, 1992
Barley Ltp2 Kalla et al., Plant J. 6:849-60, 1994
Chi26 Leah et al., Plant J. 4:579-89, 1994
Maize B-Peru Selinger et al., Genetics 149;1125-38,1998
표 2d: 배유 특이적 프로모터의 예
유전자 출처 참고문헌
glutelin (rice) Takaiwa et al. (1986) Mol Gen Genet 208:15-22;
Takaiwa et al. (1987) FEBS Letts. 221:43-47
Zein Matzke et al., (1990) Plant Mol Biol 14(3): 323-32
wheat LMW and HMW glutenin-1 Colot et al. (1989) Mol Gen Genet 216:81-90;
Anderson et al. (1989) NAR 17:461-2
wheat SPA Albani et al. (1997) Plant Cell 9:171-184
wheat gliadins Rafalski et al. (1984) EMBO 3:1409-15
barley Itr1 promoter Diaz et al. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592-8
barley B1, C, D, hordein Cho et al. (1999) Theor Appl Genet 98:1253-62;
Muller et al. (1993) Plant J 4:343-55;
Sorenson et al. (1996) Mol Gen Genet 250:750-60
barley DOF Mena et al, (1998) Plant J 116(1): 53-62
blz2 Onate et al. (1999) J Biol Chem 274(14):9175-82
synthetic promoter Vicente-Carbajosa et al. (1998) Plant J 13:629-640
rice prolamin NRP33 Wu et al, (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885-889
rice globulin Glb-1 Wu et al. (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885-889
rice globulin REB/OHP-1 Nakase et al. (1997) Plant Molec Biol 33: 513-522
rice ADP-glucose pyrophosphorylase Russell et al. (1997) Trans Res 6:157-68
maize ESR gene family Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J 12:235-46
Sorghum kafirin DeRose et al. (1996) Plant Mol Biol 32:1029-35
표 2e: 배(embryo) 특이적 프로모터의 예
유전자 출처 참고문헌
KNOX Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999
PRO0151 WO 2004/070039
PRO0175 WO 2004/070039
PRO005 WO 2004/070039
PRO0095 WO 2004/070039
표 2f: 호분층 특이적 프로모터의 예
유전자 출처 참고문헌
α-amylase (Amy32b) Lanahan et al, Plant Cell 4:203-211, 1992;
Skriver et al, Proc Natl Acad Sci USA 88:7266-7270, 1991
cathepsin β-like gene Cejudo et al, Plant Mol Biol 20:849-856, 1992
Barley Ltp2 Kalla et al., Plant J. 6:849-60, 1994
Chi26 Leah et al., Plant J. 4:579-89, 1994
Maize B-Peru Selinger et al., Genetics 149;1125-38,1998
본 발명에서 정의된 녹색 조직 특이적 프로모터는 식물의 다른 부위에 약간 누설된 발현을 허용하지만, 식물의 다른 부위를 제외하고 실질적으로 녹색 조직에서 우세하게 전사적으로 활성이 있는 프로모터이다.
본 발명의 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 녹색 조직 특이적 프로모터의 예는 하기의 표 2g에 있다.
표 2g: 녹색 조직 특이적 프로모터의 예
유전자 출처 발현 참고문헌
Maize Orthophosphate dikinase 잎 특이적 Fukavama et al., 2001
Maize Phosphoenolpyruvate carboxylase 잎 특이적 Kausch et al., 2001
Rice Phosphoenolpyruvate carboxylase 잎 특이적 Liu et al., 2003
Rice small subunit Rubisco 잎 특이적 Nomura et al., 2000
rice beta expansin EXBP9 어린줄기 특이적 WO 2004/070039
Pigeonpea small subunit Rubisco 잎 특이적 Panguluri et al., 2005
Pea RBCS3A 잎 특이적
조직 특이적 프로모터의 다른 예는 식물의 다른 부위에 약간 누설된 발현을 허용하지만, 식물의 다른 부위를 제외하고 실질적으로 분열조직에서 우세하게 전사적으로 활성이 있는 분열조직 특이적 프로모터이다. 본 발명의 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 녹색 분열조직 특이적 프로모터의 예는 하기의 표 2h에 있다.
표 2h: 분열조직 특이적 프로모터의 예
유전자 출처 발현 양상 참고문헌
rice OSH1 어린줄기 정단분열조직, 배의 구형 단계(embryo globular stage)에서 실생단계(seedling stage)까지 Sato et al . (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122
Rice metallothionein 분열조직 특이적 BAD87835.1
WAK1 & WAK 2 어린줄기 및 뿌리 정단분열조직, 및 팽창하는 잎 및 악편에서 Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303-318
종결신호(terminator)
용어 "종결신호"는 일차 전사체의 3' 프로세싱 및 폴리아데닐화와 전사 종결의 신호가 되는 전사 단위의 말단에 있는 DNA 서열인 조절 서열이다. 종결신호는 자연 유전자, 다양한 다른 식물 유전자, 또는 T-DNA로부터 유래될 수 있다. 첨가된 종결신호는 예를 들면, 노팔린 신타아제 또는 옥토파인 신타아제 유전자, 또는 또 다른 식물 유전자, 또는 덜 바람직하게는 임의의 다른 진핵세포 유전자로부터 유래된다.
조절( modulation )
용어 "조절"은 발현 또는 유전자 발현에 관한 것으로, 대조구 식물에 비하여 발현 수준이 상기 유전자 발현에 의하여 변화되는, 바람직하게는 발현 수준이 증가되는 과정이다. 원래의 조절되지 않은 발현은 구조 RNA (rRNA, tRNA) 또는 연이어 해독되는 mRNA 같이 임의의 종류의 발현일 수 있다. 용어 "활성 조절"은 식물의 증가된 수확량 관련 형질(예를 들면, 증가된 수확량 및/또는 증가된 생장)로 이끄는, 본 발명의 핵산 서열 또는 암호화된 단백질의 발현의 임의의 변화를 의미한다.
증가된 발현/과발현
본 발명에 사용된 용어 "증가된 발현" 또는 "과발현"은 원래의 야생형 발현 수준에 부가적인 임의의 형태의 발현을 의미한다.
유전자 또는 유전자 산물의 발현을 증가시키는 방법은 당업계에 잘 문헌화 되어 있으며, 예를 들면, 적절한 프로모터에 의한 과발현, 전사 인핸서 또는 해독 인핸서의 사용을 포함한다. 프로모터 또는 인핸서 인자로 작용하는 분리된 핵산 서열은 비이질성 형태의 폴리뉴클레오티드의 적절한 위치 (전형적으로 업스트림)에 도입되어 해당 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 상향 조절한다. 예를 들면, 내재적 프로모터는 돌연변이, 결실, 및/또는 치환에 의해 생체 내에서 변할 수 있거나 (Kmiec, US 5,565,350; Zarling 등, WO9322443), 또는 분리된 프로모터는 본 발명의 유전자로부터 적절한 거리와 방향으로 식물 세포 내에 도입될 수 있어 해당 유전자의 발현을 조절한다.
폴리펩티드 발현을 원한다면, 일반적으로 폴리뉴클레오티드 암호화 영역의 3'-말단에 폴리아데닐화 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 폴리아데닐화 영역은 자연 유전자, 다양한 다른 식물 유전자, 또는 T-DNA로부터 유래할 수 있다. 부가된 3' 말단 서열은 예를 들면, 노팔린 신타아제 또는 옥토파인 신타아제 유전자, 또는 또 다른 식물 유전자, 또는 덜 바람직하게는 임의의 다른 진핵세포 유전자로부터 유래된다.
세포질 내에 축적되는 성숙된 메세지 양의 증가를 위하여 인트론 서열이 또한 부분적인 암호화 서열의 5' 비해독 영역 (UTR) 또는 암호화 서열에 첨가될 수 있다. 식물 및 동물 발현 구축물에 있어 전사 단위 내에 스플라이스 가능한 인트론이 포함되면 mRNA 및 단백질 수준에서 유전자 발현이 1000 배까지 증가함이 보였다 (Buchman and Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis 등 (1987) Genes Dev 1:1183-1200). 인트론에 의한 유전자 발현의 상승효과는 전형적으로 전사 단위의 5' 말단 가까이에 위치하였을 때 가장 컸다. 옥수수 인트론 Adh1-S 인트론 1, 2, 및 6, Bronze-1 인트론의 사용은 당업계에 주지되어 있다. 전반적인 정보는 하기를 참고한다: Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).
내재적 유전자
본 발명에서 "내재적" 유전자는 자연적 형태 (즉, 임의의 인간의 개입이 없는)로 식물에서 발견되는 것으로서 문제의 유전자뿐 아니라, 분리된 형태로 연이어 식물체에 (재)도입된 (트랜스진) 동일한 유전자 (사실상 상동인 핵산/유전자)를 말한다. 예를 들면, 상기 트랜스진을 갖는 형질전환 식물체에서는 트랜스진 발현의 실질적인 감소 및/또는 내재적 유전자 발현의 실질적인 감소가 있을 수 있다. 분리된 유전자는 생물체로부터 분리되거나, 또는 예를 들면 화학적 합성에 의하여 인위적으로 만들 수도 있다.
감소된 발현
본 발명에서 "감소된 발현" 또는 발현의 "감소 또는 실질적인 제거"는 대조구에 비하여 내재적 유전자 발현 및/또는 폴리펩티드 수준 및/또는 폴리펩티드 활성의 감소를 의미한다. 감소 또는 실질적인 제거는 대조구 식물에 비하여 증가하는 순으로 선호되는 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 감소된 것이다.
식물체에 내재적 유전자의 발현의 감소 또는 실질적인 제거를 위해서는 충분한 길이의 핵산 서열의 상당히 연속적인 뉴클레오티드가 필요하다. 유전자 침묵을 수행하기 위한 뉴클레오티드는 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 개 또는 더 소수의 뉴클레오티드만큼 적을 수도 있고, 전체 유전자 (5' 및/또는 3' UTR을 포함하여, 일부분 또는 전체)만큼 많을 수도 있다. 상당한 길이의 연속적인 뉴클레오티드는 관심 있는 단백질을 암호화하는 핵산 서열 (표적 유전자)로부터, 또는 관심 있는 단백질의 오쏘로그(orthologue), 패럴로그(paralogue) 또는 상동체(homologue)를 암호화하는 것이 가능한 임의의 핵산 서열로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 상당한 길이의 연속적인 뉴클레오티드는 표적 유전자 (센스 또는 안티센스 가닥)와 수소결합을 형성할 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 상당한 길이의 연속적인 뉴클레오티드는 표적 유전자 (센스 또는 안티센스 가닥)에 증가하는 순으로 선호되는, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 동일한 서열을 갖는다. (기능성) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 내재적 유전자의 발현의 감소 또는 실질적인 제거를 위해 본 발명에서 논의된 다양한 방법에 대한 필요조건은 아니다.
상기 발현의 감소 또는 실질적인 제거는 일상적인 수단 및 기술을 사용하여 이룰 수 있다. 내재적 유전자의 발현의 감소 또는 실질적인 제거를 위한 방법은 핵산 서열 또는 그 일부를 (이 경우, 관심 있는 유전자 유래의, 또는 관심 있는 단백질의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 암호화하는 것이 가능한 임의의 핵산 서열 유래의 상당한 길이의 연속적인 뉴클레오티드), 바람직하게는 헤어핀 구조를 형성하는 것이 가능한 역반복(inverted repeat) 서열을 사용한 RNA 매개된 침묵에 의한다. RNA 침묵 방법의 또 다른 예는 핵산 서열 또는 그 일부 (이 경우, 관심 있는 유전자 유래의, 또는 관심 있는 단백질의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 암호화하는 것이 가능한 임의의 핵산 서열 유래의 상당한 길이의 연속적인 뉴클레오티드)를 센스 방향으로 식물체로의 도입을 포함한다.
RNA 침묵 방법의 또 다른 예는 안티센스 핵산 서열의 사용을 포함한다. 유전자 침묵은 또한 삽입 돌연변이유발 (예를 들면, T-DNA 삽입 또는 트랜스포손 삽입)에 의해, 또는 Angell 및 Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357-62), (Amplicon VIGS WO 98/36083), 또는 Baulcombe (WO 99/15682)에 이의해 기재된 것과 같은 전략에 의해서도 수행 가능하다. 식물체에서 그 기능을 저해하기 위한 내재적 폴리펩티드에 대한 항체 사용, 또는 해당 폴리펩티드가 관련된 신호전달 경로의 방해와 같은 다른 방법도 당업자에게는 잘 알려져 있다. 인위적인 및/또는 자연적인 microRNAs (miRNAs)가 유전자 발현 및/또는 mRNA 해독의 녹아웃(knock out)에 사용될 수 있다. 내재적 miRNAs는 전형적으로 19-24 뉴클레오티드 길이의 단일가닥의 작은 RNAs이다. 전형적으로 21 뉴클레오티드 길이인 인위적인 microRNAs (amiRNAs)는, 특히 관심 있는 하나 또는 다수 유전자의 유전자 발현을 음성적으로 조절하기 위해 유전적으로 변형될 수 있다. 식물 microRNA의 표적을 선발하는 결정요소는 당업계에 잘 알려져 있다. 표적을 인지하기 위한 경험적 매개변수는 정의되어 있으며, 특정 amiRNAs을 디자인하는데 도움이 되게 사용될 수 있다 (Schwab 등, (2005) Dev Cell 8(4):517-27). amiRNAs 및 이의 전구체의 디자인 및 생성을 위한 편리한 수단 또한 공지되어 있다 (Schwab 등, (2006) Plant Cell 18(5):1 121-33).
최적의 수행을 위해, 내재적 유전자의 식물에서의 발현을 감소시키는 유전자 침묵 기술에서 단자엽 식물의 형질전환을 위해서는 단자엽 식물의 핵산 서열을, 쌍자엽 식물의 형질전환을 위해서는 쌍자엽 식물의 핵산 서열을 사용할 것이 요구된다. 바람직하게는, 임의의 해당 식물 종의 핵산 서열이 동일 생물종에 도입된다. 예를 들면, 벼 유래의 핵산 서열은 벼 식물로 형질전환된다. 그러나, 도입될 핵산 서열이 동일 식물 종으로부터 유래해야 한다는 것은 절대적인 필요조건은 아니다. 내재적 표적 유전자 및 도입될 핵산 서열 간에 실질적인 상동성이 있으면 충분하다.
상기 기재된 것은 내재적 유전자의 식물에서의 발현의 감소 또는 실질적인 제거를 위한 다양한 방법의 예이다. 당업자는 전체 식물 또는 그 일부에서 내재적 유전자의 발현을 감소시키기 위한 침묵을 위해, 예를 들면, 적절한 프로모터를 사용하여 상기 언급된 방법을 용이하게 변형할 수 있다.
선발 마커 (유전자)/리포터 유전자
"선발 마커", "선발 마커 유전자" 또는 "리포터 유전자"는 본 발명의 핵산 구축물로 감염되거나 형질전환된 세포의 동정 및/또는 선발을 촉진하기 위하여 발현된 세포에 표현형을 부여하는 임의의 유전자를 포함한다. 이들 마커 유전자는 일련의 상이한 원리를 통해 핵산분자의 성공적인 전달을확인 가능하게 한다. 적절한 마커는 항생제나 제초제 저항성을 주거나 새로운 대사 형질을 도입하거나 또는 시각적인 선발을 가능하게 하는 마커로부터 선택된다. 선발 마커 유전자의 예는 항생제 (네오마이신 및 카나마이신을 인산화하는 nptII, hpt, 인산화 하이그로마이신, 또는 예를 들면, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 앰피실린, 겐타마이신, 제네티신 (G418), 스펙티노마이신, 블라스티시딘에 저항성을 주는 유전자), 제초제 (예를 들면, 바스타 (Basta
Figure 112009078358116-pct00002
)에 저항성을 제공하는 bar; 글리포제이트에 대한 저항성을 제공하는 aroA 또는 gox, 또는 예를 들면, 이미다졸리논, 포스피노트리신, 설포닐우레아에 저항성을 주는 유전자)에 저항성을 주는 유전자 또는 대사적 형질을 제공하는 유전자 (식물이 유일한 탄소원으로 만노즈를 이용하게 하는 manA 또는 자일로스 이용을 위한 자일로스 이성화효소, 또는 2-데옥시글루코스에 대한 저항성 같은 반영양적 마커)를 포함한다. 가시적 마커 유전자의 발현으로 발색 (예를 들면 베타-글루쿠로니다제, GUS, 또는 발색된 기질, 예를 들면 X-Gal을 갖는 베타-갈락토시다제), 발광 (루시페린/루시파라제 시스템 같은) 또는 형광 (녹색 형광 단백질, GFP, 및 이의 유도체)이 형성된다. 이 목록은 소수의 가능한 마커만을 나타낸다. 당업자는 상기 마커에 친숙하다. 생물체 및 선발 방법에 따라 다른 마커가 선호된다.
식물 세포로 핵산의 안정적인 또는 일시적인 통합에 따라 소수의 세포만이 외래 DNA를 취하여, 필요 시 사용된 발현벡터 및 사용된 감염 기술에 따라 게놈 내로 이를 통합한다는 것이 알려져 있다. 통합체를 동정하고 선발하기 위하여, 선발 마커를 암호화하는 유전자 (상기 기재된 것과 같은)가 보통 목적 유전자와 함께 숙주 세포에 도입된다. 이들 마커는 예를 들면 이들 마커 유전자가 예를 들면 전통적인 방법에 의한 결실에 의하여 기능이 없는 돌연변이체에 사용될 수 있다. 더욱이, 선발 마커를 암호화하는 핵산분자는 본 발명의 또는 본 발명의 방법에 유용한 사용된 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 동일한 벡터 또는 그 외 별개 백터 상에서 숙주 세포로 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정적으로 감염된 세포는 예를 들면 선발에 의해서 동정될 수 있다 (예를 들면, 통합된 선발 마커를 갖는 세포는 생존하는 반면, 다른 세포는 사멸한다).
마커 유전자, 특히 항생제 및 제초제에 저항성이 있는 유전자는 일단 핵산이 성공적으로 도입되면 형질전환 숙주 세포에서 더 이상 필요하지 않거나, 바람직하지 않으므로, 핵산 도입을 위한 본 발명의 방법에 유용한서는 이들 마커 유전자가 제거 또는 절단되게 하는 기술을 사용한다. 하나의 상기 방법이 동시형질전환 (co-transformation)으로 알려진 것이다. 동시형질전환 방법은 형질전환을 위해 두 벡터를 동시에 사용하여, 하나의 벡터에는 본 발명에 따른 핵산이 있고, 둘째 벡터에는 마커 유전자(들)이 있다. 대부분의 형질전환체는 양 벡터를 받거나, 식물의 경우 (형질전환체의 40% 이상까지) 포함한다. 아그로박테리아로 형질전환한 경우, 형질전환체는 보통 벡터의 일부, 즉 보통 발현 카세트인 T-DNA에 의해 플랭킹된 서열만을 받는다. 마커 유전자는 연이어 교배를 하여 형질전환 식물체로부터 제거된다. 다른 방법에서는, 마커 유전자가 트랜스포손에 통합되어 원하는 핵산과 함께 형질전환에 사용된다 (Ac/Ds 기술로 알려짐). 형질전환체는 트랜스포자제(transposase) 공급원과 교배될 수 있거나 또는 트랜스포자제가 발현되게 하는 핵산 구축물로 일시적으로 또는 안정적으로 형질전환된다. 어떤 경우에 (약 10%), 일단 형질전환이 성공적으로 되면 트랜스포존은 숙주 세포의 게놈 밖으로 튀어나가 소실된다. 더 많은 경우에, 트랜스포존은 다른 구역으로 튄다. 이들 경우에 마커 유전자는 교배에 의하여 제거되어야 한다. 미생물학에서 상기 일이 있어났는지 검출을 가능하게 하거나 용이하게 하는 기술이 개발되었다. 더욱 편리한 방법은 재조합 시스템이라 알려진 것에 의존하는 것으로 이점은 교배에 의한 제거가 면제될 수 있다는 것이다. 이 유형의 가장 잘 알려진 시스템은 Cre/lox 시스템이다. Cre1은 loxP 서열 사이에 위치한 서열을 제거하는 리콤비나아제이다. 만일 마커 유전자가 loxP 서열 사이에 통합되면 리콤비나아제의 발현에 의해서 마커 유전자는 제거된다. 다른 재조합 시스템은 HIN/HIX, FLP/FRT 및 REP/STB 시스템 (Tribble 등, J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan 등, J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566)이다. 본 발명에 따른 핵산 서열의 식물 게놈 내로 위치 특이적 통합이 가능하다. 자연적으로, 이들 방법은 또한 효모, 균류 또는 세균 같은 미생물에 응용될 수 있다.
트랜스제닉 /트랜스진/재조합
본 발명에서 "트랜스제닉", "트랜스진" 또는 "재조합"은 예를 들면, 핵산 서열, 발현카세트, 핵산 서열을 포함하는 유전자 구축물 또는 벡터, 또는 본 발명에 따른 핵산 서열, 발현 카세트나 벡터로 형질전환된 생물체, 하기에 기재된 재조합 방법에 의해 생성된 모든 구조물에 관한 의미이다:
(a) 본 발명의 방법에 유용한 단백질을 암호화하는 핵산서열, 또는
(b) 본 발명에 따른 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 조절 서열(들), 예를 들면 프로모터, 또는
(c) a) 및 b)
가 자연적인 유전적 환경에 있지 않거나, 재조합 방법으로 변형되어 왔으므로 예를 들면, 하나 이상의 뉴클레오티드 잔기의 치환, 부가, 결실, 역위 또는 삽입의 유형의 변형이 가능하다. 자연적인 유전적 환경은 원래의 식물에서 자연적인 게놈 또는 염색체 상의 위치나 게놈 라이브러리에서의 존재를의미하는 것으로 이해된다. 게놈 라이브러리의 경우, 핵산 서열의 자연적인 유전적 환경은 바람직하게는 적어도 부분적으로는 보유된다. 환경은 적어도 한 쪽의 핵산서열을 플랭킹하며 적어도 50 bp, 바람직하게는 적어도 500 bp, 특히 바람직하게는 적어도 1000 bp, 가장 바람직하게는 적어도 5000 bp 길이의 서열을 갖는다. 자연적으로 발생하는 발현 카세트, 예를 들면 본 발명의 방법에 유용한 폴리펩티드를 암호화하는 해당 핵산 서열과 핵산 서열의 자연적 프로모터의 자연적으로 생긴 조합은 이 발현 카세트가 예를 들면 돌연변이 처리 같은 비자연적인 합성 ("인위적") 방법으로 변형될 때 형질 전환 발현카세트가 된다. 적절한 방법이 예를 들면 US 5,565,350 또는 WO 00/15815에 기재되어 있다.
본 발명의 목적상, 트랜스제닉 식물은 상기처럼 본 발명의 방법에 유용한서 사용된 핵산은 상기 식물의 게놈상의 자연적 위치에 있지 않아 핵산이 동종에서 또는 이종에서 발현될 수 있다는 의미로 이해된다. 그러나, 언급된 바와 같이, 트랜스제닉은 또한 본 발명에 있어 또는 본 발명 방법에 사용된 핵산은 식물 게놈 내의 자연적 위치에 있는 반면, 그 서열이 자연적 서열에 대하여 변형되었고 및/또는 자연적 서열의 조절 서열이 변형되었음을 의미한다. 트랜스제닉은 핵산의 동종 또는 바람직하게는 이종 발현이 일어나는 게놈 내의 비자연적 위치에서 본 발명에 따른 핵산의 발현을 의미하는 것으로 바람직하게는 이해된다. 바람직한 트랜스제닉 식물이 본 발명에서 언급된다.
형질전환
본 발명에 언급된 용어 "도입" 또는 "형질전환"은 전달에 사용된 방법에 관계 없이 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주 세포로의 전달을 포함한다. 기관 발생이나 배발생에 의하여 연이은 클론 번식이 가능한 식물 조직은 본 발명의 유전자 구축물로 형질전환될 수 있으며, 전체 식물체가 이로부터 재생된다. 선택된 특정 조직은 형질전환될 특정 종에 이용 가능하며 가장 잘 맞는 클론 번식 시스템에 따라 다양할 것이다. 전형적인 조직 표적은 잎 디스크, 화분, 배, 자엽, 하배축, 대배우체, 캘러스 조직, 분열조직 (예를 들면, 정단 분열조직, 액아, 및 뿌리 분열조직), 및 유도된 분열조직 (예를 들면, 자엽 분열조직 및 하배축 분열조직)을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 일시적으로 또는 안정적으로 숙주 세포에 도입되며 예를 들면, 플라스미드처럼 비통합적으로 유지된다. 다르게는, 숙주 게놈으로 통합된다. 결과적인 형질전환 식물 세포는 당업자에게 주지된 방식으로 형질전환 식물을 재생하는데 사용된다.
외래 유전자의 식물 게놈으로 전달을 형질전환이라 부른다. 식물 종의 형질전환은 일상적인 기술이다. 유리하게도, 임의의 몇가지 형질전환 방법이 목적 유전자를 적절한 조상 세포로의 도입에 사용될 수 있다. 식물 조직 또는 식물 세포로부터 식물의 형질전환 및 재생에 관하여 기재된 방법은 일시적인 또는 안정한 형질전환에 이용될 수 있다. 형질전환 방법은 리포좀, 전기천공법, 유리 DNA 흡수를 증가시키는 화학물질, 식물체 내로 DNA의 직접적인 주입, 입자총 충격법, 바이러스 또는 화분을 이용한 형질전환 및 미세주입(microprojection)을 포함한다. 방법은 원형질에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜법 (Krens, F.A. 등, (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I 등 (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); 원형질의 전기천공법 (Shillito R.D. 등 (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); 식물로 미세주사(microinjection) (Crossway 등, (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); DNA 또는 RNA 코팅된 입자 충격법 (Klein TM 등, (1987) Nature 327: 70) (비통합적) 바이러스로 감염 등으로부터 선택할 수도 있다. 형질전환 작물을 포함한 형질전환 식물은 바람직하게는 아그로박테리움-매개된형질전환을 통해 제조된다. 편리한 형질전환방법은 식물체에서의 형질전환이다. 이를 위해, 예를 들면, 아그로박테리아를 식물 종자 상에 작용하게 하거나 식물 분열조직을 아그로박테리아로 접종하는 것이 가능하다. 형질전환된 아그로박테리아의 현탁액을 손상되지 않은 식물이나 적어도 꽃 원기에 작용하게 하는 것이 본 발명에 따라 특히 편리하다는 것이 입증되었다. 처리된 식물의 종자를 얻을 때까지 식물체를 키운다 (Clough and Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). 벼의 아그로박테리움 매개된형질전환 방법은 하기 임의의 것에 기재된 것처럼 벼 형질전환에 관한 잘 알려진 방법들을 포함한다: 유럽특허출원 EP 1198985 A1, Aldemita and Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan 등 (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei 등 (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), 상기 명세서는 충분히 설명한 것처럼 본 발명에 참조문헌으로 통합된다. 옥수수 형질전환의 경우에, 바람직한 방법은 Ishida 등 (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) 또는 Frame 등 (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002)에 기재된 것이며, 상기 명세서는 충분히 설명한 것처럼 본 발명에 참조문헌으로 통합된다. 상기 방법들은 [B. Jenes 등, Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143] 및 [Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225]에 예로서 기재되어 있다. 핵산 또는 발현될 구축물은 바람직하게는 아그로박테리움 투머파시엔스 형질전환에 적절한 벡터, 예를 들면 pBin19 내로 클론된다 (Bevan 등, Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). 상기 벡터로 형질전환된 아그로박테리아가 아라비돕시스처럼 모델로 사용된 식물 (본 발명의 범위 내의 아라비돕시스 탈리아나는 작물로 고려되지 않는다)이나 예로서 담배 같은 작물의 예를 들면, 상처 내거나 잘게 썬 잎을 아그로박테리아 용액에 적신 후 적절한 배지에 배양하는 것과 같은 식물 형질전환을 위해 알려진 방식으로 사용될 수 있다. 아그로박테리움 투머파시엔스에 의한 식물의 형질전환은 예를 들면, [Hofgen and Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877]에 의하여 기재되었거나, 특히 [F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38]에 알려져 있다.
온전한 식물로 재생되는 체세포의 형질전환외에, 식물의 분열조직 특히 배우자로 발달하는 세포의 형질전환이 가능하다. 이 경우에, 형질전환된 배우자는 자연적인 식물 발달 과정을 거쳐 형질전환 식물이 된다. 따라서 예를 들면, 아라비돕시스의 종자가 아그로박테리아로 처리되고, 발달하는 식물체로부터 취한 종자 중의 일부분이 형질전환되어 형질전환 식물체로 된다 [Feldman, KA and Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:274-289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua and J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274-289]. 또 다른 방법은 화서의 반복적인 제거에 근거하며 근생엽 중앙의 절단 부위를 형질전환된 아그로박테리아와 함께 배양하면 형질전환된 종자를 이후에 얻을 수 있다 (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). 그러나, 특히 효과적인 방법은 화서 담그기 ("floral dip") 방법의 변형인 진공 침윤 (vacuum infiltration)이다. 아라비돕시스의 진공 침윤의 경우, 감압 하에 온전한 식물체를 아그로박테리아 현탁액으로 처리하는 것이고 [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194-1199], "화서 담그기법"에서는 발달 중인 화서 조직을 계면활성제가 처리된 아그로박테리아 현탁액과 잠깐 배양하는 것이다 [Clough, SJ and Bent AF (1998) Plant J. 16, 735-743]. 양 경우에 특정 비율의 형질전환 종자가 수확되며, 이들 종자는 상기 기재된 선발 조건 하에서 재배함으로써 형질전환되지 않은 종자와 구분된다. 색소체는 모계로 유전되기 때문에 색소체의 안정적인 형질전환의 잇점은 대부분의 작물에서 화분을 통한 트랜스진의 유전이 감소되거나 제거된다는 점이다. 엽록체 게놈의 형질전환은 일반적으로 Klaus 등, 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]에 체계적으로 표시된 과정에 의하여 수행된다. 간단히, 형질전환될 서열을 선발 마커 유전자와 함께 엽록체 게놈에 상동인 플랭킹 서열 사이에 클론한다. 이들 상동 플랭킹 서열이 플라스톰(plastome) 내로 특이적으로 통합된다. 색소체 형질전환은 많은 다른 식물 종에 대해 기술되어 왔으며, 개관은 [Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3):425-38 or Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28]에 있다. 추가의 생물공학적 진보는 마커 없는 색소체 형질전환체의 형태로 최근 보고되었으며, 이는 일시적인 동시통합된(co-integrated) 마커 유전자에 의해 생성될 수 있다 (Klaus 등, 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).
T- DNA 활성화 태깅
T-DNA 활성화 태깅 (Hayashi 등 Science (1992) 1350-1353)은 보통 프로모터 (또한 해독 인핸서 또는 인트론)를 함유하는 T-DNA를 프로모터가 표적 유전자의 발현을 지시하게 배치되어 관심 유전자의 게놈 영역 내로 또는 유전자 암호화 영역의 10 kb 업스트림 또는 다운스트림으로 삽입하는 것을 포함한다. 전형적으로, 자체의 자연 프로모터에 의한 표적 유전자 발현의 조절은 붕괴되고 유전자는 새로 도입된 프로모터의 조절하에 있게 된다. 프로모터는 전형적으로 T-DNA 내에 끼워져 있다. 이 T-DNA는 식물 게놈 내에 예를 들면, 아그로박테리움 감염을 통하여 무작위로 삽입되며 삽입된 T-DNA 인근의 유전자의 발현이 변형되게 된다. 결과적인 형질전환 식물은 도입된 프로모터에 가까운 유전자의 변형된 발현으로 인하여 우성 표현형을 보인다.
틸링( TILLING )
용어 "틸링(TILLING)"은 "Targeted Induced Local Lesions In Genomes"의 약어이며 변형된 발현 및/또는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 생성 및/또는 동정하는데 유용한 돌연변이 기술을 말한다. 틸링(TILLING)은 또한 상기 돌연변이체를 갖는 식물의 선발을 가능하게 한다. 이들 돌연변이체는 강도나 위치 또는 시기상의 변형된 발현을 보인다 (만일 돌연변이가 프로모터에 영향을 준다면). 이들 돌연변이체는 자체의 자연적 형태의 유전자에 비하여 훨씬 높은 활성을 나타낸다. 틸링(TILLING)은 고밀도 돌연변이 유발과 고속처리 탐색 방법을 조합한 것이다. 틸링(TILLING)의 전형적인 단계는 하기와 같다: (a) EMS 돌연변이유발 (Redei GP 및 Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chu NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, pp. 1682; Feldmann 등, (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J and Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91-104); (b) DNA 준비 및 개체의 풀링(pooling); (c) 관심 영역의 PCR 증폭 (d) 이형 이중가닥 (heteroduplexes)이 되게 변성 및 어닐링 (e) DHPLC로 이형 이중가닥이 있는지를 크로마토그램 상의 여분의 정점으로 검출 (f) 돌연변이체 개체의 동정 (g) 돌연변이 PCR 산물의 염기서열결정. 틸링(TILLING)의 방법은 당업계에 주지되어 있다 (McCallum 등, (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).
상동 재조합
상동 재조합은 정해진 위치에 선택된 핵산 서열이 게놈 내로 도입되게 한다. 상동 재조합은 생물학에서 효모 또는 선류 (Physcomitrella) 같은 하등생물에 대해 일상적으로 사용되는 표준기술이다. 식물에 있어 상동 재조합을 수행하는 방법은 모델 식물 (Offringa 등 (1990) EMBO J 9(10): 3077-84)에 대해서 뿐 아니라 작물 예를 들면, 벼 (Terad 등 (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; Iid and Terad (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8; Terada 등 (2007) Plant Physiol)에 대해서도 기재된 바 있다.
수확량
일반적인 의미에서의 용어 "수확량"은 경제적 가치 있는 측정 가능한 생산량을 말하며, 전형적으로 특정 작물, 면적, 및 기간에 관련이 있다. 개개 식물체 부분이 직접적으로 수, 크기 및/또는 중량에 근거한 수확량에 기여하거나, 또는 실제 수확량은 작물 에이커 및 년 당 수확량이고, 이는 총생산량 (수확된 및 평가된 생산량을 포함)을 재배된 에이커로 나눔으로써 결정된다. 식물의 "수확량"은 식물체의 영양조직 생물량 (뿌리 및/또는 어린 줄기 생물량), 생식 기관, 및/또는 번식체 (예를 들면, 종자)에 관련될 수 있다.
초기 활력
"초기 활력" 특히 식물 생장의 초기 단계 중에 활기차고 건강하게 잘 균형을 이룬 생장을 말하며, 예를 들면, 식물이 환경에 보다 잘 적응함으로 인한 (즉, 에너지 자원 사용이 최적화되고 어린 줄기와 뿌리 간에 분배됨) 식물체의 적응성 증가의 결과일 것이다. 초기 활력을 갖는 식물은 또한 증가된 실생 생존 및 보다 나은 작물 생성을 보여주며, 이는 흔히 고도로 균일한 밭 (균일한 양상으로 자라는 작물, 즉 대다수의 식물이 사실상 거의 동시에 다양한 발달단계에 이르는)과 흔히 보다 낫고 보다 높은 수확량이 된다. 따라서, 초기 활력은 천 개 낱알의 중량, 발아율, 출현율, 실생 생장, 실생 높이, 뿌리 길이, 뿌리 및 어린 줄기 생물량 등과 같은 다양한 요인들을 측정함으로써 결정될 수 있다.
증가/향상/강화
용어 "증가", "향상", 또는 "강화"는 서로 호환성 있게 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 대조구 식물과 비교하여 적어도 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%, 바람직하게는 적어도 15% 또는 20%, 더욱 바람직하게는 25%, 30%, 35% 또는 40% 이상의 수확량 및/또는 생장을 의미한다.
종자 수확량
증가된 종자 수확량은 다음 중 하나 이상으로 나타난다: a) 개별 종자 당 및/또는 식물체 당 및/또는 헥타르 또는 에이커 당의 종자 생물량 (총 종자 중량)의 증가 b) 식물체 당 꽃 수의 증가 c) 증가된 수의 (충전된) 종자 d) 증가된 종자 충전율 (충전된 종자 수를 총 종자 수로 나눈 비로 나타냄); e) 증가된 수확 지수 (종자 같은 수확할 수 있는 부분의 수확량을 총 생물량으로 나눈 비율); 및 f) 증가된 천 개 낱알 중량 (TKW) (카운트한 충전된 종자 및 이의 총 중량으로부터 외삽됨). 증가된 TKW는 증가된 종자 크기 및/또는 종자 중량, 및 배 및/또는 배유 크기의 증가로 인한다.
증가된 종자 수확량은 또한 종자 크기 및/또는 종자 부피의 증가로 나타낼 수 있다. 더욱이, 종자 수확량의 증가는 또한 종자 면적 및/또는 종자 길이 및/또는 종자 폭 및/또는 종자 주계의 증가로 나타난다. 증가된 수확량으로 외형이 변형되거나, 또는 변형된 외형으로 인해 수확량이 증가할 수도 있다.
녹색 지수
본 발명에 사용된 "녹색 지수(greenness index)"는 식물의 디지탈 화상으로부터 계산된다. 화상 상에 식물 대상에 속하는 각 화소에 대하여, 녹색 값 대 적색 값의 비율 (암호화 색상에 대하여 RGB 모델에서)이 계산된다. 녹색 지수는 녹색 대 적색의 비율이 주어진 역치를 능가하는 화소의 백분율로 표시된다. 정상적인 생장 조건 하에서, 염분 스트레스가 있는 생장 조건 하에서, 양분 이용도가 감소된 생장 조건 하에서 식물의 녹색 지수는 개화 전 마지막 화상에서 측정된다. 대조적으로, 가뭄 스트레스 생장 조건 하에서 식물의 녹색 지수는 가뭄 후의 첫 번째 화상에서 측정된다.
식물
본 발명에서 사용된 용어 "식물"은 전체식물, 식물 및 종자, 어린 줄기, 줄기, 잎, 뿌리 (괴경 포함), 꽃, 및 조직과 기관을 포함하는 식물 부분의 조상 및 자손을 포함하며, 이들 각각은 목적 유전자/핵산을 포함한다. 용어 "식물"은 또한 식물 세포, 현탁 배양액, 캘러스 조직, 배, 분열조직, 배우체, 포자체, 화분 및 소포자를 포함하며, 이들 각각은 목적 유전자/핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 방법에 유용한 특히 유용한 식물은 수퍼패밀리 비리디플란태 (Viridiplantae)에 속하는 모든 식물, 특히 하기를 포함하는 목록에서 선택된 사료 또는 마초용 콩, 관상 식물, 식량 작물, 교목 또는 관목을 포함하는 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함한다: 에이서 (Acer spp.), 악티니디아 (Actinidia spp.), 아벨모스쿠스 (Abelmoschus spp.), 아가베 시살라나 (Agave sisalana), 아그로피론 (Agropyron spp.), 아그로스티스 스톨로니페라 ( Agrostis stolonifera ), 알리움 (Allium spp.), 아마란투스 (Amaranthus spp.), 암모필라 아레나리아 (Ammophila arenaria), 아나나스 코모수스 ( Ananas comosus ), 안노나 (Annona spp.), 아피움 그라베오렌스 (Apium graveolens), 아라키스 ( Arachis spp.), 알토칼푸스 ( Artocarpus spp.), 아스파라거스 오피시날리스 ( Asparagus officinalis ), 아베나 ( Avena spp.) (예를 들면, 아베나 사티바 ( Avena sativa ), 아베나 파투아 ( Avena fatua), 아베나 비잔티나 (Avena byzantina), 아베나 파투아 var . 사티바 (Avena fatua var . sativa), 아베나 하이브리다 (Avena hybrida)), 아베로아 카람볼라 (Averrhoa carambola), 뱀부사 (Bambusa sp.), 베닌카사 히스피다 (Benincasa hispida ), 벨톨레티아 엑셀세아 (Bertholletia excelsea), 베타 불가리스 (Beta vulgaris ), 브라시카 (Brassica spp.) (예를 들면, 브라시카 나푸스 ( Brassica napus ), 브라시카 라파 (Brassica rapa ssp.) [캐놀라, 유채, 순무]), 카다바 파리노사 (Cadaba farinosa), 카멜리아 시넨시스 (Camellia sinensis), 칸나 인디카 (Canna indica), 칸나비스 사티바 (Cannabis sativa), 캡시쿰 ( Capsicum spp.), 카렉스 엘라타 (Carex elata), 카리카 파파야 (Carica papaya), 카리사 마크로칼파 (Carissa macrocarpa), 카리야 (Carya spp .), 카르타무스 팅크토리우스 (Carthamus tinctorius), 카스타네아 (Castanea spp.), 케이바 펜탄드라 (Ceiba pentandra), 키코리움 엔디비아 (Cichorium endivia ), 신나모뭄 (Cinnamomum spp.), 시트룰루스 라나투스 (Citrullus lanatus), 시트루스 (Citrus spp.), 코코스 (Cocos spp .), 코페아 ( Coffea spp.), 콜로카시아 에스쿨렌타 (Colocasia esculenta), 콜라 (Cola spp.), 콜코루스 (Corchorus sp.), 코리안드룸 사티붐 (Coriandrum sativum), 코리루스 (Corylus spp.), 크라태구스 (Crataegus spp.), 크로쿠스 사티부스 (Crocus sativus), 쿠쿨비타 (Cucurbita spp .), 쿠쿠미스 ( Cucumis spp.), 키나라 ( Cynara spp.), 다우쿠스 카로타 (Daucus carota), 데스모디움 (Desmodium spp.), 디모칼푸스 론간 (Dimocarpus longan), 디오스코레아 (Dioscorea spp.), 디오스피로스 (Diospyros spp.), 에키노크로아 (Echinochloa spp .), 엘래이스 ((Elaeis (예를 들면, 엘래이스 귀넨시스 (Elaeis guineensis), 엘레이스 올레이페라 (Elaeis oleifera)), 엘레우신 코라카나 (Eleusine coracana), 에리안투스 (Erianthus sp .), 에리오보트리아 야포니카 (Eriobotrya japonica), 유카립투스 (Eucalyptus spp.), 유게니아 유니플로라 ( Eugenia uniflora), 파고피룸 ( Fagopyrum spp.), 파구스 (Fagus spp.), 페스투카 아룬디나케아 (Festuca arundinacea), 피쿠스 카리카 (Ficus carica), 폴투넬라 (Fortunella spp.), 프라가리아 (Fragaria spp.), 깅코 빌로바 (Ginkgo biloba), 글라이신 (Glycine spp.) (예를 들면, 글라이신 맥스 (Glycine max), 소야 히스피다 (Soja hispida) 또는 소야 맥스 ( Soja max )), 고시피움 힐수툼 ( Gossypium hirsutum ), 헬리안투스 (Helianthus spp.) (예를 들면, 헤리안투스 안누스 ( Helianthus annuus)), 헤메로칼리스 풀바 ( Hemerocallis fulva ), 히비스쿠스 ( Hibiscus spp.) 홀데움 ( Hordeum spp.) (예를 들면, 홀데움 불가레 (Hordeum vulgare)), 이포모에아 바타타스 (Ipomoea batatas ), 주글란스 (Juglans spp.), 락투카 사티바 (Lactuca sativa), 라티루스 (Lathyrus spp.), 렌스 쿨리나리스 (Lens culinaris), 리눔 우시타티시뭄 (Linum usitatissimum), 리치 키넨시스 (Litchi chinensis), 로투스 ( Lotus spp.), 루파 아쿠탄굴라 ( Luffa acutangula ), 루피누스 (Lupinus spp.), 루줄라 실바티카 (Luzula sylvatica), 라이코펠시콘 (Lycopersicon spp.) (예를 들면, 라이코펠시콘 에스쿨렌툼 (Lycopersicon esculentum ), 라이코펠시콘 라이코펠시쿰 (Lycopersicon lycopersicum), 라이코펠시콘 피리폴메 (Lycopersicon pyriforme)), 마크로틸로마 (Macrotyloma spp.), 말루스 (Malus spp.), 말피기아 에말기나타 (Malpighia emarginata), 맘메아 아메리카나 (Mammea americana), 망기페라 인디카 (Mangifera indica), 마니호트 ( Manihot spp.), 마닐카라 자포타 (Manilkara zapota), 메디카고 사티바 (Medicago sativa), 메릴로투스 (Melilotus spp.), 멘타 ( Mentha spp.), 미스칸투스 시넨시스 ( Miscanthus sinensis), 모몰디카 (Momordica spp.), 모루스 니그라 (Morus nigra), 무사 (Musa spp.), 니코티아나 ( Nicotiana spp.), 올레아 ( Olea spp.), 오푼티아 (Opuntia spp.), 오르니토푸스 (Ornithopus spp.), 오리자 (Oryza spp.) (예를 들면, 오리자 사티바 (Oryza sativa ), 오리자 라티포리아 ( Oryza latifolia)), 패니쿰 미리아케움 (Panicum miliaceum), 패니쿰 벌가툼 ( Panicum virgatum), 파시플로라 에둘리스 (Passiflora edulis), 파스티나카 사티바 (Pastinaca sativa), 페니세툼 (Pennisetum sp.), 펠세아 (Persea spp.), 페트로셀리눔 크리스품 (Petroselinum crispum), 파라리스 아룬디나케아 (Phalaris arundinacea), 파세올루스 (Phaseolus spp.), 플레움 프라텐세 (Phleum pratense), 피닉스 (Phoenix spp .), 프라그미테스 오스트라리스 (Phragmites australis), 피사리스 (Physalis spp.), 피누스 ( Pinus spp.,) 피스타키아 베라 (Pistacia vera ), 피숨 (Pisum spp.), 포아 (Poa spp.), 포푸러스 ( Populus spp.), 프로소피스 ( Prosopis spp.), 프루누스 (Prunus spp.), 프시디움 ( Psidium spp.), 푸니카 그라나툼 (Punica granatum), 피루스 코무니스 (Pyrus communis), 켈쿠스 (Quercus spp.), 라파누스 사티부스 (Raphanus sativus), 레움 라발바룸 (Rheum rhabarbarum), 리베스 (Ribes spp.), 리키누스 콤무니스 ( Ricinus communis ), 루부스 (Rubus spp.), 사카룸 (Saccharum spp.), 살릭스 ( Salix spp.), 삼부쿠스 ( Sambucus spp.), 세카레 세레알레 ( Secale cereale ), 세사뭄 ( Sesamum spp.), 시나피스 (Sinapis sp .), 솔라눔 ( Solanum spp.) (예를 들면, 솔라눔 투베로숨 ( Solanum tuberosum ), 솔라눔 인테그리폴리움 (Solanum integrifolium) 또는 솔라눔 라이코펠시쿰 (Solanum lycopersicum)), 솔굼 바이칼라 ( Sorghum bicolor ), 스피나시아 (Spinacia spp.), 시지기움 (Syzygium spp.), 타게테스 ( Tagetes spp.), 타마린두스 인디카 (Tamarindus indica ), 테오브로마 카카오 (Theobroma cacao ), 트리폴리움 (Trifolium spp.), 트리티코세칼레 림파우이 ( Triticosecale rimpaui ), 트리티칼레 (Triticale)(트리티쿰 세칼레(Triticum secale), 트리티쿰 (Triticum spp. (예를 들면, 트리티쿰 아에스티붐 (Triticum aestivum), 트리티쿰 두룸 (Triticum durum ), 트리티쿰 툴기둠 (Triticum turgidum ), 트리티쿰 하이베르눔 (Triticum hybernum), 트리티쿰 마차 (Triticum macha ), 트리티쿰 사티붐 (Triticum sativum ) 또는 트리티쿰 불가레 (Triticum vulgare)), 트로패오룸 미누스 (Tropaeolum minus), 트로패오룸 마주스 (Tropaeolum majus), 박시니움 (Vaccinium spp.), 비시아 (Vicia spp.), 비그나 (Vigna spp.), 비올라 오도라타 (Viola odorata), 비티스 ( Vitis spp.), 제아 메이즈 (Zea mays), 지자니아 팔루스트리스 (Zizania palustris), 지지푸스 (Ziziphus spp.).
발명의 상세한 설명
I. 2- Cys PRX (2- cysteine peroxiredoxin )
놀랍게도, 이제 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 식물 뿌리에서의 발현의 조절, 바람직하게는 증가로 대조구 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물이 된다는 것이 발견되었다. 첫 번째 일 구현예에 따라, 본 발명은 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 식물 뿌리에서의 발현의 조절, 바람직하게는 증가시키는 것을 포함하는, 대조구 식물에 비해 식물에서 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 조절하는, 바람직하게는, 증가하는 바람직한 방법은 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 식물 뿌리에의 도입 및 발현이다.
이후 "본 발명의 방법에 유용한 단백질"은 본 발명에서 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 의미한다. 이후 "본 발명의 방법에 유용한 핵산 서열"은 상기 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 것이 가능한 핵산 서열을 의미한다. 식물에 도입되는 핵산 서열은 (따라서 본 발명의 방법 수행에 유용한) 하기에 기술될 유형의 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 서열이며, 이후 또한 "2-Cys PRX 핵산 서열" 또는 "2-Cys PRX 유전자"라 칭한다.
본 발명에서 정의된 "2-Cys PRX 폴리펩티드"는 N-말단으로부터 C-말단으로 하기를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 의미한다: (1) 색소체 운반 펩티드; 및 (2) 2-Cys PRX 보존된 도메인.
부가적으로, "2-Cys PRX 폴리펩티드"는 하기 중 하나 또는 양자를 포함한다: (i) 서열번호 77로 표시된 모티프1, 또는 서열번호 77에 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 모티프; 또는 (ii) 서열번호 78로 표시된 모티프2, 또는 서열번호 78에 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 모티프.
또 다르게는 또는 부가적으로, 본 발명에서 정의된 "2-Cys PRX 폴리펩티드"는 도 3에 도시된 것과 같은 계통수 제작에 사용 시, 임의의 다른 PRX 클레이드(clade)라기 보다는, 서열번호 2로 표시된 폴리펩티드 서열을 포함하는 2-Cys PRX 폴리펩티드 클레이드와 클러스터되는 경향이 있는 임의의 폴리펩티드 서열을 말한다.
또 다르게는 또는 부가적으로, 본 발명에서 정의된 "2-Cys PRX 폴리펩티드"는 서열번호 2로 표시된 2-Cys PRX 폴리펩티드에 증가하는 순으로 선호되는 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 임의의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 표 A1에 제시된 임의의 폴리펩티드 서열을 말한다.
용어 "도메인" 및 "모티프"는 본 발명의 "정의" 섹션에 정의된 바 있다. 도메인 동정을 위한 전문가 데이터베이스, 예를 들면 SMART (Schultz 등 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic 등 (2002) Nucleic Acids Res 30, 242- 244), InterPro (Mulder 등, (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher and Bairoch (1994), generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo 등, Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)), 또는 Pfam (Bateman 등, Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002))이 존재한다. 단백질 서열의 인 실리코 분석용 도구 세트가 ExPASY 프로테오믹스 서버에서 유용하다 (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger 등, ExPASy: proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784-3788 (2003)). 도메인은 또한 서열 정렬과 같은 통상적인 기술을 사용하여서도 동정될 수 있다. 서열번호 2의 폴리펩티드 서열의 분석은 하기 실시예 2 및 4에 제시되어 있다.
비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 상기 방법은 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA를 포함한다. GAP은 일치되는 수는 최대로, 공백(gaps)의 수는 최소로 되는 두 서열의 전체적인 (즉, 전체 서열에 걸쳐) 정렬을 찾기 위해 Needleman 및 Wunsch ((1970) J MoI Biol 48: 443-453)의 알고리즘을 사용한다. BLAST 알고리즘 (Altschul 등 (1990) J MoI Biol 215: 403-10)은 서열 동일성의 백분율을 계산하여, 두 서열 간에 유사도의 통계적 분석을 수행한다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 NCBI (National Centre for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 상동체는 예를 들면, ClustalW 복수 서열 정렬 알고리즘 (version 1.83)을 사용하여, 디폴트 페어와이즈 정렬 변수(default pairwise alignment parameters) 및 백분율로 스코링(scoring)하는 방법으로 용이하게 동정된다. 유사성 및 동일성의 전체 백분율은 MatGAT 소프트웨어 패키지 (Campanell 등, BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10; 4:29. MatGAT: 단백질 또는 DNA 서열을 사용하여 유사성/동일성 매트릭스를 생성하는 적용)에서 유용한 방법 중의 하나를 사용하여 결정될 수 있다. 당업자에게 명백한 것으로서 보존된 모티프 간에 정렬을 최적화하기 위하여 약간의 수작업의 편집을 행할 수 있다. 더욱이, 상동체 동정을 위하여 전체 길이의 서열을 사용하는 대신에, 특정 도메인이 또한 사용될 수 있다. 하기 실시예 3에 백분율로서 나타낸 서열 동일성 값은 핵산 서열 또는 폴리펩티드 전체 서열에 걸쳐(본 발명의 표 A2), 또는 선정된 도메인 또는 보존된 모티프(들)(서열번호 77로 표시된 모티프1, 및 서열번호 78로 표시된 모티프2, 서열번호 2에 포함된 모티프1 및 모티프2)에 걸쳐 상기 기재된 프로그램으로 디폴트 매개변수(default parameters)를 사용하여 결정되었다.
단백질의 세포 내 위치를 추정하는 일은 중요하며 잘 연구되어 있다. 단백질의 위치를 아는 것은 그 기능을 밝히는 데 도움이 된다. 단백질의 위치를 밝히는 실험적인 방법은 immunolocalization으로부터 녹색형광단백질 (GFP)을 사용한 단백질의 태깅(tagging)까지 있다. 상기 방법은 비록 계산에 의한 방법에 비해 노동 집약적이기는 하나 정확하다. 최근에 서열 데이터로부터 단백질 위치의 계산에 의한 예측에 많은 진전이 있었다. 당업자에게 잘 알려진 알고리즘 중에 Swiss Institute for Bioinformatics에 의해 호스팅된 ExPASy Proteomics tools이 유용하며, 예를 들면, PSort, TargetP, ChloroP, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, SignalP 등이 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 세포 내 위치의 동정은 실시예 5에 제시되어 있다. 특히 본 발명의 서열번호 2는 광합성 (자가영양) 세포의 색소체 (엽록체) 부위에 지정된다.
색소체에 단백질을 표적화하는 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 운반 펩티드의 사용을 포함한다. 하기 표 3은 임의의 2-Cys PRX 폴리펩티드를 색소체에 표적화하는 데 사용될 수 있는 운반 펩티드의 예를 보여주며, 상기 2-Cys PRX 폴리펩티드는, 자연형으로는, 정상적으로 색소체에 표적화되지 않거나, 또는 상기 2-Cys PRX 폴리펩티드는 그 자연형으로는 다른 운반 펩티드 (예를 들면, 그의 자연적인 운반 펩티드)의 힘으로 색소체에 표적화된다. 예를 들면, 남세균 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은, 2-Cys PRX 폴리펩티드가 색소체에, 바람직하게는 엽록체에 표적화되는 한, 또한 본 발명의 방법에 사용하기에 적절할 수 있다.
표 3: 색소체에 폴리펩티드의 표적화에 유용한 운반 펩티드 서열의 예
NCBI 등록번호 출처 생물체 단백질 기능 운반 펩티드 서열
P07839 Chlamydomonas Ferredoxin MAMAMRSTFAARVGAKPAVRGARPASRMSCMA
AAR23425 Chlamydomonas Rubisco activase MQVTMKSSAVSGQRVGGARVATRSVRRAQLQV
CAA56932 Arabidopsis thaliana Aspartate amino transferase MASLMLSLGSTSLLPREINKDKLKLGTSASNPFLKAKSFSRVTMTVAVKPSR
CAA31991 Arabidopsis thaliana Acyl carrier protein1 MATQFSASVSLQTSCLATTRISFQKPALISNHGKTNLSFNLRRSIPSRRLSVSC
CAB63798 Arabidopsis thaliana Acyl carrier protein2 MASIAASASISLQARPRQLAIAASQVKSFSNGRRSSLSFNLRQLPTRLTVSCAAKPETVDKVCAVVRKQL
CAB63799 Arabidopsis thaliana Acyl carrier protein3 MASIATSASTSLQARPRQLVIGAKQVKSFSYGSRSNLSFNLRQLPTRLTVYCAAKPETVDKVCAVVRKQLSLKE
2-Cys PRX 폴리펩티드는 색소체에 표적화 되어 활성화된다. 즉, 2-Cys PRX 폴리펩티드 (적어도 자연형)는 엽록체에서 H2O2의 제거를 촉매할 수 있다. 상기 활성을 점검하기 분석은 당업계에 주지되어 있다. 세부적인 내용은 실시예 6에 제시되어 있다.
본 발명은 서열번호 2의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열번호 1로 표시된 핵산 서열로 식물체를 형질전환함으로써 예시된다. 그러나, 본 발명의 수행은 상기 서열에 제한되지 않으며 본 발명의 방법은 유리하게는 본 발명에서 정의된 임의의 2-Cys PRX 암호화 핵산 서열 또는 2-Cys PRX 폴리펩티드 서열을 사용하여 수행될 수 있다.
2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 예는 본 발명의 실시예 1의 표 A1에 제시되어 있다. 제시된 핵산 서열이 본 발명의 방법의 수행에 유용하다. 실시예 1의 표 A1에 제시된 폴리펩티드 서열은 서열번호 2로 표시된 2-Cys PRX 폴리펩티드의 오쏘로그(orthologue) 및 패럴로그(paralogue)의 서열의 예이며, 용어 "오쏘로그" 및 "패럴로그"는 본 발명에서 정의된 바 있다. 오쏘로그 및 패럴로그는 소위 상호간 블라스트(Reciprocal blast) 탐색을 수행하면 용이하게 동정될 수 있다. 전형적으로 공개적으로 유용한 NCBI 데이터베이스 같은 임의의 서열 데이터베이스에 대해 조회 서열 (예를 들면, 실시예 1의 표 A1에 열거된 서열 이용)을 BLASTing하는 것을 포함하는 첫 번째 BLAST를 포함한다. BLASTN 또는 TBLASTX (표준 디폴트값 사용)은 일반적으로 뉴클레오티드 서열로부터 시작할 때, BLASTP 또는 TBLASTN (표준 디폴트값 사용)은 단백질 서열로부터 시작할 때 사용된다. BLAST 결과를 선택적으로 필터할 수도 있다. 필터한 결과물 또는 필터하지 않은 결과물의 전체 길이의 서열을 조회 서열 (조회 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2, 두 번째 BLAST는 따라서 브라시카(Brassica) 서열과 대조하는 것이다)이 유래한 생물체의 서열과 대조하여 BLAST한다 (두 번째 BLAST). 첫 번째와 두 번째 BLAST의 결과물을 비교한다. 첫 번째 BLAST로부터의 높은 ranking hit이 조회 서열이 유래한 것과 동종으로부터라면 패럴로그가 동정되고, 후에 BLAST back을 하면 이상적으로는 조회 서열이 가장 높은 hit을 보일 것이며 첫 번째 블라스트로부터의 높은 ranking hit이 조회 서열이 유래한 것과 동종으로부터가 아니라면 오쏘로그가 동정되며, 바람직하게는 BLAST back을 하면 가장 높은 hits 중에 조회 서열이 있다.
높은 ranking hits은 낮은 E-값을 가진 것이다. E-값이 낮을수록, 점수가 의미있다 (또는 다른 말로, 우연히 hit이 발견될 기회가 적다). E-값의 계산은 당업계에 주지되어 있다. E-값에다가, 비교는 또한 백분율 동일성에 의하여 점수화된다. 백분율 동일성은 특정 길이에 걸쳐 두 비교되는 핵산 (또는 폴리펩티드) 서열 간에 동일한 뉴클레오티드 (또는 아미노산)의 수를 말한다. 큰 패밀리의 경우, 연관 유전자의 클러스터링을 보여주고 오쏘로그 및 패럴로그를 동정하는데 도움이 되므로 ClustalW 다음에 neighbour joining tree가 사용된다 (도 3 참고).
핵산 변이체도 본 발명의 방법 수행에 유용할 수 있다. 상기 핵산 변이체의 예는 본 발명의 실시예 1의 표 A1에 제시된 폴리펩티드 서열 중 임의의 하나의 상동체 및 유도체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 용어 "상동체" 및 "유도체"는 본 발명에 정의되어 있다. 실시예 1의 표 A1에 제시된 폴리펩티드 서열 중 임의의 하나의 오쏘로그 또는 패럴로그의 상동체 및 유도체를 암호화하는 핵산 서열도 본 발명의 방법에 유용하다. 본 발명의 방법에 유용한 상동체 및 유도체는 상기 상동체 및 유도체가 유래된 변형되지 않은 단백질과 상당한 동일한 생물학적 및 기능적 활성을 가진다.
본 발명의 방법 수행에 유용한 또 다른 핵산 변이체는 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 일부, 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 혼성화되는 핵산 서열, 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 스플라이스 변이체, 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 대립인자 변이체, 및 유전자 셔플링에 의해 얻은 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 변이체를 포함한다. 용어 혼성화되는 서열, 스플라이스 변이체, 대립인자 변이체 및 유전자 셔플링은 본 발명에 기재된 바 있다.
본 발명의 방법의 수행은 전장 핵산 서열의 사용에 의존하지 않으므로, 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 전장 핵산 서열일 필요는 없다. 본 발명에서는, 실시예 1의 표 A1에 제시된 핵산 서열 중 임의의 하나의 일부, 또는 실시예 1의 표 A1에 제시된 임의의 폴리펩티드 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 암호화하는 핵산 서열의 일부를 식물 뿌리에 도입 및 발현하는 것을 포함하는, 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
핵산 서열의 일부분은 예를 들면, 핵산 서열에 하나 이상의 결실을 만들어서 제조될 수 있다. 그 부분은 분리된 형태로 사용될 수 있거나, 또는 예를 들면, 몇 가지 활성을 조합한 단백질을 생산하기 위하여 다른 암호화 (또는 비암호화) 서열에 융합될 수도 있다. 다른 암호화 서열에 융합될 경우, 해독으로 생성된 결과적인 폴리펩티드는 단백질 부분에 대해 예측된 것보다 클 것이다.
본 발명의 방법에 유용한 일부분은 본 발명에 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하며, 실시예 1의 표 A1에 제시된 폴리펩티드 서열과 상당한 동일한 생물학적 활성을 가진다. 바람직하게는, 상기 일부분은 실시예 1의 표 A1에 제시된 핵산 서열 중의 임의의 하나의 일부분, 또는 실시예 1의 표 A1에 제시된 폴리펩티드 서열 중 임의의 하나의 오쏘로그(orthologue) 또는 패럴로그(paralogue)를 암호화하는 핵산 서열의 일부분이다. 바람직하게는 상기 일부분은 적어도 길이 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 개의 연속적인 뉴클레오티드이며, 상기 연속적인 뉴클레오티드는 실시예 1의 표 A1에 제시된 핵산 서열 중 임의의 하나, 또는 실시예 1의 표 A1에 제시된 폴리펩티드 서열 중 임의의 하나의 오쏘로그 또는 패럴로그를 암호화하는 핵산일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 일부분은 서열번호 1의 핵산 서열의 일부분이다. 바람직하게는, 상기 일부분은 도 3에 도시된 바와 같은 계통수 구축에 사용 시, 임의의 다른 그룹보다는 서열번호 2로 표시된 폴리펩티드 서열을 포함하는 2-Cys PRX 폴리펩티드 그룹과 클러스터되는 경향이 있는 폴리펩티드 서열을 암호화한다.
본 발명의 방법에 유용한 또 다른 핵산 변이체는 감소된 스트린전시 조건하에서, 바람직하게는 스트린전트 조건하에서, 본 발명에서 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열, 또는 본 발명에서 정의된 일부와 혼성화가 가능한 핵산 서열이다.
본 발명에 따라, 실시예 1의 표 A1에 제시된 핵산 서열 중 임의의 하나와 혼성화가 가능한 핵산 서열, 또는 실시예 1의 표 A1에 제시된 임의의 핵산 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 암호화하는 핵산 서열과 혼성화가 가능한 핵산의 식물 뿌리에의 도입 및 발현을 포함하는, 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 유용한 혼성화 서열은 본 발명에서 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하며, 실시예 1의 표 A1에 제시된 폴리펩티드 서열과 상당한 동일한 생물학적 활성을 가진다. 바람직하게는, 상기 혼성화 서열은 실시예 1의 표 A1에 제시된 핵산 서열 중의 임의의 하나에 또는 상기 정의된 일부인 임의의 이들 서열 중 일부에, 또는 실시예 1의 표 A1에 제시된 임의의 폴리펩티드 서열 중의 임의의 하나의 오쏘로그 또는 패럴로그를 암호화하는 핵산 서열과 혼성화가 가능하다. 가장 바람직하게는, 상기 혼성화 서열은 서열번호 1로 표시된 핵산 서열에 또는 그 일부에 혼성화가 가능하다.
바람직하게는, 상기 혼성화 서열은 도 3에 도시된 것과 같은 계통수 구축에 사용 시 임의의 다른 그룹보다 서열번호 2로 표시된 폴리펩티드 서열을 포함하는 2-Cys PRX 폴리펩티드의 그룹과 클러스터되는 경향이 있는 폴리펩티드 서열을 암호화한다.
본 발명의 방법에 유용한 또 다른 핵산 변이체는 상기 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 스플라이스 변이체이다.
본 발명에 따라, 실시예 1의 표 A1에 제시된 핵산 서열 중의 임의의 하나의 스플라이스 변이체, 또는 실시예 1의 표 A1에 제시된 임의의 폴리펩티드 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 암호화하는 핵산 서열의 스플라이스 변이체의 식물 뿌리에의 도입 및 발현을 포함하는 식물에서의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
바람직한 스플라이스 변이체는 서열번호 1에 제시된 핵산 서열의 스플라이스 변이체, 또는 서열번호 2의 오쏘로그 또는 패럴로그를 암호화하는 핵산 서열의 스플라이스 변이체이다. 바람직하게는, 스플라이스 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열은 도 3에 제시된 것과 같은 계통수 제작 시 임의의 다른 그룹보다는 서열번호 2로 표시된 폴리펩티드 서열을 포함하는 2-Cys PRX 폴리펩티드 그룹과 클러스터하는 경향이 있다.
본 발명의 방법 수행에 유용한 또 다른 핵산 변이체는 상기 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 대립인자 변이체이며, 대립인자 변이체는 본 발명에서 정의된 바 있다.
본 발명에 따라, 실시예 1의 표 A1에 제시된 임의의 핵산 서열의 대립인자 변이체의 식물 뿌리에의 도입 및 발현, 또는 실시예 1의 표 A1에 제시된 임의의 폴리펩티드 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 암호화하는 핵산 서열의 대립인자 변이체의 식물 뿌리에의 도입 및 발현을 포함하는 식물에서의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 유용한 대립인자 변이체는 서열번호 2의 2-Cys PRX 폴리펩티드 및 실시예 1의 표 A1에 제시된 임의의 폴리펩티드 서열과 상당한 동일한 생물학적 활성을 가진다. 대립인자 변이체는 자연계에 존재하며, 본 발명의 방법은 상기 자연적인 대립인자의 사용을 포함한다. 바람직하게는, 대립인자 변이체는 서열번호 1의 대립인자 변이체 또는 서열번호 2의 오쏘로그 또는 패럴로그를 암호화하는 핵산 서열의 대립인자 변이체이다. 바람직하게는, 대립인자 변이체에 의해 암호화되는 폴리펩티드 서열은 도 3에 도시된 것과 같은 계통수 구축에 사용 시 임의의 다른 그룹과 보다는 서열번호 2로 나타낸 폴리펩티드 서열을 포함하는 2-Cys PRX 폴리펩티드와 클러스터하는 경향이 있다.
유전자 셔플링 또는 방향진화는 또한 상기 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 변이체 생성에 사용될 수 있으며, 용어 "유전자 셔플링"은 본 발명에서 정의된 바 있다.
본 발명에 따라, 실시예 1의 표 A1에 제시된 핵산 서열 중의 임의의 하나의 변이체의 식물 뿌리에의 도입 및 발현을 포함하는, 또는 실시예 1의 표 A1에 제시된 임의의 폴리펩티드 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 암호화하는 핵산 서열의 변이체의 식물 뿌리에의 도입 및 발현을 포함하는 식물에서의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공하며, 상기 변이 핵산 서열은 유전자 셔플링에 의해 얻어진다.
바람직하게는 유전자 셔플링에 의해 얻어진 변이체 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드 서열은 도 3에 제시된 것과 같은 계통수 구축에 사용 시 임의의 다른 그룹보다 서열번호 2로 표시된 폴리펩티드 서열을 포함하는 2-Cys PRX 폴리펩티드의 그룹과 클러스터되는 경향이 있다.
더욱이, 핵산 변이체는 또한 자리지정 돌연변이유발에 의해서도 얻을 수 있다. 몇가지 방법이 자리지정 돌연변이유발를 달성하는데 유용하며, 가장 흔한 것은 PCR에 근거한 방법이다 (current protocols in molecular biology. Wiley Eds).
2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 진정세균 및 진핵생물 (진균, 식물, 또는 동물) 같은 자연적 출처로부터 유래될 수 있다. 핵산 서열은 임의의 인공적인 출처로부터 유래되거나, 또는 고의적인 인간의 조작으로 조성 및/또는 게놈 환경에 있어서 자연형태로부터 변형될 수 있다. 바람직하게는 2-Cys PRX 폴리펩티드 암호화 핵산 서열은 식물로부터, 더 바람직하게는 쌍자엽 식물로부터, 더욱 바람직하게는 십자화과로부터, 가장 바람직하게는 브라시카 라파 (Brassica rapa) 유래이다.
본 발명의 방법의 수행은 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물을 제공한다. 특히 본 발명의 방법의 수행은 대조구 식물에 비하여 증가된 수확량, 특히 증가된 종자 수확량을 갖는 식물을 제공한다. 용어 "수확량" 및 "종자 수확량"은 본 발명의 "정의" 섹션에 보다 상세하세 기재되어 있다.
본 발명에서 향상된 수확량 관련 형질에 대한 기준은 (수확 가능한) 지상부 및/또는 (수확 가능한) 지하부를 포함하여 하나 이상의 식물체의 일부분의 생물량 (biomass: 중량)의 증가를 의미한다. 특히, 상기 수확 가능한 부분은 종자이며, 본 발명의 방법의 수행으로 대조구 식물의 종자 수확량에 비해 증가된 종자 수확량을 갖는 식물이 된다.
옥수수를 예로 들면, 수확량 증가는 다음 중의 하나 이상으로 표시된다: 헥타르 또는 에이커당 식물체의 수 증가, 식물체당 이삭 (열매) 수의 증가, 낱알 줄의 수, 줄당 낱알의 수, 낱알 중량, 천립중량, 열매 길이/직경의 증가, 종자 충만도 (충만된 종자 수/전체 종자 수 x 100)의 증가. 벼를 예로 들면, 수확량 증가는 다음 중의 하나 이상의 증가로 표시된다: 헥타르 또는 에이커당 식물체의 수, 식물체당 원추화서의 수, 원추화서당 작은 이삭의 수, 원추화서당 소화의 수 (일차 원추화서에 대한 충만된 종자의 수의 비율로 표시된다), 종자 충만도 (충만된 종자 수/전체 종자 수 x 100)의 증가, 천립중량의 증가.
본 발명은 대조구 식물에 비하여 수확량 관련 형질을, 특히 식물의 종자 수확량을 증가시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명에서 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 식물 뿌리에서의 발현을 조절, 바람직하게는 발현을 증가시키는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 형질전환 식물은 향상된 수확량 관련 형질을 가지므로, 이들 식물은 생활사 중의 해당 단계에서 대조구 식물의 생장 속도에 비하여 증가된 생장 속도를 나타낼 것 같다 (생활사 중 적어도 일부에서).
증가된 생장 속도는 식물체의 하나 이상의 부분 (종자 포함)에 특이적이거나, 또는 실질적으로 전체 식물에 걸쳐서일 수도 있다. 증가된 생장 속도를 가진 식물은 보다 짧은 생활사를 가질 수 있다. 식물의 생활사는 건조된 성숙된 종자로부터 식물체가 출발 물질과 유사한 건조된 성숙한 종자를 생산하는 단계까지 자라는데 필요한 시간을 의미하는 것일 수 있다. 상기 생활사는 초기 활력, 생장 속도, 녹색 지수, 개화 시기 및 종자 성숙 속도와 같은 요인에 의해 영향을 받을 수 있다. 증가된 생장 속도는 식물의 생활사 중의 하나 이상의 단계에서 또는 실질적으로 전체 식물 생활사 중에 나타날 수 있다. 식물의 생활사 중의 초기 단계 중에 증가된 생장 속도는 향상된 활력을 반영한다. 생장 속도의 증가는 그렇지 않았으면 가능했을 시기보다 식물을 늦게 파종하고/하거나 이르게 수확하게 함으로써 식물의 수확 주기를 변경할 수도 있다 (비슷한 효과는 보다 이른 개화시기로 얻을 수 있다). 만일 생장 속도가 충분히 증가하면 동일 식물 종의 잇따른 파종이 가능하다 (예를 들면, 한 생장기간 내에 벼의 파종 및 수확 후에 잇따라 벼의 파종 및 수확). 유사하게 만일 생장 속도가 충분히 증가하면 다른 식물 종의 잇따른 파종이 가능하다 (예를 들면, 옥수수 식물의 파종 및 수확 후에 예를 들면, 대두, 감자 또는 임의의 다른 적절한 식물의 파종 및 선택적 수확). 일부 작물의 경우 동일한 근경으로부터 부가적인 횟수의 수확도 가능하다. 식물의 수확 주기 변경은 에이커당 년간 생물량 생산의 증가로 이끈다 ((말하자면 일년 내) 임의의 식물을 재배하여 수확하는 횟수의 증가로 인하여). 작물 생육에 대한 영역 제한은 이식기에 (초기 시기) 또는 수확기에 (후기 시기) 흔히 불리한 환경 조건에 의해 결정되므로, 생장 속도 증가는 야생형에 비하여 보다 넓은 지리적 지역에 형질전환 식물이 재배되게 한다. 상기 불리한 조건은 수확 주기가 짧아지면 피할 수 있다. 생장 속도는 생장 곡선으로부터 다양한 매개변수를 유도함으로써 결정될 수 있으며, 상기 매개변수는 T-Mid (식물이 최대 크기의 50%에 이를 때까지 걸린 시간) 및 T-90 (식물이 최대 크기의 90%에 이를 때까지 걸린 시간)이다.
본 발명의 바람직한 특징에 따라, 본 발명의 방법의 수행으로 대조구 식물에 비해 생장 속도가 증가된 식물을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따라 식물의 생장 속도를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 식물 뿌리에서의 발현의 조절, 바람직하게는 발현의 증가를 포함한다.
식물이 스트레스가 없는 조건 하에 있든지 식물이 대조구 식물에 비하여 다양한 스트레스에 노출되든지 간에 수확량 및/또는 생장 속도의 증가는 있다. 식물은 전형적으로 보다 느리게 성장함으로써 스트레스에 대한 노출에 반응한다. 심각한 스트레스 하에서 식물의 생장이 중단되기도 한다. 다른 한편으로 본 발명에서 순한 스트레스는 식물이 노출됨으로써 생장을 재개하는 능력 없이 생장을 중단하게 하지 않는 임의의 스트레스로 정의된다. 본 발명이 의미하는 순한 스트레스는 스트레스 받은 식물의 생장 감소가 스트레스가 없는 조건하의 대조구 식물에 비하여 40%, 35% 또는 30% 미만, 바람직하게는 25%, 20% 또는 15% 미만, 더욱 바람직하게는 14%, 13%, 12%, 11% 또는 10% 미만이다. 실제로는 농업상의 진척 (관개, 시비, 살충제 처리)으로 인하여 심각한 스트레스가 재배 작물에 가해지지는 않는다. 결과적으로 순한 스트레스에 의해 유도되는 손상된 생장은 흔히 농업에서는 바람직하지 않은 특징이다. 순한 스트레스는 식물이 노출되는 매일의 생물적 및/또는 비생물적 (환경) 스트레스이다. 비생물적 스트레스는 가뭄 또는 과도한 수분, 혐기적 스트레스, 염분 스트레스, 화학적 독성, 산화적 스트레스 및 더운, 추운 또는 결빙 온도에 의한 것이다. 비생물적 스트레스는 수분 스트레스 (특히 가뭄으로 인한)로 인한 삼투 스트레스, 염 스트레스, 산화적 스트레스 또는 이온 스트레스이다. 생물적 스트레스는 전형적으로 세균, 바이러스, 진균 및 곤충과 같은 병원균에 의해 야기된 스트레스이다.
특히, 본 발명의 방법은 필적하는 조건하에 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물을 제공하기 위하여, 스트레스가 없는 조건하에서 또는 순한 가뭄 조건하에서 수행될 수 있다. Wang 등 (Planta (2003) 218: 1-14)에 보고된 바와 같이, 비생물적 스트레스는 일련의 형태적, 생리적, 생화학적 및 분자적 변화를 이끌어 식물 생장 및 생산성에 불리한 영향을 미친다. 가뭄, 염분, 극단적인 온도 및 산화적 스트레스는 상호 연관된 것으로 알려져 있으며, 유사한 기작을 통하여 생장 및 세포 손상을 유도할 수 있다. Rabbani 등 (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767)은 특히 가뭄 스트레스와 고염도 스트레스 간에 고도의 "혼선"을 기재하고 있다. 예를 들면, 가뭄 및/또는 염분은 일차적으로 삼투 스트레스로 나타나서 세포 내 항상성 및 이온 분포를 파괴한다. 흔히 고온 또는 저온을 동반하는 산화적 스트레스, 염분 또는 가뭄 스트레스는 기능적 및 구조 단백질의 변성을 야기한다. 결국 이들 다양한 환경적 스트레스는 흔히 유사한 세포 신호전달 경로 및 스트레스 단백질 생산, 항산화제 상향조절, 친화성 용질 축적 및 생장 정지 같은 세포 반응을 활성화한다. 본 발명에서 사용된 용어 "스트레스가 없는" 조건은 식물의 최적 생장을 허용하는 환경 조건이다. 당업자는 주어진 위치에서 정상적인 토양 조건 및 기후 조건을 인식하고 있다.
본 발명의 방법의 수행으로 스트레스가 없는 조건하에서 또는 순한 가뭄 스트레스 조건하에서 자란 식물이 비교되는 조건하에서 자란 대조구 식물에 비해 수확량 관련 형질이 향상된 식물로 된다. 따라서, 본 발명에 따라 스트레스가 없는 조건하에서 또는 순한 가뭄 조건하에서 키운 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 식물 뿌리에서의 발현의 조절, 바람직하게는 증가를 포함한다.
본 발명의 방법의 수행으로 필적하는 스트레스 조건 하에서 키운 대조구 식물에 비해 비생물적 스트레스 조건 하에서 키운 식물의 수확량 관련 형질이 향상된다. Wang 등 (Planta (2003) 218: 1-14)의 보고에 따르면, 비생물적 스트레스는 식물 생장 및 생산성에 불리한 영향을 미치는 일련의 형태적, 생리적, 생화학적 및 분자적 변화를 야기한다. 가뭄, 염분, 극단적인 온도 및 산화적 스트레스는 상호 연관되어 있어 비슷한 기작을 통하여 생장 및 세포 손상을 유도할 수 있다. 예를 들면, 가뭄 및/또는 염분은 일차적으로 삼투 스트레스로 나타나서 세포 내 항상성 및 이온 분포를 파괴한다. 고온 또는 저온, 염분 또는 가뭄 스트레스를 흔히 동반하는 산화적 스트레스는 기능 및 구조 단백질의 변성을 야기한다. 결국 이들 다양한 환경적 스트레스는 흔히 유사한 세포 신호전달 경로 및 스트레스 단백질 생산, 항산화제 상향조절, 친화성 용질 축적 및 생장 정지 같은 세포 반응을 활성화한다. 다양한 환경 스트레스가 비슷한 경로를 활성화하므로, 가뭄 스트레스로 수행한 본 발명의 실시예는 가뭄 스트레스에 대한 제한으로서 보여지는 것이 아니라, 필적하는 스트레스 조건하에서, 일반적으로 비생물적 스트레스하에서 자란 대조구 식물에 비해 수확량 관련 형질을 향상시킴에 있어 상기 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드의 관여를 나타내기 위한 차폐물로서 보여진다.
특히 가뭄 스트레스와 고염도 스트레스 간에 고도의 "혼선"이 보고되었다 (Rabbani et al. (2003) Plant Physiol 133: 1755-1767). 따라서, 식물에서 수확량 관련 형질의 향상에 유용함에 더하여, 2-Cys PRX 폴리펩티드가 가뭄 스트레스 조건하에서 자란 대조구 식물에 비해, 또한 다양한 다른 비생물적 스트레스 조건하에서 자란 대조구 식물에 비해 식물에서 수확량 관련 형질의 향상에 용도가 있음이 발견된 것이 분명하다.
본 발명에서 정의된 용어 "비생물적 스트레스"는 하기 중 임의의 하나 이상을 의미하는 것이다: 수분 스트레스 (가뭄 또는 과도한 수분으로 인한), 혐기적 스트레스, 염분 스트레스, 온도 스트레스 (더운, 추운 또는 결빙 온도에 의한), 화학적 독성 스트레스 및 산화적 스트레스. 본 발명의 한 양상에 있어서, 비생물적 스트레스는 수분 스트레스, 염분 스트레스, 산화적 스트레스 및 이온 스트레스로부터 선택된 삼투 스트레스이다. 바람직하게는, 상기 수분 스트레스는 가뭄 스트레스이다. 용어 염분 스트레스는 통상적인 소금 (NaCl)에 제한되는 것이 아니라, 무엇보다도 NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2 중 임의의 하나 이상에 의해 야기된 임의의 스트레스일 수 있다.
특히, 필적할만한 스트레스 조건하에서 자란 대조구 식물에 비해 비생물적 스트레스 조건 (바람직하게는 가뭄 스트레스 조건)하에서 자란 식물에서 향상된 수확량 관련 형질은 하기 중 하나 이상을 포함한다: (i) 향상된 초기 활력; (ii) 증가된 지상부 생물량(biomass); (iii) 증가된 뿌리 (굵은 및 가는) 생물량(biomass); (iv) 원추화서당 증가된 꽃의 수; (v) 증가된 종자 충만율; (vi) 식물체당 증가된 총 종자 수확량; (vii) 증가된 (충만된) 종자 수; (viii) 증가된 수확 지수; 또는 (ix) 증가된 천립당 중량 (TKW).
본 발명의 방법의 수행은 필적할만한 스트레스 조건하에서 자란 대조구 식물에 비해 비생물적 스트레스 조건하에서 향상된 수확량 관련 형질을 가진 식물을 생산한다. 따라서, 본 발명에서는 비생물적 스트레스 조건하에서 자란 식물에 있어 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 식물 뿌리에서의 발현의 조절, 바람직하게는 증가를 포함한다. 본 발명의 한 가지 양상에 따라, 비생물적 스트레스는 하기 중 하나 이상으로부터 선택된 삼투 스트레스이다: 수분 스트레스, 염 스트레스, 산화적 스트레스 및 이온 스트레스. 바람직하게는, 상기 수분 스트레스는 가뭄 스트레스이다.
비생물적 환경 스트레스의 또 다른 예는 생장 및 발달을 위해 식물에 의해 동화되는 하나 이상의 양분의 감소된 이용능력이다. 식물의 수확량 및 생산품의 품질에 미치는 양분 이용 효율의 강력한 영향으로 인해, 식물 생장 및 품질을 최적화하기 위해 다량의 비료가 필드에 뿌려진다. 식물의 생산성은 보통 3 가지 주요 양분인 인, 칼륨 및 질소에 인해 제한되며, 질소가 상기 3 가지 중 식물 생장에 있어 속도 제한 요소이다. 따라서 식물 생장에 필요한 주요 양분 요소는 질소 (N) 이다. 질소는 살아있는 세포에서 발견되는 아미노산, 단백질 (효소), 핵산, 및 엽록소를 포함한 수많은 중요한 화합물의 구성성분이다. 식물 건량의 1.5% 내지 2%가 질소이며, 총 식물 단백질의 약 16%이다. 따라서, 질소 이용능력이 작물 생장 및 생산에 있어 주요 제한 요인이며 (Frink 등 (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(4): 1175-1180), 단백질 축적 및 아미노산 조성에 주요한 영향을 미친다. 따라서, 질소 제한 조건하에서 자랄 때 수확량이 증가된 작물은 관심의 대상이 된다.
본 발명의 방법의 수행은 필적할만한 조건하에서 자란 대조구 식물에 비해 양분결핍 조건하에서, 특히 질소결핍 조건하에서 자란 식물에게 향상된 수확량 관련 형질을 제공한다. 따라서, 본 발명에서는 양분결핍 조건하에서 자란 식물에 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 식물 뿌리에서의 발현의 조절, 바람직하게는 증가를 포함한다. 양분결핍은 무엇보다도 질소, 인산염 및 다른 인-함유 화합물, 칼륨, 칼슘, 카드뮴, 마그네슘, 망간, 철 및 붕소 같은 양분의 부족 또는 과다의 결과이다.
본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 얻을 수 있는 식물 또는 이의 부분 (종자 포함)을 포함한다. 상기 식물 또는 이의 부분은 뿌리-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된, 상기 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 외래도입유전자(transgene)를 포함한다.
본 발명은 또한 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 식물에의 도입 및/또는 발현을 용이하게 하는 유전자 구축물 및 벡터를 제공한다. 유전자 구축물은 상업적으로 유용하고, 식물에의 형질전환에 적절하며, 형질전환된 세포에서 목적 유전자의 발현에 적절한 벡터에 삽입될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 유용한 있어 상기 정의된 유전자 구축물의 용도를 제공한다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 하기를 포함하는 구축물을 제공한다:
(a) 상기 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열;
(b) (a)의 핵산 서열의 발현을 이끌 수 있는 하나 이상의 조절 서열 및 선택적으로
(c) 전사 종결 서열.
바람직하게는, 상기 2-Cys PRX를 암호화하는 핵산 서열은 상기 정의된 바와 같다. 용어 "조절 서열" 및 "전사 종결 서열"은 본 발명에서 정의된 바와 같다.
일 구현예에서, 구축물의 조절 서열 중 하나는 기관 특이적 프로모터, 바람직하게는 식물 뿌리에서의 발현을 위한 프로모터이다. 뿌리 특이적 프로모터의 예는 Rcc3 프로모터, 예를 들면 서열번호 80로 표시되는 벼 Rcc3 프로모터이다.
식물은 상기 기재된 임의의 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된다. 당업자는 목적 서열을 함유하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환, 선발 및 증식시키기 위하여 벡터 내에 존재해야 하는 유전적 요소를 잘 알고 있다. 목적 서열은 하나 이상의 조절 서열 (적어도 프로모터)에 작동가능하게 연결된다.
유리하게, 자연적이든 인공적이든 임의의 유형의 프로모터가 핵산 서열의 발현을 추진하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 특징에 따르면, 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 뿌리 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 상기 뿌리 특이적 프로모터는 바람직하게는 RCc3 프로모터이며 (Plant Mol Biol. 1995 Jan; 27(2): 237-48), 더욱 바람직하게는 상기 RCc3 프로모터는 벼 유래이며, 더 더욱 바람직하게는 RCc3 프로모터는 서열번호 80과 실질적으로 유사한 핵산 서열로 표시되며, 가장 바람직하게는 상기 프로모터는 서열번호 80으로 표시된다. 본 발명의 방법을 수행하기 위해 이용될 수 있는 기타 뿌리 특이적 프로모터의 예는 상기 "정의" 섹션의 표 2b에 제시되어 있다.
본 발명의 적용은 서열번호 1로 나타낸 2-Cys PRX 폴리펩티드-암호화 핵산 서열에 제한되지 않으며, 본 발명의 적용은 뿌리 특이적 프로모터에 의해 추진 시 2-Cys PRX 폴리펩티드-암호화 핵산 서열의 발현에 제한되지 않는다.
예를 들면, 잎, 줄기, 괴경, 분열조직, 종자 (배 및/또는 배유)에서의 발현에 바람직한 다른 기관 특이적 프로모터가 본 발명의 방법의 수행에 유용하다. 본 발명의 "정의" 섹션에 다양한 프로모터 형에 대해 정의되어 있다.
선택적으로, 하나 이상의 종결신호 서열이 식물에 도입된 구축물에 사용될 수 있다. 부가적인 조절 인자는 해독뿐 아니라 전사 인핸서를 포함한다. 본 발명을 수행함에 있어 사용하기에 적절한 종결신호 및 인핸서 서열이 당업자에게 공지되어 있다. 세포질 내에 축적되는 성숙한 메시지의 양 증가를 위하여 "정의" 섹션에 기재된 바와 같이 인트론 서열이 또한 5' 비해독 영역 (UTR) 또는 암호화 서열에 첨가될 수 있다. 다른 조절 서열 (프로모터, 인핸서, 사일런서, 인트론 서열, 3'UTR 및/또는 5'UTR 영역 외에)은 단백질 및/또는 RNA 안정화 인자들일 수 있다. 상기 서열은 알려져 있거나, 당업자가 쉽게 얻을 수 있다.
본 발명의 유전자 구축물은 특정 세포 유형에서 유지 및/또는 복제에 필요한 복제 서열의 원점을 포함한다. 한 예는 에피좀 유전자 요소 (예를 들면, 플라스미드 또는 코스미드 분자)로서 유전자 구축물이 세균 세포 내에 유지되어야 할 때이다. 바람직한 복제 원점은 f1-ori 및 colE1를 포함하나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 유용한 사용된 핵산 서열이 성공적으로 전달되었는지 검출 및/또는 이들 핵산 서열을 포함하는 형질전환 식물의 선발을 위해서 마커 유전자 (또는 리포터 유전자)를 사용하는 것이 유리하다. 따라서, 유전자 구축물은 선택적으로 선발 마커 유전자를 포함한다. 선발 마커는 본 발명의 "정의" 섹션에서 더 상세히 기재된다.
식물 세포로 핵산 서열의 안정적인 또는 일시적인 통합시, 소수의 세포만이 외래 DNA를 취하여, 필요 시 사용된 발현벡터 및 사용된 감염 기술에 따라 게놈 내로 이를 통합한다는 것이 알려져 있다. 통합체를 동정하고 선발하기 위하여, 선발 마커를 암호화하는 유전자 (상기 기재된 것과 같은)가 보통 목적 유전자와 함께 숙주 세포에 도입된다. 이들 마커는 예를 들면 이들 마커 유전자가 예를 들면 전통적인 방법에 의한 결실에 의하여 기능이 없는 돌연변이체에 사용될 수 있다. 더욱이, 선발 마커를 암호화하는 핵산분자는 본 발명의 또는 본 발명의 방법에 사용된 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 동일한 벡터 또는 그 외 별개 백터 상에서 숙주 세포로 도입될 수 있다. 도입된 핵산 서열로 안정적으로 감염된 세포는 예를 들면 선발에 의해서 동정될 수 있다 (예를 들면, 통합된 선발 마커를 갖는 세포는 생존하는 반면, 다른 세포는 사멸한다). 마커 유전자는 형질전환 세포에서 더 이상 필요하지 않으면 절단되거나 제거될 수 있다. 마커 유전자 제거 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 상기 정의 섹션에 기재되어 있다.
본 발명은 상기에서 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 식물 뿌리에서의 도입 및 발현을 포함하는, 대조구 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질을 가진 형질전환 식물을 제조하는 방법을 제공한다.
더욱 상세하게, 본 발명은 향상된 수확량 관련 형질을 가진 형질전환 식물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(i) 뿌리 특이적 프로모터의 조절 하에 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 식물, 식물체 일부 또는 식물 세포에의 도입 및 발현 및
(ii) 식물의 생장 및 발달을 촉진하는 조건하에서 식물 세포를 배양.
상기 (i)의 핵산 서열은 본 발명에서 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 임의의 핵산 서열일 수 있다.
상기 핵산 서열은 식물 세포로 또는 식물체 자체 (조직, 기관, 또는 식물체의 임의의 다른 부분으로 도입 포함)로 직접적으로 도입될 수 있다. 본 발명의 바람직한 특징에 따르면, 핵산 서열은 바람직하게는 형질전환에 의하여 식물체 내로 도입된다. 용어 "형질전환"은 본 발명의 "정의" 섹션에 보다 더 상세하게 기재되어 있다.
유전적으로 변형된 식물 세포는 당업자에게 친숙한 모든 방법을 통해서 재분화될 수 있다. 적절한 방법은 상기 언급된 S.D. Kung 및 R. Wu, Potrykus 또는 Hofgen 및 Willmitzer의 문헌에 있다.
일반적으로 형질전환 후, 식물 세포 또는 세포 집단은 목적 유전자와 함께 전달된 식물에서 발현 가능한 유전자에 의해 암호화되는 하나 이상의 마커의 존재에 대하여 선발되어, 형질전환된 물질은 온전한 식물로 재분화된다. 형질전환 식물을 선발하기 위하여, 형질전환에서 얻은 식물 재료는 대체로 선택적 조건 하에 두어, 형질전환 식물이 형질전환되지 않은 식물과 구분될 수 있게 한다. 예를 들면, 상기 기재된 방식으로 얻은 종자를 심고, 초기 생장기간 후, 분무에 의해 적절한 선발을 하게 된다. 추가의 가능한 방법으로는, 종자를 멸균하여 적절한 선발물질을 사용하여 한천판에 키우면, 형질전환된 종자만 식물체로 자랄 수 있다. 다르게는, 형질전환 식물은 상기 기재된 것과 같은 선발 마커의 존재에 대하여 가려진다.
DNA 전달 및 재분화에 이어, 형질전환된 것으로 추정되는 식물은 또한 예를 들면, 목적 유전자의 존재, 카피 수 및/또는 게놈 조직에 대하여 서던 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 다르게는 또는 부가적으로, 새로이 도입된 DNA의 발현수준을 노던 및/또는 웨스턴 분석으로 측정할 수 있으며, 두 기술은 당업자에게 주지되어 있다.
생성된 형질전환된 식물은 클론 번식 또는 전통적인 육종 기술 같은 다양한 수단으로 증식될 수 있다. 예를 들면, 제1세대 (또는 T1) 형질전환 식물은 자가교배되고, 동형접합 제2세대 (또는 T2) 형질전환체가 선발되어, T2 식물은 전통적인 육종 기술로 더 증식된다. 생성된 형질전환된 생물체는 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들면, 형질전환된 세포 및 형질전환되지 않은 세포의 키메라; 클론 형질전환체 (예를 들면, 발현 카세트를 함유하도록 형질전환된 모든 세포); 형질전환된 및 형질전환되지 않은 조직의 그라프트(graft) (예를 들면, 식물에 있어 형질전환되지 않은 접순에 접목된 형질전환된 대목)일 수 있다.
본 발명은 분명히 본 발명에서 기재된 임의의 방법으로 생산된 임의의 식물 세포 또는 식물 및 모든 식물 부분 및 그의 번식체로 확장된다. 본 발명은 상기 언급한 임의의 방법으로 생산된 일차 형질전환된 또는 감염된 세포, 조직, 기관 또는 전체식물의 자손을 포함하기 위해 더 확장될 수 있으며, 자손이 본 발명에 따른 방법으로 양친이 생산한 것과 동일한 유전형적 및/또는 표현형적 특징(들)을 나타내는 것만이 요구된다.
본 발명은 또한 상기에 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 숙주 세포는 식물 세포이다. 본 발명의 방법에 사용된 핵산 서열 또는 벡터, 발현 카세트 또는 구축물 또는 벡터에 대한 숙주 식물은 원칙적으로 유리하게, 본 발명의 방법에 사용된 폴리펩티드를 합성하는 것이 가능한, 모든 식물이다.
본 발명의 방법은 유리하게 임의의 식물에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법에 특히 유용한 식물은 수퍼패밀리 비리디플란태 (Viridiplantae)에 속하는 모든 식물, 특히 사료 또는 마초용 콩, 관상 식물, 식량 작물, 교목 또는 관목을 포함하는 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함한다. 본 발명의 바람직일 구현예에 있어서, 식물은 작물이다. 작물 식물의 예는 대두, 해바라기, 캐놀라, 알팔파, 유채, 목화, 토마토, 감자 및 담배를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 식물은 단자엽 식물이다. 단자엽 식물의 예는 사탕수수를 포함한다. 더욱 바람직하게는 식물은 곡물이다. 곡물의 예는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 기장, 라이밀, 호밀, 수수 및 귀리를 포함한다.
본 발명은 또한 종자, 잎, 열매, 꽃, 줄기, 지하경, 괴경 및 인경 같은 식물의 수확 가능한 부분에까지 확장되나, 이 부분에 제한되지는 않는다. 본 발명은 더욱이 건조 펠렛 또는 분말, 기름, 지방 및 지방산, 전분 또는 단백질 같은 식물의 수확 가능한 부분으로부터 바람직하게는 직접적으로 유래된 생산물에 관련된다.
본 발명의 바람직한 특징에 따라, 조절된 발현은 증가된 발현이다. 핵산 서열 또는 유전자, 또는 유전자 산물의 발현을 증가시키는 방법은 당업계에 잘 문헌화되어 있으며, 정의 섹션에 예가 제시되어 있다.
상기 언급된 바와 같이, 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 조절하는, 바람직하게는 증가시키는 바람직한 방법은 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 식물 뿌리로의 도입 및 발현이다; 그러나 상기 방법의 효과는 즉, 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법은 T-DNA 활성화 태깅, 틸링(TILLING), 상동 재조합을 포함하여 다른 잘 알려진 기술을 사용하여 행할 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 기술은 정의 섹션에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 기재된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 용도, 및 식물의 임의의 전술한 수확량 관련 형질을 향상시키는 상기 2-Cys PRX 폴리펩티드의 용도를 포함한다.
본 발명에서 기재된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열, 또는 2-Cys PRX 폴리펩티드 그 자체는 2-Cys PRX 폴리펩티드 암호화 유전자에 유전적으로 연결된 DNA 마커가 동정된 육종 프로그램에 용도가 있다. 유전자/핵산 서열, 또는 2-Cys PRX 폴리펩티드 그 자체는 분자 마커를 정의하는데 사용될 수 있다. 이 DNA 또는 단백질 마커는 상기 본 발명의 방법에 정의된 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물을 선발하는 육종 프로그램에 사용된다.
2-Cys PRX 폴리펩티드 암호화 유전자/핵산 서열의 대립인자 변이체는 또한 마커 보조 육종 프로그램에 사용된다. 상기 육종 프로그램은 때때로 예를 들면, EMS 돌연변이 유발을 사용하여 식물에 돌연변이 유발 처리로 대립인자 변이의 도입을 필요로 하며 다르게는, 그 프로그램은 자연발생적으로 생성된 "자연적인" 대립인자 변이체의 수집물로부터 시작될 수도 있다. 그러면 대립인자 변이체의 동정은 예를 들면, PCR로 한다. 문제되는 서열의 수확량 관련 형질을 향상시키는 우수한 대립인자 변이체의 선발 단계가 잇따른다. 선발은 전형적으로 문제되는 서열의 다른 대립인자 변이체를 함유하는 식물의 생장 능력을 관찰함으로써 이루어진다. 생장 능력은 온실 또는 야외에서 관찰할 수 있다. 추가적으로 선택 가능한 단계는 우수한 대립인자 변이체가 동정된 식물과 또 다른 식물의 교배를 포함한다. 이는 예를 들면, 관심을 유발하는 표현형적 특징의 조합을 만드는데 사용될 수 있다.
2-Cys PRX 폴리펩티드 암호화 핵산 서열은 또한 이 유전자에 대한 유전자 및 물리지도 제작용 탐침으로서 및 그 유전자에 연관된 형질에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 상기 정보는 원하는 표현형을 갖는 라인 개발을 위한 식물 육종에 유용하다. 상기 2-Cys PRX 폴리펩티드 암호화 핵산 서열 사용에는 적어도 길이 15 뉴클레오티드의 핵산 서열만이 필요하다. 2-Cys PRX 폴리펩티드 암호화 핵산 서열은 RFLP (restriction fragment length polymorphism) 마커로 사용될 수 있다. 제한효소 절단된 식물 게놈 DNA의 서던 블럿 (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, Laboratory Manual)에 2-Cys PRX 폴리펩티드 암호화 핵산 서열이 프로브로 사용된다. 결과로 나온 밴드 분포 양상으로 유전자지도 제작을 위하여 MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174-181) 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 유전적 분석을 하게 된다. 또한, 핵산 서열은 지정된 유전적 교배의 양친 및 자손을 나타내는 개체들의 제한 효소 처리된 게놈 DNAs의 서던 블럿에 탐침으로 사용될 수 있다. DNA 다형성의 분리를 기록하여, 이 집단을 이용하여 이전에 얻었던 유전자 지도상에 2-Cys PRX 폴리펩티드 암호화 핵산 서열의 위치 계산에 사용한다 (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331).
유전자 지도 제작에 사용하기 위한 식물 유전자 유래 탐침의 생산 및 사용은 [Bematzky and Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37-41]에 기재되어 있다. 수많은 공개문헌이 상기 개설된 방법론 또는 이의 변형을 사용하여 특정 cDNA 클론의 유전자 지도 제작을 기술한다. 예를 들면, F2 이종교배 개체군, 역교배 개체군, 무작위 교배 개체군, 근동질유전자계통, 및 다른 세트의 개체가 유전자 지도 제작에 사용될 수 있다. 상기 방법론은 당업자에게 주지되어 있다.
핵산 탐침은 또한 물리 지도에 제작 사용될 수 있다 (즉, 물리 지도상에 서열의 위치 Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, 인용된 문헌 참조).
또 다른 구현예에 있어서, 핵산 탐침은 직접적인 형광 인 시투 혼성화 (fluorescence in situ hybridisation, FISH) 지도 제작에 사용될 수 있다 (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). 비록 현 FISH 지도 제작 방법이 큰 클론에 유리하지만 (수 kb 내지 몇 백 kb; Laan et al. (1995)Genome Res. 5:13-20), 감도가 향상되면 더욱 짧은 탐침으로 FISH 지도 제작이 가능해진다.
유전자지도 및 물리지도 작성을 위한 핵산증폭에 근거한 다양한 방법이 핵산 서열을 사용하여 수행될 수 있다. 예는 대립인자 특이적 증폭 (allele-specific amplification, Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), CAPS (polymorphism of PCR-amplified fragments; Sheffield 등 (1993) Genomics 16:325-332), 대립인자 특이적 라이게이션 (allele-specific ligation, Landegren 등 (1988) Science 241:1077-1080), 뉴클레오티드 신장 반응 (nucleotide extension reactions, Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), Radiation Hybrid Mapping (Walter et al . (1997) Nat. Genet. 7:22-28) 및 Happy Mapping (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807)을 포함한다. 이들 방법을 위해서 증폭 반응 또는 프라이머 연장 반응에 사용하기 위한 프라이머 쌍을 고안하고 제작하기 위해 핵산 서열이 사용된다. 상기 프라이머의 고안은 당업자에게는 주지되어 있다. PCR에 근거한 유전자 지도 제작에 사용하는 방법에서는 핵산 서열에 해당하는 영역에서 교배 양친 간의 DNA 서열 차이를 알 필요가 있다. 그러나 이는 일반적으로 지도제작 방법에는 필요하지 않다.
본 발명의 방법에 따른 방법은 상기에서 기재된 수확량 관련 형질이 향상된 식물을 초래한다. 상기 형질은 또한 추가적인 수확량 향상 형질, 다른 비생물적 및 생물적 스트레스에 대한 내성, 다양한 외형적 특질 및/또는 생화학적 및/또는 생리적 특질을 변형시키는 형질과 같은 다른 경제적으로 유용한 형질과 조합될 수도 있다.
II . 애넥신 유사( ANN : Annexin - like )
놀랍게도, 애넥신 유사(ANN: Annexin-like) (이후 ANN이라 명명함) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 식물에서의 발현의 조절이 대조구 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질을 가진 식물을 생산한다는 것이 밝혀졌다. 첫 번째 구현예에 따라, 본 발명은 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 식물에서 발현의 조절을 포함하는, 대조구 식물에 비해 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현을 조절 (바람직하게는, 증가)하는 바람직한 방법은 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 식물에의 도입 및 발현이다.
이후 "본 발명의 방법에 유용한 단백질"은 본 발명에서 정의된 ANN 폴리펩티드를 의미한다. 이후 "본 발명의 방법에 유용한 핵산"은 상기 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 것이 가능한 핵산을 의미한다. 식물에 도입되는 핵산은 (따라서 본 발명의 방법 수행에 유용한) 하기에 기술될 유형의 단백질을 암호화하는 임의의 핵산이며, 이후 또한 "ANN 핵산" 또는 "ANN 유전자"라 칭한다.
본 발명에서 정의된 "ANN 폴리펩티드"는 자연형 (즉, 게놈 내에 암호화된 단백질) 내에 적어도 하나, 바람직하게는 2 개의 또는 그 이상의 하기 보존된 시그너처(signature) 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드를 말한다:
시그너처 서열 1 (서열번호 87):
(A/L/V) (M/V/L/I) (L/V/M/I/C)X(W/F) (I/V/M/T/A) (L/P/Y/M/F) (D/E/S/H) (P/A)X(G/S/E/A)RDA
상기에서 위치 4의 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 L, S, I, V, Q, 또는 M 중의 하나일 수 있으며; 위치 10의 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 A, V, P, G, S, T 또는 W 중의 하나일 수 있다.
바람직하게는, 시그너처 서열 1은
(A/L/V) (V/L/I) (L/V/M/I)X(W/F) (V/T/A) (L/Y/M/F) (D/E/S/H) PX (E/A) RDA이다.
시그너처 서열 2 (서열번호 88):
A(F/I/V/C/G)XG(F/R/W/M)G(C/T/V) (D/N) (S/A/T/E)X(T/A/V/L/M) (V/I/L) (I/T)X(I/V/T)L(T/A/G) (H/Q/K) (R/S)
상기에서 위치 3의 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 K, R, Q, S, E, A 또는 M 중의 하나일 수 있으며; 위치 10의 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 T, S, K, N, G, D, A, E, Q, 또는 R 중의 하나일 수 있으며; 위치 14의 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 N, A, R, E, D, S, Q, 중의 하나일 수 있으며,
바람직하게는, 시그너처 서열 2는
A(F/I/V/C/G)XG(W/M)G(T/V) (D/N)EX(A/L/M) (I/L) (I/T)X(I/V/T)L(A/G) (H/Q/K) (R/S)이다.
시그너처 서열 3 (서열번호 89):
(T/S) (D/N/E/T) (D/E/K)XXL(I/T/S/N)R(V/I/A/G) (V/I/F) (V/T/C/S/A) (T/S)R(T/A) (E/D) (I/V/F/L/K/H) (D/S)
상기에서 위치 4의 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 S, T, D, E, G, W, N, K 중의 하나일 수 있으며; 위치 5의 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 T, A, S, M, H, D, G, W 중의 하나일 수 있다.
바람직하게는, 시그너처 서열 3은
(T/S) (D/E/T) (D/E/K) XXL (T/S/N)R(V/I/A/G) (V/I/F) (V/T/C/S/A) (T/S)R(T/A) (E/D) (I/V/F/L/K/H) (D/S)이다.
시그너처 서열 4 (서열번호 90):
(Y/H) (F/Y) (A/E/V/S) (K/E/D) (V/A/L/I) (L/V/I) (R/H/D) X (S/A) (M/I/L)
상기에서 위치 8의 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 K, E, D, T, L, S, Q, R, N, 또는 A 중의 하나일 수 있다.
바람직하게는, 시그너처 서열 4는
(Y/H) (F/Y) (A/E/V/S) (K/E/D) (V/L/I) (L/V/I) (R/D)X(S/A) (I/L)이다.
시그너처 서열 5 (서열번호 91):
(Y/G/K/S) (L/I/M)E(H/E) (D/H) (I/V/L) (G/A/E)
바람직하게는, 시그너처 서열 5는
S(L/I/M)EE(D/H) (I/V/L)A이다.
시그너처 서열 6 (서열번호 92):
(F/L/V/I/T) (I/L/V) (R/Q/Y) (I/V) (F/L/V/I) (T/S/G/A) (E/D/T)RS
바람직하게는, 시그너처 서열 6은
(F/L/V/I/T) (I/L/V) (R/Y) (I/V) (L/V/I) (T/S/G/A) TRS이다.
시그너처 서열 7 (서열번호 93):
Y(R/K/M/E/Q)X(F/T/L/M/I) (L/I) (L/I/V) (S/T/V/A)L(V/I/L/A/M) (G/S)
상기에서 위치 3의 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 T, D, N, K, S, R, A 중의 하나일 수 있다.
ANN 폴리펩티드는 애넥신에 연관되므로, 본 발명의 방법에 유용한 ANN 폴리펩티드는 바람직하게는 또한, 하나 이상의 애넥신 도메인을 갖는다 (Pfam entry PF00191, SMART entry SM00335, InterPro IPR001464, 도 7 및 7 B).
바람직하게는, 상기 폴리펩티드 서열이 도 8에 도시된 것과 같은 계통수 구축에 사용 시 (Cantero 등, Plant Physiol. Biochem. 44,13-24, 2006), 임의의 다른 그룹보다는 서열번호 84 및 서열번호 135로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 ANN 폴리펩티드의 그룹과 클러스터되는 경향이 있다.
용어 "도메인", "모티프" 및 "시그너처 "는 본 발명의 "정의" 섹션에 정의된 바 있다. 도메인 동정을 위한 전문가 데이터베이스, 예를 들면 SMART (Schultz 등 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic 등 (2002) Nucleic Acids Res 30, 242- 244), InterPro (Mulder 등, (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher and Bairoch (1994), generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo 등, Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)), 또는 Pfam (Bateman 등, Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002))이 존재한다. 단백질 서열의 인 실리코 분석용 도구 세트가 ExPASY 프로테오믹스 서버에서 유용하다 (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger 등, ExPASy: proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784-3788 (2003)). 도메인은 또한 서열 정렬과 같은 통상적인 기술을 사용하여서도 동정될 수 있다.
비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 상기 방법은 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA를 포함한다. GAP은 일치되는 수는 최대로, 공백(gaps)의 수는 최소로 되는 두 서열의 전체적인 (즉, 전체 서열에 걸쳐) 정렬을 찾기 위해 Needleman 및 Wunsch ((1970) J MoI Biol 48: 443-453)의 알고리즘을 사용한다. BLAST 알고리즘 (Altschul 등 (1990) J MoI Biol 215: 403-10)은 서열 동일성의 백분율을 계산하여, 두 서열 간에 유사도의 통계적 분석을 수행한다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 NCBI (National Centre for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 상동체는 예를 들면, ClustalW 복수 서열 정렬 알고리즘 (version 1.83)을 사용하여, 디폴트 페어와이즈 정렬 변수(default pairwise alignment parameters) 및 백분율로 스코링(scoring)하는 방법으로 용이하게 동정된다. 유사성 및 동일성의 전체 백분율은 MatGAT 소프트웨어 패키지 (Campanell 등, BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10; 4:29. MatGAT: 단백질 또는 DNA 서열을 사용하여 유사성/동일성 매트릭스를 생성하는 적용)에서 유용한 방법 중의 하나를 사용하여 결정될 수 있다. 당업자에게 명백한 것으로서 보존된 모티프 간에 정렬을 최적화하기 위하여 약간의 수작업의 편집을 행할 수 있다. 더욱이, 상동체 동정을 위하여 전체 길이의 서열을 사용하는 대신에, 특정 도메인이 또한 사용될 수 있다. 서열 동일성 값은 핵산 또는 아미노산 전체 서열에 걸쳐, 또는 선정된 도메인 또는 보존된 모티프(들)에 걸쳐 상기 기재된 프로그램으로 디폴트 매개변수(default parameters)를 사용하여 결정될 수 있다.
더욱이, ANN 폴리펩티드 (적어도 자연형)는 전형적으로 칼슘 결합 활성 및 막 결합능을 갖는다. 막 결합 활성을 측정하는 수단 및 기술은 당업계에 주지되어 있으며, 수단 및 기술에는 막 표면 소수성, 소포 누출 또는 소포 유집에 미치는 영향의 측정이 포함된다. 부가하여, ANN 폴리펩티드는 효소 활성을 나타낸다; 예를 들면, 아라비돕시스 탈리아나의 애넥신 1은 페록시다아제 활성을 나타내는 것으로 보고되었다 (Gorecka 등, Biochem. Biophys. Res. Comm. 336, 868-875, 2005). 상세한 내용은 실시예 19에 제시되어 있다.
본 발명은 서열번호 84의 폴리펩티드 서열을 암호화하는, 서열번호 83으로 나타낸 핵산 서열로 식물을 형질전환함으로써 예시된다. 그러나, 본 발명의 수행은 상기 서열에 제한되지 않으며; 본 발명의 방법은 본 발명에서 정의된 임의의 ANN-암호화 핵산 또는 ANN 폴리펩티드를 사용하여 유리하게 수행될 수 있다
ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 예는 본 발명의 실시예 14의 표 B1에 제시되어 있다. 제시된 핵산이 본 발명의 방법의 수행에 유용하다. 실시예 14의 표 B1에 제시된 아미노산 서열은 서열번호 84로 표시된 ANN 폴리펩티드의 오쏘로그(orthologue) 및 패럴로그(paralogue)의 서열의 예이며, 용어 "오쏘로그" 및 "패럴로그"는 본 발명에서 정의된 바 있다. 추가의 오쏘로그 및 패럴로그는 소위 상호간 블라스트(Reciprocal blast) 탐색을 수행하면 용이하게 동정될 수 있다. 전형적으로 공개적으로 유용한 NCBI 데이터베이스 같은 임의의 서열 데이터베이스에 대해 조회 서열 (예를 들면, 실시예 14의 표 B1에 열거된 서열 이용)을 BLASTing하는 것을 포함하는 첫 번째 BLAST를 포함한다. BLASTN 또는 TBLASTX (표준 디폴트값 사용)은 일반적으로 뉴클레오티드 서열로부터 시작할 때, BLASTP 또는 TBLASTN (표준 디폴트값 사용)은 단백질 서열로부터 시작할 때 사용된다. BLAST 결과를 선택적으로 필터할 수도 있다. 필터한 결과물 또는 필터하지 않은 결과물의 전체 길이의 서열을 조회 서열 (조회 서열은 서열번호 83 또는 서열번호 84, 두 번째 BLAST는 따라서 아라비돕시스 탈리아나 서열과 대조하는 것이다)이 유래한 생물체의 서열과 대조하여 BLAST한다 (두 번째 BLAST). 첫 번째와 두 번째 BLAST의 결과물을 비교한다. 첫 번째 BLAST로부터의 높은 ranking hit이 조회 서열이 유래한 것과 동종으로부터라면 패럴로그가 동정되고, 후에 BLAST back을 하면 이상적으로는 조회 서열이 가장 높은 hit을 보일 것이며 첫 번째 블라스트로부터의 높은 ranking hit이 조회 서열이 유래한 것과 동종으로부터가 아니라면 오쏘로그가 동정되며, 바람직하게는 BLAST back을 하면 가장 높은 hits 중에 조회 서열이 있다.
높은 ranking hits은 낮은 E-값을 가진 것이다. E-값이 낮을수록, 점수가 의미있다 (또는 다른 말로, 우연히 hit이 발견될 기회가 적다). E-값의 계산은 당업계에 주지되어 있다. E-값에다가, 비교는 또한 백분율 동일성에 의하여 점수화된다. 백분율 동일성은 특정 길이에 걸쳐 두 비교되는 핵산 (또는 폴리펩티드) 서열 간에 동일한 뉴클레오티드 (또는 아미노산)의 수를 말한다. 큰 패밀리의 경우, 연관 유전자의 클러스터링을 보여주고 오쏘로그 및 패럴로그를 동정하는데 도움이 되므로 ClustalW 다음에 neighbour joining tree가 사용된다.
핵산 변이체도 본 발명의 방법 수행에 유용할 수 있다. 상기 핵산 변이체의 예는 본 발명의 실시예 14의 표 B1에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 상동체 및 유도체를 암호화하는 핵산을 포함하며, 용어 "상동체" 및 "유도체"는 본 발명에 정의되어 있다. 실시예 14의 표 B1에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 오쏘로그 또는 패럴로그의 상동체 및 유도체를 암호화하는 핵산도 본 발명의 방법에 유용하다. 본 발명의 방법에 유용한 상동체 및 유도체는 상기 상동체 및 유도체가 유래된 변형되지 않은 단백질과 상당한 동일한 생물학적 및 기능적 활성을 가진다.
본 발명의 방법 수행에 유용한 또 다른 핵산 변이체는 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 일부, ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 혼성화되는 핵산, ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 스플라이스 변이체, ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 대립인자 변이체, 및 유전자 셔플링에 의해 얻은 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 변이체를 포함한다. 용어 혼성화되는 서열, 스플라이스 변이체, 대립인자 변이체 및 유전자 셔플링은 본 발명에 기재된 바 있다.
본 발명의 방법의 수행은 전장 핵산 서열의 사용에 의존하지 않으므로, ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 전장 핵산일 필요는 없다. 본 발명에서는, 실시예 14의 표 B1에 제시된 핵산 서열 중 임의의 하나의 일부, 또는 실시예 14의 표 B1에 제시된 임의의 아미노산 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 암호화하는 핵산의 일부를 식물에 도입 및 발현하는 것을 포함하는, 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
핵산의 일부분은 예를 들면, 핵산에 하나 이상의 결실을 만들어서 제조될 수 있다. 그 부분은 분리된 형태로 사용될 수 있거나, 또는 예를 들면, 몇 가지 활성을 조합한 단백질을 생산하기 위하여 다른 암호화 (또는 비암호화) 서열에 융합될 수도 있다. 다른 암호화 서열에 융합될 경우, 해독으로 생성된 결과적인 폴리펩티드는 단백질 부분에 대해 예측된 것보다 클 것이다.
본 발명의 방법에 유용한 일부분은 본 발명에 정의된 ANN 폴리펩티드를 암호화하며, 실시예 14의 표 B1에 제시된 아미노산 서열과 상당한 동일한 생물학적 활성을 가진다. 바람직하게는, 상기 일부분은 실시예 14의 표 B1에 제시된 핵산 중의 임의의 하나의 일부분, 또는 실시예 14의 표 B1에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 오쏘로그 또는 패럴로그를 암호화하는 핵산의 일부분이다. 바람직하게는 상기 일부분은 적어도 길이 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 개의 연속적인 뉴클레오티드이며, 상기 연속적인 뉴클레오티드는 실시예 14의 표 B1에 제시된 핵산 서열 중 임의의 하나, 또는 실시예 14의 표 B1에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 오쏘로그 또는 패럴로그를 암호화하는 핵산일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 일부분은 서열번호 83의 핵산의 일부분이다. 바람직하게는, 상기 일부분은 도 8에 도시된 바와 같은 계통수 구축에 사용 시, 임의의 다른 그룹보다는 서열번호 84 및 서열번호 135로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 ANN 그룹과 클러스터되는 경향이 있는 아미노산 서열을 암호화한다.
본 발명의 방법에 유용한 또 다른 핵산 변이체는 감소된 스트린전시 조건하에서, 바람직하게는 스트린전트 조건하에서, 본 발명에서 정의된 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 본 발명에서 정의된 일부와 혼성화가 가능한 핵산이다.
본 발명에 따라, 실시예 14의 표 B1에 제시된 핵산 중 임의의 하나와 혼성화가 가능한 핵산, 또는 실시예 14의 표 B1에 제시된 임의의 핵산 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 암호화하는 핵산 서열과 혼성화가 가능한 핵산의 식물에의 도입 및 발현을 포함하는, 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 유용한 혼성화 서열은 본 발명에서 정의된 ANN 폴리펩티드를 암호화하며, 실시예 14의 표 B1에 제시된 아미노산 서열과 상당한 동일한 생물학적 활성을 가진다. 바람직하게는, 상기 혼성화 서열은 실시예 14의 표 B1에 제시된 핵산 중의 임의의 하나에 또는 상기 정의된 일부인 임의의 이들 서열 중 일부에, 또는 실시예 14의 표 B1에 제시된 임의의 아미노산 서열 중의 임의의 하나의 오쏘로그 또는 패럴로그를 암호화하는 핵산과 혼성화가 가능하다. 가장 바람직하게는, 상기 혼성화 서열은 서열번호 83으로 표시된 핵산에 또는 그 일부에 혼성화가 가능하다.
바람직하게는, 상기 혼성화 서열은 도 8에 도시된 것과 같은 계통수 구축에 사용 시 임의의 다른 그룹보다 서열번호 84 및 서열번호 135로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 ANN 폴리펩티드의 그룹과 클러스터되는 경향이 있는 아미노산 서열을 암호화한다.
본 발명의 방법에 유용한 또 다른 핵산 변이체는 상기 정의된 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 스플라이스 변이체이다.
본 발명에 따라, 실시예 14의 표 B1에 제시된 임의의 핵산의 스플라이스 변이체 또는 실시예 14의 표 B1에 제시된 임의의 아미노산 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 암호화하는 핵산의 스플라이스 변이체의 식물에의 도입 및 발현을 포함하는 식물에서의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
바람직한 스플라이스 변이체는 서열번호 83에 제시된 핵산의 스플라이스 변이체, 또는 서열번호 84의 오쏘로그 또는 패럴로그를 암호화하는 핵산의 스플라이스 변이체이다. 바람직하게는, 스플라이스 변이체에 의해 암호화된 아미노산 서열은 도 8에 제시된 것과 같은 계통수 제작 시 임의의 다른 그룹보다는 서열번호 84 및 서열번호 135로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 ANN 폴리펩티드 그룹과 클러스터하는 경향이 있다.
본 발명의 방법 수행에 유용한 또 다른 핵산 변이체는 상기 정의된 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 대립인자 변이체이며, 대립인자 변이체는 본 발명에서 정의된 바 있다.
본 발명에 따라, 실시예 14의 표 B1에 제시된 임의의 핵산의 대립인자 변이체의 식물에의 도입 및 발현, 또는 실시예 4의 표 B1에 제시된 임의의 아미노산 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 암호화하는 핵산의 대립인자 변이체의 식물에의 도입 및 발현을 포함하는 식물에서의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 유용한 대립인자 변이체는 서열번호 84의 ANN 폴리펩티드 및 실시예 14의 표 B1에 제시된 임의의 아미노산 서열과 상당한 동일한 생물학적 활성을 가진다. 대립인자 변이체는 자연계에 존재하며, 본 발명의 방법은 상기 자연적인 대립인자의 사용을 포함한다. 바람직하게는, 대립인자 변이체는 서열번호 83의 대립인자 변이체 또는 서열번호 84의 오쏘로그 또는 패럴로그를 암호화하는 핵산의 대립인자 변이체이다. 바람직하게는, 대립인자 변이체에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 도 8과 같은 계통수 구축에 사용 시 임의의 다른 그룹과 보다는 서열번호 84 및 서열번호 135으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 ANN 폴리펩티드와 클러스터하는 경향이 있다.
유전자 셔플링 또는 방향진화는 또한 상기 정의된 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 변이체 생성에 사용될 수 있으며, 용어 "유전자 셔플링"은 본 발명에서 정의된 바 있다.
본 발명에 따라, 실시예 14의 표 B1에 제시된 핵산 서열 중의 임의의 하나의 변이체의 식물에의 도입 및 발현을 포함하는, 또는 실시예 14의 표 B1에 제시된 임의의 아미노산 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 암호화하는 핵산의 변이체의 식물에의 도입 및 발현을 포함하는 식물에서의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공하며, 상기 변이체 핵산은 유전자 셔플링에 의해 얻어진다.
바람직하게는 유전자 셔플링에 의해 얻어진 변이체 핵산에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 도 8에 제시된 것과 같은 계통수 구축에 사용 시 임의의 다른 그룹보다 서열번호 84 및 서열번호 135로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 ANN 폴리펩티드의 그룹과 클러스터되는 경향이 있다.
더욱이, 핵산 변이체는 또한 자리지정 돌연변이유발에 의해서도 얻을 수 있다. 몇가지 방법이 자리지정 돌연변이유발를 달성하는데 유용하며, 가장 흔한 것은 PCR에 근거한 방법이다 (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds).
ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 임의의 자연적 또는 인위적인 출처로부터 유래될 수 있다. 핵산은 고의적인 인간의 조작으로 조성 및/또는 게놈 환경에 있어서 자연형태로부터 변형될 수 있다. 바람직하게는 ANN 폴리펩티드 암호화 핵산은 식물로부터, 더욱 바람직하게는 쌍자엽 식물로부터, 더욱 바람직하게는 십자화과(Brassicaceae)로부터, 가장 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 유래이다.
본 발명의 방법의 수행은 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물을 제공한다. 특히 본 발명의 방법의 수행은 대조구 식물에 비하여 증가된 수확량, 특히 증가된 종자 수확량을 갖는 식물을 제공한다. 용어 "수확량" 및 "종자 수확량"은 본 발명의 "정의" 섹션에 보다 상세하세 기재되어 있다.
본 발명에서 향상된 수확량 관련 형질에 대한 기준은 (수확 가능한) 지상부 및/또는 (수확 가능한) 지하부를 포함하여 하나 이상의 식물체의 일부분의 생물량(biomass) (중량)의 증가를 의미한다. 특히, 상기 수확 가능한 부분은 종자이며, 본 발명의 방법의 수행으로 대조구 식물의 종자 수확량에 비해 증가된 종자 수확량을 갖는 식물이 된다.
옥수수를 예로 들면, 수확량 증가는 다음 중의 하나 이상으로 표시된다: 헥타르 또는 에이커당 식물체의 수 증가, 식물체당 이삭 (열매) 수의 증가, 낱알 줄의 수, 줄당 낱알의 수, 낱알 중량, 천립중량, 열매 길이/직경의 증가, 종자 충만도 (충만된 종자 수/전체 종자 수 x 100)의 증가. 벼를 예로 들면, 수확량 증가는 다음 중의 하나 이상의 증가로 표시된다: 헥타르 또는 에이커당 식물체의 수, 식물체당 원추화서의 수, 원추화서당 작은 이삭의 수, 원추화서당 소화의 수 (일차 원추화서에 대한 충만된 종자의 수의 비율로 표시된다), 종자 충만도 (충만된 종자 수/전체 종자 수 x 100)의 증가, 천립중량의 증가.
본 발명은 대조구 식물에 비하여 수확량을, 특히 식물의 종자 수확량을 증가시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명에서 정의된 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 식물에서의 발현을 조절하여, 바람직하게는 발현을 증가시키는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 형질전환 식물은 수확량이 증가하므로, 이들 식물은 생활사 중의 해당 단계에서 대조구 식물의 생장 속도에 비하여 증가된 생장 속도를 나타낼 것 같다 (생활사 중 적어도 일부에서).
증가된 생장 속도는 식물체의 하나 이상의 부분 (종자 포함)에 특이적이거나, 또는 상당한 전체 식물에 걸쳐서일 수도 있다. 증가된 생장 속도를 가진 식물은 보다 짧은 생활사를 가질 수 있다. 식물의 생활사는 건조된 성숙된 종자로부터 식물체가 출발 물질과 유사한 건조된 성숙한 종자를 생산하는 단계까지 자라는데 필요한 시간을 의미하는 것일 수 있다. 상기 생활사는 초기 활력, 생장 속도, 녹색 지수, 개화 시기 및 종자 성숙 속도와 같은 요인에 의해 영향을 받을 수 있다. 증가된 생장 속도는 식물의 생활사 중의 하나 이상의 단계에서 또는 상당한 전체 식물 생활사 중에 나타날 수 있다. 식물의 생활사 중의 초기 단계 중에 증가된 생장 속도는 향상된 활력을 반영한다. 생장 속도의 증가는 그렇지 않았으면 가능했을 시기보다 식물을 늦게 파종하고/하거나 이르게 수확하게 함으로써 식물의 수확 주기를 변경할 수도 있다 (비슷한 효과는 보다 이른 개화시기로 얻을 수 있다). 만일 생장 속도가 충분히 증가하면 동일 식물 종의 잇따른 파종이 가능하다 (예를 들면, 한 생장기간 내에 벼의 파종 및 수확 후에 잇따라 벼의 파종 및 수확). 유사하게 만일 생장 속도가 충분히 증가하면 다른 식물 종의 잇따른 파종이 가능하다 (예를 들면, 옥수수 식물의 파종 및 수확 후에 예를 들면, 대두, 감자 또는 임의의 다른 적절한 식물의 파종 및 선택적 수확). 일부 작물의 경우 동일한 근경으로부터 부가적인 횟수의 수확도 가능하다. 식물의 수확 주기 변경은 에이커당 년간 생물량 생산의 증가로 이끈다 ((말하자면 일년 내) 임의의 식물을 재배하여 수확하는 횟수의 증가로 인하여). 작물 생육에 대한 영역 제한은 이식기에(초기 시기) 또는 수확기에(후기 시기) 흔히 불리한 환경 조건에 의해 결정되므로, 생장 속도 증가는 야생형에 비하여 보다 넓은 지리적 지역에 형질전환 식물이 재배되게 한다. 상기 불리한 조건은 수확 주기가 짧아지면 피할 수 있다. 생장 속도는 생장 곡선으로부터 다양한 매개변수를 유도함으로써 결정될 수 있으며, 상기 매개변수는 T-Mid (식물이 최대 크기의 50%에 이를 때까지 걸린 시간) 및 T-90 (식물이 최대 크기의 90%에 이를 때까지 걸린 시간)이다.
본 발명의 바람직한 특징에 따라, 본 발명의 방법의 수행으로 대조구 식물에 비해 생장 속도가 증가된 식물을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따라 식물의 생장 속도를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 정의된 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 식물에서의 발현의 조절, 바람직하게는 발현의 증가를 포함한다.
식물이 스트레스가 없는 조건 하에 있든지 식물이 대조구 식물에 비하여 다양한 스트레스에 노출되든지 간에 수확량 및/또는 생장 속도의 증가는 있다. 식물은 전형적으로 보다 느리게 성장함으로써 스트레스에 대한 노출에 반응한다. 심각한 스트레스 하에서 식물의 생장이 중단되기도 한다. 다른 한편으로 본 발명에서 순한 스트레스는 식물이 노출됨으로써 생장을 재개하는 능력 없이 생장을 중단하게 하지 않는 임의의 스트레스로 정의된다. 본 발명이 의미하는 순한 스트레스는 스트레스 받은 식물의 생장 감소가 스트레스가 없는 조건하의 대조구 식물에 비하여 40%, 35% 또는 30% 미만, 바람직하게는 25%, 20% 또는 15% 미만, 더욱 바람직하게는 14%, 13%, 12%, 11% 또는 10% 미만이다. 실제로는 농업상의 진척 (관개, 시비, 살충제 처리)으로 인하여 심각한 스트레스가 재배 작물에 가해지지는 않는다. 결과적으로 순한 스트레스에 의해 유도되는 손상된 생장은 흔히 농업에서는 바람직하지 않은 특징이다. 순한 스트레스는 식물이 노출되는 매일의 생물적 및/또는 비생물적 (환경) 스트레스이다. 비생물적 스트레스는 가뭄 또는 과도한 수분, 혐기적 스트레스, 염분 스트레스, 화학적 독성, 산화적 스트레스 및 더운, 추운 또는 결빙 온도에 의한 것이다. 비생물적 스트레스는 수분 스트레스 (특히 가뭄으로 인한)로 인한 삼투 스트레스, 염분 스트레스, 산화적 스트레스 또는 이온 스트레스이다. 생물적 스트레스는 전형적으로 세균, 바이러스, 진균 및 곤충과 같은 병원균에 의해 야기된 스트레스이다.
특히, 본 발명의 방법은 대조구 식물에 비하여 증가된 수확량을 갖는 식물을 제공하기 위하여, 스트레스가 없는 조건하에서 또는 순한 가뭄 조건하에서 수행될 수 있다. Wang 등 (Planta (2003) 218: 1-14)에 보고된 바와 같이, 비생물적 스트레스는 일련의 형태적, 생리적, 생화학적 및 분자적 변화를 이끌어 식물 생장 및 생산성에 불리한 영향을 미친다. 가뭄, 염분, 극단적인 온도 및 산화적 스트레스는 상호 연관된 것으로 알려져 있으며, 유사한 기작을 통하여 생장 및 세포 손상을 유도할 수 있다. Rabbani 등 (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767)은 특히 가뭄 스트레스와 고염도 스트레스 간에 고도의 "혼선"을 기재하고 있다. 예를 들면, 가뭄 및/또는 염분은 일차적으로 삼투 스트레스로 나타나서 세포 내 항상성 및 이온 분포를 파괴한다. 흔히 고온 또는 저온을 동반하는 산화적 스트레스, 염분 또는 가뭄 스트레스는 기능적 및 구조 단백질의 변성을 야기한다. 결국 이들 다양한 환경적 스트레스는 흔히 유사한 세포 신호전달 경로 및 스트레스 단백질 생산, 항산화제 상향조절, 친화성 용질 축적 및 생장 정지 같은 세포 반응을 활성화한다. 본 발명에서 사용된 용어 "스트레스가 없는" 조건은 식물의 최적 생장을 허용하는 환경 조건이다. 당업자는 주어진 위치에서 정상적인 토양 조건 및 기후 조건을 인식하고 있다.
본 발명의 방법의 수행으로 스트레스가 없는 조건하에서 또는 순한 가뭄 스트레스 조건하에서 자란 식물이 비교되는 조건하에서 자란 적절한 대조구 식물에 비해 수확량이 증가된다. 따라서, 본 발명에 따라 스트레스가 없는 조건하에서 또는 순한 가뭄 스트레스 조건하에서 키운 식물의 수확량을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 식물에서의 발현의 증가를 포함한다.
본 발명의 방법 수행은 양분결핍 조건 하에서, 특히 질소 결핍 조건 하에서 키운 식물이 동등한 조건 하에서 키운 대조구 식물에 비하여 증가된 수확량을 갖게 한다. 따라서, 본 발명에 있어서 양분결핍 조건 하에서 키운 식물의 수확량을 증가시키는 방법을 제공하며, 그 방법은 ANN 폴리펩티드 암호화 핵산의 식물에서의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 양분결핍은 무엇보다도 질소, 인산염 및 다른 인-함유 화합물, 칼륨, 칼슘, 카드뮴, 마그네슘, 망간, 철 및 붕소 같은 양분의 부족의 결과이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법으로 얻을 수 있는 식물 또는 그의 일부분 (종자 포함)을 포함한다. 식물 또는 그의 일부분은 상기 정의된 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 트랜스진을 포함한다.
본 발명은 또한 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 식물로의 도입 및/또는 발현을 하게 하는 유전자 구축물 및 벡터를 제공한다. 유전자 구축물은 상업적으로 유용하고, 식물로의 형질전환에 적절하며, 형질전환된 세포에서 목적 유전자의 발현에 적절한 벡터에 삽입될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 유용한 있어 상기 정의된 유전자 구축물의 용도를 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 하기를 포함하는 구축물을 제공한다:
(a) 상기 정의된 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
(b) (a)의 핵산 서열의 발현을 이끌 수 있는 하나 이상의 조절 서열; 및 선택적으로
(c) 전사 종결 서열.
바람직하게는, ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 상기 정의된 바와 같다. 용어 "조절 서열" 및 "전사 종결 서열"은 본 발명에서 정의된 바와 같다.
식물은 상기 기재된 임의의 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된다. 당업자는 목적 서열을 함유하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환, 선발 및 증식시키기 위하여 벡터 내에 존재해야 하는 유전적 요소를 잘 알고 있다. 목적 서열은 하나 이상의 조절 서열 (적어도 프로모터)에 작동가능하게 연결된다.
유리하게, 자연적이든 인공적이든 임의의 유형의 프로모터가 핵산 서열의 발현을 추진하기 위하여 사용될 수 있다. 구성적 프로모터가 본 발명의 방법에 유용한 특히 유용하다. 다양한 유형의 프로모터에 관해 "정의"에 정의되어 있다. 또한 본 발명의 방법에 유용한 것은 녹색 조직 특이적 프로모터이다.
본 발명의 적용범위가 서열번호 83으로 표시된 ANN 폴리펩티드 암호화 핵산에만 제한된 것이 아니며, 본 발명의 적용범위가 구성적 프로모터에 의한 구동 시, 또는 녹색 조직 특이적 프로모터에 의한 구동 시 ANN 폴리펩티드 암호화 핵산의 발현에 제한된 것이 아님은 분명하다.
구성적 프로모터는 바람직하게는 GOS2 프로모터, 더욱 바람직하게는 벼 GOS2 프로모터이다. 더 바람직하게는 구성적 프로모터는 사실상 서열번호 94에 유사한 핵산서열로 표시된 것이고, 가장 바람직하게는 구성적 프로모터는 서열번호 94로 표시된 것이다. 구성적 프로모터의 추가의 예는 본 발명의 "정의" 섹션의 표 2a에 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 특징에 있어서, ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 녹색 조직 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 녹색 조직 특이적 프로모터는 바람직하게는 익스팬신(expansin) 프로모터, 더욱 바람직하게는 벼 유래 익스팬신(expansin) 프로모터, 더욱 바람직하게는 서열번호 95에 사실상 유사한 핵산서열로 표시된 녹색 조직 특이적 프로모터, 가장 바람직하게는 서열번호 95로 표시된 녹색 조직 특이적 프로모터이다. 녹색 조직 특이적 프로모터의 추가적인 예는 본 발명 "정의" 섹션의 표 2g에 있다.
선택적으로, 하나 이상의 종결신호 서열이 식물에 도입된 구축물에 사용될 수 있다. 부가적인 조절 인자는 해독뿐 아니라 전사 인핸서를 포함한다. 본 발명을 수행함에 있어 사용하기에 적절한 종결신호 및 인핸서 서열이 당업자에게 공지되어 있다. 세포질 내에 축적되는 성숙한 메시지의 양 증가를 위하여 "정의" 섹션에 기재된 바와 같이 인트론 서열이 또한 5' 비해독 영역 (UTR) 또는 암호화 서열에 첨가될 수 있다. 다른 조절 서열 (프로모터, 인핸서, 사일런서, 인트론 서열, 3'UTR 및/또는 5'UTR 영역 외에)은 단백질 및/또는 RNA 안정화 인자들일 수 있다. 상기 서열은 알려져 있거나, 당업자가 쉽게 얻을 수 있다.
본 발명의 유전자 구축물은 특정 세포 유형에서 유지 및/또는 복제에 필요한 복제 서열의 원점을 포함한다. 한 예는 에피좀 유전자 요소 (예를 들면, 플라스미드 또는 코스미드 분자)로서 유전자 구축물이 세균 세포 내에 유지되어야 할 때이다. 바람직한 복제 원점은 f1-ori 및 colE1를 포함하나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 사용된 핵산 서열이 성공적으로 전달되었는지 검출 및/또는 이들 핵산을 포함하는 형질전환 식물의 선발을 위해서 마커 유전자 (또는 리포터 유전자)를 사용하는 것이 유리하다. 따라서, 유전자 구축물은 선택적으로 선발 마커 유전자를 포함한다. 선발 마커는 본 발명의 "정의" 섹션에서 더 상세히 기재된다.
식물 세포로 핵산의 안정적인 또는 일시적인 통합 시, 소수의 세포만이 외래 DNA를 취하여, 필요 시 사용된 발현벡터 및 사용된 감염 기술에 따라 게놈 내로 이를 통합한다는 것이 알려져 있다. 통합체를 동정하고 선발하기 위하여, 선발 마커를 암호화하는 유전자 (상기 기재된 것과 같은)가 보통 목적 유전자와 함께 숙주 세포에 도입된다. 이들 마커는 예를 들면 이들 마커 유전자가 예를 들면 전통적인 방법에 의한 결실에 의하여 기능이 없는 돌연변이체에 사용될 수 있다. 더욱이, 선발 마커를 암호화하는 핵산분자는 본 발명의 또는 본 발명의 방법에 사용된 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 동일한 벡터 또는 그 외 별개 백터 상에서 숙주 세포로 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정적으로 감염된 세포는 예를 들면 선발에 의해서 동정될 수 있다 (예를 들면, 통합된 선발 마커를 갖는 세포는 생존하는 반면, 다른 세포는 사멸한다). 마커 유전자는 형질전환 세포에서 더 이상 필요하지 않으면 절단되거나 제거될 수 있다. 마커 유전자 제거 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 상기 정의 섹션에 기재되어 있다.
본 발명은 상기에서 정의된 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 식물에서의 도입 및 발현을 포함하는, 대조구 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질을 가진 형질전환 식물을 제조하는 방법을 제공한다.
더욱 상세하게, 본 발명은 증가된 향상된 수확량 관련 형질, 특히 증가된 종자 수확량을 가진 형질전환 식물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(i) ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 식물 또는 식물 세포에의 도입 및 발현 및
(ii) 식물의 생장 및 발달을 촉진하는 조건하에서 식물 세포를 배양.
상기 (i)의 핵산은 본 발명에서 정의된 ANN 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 임의의 핵산일 수 있다.
상기 핵산은 식물 세포로 또는 식물체 자체 (조직, 기관, 또는 식물체의 임의의 다른 부분으로 도입 포함)로 직접적으로 도입될 수 있다. 본 발명의 바람직한 특징에 따르면, 핵산은 바람직하게는 형질전환에 의하여 식물체 내로 도입된다. 용어 "형질전환"은 본 발명의 "정의" 섹션에 보다 더 상세하게 기재되어 있다.
유전적으로 변형된 식물 세포는 당업자에게 친숙한 모든 방법을 통해서 재분화될 수 있다. 적절한 방법은 상기 언급된 S.D. Kung 및 R. Wu, Potrykus 또는 Hofgen 및 Willmitzer의 문헌에 있다.
일반적으로 형질전환 후, 식물 세포 또는 세포 집단은 목적 유전자와 함께 전달된 식물에서 발현 가능한 유전자에 의해 암호화되는 하나 이상의 마커의 존재에 대하여 선발되어, 형질전환된 물질은 온전한 식물로 재분화된다. 형질전환 식물을 선발하기 위하여, 형질전환에서 얻은 식물 재료는 대체로 선택적 조건 하에 두어, 형질전환 식물이 형질전환되지 않은 식물과 구분될 수 있게 한다. 예를 들면, 상기 기재된 방식으로 얻은 종자를 심고, 초기 생장기간 후, 분무에 의해 적절한 선발을 하게 된다. 추가의 가능한 방법으로는, 종자를 멸균하여 적절한 선발물질을 사용하여 한천판에 키우면, 형질전환된 종자만 식물체로 자랄 수 있다. 다르게는, 형질전환 식물은 상기 기재된 것과 같은 선발 마커의 존재에 대하여 가려진다.
DNA 전달 및 재분화에 이어, 형질전환된 것으로 추정되는 식물은 또한 예를 들면, 목적 유전자의 존재, 카피 수 및/또는 게놈 조직에 대하여 서던 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 다르게는 또는 부가적으로, 새로이 도입된 DNA의 발현수준을 노던 및/또는 웨스턴 분석으로 측정할 수 있으며, 두 기술은 당업자에게 주지되어 있다.
생성된 형질전환된 식물은 클론 번식 또는 전통적인 육종 기술 같은 다양한 수단으로 증식될 수 있다. 예를 들면, 제1세대 (또는 T1) 형질전환 식물은 자가교배되고, 동형접합 제2세대 (또는 T2) 형질전환체가 선발되어, T2 식물은 전통적인 육종 기술로 더 증식된다. 생성된 형질전환된 생물체는 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들면, 형질전환된 세포 및 형질전환되지 않은 세포의 키메라; 클론 형질전환체 (예를 들면, 발현 카세트를 함유하도록 형질전환된 모든 세포); 형질전환된 및 형질전환되지 않은 조직의 그라프트(graft) (예를 들면, 식물에 있어 형질전환되지 않은 접순에 접목된 형질전환된 대목)일 수 있다.
본 발명은 분명히 본 발명에서 기재된 임의의 방법으로 생산된 임의의 식물 세포 또는 식물 및 모든 식물 부분 및 그의 번식체로 확장된다. 본 발명은 상기 언급한 임의의 방법으로 생산된 일차 형질전환된 또는 감염된 세포, 조직, 기관 또는 전체식물의 자손을 포함하기 위해 더 확장될 수 있으며, 자손이 본 발명에 따른 방법으로 양친이 생산한 것과 동일한 유전형적 및/또는 표현형적 특징(들)을 나타내는 것만이 요구된다.
본 발명은 또한 상기에 정의된 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 숙주 세포는 식물 세포이다. 본 발명의 방법에 사용된 핵산 또는 벡터, 발현 카세트 또는 구축물 또는 벡터에 대한 숙주 식물은 원칙적으로 유리하게, 본 발명의 방법에 사용된 폴리펩티드를 합성하는 것이 가능한, 모든 식물이다.
본 발명의 방법은 유리하게 임의의 식물에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법에 특히 유용한 식물은 수퍼패밀리 비리디플란태 (Viridiplantae)에 속하는 모든 식물, 특히 사료 또는 마초용 콩, 관상 식물, 식량 작물, 교목 또는 관목을 포함하는 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함한다. 본 발명의 바람직일 구현예에 있어서, 식물은 작물이다. 작물 식물의 예는 대두, 해바라기, 캐놀라, 알팔파, 유채, 목화, 토마토, 감자 및 담배를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 식물은 단자엽 식물이다. 단자엽 식물의 예는 사탕수수를 포함한다. 더욱 바람직하게는 식물은 곡물이다. 곡물의 예는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 기장, 라이밀, 호밀, 수수 및 귀리를 포함한다.
본 발명은 또한 종자, 잎, 열매, 꽃, 줄기, 지하경, 괴경 및 인경 같은 식물의 수확 가능한 부분에까지 확장되나, 이 부분에 제한되지는 않는다. 본 발명은 더욱이 건조 펠렛 또는 분말, 기름, 지방 및 지방산, 전분 또는 단백질 같은 식물의 수확 가능한 부분으로부터 바람직하게는 직접적으로 유래된 생산물에 관련된다.
본 발명의 바람직한 특징에 따라, 조절된 발현은 증가된 발현이다. 핵산 또는 유전자, 또는 유전자 산물의 발현을 증가시키는 방법은 당업계에 잘 문헌화되어 있으며, 정의 섹션에 예가 제시되어 있다.
상기 언급된 바와 같이, ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현을 조절하는, 바람직하게는 증가시키는 바람직한 방법은 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 식물로의 도입 및 발현이나 상기 방법의 효과는 즉, 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법은 T-DNA 활성화 태깅, 틸링(TILLING), 상동 재조합을 포함하여 다른 잘 알려진 기술을 사용하여 행할 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 기술은 정의 섹션에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 기재된 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 용도, 및 식물의 임의의 전술한 수확량 관련 형질을 향상시키는 상기 ANN 폴리펩티드의 용도를 포함한다.
본 발명에서 기재된 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 ANN 폴리펩티드 그 자체는 ANN 폴리펩티드 암호화 유전자에 유전적으로 연결된 DNA 마커가 동정된 육종 프로그램에 용도가 있다. 핵산/유전자, 또는 ANN 폴리펩티드 그 자체는 분자 마커를 정의하는데 사용될 수 있다. 이 DNA 또는 단백질 마커는 상기 본 발명의 방법에 정의된 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물을 선발하는 육종 프로그램에 사용된다.
ANN 폴리펩티드 암호화 핵산/유전자의 대립인자 변이체는 또한 마커 보조 육종 프로그램에 사용된다. 상기 육종 프로그램은 때때로 예를 들면, EMS 돌연변이 유발을 사용하여 식물에 돌연변이 유발 처리로 대립인자 변이의 도입을 필요로 하며 다르게는, 그 프로그램은 자연발생적으로 생성된 "자연적인" 대립인자 변이체의 수집물로부터 시작될 수도 있다. 그러면 대립인자 변이체의 동정은 예를 들면, PCR로 한다. 문제되는 서열의 증가된 수확량을 제공하는 우수한 대립인자 변이체의 선발 단계가 잇따른다. 선발은 전형적으로 문제되는 서열의 다른 대립인자 변이체를 함유하는 식물의 생장 능력을 관찰함으로써 이루어진다. 생장 능력은 온실 또는 야외에서 관찰할 수 있다. 추가적으로 선택 가능한 단계는 우수한 대립인자 변이체가 동정된 식물과 또 다른 식물의 교배를 포함한다. 이는 예를 들면, 관심을 유발하는 표현형적 특징의 조합을 만드는데 사용될 수 있다.
ANN 폴리펩티드 암호화 핵산은 또한 이 유전자에 대한 유전자 및 물리지도 제작용 탐침으로서 및 그 유전자에 연관된 형질에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 상기 정보는 원하는 표현형을 갖는 라인 개발을 위한 식물 육종에 유용하다. 상기 ANN 폴리펩티드 암호화 핵산 사용에는 적어도 길이 15 뉴클레오티드의 핵산 서열만이 필요하다. ANN 폴리펩티드 암호화 핵산은 RFLP (restriction fragment length polymorphism) 마커로 사용될 수 있다. 제한효소 절단된 식물 게놈 DNA의 서던 블럿 (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, Laboratory Manual)에 ANN 폴리펩티드 암호화 핵산이 프로브로 사용된다. 결과로 나온 밴드 분포 양상으로 유전자지도 제작을 위하여 MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174-181) 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 유전적 분석을 하게 된다. 또한, 핵산 서열은 제한된 유전적 교배의 양친 및 자손을 포함하는 개체들의 제한 효소 처리된 게놈 DNAs의 서던 블럿에 탐침으로 사용될 수 있다. DNA 다형의 분리를 기록하여, 이 집단을 이용하여 이전에 얻었던 유전자 지도상에 ANN 폴리펩티드 암호화 핵산의 위치 계산에 사용한다 (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331).
유전자 지도 제작에 사용하기 위한 식물 유전자 유래 탐침의 생산 및 사용은 [Bematzky and Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37-41]에 기재되어 있다. 수많은 공개문헌이 상기 개설된 방법론 또는 이의 변형을 사용하여 특정 cDNA 클론의 유전자 지도 제작을 기술한다. 예를 들면, F2 이종교배 개체군, 역교배 개체군, 무작위 교배 개체군, 근동질유전자계통, 및 다른 세트의 개체가 유전자 지도 제작에 사용될 수 있다. 상기 방법론은 당업자에게 주지되어 있다.
핵산 탐침은 또한 물리 지도에 제작 사용될 수 있다 (즉, 물리 지도상에 서열의 위치; Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, 인용된 문헌 참조).
또 다른 구현예에 있어서, 핵산 탐침은 직접적인 형광 인 시투 혼성화 (fluorescence in situ hybridisation, FISH) 지도 제작에 사용될 수 있다 (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). 비록 현 FISH 지도 제작 방법이 큰 클론에 유리하지만 (수 kb 내지 몇 백 kb; Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13-20), 감도가 향상되면 더욱 짧은 탐침으로 FISH 지도 제작이 가능해진다.
유전자지도 및 물리지도 작성을 위한 핵산증폭에 근거한 다양한 방법이 핵산 서열을 사용하여 수행될 수 있다. 예는 대립인자 특이적 증폭 (allele-specific amplification, Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), CAPS (polymorphism of PCR-amplified fragments; Sheffield 등 (1993) Genomics 16:325-332), 대립인자 특이적 라이게이션 (allele-specific ligation, Landegren 등 (1988) Science 241:1077-1080), 뉴클레오티드 신장 반응 (nucleotide extension reactions, Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), Radiation Hybrid Mapping (Walter et al . (1997) Nat. Genet. 7:22-28) 및 Happy Mapping (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807)을 포함한다. 이들 방법을 위해서 증폭 반응 또는 프라이머 연장 반응에 사용하기 위한 프라이머 쌍을 고안하고 제작하기 위해 핵산 서열이 사용된다. 상기 프라이머의 고안은 당업자에게는 주지되어 있다. PCR에 근거한 유전자 지도 제작에 사용하는 방법에서는 핵산 서열에 해당하는 영역에서 교배 양친 간의 DNA 서열 차이를 알 필요가 있다. 그러나 이는 일반적으로 지도제작 방법에는 필요하지 않다.
본 발명의 방법에 유용한 따라, 대조구 식물에 비해 상기에서 기재된 수확량 관련 형질이 향상된 식물이 초래된다. 상기 형질은 또한 추가적인 수확량 향상 형질, 다른 비생물적 및 생물적 스트레스에 대한 내성, 다양한 외형적 특질 및/또는 생화학적 및/또는 생리적 특질을 변형시키는 형질과 같은 다른 경제적으로 유용한 형질과 조합될 수도 있다.
조항
1. 2-Cys PRX(2- Cysteine peroxiredoxin)를 암호화하는 핵산 서열의 식물 뿌리에서의 발현을 조절하는, 바람직하게는 증가시키는 단계 및 선택적으로 증가된 수확량을 갖는 식물을 선발하는 단계를 포함하는 대조구 식물에 비해 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법으로서, 상기 2-Cys PRX 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단으로: (1) 색소체 운반 펩티드(transit peptide); 및 (2) 2-Cys PRX 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 조항1에 있어서, 상기 2-Cys PRX 폴리펩티드는 부가적으로 하기 중 하나 또는 양자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(i) 서열번호 77로 표시된 모티프 1, 또는 서열번호 77에 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 모티프; 또는
(ii) 서열번호 78로 표시된 모티프 2, 또는 서열번호 78에 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 모티프.
3. 조항1 또는 조항2에 있어서, 상기 2-Cys PRX 폴리펩티드는, 도 3에 도시된 것과 같은 계통수 구축에 이용 시, 임의의 다른 PRX 클레이드(clade)보다는 서열번호 2로 표시된 폴리펩티드 서열을 포함하는 2-Cys PRX 폴리펩티드 클레이드와 클러스터되는 경향이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 조항1 내지 조항3 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 2-Cys PRX 폴리펩티드는 서열번호 2로 표시된 2-Cys PRX 폴리펩티드 또는 본 발명의 표 A1에 제시된 임의의 폴리펩티드 서열에 증가하는 순으로 선호되는 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 조항1 내지 조항4 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 표 A1에 제시된 핵산 서열 중 임의의 하나로 표시되거나, 또는 이의 부분, 또는 표 A1에 제시된 핵산 서열 중 임의의 하나와 혼성화할 수 있는 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 조항1 내지 조항5 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 핵산 서열은 표 A1에 제시된 임의의 폴리펩티드의 오쏘로그(orthologue) 또는 패럴로그(paralogue)를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 조항1 내지 조항6 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 조절된 바람직하게는 증가된 발현은 T-DNA 활성화 태킹, TILLING, 또는 상동 재조합의 임의의 하나 이상에 의해 수행되는(effected) 것을 특징으로 하는 방법.
8. 조항1 내지 조항7 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 조절된 바람직하게는 증가된 발현은 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 식물 뿌리에 도입 및 발현에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 조항1 내지 조항8 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 향상된 수확량 관련 형질은 하기 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법:
(i) 향상된 초기 활력; (ii) 증가된 지상부 생물량(biomass); (iii) 증가된 뿌리 생물량(biomass); (iv) 원추화서당 증가된 꽃의 수; (v) 증가된 종자 충만율(fill rate); (vi) 식물체당 증가된 총 종자 수확량; (vii) 증가된 (충만된) 종자 수; (viii) 증가된 수확 지수; 또는 (ix) 증가된 천립당 중량 (TKW).
10. 조항1 내지 조항9 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 향상된 수확량 관련 형질은 비생물적 스트레스 조건하에서 얻어진 것을 특징으로 하는 방법.
11. 조항10에 있어서, 상기 비생물적 스트레스는 하나 이상의 수분 스트레스, 염 스트레스, 산화적 스트레스 및 이온 스트레스로부터 선택된 삼투 스트레스로서, 바람직하게는 상기 수분 스트레스는 가뭄 스트레스 및/또는 감소된 양분 이용성(availability)이며, 바람직하게는 감소된 질소 이용성인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 조항10 또는 조항11에 있어서, 상기 비생물적 스트레스 내성은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된 향상된 수확량 관련 형질로서 나타나는 것을 특징으로 하는 방법: 대조구 식물에 비해 각각 (i) 향상된 초기 활력; (ii) 증가된 지상부 생물량(biomass); (iii) 증가된 뿌리 (굵은 및 가는) 생물량(biomass); (iv) 원추화서당 증가된 꽃의 수; (v) 증가된 종자 충만율; (vi) 식물체당 증가된 총 종자 수확량; (vii) 증가된 (충만된) 종자 수; (viii) 증가된 수확 지수; 또는 (ix) 증가된 천립당 중량 (TKW).
13. 조항8 내지 조항12 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 핵산 서열은 뿌리 특이적 프로모터에, 바람직하게는 RCc3 프로모터에, 더욱 바람직하게는 서열번호 80에 실질적으로 유사한 RCc3 프로모터에, 가장 바람직하게는 서열번호 80으로 표시된 프로모터에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
14. 조항1 내지 조항13 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 식물 유래이며, 바람직하게는 쌍자엽 식물 유래이며, 더욱 바람직하게는 십자화과(Brassicaceae) 유래이며, 가장 바람직하게는 브라시카 라파(Brassica rapa) 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 뿌리 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된, 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 외래도입유전자(transgene)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조항1 내지 조항14 중 어느 한 조항에 따른 방법에 의해 수득 가능한 종자를 포함하는 식물 또는 식물의 일부.
16. 하기를 포함하는 구축물로서:
(a) 조항1 내지 조항6 중 어느 한 조항에 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
(b) (a)의 핵산 서열의 발현을 이끌 수 있는 하나 이상의 조절 서열; 및 선택적으로
(c) 전사 종결 서열;
상기 조절 서열 중 적어도 하나는 뿌리 특이적 프로모터, 바람직하게는 Rcc3 프로모터인 것을 특징으로 하는 구축물.
17. 대조구 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질을 가진 식물을 생산하기 위한 방법에 있어, 조항16에 따른 구축물의 용도로서, 상기 향상된 수확량 관련 형질은 바람직하게는 하기 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 용도:
(i) 향상된 초기 활력; (ii) 증가된 지상부 생물량(biomass); (iii) 증가된 뿌리 (굵은 및 가는) 생물량(biomass); (iv) 원추화서당 증가된 꽃의 수; (v) 증가된 종자 충만율; (vi) 식물체당 증가된 총 종자 수확량; (vii) 증가된 (충만된) 종자 수; (viii) 증가된 수확 지수; 또는 (ix) 증가된 천립당 중량 (TKW).
18. 조항16에 따른 구축물로 형질전환된 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포.
19. 하기 단계를 포함하는 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 형질전환 식물의 제조 방법:
(i) 뿌리 특이적 프로모터의 조절하에서 조항1 내지 조항5 중 어느 조항에 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에 도입 및 발현하는 단계; 및
(ii) 식물의 생장 및 발달을 촉진하는 조건 하에서 식물 세포를 배양하는 단계.
20. 조항19에 있어서, 상기 향상된 수확량 관련 형질이 증가된 비생물적 스트레스 조건하에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 조항1 내지 조항6 중 어느 조항에 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 조절된, 바람직하게는 증가된 발현으로 인해, 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질을 가진 형질전환 식물, 또는 상기 형질전환 식물 유래의 형질전환 식물 세포 또는 식물의 일부.
22. 조항15, 조항18, 또는 조항21에 있어서, 상기 식물이 작물 식물 또는 단자엽 식물 또는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 기장, 호밀, 라이밀, 수수 및 귀리 같은 곡물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물, 또는 상기 형질전환 식물 유래의 형질전환 식물 세포 또는 식물의 일부.
23. 수확 가능한 부분이 바람직하게는 종자인 것을 특징으로 하는, 조항22에 따른 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 식물의 수확 가능한 부분.
24. 조항22에 따른 식물 및/또는 조항23에 따른 식물의 수확 가능한 부분 유래의 산물.
25. 대조구 식물에 비해 식물에서 수확량 관련 형질의 향상을 위한, 바람직하게는 하기 중 하나 이상의 증가를 위한 조항1 내지 조항6 중 어느 조항에 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 용도:
(i) 증가된 종자 충만율; (ii) 식물체당 증가된 총 종자 수확량; (iii) 충만된 종자의 증가된 수; (iv) 증가된 총 종자 수; (v) 증가된 천립당 중량 (TKW) 또는 (vi) 증가된 수확 지수.
26. 조항25에 있어서, 상기 향상된 수확량 관련 형질이 비생물적 스트레스 조건 하에서 발생하는 것을 특징으로 하는 용도.
27. ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 식물에서의 발현 조절을 포함하는, 대조구 식물에 비해 식물에서 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법으로서, 상기 ANN 폴리펩티드는 하기 모티프 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(i) 시그너처 서열 1 (서열번호 87),
(ii) 시그너처 서열 2 (서열번호 88),
(iii) 시그너처 서열 3 (서열번호 89),
(iv) 시그너처 서열 4 (서열번호 90),
(v) 시그너처 서열 5 (서열번호 91),
(vi) 시그너처 서열 6 (서열번호 92),
(vii) 시그너처 서열 7 (서열번호 93).
28. 조항27에 있어서, 상기 ANN 폴리펩티드는 적어도 애넥신(annexin) 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 조항27 또는 조항28에 있어서, 상기 조절된 발현은 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 식물에서의 도입 및 발현에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 조항27 내지 조항29 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 표 B1에 제시된 단백질 중 임의의 하나를 암호화하거나, 또는 상기 핵산의 일부분, 또는 상기 핵산과 혼성화할 수 있는 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
31. 조항27 내지 조항30 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 핵산 서열은 표 B1에 제시된 임의의 단백질의 오쏘로그(orthologue) 또는 패럴로그(paralogue)를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 조항27 내지 조항31 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 향상된 수확량 관련 형질은 대조구 식물에 비해 증가된 수확량, 바람직하게는 증가된 종자 수확량을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 조항27 내지 조항32 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 향상된 수확량 관련 형질은 스트레스가 없는 조건하에서 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 조항27 내지 조항33 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 향상된 수확량 관련 형질은 가뭄 조건하에서 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 조항29 내지 조항34 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 핵산은 구성적(constitutive) 프로모터에, 바람직하게는 GOS2 프로모터에, 가장 바람직하게는 벼의 GOS2 프로모터에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
36. 조항29 내지 조항34 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 핵산은 녹색 조직 특이적 프로모터에, 바람직하게는 익스팬신(expansin) 프로모터에, 가장 바람직하게는 벼의 익스팬신 프로모터에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
37. 조항27 내지 조항36 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 식물 유래이며, 바람직하게는 쌍자엽 식물 유래이며, 더욱 바람직하게는 십자화과(Brassicaceae) 유래이며, 더 더욱 바람직하게는 아라비돕시스(Arabidopsis) 속 유래이며, 가장 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana ) 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
38. ANN 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조항27 내지 조항37 중 어느 한 조항의 방법에 의해 수득 가능한 종자를 포함하는 식물 또는 식물의 일부.
39. 하기를 포함하는 구축물:
(i) 조항27 또는 조항28에 정의된 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
(ii) (i)의 핵산 서열의 발현을 이끌 수 있는 하나 이상의 조절 서열; 및 선택적으로
(iii) 전사 종결 서열.
40. 조항39에 있어서, 상기 조절 서열은 구성적 프로모터, 바람직하게는 GOS2 프로모터, 가장 바람직하게는 벼의 GOS2 프로모터인 것을 특징으로 하는 구축물.
41. 조항39에 있어서, 상기 조절 서열은 녹색 조직 특이적 프로모터, 바람직하게는 익스팬신(expansin) 프로모터, 가장 바람직하게는 벼의 익스팬신(expansin) 프로모터인 것을 특징으로 하는 구축물.
42. 대조구 식물에 비하여 증가된 수확량, 특히 증가된 생물량(biomass) 및/또는 증가된 종자 수확량을 갖는 식물을 생산하는 방법에 대한 조항39 내지 조항41 중 어느 한 조항에 따른 구축물의 용도.
43. 조항39 내지 조항41 중 어느 한 조항에 따른 구축물로 형질전환된 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포.
44. 하기 단계를 포함하는, 대조구 식물에 비하여 증가된 수확량, 특히 증가된 종자 수확량을 갖는 형질전환 식물의 제조 방법:
(i) 조항27 또는 조항28에서 정의된 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 식물에 도입 및 발현하는 단계; 및
(ii) 식물의 생장 및 발달을 촉진하는 조건 하에서 식물 세포를 배양하는 단계.
45. 조항27 또는 조항28에서 정의된 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 증가된 발현으로 인하여 대조구 식물에 비하여 증가된 수확량, 특히 증가된 종자 수확량을 갖는 형질전환 식물, 또는 상기 형질전환 식물로부터 유래한 형질전환 식물 세포.
46. 조항38, 조항43 또는 조항45에 있어서, 상기 식물은 작물 식물 또는 단자엽 식물 또는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 기장, 호밀, 라이밀, 수수 및 귀리 같은 곡물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물, 또는 상기 형질전환 식물로부터 유래한 형질전환 식물 세포.
47. 수확 가능한 부분이 바람직하게는 종자인 것을 특징으로 하는, 조항46에 따른 식물의 수확 가능한 부분.
48. 조항46에 따른 식물 및/또는 조항47에 따른 식물의 수확 가능한 부분 유래의 산물.
49. 대조구 식물에 비하여 식물에서 수확량을 증가, 특히 종자 수확량을 증가시키기 위한 ANN 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 용도.
도 1은 Rhee 등 (2005, Free radical Biology and Medicine 38: 1543-1552)에 따른 2-Cys Prx 효소의 촉매 및 불활성화/재활성화 사이클을 나타낸다.
도 2는 서열번호 2로 나타낸 2-Cys PRX로 NCBI에서의 보존된 도메인 데이터베이스 (CDD: Conserved Domains Database) 탐색 (default 값 사용) 결과를 나타낸다. 최고 hit entry는 CD3015, PRX_Typ2cys이다.
도 3은 진정세균, 식물 조류, 동물의 2-Cys PRX, 및 식물의 1-Cys PRX의 ClustalW (1.83) 복수 서열 정렬 후 neighbour joining 클러스터링 방법을 사용하여 수립된 계통수를 보여준다. 2-Cys PRX 클래스는 괄호로 묶어 표시하였다. 서열번호 2로 나타낸 2-Cys PRX는 박스로 표시하였다.
도 4는 진정세균, 식물 조류, 동물의 2-Cys PRX, 및 식물의 1-Cys PRX의 ClustalW (1.83) 복수 서열 정렬을 보여준다. 서열번호 77로 나타낸 모티프 1 및 서열번호 78로 나타낸 모티프 2는 박스로 표시하였다.
도 5는 벼 GOS2 프로모터 (pGOS2; 서열번호 79) 또는 벼 Rcc3 프로모터 (pRcc3; 서열번호 80)의 조절 하에서 2-Cys PRX 암호화 핵산 서열의 벼(Oryza sativa)에서의 증가된 발현을 위한 바이너리 벡터를 보여준다.
도 6은 본 발명에 따른 방법의 수행에 유용한 서열의 상세한 예이다.
도 7 A는 SMART에 의해 예측된 애넥신 도메인이 밑줄친 볼드체로 표시되어 있는 서열번호 84를 나타내며; 도 7 B는 아라비돕시스 탈리아나 애넥신 4 (서열번호 135)의 애넥신 도메인 (SMART에 의해 예측)을 보여준다.
도 8은 본 발명의 방법에 유용한 식물 애넥신 단백질의 계통수 (Cantero 등, Plant Physiol. Biochem. 44, 13-24, 2006)를 보여준다. 화살표는 아라비돕시스 탈리아나 유래의 애넥신 1 (서열번호 84) 및 애넥신 4 (서열번호 135)를 나타낸다.
도 9는 다양한 식물 애넥신 단백질의 복수 정렬을 나타낸다. 식별자는 데이터베이스 accessions을 의미한다; NP_174810는 서열번호 84에 해당한다. 보존된 잔기는 콜론 또는 점으로 표시되었다.
도 10은 벼 GOS2 프로모터 (pGOS2)의 조절 하에서 ANN 암호화 핵산의 벼(Oryza sativa)에서의 증가된 발현을 위한 바이너리 벡터를 보여준다.
도 11은 본 발명에 따른 방법의 수행에 유용한 서열의 상세한 예이다.
본 발명은 단지 예시인 하기 실시예를 참고하여 기재될 것이다. 하기 실시예는 본 발명의 범위를 완전히 한정하거나 제한할 의도는 아니다.
DNA 조작: 달리 언급되지 않는 한, 재조합 DNA 기술은 Sambrook (2001, Molecular Cloning: laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) 또는 Ausubel 등 (1994, Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols의 Volumes 1 및 2)에 기재된 표준 프로토콜에 따라 수행되었다. 식물 분자작업에 대한 표준 재료 및 방법은 Plant Molecular Biology Labfax (1993, by R.D.D. Croy, published by BIOS Scientific Publications Ltd (UK) 및 Blackwell Scientific Publications (UK))에 기재되어 있다.
실시예 1: 본 발명의 방법에 사용된 핵산 서열에 연관된 서열의 동정
본 발명의 방법에 사용된 핵산 서열에 연관된 서열 (전장 cDNA, ESTs 또는 게놈)이 Basic Local Alignment Tool (BLAST) 같은 데이터베이스 서열 탐색 도구를 사용하여 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Entrez 뉴클레오티드 데이터베이스 (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; 및 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)에 보유된 것 중에서 동 정되었다. 이 프로그램은 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 서열 데이터 베이스에 비교하거나 필적하는 것의 통계적 유의성을 계산하여 서열 간에 국부적인 유사성이 있는 영역을 발견하는 데 사용된다. 예를 들면, 본 발명에서 사용된 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드는 낮은 복잡성 서열 세트 오프를 무시하기 위해, 디폴트 셋팅 및 필터를 갖는 TBLASTN 알고리즘에 대해 이용되었다. 분석 결과는 pairwise 비교로 보이게 하였으며, 확률 점수 (E-값)에 따라 순위를 매겼으며, 여기서 점수는 특정 정렬이 우연히 발생할 가능성을 반영한다 (E-값이 낮을수록 hit가 보다 유의하다). E-값 외에, 비교는 동일성 백분율에 의해서도 점수가 매겨진다. 동일성 백분율은 특정 길이에 걸쳐 두 가지 비교되는 핵산 (또는 폴리펩티드) 서열 간에 동일한 뉴클레오티드 (또는 아미노산)의 수를 말한다. 특정 경우에, 탐색의 엄격성을 변경하기 위하여 디폴트 매개변수를 조절할 수도 있다. 예를 들면, E-값은 덜 엄격한 일치부위를 보이기 위해 증가될 수 도 있다. 이와 같은 방식으로, 거의 정확하게 일치하는 짧은 부위가 동정될 수 있다.
표 A1는 본 발명의 방법에 사용된 핵산 서열에 연관된 핵산 서열의 목록이다.
표 A1 : 2-Cys PRX 핵산 및 폴리펩티드 서열의 예:
종 핵산 서열 NCBI 등록번호 서열번호 폴리펩티드 서열 NCBI 등록번호 서열번호
Brassica sp . 서열번호 1 1 서열번호 2 2
Brassica rapa AF052202.1 3 AAF00001.1 4
Arabidopsis thaliana AY086974.1 5 AAM64537.1 6
Brassica napus AF311863.1 7 AAG30570.1 8
Arabidopsis thaliana NM_120712.2 9 AAM62760.1 10
Spinacia oleracea X94219.1 11 O24364 12
Nicotiana tabacum AJ309009.2 13 CAC84143.2 14
Phaseolus vulgaris AJ288895.1 15 CAC17803.1 16
Pisum sativum AJ315851.1| 17 CAC48323.1 18
Oryza sativa NM_001053585.1 19 NP_001047050.1 Os02g0537700 20
Secale cereale AF076920.1 21 AAC78473.1 22
Riccia fluitans AJ005006.1 23 CAB82860.1 24
Chlamydomonas incerta DQ122920.1 25 ABA01151.1 26
Nostoc gi|17227497:5544705-5545316 27 NP_488681.1 28
Synechococcus sp gi|86607503:2357237-2357845 29 YP_478458.1 30
Nodularia spumigena gi|119509627:35267-35878 31 ZP_01628800.1 32
Thermosynechococcus elongatus gi|22297544:1516844-1517437 33 NP_682244.1 34
Ostreococcus tauri gi|118721427:14610-14671, 14874-14913, 15068-15658 35 CAL55168.1 36
Synechococcus gi|86604733:552727-553335 37 YP_474017.1 38
Synechococcus gi|33864539:1204065-1204667 39 NP_897306.1 40
Synechococcus elongatus gi|81298811:2377107-2377703 41 YP_401326.1 42
Prochlorococcus marinus gi|84517401:555567-556163 43 ZP_01005378.1 44
Porphyra purpurea gi|11465652:76976-77575 45 NP_053882.1 46
Gracilaria tenuistipitata gi|51209843:100291-100971 47 YP_063623.1 48
Mus musculus X82067.1 49 Q61171 50
Rattus norvegicus NM_017169.1 51 NP_058865.1 52
어떤 경우에는, TIGR (The Institute for Genomic Research)과 같은 연구 기관에 의해 연관 서열이 시험적으로 조립되어(assembled), 공개된다. EGO (Eukaryotic Gene Orthologs) 데이터베이스는 키워드 탐색으로 또는 관심 있는 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열로 BLAST 알고리즘을 사용하여 상기와 같은 연관 서열의 동정에 사용될 수 있다.
실시예 2: 2- Cys PRX 폴리펩티드 서열의 정렬( Alignment )
진정세균, 식물 조류, 동물의 2-Cys PRX 폴리펩티드 서열, 및 식물의 1- Cys PRX 폴리펩티드 서열 (outliers로서)의 정렬은 default 값을 사용하여 progressive 정렬의 Clustal 알고리즘 (1.83)으로 수행되었다 (Thompson 등 (1997) Nucleic Acids Res 25:4876-4882; Chenna 등 (2003) Nucleic Acids Res 31 :3497-3500). 정렬을 최적화하기 위해 약간의 편집이 수작업으로 가해졌다. 2-Cys PRX 폴리펩티드는 도 4에 정렬되어 있다. 서열번호 77로 나타낸 모티프 1 및 서열번호 78로 나타낸 모티프 2는 박스로 표시하였다.
진정세균, 식물 조류, 동물의 2-Cys PRX 폴리펩티드 서열, 및 식물의 1- Cys PRX 폴리펩티드 서열 (outliers 로서)의 계통수는 당업계에 주지된 neighbour-joining 클러스터링 알고리즘을 사용하여 구축되었다 (도 3). 2-Cys PRX는 연결괄호(accolade)로 표시하였다. 서열번호 2로 나타낸 2-Cys PRX는 박스로 표시하였다.
실시예 3: 본 발명의 방법의 수행에 유용한 폴리펩티드 서열 간에 전체적인 동일성 백분율 계산
본 발명의 방법 수행에 유용한 전장 폴리펩티드 서열 간에 동일성 및 유사성의 전체적인 백분율은 당업계에 유용한 방법 중의 하나인 MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) 소프트웨어 (Campanella 등, BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences; Ledion Bitincka에 의해 호스팅된 소프트웨어)를 사용하여 결정되었다. MatGAT 소프트웨어는 데이타의 사전 정렬의 필요 없이 DNA 또는 단백질 서열에 대한 유사성/동일성 행렬을 생성한다. 상기 프로그램은 Myers 및 Miller 전체적인 정렬 알고리즘 (gap opening penalty 12, 및 gap extension penalty 2로)을 사용하여 일련의 pair-wise 정렬을 수행하고, 예를 들면, Blosum 62 (폴리펩티드에 대하여)를 사용하여 유사성 및 동일성을 계산하여, 결과를 거리 행렬로 배열한다. 서열 유사성은 구분선 아래 반쪽에 보여지며, 서열 동일성은 대각선 구분선 위 반쪽에 보여진다.
비교에 사용된 매개변수는:
Scoring matrix: Blosum62
첫째 갭: 12
연장 갭: 2
소프트웨어 분석의 결과는 전장 폴리펩티드 서열에 걸쳐 전체적인 유사성 및 동일성에 대하여 표 A2에 보여진다. 동일성 백분율은 대각선 상부에 볼드체로, 유사성 백분율은 대각선 하부에 있다 (보통체).
본 발명의 방법을 수행하는데 유용한 2-Cys PRX 폴리펩티드 서열 간의 동일성 백분율은 서열번호 2에 비교 시 35% 아미노산 동일성만큼 낮을 수도 있다.
표 A2: 전장 폴리펩티드 서열에 걸친 전체적인 유사성 및 동일성에 대한 MatGAT 결과
Figure 112009078358116-pct00003
Figure 112009078358116-pct00004
실시예 4: 본 발명의 방법의 수행에 유용한 폴리펩티드 서열에 포함된 도메인의 동정
CD-Search (Conserved Domain Search service)는 NCBI에 호스팅된 단백질 서열 내에 구조적 및 기능적 도메인을 검출하는 웹-기반 수단이다. CD-Search는 도메인 모델의 광범위한 수집물을 검색하기 위해 BLAST(R)을 사용한다. 검색 결과는 조회 및 도메인-모델 일치 서열 간에 도메인 architecture cartoons 및 pairwise 정렬로 표시된다 (Marchler-Bauer A, Bryant SH (2004), "CD-Search: protein domain annotations on the fly", Nucleic Acids Res.32 (W)327-331). 서열번호 2로 나타낸 2-Cys PRX를 사용하여 수행된 검색 (default 값 사용)은 top hit로서 entry CD3015, PRX_Typ2cys (도 2, 표 A3)를 보인다.
표 A3: 서열번호 2로 표시된 폴리펩티드 서열의 CDD
데이터베이스 등록번호 등록명 기재
CDD CD3015 PRX_Typ2cys Peroxiredoxin (PRX) 패밀리, 전형적인 2-CysPRX 서브패밀리; PRXs는 과산화수소, 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite), 및 유기 히드로퍼옥사이드(organic hydroperoxides)를 환원시킴으로써 페록시다아제 활성을 통해 세포에서 보호 역할을 부여하는 TSA(thiol-specific antioxidant) 단백질
실시예 5: 본 발명의 방법의 수행에 유용한 폴리펩티드 서열의 세포 내 위치 예측
TargetP 1.1은 진핵세포 단백질의 세포 내 위치를 예측한다. 위치 할당은 임의의 N-말단 사전-서열 (엽록체 운반 펩티드 (cTP), 미토콘드리아 표적 펩티드 (mTP) 또는 분비성 경로 신호 펩티드 (SP))의 예측된 존재에 근거한다. 최종 예측이 근거한 점수는 실제로 확률이 아니며, 반드시 부가적이지도 않다. 그러나, 가장 높은 점수를 가진 위치가 TargetP에 따라 가장 가능성이 높으며, 점수 (신뢰도 등급)간의 관계가 예측의 확실성의 표시일 것이다. 신뢰도 등급 (RC)은 1에서 5까지이며, 상기 1은 가장 강한 예측을 나타낸다. TargetP는 Technical University of Denmark의 서버에 유지된다.
N-말단 사전-서열을 포함하는 것으로 예측된 서열에 대해서 잠재적인 절단 부위 또한 예측될 수 있다.
생물체 그룹 (식물이 아닌 것 또는 식물), 컷오프 세트(cutoff sets) (없음, 사전 지정된 컷오프 세트, 또는 사용자 명시 컷오프 세트), 및 절단 부위의 예측 계산 (yes 또는 no)과 같은 많은 매개변수가 선택되었다.
서열번호 2로 표시된 폴리펩티드 서열의 TargetP 1.1 분석 결과는 표 A4에 제시된다. "식물" 그룹이 선택되었고, 컷오프는 정의되지 않았으며, 운반 펩티드의 예측된 길이가 요청되었다. 서열번호 2로 표시된 폴리펩티드 서열의 예측된 세포 내 위치는 색소체이다.
표 A4: 서열번호 2로 표시된 폴리펩티드 서열의 TargetP 1.1 분석
길이 (AA) 268
엽록체 운반 펩티드 0.987
미토콘드리아 운반 펩티드 0.014
분비 경로 신호 펩티드 0.023
세포 내 다른 표적 0.018
예측된 위치 엽록체
신뢰 등급 1
예측된 운반 펩티드 깅이 58
TargetP1.1에 따라 예측된 길이는 58 개 아미노산 (N-말단으로부터 시작)이 나, 이는 성숙한 단백질의 서열분석으로 실험적으로만 확인될 수 있다. Cheong 등 (1999)은 서열번호 2로 표시된 폴리펩티드에 대해 65 개 아미노산의 운반 펩티드를 예측한다 (Plant Molec Biol 40: 825-834).
하기를 포함한 많은 다른 알고리즘이 상기 분석의 수행에 사용될 수 있다:
● [Technical University of Denmark]의 서버 상에 호스팅된 ChloroP 1.1;
● [Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane, Australia]의 서버 상에 호스팅된 Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor version 1.2;
● [University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada]의 서버 상에 호스팅된 PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5;
● [Technical University of Denmark]의 서버 상에 호스팅된 TMHMM
실시예 6: 2- Cys PRX 폴리펩티드에 대한 기능적 분석
2-Cys PRX 폴리펩티드는 예를 들면, 과산화수소에 페록시다아제(peroxidase) 활성을 나타낸다. 2-Cys PRX 단백질에 대한 효소 분석은 문헌에 광범위하게 기재되어 있으며, 당업자에게 주지되어 있다. Huang 등 (2007; Appl Microbiol Biotechnol 74(1):84-92), Bernier-Villamor 등 (2004; J Exp Bot 55(406):2191-9) 및 Caporaletti 등 (2007; Biochem Biophys Res Commun 355(3):722-7)이 2-Cys PRX 단백질의 효소 분석을 기재한 최근 문헌이다.
실시예 7: 본 발명의 방법에 사용된 핵산 서열의 클로닝
본 발명의 방법에 사용된 핵산 서열은 브라시카 라파 (Brassica rapa) 2-Cys PRX 클론을 주형으로 Cheong 등의 기재 (1999; Plant Molec Biol)에 따라 PCR로 증폭되었다. PCR은 표준 조건에서 Hifi Taq DNA 중합효소를 사용하여, 50 ㎕ PCR 혼합물 내에 주형 200 ng을 사용하여 수행되었다. 사용된 프라이머는 prmO8756 (서열번호 81; 정방향, 개시 코돈 볼드체): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcgtctgttgcttctt-3' 및 prmO8757 (서열번호 82; 역방향, 상보적): 5'-gg ggaccactttgtacaagaaagctgggttcgagctaaatagctgagaagag-3', 상기 프라이머는 Gateway 재조합에 대한 AttB 부위를 포함한다. 증폭된 PCR 단편은 표준 방법을 사용하여 정제되었다. Gateway 과정의 첫 단계인 BP 반응이 수행되었으며, 이 때 PCR 단편이 Gateway 용어에 따르면 "entry 클론"인 p2-Cys PRX를 생성하기 위해 pDONR201 플라스미드와 인 비보(in vivo) 재조합된다. Gateway
Figure 112009078358116-pct00005
기술의 일부분으로서, 플라스미드 pDONR201은 Invitrogen으로부터 구입하였다.
서열번호 1을 포함하는 entry 클론이 오리자 사티바(Oryza sativa) 형질전환에 사용된 2개의 destination 벡터와 LR 반응에 사용되었다. 상기 벡터는 T-DNA 경계부 내에 기능적 인자로서 하기를 포함한다: 식물 선발 마커; 스크리닝 가능한 마커 발현 카세트; 및 entry 클론에 이미 클로닝된 목적 핵산 서열과 LR 인 비보(in vivo) 재조합에 예정된 Gateway 카세트. 첫 번째 destination 벡터는 상기 Gateway 카세트의 상부에 강력한 구성적 발현을 위한 벼 GOS2 프로모터 (서열번호 79)를 포 함하며, 두 번째 destination 벡터는 뿌리 특이적 발현을 위한 벼 Rcc3 프로모터 (서열번호 80)를 포함한다.
LR 재조합 단계 후, 생성된 발현 벡터 pGOS2::2-Cys PRX 및 pRcc3::2-Cys PRX (도 5)는 당업계에 주지된 방법에 따라 아그로박테리움 (Agrobacterium) 균주 LBA4044에 개별적으로 형질전환되었다.
실시예 8: 식물 형질전환
벼 형질전환
실시예 7에 기재된 발현 벡터 중 하나를 각각 함유하는 2 개의 아그로박테리움 균주가 오리자 사티바 식물의 형질전환에 사용되었다. 벼 야포니카 재배 품종 니폰바레의 성숙한 건조 종자의 껍질을 벗겼다. 70% 에탄올에 1 분, 0.2% HgCl2에 30 분, 멸균된 증류수로 6 회, 15분 세척하여 멸균하였다. 멸균된 종자를 2,4-D 함유 배지 (캘러스 유도배지)에서 발아시켰다. 암소에서 4주간 배양 후, 배, 배반-유래 캘러스를 절단하여 동일한 배지에서 번식시켰다. 2주 후, 캘러스는 계대배양에 의해 동일한 배지 상에서 또 다른 2주간 증식되거나 번식되었다. 배 캘러스 단편은 (세포 분열 활성을 증대시키기 위하여) 공동배양 3일 전에 신선한 배지 상에서 계대배양 되었다.
발현 벡터 함유 아그로박테리움 균주 LBA4404가 공동배양에 사용되었다. 아그로박테리움은 적절한 항생제가 포함된 AB 배지에 접종되어, 28℃에서 3일간 배양 되었다. 세균을 수집하여 밀도 (OD600) 약 1이 되게 액체 공동배양 배지에 현탁액을 만들었다. 이 현탁액을 페트리디쉬에 옮겨 캘러스를 현탁액에 15 분간 침지하였다. 캘러스 조직을 필터 페이퍼 상에 옮겨 건조시킨 후, 굳힌 공동배양 배지에 옮겨 25℃, 암소에서 3일간 배양하였다. 공동배양된 캘러스를 선발제의 존재 하에 2,4-D-함유 배지에서 28℃, 암소에서 4주간 키웠다. 이 기간 중에, 급속히 자라는 저항성 캘러스 섬이 발달되었다. 이를 재분화 배지에 옮겨 명소에서 배양 후, 배가 방출되었으며 다음 4 내지 5주 후에 어린 줄기가 발달되었다. 어린 줄기를 캘러스에서 절단하여 옥신 함유 배지에서 2 내지 3주간 배양하여 토양으로 이식하였다. 강해진 어린 줄기를 온실 내 고습도 및 단일에서 키웠다.
약 35 개의 독립적인 T0 벼 형질전환체가 한 구축물당 생성되었다. 일차 형질전환체를 조직 배양실에서 온실로 옮겼다. T-DNA 삽입물의 카피 수를 확인하기 위한 정량적 PCR 분석 후, 선발제에 내성을 보이는 한 카피 형질전환 식물을 T1 종자 수확을 위하여 유지하였다. 이식 3 내지 5 개월 후 종자를 수확하였다. 본 방법으로 한 좌위 형질전환체가 50% 넘는 비율로 생산되었다 (Aldemita and Hodges 1996, Chan 등 1993, Hiei 등 1994).
실시예 9: 표현형 평가 절차
9.1 평가 셋업
약 35개의 독립적인 T0 벼 형질전환체가 생성되었다. 일차 형질전환체를 조 직배양실에서 온실로 옮겨 키워 T1 종자를 수확하였다. 외래도입유전자의 유/무에 대하여 3:1로 분리되는 T1 자손 중 6 events를 보유하였다. 이들 events의 각각에 대해, 외래도입유전자(이형- 및 동형접합자)를 가진 약 10 개의 T1 실생 및 외래도입유전자가 없는 (공접합자) 약 10 개의 T1 실생을 가시적 마커 발현을 관찰하여 선발하였다. 형질전환 식물 및 해당 공접합자를 무작위 위치에 나란히 키웠다. 온실 조건은 단일 (12 시간 빛), 명소에서 28℃, 암소에서 22℃, 및 상대습도 70%였다.
4 개의 T1 events는 T2 세대에서 T1 세대에 대해서와 동일한 평가 절차이나 event당 더 많은 개체로 한층 더 평가되었다. 파종 단계에서부터 성숙 단계까지 식물에 디지털 이미지 캐비닛을 몇 회 통과시켰다. 매번 각 식물의 디지털 이미지 (2048x1536 픽셀, 1,600만 가지 색)를 적어도 6 가지 다른 각도에서 촬영하였다.
가뭄 스크린
4 events로부터 T2 종자로부터의 식물체를 정상적인 조건에서 이삭이 나오는 단계에 이를 때까지 화분에서 키웠다. 관개가 억제된 "건조한" 곳으로 옮겼다. 토양 수분 함량 (SWC)을 모니터하기 위해 무작위로 선택한 화분에 습도 탐침을 삽입하였다. SWC가 특정 역치 밑으로 떨어질 때에는 정상적인 수준에 다시 도달할 때까지 연속적으로 자동적으로 식물에 재급수하였다. 식물체를 다시 정상적인 조건으로 옮겼다. 재배의 나머지 과정 (식물 성숙, 종자 수확)은 비생물적 스트레스 조건하에서 키우지 않은 식물과 동일하였다. 생장 및 수확량 매개변수는 정상적인 조건하의 생장에 대해서 만큼 상세하게 기록하였다.
9.2 통계적 분석:F-검정
식물의 표현형적 특징의 종합적인 평가를 위한 통계적 모델로 2 인자 ANOVA (변이체의 분석)를 사용하였다. 본 발명의 유전자로 형질전환된 모든 건의 모든 식물에서 측정된 모든 매개변수에 대하여 F-검정이 수행되었다. 모든 형질전환 건에 미치는 유전자의 종합적인 효과를 점검하고 전체적인 유전자 효과로 알려진 유전자의 종합적인 효과를 확인하기 위하여 F-검정이 수행되었다. F-검정에 대하여 진정한 전체적인 유전자 효과에 대한 유의성 역치는 5% 확률 수준으로 설정하였다. 유의한 F-검정 값은 유전자 효과를 나타내는데, 이는 표현형 상의 차이를 야기한 것이 유전자의 단순한 존재나 위치만이 아니라는 의미이다.
중복적인 events의 2 회 실험이 수행되었으므로, 조합된 분석이 수행되었다. 이는 두 실험에 걸친 효과의 일관성을 확인하기에 유용하며, 그렇다면 결론에 대한 신뢰도를 증가시키기 위해 양 실험으로부터의 증거를 축적하는 것이 유용하다. 사용된 방법은 자료의 다층구조(즉, experiment-event-segregants)를 고려하는 혼합모델 접근(mixed-model approach)이다. P 값은 우도비 검정 (likelihood ratio test)을 카이 제곱 분포에 비교함으로써 구했다.
9.3 측정된 매개변수
생물량 관련 매개변수 측정
파종 단계에서부터 성숙 단계까지 식물에 디지털 이미지 캐비닛을 몇 회 통 과시켰다. 매번 2-Cys PRXnt 디지털 이미지 (2048x1536 픽셀, 1,600만 가지 색)를 적어도 6 가지 다른 각도에서 촬영하였다.
초기 활력은 발아 후 3주된 식물 (seedling) 지상부 면적이다. 초기 활력은 백그라운드로부터 구분되는 지상부 식물체로부터 총 픽셀의 수를 세어 결정되었다. 이 값은 다른 각도에서 동일한 시점에 촬영한 그림에 대해 평균을 내었으며, 보정에 의해 평방 mm로 표시된 물리적 표면 값으로 전환되었다. 하기 기재된 결과는 발아 후 3 주된 식물체에 대한 것이다
식물 지상부 면적 (또는 잎으로 된 생물량)은 백그라운드로부터 구분되는 지상부 식물 부분의 디지털 이미지의 픽셀의 총 수를 세어 결정하였다. 이 값은 다른 각도에서 동일한 시점에 촬영한 그림에 대해 평균을 내었으며, 보정에 의해 평방 mm로 표시된 물리적 표면 값으로 전환되었다. 실험은 이 방식으로 측정된 지상부 식물 면적이 지상부 식물 부분의 생물량과 상관관계가 있음을 보여준다. 지상부 면적은 식물의 잎으로 된 생물량이 최대에 달한 시점에서 측정된 면적이다.
뿌리-관련 매개변수를 측정하기 위해, 뿌리를 보이게 하기위해 바닥이 투명하게 특별히 고안된 화분에 식물체를 키웠다. 식물체의 생장 중에 화분 바닥을 통해 디지털 카메라로 이미지를 기록하였다. 총 투영면적(projected area) (총 뿌리 체적에 관련될 수 있는), 임의의 두께 역치 상부 뿌리의 평균 직경 및 길이 (두꺼운 뿌리의 길이, 또는 두꺼운 뿌리 길이)와 같은 뿌리 특징을 적절한 소프트웨어를 사용하여 그림으로부터 추론하였다. 뿌리 생물량(biomass)의 증가는 총 뿌리 생물량(biomass) (식물의 수명 중에 관찰된 뿌리의 최대 생물량(biomass)으로 측정됨) 의 증가로; 또는 뿌리/신초 지수 (뿌리 및 신초의 활성 성장 기간에 근질량 및 신초 질량(shoot mass)간의 비율로 측정됨)의 증가로 표현된다.
종자 관련 매개변수 측정
성숙한 일차 원추화서를 수확하여, 세고, 봉지에 넣어, 바코드로 표지하여 37℃ 오븐에서 3일간 건조하였다. 원추화서를 타작하여 모든 종자를 수집하고, 세었다. 충만된 깍지는 공기분출기를 사용하여 빈 것과 분리하였다. 빈 깍지는 버리고 나머지를 세었다. 충만된 깍지는 분석 저울로 무게를 재었다. 충만된 종자의 수는 분리 단계 후 남은 충만된 깍지의 수를 세어 결정하였다. 총 종자 수확량은 식물체로부터 수확된 모든 충만된 깍지 중량으로 측정하였다. 식물체당 총 종자수는 식물체로부터 수확된 깍지의 수를 세어 측정하였다. 천립중량 (TKW)은 숫자를 센 충만된 종자의 수와 그 총 중량으로부터 외삽하였다. 본 발명에서 수확지수 (HI)는 총 종자 수확량과 지상부 면적 (mm2) 간의 비율에 106을 곱한 것으로 정의된다. 본 발명에서 정의된 원추화서당 총 꽃의 수는 총 종자 수와 성숙한 1차 원추화서의 수 간의 비율이다. 본 발명에서 정의된 종자 충만도(fill rate)는 총 종자 (또는 소화) 수에 대한 충만된 종자 수의 비율 (%)로 표시된다.
실시예 10: 정상적인 생장 조건하에서 자란 형질전환 식물의 표현형 평가 결과
뿌리 특이적 프로모터의 조절하에서, 및 정상적인 생장 조건하에서 자란 2- Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 발현하는 형질전환 벼 식물의 평가 결과가 하기에 제시되어 있다. 증가된 종자 충만율, 식물체당 증가된 총 종자 수확량, 충만된 종자의 증가된 수, 증가된 수확 지수, 및 증가된 천립당 중량뿐 아니라 향상된 초기 활력이 관찰되었다.
표 A5: 뿌리 특이적 프로모터의 조절하에서, 및 정상적인 생장 조건하에서 자란 본 발명의 방법 수행에 유용한 핵산 서열을 발현하는 형질전환 벼 식물의 평가 결과
형질 T1 세대에서 3 회 최고 　events에 대한 증가 % T2 세대에서 3 회 최고 　events에 대한 증가 %　
초기 활력 (실생) 7% 5%
종자 충만율 1% 10%
식물체당 총 종자 수확량 8% 10%
충만된 종자의 총 수 6% 8%
수확 지수 7% 9%
천립중량 3% 3%
구성적 프로모터 (벼 GOS2 프로모터)의 조절하에서, 및 정상적인 생장 조건하에서 자란 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 발현하는 형질전환 벼 식물은 필적할만한 정상적인 생장 조건 하에서 자란 대조구 식물에 비교 시, 임의의 표현형적 형질 차이를 보이지 않았다 (데이터 미제시).
실시예 11: 스트레스 생장 조건하에서 자란 형질전환된 식물의 표현형 평가 결과
뿌리 특이적 프로모터의 조절하에서, 및 가뭄-스트레스 생장 조건하에서 자란 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 발현하는 형질전환 벼 식물의 평가 결과가 하기에 제시되어 있다. 증가된 지상부 생물량(biomass), 증가된 뿌리 생물량(biomass), 원추화서당 증가된 꽃의 수, 증가된 종자 충만율, 식물체당 증가 된 총 종자 수확량, 증가된 종자 수, 증가된 충만된 종자 수, 및 증가된 수확 지수뿐 아니라 향상된 초기 활력이 관찰되었다.
표 A6: 뿌리 특이적 프로모터의 조절하에서, 및 가뭄-스트레스 생장 조건하에서 자란 본 발명의 방법 수행에 유용한 핵산 서열을 발현하는 형질전환 벼 식물의 평가 결과
형질 T2 세대에서 증가 % (모든 events)
초기 활력 (실생) 31%
지상부 생물량 11%
뿌리 생물량 6%
원추화서당 꽃 8%
종자 충만율 8%
식물체당 총 종자 수확량 18%
총 종자 수 10%
충만된 종자의 총 수 17%
수확 지수 8%
실시예 12: 다른 작물의 형질전환의 예
옥수수 형질전환
옥수수 (Zea mays) 형질전환은 [Ishida 등 (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50]에 기재된 방법을 변형하여 수행하였다. 옥수수에 있어 형질전환은 유전형에 의존하며, 특정 유전형만이 형질전환 및 재분화에 순응한다. 근교계통 A188 (University of Minnesota) 또는 양친으로서 A188과의 교배는 형질전환을 위한 공여자의 좋은 원천이나 다른 유전형도 성공적으로 사용될 수 있다. 옥수수 알을 미성숙된 배의 길이가 약 1 내지 1.2mm일 때인 수분 후 약 11일된 옥수수 식물체로부터 수확한다. 미성숙한 배는 발현 벡터를 함유하는 아그로박테리움 투머파시엔스와 공배양 되었으며, 형질전환 식물체는 기관발생을 통해 회수된다. 절단된 배를 캘러 스 유도 배지에서, 다음에는 선발제 (예를 들면 이미다졸리논, 그러나 다양한 선발 마커 사용 가능)를 함유하는 옥수수 재분화 배지에서 키운다. 페트리 플레이트를 명소, 25℃에서 2 내지 3주간, 또는 어린 줄기가 발달하기까지 배양한다. 각 배에서 녹색 어린 줄기를 옥수수 발근 배지로 옮겨 25℃에서 2 내지 3주간 뿌리가 발달하기까지 배양한다. 발근된 어린 줄기를 온실의 토양으로 이식한다. T1 종자는 선발제에 내성을 보이며 한 카피의 T-DNA 삽입물을 가진 식물에서 생산된다.
밀 형질전환
밀의 형질전환은 [Ishida 등 (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50]에 기재된 방법으로 수행하였다. 재배품종 봅화이트 (Bobwhite; CIMMYT, Mexico로부터 입수 가능)가 형질전환에 흔히 사용된다. 미성숙한 배는 발현 벡터를 함유하는 아그로박테리움 투머파시엔스와 공배양 되었으며, 형질전환 식물체는 기관발생을 통해 회수된다. 아그로박테리움과의 공배양 후 배를 캘러스 유도 배지에서, 다음에는 선발제 (예를 들면 이미다졸리논, 그러나 다양한 선발 마커 사용 가능)를 함유하는 재분화 배지에서 시험관 내에서 키운다. 페트리 플레이트를 명소, 25℃에서 2 내지 3주간, 또는 어린 줄기가 발달하기까지 배양한다. 각 배에서 녹색 어린 줄기를 발근 배지로 옮겨 25℃에서 2 내지 3주간 뿌리가 발달하기까지 배양한다. 발근된 어린 줄기를 온실의 토양으로 이식한다. T1 종자는 선발제에 내성을 보이며 한 카피의 T-DNA 삽입물을 가진 식물에서 생산된다.
대두 형질전환
대두는 Texas A&M 특허 US 5,164,310에 기재된 방법을 변형하여 형질전환되 었다. 몇 가지 상업적 대두 변종은 이 방법에 의한 형질전환에 순응한다. 재배품종 잭 (Jack; Illinois Seed foundation으로부터 입수 가능)이 흔히 형질전환에 사용된다. 대두 종자는 시험관 내 파종을 위해 멸균된다. 하배축, 유근 및 자엽 하나를 7일 된 어린 실생으로부터 잘라낸다. 상배축 및 나머지 자엽을 엽액 마디가 발달할 때까지 키운다. 이 엽액 마디를 잘라내어 발현벡터를 함유하는 아그로박테리움 투머파시엔스와 배양한다. 공배양 후 잘라낸 식물체 조각을 수세하여 선발 배지로 옮긴다. 재분화된 어린 줄기를 잘라내어 어린 줄기 신장 배지에 둔다. 1 cm가 되지 않는 어린 줄기를 뿌리가 발달하기까지 발근 배지에 둔다. 발근된 어린 줄기를 온실의 토양으로 이식한다. T1 종자는 선발제에 내성을 보이며 한 카피의 T-DNA 삽입물을 가진 식물에서 생산된다.
유채/ 캐놀라 형질전환
5 내지 6일된 어린 실생의 자엽 엽병 및 하배축이 조직 배양을 위한 식물절편으로 사용되었으며 Babic 등 (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188)에 따라 형질전환되었다. 상업적 재배종 웨스타 (Westar; Agriculture Canada)가 형질전환을 위한 표준 변종으로 사용되나, 다른 변종도 사용될 수 있다. 캐놀라 종자는 시험관 내 파종을 위해 표면 멸균된다. 자엽이 붙어 있는 자엽 엽병 식물절편을 시험관 내 실생으로부터 절단하여, 엽병 절편의 잘린 끝 부분을 세균 현탁액에 담구어 아그로박테리움 (발현 벡터 포함)을 접종하였다. 식물절편을 3 mg/l BAP, 3 % 수크로스, 0.7 % Phytagar를 함유하는 MSBAP-3 배지에서 23℃에서, 16 시간의 빛 하에서 2일간 배양하였다. 아그로박테리움과의 공배양 2일 후, 엽병 식물 절편을 3mg/l BAP, 세포탁심, 카베니실린, 또는 티멘틴 (300mg/l)을 함유하는 MSBAP-3 배지에 옮겨 7일간 둔 후, 어린 줄기가 재분화될 때까지 세포탁심, 카베니실린, 또는 티멘틴 및 선발제가 포함된 MSBAP-3 배지에 배양하였다. 어린 줄기의 길이가 5 내지 10 mm일 때 잘라 어린 줄기 신장 배지 (0.5 mg/l BAP 함유 MSBAP-0.5)로 옮긴다. 길이 약 2 cm인 어린 줄기를 뿌리 유도를 위하여 발근 배지(MS0)로 옮긴다. 발근된 어린 줄기를 온실의 토양으로 이식한다. T1 종자는 선발제에 내성을 보이며 한 카피의 T-DNA 삽입물을 가진 식물에서 생산된다.
알팔파 형질전환
알팔파 (Medicago sativa)의 재생 클론이 (McKersie 등, 1999 Plant Physiol 119: 839-847)의 방법으로 형질전환된다. 알팔파의 재분화 및 형질전환은 유전형 의존적이므로 재분화 식물이 요구된다. 재분화 식물을 얻는 방법이 기재된다. 예를 들면, 이들은 재배품종 랭그랜더 (Rangelander; Agriculture Canada) 또는 Brown DCW 및 Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112)에 의해 기재된 임의의 다른 상업적 알팔파 변종으로부터 선택할 수 있다. 다르게는, RA3 변종 (University of Wisconsin)이 조직배양에 사용하기 위해 선택되었다 (Walker 등, 1978 Am J Bot 65:654-659). 엽병 식물절편은 발현 벡터를 가진 아그로박테리움 투머파시엔스 C58C1 pMP90 (McKersie 등, 1999 Plant Physiol 119: 839-847) 또는 LBA4404와 밤새 공배양된다. 식물절편은 288 mg/L Pro, 53 mg/L 티오프롤린, 4.35 g/L K2SO4, 및 100μM 아세토시링원을 함유하는 SH 유도배지 상에서 암소에서 3일간 공배양된다. 식물절편을 절반 강도의 Murashige-Skoog 배지 (Murashige and Skoog, 1962)로 세척하여 아세토시링원은 없으나 적절한 선발제 및 아그로박테리움 생장을 저해하는 적절한 항생제를 포함하는 동일한 SH 유도배지 상에 플레이팅한다. 몇 주 후, 체세포 배를 생장조절제 및 항생제는 없고, 50g/L 수크로스가 함유된 BOi2Y 발생 배지로 옮긴다. 체세포 배는 연이어 절반 강도의 Murashige-Skoog 배지 상에서 발아된다. 발근된 실생을 온실의 토양으로 이식하여 키운다. T1 종자는 선발제에 내성을 보이며 한 카피의 T-DNA 삽입물을 가진 식물에서 생산된다.
목화 형질전환
목화 (Gossypium hirsutum L.) 형질전환은 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용하여, 자엽하축(hypocotyls) 외식편에 수행하였다. Coker 130 또는 Coker 312 (SeedCo, Lubbock, TX)와 같은 상업적 재배품종이 형질전환에 사용된 표준 변종이었으나, 다른 변종도 사용될 수 있다. 종자를 표면 살균하였으며, 암소에서 발아시켰다. 자엽하축 외식편은 약 1 -1.5 cm의 길이로 발아된 실생으로부터 절단하였다. 자엽하축 외식편을 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 투머파시엔스 접종물에 5분간 침지하고, 24℃, 암소에서 MS +1.8 mg/l KNO3 + 2% 포도당 상에 약 48시간 공배양하였다. 적절한 세균 및 식물 선발 마커를 포함하는 동일 배지에 외식편을 옮겨, 배 캘러스(embryogenic calli)가 보일 때까지 수 회 새배지로의 교환을 반복하였다. 캘러스를 분리하여 체세포 배 (somatic embryos)가 나올 때까지 계대 배양하였다. 체세포 배 유래의 소식물체를 뿌리가 나올 때까지 발근배지에서 키웠다. 발근된 신초(shoots)를 화분으로 이식하여 온실에서 키웠다. 선발제에 내성을 보이며 한 카피의 T-DNA 삽입물(insert)을 포함하는 식물체로부터 T1 종자를 수확하였다.
실시예 13: 다른 스트레스 스크린의 예
염 스트레스 스크린
식물체를 코코넛 섬유(coco fibers) 및 아르젝스(argex) (3:1 비율)로 만들어진 기질에서 키웠다. 정상적인 양분액을 온실에 식물체를 이식 후 처음 2주간 사용하였다. 처음 2주 후, 식물을 수확할 때까지 25 mM 염 (NaCl)를 양분액에 첨가하였다.
감소된 양분 (질소) 이용 효율 스크린
T2 종자로부터의 벼 식물체를 양분액을 제외하고는 정상적인 조건하에서 화분용 상토에서 키웠다. 질소 함량이 감소된 특정 양분액으로 이식에서부터 성숙에 이를 때까지, 보통 7 내지 8 회 이하로 화분에 급수하였다. 재배 (식물 성숙, 종자 수확)의 나머지 부분은 비생물적 스트레스 하에서 키우지 않은 식물과 동일하다. 생장 및 수확량 매개변수는 정상적인 조건하의 생장에 대해서 만큼 상세하게 기록하였다.
실시예 14: 본 발명의 방법에 사용된 핵산 서열에 연관된 서열의 동정
본 발명의 방법에 사용된 핵산 서열에 연관된 서열 (전장 cDNA, ESTs 또는 게놈)은 BLAST (Basic Local Alignment Tool) 같은 데이터베이스 서열 탐색 도구를 사용하여 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 Entrez 뉴클레 오티드 데이터베이스 (Altschul et al . (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; 및 Altschul et al . (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)에 보유된 것 중에서 동정되었다. 이 프로그램은 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 서열 데이터 베이스에 비교하고 필적하는 것의 통계적 유의성을 계산하여 서열 간에 국부적인 유사성이 있는 영역을 발견하는데 사용된다. 예를 들면, 본 발명에 사용된 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드는 낮은 복잡성 서열 세트 오프를 무시하기 위해, 디폴트 셋팅 및 필터를 갖는 TBLASTN 알고리즘에 대해 이용되었다. 분석 결과는 pairwise 비교로 보이게 하였으며, 확률 점수 (E-값)에 따라 순위를 매겼으며, 여기서 점수는 특정 정렬이 우연히 발생할 가능성을 반영한다 (E-값이 낮을수록 hit가 보다 유의하다). E-값 외에, 비교는 동일성 백분율에 의해서도 점수가 매겨진다. 동일성 백분율은 특정 길이에 걸쳐 두 가지 비교되는 핵산 (또는 폴리펩티드) 서열 간에 동일한 뉴클레오티드 (또는 아미노산)의 수를 말한다. 특정 경우에, 탐색의 엄격성을 변경하기 위하여 디폴트 매개변수를 조절할 수도 있다. 예를 들면, 덜 엄격한 일치부위를 보이기 위해 E-값을 증가할 수 있으며, 이와 같은 방식으로, 거의 정확하게 일치되는 짧은 부위가 동정된다.
표 B1은 본 발명의 방법에 유용한 핵산 서열에 연관된 핵산 서열의 목록이다.
표 B1: ANN 폴리펩티드의 예:
식물 소스 핵산
서열번호:		 단벡질
서열번호:
Arabidopsis thaliana ANNAT1 83 84
Gossypium hirsutum fiber annexin 96 97
Lavatera thuringiaca annexin 98 99
Brassica rapa subsp. Pekinensis 80C09_22 100 101
Gossypium hirsutum annexin 102 103
Capsicum annuum Annexin 24 104 105
Nicotiana tabacum VCaB42 106 107
Gossypium hirsutum Anx1 108 109
Nicotiana tabacum annexin 110 111
Solanum tuberosum annexin p34 112 113
Lycopersicon esculentum annexin p34 114 115
Lycopersicon esculentum annexin p35 116 117
Arabidopsis thaliana ANNAT2 118 119
Nicotiana tabacum annexin 120 121
Solanum tuberosum annexin p34-like 122 123
Arabidopsis thaliana ANN7 124 125
Medicago sativa annexin 126 127
Brassica rapa subsp. pekinensis 80A08_20 128 129
Arabidopsis thaliana ANNAT3 130 131
Arabidopsis thaliana annexin 5 132 133
Arabidopsis thaliana ANNAT4 134 135
Arabidopsis thaliana ANN6 136 137
Arabidopsis thaliana ANN8 At5g12380 138 139
Oryza sativa (japonica cultivar-group) Os09g0394900 140 141
Oryza sativa (japonica cultivar-group) Os02g0753800 142 143
Oryza sativa (japonica cultivar-group) Os08g0425700 144 145
Oryza sativa (japonica cultivar-group) Os06g0221200 146 147
Oryza sativa (japonica cultivar-group) Os09g0453300 148 149
Oryza sativa (japonica cultivar-group) Os05g0382900 150 151
Oryza sativa (japonica cultivar-group) Os08g0372900 152 153
Oryza sativa (japonica cultivar-group) Os03g0819300 154 155
어떤 경우에는, TIGR (The Institute for Genomic Research)과 같은 연구 기관에 의해 연관 서열이 시험적으로 조립되어(assembled), 공개된다. EGO (Eukaryotic Gene Orthologs) 데이터베이스는 키워드 탐색으로 또는 관심 있는 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열로 BLAST 알고리즘을 사용하여 상기와 같은 연관 서열의 동정에 사용될 수 있다.
실시예 15: ANN 폴리펩티드 서열의 정렬
폴리펩티드 서열의 정렬은 점진적 정렬의 대중적인 Clustal 알고리즘에 근거 한 벡터 NTI (Invitrogen)의 AlignX 프로그램을 사용하여 수행되었다 (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25:4876-4882; Chenna et al . (2003). Nucleic Acids Res 31:3497-3500). Gap open penalty에 대한 디폴트 값은 10, gap extension penalty에 대한 디폴트 값은 0.1이고, 선택된 가중치 행렬은 Blosum 62 (만일 폴리펩티드가 정렬되면)이다. 정렬(alignment)을 최적화하기 위해 약간의 편집이 수작업으로 가해졌다. ANN 폴리펩티드간에 전체 서열에 걸쳐 서열의 보존성이 있었다. ANN 폴리펩티드는 도 9에 정렬되어 있다.
ANN 폴리펩티드 (도 8 중의 하나와 같은)의 계통수는 벡터 NTI (Invitrogen)의 AlignX 프로그램에 제공된 neighbour-joining 클러스터링 알고리즘을 사용하여 제작되었다.
실시예 16: 본 발명의 방법의 수행에 유용한 폴리펩티드 서열 간에 전체적인 동일성 백분율 계산
본 발명의 방법 수행에 유용한 전장 폴리펩티드 서열 간에 동일성 및 유사성의 전체적인 백분율은 당업계에 유용한 방법 중의 하나인 MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) 소프트웨어 (Campanella 등, BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences; Ledion Bitincka에 의해 호스팅된 소프트웨어)를 사용하여 결정되었다. MatGAT 소프트웨어는 데이타의 사전 정렬의 필요 없이 DNA 또는 단백질 서열에 대한 유사성/동일성 행렬을 생성한다. 상기 프로그램은 Myers 및 Miller 전체적인 정렬 알고리즘 (gap opening penalty 12, 및 gap extension penalty 2로)을 사용하여 일련의 pair-wise 정렬을 수행하고, 예를 들면, Blosum 62 (폴리펩티드에 대하여)를 사용하여 유사성 및 동일성을 계산하여, 결과를 거리 행렬로 배열한다. 서열 유사성은 구분선 아래 반쪽에 보여지며, 서열 동일성은 대각선 구분선 위 반쪽에 보여진다.
비교에 사용된 매개변수는:
Scoring matrix: Blosum62
첫째 갭: 12
연장 갭: 2
소프트웨어 분석의 결과는 전장 폴리펩티드 서열에 걸쳐 전체적인 유사성 및 동일성에 대하여 표 B2에 보여진다. 동일성 백분율은 대각선 상부에 볼드체로, 유사성 백분율은 대각선 하부에 있다(보통체).
본 발명의 방법을 수행하는데 유용한 ANN 폴리펩티드 서열 간의 동일성 백분율은 서열번호 84 (NP_174810)에 비교 시 30% 아미노산 동일성만큼 낮을 수도 있다.
표 B2: 전장 폴리펩티드 서열에 걸친 전체적인 유사성 및 동일성에 대한 MatGAT 결과
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1. NP_174810 72.6 71.0 29.9 68.6 65.2 67.5 67.8 65.6 66.2 65.9
2. AAC33305 84.5 89.9 32.1 71.6 71.6 68.0 72.8 72.8 72.8 73.4
3. AAB71830 84.5 94.3 30.6 68.8 67.0 64.2 68.7 69.0 68.7 69.0
4. AAZ41833 36.4 37.4 36.8 32.6 29.4 33.4 33.9 29.6 30.0 30.2
5. AAB67994 82.3 84.5 83.2 38.7 63.1 72.2 85.5 63.4 63.1 63.1
6. 1DK5 83.9 83.9 81.7 37.7 79.2 63.6 64.5 91.0 91.9 91.6
7. AAD24540 81.1 82.6 81.0 38.7 83.9 77.6 74.4 63.9 64.2 64.9
8. AAR13288 81.7 84.5 82.6 39.3 92.7 78.6 84.8 65.2 65.2 66.5
9. CAA75213 84.2 85.1 83.2 37.4 81.0 95.7 79.1 80.4 92.4 92.7
10. CAB92956 83.9 85.4 83.5 37.6 80.6 95.3 79.1 80.4 97.8 98.4
11. AAC97494 83.9 85.4 83.5 37.6 80.6 95.3 79.1 80.4 97.8 100.0
12. AAC97493 80.8 80.4 79.4 37.8 82.9 77.6 92.1 85.8 79.4 79.4 79.4
13. NP_201307 79.8 81.4 80.1 44.5 85.5 79.2 83.9 84.5 80.1 80.4 80.4
14. CAA75214 83.6 84.2 82.3 37.1 80.0 94.7 78.2 79.7 98.4 97.5 97.5
15. ABB55363 83.3 84.8 82.9 37.3 79.7 94.7 78.5 79.7 96.5 98.7 98.7
16. NP_196585 80.4 80.4 79.1 41.2 84.2 78.9 82.0 82.6 80.4 81.0 81.0
17. CAA52903 80.8 82.0 81.6 38.6 83.8 79.2 82.3 83.2 81.5 81.5 81.5
18. AAZ67605 79.2 79.1 79.1 41.1 82.6 78.0 81.6 82.0 79.4 79.7 79.7
19. NP_181410 59.2 58.6 58.6 27.8 61.4 58.4 61.7 63.2 58.6 58.9 58.9
20. ABE65753 58.4 56.3 54.7 27.0 58.5 54.0 56.6 59.5 54.7 55.1 55.1
21. NP_181409 56.4 55.2 53.6 25.3 53.9 54.7 54.5 54.2 55.8 55.8 55.8
22. NP_196584 77.4 78.9 78.6 41.2 81.8 78.0 81.1 81.8 78.3 79.2 78.9
23. NP_568271 69.4 67.1 67.7 30.9 68.4 66.5 66.8 69.0 66.8 68.0 67.7
24. NP_001063096 55.8 55.7 53.8 27.4 59.0 54.7 57.0 58.5 54.9 54.6 54.6
25. NP_001048149 76.0 78.5 77.5 35.2 79.4 74.5 75.3 79.1 77.1 77.1 77.1
26. NP_001061839 55.1 54.5 52.6 27.1 57.6 53.7 57.0 56.1 55.1 53.9 53.9
27. NP_001057176 78.2 79.8 80.1 35.2 79.5 75.8 77.0 79.5 76.7 77.0 77.0
28. NP_001063343 53.0 53.6 52.4 26.1 53.6 50.3 52.0 52.0 50.8 51.1 51.1
29. NP_001055408 54.3 52.7 53.0 30.2 53.8 55.1 53.8 54.3 53.0 53.2 53.2
30. NP_001061661 27.8 27.6 27.3 24.9 26.8 24.2 28.4 26.8 28.1 27.3 27.3
31. NP_001051711 17.7 16.8 17.1 10.2 16.5 17.4 14.2 16.8 17.2 17.5 17.8
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
1. NP_174810 65.9 64.0 65.6 64.9 63.1 65.0 62.8 38.5 34.3 32.3 60.8
2. AAC33305 65.5 67.5 71.8 71.4 66.5 69.3 64.9 41.0 35.6 34.2 63.8
3. AAB71830 63.3 64.4 68.0 67.3 63.3 68.4 62.3 39.8 34.1 33.0 61.3
4. AAZ41833 32.4 41.8 29.3 29.5 35.9 33.1 35.3 19.9 17.5 16.8 34.8
5. AAB67994 70.3 70.1 63.1 62.1 68.1 70.5 67.5 39.6 34.9 35.1 64.9
6. 1DK5 62.0 61.8 90.7 90.4 62.0 63.6 61.1 40.0 33.5 34.2 59.8
7. AAD24540 87.0 70.3 63.6 62.9 69.3 69.6 69.3 42.5 36.9 33.7 67.6
8. AAR13288 73.7 71.0 65.2 63.8 70.3 69.3 68.7 43.5 36.6 35.3 67.3
9. CAA75213 62.0 64.4 97.1 90.8 64.6 64.2 62.7 41.9 35.6 35.0 61.9
10. CAB92956 63.6 64.4 92.4 98.4 63.9 65.2 62.7 41.3 35.3 34.1 61.6
11. AAC97494 64.2 64.4 92.7 96.8 64.9 65.8 63.6 42.2 35.0 34.7 62.3
12. AAC97493 68.1 62.7 62.3 68.0 66.5 67.4 40.4 36.0 33.4 65.4
13. NP_201307 81.4 63.1 63.0 79.2 69.7 78.9 42.2 37.4 34.9 74.9
14. CAA75214 79.0 79.5 90.8 63.9 63.0 62.3 41.0 35.0 34.7 61.6
15. ABB55363 78.8 79.8 96.2 62.6 63.8 61.3 40.4 34.5 34.1 60.3
16. NP_196585 80.7 89.9 79.7 80.4 69.0 89.9 41.9 38.2 34.7 82.4
17. CAA52903 80.3 83.3 80.9 80.4 81.0 68.4 40.8 35.1 33.8 67.0
18. AAZ67605 80.1 89.9 78.8 79.1 95.6 81.3 40.4 36.0 33.8 82.4
19. NP_181410 60.1 57.6 58.3 58.9 59.5 58.3 58.3 31.9 33.6 41.4
20. ABE65753 55.4 58.0 55.7 55.1 58.9 54.7 58.5 51.7 27.4 36.1
21. NP_181409 54.9 53.9 55.8 55.8 53.0 51.4 52.0 54.2 47.6 32.6
22. NP_196584 80.2 88.4 77.4 78.6 91.2 80.8 91.5 58.6 58.5 51.7
23. NP_568271 66.5 66.9 66.8 68.0 67.7 68.0 68.4 63.2 56.6 55.8 66.0
24. NP_001063096 57.5 59.0 55.2 54.4 59.2 57.1 58.9 55.1 72.2 46.1 59.1
25. NP_001048149 74.9 76.0 76.1 75.9 76.6 77.1 75.9 60.1 57.9 51.1 74.2
26. NP_001061839 56.1 58.3 54.8 53.6 57.9 55.5 57.0 54.5 69.2 46.4 58.6
27. NP_001057176 74.8 76.3 75.7 76.7 74.8 76.3 74.4 60.4 56.8 48.6 74.2
28. NP_001063343 51.4 52.4 50.8 50.8 53.0 48.3 52.0 48.6 48.9 50.2 52.4
29. NP_001055408 53.5 53.8 53.2 53.2 53.8 52.4 53.5 60.2 44.9 47.3 53.0
30. NP_001061661 29.1 29.4 28.1 29.4 28.1 25.8 27.3 26.3 26.0 28.9 27.3
31. NP_001051711 16.8 16.4 16.2 17.1 15.2 19.2 16.8 16.8 17.1 17.2 16.7
23 24 25 26 27 28 29 30 31
1. NP_174810 49.4 35.5 59.6 36.8 60.2 28.4 37.2 12.4 11.3
2. AAC33305 51.1 37.4 63.3 38.8 64.5 30.2 38.9 14.1 10.1
3. AAB71830 49.2 35.3 59.8 36.0 61.9 29.1 37.8 15.1 9.2
4. AAZ41833 22.7 19.2 29.0 19.0 28.9 14.6 21.5 14.4 8.0
5. AAB67994 51.3 36.8 63.1 39.0 61.8 30.6 39.0 12.5 10.1
6. 1DK5 48.6 35.2 60.8 33.9 59.5 29.0 41.3 12.2 10.5
7. AAD24540 51.4 37.2 61.1 40.7 62.6 28.3 39.4 14.9 9.5
8. AAR13288 51.7 37.5 63.6 38.8 63.5 30.2 40.8 14.3 7.9
9. CAA75213 48.6 36.5 62.0 35.6 60.7 30.5 39.1 13.0 10.5
10. CAB92956 49.2 35.5 62.0 34.8 61.0 29.5 39.1 12.5 9.9
11. AAC97494 49.5 35.5 63.0 34.8 61.9 29.5 39.7 12.5 8.6
12. AAC97493 49.8 36.9 59.5 39.8 59.4 28.0 38.3 13.7 11.6
13. NP_201307 48.1 40.4 59.6 39.6 60.8 27.9 40.1 12.9 10.7
14. CAA75214 48.9 35.3 60.8 35.3 59.4 29.8 38.9 13.0 9.9
15. ABB55363 48.3 35.3 61.0 34.0 60.6 29.2 38.4 13.2 10.2
16. NP_196585 50.5 38.7 61.4 38.8 58.2 28.3 39.4 12.9 11.4
17. CAA52903 49.1 36.3 60.3 36.0 59.6 27.5 37.6 13.0 9.4
18. AAZ67605 50.2 37.5 60.1 37.9 56.6 28.3 37.5 12.8 11.1
19. NP_181410 45.5 33.4 41.1 30.3 42.4 25.5 41.4 15.0 11.1
20. ABE65753 34.3 53.2 37.0 50.2 35.5 27.0 28.8 14.7 12.3
21. NP_181409 34.7 30.1 33.0 28.2 31.0 25.4 30.2 14.1 10.3
22. NP_196584 49.5 37.9 59.1 37.5 58.1 29.0 37.6 12.8 11.3
23. NP_568271 36.5 51.1 35.9 52.4 29.2 38.5 13.3 12.3
24. NP_001063096 58.9 37.8 68.5 38.6 30.4 29.3 14.0 12.1
25. NP_001048149 67.1 59.7 37.7 83.9 29.8 37.4 14.6 10.8
26. NP_001061839 57.3 84.4 57.3 38.4 31.8 30.9 16.8 15.5
27. NP_001057176 69.1 57.4 90.2 58.3 28.1 39.8 15.4 11.4
28. NP_001063343 50.2 50.2 49.8 49.2 49.2 19.8 14.6 10.9
29. NP_001055408 55.6 46.5 51.6 46.5 54.8 38.4 15.5 12.1
30. NP_001061661 27.6 26.5 29.4 27.6 27.3 28.6 29.1 13.4
31. NP_001051711 19.0 19.0 17.8 20.6 17.7 19.4 16.4 19.6
실시예 17: 본 발명의 방법의 수행에 유용한 폴리펩티드 서열에 포함된 도메인의 동정
InterPro (The Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites) 데이터베이스는 문자 및 서열에 근거한 탐색을 위한 통상적으로 사용되는 시그너처(signature) 데이터베이스에 대한 통합된 인터페이스이다. InterPro 데이터베이스는 단백질 시그너처를 유도하기 위해 다른 방법론 및 잘 규명된 단백질에 관한 다양한 정도의 생물학적 정보를 사용하는 이들 데이터베이스를 통합한다. 협 력 데이터베이스는 SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom 및 Pfam, Smart 및 TIGRFAMs을 포함한다. Pfam은 많은 일반적인 단백질 도메인 및 패밀리를 포함하는 복수 서열 정렬 및 hidden Markov 모델의 큰 집합체이다. Pfam는 영국의 Sanger Institute server에서 호스팅된다. Interpro는 영국의 European Bioinformatics Institute에서 호스팅된다.
서열번호 84로 표시된 폴리펩티드 서열의 InterPro 스캔의 결과는 표 B3에 제시되어 있다.
표 B3: 서열번호 84로 표시된 폴리펩티드 서열의 InterPro 스캔 결과 (주요 등록번호)
데이터베이스 등록번호 등록명 서열번호 84에 근접하는 아미노산
PRODOM PD000143 Annexin [16-78]T - [88-153]T - [172-239]T - [246-313]T
PRINTS PR00196 ANNEXIN [25-47]T - [65-81]T - [92-113]T - [255-275]T - [299-312]T
GENE3D G3DSA:1.10.220.10 Annexin [13-82]T - [83-161]T - [166-238]T - [243-317]T
PANTHER PTHR10502 Annexin [9-312]T
PFAM PF00191 Annexin [15-80]T - [87-152]T - [170-236]T - [246-311]T
SMART SM00335 ANX [28-80]T - [100-152]T - [183-232]T - [259-311]T
PROFILE PS00223 ANNEXIN [259-311]T
SUPERFAMILY SSF47874 Annexin [1-316]T
PRINTS PR01814 ANNEXINPLANT [119-133]T - [161-181]T - [227-245]T
PANTHER PTHR10502:SF10 Annexin_like [9-312]T
실시예 18: 본 발명의 방법의 수행에 유용한 폴리펩티드 서열의 Topology 예측
TargetP 1.1는 진핵세포 단백질의 세포 내 위치를 예측한다. 위치 지정은 임 의의 N-말단 사전 서열 (엽록체 운반 펩티드 (cTP), 미토콘드리아 표적 펩티드 (mTP) 또는 분비 경로 신호 펩티드 (SP))의 예측된 존재에 근거한다. 최종 예측이 근거를 둔 점수는 실제로 가능성은 아니며, 하나에 반드시 추가하지는 않는다. 그러나, 가장 높은 점수를 갖는 위치는 아마 TargetP에 따른 것이며, 점수 간에 상관관계 (신뢰성 등급)는 아마 그 예측이 얼마나 확실한가의 표시이다. 신뢰성 등급 (RC)은 1에서 5까지이며, 1은 가장 강한 예측을 나타낸다. TargetP는 [Technical University of Denmark]의 서버에서 유지된다.
N-말단 사전 서열을 포함하는 것으로 예측되는 서열에 대해 잠재적인 절단 부위도 예측 가능하다.
생물체 그룹 (비식물 또는 식물), 컷오프 세트 (없거나, 사전 지정된 컷오프 세트, 또는 사용자 정의된 컷오프 세트), 절단 부위 (유 또는 무) 예측의 계산 같은 많은 매개변수가 선택된다.
서열번호 84로 표시된 폴리펩티드 서열의 TargetP 1.1 분석 결과는 표 B4에 있다. "식물" 그룹이 선택되고, 컷오프는 지정되지 않고, 운반 펩티드의 예상 길이가 요청되었다. 서열번호 84로 표시된 폴리펩티드 서열의 세포 내 위치는 세포질 또는 핵일 수 있으며, 운반 펩티드가 없는 것으로 예측된다. 상기 예측은 애넥신 단백질이 원형질막, 액포 및 핵 외연과 관련되어 있다는 이전 보고 (Clark & Roux, Plant Physiol. 109, 1 133-1 139, 1995)와 일치한다.
표 B4: 서열번호 84로 표시된 폴리펩티드 서열의 TargetP 1.1 분석
길이 (AA) 317
엽록체 운반 펩티드 0.102
미토콘드리아 운반 펩티드 0.126
분비 경로 신호 펩티드 0.045
세포 내 다른 표적 0.905
예측된 위치 /
신뢰 등급 2
예측된 운반 펩티드 길이 /
하기의 것을 포함하여 많은 다른 알고리즘도 이런 분석 수행에 사용될 수 있다:
● [Technical University of Denmark]의 서버 상에 호스팅된 ChloroP 1.1;
● [Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane, Australia]의 서버 상에 호스팅된 Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor version 1.2;
● [University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada]의 서버 상에 호스팅된 PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5;
● [Technical University of Denmark]의 서버 상에 호스팅된 TMHMM
실시예 19: ANN 폴리펩티드에 대한 기능적 분석
애넥신-막 상호작용에 대한 분석 (Dabitz 등 Biochemistry 44, 16292-16300, 2005):
막 결합 분석 ( Copelletinq 분석)
인지질 소포를 Reeves 및 Dowben (J. Cell. Physiol. 73, 49-60, 1969)의 프로토콜에 따라 제조하였다. 식물 애넥신-막 결합 양상을 평가하기 위해 copelleting 분석을 수행하였다 (Hofmann 및 Huber, Methods Enzymol. 372, 186-216, 2003). 리포좀 버퍼에 0.5 nmol의 단백질 및 다양한 양의 칼슘을 포함하는 각 개별 시료(500 ㎕)에 대해 총 0.2 μmol의 인지질이 사용되었다. 이 단계에서, 10% SDS 100 ㎕에 단백질 0.1 nmol의 시료가 대조구로 준비되었다. 모든 시료를 원심분리하여 (4℃, 23,000 rpm으로 45분간), 펠렛(pellet)을 10% SDS 50 ㎕에 재현탁하여 SDS-PAGE에 사용하였다. 겔을 쿠마씨로 염색하여, ImageJ (Rasband, W. ImageJ,version 1.30, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 2005)을 사용하여 광학농도 분석을 하였다. 각 칼슘 농도는 3 회 독립적으로 평가하였다. 표준결합방정식(standard binding equation)을 사용하여 SigmaPlot으로 Curve fitting을 수행하였다.
인지질 소포 제조
막 표면 소수성 및 리포좀 누설 평가를 위한 실험을 위해 하기 프로토콜을 사용하였다. 뇌 PS (phosphatidylserine), 난 PC (egg phosphatidylcholine), 난 PE (phosphatidylethanolamine), NBD-PE (nitrobenzoxadiazole phosphatidylethanolamine), 및 Rh-PE (lissamine rhodamine B sulfonyl phosphatidylethanolamine)를 구입하였다. MLVs (Multilamellar phospholipid vesicles)를 Bangham 등 (Preparation and use of liposomes as models of biological membranes, in Methods in Membrane Biology (Korn, E. D., Ed.) pp 1-68, Plenum Press, New York, 1974)의 방법으로 제조하였다. 5 회의 동결-해동 과정 및 연이어 압출기(extruder) (Lipex Biomembranes, Vancouver, BC)를 사용하여 30℃에서 0.1 μm Nucleopore 여과막을 통과하는 압출성형(extrusion, 5 회)으로 MLVs를 LUVs (large unilamellar vesicles)로 변환하였다. 인산염 측정은 Chen 등 (Anal. Chem. 28, 1756- 1758, 1956)의 방법에 따라 수행하였다.
막 표면 소수성
응집 (aggregation) 중에 발생하는, 2 개의 소포간에 수분이 없는 계면의 생성 또는 막 표면에 단백질의 결합에 의해 인지질 헤드그룹(headgroup)의 탈수로 인하여 막 표면 소수성이 증가한다. 막 표면 소수성의 변화는 소포를 방출 파장이 프로브 환경의 유전상수(dielectric constant)에 비례하는 dansyl-PE (N-[5-(dimethylamino)-naphthalene-2-sulfonyl)-1,2-dioleoylyl-sn-glycero-3-PE)로 표지하여 관찰 가능하다. 상기 환경에서, 순수한 PS, PS/PE (3:1), 및 1 mol % dansyl-PE를 포함하는 PS/PC (1:1) LUVs를 제조하여 900 ㎕ 버퍼용액에 첨가하였다 (최종 인지질 농도 45 μM). 상기 소포에 미치는 애넥신의 효과는 칼슘이 없는 시료에 200nM (0.18 nmol) 단백질을 주입하여 다른 pH 값에서 관찰하였다. 시료는 340 nm에서 여기되어, 400에서부터 600 nm에서 (23) 형광 방출이 기록되었다. 표면 소수성의 칼슘-의존성 양상은 단백질만의 효과 모니터링 이후에 관찰되었다.
리포좀 누출 분석
애넥신-인지질 상호작용은 인지질 소포를 불안정하게 만들 수 있어, 결국 소포 내부의 누출이 일어나게 된다. 소포 누출은 DPX (p-xylen-bis-pyridiniumbromid)의 존재하에서 ANTS (8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid)의 형광 소멸에 의해 탐지된다. 수용성 플루오로포어 (fluorophore) ANTS 및 그의 소멸제 DPX가 소포가 제조되는 동안에 버퍼액에 첨가된다. 과다한 ANTS/DPX 버퍼액은 Sephadex G-50 컬럼을 사용하여 겔 여과로 제거한다. 교란되지 않은 소포에 있어서는, 플루오로포어(fluorophore) 및 소멸제가 공간적으로 근접하여 DPX가 ANTS의 형광을 끈다. 소포 누출의 정도가 증가함으로써, ANTS 및 DPX가 외부 버퍼액으로 희석되어, ANTS의 형광이 증가하게 된다 (Ellens 등, Biochemistry 24, 3099-3106, 1985).
애넥신 1의 페록시다아제 ( Peroxidase ) 활성 분석 ( Gorecka 등 2005)
진핵세포 또는 원핵세포 시스템에서 발현되는 재조합 애넥신1 단백질의 페록시다아제(Peroxidase) 활성은 2 가지 방법으로 조사할 수 있다. 첫 번째 방법은 산화된 루미날(luminal)의 화학발광(chemiluminescence)에 기반한 것이다. 비변성 전기영동(non-denaturating electrophoresis)으로 분리된, 분석될 단백질을 포함하는 시료를 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 막으로 옮겨, 루미놀(luminol)을 포함하는 현상액 (ECL kit, Amersham)으로 덮어, 제조자의 프로토콜에 따라 1시간 동안 X-ray 의학 필름에 노출시킨다. 또 다르게는, 재조합 애넥신1 단백질의 페록시다아제 활성은 여기 및 방출 양자에 대해 1-nm 슬릿으로 Fluorolog 3 분광형광계 (spectrofluorimeter: Jobin Yvon Spex, Edison, NJ)상에 Amplex Red reagent (Molecular Probes)로 형광강도측정법(fluorometric method)을 사용하여 결정된다. 분석 배지 (총 부피 100 ㎕)는 50 mM 인산칼륨 버퍼, pH 7.4, 2 mM H2O2, 최종 농도 100 μM의 Amplex Red reagent를 포함한다. 측정은 광로 길이(optical path length) 10 mm의 석영 큐벳(0.1 ml 부피)으로 하였다. Amplex Red reagent 산화의 산물인 resorufin의 형광방출은 λem 590 nm (λexc 560 nm)에서 기록하였다. 페록시다아제 활성에 미치는 단백질 인산화의 효과의 측정을 위해, AnnAt1은 측정에 앞서 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase: Sigma, 15 U/ml)와 36℃에서 10분간, pH 7.4 인산칼륨 버퍼 내에서 인큐베이션하였다. AnnAt1이 없는 시료가 대조구로 사용되었다.
실시예 20: 본 발명의 방법에 사용된 핵산 서열의 클로닝
본 발명의 방법에 사용된 핵산 서열은 주문제작한 아라비돕시스 탈리아나 실생 cDNA 라이브러리 (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK)를 주형으로 사용하여 PCR로 증폭되었다. PCR은 표준 조건에서 Hifi Taq DNA 중합효소를 사용하여, 50 ㎕ PCR 혼합물 내에 주형 200 ng을 사용하여 수행되었다. 사용된 프라이머는 prmO8727 (서열번호 85; 정방향, 개시 코돈은 볼드체): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcgactcttaaggtttct-3' 및 prm09025 (서열번호 86; 역방향, 상보적): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttaagcatcatcttcaccgag-3', 상기 프라이머는 Gateway 재조합에 대한 AttB 부위를 포함한다. 증폭된 PCR 단편은 표준 방법을 사용하여 정제되었다. Gateway 과정의 첫 단계인 BP 반응이 수행되었으며, 이 때 PCR 단편이 Gateway 용어에 따르면 "entry 클론" pANN을 생성하기 위해 pDONR201 플라 스미드와 인 비보(in vivo)로 재조합된다. 플라스미드 pDONR201은 Gateway
Figure 112009078358116-pct00006
기술의 일부분으로서, Invitrogen으로부터 구입하였다.
서열번호 83을 포함하는 entry 클론이 오리자 사티바(Oryza sativa) 형질전환에 사용된 destination 벡터와 LR 반응에 사용되었다. 상기 벡터는 T-DNA 경계부 내에 기능적 인자로서 하기를 포함한다: 식물 선발 마커; 스크리닝 가능한 마커 발현 카세트; 및 entry 클론에 이미 클로닝된 목적 핵산 서열과 LR 인 비보(in vivo) 재조합 예정된 Gateway 카세트. 녹색 조직 특이적 발현을 위한 벼 익스팬신(expansin) 프로모터 (서열번호 95)는 상기 Gateway 카세트의 상부에 위치한다.
또 다른 일구현에서, GOS2 프로모터 (서열번호 94)를 포함하는 destination 벡터가 발현 벡터 pGOS2::ANN 생성에 사용되었다.
LR 재조합 단계 후, 생성된 발현 벡터 pEXP::ANN (도 10) 또는 pGOS2::ANN는 당업계에 주지된 방법에 따라 아그로박테리움(Agrobacterium) 균주 LBA4044로 형질전환되었다.
실시예 21: 식물 형질전환
벼 식물의 형질전환은 본 발명의 실시예 8에 기술된 과정에 따라 수행되었다.
실시예 22: 표현형 평가 절차
22.1 평가 셋업
약 35개의 독립적인 T0 벼 형질전환체가 생성되었다. 일차 형질전환체를 조직배양실에서 온실로 옮겨 키워 T1 종자를 수확하였다. 트랜스진의 유/무에 대하여 3:1로 분리되는 T1 자손 중 6 events를 보유하였다. 이들 events의 각각에 대해, 트랜스진을 갖는 (이형- 및 동형접합자) 약 10 개의 T1 실생 및 트랜스진이 없는 (공접합자) 약 10 개의 T1 실생을 가시적 마커 발현을 관찰하여 선발하였다. 형질전환 식물 및 해당 공접합자를 무작위 위치에 나란히 키웠다. 온실 조건은 단일 (12 시간 빛), 명소에서 28℃, 암소에서 22℃, 및 상대습도 70%였다.
4개의 T1 events는 T2 세대에서 T1 세대에 대해서와 동일한 평가 절차이나 event 당 보다 많은 개체로 한층 더 평가되었다. 파종 단계에서부터 성숙 단계까지 식물에 디지털 이미지 캐비닛을 몇 회 통과시켰다. 매번 각 식물의 디지털 이미지 (2048x1536 픽셀, 16 백만 색)를 적어도 6 가지 다른 각도에서 촬영하였다.
가뭄 스크린
T2 종자로부터의 식물체를 정상적인 조건에서 이삭이 나오는 단계에 이를 때까지 화분에서 키웠다. 관개가 억제된 "건조한" 곳으로 옮겼다. 토양 수분 함량 (SWC)을 모니터하기 위해 무작위로 선택한 화분에 습도 탐침을 삽입하였다. SWC가 특정 역치 밑으로 떨어질 때에는 정상적인 수준에 다시 도달할 때까지 연속적으로 자동적으로 식물에 재급수하였다. 식물체를 다시 정상적인 조건으로 옮겼다. 재배의 나머지 과정 (식물 성숙, 종자 수확)은 비생물적 스트레스 조건하에서 키우지 않은 식물과 동일하였다. 생장 및 수확량 매개변수는 정상적인 조건하의 생장에 대해서만큼 상세하게 기록하였다.
질소 이용 효율 스크린
T2 종자로부터의 벼 식물체를 양분액을 제외하고는 정상적인 조건하에서 화분용 상토에서 키웠다. 질소 함량이 감소된 특정 양분액으로 이식에서부터 성숙에 이를 때까지, 보통 7 내지 8 회 이하로 화분에 급수하였다. 재배 (식물 성숙, 종자 수확)의 나머지 부분은 비생물적 스트레스 하에서 키우지 않은 식물과 동일하다. 생장 및 수확량 매개변수는 정상적인 조건하의 생장에 대해서만큼 상세하게 기록하였다.
22.2 통계적 분석: F-검정
식물의 표현형적 특징의 종합적인 평가를 위한 통계적 모델로 2 인자 ANOVA (변이체의 분석)를 사용하였다. 본 발명의 유전자로 형질전환된 모든 건의 모든 식물에서 측정된 모든 매개변수에 대하여 F-검정이 수행되었다. 모든 형질전환 건에 미치는 유전자의 종합적인 효과를 점검하고 전체적인 유전자 효과로 알려진 유전자의 종합적인 효과를 확인하기 위하여 F-검정이 수행되었다. F-검정에 대하여 진정한 전체적인 유전자 효과에 대한 유의성 역치는 5% 확률 수준으로 설정하였다. 유의한 F-검정 값은 유전자 효과를 나타내는데, 이는 표현형 상의 차이를 야기한 것이 유전자의 단순한 존재나 위치만이 아니라는 의미이다.
중복적인 events의 2 회 실험이 수행되었으므로, 조합된 분석이 수행되었다. 이는 두 실험에 걸친 효과의 일관성을 확인하기에 유용하며, 그렇다면 결론에 대한 신뢰도를 증가시키기 위해 양 실험으로부터의 증거를 축적하는 것이 유용하다. 사용된 방법은 자료의 다층구조를 고려하는 혼합모델 접근(mixed-model approach)이 다. P 값은 우도비 검정 (likelihood ratio test)을 카이 제곱 분포에 비교함으로써 구했다.
22.3 측정된 매개변수
생물량 관련 매개변수 측정
파종 단계에서부터 성숙 단계까지 식물에 디지털 이미지 캐비닛을 몇 회 통과시켰다. 매번 각 식물의 디지털 이미지 (2048x1536 픽셀, 1,600만 가지 색)를 적어도 6 가지 다른 각도에서 촬영하였다.
식물 지상부 면적 (또는 잎으로 된 생물량)은 백그라운드로부터 구분되는 지상부 식물 부분의 디지털 이미지의 픽셀의 총 수를 세어 결정하였다. 이 값은 다른 각도에서 동일한 시점에 촬영한 그림에 대해 평균을 내었으며, 보정에 의해 평방 mm로 표시된 물리적 표면 값으로 전환되었다. 실험은 이 방식으로 측정된 지상부 식물 면적이 지상부 식물 부분의 생물량과 상관관계가 있음을 보여준다. 지상부 면적은 식물의 잎으로 된 생물량이 최대에 달한 시점에서 측정된 면적이다.
종자 관련 매개변수 측정
성숙한 일차 원추화서를 수확하여, 세고, 봉지에 넣어, 바코드로 표지하여 37℃ 오븐에서 3일간 건조하였다. 원추화서를 타작하여 모든 종자를 수집하고, 세었다. 충만된 깍지는 공기분출기를 사용하여 빈 것과 분리하였다. 빈 깍지는 버리고 나머지를 세었다. 충만된 깍지는 분석 저울로 무게를 재었다. 충만된 종자의 수는 분리 단계 후 남은 충만된 깍지의 수를 세어 결정하였다. 총 종자 수확량은 식물체로부터 수확된 모든 충만된 깍지 중량으로 측정하였다. 식물체당 총 종자수는 식물체로부터 수확된 깍지의 수를 세어 측정하였다. 천립중량 (TKW)은 숫자를 센 충만된 종자의 수와 그 총 중량으로부터 외삽하였다. 본 발명에서 수확지수 (HI)는 총 종자 수확량과 지상부 면적 (mm2) 간의 비율에 106을 곱한 것으로 정의된다. 본 발명에서 정의된 원추화서당 총 꽃의 수는 총 종자 수와 성숙한 1차 원추화서의 수간의 비율이다. 본 발명에서 정의된 종자 충만도(fill rate)는 총 종자 (또는 소화) 수에 대한 충만된 종자 수의 비율 (%)로 표시된다.
실시예 23: 형질전환 식물의 표현형 평가 결과
구성적 프로모터에 작동가능하게 연결된 ANN 핵산을 발현하는 형질전환 벼 식물은 스트레스가 없는 조건하에서, 5% 이상의 증가를 보인 것은 총 종자 수확량, 충만된 종자의 수, 충만도, 및 수확 지수이었으며, TKW에 대해서는 3% 이상의 증가를 보였다. 가뭄 스트레스 조건하에서는 총 종자 수확량, 충만된 종자의 수, 및 충만도의 증가가 관찰되었다.
녹색 조직 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 ANN 핵산을 발현하는 식물 또한 증가된 수확량, 특히 증가된 TKW를 나타내었다.
실시예 24: 다른 작물의 형질전환의 예
다른 작물의 형질전환은 본 발명의 상기 실시예 12에 기재되어 있다.
<110> Cropdesign N.V. Crop Functional Genomics Center <120> Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same <130> PF59233 <150> EP 07108768.8 <151> 2007-05-23 <150> US 60/932,226 <151> 2007-05-29 <150> EP 07110086.1 <151> 2007-06-12 <150> US 60/937,994 <151> 2007-06-29 <160> 155 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 848 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 1 ttgtacaaaa aagcaggctt aaacaatggc gtctgttgct tcttcaacca ctctcatctc 60 ctcctccgct agtgttctcc cagccaccaa gtcttcgctt cttccatctc cctccctctc 120 tttccttcca accctctcct ctccttcccc atccgcttct ctccggctcc ctcgtccctc 180 tcccctcacc tcaatccgct cctcttctcg ccggagcttc gctgtcaagg cccaaaccga 240 tgatcttcca ttggttggaa acaaggcgcc tgattttgag gcagaggctg tgttcgatca 300 ggagttcatc aaggtcaagc tctctgagta cattgggaag aagtatgtga ttctcttttt 360 ctaccccttg gacttcactt tcgtctgccc aacagagatt actgccttca gtgaccgata 420 tgcagaattt gagaagctga acacagaagt gttaggtgtc tctgttgata gtgtgttctc 480 ccaccttgct tgggttcaaa ccgacagaaa atctggagga cttggtgatc tcaactatcc 540 acttatatca gatgtcacta aatctatctc aaaatctttt ggagtgctca tccatgatca 600 gggaatagcg ttgagagggc ttttcataat agacaaggaa ggagtgatcc aacattcaac 660 catcaacaat cttggtattg gccgaagtgt tgatgagaca atgagaaccc ttcaggcatt 720 acagtacatc caggagaacc ctgatgaagt ctgccctgca ggatggaaac caggggagaa 780 gtcaatgaaa cctgacccca agctcagcaa agagtacttc tcagctattt agctcgaacc 840 cagctttc 848 <210> 2 <211> 268 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 2 Met Ala Ser Val Ala Ser Ser Thr Thr Leu Ile Ser Ser Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Leu Pro Ala Thr Lys Ser Ser Leu Leu Pro Ser Pro Ser Leu Ser 20 25 30 Phe Leu Pro Thr Leu Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Ser Leu Arg Leu 35 40 45 Pro Arg Pro Ser Pro Leu Thr Ser Ile Arg Ser Ser Ser Arg Arg Ser 50 55 60 Phe Ala Val Lys Ala Gln Thr Asp Asp Leu Pro Leu Val Gly Asn Lys 65 70 75 80 Ala Pro Asp Phe Glu Ala Glu Ala Val Phe Asp Gln Glu Phe Ile Lys 85 90 95 Val Lys Leu Ser Glu Tyr Ile Gly Lys Lys Tyr Val Ile Leu Phe Phe 100 105 110 Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe 115 120 125 Ser Asp Arg Tyr Ala Glu Phe Glu Lys Leu Asn Thr Glu Val Leu Gly 130 135 140 Val Ser Val Asp Ser Val Phe Ser His Leu Ala Trp Val Gln Thr Asp 145 150 155 160 Arg Lys Ser Gly Gly Leu Gly Asp Leu Asn Tyr Pro Leu Ile Ser Asp 165 170 175 Val Thr Lys Ser Ile Ser Lys Ser Phe Gly Val Leu Ile His Asp Gln 180 185 190 Gly Ile Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Lys Glu Gly Val Ile 195 200 205 Gln His Ser Thr Ile Asn Asn Leu Gly Ile Gly Arg Ser Val Asp Glu 210 215 220 Thr Met Arg Thr Leu Gln Ala Leu Gln Tyr Ile Gln Glu Asn Pro Asp 225 230 235 240 Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp Lys Pro Gly Glu Lys Ser Met Lys Pro 245 250 255 Asp Pro Lys Leu Ser Lys Glu Tyr Phe Ser Ala Ile 260 265 <210> 3 <211> 841 <212> DNA <213> Brassica rapa <220> <221> misc_feature <222> (662)..(662) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 gccatatggc gtctgttgct tcttcaacca ctctcatctc ctcctccgct agtgttctcc 60 cagccaccaa gtcttcgctt cttccatctc cctccctctc tttccttcca accctctcct 120 ctccttcccc atccgcttct ctccggtccc tcgtccctct cccctcacct caatccgctt 180 cctcttctcg ccggagcttc gctgtcaagg gccaaaccga tgatcttcca ttggttggaa 240 acaaggcgcc tgattttgag gcagagggtg tgttcgatca ggagttcatc aagttcatca 300 aggtcaagct ctctgattac attgggaaaa agtatgtgat tctctttttt ctaccccttg 360 acttcacttt cgtctgccca acagaaatta ctgccttcag tgaccgatat gcagaatttg 420 agaagctgaa tacagaagtg ttaggtgttt ctgttgatag tgtgagtgtg ttctcccacc 480 ttgctggggt tcaaaccgac agaaaatttg gaggacttgg tgatctcaac tatccactta 540 tatcagatgt cactaaatct atctcaaaat cttttggagt gctcatccat gatcagggaa 600 tagcgttgag agggcttttc ataatagaca aggaaggagt gatccaacat tcaaccatca 660 anaatcttgg tattggccga agtgttgatg agacaatgag aacccttcag gcattacagt 720 acatccagga aggccctggt gaagtctgcc ctgcaggatg gaaaccaggg gagaagtcaa 780 tgaaacctga ccccaagctc agcaaagagc tcttctcagc tatttagctc gaggctaagc 840 c 841 <210> 4 <211> 273 <212> PRT <213> Brassica rapa <220> <221> UNSURE <222> (219)..(219) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 4 Met Ala Ser Val Ala Ser Ser Thr Thr Leu Ile Ser Ser Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Leu Pro Ala Thr Lys Ser Ser Leu Leu Pro Ser Pro Ser Leu Ser 20 25 30 Phe Leu Pro Thr Leu Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Ser Leu Arg Ser 35 40 45 Leu Val Pro Leu Pro Ser Pro Gln Ser Ala Ser Ser Ser Arg Arg Ser 50 55 60 Phe Ala Val Lys Gly Gln Thr Asp Asp Leu Pro Leu Val Gly Asn Lys 65 70 75 80 Ala Pro Asp Phe Glu Ala Glu Gly Val Phe Asp Gln Glu Phe Ile Lys 85 90 95 Phe Ile Lys Val Lys Leu Ser Asp Tyr Ile Gly Lys Lys Tyr Val Ile 100 105 110 Leu Phe Phe Leu Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile 115 120 125 Thr Ala Phe Ser Asp Arg Tyr Ala Glu Phe Glu Lys Leu Asn Thr Glu 130 135 140 Val Leu Gly Val Ser Val Asp Ser Val Ser Val Phe Ser His Leu Ala 145 150 155 160 Gly Val Gln Thr Asp Arg Lys Phe Gly Gly Leu Gly Asp Leu Asn Tyr 165 170 175 Pro Leu Ile Ser Asp Val Thr Lys Ser Ile Ser Lys Ser Phe Gly Val 180 185 190 Leu Ile His Asp Gln Gly Ile Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp 195 200 205 Lys Glu Gly Val Ile Gln His Ser Thr Ile Xaa Asn Leu Gly Ile Gly 210 215 220 Arg Ser Val Asp Glu Thr Met Arg Thr Leu Gln Ala Leu Gln Tyr Ile 225 230 235 240 Gln Glu Gly Pro Gly Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp Lys Pro Gly Glu 245 250 255 Lys Ser Met Lys Pro Asp Pro Lys Leu Ser Lys Glu Leu Phe Ser Ala 260 265 270 Ile <210> 5 <211> 1002 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 5 gtgattgaca gatagataag agtgtttggt agctcagact cagagagtca caaagtgtgt 60 gtagcagcaa tggcgtctgt tgcttcttca actactctca tctcttctcc ctcttctagg 120 gtttttccag caaagtcttc actttcctct ccatctgttt ctttccttcg aaccctttct 180 tctccttccg catctgcttc tctccgctcc ggatttgctc gacgctcttc cctcagctcc 240 acttctcgtc ggagctttgc tgtcaaagcc caggccgatg atcttccact ggttggaaac 300 aaggcgcctg attttgaggc agaggctgtg tttgatcaag agttcatcaa ggttaagctc 360 tctgattaca ttggaaagaa gtatgtgatt ctctttttct acccattgga ctttactttc 420 gtctgcccaa cagagattac tgccttcagt gaccggcatt cagaatttga gaagttgaac 480 accgaagtat taggtgtttc tgtcgatagt gtgttctctc accttgcatg ggtccaaaca 540 gacaggaaat ctggagggct tggtgatctg aactatcccc ttatttcata tttcactaaa 600 tcaatctcaa agtcgttcgg agtgctcatc catgatcagg gaatagcact gagaggactt 660 ttcataatcg acaaggaagg agtgatccaa cattccacca tcaacaatct tggtattggc 720 caaagcgttg atgagacaat gagaaccctc caggcattac agtacatcca ggaaaacccg 780 gatgaagtct gcccagcagg atggaagccg ggtgagaagt caatgaaacc cgacccaaaa 840 ctcagcaaag agtacttctc agctatttag aaactctact atgatagcaa aaaggtacaa 900 tctttgttat atgtgagcag agtttttttt cttgtacgct aaaacaatcc tttgtttgat 960 tctcactttg tccccaaaat tataataaaa aactttttcc gc 1002 <210> 6 <211> 266 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 6 Met Ala Ser Val Ala Ser Ser Thr Thr Leu Ile Ser Ser Pro Ser Ser 1 5 10 15 Arg Val Phe Pro Ala Lys Ser Ser Leu Ser Ser Pro Ser Val Ser Phe 20 25 30 Leu Arg Thr Leu Ser Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Arg Ser Gly 35 40 45 Phe Ala Arg Arg Ser Ser Leu Ser Ser Thr Ser Arg Arg Ser Phe Ala 50 55 60 Val Lys Ala Gln Ala Asp Asp Leu Pro Leu Val Gly Asn Lys Ala Pro 65 70 75 80 Asp Phe Glu Ala Glu Ala Val Phe Asp Gln Glu Phe Ile Lys Val Lys 85 90 95 Leu Ser Asp Tyr Ile Gly Lys Lys Tyr Val Ile Leu Phe Phe Tyr Pro 100 105 110 Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser Asp 115 120 125 Arg His Ser Glu Phe Glu Lys Leu Asn Thr Glu Val Leu Gly Val Ser 130 135 140 Val Asp Ser Val Phe Ser His Leu Ala Trp Val Gln Thr Asp Arg Lys 145 150 155 160 Ser Gly Gly Leu Gly Asp Leu Asn Tyr Pro Leu Ile Ser Tyr Phe Thr 165 170 175 Lys Ser Ile Ser Lys Ser Phe Gly Val Leu Ile His Asp Gln Gly Ile 180 185 190 Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Lys Glu Gly Val Ile Gln His 195 200 205 Ser Thr Ile Asn Asn Leu Gly Ile Gly Gln Ser Val Asp Glu Thr Met 210 215 220 Arg Thr Leu Gln Ala Leu Gln Tyr Ile Gln Glu Asn Pro Asp Glu Val 225 230 235 240 Cys Pro Ala Gly Trp Lys Pro Gly Glu Lys Ser Met Lys Pro Asp Pro 245 250 255 Lys Leu Ser Lys Glu Tyr Phe Ser Ala Ile 260 265 <210> 7 <211> 988 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 7 gtcgaccacg cgtccggaga gaaagagaga gagagcagag ttcttcagtc catggcttcc 60 ttagcttcaa ccaccacact tatctcttca tctagcgttc ttcttccctc aaagccttct 120 cctttttctc ccgccgcctc cttcctccga actcttcctt ctacctccgt atctacctcc 180 tcttctctcc gctcctgttt ctccagcatc agtcccctca cctgcatccg ctcttcctct 240 cgccctagct tcgccgtcaa ggcccaggct gatgatttgc cactggttgg taacaaggcg 300 cctgattttg aggcagaggc tgtttttgac caagagttca tcaaggtgaa gctctcagag 360 tacattggta aaaagtatgt gattctgttt ctctaccctt tggacttcac ttttgtctgc 420 cctacggaga ttactgcctt cagtgaccgt tatgaagaat ttgagaagct aaacacggaa 480 gtgttaggtg tctcagtcga cagtgtgttc tcgcatcttg cgtgggtcca aacagagaga 540 aagtcaggag ggctgggtga cctgaactac ccacttgtct ctgatatcac taaatccatt 600 tcaaaatctt ttggagtgct catccctgat cagggcattg cactgagagg gcttttcatc 660 atcgacaaaa aaggagtcat acagcattcc acaatcaaca acctcggtat tggccgaagc 720 gttgatgaga caatgagaac cctccaggca ttgcagtatg ttcaagaaaa ccctgatgag 780 gtttgccccg cgggatggaa gcctggggag aaatcgatga agcctgaccc caagctgagc 840 aaagagtatt tttcagctat ttaaaggctt tttaaacaaa tgattggtga aaagcagagg 900 catgttttgt cttcattgct tatgtttctg ctatgtgtgt tttcctcaaa attgaataaa 960 aataatggaa tttaaaaaaa aaaaaaaa 988 <210> 8 <211> 270 <212> PRT <213> Brassica napus <400> 8 Met Ala Ser Leu Ala Ser Thr Thr Thr Leu Ile Ser Ser Ser Ser Val 1 5 10 15 Leu Leu Pro Ser Lys Pro Ser Pro Phe Ser Pro Ala Ala Ser Phe Leu 20 25 30 Arg Thr Leu Pro Ser Thr Ser Val Ser Thr Ser Ser Ser Leu Arg Ser 35 40 45 Cys Phe Ser Ser Ile Ser Pro Leu Thr Cys Ile Arg Ser Ser Ser Arg 50 55 60 Pro Ser Phe Ala Val Lys Ala Gln Ala Asp Asp Leu Pro Leu Val Gly 65 70 75 80 Asn Lys Ala Pro Asp Phe Glu Ala Glu Ala Val Phe Asp Gln Glu Phe 85 90 95 Ile Lys Val Lys Leu Ser Glu Tyr Ile Gly Lys Lys Tyr Val Ile Leu 100 105 110 Phe Leu Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Thr 115 120 125 Ala Phe Ser Asp Arg Tyr Glu Glu Phe Glu Lys Leu Asn Thr Glu Val 130 135 140 Leu Gly Val Ser Val Asp Ser Val Phe Ser His Leu Ala Trp Val Gln 145 150 155 160 Thr Glu Arg Lys Ser Gly Gly Leu Gly Asp Leu Asn Tyr Pro Leu Val 165 170 175 Ser Asp Ile Thr Lys Ser Ile Ser Lys Ser Phe Gly Val Leu Ile Pro 180 185 190 Asp Gln Gly Ile Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Lys Lys Gly 195 200 205 Val Ile Gln His Ser Thr Ile Asn Asn Leu Gly Ile Gly Arg Ser Val 210 215 220 Asp Glu Thr Met Arg Thr Leu Gln Ala Leu Gln Tyr Val Gln Glu Asn 225 230 235 240 Pro Asp Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp Lys Pro Gly Glu Lys Ser Met 245 250 255 Lys Pro Asp Pro Lys Leu Ser Lys Glu Tyr Phe Ser Ala Ile 260 265 270 <210> 9 <211> 1146 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 9 agctatttgg tttctctatc cgattcgtct ctctcacgcc ctcacgttta tccacctcat 60 cctcaaacca aaccacaaga cctctttttt aagtaaccaa tcacagagag atagagagag 120 agaacagagt caatgtcaat ggcgtctata gcttcttctt cttccaccac cctactctct 180 tcctctaggg ttcttcttcc ctccaagtct tctcttttat ctcctaccgt ctctttcccc 240 agaatcatac cctcttcctc ggcatcatcc tcttctctct gttccgggtt ctccagtctc 300 ggttccctca ccaccaaccg ctccgcctca cgccggaact tcgccgtcaa ggctcaggct 360 gatgatttac cactggtcgg taataaggcg cctgattttg aagctgaggc agtttttgat 420 caagagttca taaaggtgaa gctctctgag tacattggca aaaagtatgt tattctattc 480 ttctaccctt tggacttcac ttttgtctgc cccactgaga ttactgcctt cagtgaccgt 540 tatgaagaat ttgagaagct aaacaccgaa gtattagggg tctctgtcga cagtgtgttc 600 tcgcatcttg cgtgggtcca aacagacaga aagtcgggag ggctcggtga tctgaattat 660 cctcttgttt cggatatcac taaatccatt tcaaaatcgt ttggagtgct catccctgat 720 cagggcattg cactgagagg gcttttcatc atagacaagg aaggagtcat tcagcattcc 780 accatcaaca acctcggtat tggccgaagt gttgatgaga caatgagaac cctccaggca 840 ttacagtatg ttcaagaaaa cccggatgaa gtgtgccctg cgggatggaa gccaggggag 900 aaatcaatga aacctgaccc caagctcagc aaagaatact tttcagctat ctagaggcta 960 agattgaaca catgtttggt gaaaattagc aatcagagtt gttttattcg tcttttcaaa 1020 gttggagcag agttgttatt tttagccaaa gaacctttgt atctatctca tctttctcct 1080 gtttctgcta tgtgattctc cttaaattga atcaaaaata aagaaatcct tcttttcttt 1140 tgccaa 1146 <210> 10 <211> 271 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 10 Met Ala Ser Ile Ala Ser Ser Ser Ser Thr Thr Leu Leu Ser Ser Ser 1 5 10 15 Arg Val Leu Leu Pro Ser Lys Ser Ser Leu Leu Ser Pro Thr Val Ser 20 25 30 Val Pro Arg Thr Leu His Ser Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ser Leu Cys 35 40 45 Ser Gly Phe Ser Ser Leu Gly Ser Leu Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser 50 55 60 Arg Arg Asn Phe Ala Val Lys Ala Gln Ala Asp Asp Leu Pro Leu Val 65 70 75 80 Gly Asn Lys Ala Pro Asp Phe Glu Ala Glu Ala Val Phe Asp Gln Glu 85 90 95 Phe Ile Lys Val Lys Leu Ser Glu Tyr Ile Gly Lys Lys Tyr Val Ile 100 105 110 Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile 115 120 125 Thr Ala Phe Ser Asp Arg Tyr Glu Glu Phe Glu Lys Leu Asn Thr Glu 130 135 140 Val Leu Gly Val Ser Val Asp Ser Val Phe Ser His Leu Ala Trp Val 145 150 155 160 Gln Thr Asp Arg Lys Ser Gly Gly Leu Gly Asp Leu Asn Tyr Pro Leu 165 170 175 Val Ser Asp Ile Thr Lys Ser Ile Ser Lys Ser Phe Gly Val Leu Ile 180 185 190 Pro Asp Gln Gly Ile Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Lys Glu 195 200 205 Gly Val Ile Gln His Ser Thr Ile Asn Asn Leu Gly Ile Gly Arg Ser 210 215 220 Val Asp Glu Thr Met Arg Thr Leu Gln Ala Leu Gln Tyr Val Gln Glu 225 230 235 240 Asn Pro Asp Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp Lys Pro Gly Glu Lys Ser 245 250 255 Met Lys Pro Asp Pro Lys Leu Ser Lys Glu Tyr Phe Ser Ala Ile 260 265 270 <210> 11 <211> 867 <212> DNA <213> Spinacia oleracea <400> 11 gtgtgtagca gcaatggcgt gtgttgcttc ttcaactact ctcatctctt ctccctcttc 60 tagggttttt ccagcaaagt cttcactttc ctctccatct gtttctttcc ttcgaaccct 120 ttcttctcct tccgcatctg cttctctccg ctccggattt gctcgacgct cttccctcag 180 ctccacttct cgtcggagct ttgctgtcaa agcccaggcc gatgatcttc cactggttgg 240 aaacaaggcg cctgattttg aggcagaggc tgtgtttgat caagagttca tcaaggttaa 300 gctctctgat tacattggaa agaagtatgt gattctgttt ttctacccat tggactttac 360 tttcgtctgc ccaacagaga ttactgcctt cagtgaccgg cattcagaat ttgagaagtt 420 gaacaccgaa gtattaggtg tttctgtcga tagtgtgttc tctcaccttg catgggtcca 480 aacagacagg aaatctggag ggcttggtga tctgaactat ccccttattt cagatgtcac 540 taaatcaatc tcaaagtcgt tcggagtgct catccatgat cagggaatag cactgagagg 600 acttttcata atcgacaagg aaggagtgat ccaacattcc accatcaaca atcttggtat 660 tggccgaagc gttgatgaga caatgagaac cctccaggca ttacagtaca caggaaaccc 720 ggatgaagtc tgcccagcag gatggaagcc gggtgagaag tcaatgaaac ccgacccaaa 780 actcagcaag gagtacttct cagctattta gaactctact atgatagcaa aggtacatct 840 ttgttatatg tgagcagagt ttttctg 867 <210> 12 <211> 265 <212> PRT <213> Spinacia oleracea <400> 12 Met Ala Cys Val Ala Ser Ser Thr Thr Leu Ile Ser Ser Pro Ser Ser 1 5 10 15 Arg Val Phe Pro Ala Lys Ser Ser Leu Ser Ser Pro Ser Val Ser Phe 20 25 30 Leu Arg Thr Leu Ser Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Arg Ser Gly 35 40 45 Phe Ala Arg Arg Ser Ser Leu Ser Ser Thr Ser Arg Arg Ser Phe Ala 50 55 60 Val Lys Ala Gln Ala Asp Asp Leu Pro Leu Val Gly Asn Lys Ala Pro 65 70 75 80 Asp Phe Glu Ala Glu Ala Val Phe Asp Gln Glu Phe Ile Lys Val Lys 85 90 95 Leu Ser Asp Tyr Ile Gly Lys Lys Tyr Val Ile Leu Phe Phe Tyr Pro 100 105 110 Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser Asp 115 120 125 Arg His Ser Glu Phe Glu Lys Leu Asn Thr Glu Val Leu Gly Val Ser 130 135 140 Val Asp Ser Val Phe Ser His Leu Ala Trp Val Gln Thr Asp Arg Lys 145 150 155 160 Ser Gly Gly Leu Gly Asp Leu Asn Tyr Pro Leu Ile Ser Asp Val Thr 165 170 175 Lys Ser Ile Ser Lys Ser Phe Gly Val Leu Ile His Asp Gln Gly Ile 180 185 190 Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Lys Glu Gly Val Ile Gln His 195 200 205 Ser Thr Ile Asn Asn Leu Gly Ile Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Met 210 215 220 Arg Thr Leu Gln Ala Leu Gln Tyr Thr Gly Asn Pro Asp Glu Val Cys 225 230 235 240 Pro Ala Gly Trp Lys Pro Gly Glu Lys Ser Met Lys Pro Asp Pro Lys 245 250 255 Leu Ser Lys Glu Tyr Phe Ser Ala Ile 260 265 <210> 13 <211> 990 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 13 ggcacgagct cctatccaat ggcttgctct gcttcttcta cagcacttct ttcttccaac 60 ccaaaagcag cttccatttc ccccaaatcc tcctttcaag ctcccatttc tcaatgttta 120 tctgtacctt cctctttcaa tgggctccgt aattgcaagc cttttgtttc tcgtgtagcc 180 cgttccctct ctactcgcgt tgctcaatcc caacgccgtc gtttcgttgt tcgtgcctct 240 agtgaacttc cacttgttgg aaatcaagcg ccagactttg aggctgaagc tgtttttgat 300 caagaattca tcaaggttaa actatctgag tacattggga agaagtatgt cattctcttt 360 ttctacccac tagactttac atttgtttgc ccaacagaga tcactgcttt cagtgaccgt 420 tatggagaat ttgaaaagtt gaacacagaa atattgggtg tttccgtaga cagtgtgttc 480 tcccaccttg cctgggttca aactgataga aagtctggtg gcctaggtga tctgaactat 540 ccattaattt ccgacgtgac caagtcaatt tcaaaatcat acaatgttct gatccccgat 600 cagggaattg cattgagagg acttttcatc attgacaagg aaggagttat tcagcattca 660 accattaaca atcttggaat tggtcgtagt gttgatgaaa cattgagaac tcttcaggca 720 ttgcaatacg ttcaggataa cccggatgaa gtgtgcccag ctggatggaa gcctggggag 780 aaatccatga agcctgaccc caagggtagc aaagaatact ttgcatccat atgaggtgat 840 gactgcaatt gctttatcta atttgttgtt taggaaggct ggagacccta cttttctgtt 900 acatttttct aatgtaccgg ctgagtttgg tcatttttga gaatatatac acttgtacac 960 ttttaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 990 <210> 14 <211> 271 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 14 Met Ala Cys Ser Ala Ser Ser Thr Ala Leu Leu Ser Ser Asn Pro Lys 1 5 10 15 Ala Ala Ser Ile Ser Pro Lys Ser Ser Phe Gln Ala Pro Ile Ser Gln 20 25 30 Cys Leu Ser Val Pro Ser Ser Phe Asn Gly Leu Arg Asn Cys Lys Pro 35 40 45 Phe Val Ser Arg Val Ala Arg Ser Leu Ser Thr Arg Val Ala Gln Ser 50 55 60 Gln Arg Arg Arg Phe Val Val Arg Ala Ser Ser Glu Leu Pro Leu Val 65 70 75 80 Gly Asn Gln Ala Pro Asp Phe Glu Ala Glu Ala Val Phe Asp Gln Glu 85 90 95 Phe Ile Lys Val Lys Leu Ser Glu Tyr Ile Gly Lys Lys Tyr Val Ile 100 105 110 Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile 115 120 125 Thr Ala Phe Ser Asp Arg Tyr Gly Glu Phe Glu Lys Leu Asn Thr Glu 130 135 140 Ile Leu Gly Val Ser Val Asp Ser Val Phe Ser His Leu Ala Trp Val 145 150 155 160 Gln Thr Asp Arg Lys Ser Gly Gly Leu Gly Asp Leu Asn Tyr Pro Leu 165 170 175 Ile Ser Asp Val Thr Lys Ser Ile Ser Lys Ser Tyr Asn Val Leu Ile 180 185 190 Pro Asp Gln Gly Ile Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Lys Glu 195 200 205 Gly Val Ile Gln His Ser Thr Ile Asn Asn Leu Gly Ile Gly Arg Ser 210 215 220 Val Asp Glu Thr Leu Arg Thr Leu Gln Ala Leu Gln Tyr Val Gln Asp 225 230 235 240 Asn Pro Asp Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp Lys Pro Gly Glu Lys Ser 245 250 255 Met Lys Pro Asp Pro Lys Gly Ser Lys Glu Tyr Phe Ala Ser Ile 260 265 270 <210> 15 <211> 944 <212> DNA <213> Phaseolus vulgaris <400> 15 tctattctat ctacactcac tctctcactc tcccactctc ccatggcttc ctcagctccc 60 tgtgcttctc tcatatcctc aaaccctaac attctcttct ctcccaaatt cccttcttct 120 tccttttctt ccctctcctt ccccaattcc cccaactctc ttttcaaacc tttacgcact 180 tctctcaatc cttcatctcc ccctctcaga accttcgttg ccagggcttc gagtgaactt 240 ccattagttg ggaacacagc accggatttt gaagcagagg ccgtttttga tcaggagttc 300 atcaaggtca aactatctga ttatattggg aaaaaatatg ttatcctctt tttctatcca 360 ctggacttca cattcgtttg tccgacagaa atcactgcct tcagtgaccg gtatgcagag 420 tttgaggcac taaatacaga aattttgggt gtttcagttg acagtgtttt ttcacacctt 480 gcatgggttc aaactgatag aaagtcgggt ggtcttggcg acttgaatta tccattgatt 540 tctgatgtca ccaaatccat ctcaaaatct tatgatgttc tcattcccga tcaggggatt 600 gcattgagag gattgttcat tattgacaag gaaggggtta ttcagcattc taccattaac 660 aacctggcca ttggtagaag tgttgatgag acaaagagaa cgctccaggc cttgcagtat 720 gtgcaggaga acccagatga agtttgccca gctgggtgga agcctggtga gaagtccatg 780 aaaccagacc ctaaacttag caaagagtac ttctctgcta tttagggagg ataatggttg 840 aagagtagca attgctcata tgtatcaatc aatgataatt tgtataatgc aacgcaagtt 900 tataaagttt tgattgagag ggtctcatga ttatacaaaa aaaa 944 <210> 16 <211> 260 <212> PRT <213> Phaseolus vulgaris <400> 16 Met Ala Ser Ser Ala Pro Cys Ala Ser Leu Ile Ser Ser Asn Pro Asn 1 5 10 15 Ile Leu Phe Ser Pro Lys Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Phe Pro Asn Ser Pro Asn Ser Leu Phe Lys Pro Leu Arg Thr Ser Leu 35 40 45 Asn Pro Ser Ser Pro Pro Leu Arg Thr Phe Val Ala Arg Ala Ser Ser 50 55 60 Glu Leu Pro Leu Val Gly Asn Thr Ala Pro Asp Phe Glu Ala Glu Ala 65 70 75 80 Val Phe Asp Gln Glu Phe Ile Lys Val Lys Leu Ser Asp Tyr Ile Gly 85 90 95 Lys Lys Tyr Val Ile Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val 100 105 110 Cys Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser Asp Arg Tyr Ala Glu Phe Glu 115 120 125 Ala Leu Asn Thr Glu Ile Leu Gly Val Ser Val Asp Ser Val Phe Ser 130 135 140 His Leu Ala Trp Val Gln Thr Asp Arg Lys Ser Gly Gly Leu Gly Asp 145 150 155 160 Leu Asn Tyr Pro Leu Ile Ser Asp Val Thr Lys Ser Ile Ser Lys Ser 165 170 175 Tyr Asp Val Leu Ile Pro Asp Gln Gly Ile Ala Leu Arg Gly Leu Phe 180 185 190 Ile Ile Asp Lys Glu Gly Val Ile Gln His Ser Thr Ile Asn Asn Leu 195 200 205 Ala Ile Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Lys Arg Thr Leu Gln Ala Leu 210 215 220 Gln Tyr Val Gln Glu Asn Pro Asp Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp Lys 225 230 235 240 Pro Gly Glu Lys Ser Met Lys Pro Asp Pro Lys Leu Ser Lys Glu Tyr 245 250 255 Phe Ser Ala Ile 260 <210> 17 <211> 1044 <212> DNA <213> Pisum sativum <220> <221> misc_feature <222> (968)..(968) <223> n is a, c, g, or t <400> 17 atggcttgct cagctccatt tgcttctctc ctatattcaa accctaacac actcttctct 60 cccaaattct cttctccgcg cctctcttct ctctcaatcc ccaatgcacc caattctctc 120 cccaaactac gcacttccct ccctctttcc ctcaaccgct cctcttcctc tcgccgcact 180 ttcgtcgtta gggcttctgg tgaattacca ttagttggga actcagcgcc ggattttgaa 240 gctgaagctg ttttcgatca ggagtttatc aaggtcaaac tatctgaata tattgggaag 300 aaatatgtta tcctcttttt ctacccattg gacttcacgt tcgtttgccc aacagaaatc 360 actgctttca gtgaccggca tgcagagttt gatgcaataa atactgagat tttgggtgtt 420 tcagttgaca gtgtgttctc gcaccttgca tgggttcaat cagatagaaa gtcaggtggc 480 cttggtgact tgaaatatcc tctggtttct gatgtcacca aatccatatc ggaatcttac 540 ggtgttctca ttcccgatca gggaattgca ttgagaggat tgttcattat cgataaggaa 600 ggggtgatcc aacattccac catcaacaac ctcggaattg gtagaagtgt tgacgagaca 660 aagagaacac tccaggcttt gcagtatgtg caggagaacc cagatgaagt ttgccctgct 720 gggtggaagc ctggtgagaa gtccatgaaa ccagacccca aaggtagcaa agagtacttt 780 gctgctgtgt agaatggcta atagtaaatt gctatgagta ttaactactc atctgtatca 840 tttgggatgt aaaaggattt tgttttatgt aattctatcc attttgaatt atgaggccta 900 tgggcttagc cataaaaata aaaagtatga ggtccaaaag tgtgtggtta cagaagcatg 960 cttgtgtncc ttgattttgg agtgaattat gaattgatgt attatctgta aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1044 <210> 18 <211> 263 <212> PRT <213> Pisum sativum <400> 18 Met Ala Cys Ser Ala Pro Phe Ala Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Pro Asn 1 5 10 15 Thr Leu Phe Ser Pro Lys Phe Ser Ser Pro Arg Leu Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ile Pro Asn Ala Pro Asn Ser Leu Pro Lys Leu Arg Thr Ser Leu Pro 35 40 45 Leu Ser Leu Asn Arg Ser Ser Ser Ser Arg Arg Thr Phe Val Val Arg 50 55 60 Ala Ser Gly Glu Leu Pro Leu Val Gly Asn Ser Ala Pro Asp Phe Glu 65 70 75 80 Ala Glu Ala Val Phe Asp Gln Glu Phe Ile Lys Val Lys Leu Ser Glu 85 90 95 Tyr Ile Gly Lys Lys Tyr Val Ile Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe 100 105 110 Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser Asp Arg His Ala 115 120 125 Glu Phe Asp Ala Ile Asn Thr Glu Ile Leu Gly Val Ser Val Asp Ser 130 135 140 Val Phe Ser His Leu Ala Trp Val Gln Ser Asp Arg Lys Ser Gly Gly 145 150 155 160 Leu Gly Asp Leu Lys Tyr Pro Leu Val Ser Asp Val Thr Lys Ser Ile 165 170 175 Ser Glu Ser Tyr Gly Val Leu Ile Pro Asp Gln Gly Ile Ala Leu Arg 180 185 190 Gly Leu Phe Ile Ile Asp Lys Glu Gly Val Ile Gln His Ser Thr Ile 195 200 205 Asn Asn Leu Gly Ile Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Lys Arg Thr Leu 210 215 220 Gln Ala Leu Gln Tyr Val Gln Glu Asn Pro Asp Glu Val Cys Pro Ala 225 230 235 240 Gly Trp Lys Pro Gly Glu Lys Ser Met Lys Pro Asp Pro Lys Gly Ser 245 250 255 Lys Glu Tyr Phe Ala Ala Val 260 <210> 19 <211> 1078 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 19 acccaagctc ccaaacccct ctcgcaccca atccaaccca atcccctcct catccactcc 60 gctctgcggc catggccgcc tgctgctcct ccctcgccac cgccgtctcc tcctcctccg 120 ccaagcccct cgccggcatc ccccccgccg cgccgcactc cctctccctc ccccgcgctc 180 ccgccgccag gcccctccgc ctctccgcct cctcatccag atccgcccgg gccagcagct 240 tcgtcgcccg cgccggcggt gtggacgatg cgccgctggt cgggaacaag gcgcccgact 300 tcgatgcgga ggcagtcttc gaccaggagt tcatcaacgt gaagctgtcc gactacatcg 360 ggaagaagta cgtcattctc ttcttctacc cgttggactt caccttcgtc tgcccgaccg 420 agattaccgc tttcagtgac agatacgatg agttcgagaa gttgaacact gagatcctcg 480 gtgtttcaat tgacagtgtg ttctcccatc ttgcatgggt gcagacagac aggaaatctg 540 gtgggcttgg tgatctgaaa tacccattga tttcagatgt tactaaatca atttcgaagt 600 cctttggtgt cttgatccct gaccagggaa ttgctctgag aggacttttc atcattgaca 660 aggagggagt gattcagcac tctaccatta acaaccttgc cattggacgc agtgtagatg 720 agaccatgag gacccttcag gcgttgcagt acgtccagga caacccggac gaggtgtgcc 780 cggccggatg gaagcccggt gacaagtcga tgaagcctga ccccaaggga agcaaggagt 840 acttcgcggc catctaagca cacatatgca tatgcctggt gatggatgta gggagttttt 900 ttgctttcgc gagagccatt gcgtttcgtc tccaaagtgt agtaccgtgt gctcgtctga 960 tcggattttg ttacttgttc gccaccagct gttactttgt tccctaacaa ataaggcttt 1020 gttttggtcg tgttatacat gtatacatgt tagtgcgttt caagatcgct tctgtttt 1078 <210> 20 <211> 261 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 20 Met Ala Ala Cys Cys Ser Ser Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser Ser Ser 1 5 10 15 Ala Lys Pro Leu Ala Gly Ile Pro Pro Ala Ala Pro His Ser Leu Ser 20 25 30 Leu Pro Arg Ala Pro Ala Ala Arg Pro Leu Arg Leu Ser Ala Ser Ser 35 40 45 Ser Arg Ser Ala Arg Ala Ser Ser Phe Val Ala Arg Ala Gly Gly Val 50 55 60 Asp Asp Ala Pro Leu Val Gly Asn Lys Ala Pro Asp Phe Asp Ala Glu 65 70 75 80 Ala Val Phe Asp Gln Glu Phe Ile Asn Val Lys Leu Ser Asp Tyr Ile 85 90 95 Gly Lys Lys Tyr Val Ile Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe 100 105 110 Val Cys Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser Asp Arg Tyr Asp Glu Phe 115 120 125 Glu Lys Leu Asn Thr Glu Ile Leu Gly Val Ser Ile Asp Ser Val Phe 130 135 140 Ser His Leu Ala Trp Val Gln Thr Asp Arg Lys Ser Gly Gly Leu Gly 145 150 155 160 Asp Leu Lys Tyr Pro Leu Ile Ser Asp Val Thr Lys Ser Ile Ser Lys 165 170 175 Ser Phe Gly Val Leu Ile Pro Asp Gln Gly Ile Ala Leu Arg Gly Leu 180 185 190 Phe Ile Ile Asp Lys Glu Gly Val Ile Gln His Ser Thr Ile Asn Asn 195 200 205 Leu Ala Ile Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Met Arg Thr Leu Gln Ala 210 215 220 Leu Gln Tyr Val Gln Asp Asn Pro Asp Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp 225 230 235 240 Lys Pro Gly Asp Lys Ser Met Lys Pro Asp Pro Lys Gly Ser Lys Glu 245 250 255 Tyr Phe Ala Ala Ile 260 <210> 21 <211> 1067 <212> DNA <213> Secale cereale <400> 21 tcttcatatt cgggaaccct atctatctgg aggctaccgc ggccgccccc gggcactccc 60 cgcctgacaa ccacggccat ggcgtgcgcc ttctccgcct ccaccgtgtc cacggcggcc 120 gcgctcgtcg cgtccccgaa gccagccggg gcgccgagtg cctgtcgttt ccccgcgctt 180 cgcaggggcc gcgcaggcct ccgctgcgcg cggctcgagg acgccagggc ccgcagcttc 240 gtcgcccgcg ccgcagccga gtacgacctg ccactggtgg ggaacaaagc accggacttc 300 gctgcggagg ccgtgttcga ccaggagttc atcaacgtca agctatctga ttacattggg 360 aagaagtatg tgattctttt cttctaccct ctggacttca ccttcgtctg cccaactgag 420 attacggctt tcagcgacag acatgaggag ttcgagaaga taaacactga aattcttggt 480 gtttcagttg atagtgtgtt ttcccatctt gcatgggtgc agacagagag gaaatctggt 540 ggacttggtg atcttaagta tcctctggtt tctgatgtca ccaaatcaat ctcaaagtct 600 tttggtgtat tgatccctga tcagggaatt gctctgagag gattattcat gattgacaag 660 gagggtgtga ttcagcattc cactattaac aaccttggta ttggccgcag tgtggatgag 720 accttgagaa cccttcaggc tctgcaatac gtccaagaaa acccagacga ggtctgcccg 780 gcaggatgga aacccgggga aaagtcgatg aagcctgacc ctaagggcag caaggagtac 840 ttcgctgcca tctagatgcg acctttgcgc tcacagtctg agttttgtca tggccatttc 900 tggttacttg tgttcttgtg acccgagttg tagttatcac gcgtccaatt gcctctgtaa 960 ttcctccaat aagggtttgt ctgtgtgttg attttccctc ctccaatttg gaaagcccaa 1020 tccaagattg gaaataaaac cttctgccac ccaaaaaaaa aaaaaaa 1067 <210> 22 <211> 258 <212> PRT <213> Secale cereale <400> 22 Met Ala Cys Ala Phe Ser Ala Ser Thr Val Ser Thr Ala Ala Ala Leu 1 5 10 15 Val Ala Ser Pro Lys Pro Ala Gly Ala Pro Ser Ala Cys Arg Phe Pro 20 25 30 Ala Leu Arg Arg Gly Arg Ala Gly Leu Arg Cys Ala Arg Leu Glu Asp 35 40 45 Ala Arg Ala Arg Ser Phe Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu Tyr Asp Leu 50 55 60 Pro Leu Val Gly Asn Lys Ala Pro Asp Phe Ala Ala Glu Ala Val Phe 65 70 75 80 Asp Gln Glu Phe Ile Asn Val Lys Leu Ser Asp Tyr Ile Gly Lys Lys 85 90 95 Tyr Val Ile Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro 100 105 110 Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser Asp Arg His Glu Glu Phe Glu Lys Ile 115 120 125 Asn Thr Glu Ile Leu Gly Val Ser Val Asp Ser Val Phe Ser His Leu 130 135 140 Ala Trp Val Gln Thr Glu Arg Lys Ser Gly Gly Leu Gly Asp Leu Lys 145 150 155 160 Tyr Pro Leu Val Ser Asp Val Thr Lys Ser Ile Ser Lys Ser Phe Gly 165 170 175 Val Leu Ile Pro Asp Gln Gly Ile Ala Leu Arg Gly Leu Phe Met Ile 180 185 190 Asp Lys Glu Gly Val Ile Gln His Ser Thr Ile Asn Asn Leu Gly Ile 195 200 205 Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Leu Arg Thr Leu Gln Ala Leu Gln Tyr 210 215 220 Val Gln Glu Asn Pro Asp Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp Lys Pro Gly 225 230 235 240 Glu Lys Ser Met Lys Pro Asp Pro Lys Gly Ser Lys Glu Tyr Phe Ala 245 250 255 Ala Ile <210> 23 <211> 876 <212> DNA <213> Riccia fluitans <400> 23 gttgggaaag gcagcaaata tggcaaccgc ctgtgctgca gtgtctgcag tggctgttcc 60 tgtggcctct gtagctaacc acattgcgtc ttcatcatct gggaccccat cccttgccat 120 tcccaggtct tatgagggtt taaacaaatc cttcggcgct agaattgcac cccgatcaac 180 ctccgctttt cgcaagcccg tcactggtgt ctccctcaag cagttctcga agggaaaagt 240 cgcttctgcg agatgtgcgt cacctcttgt tggaaatgtc gccccggact tcgaggcgga 300 ggccgttttt gaccaagagt tcgtgaagat caagctctcg gagtacattg ggaagagata 360 cgttgttctt ttcttctacc ctcttgactt caccttcgtt tgcccaacag aaattaccgc 420 atttagcgac aaacacgaag agtttgagaa gttgaacacc gaagttattg gggtttctac 480 tgacagtgtg ttttcccatc ttgcctggat tcaaactgac agaaaatctg gaggacttgg 540 tgacttgaag tacccacttg tgtccgactt gaccaagaag atcgctgaag attttggagt 600 attgatcccc gatcagggca ttgcattgcg aggattgttc atcatcgaca aggagggcgt 660 cattcagcac gcaaccatta acaatttggc catcggcaga agtgtggagg agacgcttcg 720 aactctgcag gctgtacaat atgtgcagga gaacccagac gaggtctgcc ccgctggctg 780 gaagccgggt gaaaagacca tgaagcctga cacaaagctc agcaaggagt acttcgcaca 840 agtataggcc gaaaatagct tcgtttggaa tacata 876 <210> 24 <211> 275 <212> PRT <213> Riccia fluitans <400> 24 Met Ala Thr Ala Cys Ala Ala Val Ser Ala Val Ala Val Pro Val Ala 1 5 10 15 Ser Val Ala Asn His Ile Ala Ser Ser Ser Ser Gly Thr Pro Ser Leu 20 25 30 Ala Ile Pro Arg Ser Tyr Glu Gly Leu Asn Lys Ser Phe Gly Ala Arg 35 40 45 Ile Ala Pro Arg Ser Thr Ser Ala Phe Arg Lys Pro Val Thr Gly Val 50 55 60 Ser Leu Lys Gln Phe Ser Lys Gly Lys Val Ala Ser Ala Arg Cys Ala 65 70 75 80 Ser Pro Leu Val Gly Asn Val Ala Pro Asp Phe Glu Ala Glu Ala Val 85 90 95 Phe Asp Gln Glu Phe Val Lys Ile Lys Leu Ser Glu Tyr Ile Gly Lys 100 105 110 Arg Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys 115 120 125 Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser Asp Lys His Glu Glu Phe Glu Lys 130 135 140 Leu Asn Thr Glu Val Ile Gly Val Ser Thr Asp Ser Val Phe Ser His 145 150 155 160 Leu Ala Trp Ile Gln Thr Asp Arg Lys Ser Gly Gly Leu Gly Asp Leu 165 170 175 Lys Tyr Pro Leu Val Ser Asp Leu Thr Lys Lys Ile Ala Glu Asp Phe 180 185 190 Gly Val Leu Ile Pro Asp Gln Gly Ile Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile 195 200 205 Ile Asp Lys Glu Gly Val Ile Gln His Ala Thr Ile Asn Asn Leu Ala 210 215 220 Ile Gly Arg Ser Val Glu Glu Thr Leu Arg Thr Leu Gln Ala Val Gln 225 230 235 240 Tyr Val Gln Glu Asn Pro Asp Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp Lys Pro 245 250 255 Gly Glu Lys Thr Met Lys Pro Asp Thr Lys Leu Ser Lys Glu Tyr Phe 260 265 270 Ala Gln Val 275 <210> 25 <211> 1255 <212> DNA <213> Chlamydomonas incerta <400> 25 atggccgctc tgcagtccgc ttcccgctcc tcggcggtgg ccttctcgcg ccaggcgcgc 60 gtggccccgc gcgttgcctc cagcgttgct cgccgcaacc tggtcgtgcg cgcttcccac 120 gctgagaagc ctctggtcgg ctccgtcgcc cctgacttca aggcccaggc cgtgttcgac 180 caggagttcc aggagattac cctgagcaag taccgcggca agtacgtggt gctgttcttc 240 taccccctgg acttcacctt cgtgtgcccc accgagatca ccgccttctc ggaccgctac 300 aaggagttca aggacatcaa caccgaggtc ctgggcgtgt ccgtggacag ccagttcacc 360 cacctggcct ggattcagac cgaccgcaag gagggtggcc tgggcgacct gaactacccc 420 ctggtggctg acctgaagaa ggagatctcc aaggcctacg gcgtcctgac cgaggacggc 480 atctccctgc gcggcctgtt catcatcgac aaggagggcg ttgtgcagca cgccaccatc 540 aacaacctgg ctttcggccg ctcggtcgac gagaccaagc gtgtgctgca ggccatccag 600 tacgtgcagt ccaaccccga tgaggtctgc cccgccggct ggaagcccgg tgacaagacc 660 atgaagcccg accccaaggg ctccaaggag tacttcgccg ccgtgtaaat tgacccttga 720 ttgagagtca atgacacgcg agggcgtcat cgcagtactc gggggcatgc tgcagatcag 780 caggcatgcg gacgagacca gtgcattggc aggctaggcg cacacgggag gcagagccag 840 tgcggcggca gcggcgagcg gcggctgtgg aagcaggcgc tagcagcagc ggcggccgcg 900 gcggcgctgc tctccatggg tgcgcctgca agcagcatgt gcatgtggac tcggtgcttc 960 tcgttgatgg gtcagggcgg cgttgccggt ggtgcggacc gggcggtaat cgcacgtagc 1020 tcaattgttg cgtgcgggcg ctgtgcgggc tggcgtgacg gcacgcaacc tgtgtggggc 1080 ctgttggtac gctcgcgata atgcagtgcg cggtccgagc ggagggacgc ggcggtgaat 1140 agctgctgta gtttcaggca gggatttacc aggtgacggg tggttgcgcc cacacccgaa 1200 cggctgtgat cccaattttc catgagaggg cttgcagatg gacggcgtgt gatcg 1255 <210> 26 <211> 235 <212> PRT <213> Chlamydomonas incerta <400> 26 Met Ala Ala Leu Gln Ser Ala Ser Arg Ser Ser Ala Val Ala Phe Ser 1 5 10 15 Arg Gln Ala Arg Val Ala Pro Arg Val Ala Ser Ser Val Ala Arg Arg 20 25 30 Asn Leu Val Val Arg Ala Ser His Ala Glu Lys Pro Leu Val Gly Ser 35 40 45 Val Ala Pro Asp Phe Lys Ala Gln Ala Val Phe Asp Gln Glu Phe Gln 50 55 60 Glu Ile Thr Leu Ser Lys Tyr Arg Gly Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe 65 70 75 80 Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe 85 90 95 Ser Asp Arg Tyr Lys Glu Phe Lys Asp Ile Asn Thr Glu Val Leu Gly 100 105 110 Val Ser Val Asp Ser Gln Phe Thr His Leu Ala Trp Ile Gln Thr Asp 115 120 125 Arg Lys Glu Gly Gly Leu Gly Asp Leu Asn Tyr Pro Leu Val Ala Asp 130 135 140 Leu Lys Lys Glu Ile Ser Lys Ala Tyr Gly Val Leu Thr Glu Asp Gly 145 150 155 160 Ile Ser Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Lys Glu Gly Val Val Gln 165 170 175 His Ala Thr Ile Asn Asn Leu Ala Phe Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr 180 185 190 Lys Arg Val Leu Gln Ala Ile Gln Tyr Val Gln Ser Asn Pro Asp Glu 195 200 205 Val Cys Pro Ala Gly Trp Lys Pro Gly Asp Lys Thr Met Lys Pro Asp 210 215 220 Pro Lys Gly Ser Lys Glu Tyr Phe Ala Ala Val 225 230 235 <210> 27 <211> 612 <212> DNA <213> Nostoc sp. <400> 27 atgtccatca cctacggaac acaagaaagc ctccgcgttg gtcaacaggc tcccgacttt 60 acagcaacag ctgtagttga tcaggaattc aagacaatta agctttccga ctatcgtggt 120 aagtacgttg tcttgttctt ctatccccta gactttacct ttgtttgccc cacggagatc 180 acagcattta gcgatcgcta cgaagaattc aagaaactta acaccgaaat tctcggtgtg 240 tccgttgata gcgagttctc ccacctagct tggattcaaa ctgatcgtaa gtctggtggt 300 gttggcgacc taaattatcc cttagtttcc gatattaaga aagaggttag cgacgcttac 360 aacgtactag acccagcagc aggtatcgct ttacgtggtc tgttcatcat cgataaagat 420 ggtatcattc agcacgctac cattaacaac ctagcttttg gtcgtagcgt tgatgaaacc 480 ctacggacat tgcaagcaat ccagtatgtc cagtctcacc cagatgaagt ttgccctgct 540 ggttggcaac ctggggaaaa gaccatgact cccgaccctg tgaagtccaa agtttacttc 600 gctgctgtgt aa 612 <210> 28 <211> 203 <212> PRT <213> Nostoc sp. <400> 28 Met Ser Ile Thr Tyr Gly Thr Gln Glu Ser Leu Arg Val Gly Gln Gln 1 5 10 15 Ala Pro Asp Phe Thr Ala Thr Ala Val Val Asp Gln Glu Phe Lys Thr 20 25 30 Ile Lys Leu Ser Asp Tyr Arg Gly Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr 35 40 45 Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser 50 55 60 Asp Arg Tyr Glu Glu Phe Lys Lys Leu Asn Thr Glu Ile Leu Gly Val 65 70 75 80 Ser Val Asp Ser Glu Phe Ser His Leu Ala Trp Ile Gln Thr Asp Arg 85 90 95 Lys Ser Gly Gly Val Gly Asp Leu Asn Tyr Pro Leu Val Ser Asp Ile 100 105 110 Lys Lys Glu Val Ser Asp Ala Tyr Asn Val Leu Asp Pro Ala Ala Gly 115 120 125 Ile Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Lys Asp Gly Ile Ile Gln 130 135 140 His Ala Thr Ile Asn Asn Leu Ala Phe Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr 145 150 155 160 Leu Arg Thr Leu Gln Ala Ile Gln Tyr Val Gln Ser His Pro Asp Glu 165 170 175 Val Cys Pro Ala Gly Trp Gln Pro Gly Glu Lys Thr Met Thr Pro Asp 180 185 190 Pro Val Lys Ser Lys Val Tyr Phe Ala Ala Val 195 200 <210> 29 <211> 609 <212> DNA <213> Synechococcus sp. <400> 29 ctacttggca atcgccgcga agaactcctt ggatttcact gggtcggggt gcatggtttt 60 ctggccgggc tgccagttgg ccgggcaaac ttcatcgggg tgagattgca cgtattggat 120 agcttgcagg gtgcgcaagg tttcatccac actgcggcca aaggccaggt tgttaatggt 180 ggcgtgctgg atgatccctt ctttgtcgat gatgaacagg ccgcgcagcg ccacaccggc 240 ctccggatcc agaacattgt aggcagcgct gatctccttt ttcaggtcag agaccagagg 300 ataccttagc tcgcccaccc ctccggcttt gcggtcggtc tggatccagg ccaagtgaga 360 gtattcgctg tccaccgaga cgcccaggat ctcggtatcc agcttggcaa agtcgtcata 420 gcggtcgcta aaggccgtga tctccgttgg gcagacaaag gtgaagtcca aggggtagaa 480 gaacagcacc acatacttct taccccggta gtcggagagc ttcaccgtct tgaattccat 540 gtcatagacg gcggtggccg aaaaatcggg agcgggctgc cccactcgca ggcatccttc 600 ctgagacat 609 <210> 30 <211> 202 <212> PRT <213> Synechococcus sp. <400> 30 Met Ser Gln Glu Gly Cys Leu Arg Val Gly Gln Pro Ala Pro Asp Phe 1 5 10 15 Ser Ala Thr Ala Val Tyr Asp Met Glu Phe Lys Thr Val Lys Leu Ser 20 25 30 Asp Tyr Arg Gly Lys Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp 35 40 45 Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser Asp Arg Tyr 50 55 60 Asp Asp Phe Ala Lys Leu Asp Thr Glu Ile Leu Gly Val Ser Val Asp 65 70 75 80 Ser Glu Tyr Ser His Leu Ala Trp Ile Gln Thr Asp Arg Lys Ala Gly 85 90 95 Gly Val Gly Glu Leu Arg Tyr Pro Leu Val Ser Asp Leu Lys Lys Glu 100 105 110 Ile Ser Ala Ala Tyr Asn Val Leu Asp Pro Glu Ala Gly Val Ala Leu 115 120 125 Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Lys Glu Gly Ile Ile Gln His Ala Thr 130 135 140 Ile Asn Asn Leu Ala Phe Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Leu Arg Thr 145 150 155 160 Leu Gln Ala Ile Gln Tyr Val Gln Ser His Pro Asp Glu Val Cys Pro 165 170 175 Ala Asn Trp Gln Pro Gly Gln Lys Thr Met His Pro Asp Pro Val Lys 180 185 190 Ser Lys Glu Phe Phe Ala Ala Ile Ala Lys 195 200 <210> 31 <211> 612 <212> DNA <213> Nodularia spumigena <400> 31 atgtccctca cttacgcaac agaaggatgc ctccgcgttg gtcaacaggc tcctgaattt 60 acagccacag ctgtggtaga tcaagaattt aagaccatta aactttccga ctatcgcggt 120 aagtatgtgg ttctgttttt ctacccctta gactttacct ttgtttgccc cactgagatc 180 acagcattta gcgatcgcta cgaagaattt aagaaagtta acacagaagt tctcggtgtt 240 tccgttgata gcgaattctc tcacctagcc tggattcaaa ctgaacgcaa gtctggtggt 300 gtcggcgacc tcaattatcc cttagtttcg gacatcaaaa aagagattag cgccacctac 360 aatgtccttg acccagccgc aggtattgct ttacgcggtt tgttcattat tgataaagat 420 ggtatcatcc agcattctac agtgaataac ctcgcctttg gtcgcagcgt tgatgaaacc 480 ctgcggacat tgcaagccct tcagtatgtt cagtctcacc ccgatgaagt ttgcccagcc 540 ggttggcaac ctggtgatca aacaatggtt cctgaccctg tgaagtcgaa agtctacttc 600 tcggctgtct ag 612 <210> 32 <211> 203 <212> PRT <213> Nodularia spumigena <400> 32 Met Ser Leu Thr Tyr Ala Thr Glu Gly Cys Leu Arg Val Gly Gln Gln 1 5 10 15 Ala Pro Glu Phe Thr Ala Thr Ala Val Val Asp Gln Glu Phe Lys Thr 20 25 30 Ile Lys Leu Ser Asp Tyr Arg Gly Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr 35 40 45 Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser 50 55 60 Asp Arg Tyr Glu Glu Phe Lys Lys Val Asn Thr Glu Val Leu Gly Val 65 70 75 80 Ser Val Asp Ser Glu Phe Ser His Leu Ala Trp Ile Gln Thr Glu Arg 85 90 95 Lys Ser Gly Gly Val Gly Asp Leu Asn Tyr Pro Leu Val Ser Asp Ile 100 105 110 Lys Lys Glu Ile Ser Ala Thr Tyr Asn Val Leu Asp Pro Ala Ala Gly 115 120 125 Ile Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Lys Asp Gly Ile Ile Gln 130 135 140 His Ser Thr Val Asn Asn Leu Ala Phe Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr 145 150 155 160 Leu Arg Thr Leu Gln Ala Leu Gln Tyr Val Gln Ser His Pro Asp Glu 165 170 175 Val Cys Pro Ala Gly Trp Gln Pro Gly Asp Gln Thr Met Val Pro Asp 180 185 190 Pro Val Lys Ser Lys Val Tyr Phe Ser Ala Val 195 200 <210> 33 <211> 594 <212> DNA <213> Thermosynechococcus elongatus <400> 33 ttagcccacg gcttcaaaat agactttgga tttgacaggg tcagggttca tcgtcttgtc 60 accggggtgc cagcccgcgg ggcagacttc atcggggtga gtttgaacgt attgaatcgc 120 ttggagtacc cgcagggtct catcaacact gcggccaaag gccaagttat tgattgttgc 180 gtgttggata atcccttctt tatcaatgat gaacagaccc cgcagggcca cgccttcttc 240 ggtcaggaca ttgtaggcag tgctgatgtc ttttttcagg tcagacacca agggatattt 300 aagatcgccg acaccaccag ctttgcgatc agtttgtgtc caagccaagt gggagaactg 360 gctatccaca gacacgccca ggatttcggt gttcaatttg gcaaattcat cgtagcgatc 420 gctaaaggca acaatttccg tggggcagac aaaggtaaag tccaagggat agaaaaagag 480 aacaacgtac ttaccgcgat agtccgagag cttgatggtt ttgaactctt ggtcataaac 540 agcaaccgct tcaaaatcgg gggcgggttg accgacgcgc agacactcag acat 594 <210> 34 <211> 197 <212> PRT <213> Thermosynechococcus elongatus <400> 34 Met Ser Glu Cys Leu Arg Val Gly Gln Pro Ala Pro Asp Phe Glu Ala 1 5 10 15 Val Ala Val Tyr Asp Gln Glu Phe Lys Thr Ile Lys Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 Arg Gly Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe 35 40 45 Val Cys Pro Thr Glu Ile Val Ala Phe Ser Asp Arg Tyr Asp Glu Phe 50 55 60 Ala Lys Leu Asn Thr Glu Ile Leu Gly Val Ser Val Asp Ser Gln Phe 65 70 75 80 Ser His Leu Ala Trp Thr Gln Thr Asp Arg Lys Ala Gly Gly Val Gly 85 90 95 Asp Leu Lys Tyr Pro Leu Val Ser Asp Leu Lys Lys Asp Ile Ser Thr 100 105 110 Ala Tyr Asn Val Leu Thr Glu Glu Gly Val Ala Leu Arg Gly Leu Phe 115 120 125 Ile Ile Asp Lys Glu Gly Ile Ile Gln His Ala Thr Ile Asn Asn Leu 130 135 140 Ala Phe Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Leu Arg Val Leu Gln Ala Ile 145 150 155 160 Gln Tyr Val Gln Thr His Pro Asp Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp His 165 170 175 Pro Gly Asp Lys Thr Met Asn Pro Asp Pro Val Lys Ser Lys Val Tyr 180 185 190 Phe Glu Ala Val Gly 195 <210> 35 <211> 693 <212> DNA <213> Ostreococcus tauri <400> 35 atgttgtccg cgagtttgtc caagagcgcg ttcacgccca gggcgtcggc gctccagaag 60 agcgttaagg ggaagaactt ctcccgatcc gccgtccgcg tggaagcgcg caagccgctc 120 gtgggctacc cggcgccgga gtttagcgcc gaggcggtgt tcgatcaaga gttccaagac 180 atcaagctct cggattaccg cggcaagtac gtcgtgctct tcttctaccc gctcgatttt 240 acctttgtgt gcccgacgga aatcaccgcc ttctccgatc gctacgaaga gttcgcgaag 300 ctcaacaccg aagtcctcgg cgtgagcgtt gactccaagt tctctcactt ggcgtggttg 360 caaaccgacc gcaacgacgg cggcctcggc gacttggcct acccgctcgt cagtgacctc 420 aagcgcgaaa tctgcgaatc gtacgatgtg ttgtacgaag acggcaccgc gctccgtggg 480 ttgtacatca tcgatcgtga gggcgtcatc cagcactaca catgcaacaa cgctccgttc 540 ggccgcaacg tcgacgagtg cctgcgcgtg cttcaagcga tccaatacgt tcaaaacaac 600 ccagacgagg tgtgcccggc gggctggacc ccgggtgcgg cgacgatgaa gccggatccg 660 aagggctcga aggaatactt caaggcgatc taa 693 <210> 36 <211> 230 <212> PRT <213> Ostreococcus tauri <400> 36 Met Leu Ser Ala Ser Leu Ser Lys Ser Ala Phe Thr Pro Arg Ala Ser 1 5 10 15 Ala Leu Gln Lys Ser Val Lys Gly Lys Asn Phe Ser Arg Ser Ala Val 20 25 30 Arg Val Glu Ala Arg Lys Pro Leu Val Gly Tyr Pro Ala Pro Glu Phe 35 40 45 Ser Ala Glu Ala Val Phe Asp Gln Glu Phe Gln Asp Ile Lys Leu Ser 50 55 60 Asp Tyr Arg Gly Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe 65 70 75 80 Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser Asp Arg Tyr Glu 85 90 95 Glu Phe Ala Lys Leu Asn Thr Glu Val Leu Gly Val Ser Val Asp Ser 100 105 110 Lys Phe Ser His Leu Ala Trp Leu Gln Thr Asp Arg Asn Asp Gly Gly 115 120 125 Leu Gly Asp Leu Ala Tyr Pro Leu Val Ser Asp Leu Lys Arg Glu Ile 130 135 140 Cys Glu Ser Tyr Asp Val Leu Tyr Glu Asp Gly Thr Ala Leu Arg Gly 145 150 155 160 Leu Tyr Ile Ile Asp Arg Glu Gly Val Ile Gln His Tyr Thr Cys Asn 165 170 175 Asn Ala Pro Phe Gly Arg Asn Val Asp Glu Cys Leu Arg Val Leu Gln 180 185 190 Ala Ile Gln Tyr Val Gln Asn Asn Pro Asp Glu Val Cys Pro Ala Gly 195 200 205 Trp Thr Pro Gly Ala Ala Thr Met Lys Pro Asp Pro Lys Gly Ser Lys 210 215 220 Glu Tyr Phe Lys Ala Ile 225 230 <210> 37 <211> 609 <212> DNA <213> Synechococcus sp. <400> 37 ctacttggca accgccgcga agaactcctt ggatttcacc gggtcggggt tcagggttct 60 ctggccgggc tgccagttgg ccgggcaaac ttcatcgggg tgagcttgca cgtactggat 120 ggcctgcagg gtgcgcaggg tttcatccac gctgcggcca aaggccaggt tgttgatggt 180 ggcgtgctgg atgatccctt ccttgtcgat gatgaacagg ccgcgcaaag ccacccctgc 240 cgccggatcc aggacattgt aggcggcgct gatctccttt ttcaggtcgg agaccagcgg 300 atacctcagc tcgcccaccc ctccggcttt gcggtcggtc tgaatccagg ccaggtgaga 360 gtactcgcta tccaccgaga cgccgaggat ctccgtgtcc agcttggcaa actcgtcgta 420 gcgatcgctg aaagccgtga tctccgtcgg gcagacgaag gtgaagtcca aggggtagaa 480 gaacagcacc acgtacttct tgccccggta gtcggagagc ctcaccgtct taaattccat 540 gtcgtaaacg gcagtggccg aaaaatcggg agcgggctgc cccacccgca gacatccttc 600 ctgagacat 609 <210> 38 <211> 202 <212> PRT <213> Synechococcus sp. <400> 38 Met Ser Gln Glu Gly Cys Leu Arg Val Gly Gln Pro Ala Pro Asp Phe 1 5 10 15 Ser Ala Thr Ala Val Tyr Asp Met Glu Phe Lys Thr Val Arg Leu Ser 20 25 30 Asp Tyr Arg Gly Lys Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp 35 40 45 Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser Asp Arg Tyr 50 55 60 Asp Glu Phe Ala Lys Leu Asp Thr Glu Ile Leu Gly Val Ser Val Asp 65 70 75 80 Ser Glu Tyr Ser His Leu Ala Trp Ile Gln Thr Asp Arg Lys Ala Gly 85 90 95 Gly Val Gly Glu Leu Arg Tyr Pro Leu Val Ser Asp Leu Lys Lys Glu 100 105 110 Ile Ser Ala Ala Tyr Asn Val Leu Asp Pro Ala Ala Gly Val Ala Leu 115 120 125 Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Lys Glu Gly Ile Ile Gln His Ala Thr 130 135 140 Ile Asn Asn Leu Ala Phe Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Leu Arg Thr 145 150 155 160 Leu Gln Ala Ile Gln Tyr Val Gln Ala His Pro Asp Glu Val Cys Pro 165 170 175 Ala Asn Trp Gln Pro Gly Gln Arg Thr Leu Asn Pro Asp Pro Val Lys 180 185 190 Ser Lys Glu Phe Phe Ala Ala Val Ala Lys 195 200 <210> 39 <211> 603 <212> DNA <213> Synechococcus sp. <400> 39 tcaaccgatg gcggagaaat actccttgga acctttcgga tcgggcttca tggtcttttc 60 gccgggcgtc cagttggcgg ggcagacttc atcggggttg gactgcacgt actggaaggc 120 ctgaagcaca cgcagggttt cgtccacatt ccggccaaca ggcaggttgt tgatcgtgga 180 gtgcatgatc acgccatcgg gatcgatgat gaacagtcca cgcaaagcaa cgccttcggc 240 gtcgtccagc acgttgtatg cggtggcgat ttccttcttg aggtcagcga ccaggggata 300 gttgatgtcg cccagaccgc cctgattgcg gggagtctga atccaggcca gatggctgaa 360 ctggctgtca acggaaacgc cgaggacttc ggtgttcttg ctggagaaat cggcgtagcg 420 gtcgctgaag gccgtgattt ctgtggggca gacgaaggtg aaatccaggg gatagaagaa 480 gagcaccacg tacttgccgc ggtactggga cagggagatt tccttgaatt cctggtccac 540 cactgcagtg gcagtgaaat cgggggcctg ctggcccaca cgaaggcaac cggtctcggt 600 cat 603 <210> 40 <211> 200 <212> PRT <213> Synechococcus sp. <400> 40 Met Thr Glu Thr Gly Cys Leu Arg Val Gly Gln Gln Ala Pro Asp Phe 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ala Val Val Asp Gln Glu Phe Lys Glu Ile Ser Leu Ser 20 25 30 Gln Tyr Arg Gly Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe 35 40 45 Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser Asp Arg Tyr Ala 50 55 60 Asp Phe Ser Ser Lys Asn Thr Glu Val Leu Gly Val Ser Val Asp Ser 65 70 75 80 Gln Phe Ser His Leu Ala Trp Ile Gln Thr Pro Arg Asn Gln Gly Gly 85 90 95 Leu Gly Asp Ile Asn Tyr Pro Leu Val Ala Asp Leu Lys Lys Glu Ile 100 105 110 Ala Thr Ala Tyr Asn Val Leu Asp Asp Ala Glu Gly Val Ala Leu Arg 115 120 125 Gly Leu Phe Ile Ile Asp Pro Asp Gly Val Ile Met His Ser Thr Ile 130 135 140 Asn Asn Leu Pro Val Gly Arg Asn Val Asp Glu Thr Leu Arg Val Leu 145 150 155 160 Gln Ala Phe Gln Tyr Val Gln Ser Asn Pro Asp Glu Val Cys Pro Ala 165 170 175 Asn Trp Thr Pro Gly Glu Lys Thr Met Lys Pro Asp Pro Lys Gly Ser 180 185 190 Lys Glu Tyr Phe Ser Ala Ile Gly 195 200 <210> 41 <211> 597 <212> DNA <213> Synechococcus elongatus <400> 41 ctagactgca gcgaagaact ctttcgactt aacagggtcg gggttcatcg tcgctgcacc 60 cggttgccaa ttggcggggc aaacttcatc ggggtgactt tggacgtact gaatggcttg 120 cagcacccgc agggtttcat caacgctgcg gccaaacgcc aggttgttga tggtggcgtg 180 ctggatcaca ccttctttgt cgatgatgaa cagaccgcgc agggcaatgc cttcagccgg 240 atcaagcacg ttgtaggcag tgctgatttc tttcttgagg tcagcaacca gcgggtaagc 300 caagtcaccc aaaccacctt ctttacggct ggtttgaatc caagccaagt ggctgaattg 360 gctatcgacc gagacaccca agatttcggt gttcagggct gaaaagtctg catagcgatc 420 gctaaaagca gtaatttcgg tcgggcaaac aaaggtgaag tcgaggggat agaagaacag 480 aacgacgtat ttgccccggt aattggatag cttgatcgtc tggaattcct gatcaacgac 540 tgcagtcgct tcaaaatcgg gggccaattg gccgacgcgc agggctcctt cggtcat 597 <210> 42 <211> 198 <212> PRT <213> Synechococcus elongatus <400> 42 Met Thr Glu Gly Ala Leu Arg Val Gly Gln Leu Ala Pro Asp Phe Glu 1 5 10 15 Ala Thr Ala Val Val Asp Gln Glu Phe Gln Thr Ile Lys Leu Ser Asn 20 25 30 Tyr Arg Gly Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr 35 40 45 Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser Asp Arg Tyr Ala Asp 50 55 60 Phe Ser Ala Leu Asn Thr Glu Ile Leu Gly Val Ser Val Asp Ser Gln 65 70 75 80 Phe Ser His Leu Ala Trp Ile Gln Thr Ser Arg Lys Glu Gly Gly Leu 85 90 95 Gly Asp Leu Ala Tyr Pro Leu Val Ala Asp Leu Lys Lys Glu Ile Ser 100 105 110 Thr Ala Tyr Asn Val Leu Asp Pro Ala Glu Gly Ile Ala Leu Arg Gly 115 120 125 Leu Phe Ile Ile Asp Lys Glu Gly Val Ile Gln His Ala Thr Ile Asn 130 135 140 Asn Leu Ala Phe Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Leu Arg Val Leu Gln 145 150 155 160 Ala Ile Gln Tyr Val Gln Ser His Pro Asp Glu Val Cys Pro Ala Asn 165 170 175 Trp Gln Pro Gly Ala Ala Thr Met Asn Pro Asp Pro Val Lys Ser Lys 180 185 190 Glu Phe Phe Ala Ala Val 195 <210> 43 <211> 597 <212> DNA <213> Prochlorococcus marinus <400> 43 ttatagactt gagaaatact ccttgctccc ttctggatct ggcttcattg tcttttcccc 60 tggagtccaa ttggcaggac atacctcgtc tgggttggct tgaacatatt gaaatgcttg 120 aagaactctc aaggtctcat caacatttct tcctacaggt aggttgttaa tagtagcgtg 180 catgatcaca ccatctggat cgatgatata aagacctctt aaagcaacac cctctgcatc 240 gtcgagaacg ttataagcca atgaaatctc tttctttaaa tcggcaacca agggataatt 300 gatatcgcca atgcctccat catttctttg agtttgaatc caggcaaggt ggctaaattg 360 actgtctaca gataccccta agacctcagt gttcttactt gaaaattcgg agtatctatc 420 gctaaaagcg gtaatttcag ttggacatac aaaagtaaaa tctagagggt aaaagaaaag 480 cacaacatat ttacctctgt aatttgaaag tgatatttcc ttgaattcct ggtctatcac 540 tgcagtagca gtaaaatcag gagctttctg gccaacacgg atacattcgt tcgtcat 597 <210> 44 <211> 198 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 44 Met Thr Asn Glu Cys Ile Arg Val Gly Gln Lys Ala Pro Asp Phe Thr 1 5 10 15 Ala Thr Ala Val Ile Asp Gln Glu Phe Lys Glu Ile Ser Leu Ser Asn 20 25 30 Tyr Arg Gly Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr 35 40 45 Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser Asp Arg Tyr Ser Glu 50 55 60 Phe Ser Ser Lys Asn Thr Glu Val Leu Gly Val Ser Val Asp Ser Gln 65 70 75 80 Phe Ser His Leu Ala Trp Ile Gln Thr Gln Arg Asn Asp Gly Gly Ile 85 90 95 Gly Asp Ile Asn Tyr Pro Leu Val Ala Asp Leu Lys Lys Glu Ile Ser 100 105 110 Leu Ala Tyr Asn Val Leu Asp Asp Ala Glu Gly Val Ala Leu Arg Gly 115 120 125 Leu Tyr Ile Ile Asp Pro Asp Gly Val Ile Met His Ala Thr Ile Asn 130 135 140 Asn Leu Pro Val Gly Arg Asn Val Asp Glu Thr Leu Arg Val Leu Gln 145 150 155 160 Ala Phe Gln Tyr Val Gln Ala Asn Pro Asp Glu Val Cys Pro Ala Asn 165 170 175 Trp Thr Pro Gly Glu Lys Thr Met Lys Pro Asp Pro Glu Gly Ser Lys 180 185 190 Glu Tyr Phe Ser Ser Leu 195 <210> 45 <211> 600 <212> DNA <213> Porphyra purpurea <400> 45 ttatgcagcc gcaaaataat ttttagattt tataggatcc ggattcattg ttctatcacc 60 aggtttccaa tttgctggac atacttcatc tggatgggct tgaacatatt gaattgcttg 120 cagaactctt aaagtttctt caacgcttct tccaaactcc agattgttaa cggtagaata 180 ttgaattata cctttaggat ctataataaa taatcccctt agggctacac ccccactatt 240 taatacatta taggcaatgc taatttcttt ttttagatct gatactaaag gatactcaag 300 atctcctaat ccaccagatt ctcgatctgt ttgcaaccaa gctaagtgag aatattcgct 360 atccacagaa acgcctaaga tttctgtgtt aagttcagaa aaatcagaat acttatcact 420 gaacgcggtt atttctgtag ggcaaacaaa agtaaaatct aaagggtaaa aaaataagat 480 gacatactta tttttaaagt cagataattt tattgtttta aattcttggt cataaacagc 540 tgtagctgaa aagtcaggcg cgatctggcc tacttgaaga caattgtgtc ctgaaatcat 600 <210> 46 <211> 199 <212> PRT <213> Porphyra purpurea <400> 46 Met Ile Ser Gly His Asn Cys Leu Gln Val Gly Gln Ile Ala Pro Asp 1 5 10 15 Phe Ser Ala Thr Ala Val Tyr Asp Gln Glu Phe Lys Thr Ile Lys Leu 20 25 30 Ser Asp Phe Lys Asn Lys Tyr Val Ile Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp 35 40 45 Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser Asp Lys Tyr 50 55 60 Ser Asp Phe Ser Glu Leu Asn Thr Glu Ile Leu Gly Val Ser Val Asp 65 70 75 80 Ser Glu Tyr Ser His Leu Ala Trp Leu Gln Thr Asp Arg Glu Ser Gly 85 90 95 Gly Leu Gly Asp Leu Glu Tyr Pro Leu Val Ser Asp Leu Lys Lys Glu 100 105 110 Ile Ser Ile Ala Tyr Asn Val Leu Asn Ser Gly Gly Val Ala Leu Arg 115 120 125 Gly Leu Phe Ile Ile Asp Pro Lys Gly Ile Ile Gln Tyr Ser Thr Val 130 135 140 Asn Asn Leu Glu Phe Gly Arg Ser Val Glu Glu Thr Leu Arg Val Leu 145 150 155 160 Gln Ala Ile Gln Tyr Val Gln Ala His Pro Asp Glu Val Cys Pro Ala 165 170 175 Asn Trp Lys Pro Gly Asp Arg Thr Met Asn Pro Asp Pro Ile Lys Ser 180 185 190 Lys Asn Tyr Phe Ala Ala Ala 195 <210> 47 <211> 681 <212> DNA <213> Gracilaria tenuistipitata <400> 47 atgttattat gttgttttat tactgttatt ttatataata tagacaatac taaattttat 60 aacaggaagt gtagtattaa aatgataaca aataataata ttttgagagt tggtcaacaa 120 gcccccaatt tttctgctat tgctgtatat gatcaagagt ttaagaaaat aacactgtct 180 gattacttgg gtaagtatgt aatattactg ttttatcctt tagatttcac atttgtttgt 240 ccaactgaga tcactgcttt cagtgattca tataaagaga ttcaaagtct gaatacagaa 300 gttttgggta tatctgttga cagtgaatat tcacatttag catggttgca aatggaaaga 360 gatattggag gcttaggaga tcttaattac ccgttagttt ctgatttaac aaaacagatt 420 agtgcttcat ataatgttct aacagaagaa ggtaaagcat taagaggttt atttattgtt 480 gatcagcaag gaattataca atattcttta gttaataatt tagactttgg ccgtagtatt 540 agtgaaacta taagaacact taaagctatc caatatgtac aatctcaccc agatgaagtt 600 tgtccagcaa attggcagcc aggaaaagct actataatta atagtcctca aaaatcgaaa 660 aattattttc aatctatata g 681 <210> 48 <211> 226 <212> PRT <213> Gracilaria tenuistipitata <400> 48 Met Leu Leu Cys Cys Phe Ile Thr Val Ile Leu Tyr Asn Ile Asp Asn 1 5 10 15 Thr Lys Phe Tyr Asn Arg Lys Cys Ser Ile Lys Met Ile Thr Asn Asn 20 25 30 Asn Ile Leu Arg Val Gly Gln Gln Ala Pro Asn Phe Ser Ala Ile Ala 35 40 45 Val Tyr Asp Gln Glu Phe Lys Lys Ile Thr Leu Ser Asp Tyr Leu Gly 50 55 60 Lys Tyr Val Ile Leu Leu Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys 65 70 75 80 Pro Thr Glu Ile Thr Ala Phe Ser Asp Ser Tyr Lys Glu Ile Gln Ser 85 90 95 Leu Asn Thr Glu Val Leu Gly Ile Ser Val Asp Ser Glu Tyr Ser His 100 105 110 Leu Ala Trp Leu Gln Met Glu Arg Asp Ile Gly Gly Leu Gly Asp Leu 115 120 125 Asn Tyr Pro Leu Val Ser Asp Leu Thr Lys Gln Ile Ser Ala Ser Tyr 130 135 140 Asn Val Leu Thr Glu Glu Gly Lys Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Val 145 150 155 160 Asp Gln Gln Gly Ile Ile Gln Tyr Ser Leu Val Asn Asn Leu Asp Phe 165 170 175 Gly Arg Ser Ile Ser Glu Thr Ile Arg Thr Leu Lys Ala Ile Gln Tyr 180 185 190 Val Gln Ser His Pro Asp Glu Val Cys Pro Ala Asn Trp Gln Pro Gly 195 200 205 Lys Ala Thr Ile Ile Asn Ser Pro Gln Lys Ser Lys Asn Tyr Phe Gln 210 215 220 Ser Ile 225 <210> 49 <211> 924 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 49 gcctagggct ctctcggttt cgagatctct ttcctgtctc taaccgtgtc tggaagtcca 60 tgtgtccggc tcttgttcac gcagtaatgg cctccggcaa cgcgcaaatc ggaaagtcgg 120 ctcctgactt cacggccaca gcggtggtgg atggtgcctt caaggaaatc aagctttcgg 180 actacagagg gaagtacgtg gtcctctttt tctacccact ggacttcact tttgtttgcc 240 ccacggagat catcgctttt agcgaccatg ctgaggactt ccgaaagcta ggctgcgagg 300 tgctgggagt gtctgtggac tctcagttca cccacctggc gtggatcaat accccacgga 360 aagagggagg cttgggcccc ctgaatatcc ctctgcttgc tgacgtgact aaaagcttgt 420 cccagaatta cggcgtgttg aaaaatgatg agggcattgc ttacaggggt ctctttatca 480 tcgatgccaa gggtgtcctt cgccagatca cagtcaatga cctacctgtg ggccgctctg 540 tagacgaggc tctccgccta gtccaggcct ttcagtatac agacgagcat ggggaagtct 600 gccctgctgg ctggaagccc ggcagtgaca ccatcaagcc caatgtggat gacagcaagg 660 aatacttctc caaacacaac tgagatgggt aaacatcggt gagcctgaag cttggatttc 720 acctgtgccc caacctggat gtcctgtgct ggcccagaaa atgctagatt ttcctccact 780 ctctgaaggg gctggagtct aggctgaggc tttctcatta cccacctgga atctggtgaa 840 tagtgatcct gccctgagca cacctagctg ggcccaggtc tataggaaac caataaagta 900 ttagggacag tgtaaaaaaa aaaa 924 <210> 50 <211> 198 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50 Met Ala Ser Gly Asn Ala Gln Ile Gly Lys Ser Ala Pro Asp Phe Thr 1 5 10 15 Ala Thr Ala Val Val Asp Gly Ala Phe Lys Glu Ile Lys Leu Ser Asp 20 25 30 Tyr Arg Gly Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr 35 40 45 Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Ile Ala Phe Ser Asp His Ala Glu Asp 50 55 60 Phe Arg Lys Leu Gly Cys Glu Val Leu Gly Val Ser Val Asp Ser Gln 65 70 75 80 Phe Thr His Leu Ala Trp Ile Asn Thr Pro Arg Lys Glu Gly Gly Leu 85 90 95 Gly Pro Leu Asn Ile Pro Leu Leu Ala Asp Val Thr Lys Ser Leu Ser 100 105 110 Gln Asn Tyr Gly Val Leu Lys Asn Asp Glu Gly Ile Ala Tyr Arg Gly 115 120 125 Leu Phe Ile Ile Asp Ala Lys Gly Val Leu Arg Gln Ile Thr Val Asn 130 135 140 Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Ala Leu Arg Leu Val Gln 145 150 155 160 Ala Phe Gln Tyr Thr Asp Glu His Gly Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp 165 170 175 Lys Pro Gly Ser Asp Thr Ile Lys Pro Asn Val Asp Asp Ser Lys Glu 180 185 190 Tyr Phe Ser Lys His Asn 195 <210> 51 <211> 877 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 51 gaattcggca cgagggtcgt ccgcgtgtcc ggctcttgcc cacgcagtca tggcctccgg 60 caacgcgcac atcggaaagc ctgcccctga cttcacgggc accgccgtgg tggatggtgc 120 ctttaaggaa atcaagcttt cagactacag agggaagtac gtggtcctct ttttctatcc 180 actggacttc acttttgttt gccccacgga gatcatcgct tttagcgacc acgctgagga 240 cttccgaaag ctaggctgcg aggtgctggg agtgtctgtg gactctcagt tcacccacct 300 ggcctggatc aataccccac ggaaggaggg aggcttgggc ccactgaata tccctctgct 360 tgctgatgtg actaaaagct tgtcccagaa ttacggcgtg ttgaaaaatg atgagggcat 420 cgcttacagg ggcctcttta tcatcgatgc caagggtgtc cttcgccaga tcacagtcaa 480 cgacctacct gtgggacgct ctgtagatga ggctctccgc ctcgtccagg cctttcagta 540 tacagatgag catggggaag tctgtcctgc tggctggaag cccggcagtg acaccatcaa 600 acccaatgtg gatgacagca aggaatactt ctccaaacac aactgagatg ggtaaacatc 660 ggtgagcctg aatcccggat ctcacctgcg cccttacctg gatgtcctgt gctggcccag 720 aaaacgctag atcttcctct acattctaaa ggggctggag gctaggccga ggctttctca 780 ttacccacct ggaatctggt gaatagtgac cctgccctga gcacacccag ctgggcccag 840 gtctatagga aaccaataaa gtattaggga cagtgta 877 <210> 52 <211> 198 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 52 Met Ala Ser Gly Asn Ala His Ile Gly Lys Pro Ala Pro Asp Phe Thr 1 5 10 15 Gly Thr Ala Val Val Asp Gly Ala Phe Lys Glu Ile Lys Leu Ser Asp 20 25 30 Tyr Arg Gly Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr 35 40 45 Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Ile Ala Phe Ser Asp His Ala Glu Asp 50 55 60 Phe Arg Lys Leu Gly Cys Glu Val Leu Gly Val Ser Val Asp Ser Gln 65 70 75 80 Phe Thr His Leu Ala Trp Ile Asn Thr Pro Arg Lys Glu Gly Gly Leu 85 90 95 Gly Pro Leu Asn Ile Pro Leu Leu Ala Asp Val Thr Lys Ser Leu Ser 100 105 110 Gln Asn Tyr Gly Val Leu Lys Asn Asp Glu Gly Ile Ala Tyr Arg Gly 115 120 125 Leu Phe Ile Ile Asp Ala Lys Gly Val Leu Arg Gln Ile Thr Val Asn 130 135 140 Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Ala Leu Arg Leu Val Gln 145 150 155 160 Ala Phe Gln Tyr Thr Asp Glu His Gly Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp 165 170 175 Lys Pro Gly Ser Asp Thr Ile Lys Pro Asn Val Asp Asp Ser Lys Glu 180 185 190 Tyr Phe Ser Lys His Asn 195 <210> 53 <211> 1089 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 53 gccttcgtct cgacacgttt gcattgcagc agctcataag tttcttcttc gtttctgctc 60 ccagtgctaa ggcagcacag tcgttcgtcg ccatgccagg gctcaccatc ggcgacaccg 120 tccccaacct ggagctggac tccacccacg gcaagatccg catccacgac ttcgtcggcg 180 acacctatgt catcctcttc tcccaccccg gcgacttcac cccggtctgc accacggagc 240 tggcagccat ggccggctac gccaaggagt tcgacaagag gggcgtcaag ctgctcggca 300 tctcctgcga cgacgtgcag tctcacaagg actggatcaa ggacatcgag gcctacaagc 360 ctgggaaccg cgtgacgtac ccgatcatgg ccgatccgag ccgcgaggcc atcaagcagc 420 tgaacatggt cgacccggac gagaaggatt ccaacggcgg ccacctcccg tcccgcgcgc 480 tgcacatcgt cggccccgac aagaaggtga agctgagctt cctgtacccg gcgtgcgtgg 540 ggcggaacat ggatgaggtg gtgcgtgcgg tcgacgcgct gcagacggcg gcgaagcacg 600 cggtggcgac gccggtgaac tggaagcccg gcgagcgcgt cgtcatccct cccggcgtct 660 ccgacgacga ggcgaaggag aagttccccc aggggttcga caccgccgac ctgccgtccg 720 gcaagggcta cctccgcttc accaaggtcg gctagatcat atcgatatcg acctcgctct 780 tcgtacatca tgtgcgccac gcgtgcgtga tagcgtgtgc tggcgtgatg actatgcgag 840 atgcatccct gtgtgtgttg gtgtggataa tgccgctacg tttggaacag tagtgcattt 900 actctgtgct actgtctgaa ctttggctgt ttggcagact gtttatgtac ccgtatgttc 960 gcccctgtac taatagagtg ggtgttgtgg ttggcaagta ctctcctcgg acaacatttt 1020 aactttgact actaataaca aacaaattaa aaagatcaat cagatgttac tagacatctt 1080 aattttatt 1089 <210> 54 <211> 220 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 54 Met Pro Gly Leu Thr Ile Gly Asp Thr Val Pro Asn Leu Glu Leu Asp 1 5 10 15 Ser Thr His Gly Lys Ile Arg Ile His Asp Phe Val Gly Asp Thr Tyr 20 25 30 Val Ile Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Val Cys Thr Thr 35 40 45 Glu Leu Ala Ala Met Ala Gly Tyr Ala Lys Glu Phe Asp Lys Arg Gly 50 55 60 Val Lys Leu Leu Gly Ile Ser Cys Asp Asp Val Gln Ser His Lys Asp 65 70 75 80 Trp Ile Lys Asp Ile Glu Ala Tyr Lys Pro Gly Asn Arg Val Thr Tyr 85 90 95 Pro Ile Met Ala Asp Pro Ser Arg Glu Ala Ile Lys Gln Leu Asn Met 100 105 110 Val Asp Pro Asp Glu Lys Asp Ser Asn Gly Gly His Leu Pro Ser Arg 115 120 125 Ala Leu His Ile Val Gly Pro Asp Lys Lys Val Lys Leu Ser Phe Leu 130 135 140 Tyr Pro Ala Cys Val Gly Arg Asn Met Asp Glu Val Val Arg Ala Val 145 150 155 160 Asp Ala Leu Gln Thr Ala Ala Lys His Ala Val Ala Thr Pro Val Asn 165 170 175 Trp Lys Pro Gly Glu Arg Val Val Ile Pro Pro Gly Val Ser Asp Asp 180 185 190 Glu Ala Lys Glu Lys Phe Pro Gln Gly Phe Asp Thr Ala Asp Leu Pro 195 200 205 Ser Gly Lys Gly Tyr Leu Arg Phe Thr Lys Val Gly 210 215 220 <210> 55 <211> 465 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 55 atggcgtgcg ccttctccgt ctcctctgcc gcggcgcctc tcgcctcccc gaagggggac 60 ctgccgttgg tcgggaacaa ggcgccggac ttcgaggcgg aggccatgtt cgaccagggg 120 ttcatcaagt ctaaatgcat gtttgtaagc tctgcagaga tcactgcttt cagcgacaga 180 tatgaggagt ttgagaagat aaatactgaa gttctcggtg tttcgattga cagtgtgggg 240 attgctctga gaggattatt catcattgac aaggagggtg tgattcagca ttctaccatt 300 aacaaccttg ctattggccg tagcgtggat gagacgctta ggacccttca ggccctacag 360 tatgtccaag aaaacccgga tgaggtttgc ccagctggat ggaaacctgg ggagaagtca 420 atgaagcctg accccaagga cagcaaggag gaacaagaat gctga 465 <210> 56 <211> 154 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 56 Met Ala Cys Ala Phe Ser Val Ser Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ala Ser 1 5 10 15 Pro Lys Gly Asp Leu Pro Leu Val Gly Asn Lys Ala Pro Asp Phe Glu 20 25 30 Ala Glu Ala Met Phe Asp Gln Gly Phe Ile Lys Ser Lys Cys Met Phe 35 40 45 Val Ser Ser Ala Glu Ile Thr Ala Phe Ser Asp Arg Tyr Glu Glu Phe 50 55 60 Glu Lys Ile Asn Thr Glu Val Leu Gly Val Ser Ile Asp Ser Val Gly 65 70 75 80 Ile Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Lys Glu Gly Val Ile Gln 85 90 95 His Ser Thr Ile Asn Asn Leu Ala Ile Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr 100 105 110 Leu Arg Thr Leu Gln Ala Leu Gln Tyr Val Gln Glu Asn Pro Asp Glu 115 120 125 Val Cys Pro Ala Gly Trp Lys Pro Gly Glu Lys Ser Met Lys Pro Asp 130 135 140 Pro Lys Asp Ser Lys Glu Glu Gln Glu Cys 145 150 <210> 57 <211> 1085 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 57 cattccatca cagacagttc gcagaatcgc agcagcttag cttaattact tttttcacca 60 actcaacttt cagttaattt ccggttaatc ctcgattcct catcatgcct ggactcaccc 120 tcggcgacgt cgtccccgac ctggagctcg acaccaccca cggcaagatc cgcctccacg 180 acttcgtcgg cgacgcctac gtcatcatct tctcccaccc cgctgacttc acgccggtct 240 gcacgacgga gctgtcggag atggcgggct acgccggcga gttcgacaag aggggcgtca 300 agctcctcgg cttctcctgc gacgacgtcg agtcgcacaa ggactggatc aaggacatcg 360 aggcctacaa gcctggccgc cgcgtcggct tcccgatcgt cgccgacccg gacagggagg 420 cgatcaggca gctcaacatg atcgacgccg acgagaagga caccgccggc ggcgagctcc 480 ccaaccgggc gctccacatc gtcgggccgg acaagaaggt gaagctgagc ttcctgttcc 540 cggcgtgcac ggggcggaac atggcggagg tgctgcgcgc gacggacgcg ctgctgacgg 600 cggcgaggca ccgggtggcg acgccggtga actggaagcc cggcgagcgc gtcgtcatcc 660 cccccggcgt ctccgacgag gaggccaagg cgaggttccc ggccgggttc gagaccgccc 720 agctgccctc caacaagtgc tacctccgct tcacccaggt ggactgagag actgatggtg 780 agggagggag ggagagatct gggccgtcgg tttcgtgtgt aataaaccaa cgcacgacgt 840 agatgcttcc acgtgtgtgt ttcccgtgct gcttcgattg atcgatcgat cattcggtaa 900 gtactctagt tatgtgtaat ctgctgtttg ggtgtagtgg tgcatttgct gttctgttgc 960 ctgaaagtga cgaacggatt atgtttgtca tttgtatgta aaatgtaacc gtatgttttt 1020 tatttatccc ttccgaaatt actgtggaat atagtgaagt aatgctgtta ataaacagcc 1080 cgttt 1085 <210> 58 <211> 220 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 58 Met Pro Gly Leu Thr Leu Gly Asp Val Val Pro Asp Leu Glu Leu Asp 1 5 10 15 Thr Thr His Gly Lys Ile Arg Leu His Asp Phe Val Gly Asp Ala Tyr 20 25 30 Val Ile Ile Phe Ser His Pro Ala Asp Phe Thr Pro Val Cys Thr Thr 35 40 45 Glu Leu Ser Glu Met Ala Gly Tyr Ala Gly Glu Phe Asp Lys Arg Gly 50 55 60 Val Lys Leu Leu Gly Phe Ser Cys Asp Asp Val Glu Ser His Lys Asp 65 70 75 80 Trp Ile Lys Asp Ile Glu Ala Tyr Lys Pro Gly Arg Arg Val Gly Phe 85 90 95 Pro Ile Val Ala Asp Pro Asp Arg Glu Ala Ile Arg Gln Leu Asn Met 100 105 110 Ile Asp Ala Asp Glu Lys Asp Thr Ala Gly Gly Glu Leu Pro Asn Arg 115 120 125 Ala Leu His Ile Val Gly Pro Asp Lys Lys Val Lys Leu Ser Phe Leu 130 135 140 Phe Pro Ala Cys Thr Gly Arg Asn Met Ala Glu Val Leu Arg Ala Thr 145 150 155 160 Asp Ala Leu Leu Thr Ala Ala Arg His Arg Val Ala Thr Pro Val Asn 165 170 175 Trp Lys Pro Gly Glu Arg Val Val Ile Pro Pro Gly Val Ser Asp Glu 180 185 190 Glu Ala Lys Ala Arg Phe Pro Ala Gly Phe Glu Thr Ala Gln Leu Pro 195 200 205 Ser Asn Lys Cys Tyr Leu Arg Phe Thr Gln Val Asp 210 215 220 <210> 59 <211> 1248 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 59 atcgattccc ccaacatatt agggctcacg cctcccaaag tcaaaacagc ccagcccgaa 60 caagcatttc ctcgaacact tcgccctcca ccaccatggc cgccgccgcc tccaccctcg 120 cctccctctc cgccaccgcg gccgcggccg ccggcaagcg cctcctcctc tcctccccct 180 cccgctccct ctccctctcc ctcgcctccc gcggccgcat cgccgtcatg ccccacctcc 240 gcgctggcat cctctccgcc gcaccgagga gggcggtgtc ggcctcggcc ccggccgcgg 300 ccaccatcgc ggtcggggac aagctccccg acgcgacgct ctcctacttc gactcgcccg 360 acggggagct gaagacggtg accgtgcgcg acctcaccgc cgggaagaag gtggtcctct 420 tcgcggtccc cggcgcgttc accccgacct gcacgcagaa gcacgtcccg gggttcgtcg 480 ccaaggccgg ggagctccgc gccaaggggg tcgacgccgt ggcctgcgtc tccgtcaacg 540 acgcgttcgt gatgcgggcg tggaaggaga gcctcggcgt cggcgacgag gtgctcctcc 600 tctccgacgg caacggcgag ctcgcccgcg ccatgggcgt cgagctcgac ctctccgaca 660 agcccgccgg cctcggcgtg cggtcccgcc gctacgcgct cctggcggag gacggcgtcg 720 tcaaggtgct caacctcgag gagggcggcg ccttcaccac cagcagcgcc gaggagatgc 780 tcaaggcgct ctgaagcgtg aacaactcaa gccatcctcc acttttcatc tcaaatctcc 840 atagctcggt tcgttgccta cttctctcaa gtgttcgctt cttttcctga ataataaatc 900 atggcaacaa tggtggaccg tgcagagtag tgttgtcgtt ttgatgtgtg aagcttctat 960 agcgaacata gtgtgcaatt tttaggtaac atatatgagt cttggccttg cactgtttgt 1020 caggtagtaa caacttggca cagctataga ctgtagtaac agagttcctt tcatgttgaa 1080 tggtgaggct gtgatgtgtt ctagagctga ataaacgtgc tctggtaaat actgtcacca 1140 gatcagacta tggagtagta gtaagatttt gcttggttaa ttgggcaatg gctatttttc 1200 aggatcgttc agttgagata aacatgtttt gctgttcaga tgagttcg 1248 <210> 60 <211> 232 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 60 Met Ala Ala Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Leu Ser Ala Thr Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Gly Lys Arg Leu Leu Leu Ser Ser Pro Ser Arg Ser Leu 20 25 30 Ser Leu Ser Leu Ala Ser Arg Gly Arg Ile Ala Val Met Pro His Leu 35 40 45 Arg Ala Gly Ile Leu Ser Ala Ala Pro Arg Arg Ala Val Ser Ala Ser 50 55 60 Ala Pro Ala Ala Ala Thr Ile Ala Val Gly Asp Lys Leu Pro Asp Ala 65 70 75 80 Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ser Pro Asp Gly Glu Leu Lys Thr Val Thr 85 90 95 Val Arg Asp Leu Thr Ala Gly Lys Lys Val Val Leu Phe Ala Val Pro 100 105 110 Gly Ala Phe Thr Pro Thr Cys Thr Gln Lys His Val Pro Gly Phe Val 115 120 125 Ala Lys Ala Gly Glu Leu Arg Ala Lys Gly Val Asp Ala Val Ala Cys 130 135 140 Val Ser Val Asn Asp Ala Phe Val Met Arg Ala Trp Lys Glu Ser Leu 145 150 155 160 Gly Val Gly Asp Glu Val Leu Leu Leu Ser Asp Gly Asn Gly Glu Leu 165 170 175 Ala Arg Ala Met Gly Val Glu Leu Asp Leu Ser Asp Lys Pro Ala Gly 180 185 190 Leu Gly Val Arg Ser Arg Arg Tyr Ala Leu Leu Ala Glu Asp Gly Val 195 200 205 Val Lys Val Leu Asn Leu Glu Glu Gly Gly Ala Phe Thr Thr Ser Ser 210 215 220 Ala Glu Glu Met Leu Lys Ala Leu 225 230 <210> 61 <211> 946 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 61 acacccaaac ccgacgaaca gccgcagctg caggccacgc atcctcgccg tgaatctccc 60 accgcgctcc ggcgatggca ttcgcggtct ccaccgcctg caggccgtcc ctgctcctgc 120 ccccgcgcca gcgctcgtcg ccgccgcggc cgcggccgct cctctgcacg ccctccaccg 180 ccgccttccg ccgcggcgcc ctcagcgcga caacaacgcc aacgccggcg cgcgcagcac 240 tgccgtcgac gacggggagg aacaggatcg tctgcggcaa ggtgagcaag ggcagcgcgg 300 cgcccaactt cacgctgagg gaccaggacg ggagggcggt gtcgctgtcc aagttcaagg 360 ggaggccggt ggtggtgtac ttctaccccg ccgacgagac ccccggatgc accaagcagg 420 cctgcgcctt ccgcgactcc tacgagaagt tcaagaaggc cggcgccgag gtcatcggca 480 tcagcggcga cgacgccgcc tcccacaagg agttcaagaa gaagtacaag ctgccgttca 540 cgctgctgag cgacgagggg aacaaggtga ggaaggagtg gggtgtgccg gctgacctgt 600 tcgggacgct gccgggaagg cagacgtacg tgctcgacaa gaacggcgtc gtccagtaca 660 tctacaacaa ccagttccag cccgagaagc acattggcga gaccctcaag atcctccaga 720 gcctctgatt ctcttcttct tcttcctcct tttttaacta caatctctca tgtatgatcc 780 atcacagtat accgagaaat taatccatct gttaatctct tctcgatcgt ttttctccct 840 cggcatgtgt atagctagtg tatctgtaac tctgtgagta tatatacagt caaaatcggt 900 gggctgctag ctctgaattt tgccgtaagg cactctgatt ttctct 946 <210> 62 <211> 217 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 62 Met Ala Phe Ala Val Ser Thr Ala Cys Arg Pro Ser Leu Leu Leu Pro 1 5 10 15 Pro Arg Gln Arg Ser Ser Pro Pro Arg Pro Arg Pro Leu Leu Cys Thr 20 25 30 Pro Ser Thr Ala Ala Phe Arg Arg Gly Ala Leu Ser Ala Thr Thr Thr 35 40 45 Pro Thr Pro Ala Arg Ala Ala Leu Pro Ser Thr Thr Gly Arg Asn Arg 50 55 60 Ile Val Cys Gly Lys Val Ser Lys Gly Ser Ala Ala Pro Asn Phe Thr 65 70 75 80 Leu Arg Asp Gln Asp Gly Arg Ala Val Ser Leu Ser Lys Phe Lys Gly 85 90 95 Arg Pro Val Val Val Tyr Phe Tyr Pro Ala Asp Glu Thr Pro Gly Cys 100 105 110 Thr Lys Gln Ala Cys Ala Phe Arg Asp Ser Tyr Glu Lys Phe Lys Lys 115 120 125 Ala Gly Ala Glu Val Ile Gly Ile Ser Gly Asp Asp Ala Ala Ser His 130 135 140 Lys Glu Phe Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Pro Phe Thr Leu Leu Ser Asp 145 150 155 160 Glu Gly Asn Lys Val Arg Lys Glu Trp Gly Val Pro Ala Asp Leu Phe 165 170 175 Gly Thr Leu Pro Gly Arg Gln Thr Tyr Val Leu Asp Lys Asn Gly Val 180 185 190 Val Gln Tyr Ile Tyr Asn Asn Gln Phe Gln Pro Glu Lys His Ile Gly 195 200 205 Glu Thr Leu Lys Ile Leu Gln Ser Leu 210 215 <210> 63 <211> 770 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 63 atctcccttc cctgtcgatt accttctctc cttcctctgt tcctcctctc ctccacacat 60 ccaggcaggc aacacaagaa tcatccggga gagcgacatg gccccggttg ccgtgggcga 120 caccctcccc gacggccagc tggggtggtt cgacggggag gacaagctgc agcaggtctc 180 cgtccacggc ctcgccgccg gcaagaaggt cgtcctcttc ggcgtccccg gtgccttcac 240 cccgacctgc agcaatcagc atgtgccagg attcataaat caggctgagc agctcaaagc 300 caagggtgta gacgacatct tgcttgtcag tgttaacgac ccctttgtca tgaaggcgtg 360 ggcaaagtca taccctgaga ataagcatgt gaaattcctt gccgatggtt tgggaacata 420 caccaaggca cttggtcttg agcttgacct ttcggagaaa gggcttggta ttcgttcgag 480 acggtttgct ctccttgctg acaacctcaa ggttactgtt gcaaacattg aggaaggtgg 540 ccaattcaca atctctggtg ctgaggagat cctcaaggca ctgtaagagc ttcagctctt 600 aggaacggca gcgatcactt ggacctatcg tgtcaatctt gtttaaattt gtctgcaaaa 660 tacttgtgcg aataaaattg tcgatgagct gcctagttgt gaggacttta tgataatgtt 720 tgaatctgta tccactgttg aatcaagtag taatgttcag tgctcatgtt 770 <210> 64 <211> 162 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 64 Met Ala Pro Val Ala Val Gly Asp Thr Leu Pro Asp Gly Gln Leu Gly 1 5 10 15 Trp Phe Asp Gly Glu Asp Lys Leu Gln Gln Val Ser Val His Gly Leu 20 25 30 Ala Ala Gly Lys Lys Val Val Leu Phe Gly Val Pro Gly Ala Phe Thr 35 40 45 Pro Thr Cys Ser Asn Gln His Val Pro Gly Phe Ile Asn Gln Ala Glu 50 55 60 Gln Leu Lys Ala Lys Gly Val Asp Asp Ile Leu Leu Val Ser Val Asn 65 70 75 80 Asp Pro Phe Val Met Lys Ala Trp Ala Lys Ser Tyr Pro Glu Asn Lys 85 90 95 His Val Lys Phe Leu Ala Asp Gly Leu Gly Thr Tyr Thr Lys Ala Leu 100 105 110 Gly Leu Glu Leu Asp Leu Ser Glu Lys Gly Leu Gly Ile Arg Ser Arg 115 120 125 Arg Phe Ala Leu Leu Ala Asp Asn Leu Lys Val Thr Val Ala Asn Ile 130 135 140 Glu Glu Gly Gly Gln Phe Thr Ile Ser Gly Ala Glu Glu Ile Leu Lys 145 150 155 160 Ala Leu <210> 65 <211> 1249 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 65 gagagccaac acggtgcatc tctcagccac acagccccac ccgcgccatg tcactcgcca 60 ccgccgccgc cggagcgcaa ccgttcgtcc gctcctcctc ctccgccgcc gcggcgtcct 120 cgtcgcggcc cctgctcgcc gtcgccgccg cccgccaccg ccgcccgcat ggatctctcg 180 ccgccgccgc cgccgcggca aggcggcgtc gtcgtcgtcc gctcctccag gtgcgcgcgg 240 caaggacgga gtccacgggc gtctccgtcg ggttccgcgc gccccagttc gagctcccgg 300 agccactgac ggggaagctc tggacattgg atgacttcga aggcaacccc gcgctgctgg 360 ttatgtttgt atgtaatcac tgtccattcg taaagcatct caaaaaagat attgcgaagc 420 tcacctcatt ctacatggag aaagggcttg ctgctgttgc catatcctcg aactcaattg 480 tgacacaccc acaggatggt cctgattaca tagctgagga agcaaaattg tataaatact 540 ctttcccgta tctatatgat gagtctcaag aagttgctaa agcttttcga gccgtctgca 600 cgccagagtt ttacttgttc aaaaaggatg gacgaaggcc atttgagctt ttctaccatg 660 ggcagtttga cgattcaaga ccgagtaaca acgtgccagt taccggaagg gatttaagtc 720 gtgcgattga ttgtgcactt agtggacaag agctaccttt tgtgccaaaa cccagtgtcg 780 ggtgcagcat caaatggcac ccatgaagag cgtattgcat tgtcatgtgc tggaatatag 840 atgtttttcc cccttaaatt gaaggttgaa catggggatt gaggtgagcc atgctctcta 900 ctactagaag tatggaagca cacacatagt agatttatga tagctaattt cacatagtag 960 atttatgata gctaatttat aatgtaattt ttaagggaaa tagatgcagt tgaggccttg 1020 tggagctgat tcttaacgtt gtgggggctg ttcaacttga gagttgcaaa actagacatg 1080 aatggcgtgg atagtgttat gttgtgtgct ggtgtctcat cttggccgga aaaagaaaaa 1140 ctgatggatg taactggtat ttgtgcaaca atgggataat gcacacaagt acaataaccc 1200 attattatgg ctaacacaac acccacgggt gaaaattaaa gatgagggc 1249 <210> 66 <211> 252 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 66 Met Ser Leu Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gln Pro Phe Val Arg Ser 1 5 10 15 Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ser Arg Pro Leu Leu Ala Val 20 25 30 Ala Ala Ala Arg His Arg Arg Pro His Gly Ser Leu Ala Ala Ala Ala 35 40 45 Ala Ala Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Leu Leu Gln Val Arg Ala 50 55 60 Ala Arg Thr Glu Ser Thr Gly Val Ser Val Gly Phe Arg Ala Pro Gln 65 70 75 80 Phe Glu Leu Pro Glu Pro Leu Thr Gly Lys Leu Trp Thr Leu Asp Asp 85 90 95 Phe Glu Gly Asn Pro Ala Leu Leu Val Met Phe Val Cys Asn His Cys 100 105 110 Pro Phe Val Lys His Leu Lys Lys Asp Ile Ala Lys Leu Thr Ser Phe 115 120 125 Tyr Met Glu Lys Gly Leu Ala Ala Val Ala Ile Ser Ser Asn Ser Ile 130 135 140 Val Thr His Pro Gln Asp Gly Pro Asp Tyr Ile Ala Glu Glu Ala Lys 145 150 155 160 Leu Tyr Lys Tyr Ser Phe Pro Tyr Leu Tyr Asp Glu Ser Gln Glu Val 165 170 175 Ala Lys Ala Phe Arg Ala Val Cys Thr Pro Glu Phe Tyr Leu Phe Lys 180 185 190 Lys Asp Gly Arg Arg Pro Phe Glu Leu Phe Tyr His Gly Gln Phe Asp 195 200 205 Asp Ser Arg Pro Ser Asn Asn Val Pro Val Thr Gly Arg Asp Leu Ser 210 215 220 Arg Ala Ile Asp Cys Ala Leu Ser Gly Gln Glu Leu Pro Phe Val Pro 225 230 235 240 Lys Pro Ser Val Gly Cys Ser Ile Lys Trp His Pro 245 250 <210> 67 <211> 994 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 67 aaatcccaac agagaagcat ttcctcgaac acatcgccgt cgccgccctc catggccgct 60 cccaccgcag cagctctctc caccctctcc accgccagcg tcacctccgg caagcgcttc 120 atcacctcct ccttctccct ctccttctcc tcccgccccc tcgcaacagg cgtccgcgcc 180 gcgggggcga gagcggcgcg gaggtcggcg gcgtcggcgt ccaccgtggt ggcgaccatc 240 gccgtcggag acaagctccc cgacgcgacg ctgtcctact tcgacccggc ggacggcgag 300 ctgaagacgg tgacggtggc ggagctgacg gcgggcagga aggcggtgct gttcgcggtg 360 cccggcgcgt tcacgccgac gtgctcgcag aagcacctcc cggggttcat cgagaaggcc 420 ggggagctcc acgccaaggg ggtggacgcc attgcctgcg tgtcggtgaa cgacgcgttc 480 gtgatgcgcg cgtggaagga gagcctgggc ctcggcgacg ccgacgtgct cctcctctcc 540 gacggcaacc tggagctcac gcgcgcgctc ggcgtcgaga tggacctctc cgacaagccc 600 atggggctcg gcgtcaggtc gcgccgctac gcgctcctcg ccgacgacgg cgtcgtcaag 660 gtgctcaacc tcgaggaggg cggcgccttc accaccagca gcgccgagga gatgctcaag 720 gcgctctgaa gatggaatcc gagctctcgt aggtggcaac aatggcagga tcagcccgtt 780 gctctcgcgc gttggtgagt agcgtcgtcg ttgtgaagag gaaattttgt gtgtgttttt 840 tttcggttga atgttgcatg ccatgtgctt gacgaaatga cggaataaca aaagaaaaaa 900 aactactttt atttttttgt tgaaatttgc aaaccatgtg tttgacgaaa tgtcgagata 960 tgaaagctgt gaaatcgctt acgtcacgtg cacc 994 <210> 68 <211> 225 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 68 Met Ala Ala Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ser Thr Leu Ser Thr Ala Ser 1 5 10 15 Val Thr Ser Gly Lys Arg Phe Ile Thr Ser Ser Phe Ser Leu Ser Phe 20 25 30 Ser Ser Arg Pro Leu Ala Thr Gly Val Arg Ala Ala Gly Ala Arg Ala 35 40 45 Ala Arg Arg Ser Ala Ala Ser Ala Ser Thr Val Val Ala Thr Ile Ala 50 55 60 Val Gly Asp Lys Leu Pro Asp Ala Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Pro Ala 65 70 75 80 Asp Gly Glu Leu Lys Thr Val Thr Val Ala Glu Leu Thr Ala Gly Arg 85 90 95 Lys Ala Val Leu Phe Ala Val Pro Gly Ala Phe Thr Pro Thr Cys Ser 100 105 110 Gln Lys His Leu Pro Gly Phe Ile Glu Lys Ala Gly Glu Leu His Ala 115 120 125 Lys Gly Val Asp Ala Ile Ala Cys Val Ser Val Asn Asp Ala Phe Val 130 135 140 Met Arg Ala Trp Lys Glu Ser Leu Gly Leu Gly Asp Ala Asp Val Leu 145 150 155 160 Leu Leu Ser Asp Gly Asn Leu Glu Leu Thr Arg Ala Leu Gly Val Glu 165 170 175 Met Asp Leu Ser Asp Lys Pro Met Gly Leu Gly Val Arg Ser Arg Arg 180 185 190 Tyr Ala Leu Leu Ala Asp Asp Gly Val Val Lys Val Leu Asn Leu Glu 195 200 205 Glu Gly Gly Ala Phe Thr Thr Ser Ser Ala Glu Glu Met Leu Lys Ala 210 215 220 Leu 225 <210> 69 <211> 959 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 69 tacctatgga gacggtcgcc tcgctctcgc gcgccgcgct cgccggcgcg cccgccgcta 60 cacgcgcgac agcgtcgccc gtgaacaggg ccgtggtccc tgcggcgtcc cggccgcgcg 120 ggggacgcct ttgctgccga cgctcgctga cggccgtctc cgcggcggca ggggcttccc 180 ctcccgtctc cccgtcgcct agccccgatg gcggctcccc cggcgtgtgg gacgctctcg 240 gcggcgtgtc cgtgctcgcc gccggcaccg gcgaagccgt tcagctcagg gacctgtggg 300 accccaccga gggggtggcc gtggtggcgc tgctccggca cttcgggtgc ttctgctgct 360 gggagctggc ctctgttctg aaggaatcca tggcgaaatt cgacgctgcc ggggccaagc 420 tgatcgccat cggcgtcggg actcctgaca aagctcgcat tctcgccgat gggctgccgt 480 tccctgttga tagcttgtac gctgaccccg agcgcaaggc ttacgacgta ttggggcttt 540 accatggtct gggtcggaca ttaatcagtc ctgcgaagat gtactcgggg cttaattcca 600 tcaagaaggt aaccaagaac tacacgctca agggcacacc agcagacctg acgggtatct 660 tgcagcaggg tggtatgctt gtgttcagag ggaaagagtt gctgtactca tggaaagaca 720 aaggcacggg tgatcatgct cctctggatg atgtcctcaa cgcttgctgc aatcgaactt 780 cttgaggtct ctagcagtcg gaagatgtgt atgtaaatat atgaaatgct cagcatgcca 840 aacagagagc aattagactc aacagtacta gatgttcgat taattatgca ttgttggttt 900 gcttatgtac ttagcatgat attggattag ctacccaatg gacatgacac tacagtctg 959 <210> 70 <211> 259 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 70 Met Glu Thr Val Ala Ser Leu Ser Arg Ala Ala Leu Ala Gly Ala Pro 1 5 10 15 Ala Ala Thr Arg Ala Thr Ala Ser Pro Val Asn Arg Ala Val Val Pro 20 25 30 Ala Ala Ser Arg Pro Arg Gly Gly Arg Leu Cys Cys Arg Arg Ser Leu 35 40 45 Thr Ala Val Ser Ala Ala Ala Gly Ala Ser Pro Pro Val Ser Pro Ser 50 55 60 Pro Ser Pro Asp Gly Gly Ser Pro Gly Val Trp Asp Ala Leu Gly Gly 65 70 75 80 Val Ser Val Leu Ala Ala Gly Thr Gly Glu Ala Val Gln Leu Arg Asp 85 90 95 Leu Trp Asp Pro Thr Glu Gly Val Ala Val Val Ala Leu Leu Arg His 100 105 110 Phe Gly Cys Phe Cys Cys Trp Glu Leu Ala Ser Val Leu Lys Glu Ser 115 120 125 Met Ala Lys Phe Asp Ala Ala Gly Ala Lys Leu Ile Ala Ile Gly Val 130 135 140 Gly Thr Pro Asp Lys Ala Arg Ile Leu Ala Asp Gly Leu Pro Phe Pro 145 150 155 160 Val Asp Ser Leu Tyr Ala Asp Pro Glu Arg Lys Ala Tyr Asp Val Leu 165 170 175 Gly Leu Tyr His Gly Leu Gly Arg Thr Leu Ile Ser Pro Ala Lys Met 180 185 190 Tyr Ser Gly Leu Asn Ser Ile Lys Lys Val Thr Lys Asn Tyr Thr Leu 195 200 205 Lys Gly Thr Pro Ala Asp Leu Thr Gly Ile Leu Gln Gln Gly Gly Met 210 215 220 Leu Val Phe Arg Gly Lys Glu Leu Leu Tyr Ser Trp Lys Asp Lys Gly 225 230 235 240 Thr Gly Asp His Ala Pro Leu Asp Asp Val Leu Asn Ala Cys Cys Asn 245 250 255 Arg Thr Ser <210> 71 <211> 1183 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 71 tccgcaacga cctccacacc gcaacggtcc actcgctcgc ctccgtctcc ctcccgcgtc 60 tagggtttcg ccacgtctca cgcagccatg gccgcggcgg ccgcgtccac ctcgctcccc 120 gtcccgcgcg tctccctccc gccgtccgct cgcccagccg ccgctccccg gcacggtctc 180 ctcatccccg gtcgccgtgg gtgcttccgt ctccgcggct caccagcggc accggccgcc 240 gccgcctcgg gctccccttc cgtgccttcc tcttccccgg aggctgggtc gggcatcggg 300 gatgccctcg gtggcgtcgc catctactcc gcggccaccg gcgagcccgt gctgttcagg 360 gacctgtggg accagaacga gggaatggct gttgttgccc tgctaaggca ttttgggtgc 420 ccttgctgtt gggagttggc ctctgtgttg agggatacaa aagagagatt tgattcagct 480 ggtgtcaagc taatagccgt tggtgttggc actccagata aagcccgtat tcttgctgag 540 cgtttaccat ttccattgga ctacctctac gcagatcctg agcgcaaggc ctatgatctc 600 ttgggtttgt attttggtat tggtcgcaca ttcttcaatc cagccagtgc aagtgtgttt 660 tcacgatttg actccctcaa ggaggcagtg aagaactata caattgaagc caccccagat 720 gatagggcta gtgttctaca acagggtgga atgtttgtgt tcagagggaa agaattaata 780 tatgcaagga aagatgaggg cactggtgat catgcacctc tggatgatgt cctcaacatc 840 tgttgtaaag cccctgcggc atgatattgt gtaatcaatg tcccatgaga attttcatag 900 cctggttctg ttcgtgtccc aaagttgtat gcagaaaagc atctcttgat tttggaaggc 960 tggcttctgc aaggatagta tctctttgtc tgtacgtctg atctaccatg ctgttgatat 1020 gtaatatatc agttgaaaac ttgagggatg taggcagacc aaaggacttt ctcatgccat 1080 aagctcagca gttcttttcc ttttcctcat agaaatgtac taattataga agagaatctt 1140 acactgtaca ataagtttgt gttaaagttg gcgaaatttt cct 1183 <210> 72 <211> 258 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 72 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ser Leu Pro Val Pro Arg Val Ser 1 5 10 15 Leu Pro Pro Ser Ala Arg Pro Ala Ala Ala Pro Arg His Gly Leu Leu 20 25 30 Ile Pro Gly Arg Arg Gly Cys Phe Arg Leu Arg Gly Ser Pro Ala Ala 35 40 45 Pro Ala Ala Ala Ala Ser Gly Ser Pro Ser Val Pro Ser Ser Ser Pro 50 55 60 Glu Ala Gly Ser Gly Ile Gly Asp Ala Leu Gly Gly Val Ala Ile Tyr 65 70 75 80 Ser Ala Ala Thr Gly Glu Pro Val Leu Phe Arg Asp Leu Trp Asp Gln 85 90 95 Asn Glu Gly Met Ala Val Val Ala Leu Leu Arg His Phe Gly Cys Pro 100 105 110 Cys Cys Trp Glu Leu Ala Ser Val Leu Arg Asp Thr Lys Glu Arg Phe 115 120 125 Asp Ser Ala Gly Val Lys Leu Ile Ala Val Gly Val Gly Thr Pro Asp 130 135 140 Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Arg Leu Pro Phe Pro Leu Asp Tyr Leu 145 150 155 160 Tyr Ala Asp Pro Glu Arg Lys Ala Tyr Asp Leu Leu Gly Leu Tyr Phe 165 170 175 Gly Ile Gly Arg Thr Phe Phe Asn Pro Ala Ser Ala Ser Val Phe Ser 180 185 190 Arg Phe Asp Ser Leu Lys Glu Ala Val Lys Asn Tyr Thr Ile Glu Ala 195 200 205 Thr Pro Asp Asp Arg Ala Ser Val Leu Gln Gln Gly Gly Met Phe Val 210 215 220 Phe Arg Gly Lys Glu Leu Ile Tyr Ala Arg Lys Asp Glu Gly Thr Gly 225 230 235 240 Asp His Ala Pro Leu Asp Asp Val Leu Asn Ile Cys Cys Lys Ala Pro 245 250 255 Ala Ala <210> 73 <211> 917 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 73 ctcggcgcgg ccacagccgc agaaccacac ctaggccgct cgaagaccca cgtagcttcc 60 atccaagctt accgccatgg ccgcgcgcgc gccgctcccc gtaccgcacg cggccgccac 120 cagcccgcga ccggctgcgg cgtcgagcct cctccgcgcg aggggcccgt gcgcctccct 180 cctctacccg cgccgcctcc gcttctccgt tgcgccggtg gccgccgcca agcccgaggc 240 cgtcgggagg gccggggagg cagctgcggc gccggtggaa gggctcgcga aatccctgca 300 gggggtggag gtgttcgatc tgagcggaaa ggcggtgccc gttgttgatc tgtggaagga 360 caggaaggcc atcgttgcgt tcgcccgcca ttttggatgc gtgctgtgcc gtaagagggc 420 cgatcttctc gcggctaagc aggatgcaat ggaggctgca ggggttgctc ttgttttaat 480 cggaccaggt actgttgaac aggcaaaggc attttatgac caaaccaaat tcaaaggaga 540 agtatacgct gatccaagtc actcatcata taatgccctt gaatttgcat ttgggctgtt 600 ctcaacgttt actccatcgg ccggtttgaa gattatacag ttgtacatgg aaggatacag 660 gcaggattgg gaactgtcgt tcgagaagac caccagaacg aaaggtggat ggtatcaagg 720 gggcctactt gttgcaggac caggcatcga caatattttg tatatccaca aggacaaaga 780 agcaggagat gaccctgaca tggatgatgt cttgaaagct tgctgttcct agatcactag 840 tatcctatat catttctgtt aacctccaga ccttgaagac acatgtaaat attttgccaa 900 gttaaagtat gttatgt 917 <210> 74 <211> 251 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 74 Met Ala Ala Arg Ala Pro Leu Pro Val Pro His Ala Ala Ala Thr Ser 1 5 10 15 Pro Arg Pro Ala Ala Ala Ser Ser Leu Leu Arg Ala Arg Gly Pro Cys 20 25 30 Ala Ser Leu Leu Tyr Pro Arg Arg Leu Arg Phe Ser Val Ala Pro Val 35 40 45 Ala Ala Ala Lys Pro Glu Ala Val Gly Arg Ala Gly Glu Ala Ala Ala 50 55 60 Ala Pro Val Glu Gly Leu Ala Lys Ser Leu Gln Gly Val Glu Val Phe 65 70 75 80 Asp Leu Ser Gly Lys Ala Val Pro Val Val Asp Leu Trp Lys Asp Arg 85 90 95 Lys Ala Ile Val Ala Phe Ala Arg His Phe Gly Cys Val Leu Cys Arg 100 105 110 Lys Arg Ala Asp Leu Leu Ala Ala Lys Gln Asp Ala Met Glu Ala Ala 115 120 125 Gly Val Ala Leu Val Leu Ile Gly Pro Gly Thr Val Glu Gln Ala Lys 130 135 140 Ala Phe Tyr Asp Gln Thr Lys Phe Lys Gly Glu Val Tyr Ala Asp Pro 145 150 155 160 Ser His Ser Ser Tyr Asn Ala Leu Glu Phe Ala Phe Gly Leu Phe Ser 165 170 175 Thr Phe Thr Pro Ser Ala Gly Leu Lys Ile Ile Gln Leu Tyr Met Glu 180 185 190 Gly Tyr Arg Gln Asp Trp Glu Leu Ser Phe Glu Lys Thr Thr Arg Thr 195 200 205 Lys Gly Gly Trp Tyr Gln Gly Gly Leu Leu Val Ala Gly Pro Gly Ile 210 215 220 Asp Asn Ile Leu Tyr Ile His Lys Asp Lys Glu Ala Gly Asp Asp Pro 225 230 235 240 Asp Met Asp Asp Val Leu Lys Ala Cys Cys Ser 245 250 <210> 75 <211> 886 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 75 acgcgtgagt tcgtgacgcg tcacgccccg cggccttccc ctcccaaaaa gcggcaggac 60 gcaacctgat ccccatcccc cgagcaagca aagcggagga acgcgatggc gtcggcgctg 120 ctgaggaagg cgacggtagg cggctccgcg gcggcggcgg cggcgaggtg ggcttccagg 180 gggctcgcgt cggtgggctc cggctccgac atcgtctcgg cggcgcccgg cgtgtcgctg 240 cagaaggccc gctcctggga cgagggcgtc gccaccaact tctccaccac ccctctcaag 300 gacatcttcc atgggaagaa agtggtcatc ttcggcctgc ctggtgcata cacaggagtc 360 tgttcacagg cacacgtccc tagttataaa aataacattg acaagttgaa agcaaaaggg 420 gttgactctg ttatctgtgt ctctgtgaat gacccttatg ccctgaatgg atgggcagaa 480 aagctacagg caaaagatgc tattgaattt tatggtgatt ttgatgggag tttccacaaa 540 agcttggatt tggaagtaga cctctctgct gctttgcttg gccgccgttc ccacaggtgg 600 tcagcctttg ttgacgatgg gaagatcaag gctttcaatg ttgaggtagc tccttctgac 660 ttcaaggttt ctggtgccga ggtgatcttg gaccaaatct gatccgagta acgaaattct 720 gtcgttgttt gttttctcat gcagcatgca tgcttttgct gtagtaaata aacgaaaact 780 cgactactcg agtatccatg taaagatgtt tgtagtctgc cttgctacgc ccagaatatt 840 tgttttcctg ttacaaatca gcttgccggg caacatgttt gtcagc 886 <210> 76 <211> 198 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 76 Met Ala Ser Ala Leu Leu Arg Lys Ala Thr Val Gly Gly Ser Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Arg Trp Ala Ser Arg Gly Leu Ala Ser Val Gly Ser 20 25 30 Gly Ser Asp Ile Val Ser Ala Ala Pro Gly Val Ser Leu Gln Lys Ala 35 40 45 Arg Ser Trp Asp Glu Gly Val Ala Thr Asn Phe Ser Thr Thr Pro Leu 50 55 60 Lys Asp Ile Phe His Gly Lys Lys Val Val Ile Phe Gly Leu Pro Gly 65 70 75 80 Ala Tyr Thr Gly Val Cys Ser Gln Ala His Val Pro Ser Tyr Lys Asn 85 90 95 Asn Ile Asp Lys Leu Lys Ala Lys Gly Val Asp Ser Val Ile Cys Val 100 105 110 Ser Val Asn Asp Pro Tyr Ala Leu Asn Gly Trp Ala Glu Lys Leu Gln 115 120 125 Ala Lys Asp Ala Ile Glu Phe Tyr Gly Asp Phe Asp Gly Ser Phe His 130 135 140 Lys Ser Leu Asp Leu Glu Val Asp Leu Ser Ala Ala Leu Leu Gly Arg 145 150 155 160 Arg Ser His Arg Trp Ser Ala Phe Val Asp Asp Gly Lys Ile Lys Ala 165 170 175 Phe Asn Val Glu Val Ala Pro Ser Asp Phe Lys Val Ser Gly Ala Glu 180 185 190 Val Ile Leu Asp Gln Ile 195 <210> 77 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> motif 1 <220> <221> UNSURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> UNSURE <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (14)..(14) <223> /replace = "Gly" <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> /replace = "Met" <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> /replace = "Gly" <220> <221> VARIANT <222> (21)..(21) <223> /replace = "Val" <220> <221> VARIANT <222> (22)..(22) <223> /replace = "Asn" <400> 77 Pro Leu Val Gly Asn Xaa Ala Pro Asp Phe Xaa Ala Glu Ala Val Phe 1 5 10 15 Asp Gln Glu Phe Ile Lys 20 <210> 78 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> motif 2 <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace = "Val" <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> /replace = "Tyr" <220> <221> UNSURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> /replace = "Lys" <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> /replace = "Ala" <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> /replace = "Glu" <220> <221> VARIANT <222> (14)..(14) <223> /replace = "Asp" <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> /replace = "Tyr" <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> /replace = "Asp" /replace = "Asn" <220> <221> VARIANT <222> (20)..(20) <223> /replace = "His" <400> 78 Tyr Pro Leu Ile Ser Asp Xaa Thr Lys Ser Ile Ser Lys Ser Phe Gly 1 5 10 15 Val Leu Ile Pro Asp Gln 20 <210> 79 <211> 2194 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 79 aatccgaaaa gtttctgcac cgttttcacc ccctaactaa caatataggg aacgtgtgct 60 aaatataaaa tgagacctta tatatgtagc gctgataact agaactatgc aagaaaaact 120 catccaccta ctttagtggc aatcgggcta aataaaaaag agtcgctaca ctagtttcgt 180 tttccttagt aattaagtgg gaaaatgaaa tcattattgc ttagaatata cgttcacatc 240 tctgtcatga agttaaatta ttcgaggtag ccataattgt catcaaactc ttcttgaata 300 aaaaaatctt tctagctgaa ctcaatgggt aaagagagag atttttttta aaaaaataga 360 atgaagatat tctgaacgta ttggcaaaga tttaaacata taattatata attttatagt 420 ttgtgcattc gtcatatcgc acatcattaa ggacatgtct tactccatcc caatttttat 480 ttagtaatta aagacaattg acttattttt attatttatc ttttttcgat tagatgcaag 540 gtacttacgc acacactttg tgctcatgtg catgtgtgag tgcacctcct caatacacgt 600 tcaactagca acacatctct aatatcactc gcctatttaa tacatttagg tagcaatatc 660 tgaattcaag cactccacca tcaccagacc acttttaata atatctaaaa tacaaaaaat 720 aattttacag aatagcatga aaagtatgaa acgaactatt taggtttttc acatacaaaa 780 aaaaaaagaa ttttgctcgt gcgcgagcgc caatctccca tattgggcac acaggcaaca 840 acagagtggc tgcccacaga acaacccaca aaaaacgatg atctaacgga ggacagcaag 900 tccgcaacaa ccttttaaca gcaggctttg cggccaggag agaggaggag aggcaaagaa 960 aaccaagcat cctccttctc ccatctataa attcctcccc ccttttcccc tctctatata 1020 ggaggcatcc aagccaagaa gagggagagc accaaggaca cgcgactagc agaagccgag 1080 cgaccgcctt ctcgatccat atcttccggt cgagttcttg gtcgatctct tccctcctcc 1140 acctcctcct cacagggtat gtgcctccct tcggttgttc ttggatttat tgttctaggt 1200 tgtgtagtac gggcgttgat gttaggaaag gggatctgta tctgtgatga ttcctgttct 1260 tggatttggg atagaggggt tcttgatgtt gcatgttatc ggttcggttt gattagtagt 1320 atggttttca atcgtctgga gagctctatg gaaatgaaat ggtttaggga tcggaatctt 1380 gcgattttgt gagtaccttt tgtttgaggt aaaatcagag caccggtgat tttgcttggt 1440 gtaataaagt acggttgttt ggtcctcgat tctggtagtg atgcttctcg atttgacgaa 1500 gctatccttt gtttattccc tattgaacaa aaataatcca actttgaaga cggtcccgtt 1560 gatgagattg aatgattgat tcttaagcct gtccaaaatt tcgcagctgg cttgtttaga 1620 tacagtagtc cccatcacga aattcatgga aacagttata atcctcagga acaggggatt 1680 ccctgttctt ccgatttgct ttagtcccag aatttttttt cccaaatatc ttaaaaagtc 1740 actttctggt tcagttcaat gaattgattg ctacaaataa tgcttttata gcgttatcct 1800 agctgtagtt cagttaatag gtaatacccc tatagtttag tcaggagaag aacttatccg 1860 atttctgatc tccattttta attatatgaa atgaactgta gcataagcag tattcatttg 1920 gattattttt tttattagct ctcacccctt cattattctg agctgaaagt ctggcatgaa 1980 ctgtcctcaa ttttgttttc aaattcacat cgattatcta tgcattatcc tcttgtatct 2040 acctgtagaa gtttcttttt ggttattcct tgactgcttg attacagaaa gaaatttatg 2100 aagctgtaat cgggatagtt atactgcttg ttcttatgat tcatttcctt tgtgcagttc 2160 ttggtgtagc ttgccacttt caccagcaaa gttc 2194 <210> 80 <211> 1264 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 80 tcgacgctac tcaagtggtg ggaggccacc gcatgttcca acgaagcgcc aaagaaagcc 60 ttgcagactc taatgctatt agtcgcctag gatatttgga atgaaaggaa ccgcagagtt 120 tttcagcacc aagagcttcc ggtggctagt ctgatagcca aaattaagga ggatgccaaa 180 acatgggtct tggcgggcgc gaaacacctt gataggtggc ttacctttta acatgttcgg 240 gccaaaggcc ttgagacggt aaagttttct atttgcgctt gcgcatgtac aattttattc 300 ctctattcaa tgaaattggt ggctcactgg ttcattaaaa aaaaaagaat ctagcctgtt 360 cgggaagaag aggattttgt tcgtgagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 420 gaaggaggag gaggattttc aggcttcgca ttgcccaacc tctgcttctg ttggcccaag 480 aagaatccca ggcgcccatg ggctggcagt ttaccacgga cctacctagc ctaccttagc 540 tatctaagcg ggccgaccta gtagccacgt gcctagtgta gattaaagtt gccgggccag 600 caggaagcca cgctgcaatg gcatcttccc ctgtccttcg cgtacgtgaa aacaaaccca 660 ggtaagctta gaatcttctt gcccgttgga ctgggacacc caccaatccc accatgcccc 720 gatattcctc cggtctcggt tcatgtgatg tcctctcttg tgtgatcacg gagcaagcat 780 tcttaaacgg caaaagaaaa tcaccaactt gctcacgcag tcacgctgca ccgcgcgaag 840 cgacgcccga taggccaaga tcgcgagata aaataacaac caatgatcat aaggaaacaa 900 gcccgcgatg tgtcgtgtgc agcaatcttg gtcatttgcg ggatcgagtg cttcacagct 960 aaccaaatat tcggccgatg atttaacaca ttatcagcgt agatgtacgt acgatttgtt 1020 aattaatcta cgagccttgc tagggcaggt gttctgccag ccaatccaga tcgccctcgt 1080 atgcacgctc acatgatggc agggcagggt tcacatgagc tctaacggtc gattaattaa 1140 tcccggggct cgactataaa tacctcccta atcccatgat caaaaccatc tcaagcagcc 1200 taatcatctc cagctgatca agagctctta attagctagc tagtgattag ctgcgcttgt 1260 gatc 1264 <210> 81 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer: forward primer prm8756 <400> 81 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aaacaatggc gtctgttgct tctt 54 <210> 82 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer: reverse primer prm8757 <400> 82 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cgagctaaat agctgagaag ag 52 <210> 83 <211> 1317 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 83 cggacaggcc acgtcgtgtc ctaaacctct tagcctttcc ctttataagt caatcttgtg 60 tcggcttcga ctcccaacat acacaaaaca ctaaaagtag aagaaaaatg gcgactctta 120 aggtttctga ttctgttcct gctccttctg atgatgctga gcaattgaga accgcttttg 180 aaggatgggg tacgaacgag gacttgatca tatcaatctt ggctcacaga agtgctgaac 240 agaggaaagt catcaggcaa gcataccacg aaacctacgg cgaagacctt ctcaagactc 300 ttgacaagga gctctctaac gatttcgaga gagctatctt gttgtggact cttgaacccg 360 gtgagcgtga tgctttattg gctaatgaag ctacaaaaag atggacttca agcaaccaag 420 ttcttatgga agttgcttgc acaaggacat caacgcagct gcttcacgct aggcaagctt 480 accatgctcg ctacaagaag tctcttgaag aggacgttgc tcaccacact accggtgact 540 tcagaaagct tttggtttct cttgttacct catacaggta cgaaggagat gaagtgaaca 600 tgacattggc taagcaagaa gctaagctgg tccatgagaa aatcaaggac aagcactaca 660 atgatgagga tgttattaga atcttgtcca caagaagcaa agctcagatc aatgctactt 720 ttaaccgtta ccaagatgat catggcgagg aaattctcaa gagtcttgag gaaggagatg 780 atgatgacaa gttccttgca cttttgaggt caaccattca gtgcttgaca agaccagagc 840 tttactttgt cgatgttctt cgttcagcaa tcaacaaaac tggaactgat gaaggagcac 900 tcactagaat tgtgaccaca agagctgaga ttgacttgaa ggtcattgga gaggagtacc 960 agcgcaggaa cagcattcct ttggagaaag ctattaccaa agacactcgt ggagattacg 1020 agaagatgct cgtcgcactt ctcggtgaag atgatgctta atcaatcaat cctccacaga 1080 gaaacataag ctgctctaca gcttctgtta tctcttatct ccctctctct ctctttgatg 1140 agtttcaaat cgtttgattt tgtttctaca aaaaccttgt ttgtttctgt tgtgtgtttt 1200 gagttcctaa ataatgcaaa agagagagac agagagaacc agtgtggtct cttaagttat 1260 atatatatga agagcattgg cctaaaacac agactaacaa gtagttctgg ttttgac 1317 <210> 84 <211> 317 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 84 Met Ala Thr Leu Lys Val Ser Asp Ser Val Pro Ala Pro Ser Asp Asp 1 5 10 15 Ala Glu Gln Leu Arg Thr Ala Phe Glu Gly Trp Gly Thr Asn Glu Asp 20 25 30 Leu Ile Ile Ser Ile Leu Ala His Arg Ser Ala Glu Gln Arg Lys Val 35 40 45 Ile Arg Gln Ala Tyr His Glu Thr Tyr Gly Glu Asp Leu Leu Lys Thr 50 55 60 Leu Asp Lys Glu Leu Ser Asn Asp Phe Glu Arg Ala Ile Leu Leu Trp 65 70 75 80 Thr Leu Glu Pro Gly Glu Arg Asp Ala Leu Leu Ala Asn Glu Ala Thr 85 90 95 Lys Arg Trp Thr Ser Ser Asn Gln Val Leu Met Glu Val Ala Cys Thr 100 105 110 Arg Thr Ser Thr Gln Leu Leu His Ala Arg Gln Ala Tyr His Ala Arg 115 120 125 Tyr Lys Lys Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala His His Thr Thr Gly Asp 130 135 140 Phe Arg Lys Leu Leu Val Ser Leu Val Thr Ser Tyr Arg Tyr Glu Gly 145 150 155 160 Asp Glu Val Asn Met Thr Leu Ala Lys Gln Glu Ala Lys Leu Val His 165 170 175 Glu Lys Ile Lys Asp Lys His Tyr Asn Asp Glu Asp Val Ile Arg Ile 180 185 190 Leu Ser Thr Arg Ser Lys Ala Gln Ile Asn Ala Thr Phe Asn Arg Tyr 195 200 205 Gln Asp Asp His Gly Glu Glu Ile Leu Lys Ser Leu Glu Glu Gly Asp 210 215 220 Asp Asp Asp Lys Phe Leu Ala Leu Leu Arg Ser Thr Ile Gln Cys Leu 225 230 235 240 Thr Arg Pro Glu Leu Tyr Phe Val Asp Val Leu Arg Ser Ala Ile Asn 245 250 255 Lys Thr Gly Thr Asp Glu Gly Ala Leu Thr Arg Ile Val Thr Thr Arg 260 265 270 Ala Glu Ile Asp Leu Lys Val Ile Gly Glu Glu Tyr Gln Arg Arg Asn 275 280 285 Ser Ile Pro Leu Glu Lys Ala Ile Thr Lys Asp Thr Arg Gly Asp Tyr 290 295 300 Glu Lys Met Leu Val Ala Leu Leu Gly Glu Asp Asp Ala 305 310 315 <210> 85 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> forward primer: P08727 <400> 85 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aaacaatggc gactcttaag gtttct 56 <210> 86 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> reverse primer: P09025 <400> 86 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt taagcatcat cttcaccgag 50 <210> 87 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> signature sequence 1 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> / replace = "Leu" / replace = "Val" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> / replace = "Val" / replace = "Leu" / replace = "Ile" <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> / replace = "Val" / replace = "Met" / replace = "Ile" / replace = "Cys" <220> <221> UNSURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably one of Leu, Ser, Ile, Val, Gln or Met <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> / replace = "Phe" <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> / replace = "Val" / replace = "Met" / replace = "Thr" / replace = "Ala" <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> / replace = "Pro" / replace = "Tyr" / replace = "Met" / replace = "Phe" <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> / replace = "Glu" / replace = "Ser" / replace = "His" <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> / replace = "Ala" <220> <221> UNSURE <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably one of Ala, Val, Pro, Gly, Ser, Thr or Trp <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> / replace = "Ser" / replace = "Glu" / replace = "Ala" <400> 87 Ala Met Leu Xaa Trp Ile Leu Asp Pro Xaa Gly Arg Asp Ala 1 5 10 <210> 88 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> signature sequence 2 <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace = "Ile" /replace = "Val" /replace = "Cys" /replace = "Gly" <220> <221> UNSURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably one of Lys, Arg, Gln, Ser, Glu, Ala or Met <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> /replace = "Arg" /replace = "Trp" /replace = "Met" <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace = "Thr" /replace = "Val" <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> /replace = "Asn" <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> /replace = "Ala" /replace = "Thr" /replace = "Glu" <220> <221> UNSURE <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably one of Thr, Ser, Lys, Asn, Gly, Asp, Ala, Glu, Gln, or Arg <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> /replace = "Ala" /replace = "Val" /replace = "Leu" /replace = "Met" <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> /replace = "Ile" /replace = "Leu" <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> /replace = "Thr" <220> <221> UNSURE <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably one of Asn, Ala, Arg, Glu, Asp, Ser or Gln <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> /replace = "Val" /replace = "Thr" <220> <221> VARIANT <222> (17)..(17) <223> /replace = "Ala" /replace = "Gly" <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> /replace = "Gln" /replace = "Lys" <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> /replace = "Ser" <400> 88 Ala Phe Xaa Gly Phe Gly Cys Asp Ser Xaa Thr Val Ile Xaa Ile Leu 1 5 10 15 Thr His Arg <210> 89 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> signature sequence 3 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace = "Ser" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace = "Asn" /replace = "Glu" /replace = "Thr" <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /replace = "Glu" /replace = "Lys" <220> <221> UNSURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably one of Ser Thr, Asp, Glu, Trp, Asn or Lys <220> <221> UNSURE <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably one of Thr, Ala, Ser, Met, His, Asp, Gly, or Trp <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace = "Thr" /replace = "Ser" /replace = "Asn" <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> /replace = "Ile" /replace = "Ala" /replace = "Gly" <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> /replace = "Ile" /replace = "Phe" <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> /replace = "Thr" /replace = "Cys" /replace = "Ser" /replace = "Ala" <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> /replace = "Ser" <220> <221> VARIANT <222> (14)..(14) <223> /replace = "Ala" <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> /replace = "Asp" <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> /replace = "Val" /replace = "Phe" /replace = "Leu" /replace = "Lys" /replace = "His" <220> <221> VARIANT <222> (17)..(17) <223> /replace = "Ser" <400> 89 Thr Asp Asp Xaa Xaa Leu Ile Arg Val Val Val Thr Arg Thr Glu Ile 1 5 10 15 Asp <210> 90 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> signtaure sequence 4 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace = "His" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace = "Tyr" <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /replace = "Glu" /replace = "Val" /replace = "Ser" <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace = "Glu" /replace = "Asp" <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> /replace = "Ala" /replace = "Leu" /replace = "Ile" <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> /replace = "Val" /replace = "Ile" <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace = "His" /replace = "Asp" <220> <221> UNSURE <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably one of Lys, Glu, Asp, Thr, Leu, Ser, Gln, Arg, Asn or Ala <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> /replace = "Ala" <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> /replace = "Ile" /replace = "Leu" <400> 90 Tyr Phe Ala Lys Val Leu Arg Xaa Ser Met 1 5 10 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> signature sequence 5 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace = "Gly" /replace = "Lys" /replace = "Ser" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace = "Ile" /replace = "Met" <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace = "Glu" <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> /replace = "His" <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> /replace = "Val" /replace = "Leu" <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace = "Ala" /replace = "Glu" <400> 91 Tyr Leu Glu His Asp Ile Gly 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> signature sequence 6 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> /replace = "Leu" /replace = "Val" /replace = "Ile" /replace = "Thr" <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace = "Leu" /replace = "Val" <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /replace = "Gln" /replace = "Tyr" <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace = "Val" <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> /replace = "Leu" /replace = "Val" /replace = "Ile" <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> /replace = "Ser" /replace = "Gly" /replace = "Ala" <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace = "Asp" /replace = "Thr" <400> 92 Phe Ile Arg Ile Phe Thr Glu Arg Ser 1 5 <210> 93 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> signature sequence 7 <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace = "Lys" /replace = "Met" /replace = "Glu" /replace = "Gln" <220> <221> UNSURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably one of Thr, Asp, Asn, Lys, Ser, Arg or Ala <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace = "Thr" /replace = "Leu" /replace = "Met" /replace = "Ile" <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> /replace = "Ile" <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> /replace = "Ile" /replace = "Val" <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> /replace = "Thr" /replace = "Val" /replace = "Ala" <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> /replace = "Ile" /replace = "Leu" /replace = "Ala" /replace = "Met" <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> /replace = "Ser" <400> 93 Tyr Arg Xaa Phe Leu Leu Ser Leu Val Gly 1 5 10 <210> 94 <211> 2194 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 94 aatccgaaaa gtttctgcac cgttttcacc ccctaactaa caatataggg aacgtgtgct 60 aaatataaaa tgagacctta tatatgtagc gctgataact agaactatgc aagaaaaact 120 catccaccta ctttagtggc aatcgggcta aataaaaaag agtcgctaca ctagtttcgt 180 tttccttagt aattaagtgg gaaaatgaaa tcattattgc ttagaatata cgttcacatc 240 tctgtcatga agttaaatta ttcgaggtag ccataattgt catcaaactc ttcttgaata 300 aaaaaatctt tctagctgaa ctcaatgggt aaagagagag atttttttta aaaaaataga 360 atgaagatat tctgaacgta ttggcaaaga tttaaacata taattatata attttatagt 420 ttgtgcattc gtcatatcgc acatcattaa ggacatgtct tactccatcc caatttttat 480 ttagtaatta aagacaattg acttattttt attatttatc ttttttcgat tagatgcaag 540 gtacttacgc acacactttg tgctcatgtg catgtgtgag tgcacctcct caatacacgt 600 tcaactagca acacatctct aatatcactc gcctatttaa tacatttagg tagcaatatc 660 tgaattcaag cactccacca tcaccagacc acttttaata atatctaaaa tacaaaaaat 720 aattttacag aatagcatga aaagtatgaa acgaactatt taggtttttc acatacaaaa 780 aaaaaaagaa ttttgctcgt gcgcgagcgc caatctccca tattgggcac acaggcaaca 840 acagagtggc tgcccacaga acaacccaca aaaaacgatg atctaacgga ggacagcaag 900 tccgcaacaa ccttttaaca gcaggctttg cggccaggag agaggaggag aggcaaagaa 960 aaccaagcat cctccttctc ccatctataa attcctcccc ccttttcccc tctctatata 1020 ggaggcatcc aagccaagaa gagggagagc accaaggaca cgcgactagc agaagccgag 1080 cgaccgcctt ctcgatccat atcttccggt cgagttcttg gtcgatctct tccctcctcc 1140 acctcctcct cacagggtat gtgcctccct tcggttgttc ttggatttat tgttctaggt 1200 tgtgtagtac gggcgttgat gttaggaaag gggatctgta tctgtgatga ttcctgttct 1260 tggatttggg atagaggggt tcttgatgtt gcatgttatc ggttcggttt gattagtagt 1320 atggttttca atcgtctgga gagctctatg gaaatgaaat ggtttaggga tcggaatctt 1380 gcgattttgt gagtaccttt tgtttgaggt aaaatcagag caccggtgat tttgcttggt 1440 gtaataaagt acggttgttt ggtcctcgat tctggtagtg atgcttctcg atttgacgaa 1500 gctatccttt gtttattccc tattgaacaa aaataatcca actttgaaga cggtcccgtt 1560 gatgagattg aatgattgat tcttaagcct gtccaaaatt tcgcagctgg cttgtttaga 1620 tacagtagtc cccatcacga aattcatgga aacagttata atcctcagga acaggggatt 1680 ccctgttctt ccgatttgct ttagtcccag aatttttttt cccaaatatc ttaaaaagtc 1740 actttctggt tcagttcaat gaattgattg ctacaaataa tgcttttata gcgttatcct 1800 agctgtagtt cagttaatag gtaatacccc tatagtttag tcaggagaag aacttatccg 1860 atttctgatc tccattttta attatatgaa atgaactgta gcataagcag tattcatttg 1920 gattattttt tttattagct ctcacccctt cattattctg agctgaaagt ctggcatgaa 1980 ctgtcctcaa ttttgttttc aaattcacat cgattatcta tgcattatcc tcttgtatct 2040 acctgtagaa gtttcttttt ggttattcct tgactgcttg attacagaaa gaaatttatg 2100 aagctgtaat cgggatagtt atactgcttg ttcttatgat tcatttcctt tgtgcagttc 2160 ttggtgtagc ttgccacttt caccagcaaa gttc 2194 <210> 95 <211> 1244 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 95 aaaaccaccg agggacctga tctgcaccgg ttttgatagt tgagggaccc gttgtgtctg 60 gttttccgat cgagggacga aaatcggatt cggtgtaaag ttaagggacc tcagatgaac 120 ttattccgga gcatgattgg gaagggagga cataaggccc atgtcgcatg tgtttggacg 180 gtccagatct ccagatcact cagcaggatc ggccgcgttc gcgtagcacc cgcggtttga 240 ttcggcttcc cgcaaggcgg cggccggtgg ccgtgccgcc gtagcttccg ccggaagcga 300 gcacgccgcc gccgccgacc cggctctgcg tttgcaccgc cttgcacgcg atacatcggg 360 atagatagct actactctct ccgtttcaca atgtaaatca ttctactatt ttccacattc 420 atattgatgt taatgaatat agacatatat atctatttag attcattaac atcaatatga 480 atgtaggaaa tgctagaatg acttacattg tgaattgtga aatggacgaa gtacctacga 540 tggatggatg caggatcatg aaagaattaa tgcaagatcg tatctgccgc atgcaaaatc 600 ttactaattg cgctgcatat atgcatgaca gcctgcatgc gggcgtgtaa gcgtgttcat 660 ccattaggaa gtaaccttgt cattacttat accagtacta catactatat agtattgatt 720 tcatgagcaa atctacaaaa ctggaaagca ataagaaata cgggactgga aaagactcaa 780 cattaatcac caaatatttc gccttctcca gcagaatata tatctctcca tcttgatcac 840 tgtacacact gacagtgtac gcataaacgc agcagccagc ttaactgtcg tctcaccgtc 900 gcacactggc cttccatctc aggctagctt tctcagccac ccatcgtaca tgtcaactcg 960 gcgcgcgcac aggcacaaat tacgtacaaa acgcatgacc aaatcaaaac caccggagaa 1020 gaatcgctcc cgcgcgcggc ggcgacgcgc acgtacgaac gcacgcacgc acgcccaacc 1080 ccacgacacg atcgcgcgcg acgccggcga caccggccgt ccacccgcgc cctcacctcg 1140 ccgactataa atacgtaggc atctgcttga tcttgtcatc catctcacca ccaaaaaaaa 1200 aaggaaaaaa aaacaaaaca caccaagcca aataaaagcg acaa 1244 <210> 96 <211> 1141 <212> DNA <213> Gossypium hirsutum <400> 96 cagattcaga aagaaataaa ggaagaagaa gcaatggcca ctcttacagt gcccacgaca 60 gttccttcgg tgtctgaaga ttgtgaacag ctaagaaaag ccttttcagg atggggaact 120 aatgagggct taatcataga tatattgggt cacagaaatg ccgagcaacg aaacttgatt 180 cgaaaaacct acgctgaaac ctatggagag gatctcctca aggcactaga caaggagctc 240 tcgaatgact ttgagaggct ggttttgctt tgggctcttg atcctgctga acgtgatgcc 300 cttttggcta atgaagccac caaaaggtgg acttcaagca atcaggtcct tatggaaata 360 gcttgcacaa ggtctgccaa ccaactgctt cacgcaaggc aggcttatca tgctcgttat 420 aagaagtcgc ttgaagagga tgttgctcat cacacgactg gcgacttccg taagctcctc 480 ctacctctag tgagttcata cagatatgag ggagaggagg tgaacatgaa tctggcgaaa 540 acagaggcga agttgcttca tgagaaaatt tcagacaaag cttacagtga tgacgatgtc 600 ataagggttt tggctacaag aagcaaggca cagatcaatg caactctgaa tcactacaaa 660 aatgaatatg gaaatgacat aaacaaggac ttgaaggctg atcctaagga tgagttcctt 720 gcactactaa ggtccacagt gaagtgcttg gtctatccgg aaaagtattt tgagaaggtt 780 cttcgcctag caatcaatag acgaggaacg gatgaaggag ctcttactag agttgtttgc 840 actagggctg aggttgatct aaagatcata gcagatgagt accagcgaag gaacagtgtc 900 ccactgactc gtgccattgt caaggacact catggagact atgaaaaatt gctgctggta 960 cttgcaggac atgtggagaa ttgaatctga tatcatgaga caatttcctg gtgaataaat 1020 gtttatgacc aaactataat ggtctagtgt ggttattgat gttttcctgt ttttctatgt 1080 agtattgcga gttatatgct atccaagaat tcgaagtcta tttaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 a 1141 <210> 97 <211> 316 <212> PRT <213> Gossypium hirsutum <400> 97 Met Ala Thr Leu Thr Val Pro Thr Thr Val Pro Ser Val Ser Glu Asp 1 5 10 15 Cys Glu Gln Leu Arg Lys Ala Phe Ser Gly Trp Gly Thr Asn Glu Gly 20 25 30 Leu Ile Ile Asp Ile Leu Gly His Arg Asn Ala Glu Gln Arg Asn Leu 35 40 45 Ile Arg Lys Thr Tyr Ala Glu Thr Tyr Gly Glu Asp Leu Leu Lys Ala 50 55 60 Leu Asp Lys Glu Leu Ser Asn Asp Phe Glu Arg Leu Val Leu Leu Trp 65 70 75 80 Ala Leu Asp Pro Ala Glu Arg Asp Ala Leu Leu Ala Asn Glu Ala Thr 85 90 95 Lys Arg Trp Thr Ser Ser Asn Gln Val Leu Met Glu Ile Ala Cys Thr 100 105 110 Arg Ser Ala Asn Gln Leu Leu His Ala Arg Gln Ala Tyr His Ala Arg 115 120 125 Tyr Lys Lys Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala His His Thr Thr Gly Asp 130 135 140 Phe Arg Lys Leu Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Tyr Arg Tyr Glu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Val Asn Met Asn Leu Ala Lys Thr Glu Ala Lys Leu Leu His 165 170 175 Glu Lys Ile Ser Asp Lys Ala Tyr Ser Asp Asp Asp Val Ile Arg Val 180 185 190 Leu Ala Thr Arg Ser Lys Ala Gln Ile Asn Ala Thr Leu Asn His Tyr 195 200 205 Lys Asn Glu Tyr Gly Asn Asp Ile Asn Lys Asp Leu Lys Ala Asp Pro 210 215 220 Lys Asp Glu Phe Leu Ala Leu Leu Arg Ser Thr Val Lys Cys Leu Val 225 230 235 240 Tyr Pro Glu Lys Tyr Phe Glu Lys Val Leu Arg Leu Ala Ile Asn Arg 245 250 255 Arg Gly Thr Asp Glu Gly Ala Leu Thr Arg Val Val Cys Thr Arg Ala 260 265 270 Glu Val Asp Leu Lys Ile Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Arg Arg Asn Ser 275 280 285 Val Pro Leu Thr Arg Ala Ile Val Lys Asp Thr His Gly Asp Tyr Glu 290 295 300 Lys Leu Leu Leu Val Leu Ala Gly His Val Glu Asn 305 310 315 <210> 98 <211> 1112 <212> DNA <213> Lavatera thuringiaca <400> 98 aatggctact cttacagttc cctccacact tccgtcagtg tctgaagatt gtgaacaact 60 caggaaagcc ttctcaggat ggggaactaa tgaggactta atcataaata tattgggtca 120 ccgaaatgcg gacgaacgaa actcgattcg aaaagcttat actgaaaccc atggagaaga 180 tctcctcaag gcactggaca aggaactctc aaatgacttt gagaggctgg ttctgctttg 240 gactcttgat cctcctgaac gtgatgcact tttggcaaat gaagccacca aaaggtggac 300 ttcaagcaat caggtaatta tggaaatagc ctgcagaagt tcttctgacc aactgcttcg 360 cgcgaggcag gcttatcatg ttcgttataa gaaatcgctt gaagaggatg ttgcccatca 420 cacaactggc gacttccgta agcttctcct acctcttgtg agttcataca gatacgaggg 480 agatgaagtg aacatgactc tggcgaaaac agaggccaag ttactccatg agaaaatctc 540 aaacaaagct tacagtgatg acgatgtcat cagggttttg gctacgagaa gcaagtcaca 600 gatcaacgaa cgtcttaatc actacaaaaa tgaatacgca actgatataa acaaggacct 660 gaaggctgac cctaaggatg agttccttgc actgctaagg tccacagtga agtgcttggt 720 ctaccctgaa aagtatttcg agaaggttct tcgtctagca atcaataaac gaggaacgga 780 tgaaggagct cttacgaggg ttgtttccac cagggctgag gttgatctaa agatcatagc 840 agatgagtac cagcgaagga acagtgtccc actgactcgt gctattgtca aggacactaa 900 tggagactac gaaaaattgc tgctggtact tgctggagag gtggaggctt gaaccggttt 960 tcatgagatg attttgtgtt gaataaaaac ttaatgaccg gaactctaat ggtctagtgt 1020 tgctattatg ttatcctgtt ttttttcttc tatggtactg tgagttttat gcaataaagg 1080 cttgttattt agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1112 <210> 99 <211> 316 <212> PRT <213> Lavatera thuringiaca <400> 99 Met Ala Thr Leu Thr Val Pro Ser Thr Leu Pro Ser Val Ser Glu Asp 1 5 10 15 Cys Glu Gln Leu Arg Lys Ala Phe Ser Gly Trp Gly Thr Asn Glu Asp 20 25 30 Leu Ile Ile Asn Ile Leu Gly His Arg Asn Ala Asp Glu Arg Asn Ser 35 40 45 Ile Arg Lys Ala Tyr Thr Glu Thr His Gly Glu Asp Leu Leu Lys Ala 50 55 60 Leu Asp Lys Glu Leu Ser Asn Asp Phe Glu Arg Leu Val Leu Leu Trp 65 70 75 80 Thr Leu Asp Pro Pro Glu Arg Asp Ala Leu Leu Ala Asn Glu Ala Thr 85 90 95 Lys Arg Trp Thr Ser Ser Asn Gln Val Ile Met Glu Ile Ala Cys Arg 100 105 110 Ser Ser Ser Asp Gln Leu Leu Arg Ala Arg Gln Ala Tyr His Val Arg 115 120 125 Tyr Lys Lys Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala His His Thr Thr Gly Asp 130 135 140 Phe Arg Lys Leu Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Tyr Arg Tyr Glu Gly 145 150 155 160 Asp Glu Val Asn Met Thr Leu Ala Lys Thr Glu Ala Lys Leu Leu His 165 170 175 Glu Lys Ile Ser Asn Lys Ala Tyr Ser Asp Asp Asp Val Ile Arg Val 180 185 190 Leu Ala Thr Arg Ser Lys Ser Gln Ile Asn Glu Arg Leu Asn His Tyr 195 200 205 Lys Asn Glu Tyr Ala Thr Asp Ile Asn Lys Asp Leu Lys Ala Asp Pro 210 215 220 Lys Asp Glu Phe Leu Ala Leu Leu Arg Ser Thr Val Lys Cys Leu Val 225 230 235 240 Tyr Pro Glu Lys Tyr Phe Glu Lys Val Leu Arg Leu Ala Ile Asn Lys 245 250 255 Arg Gly Thr Asp Glu Gly Ala Leu Thr Arg Val Val Ser Thr Arg Ala 260 265 270 Glu Val Asp Leu Lys Ile Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Arg Arg Asn Ser 275 280 285 Val Pro Leu Thr Arg Ala Ile Val Lys Asp Thr Asn Gly Asp Tyr Glu 290 295 300 Lys Leu Leu Leu Val Leu Ala Gly Glu Val Glu Ala 305 310 315 <210> 100 <211> 2040 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 100 atggcgtctc tcaaagtccc taccaacgtt cctcttcccg aggaagacgc cgagcaactc 60 cacaaggctt ttgcaggatg gggtaccaac gagaagctga tcatatcaat cctagctcac 120 aggacctcag cacaacgcag cttaatccgc agcgcttatg ccgctgctta caatgaggat 180 ctcctcaagg ccttagacaa agagctttct agtgactttg agcgagttgt catgttgtgg 240 actcttgatc cagcggagag agatgctttc cttgctaaag aatctaccaa aatgttcacc 300 aagaacaatt gggttcttgt tgaaatcgca tgcactaggt gtcctcttga tcttttcaag 360 gtcaaacaag cttaccaagc acgttacaag aaatctctag aggaagatgt tgcgcaacac 420 acatctggtg accttcgtaa gctcttgctt cctcttgtta gtacttttag gtacgaagga 480 gatgaggtga acatgaggct tgcaagatcc gaagctaagt tacttcacga gaaggtctca 540 gagaaagcct ttagtgatga tgacttcatc agaatcttga caacaagaag caaagcacag 600 ctcggtgcaa ctcttaacca ctacaataat gagtacggaa acgctattaa caagcacttg 660 aaggaagatt cagatgatga gtacctgaag ctactaagag ctgcgatcac gtgtttgaca 720 taccctgaga agcattttga gaaggttttg cgtctagcaa ttaacaaaat ggggactgat 780 gagtgggcac taacccgagt tgtgactaca cgaactgaag ttgatatgga acgtatcaaa 840 gaggaatatc aacgaaggaa cagcattcct ttgcaccatg ccgtcgctaa agacacttct 900 ggtgattatg aggatatgct tgtttctctt ctcggacatg gagatgaagg gactctcgac 960 ggatcttttg ctggagataa gcgcctcggc ttctcgtctt cttcacagtc ctcacgtcgt 1020 ctcgccctat ctggtgggtc gtctctccaa caacgaatcg agaggactct cttgccactg 1080 ctgctctcgg gttatcggag acaagctcca gtgaactccc ctctaactgc cccagacatg 1140 tctcgatttt gcagatccga agaaccttct ggttctcttg gtctctcatc atttggtggc 1200 tccttcctca ccagagccgg gtctagcgtc aattcacctg ctcctctctc atcaatttat 1260 gttaatccgg cgaccgatgt aggtggaact ccactccggc gaccagatct gttccttaaa 1320 agtttgagaa gacaagcatc ctccagcgac attcctcttc cccgctccat cctctccatc 1380 ctccatgttt ggcctcctcc acccttcaga ttgtgtaaac ttggtttaaa acgattgcat 1440 gaagatccat accaccaacc actgcaaaca taccttctat cacagcggtt tgcaaatttg 1500 gcgtccgatg taggtgggaa ttcactccgg catacagttt tgagccatat gtttatgaat 1560 atgacgtctg atgtgagtgg gaatccactc cggcctccag ctctgagcca tcaaaagcta 1620 gtaaggccaa tttgtcggcg cattattctc acctcttttt ctgttgtgga gatcacttta 1680 ctaccatgtc tcccttctat gaatggagaa aatttctcag attcttttcc gagcttcagt 1740 tgcagtttac tcactggttt gttactttat ggagcggtcc gtacggggcc tgaaggtgca 1800 atcgagacta cttcggtttt tcttgttggt gaagactgtc tttcaacgtc acttgtgact 1860 atctctcaac tatccaactt tgccgtggaa gctttattga cgcattcaaa cttgatattg 1920 aattcgctgt caacttcata tgaagattta ttatgcttgt ttctaattgc tattatagtt 1980 catgaattgt ccacaagagg atgtttagtt ctcttttggc tttgtagtcc ttgcatttga 2040 <210> 101 <211> 679 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 101 Met Ala Ser Leu Lys Val Pro Thr Asn Val Pro Leu Pro Glu Glu Asp 1 5 10 15 Ala Glu Gln Leu His Lys Ala Phe Ala Gly Trp Gly Thr Asn Glu Lys 20 25 30 Leu Ile Ile Ser Ile Leu Ala His Arg Thr Ser Ala Gln Arg Ser Leu 35 40 45 Ile Arg Ser Ala Tyr Ala Ala Ala Tyr Asn Glu Asp Leu Leu Lys Ala 50 55 60 Leu Asp Lys Glu Leu Ser Ser Asp Phe Glu Arg Val Val Met Leu Trp 65 70 75 80 Thr Leu Asp Pro Ala Glu Arg Asp Ala Phe Leu Ala Lys Glu Ser Thr 85 90 95 Lys Met Phe Thr Lys Asn Asn Trp Val Leu Val Glu Ile Ala Cys Thr 100 105 110 Arg Cys Pro Leu Asp Leu Phe Lys Val Lys Gln Ala Tyr Gln Ala Arg 115 120 125 Tyr Lys Lys Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala Gln His Thr Ser Gly Asp 130 135 140 Leu Arg Lys Leu Leu Leu Pro Leu Val Ser Thr Phe Arg Tyr Glu Gly 145 150 155 160 Asp Glu Val Asn Met Arg Leu Ala Arg Ser Glu Ala Lys Leu Leu His 165 170 175 Glu Lys Val Ser Glu Lys Ala Phe Ser Asp Asp Asp Phe Ile Arg Ile 180 185 190 Leu Thr Thr Arg Ser Lys Ala Gln Leu Gly Ala Thr Leu Asn His Tyr 195 200 205 Asn Asn Glu Tyr Gly Asn Ala Ile Asn Lys His Leu Lys Glu Asp Ser 210 215 220 Asp Asp Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Arg Ala Ala Ile Thr Cys Leu Thr 225 230 235 240 Tyr Pro Glu Lys His Phe Glu Lys Val Leu Arg Leu Ala Ile Asn Lys 245 250 255 Met Gly Thr Asp Glu Trp Ala Leu Thr Arg Val Val Thr Thr Arg Thr 260 265 270 Glu Val Asp Met Glu Arg Ile Lys Glu Glu Tyr Gln Arg Arg Asn Ser 275 280 285 Ile Pro Leu His His Ala Val Ala Lys Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Glu 290 295 300 Asp Met Leu Val Ser Leu Leu Gly His Gly Asp Glu Gly Thr Leu Asp 305 310 315 320 Gly Ser Phe Ala Gly Asp Lys Arg Leu Gly Phe Ser Ser Ser Ser Gln 325 330 335 Ser Ser Arg Arg Leu Ala Leu Ser Gly Gly Ser Ser Leu Gln Gln Arg 340 345 350 Ile Glu Arg Thr Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ser Gly Tyr Arg Arg Gln 355 360 365 Ala Pro Val Asn Ser Pro Leu Thr Ala Pro Asp Met Ser Arg Phe Cys 370 375 380 Arg Ser Glu Glu Pro Ser Gly Ser Leu Gly Leu Ser Ser Phe Gly Gly 385 390 395 400 Ser Phe Leu Thr Arg Ala Gly Ser Ser Val Asn Ser Pro Ala Pro Leu 405 410 415 Ser Ser Ile Tyr Val Asn Pro Ala Thr Asp Val Gly Gly Thr Pro Leu 420 425 430 Arg Arg Pro Asp Leu Phe Leu Lys Ser Leu Arg Arg Gln Ala Ser Ser 435 440 445 Ser Asp Ile Pro Leu Pro Arg Ser Ile Leu Ser Ile Leu His Val Trp 450 455 460 Pro Pro Pro Pro Phe Arg Leu Cys Lys Leu Gly Leu Lys Arg Leu His 465 470 475 480 Glu Asp Pro Tyr His Gln Pro Leu Gln Thr Tyr Leu Leu Ser Gln Arg 485 490 495 Phe Ala Asn Leu Ala Ser Asp Val Gly Gly Asn Ser Leu Arg His Thr 500 505 510 Val Leu Ser His Met Phe Met Asn Met Thr Ser Asp Val Ser Gly Asn 515 520 525 Pro Leu Arg Pro Pro Ala Leu Ser His Gln Lys Leu Val Arg Pro Ile 530 535 540 Cys Arg Arg Ile Ile Leu Thr Ser Phe Ser Val Val Glu Ile Thr Leu 545 550 555 560 Leu Pro Cys Leu Pro Ser Met Asn Gly Glu Asn Phe Ser Asp Ser Phe 565 570 575 Pro Ser Phe Ser Cys Ser Leu Leu Thr Gly Leu Leu Leu Tyr Gly Ala 580 585 590 Val Arg Thr Gly Pro Glu Gly Ala Ile Glu Thr Thr Ser Val Phe Leu 595 600 605 Val Gly Glu Asp Cys Leu Ser Thr Ser Leu Val Thr Ile Ser Gln Leu 610 615 620 Ser Asn Phe Ala Val Glu Ala Leu Leu Thr His Ser Asn Leu Ile Leu 625 630 635 640 Asn Ser Leu Ser Thr Ser Tyr Glu Asp Leu Leu Cys Leu Phe Leu Ile 645 650 655 Ala Ile Ile Val His Glu Leu Ser Thr Arg Gly Cys Leu Val Leu Phe 660 665 670 Trp Leu Cys Ser Pro Cys Ile 675 <210> 102 <211> 1146 <212> DNA <213> Gossypium hirsutum <400> 102 caaccctcaa agttccagtt cacgttcctt ctccttctga ggatgctgaa tggcaacttc 60 ggaaagcttt tgaaggctgg ggtacgaacg agcaattgat tatcgacata ttggctcaca 120 ggaatgcagc acagcgcaat tcaattcgga aagtttatgg tgaagcttat ggggaagatc 180 ttctcaagtg tttggagaag gaacttacaa gtgatttcga gcgggctgtg ctgcttttta 240 cgttggaccc tgcagagcga gatgctcatc tggctaatga agctacaaag aagttcacat 300 caagcaattg gattctcatg gagatagctt gcagtaggtc ttcgcatgaa ctactcaatg 360 tgaaaaaggc gtatcatgct cgttataaga aatcccttga agaagatgtt gctcaccaca 420 ctaccggaga gtaccgcaag cttttggtcc ctcttgttag tgcattccga tatgagggag 480 aggaggtgaa catgacattg gcaaaatctg aggctaagat acttcatgat aaaatttcgg 540 acaagcatta taccgatgag gaggtgatta ggattgtatc aacaaggagt aaggcacagc 600 tcaatgcaac tctcaaccat tacaatactt cattcggcaa tgctatcaac aaggatttga 660 aggctgatcc cagtgatgaa ttcctcaaat tactaagagc tgtgatcaag tgcttgacca 720 ccccagagca atatttcgag aaggttttac gtcaagccat caataagttg ggatccgatg 780 aatgggctct tacccgagtc gtcacaactc gtgcagaggt cgacatggta cgtattaagg 840 aggcatatca acgaagaaac agcatccctc tcgaacaagc aattgctaaa gatacttcgg 900 gtgactatga gaagtttctt cttgccttga tcggagctgg agatgcatga accgtcttcg 960 gtattaagtt cctctgtatg aatgtttagt ttgccttatc cgctatgact taataattta 1020 tgcttggttt ttcatcgttt tcattatcta aagcattgct tgcttccatg atagaacatt 1080 caaaataaaa tgattgagtt cgtttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagg aaaaaaaaaa 1140 aaaaaa 1146 <210> 103 <211> 315 <212> PRT <213> Gossypium hirsutum <400> 103 Thr Leu Lys Val Pro Val His Val Pro Ser Pro Ser Glu Asp Ala Glu 1 5 10 15 Trp Gln Leu Arg Lys Ala Phe Glu Gly Trp Gly Thr Asn Glu Gln Leu 20 25 30 Ile Ile Asp Ile Leu Ala His Arg Asn Ala Ala Gln Arg Asn Ser Ile 35 40 45 Arg Lys Val Tyr Gly Glu Ala Tyr Gly Glu Asp Leu Leu Lys Cys Leu 50 55 60 Glu Lys Glu Leu Thr Ser Asp Phe Glu Arg Ala Val Leu Leu Phe Thr 65 70 75 80 Leu Asp Pro Ala Glu Arg Asp Ala His Leu Ala Asn Glu Ala Thr Lys 85 90 95 Lys Phe Thr Ser Ser Asn Trp Ile Leu Met Glu Ile Ala Cys Ser Arg 100 105 110 Ser Ser His Glu Leu Leu Asn Val Lys Lys Ala Tyr His Ala Arg Tyr 115 120 125 Lys Lys Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala His His Thr Thr Gly Glu Tyr 130 135 140 Arg Lys Leu Leu Val Pro Leu Val Ser Ala Phe Arg Tyr Glu Gly Glu 145 150 155 160 Glu Val Asn Met Thr Leu Ala Lys Ser Glu Ala Lys Ile Leu His Asp 165 170 175 Lys Ile Ser Asp Lys His Tyr Thr Asp Glu Glu Val Ile Arg Ile Val 180 185 190 Ser Thr Arg Ser Lys Ala Gln Leu Asn Ala Thr Leu Asn His Tyr Asn 195 200 205 Thr Ser Phe Gly Asn Ala Ile Asn Lys Asp Leu Lys Ala Asp Pro Ser 210 215 220 Asp Glu Phe Leu Lys Leu Leu Arg Ala Val Ile Lys Cys Leu Thr Thr 225 230 235 240 Pro Glu Gln Tyr Phe Glu Lys Val Leu Arg Gln Ala Ile Asn Lys Leu 245 250 255 Gly Ser Asp Glu Trp Ala Leu Thr Arg Val Val Thr Thr Arg Ala Glu 260 265 270 Val Asp Met Val Arg Ile Lys Glu Ala Tyr Gln Arg Arg Asn Ser Ile 275 280 285 Pro Leu Glu Gln Ala Ile Ala Lys Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Glu Lys 290 295 300 Phe Leu Leu Ala Leu Ile Gly Ala Gly Asp Ala 305 310 315 <210> 104 <211> 1180 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 104 aaaaatggca agtctaaccg ttccagcaca tgttccttcg gctgctgaag actgtgaaca 60 actccgatct gccttcaaag gatggggaac aaatgagaag ttgatcatat caattttggc 120 tcatagaact gctgctcagc gcaaattgat tcgtcaaact tatgctgaga ctttcggaga 180 ggatctactt aaagagttgg acagagaact tacccatgat tttgagaaat tggtgctagt 240 gtggacgttg gatccttcag aacgtgatgc tcatttggct aaggaagcta ctaagagatg 300 gacaaaaagc aactttgttc ttgtggagct agcttgtacc agatcgccta aagaactggt 360 tttggctagg gaagcttatc atgcacgtta caagaaatct cttgaagagg atgttgccta 420 tcacactact ggggatcacc gcaagctttt ggtacctctt gtgagctcct accgatatgg 480 aggagaggag gtggacttgc gccttgctaa agcagaatct aaaattctgc atgagaagat 540 ctccgataag gcttacagtg atgatgaggt cattagaatt ttagccacaa ggagcaaagc 600 gcaactcaat gctactttga atcattacaa agatgaacat ggtgaggata tcctaaagca 660 attggaagat ggggatgagt ttgttgcact attgagggcc accattaaag gtcttgtcta 720 cccggagcac tattttgtgg aggttcttcg tgatgcaatc aacaggagag ggacagagga 780 agatcatctg acaagagtta ttgctacaag ggctgaggtc gatctgaaga ttatcgctga 840 tgagtaccag aagagggata gcattcccct gggtcgcgcc attgccaaag atacaagagg 900 agattatgag agtatgctgt tggctttgct tggacaagag gaggactgag gaggatttgg 960 ccacttatgt tttacaatga caagaataaa tatgccatcc cctatatgag aattggcatc 1020 cgttgtatgt ttgatgattg agtgtggtct gtttatgagc ttttagtcct tttttcttct 1080 cgtgagaaac ttctaatatg caactttgtg ctgtctacat atgttttcta ataatatgca 1140 tcgattagtt ctaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1180 <210> 105 <211> 322 <212> PRT <213> Capsicum annuum <400> 105 Met Ala His His His His His His Met Ala Ser Leu Thr Val Pro Ala 1 5 10 15 His Val Pro Ser Ala Ala Glu Asp Cys Glu Gln Leu Arg Ser Ala Phe 20 25 30 Lys Gly Trp Gly Thr Asn Glu Lys Leu Ile Ile Ser Ile Leu Ala His 35 40 45 Arg Thr Ala Ala Gln Arg Lys Leu Ile Arg Gln Thr Tyr Ala Glu Thr 50 55 60 Phe Gly Glu Asp Leu Leu Lys Glu Leu Asp Arg Glu Leu Thr His Asp 65 70 75 80 Phe Glu Lys Leu Val Leu Val Trp Thr Leu Asp Pro Ser Glu Arg Asp 85 90 95 Ala His Leu Ala Lys Glu Ala Thr Lys Arg Trp Thr Lys Ser Asn Phe 100 105 110 Val Leu Val Glu Leu Ala Cys Thr Arg Ser Pro Lys Glu Leu Val Leu 115 120 125 Ala Arg Glu Ala Tyr His Ala Arg Tyr Lys Lys Ser Leu Glu Glu Asp 130 135 140 Val Ala Tyr His Thr Thr Gly Asp His Arg Lys Leu Leu Val Pro Leu 145 150 155 160 Val Ser Ser Tyr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Val Asp Leu Arg Leu Ala 165 170 175 Lys Ala Glu Ser Lys Ile Leu His Glu Lys Ile Ser Asp Lys Ala Tyr 180 185 190 Ser Asp Asp Glu Val Ile Arg Ile Leu Ala Thr Arg Ser Lys Ala Gln 195 200 205 Leu Asn Ala Thr Leu Asn His Tyr Lys Asp Glu His Gly Glu Asp Ile 210 215 220 Leu Lys Gln Leu Glu Asp Gly Asp Glu Phe Val Ala Leu Leu Arg Ala 225 230 235 240 Thr Ile Lys Gly Leu Val Tyr Pro Glu His Tyr Phe Val Glu Val Leu 245 250 255 Arg Asp Ala Ile Asn Arg Arg Gly Thr Glu Glu Asp His Leu Thr Arg 260 265 270 Val Ile Ala Thr Arg Ala Glu Val Asp Leu Lys Ile Ile Ala Asp Glu 275 280 285 Tyr Gln Lys Arg Asp Ser Ile Pro Leu Gly Arg Ala Ile Ala Lys Asp 290 295 300 Thr Arg Gly Asp Tyr Glu Ser Met Leu Leu Ala Leu Leu Gly Gln Glu 305 310 315 320 Glu Asp <210> 106 <211> 1197 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 106 catccacaat tctccacagt acaagaaaac aaaaaaatgg cgagtcttaa agttccaaca 60 tctgttccag aaccttatga agatgctgag caactcaaaa aagcttttgc tggatggggt 120 acaaatgagg cacttattat tcagattctg gcacatagaa atgcagcaca acgcaagtta 180 atccgagaaa cttatgctgc agcttatgga gaggatcttc tcaaggactt ggatgctgaa 240 ctgacaagtg attttcagcg tgcagtgctt ctgtggactt tgagtcctgc tgagcgcgac 300 gcctacttgg ttaatgaagc taccaaacgt ctgacttcta gcaattgggt tatcttggaa 360 attgcttgta caaggtcttc tgatgatctc tttaaggcga ggcaggccta ccatgctcga 420 tacaagaaat cacttgaaga agatgttgct tatcacacaa ctggggattt ccgtaagctt 480 ttggttcctc ttttaactgc attcagatac gaaggagaag aggcgaacat gacattggca 540 agaaaggagg caaatatact acacgagaag atctctgaca aggcttacaa tgatgaggag 600 ctcatccgaa ttatttctac taggagtaaa gcacagctga atgcaacatt caaccactac 660 cttgaccaac atggcagtga aatcaacaag gatctggaaa ctgattctga tgatgagtac 720 ctgaaattac tcagcgcagc aatagaatgc ttgaaaaccc cagagaaaca ctttgagaaa 780 gttcttcgat tggctatcaa gggtacaggc acagacgaat gggaccttac tagagttgtc 840 actactcggg ctgaagttga catggaacgt atcaaagaag agtaccataa gaggaacagt 900 gttccattgg accgtgcaat tgctggagac acttcaggag actatgaaag gatgcttctg 960 gctttgattg ggcatggaga tgcttgaatg gaatatgtgt tctaagattg gataagaaac 1020 tatttcctaa tgtctgaagt ttgaatttgt ttgatgatgt gtgcatgtat gcccagagtt 1080 tggtttgcat tatatggatt taaataatcc aggtgttgtg ttttgttttt ttcttcactt 1140 gtcatagttt ggttctatat attcggactt cctcaaccag tgatcttatt gtttatc 1197 <210> 107 <211> 316 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 107 Met Ala Ser Leu Lys Val Pro Thr Ser Val Pro Glu Pro Tyr Glu Asp 1 5 10 15 Ala Glu Gln Leu Lys Lys Ala Phe Ala Gly Trp Gly Thr Asn Glu Ala 20 25 30 Leu Ile Ile Gln Ile Leu Ala His Arg Asn Ala Ala Gln Arg Lys Leu 35 40 45 Ile Arg Glu Thr Tyr Ala Ala Ala Tyr Gly Glu Asp Leu Leu Lys Asp 50 55 60 Leu Asp Ala Glu Leu Thr Ser Asp Phe Gln Arg Ala Val Leu Leu Trp 65 70 75 80 Thr Leu Ser Pro Ala Glu Arg Asp Ala Tyr Leu Val Asn Glu Ala Thr 85 90 95 Lys Arg Leu Thr Ser Ser Asn Trp Val Ile Leu Glu Ile Ala Cys Thr 100 105 110 Arg Ser Ser Asp Asp Leu Phe Lys Ala Arg Gln Ala Tyr His Ala Arg 115 120 125 Tyr Lys Lys Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala Tyr His Thr Thr Gly Asp 130 135 140 Phe Arg Lys Leu Leu Val Pro Leu Leu Thr Ala Phe Arg Tyr Glu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Ala Asn Met Thr Leu Ala Arg Lys Glu Ala Asn Ile Leu His 165 170 175 Glu Lys Ile Ser Asp Lys Ala Tyr Asn Asp Glu Glu Leu Ile Arg Ile 180 185 190 Ile Ser Thr Arg Ser Lys Ala Gln Leu Asn Ala Thr Phe Asn His Tyr 195 200 205 Leu Asp Gln His Gly Ser Glu Ile Asn Lys Asp Leu Glu Thr Asp Ser 210 215 220 Asp Asp Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Ser Ala Ala Ile Glu Cys Leu Lys 225 230 235 240 Thr Pro Glu Lys His Phe Glu Lys Val Leu Arg Leu Ala Ile Lys Gly 245 250 255 Thr Gly Thr Asp Glu Trp Asp Leu Thr Arg Val Val Thr Thr Arg Ala 260 265 270 Glu Val Asp Met Glu Arg Ile Lys Glu Glu Tyr His Lys Arg Asn Ser 275 280 285 Val Pro Leu Asp Arg Ala Ile Ala Gly Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Glu 290 295 300 Arg Met Leu Leu Ala Leu Ile Gly His Gly Asp Ala 305 310 315 <210> 108 <211> 1086 <212> DNA <213> Gossypium hirsutum <400> 108 gggcaggttc ttcacaaaaa agaaaagaaa aattacagtg aaaatggcaa cccttaaagt 60 tccagctcat gtacctgccc cttctgagga tgctgagcaa cttcgtaaag cttttgaagg 120 atggggtaca aatgagcaat tgattatcga cattttggct cacaggaatg cagctcagcg 180 caatttgatt cgtaaaactt atcgtgaagc ttatggggaa gatctcctta agtctttgga 240 tgaggaactt tcaagtgact ttgagcgagc tgtggtgctg tttactttgg accctgcaga 300 gcgtgatgca tttctggctc atgaagctac aaagaggttc acatcaagcc attgggttct 360 catggaaatt gcttgcacta ggtcttcaca tgaactgttc aatgtgagga aggcgtatca 420 cgatctttac aagaaatccc ttgaagaaga tgttgcgcac cataccaagg gagactaccg 480 caagcttttg gtcccacttg ttagtgcatt ccgataccag ggagaggagg tgaacatgac 540 actggcaagg tcggaggcaa agatacttcg tgagaagata tcagacaagc agtacagtga 600 tgaggaggtc atcaggattg taacaacacg gagtaaggca cagttaaatg ctactctgaa 660 tcattacaat actgcatttg ggaatgctat caacaaggat ttgaaggccg accctgaaga 720 cgaattcctc aaattgctga gagctgcaat caagtgcttg actgtccctg agaaatattt 780 tgagaaggtg ctacgtcaag caatcaataa gctgggaaca gatgaatggg ctcttactag 840 agtggtcgcc actcgggcgg aggtagacat ggtgcgtatt aaggaggaat atcagcgaag 900 aaacagtgtg accctggaaa aagcgattgc tggagatacc tctggagact atgagaaaat 960 gctgcttgcg ttgattggag ctggagacgt ctgagctgct ttcctatatt gagttgttgg 1020 tatgaaaatt tagtttgcaa tttgaggtgt gagttatgtt tgtttggttg agggtgtgcc 1080 aatcgc 1086 <210> 109 <211> 316 <212> PRT <213> Gossypium hirsutum <400> 109 Met Ala Thr Leu Lys Val Pro Ala His Val Pro Ala Pro Ser Glu Asp 1 5 10 15 Ala Glu Gln Leu Arg Lys Ala Phe Glu Gly Trp Gly Thr Asn Glu Gln 20 25 30 Leu Ile Ile Asp Ile Leu Ala His Arg Asn Ala Ala Gln Arg Asn Leu 35 40 45 Ile Arg Lys Thr Tyr Arg Glu Ala Tyr Gly Glu Asp Leu Leu Lys Ser 50 55 60 Leu Asp Glu Glu Leu Ser Ser Asp Phe Glu Arg Ala Val Val Leu Phe 65 70 75 80 Thr Leu Asp Pro Ala Glu Arg Asp Ala Phe Leu Ala His Glu Ala Thr 85 90 95 Lys Arg Phe Thr Ser Ser His Trp Val Leu Met Glu Ile Ala Cys Thr 100 105 110 Arg Ser Ser His Glu Leu Phe Asn Val Arg Lys Ala Tyr His Asp Leu 115 120 125 Tyr Lys Lys Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala His His Thr Lys Gly Asp 130 135 140 Tyr Arg Lys Leu Leu Val Pro Leu Val Ser Ala Phe Arg Tyr Gln Gly 145 150 155 160 Glu Glu Val Asn Met Thr Leu Ala Arg Ser Glu Ala Lys Ile Leu Arg 165 170 175 Glu Lys Ile Ser Asp Lys Gln Tyr Ser Asp Glu Glu Val Ile Arg Ile 180 185 190 Val Thr Thr Arg Ser Lys Ala Gln Leu Asn Ala Thr Leu Asn His Tyr 195 200 205 Asn Thr Ala Phe Gly Asn Ala Ile Asn Lys Asp Leu Lys Ala Asp Pro 210 215 220 Glu Asp Glu Phe Leu Lys Leu Leu Arg Ala Ala Ile Lys Cys Leu Thr 225 230 235 240 Val Pro Glu Lys Tyr Phe Glu Lys Val Leu Arg Gln Ala Ile Asn Lys 245 250 255 Leu Gly Thr Asp Glu Trp Ala Leu Thr Arg Val Val Ala Thr Arg Ala 260 265 270 Glu Val Asp Met Val Arg Ile Lys Glu Glu Tyr Gln Arg Arg Asn Ser 275 280 285 Val Thr Leu Glu Lys Ala Ile Ala Gly Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Glu 290 295 300 Lys Met Leu Leu Ala Leu Ile Gly Ala Gly Asp Val 305 310 315 <210> 110 <211> 1196 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 110 gcatttacga gttttgacaa tcatatcttc cacagacaga aaaaaaatgg ctagtcttac 60 tgttccggca gaagttcctt cagttgctga agactgtgaa caactccgat ctgccttcaa 120 aggatgggga acaaatgaga agttgatcat atcaattttg gctcatagaa atgctgctca 180 acgcaagttg attcaacaga cttatgctga gacttttggt gaagatctcc ttaaagagtt 240 ggacagagaa cttaccaatg attttgagaa attggtggta gtgtggacat tggatccttc 300 agaacgcgat gcctatttgg ctaaggaagc tactaagaga tggacaaaaa gcaattttgt 360 tcttgtggag attgcttgta ccagatctcc taaagaattg gttttggcaa gggaagctta 420 tcatgctcgt ttcaagaaat ctcttgaaga ggacgttgct tatcacacta ctggggaaca 480 cccccagctt ttggtacctc ttgtgagctc ctaccgatat ggaggggacg aggtggactt 540 gcgccttgct aaagcagaag ctaaaatact gcacgagaag atctccgata aggcttacag 600 tgacgatgag gtcatcagaa ttctagccac aaggagcaaa gcacagatca atgctactct 660 gaaccattac aaagatgaat atgaagaaga tatcctgaag caattggaag agggggatga 720 gtttgttgga ctattgaggg caaccataaa aggtcttgtc taccccgagc actacttcgt 780 ggaggttctt cgagatgcaa ttaacaggag aggaacagat gaagatcatc tgaccagagt 840 tatcgctaca agggctgagg ttgatatgaa gattatcgct gatgagtacc agaagaggga 900 tagcatccct ctgggtcggg ccatcgccaa agatacaaga ggagattatg agagtatgtt 960 gttggctctg cttggacaag aggaggacta agaaggtttt gcttctgttt cataatgacc 1020 agaataaaca tgctatcccc tatatttgag agttggcatc cgttgtatgc ttgatgatta 1080 agcgtggtct gtttaacgtg agcttttagt ccttttcttc ttgtgataaa ctttgaatgt 1140 acaactttat gctatctaag aatgtttttc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1196 <210> 111 <211> 314 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 111 Met Ala Ser Leu Thr Val Pro Ala Glu Val Pro Ser Val Ala Glu Asp 1 5 10 15 Cys Glu Gln Leu Arg Ser Ala Phe Lys Gly Trp Gly Thr Asn Glu Lys 20 25 30 Leu Ile Ile Ser Ile Leu Ala His Arg Asn Ala Ala Gln Arg Lys Leu 35 40 45 Ile Gln Gln Thr Tyr Ala Glu Thr Phe Gly Glu Asp Leu Leu Lys Glu 50 55 60 Leu Asp Arg Glu Leu Thr Asn Asp Phe Glu Lys Leu Val Val Val Trp 65 70 75 80 Thr Leu Asp Pro Ser Glu Arg Asp Ala Tyr Leu Ala Lys Glu Ala Thr 85 90 95 Lys Arg Trp Thr Lys Ser Asn Phe Val Leu Val Glu Ile Ala Cys Thr 100 105 110 Arg Ser Pro Lys Glu Leu Val Leu Ala Arg Glu Ala Tyr His Ala Arg 115 120 125 Phe Lys Lys Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala Tyr His Thr Thr Gly Glu 130 135 140 His Pro Gln Leu Leu Val Pro Leu Val Ser Ser Tyr Arg Tyr Gly Gly 145 150 155 160 Asp Glu Val Asp Leu Arg Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys Ile Leu His 165 170 175 Glu Lys Ile Ser Asp Lys Ala Tyr Ser Asp Asp Glu Val Ile Arg Ile 180 185 190 Leu Ala Thr Arg Ser Lys Ala Gln Ile Asn Ala Thr Leu Asn His Tyr 195 200 205 Lys Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Ile Leu Lys Gln Leu Glu Glu Gly Asp 210 215 220 Glu Phe Val Gly Leu Leu Arg Ala Thr Ile Lys Gly Leu Val Tyr Pro 225 230 235 240 Glu His Tyr Phe Val Glu Val Leu Arg Asp Ala Ile Asn Arg Arg Gly 245 250 255 Thr Asp Glu Asp His Leu Thr Arg Val Ile Ala Thr Arg Ala Glu Val 260 265 270 Asp Met Lys Ile Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Lys Arg Asp Ser Ile Pro 275 280 285 Leu Gly Arg Ala Ile Ala Lys Asp Thr Arg Gly Asp Tyr Glu Ser Met 290 295 300 Leu Leu Ala Leu Leu Gly Gln Glu Glu Asp 305 310 <210> 112 <211> 945 <212> DNA <213> Solanum tuberosum <400> 112 atggcaagtc ttacagttcc ggcagaagtt ccttccgtag ctgaagactg tgaacaactc 60 cgatctgcct tcaaaggatg gggaacgaac gagaagttga ttatatcaat tttggctcat 120 agaaatgctg ctcagcgcaa attgattcga cagacttatg ctgaaacttt tggggaagat 180 ctacttaaag agttggacag agaacttacc catgattttg agaaattggt gctaatatgg 240 acactggatc cgtcagaacg tgatgcctat ttggctaagg aagctactaa gagatggaca 300 aaaagcaact ttgttcttgt ggagatagct tgtactagat ctcctaaaga actggttttg 360 gcaagggaag cttatcatgc tcgtaacaag aaatctcttg aagaggacgt tgcttatcac 420 actactgggg atcaccgcaa gcttttggta cctcttgtga gctcctaccg atatggagga 480 gacgaggtgg acttgcgcct tgctaaagca gaatctaaag tactgcatga gaagatctcc 540 gataaggctt acagtgacga tgaggtcatt agaattttag ccacaaggag caaagcgcaa 600 ctcaatgcta ctttgaatca ttacaaagat gaatatggtg aggatatcct aaagcaattg 660 gaagatgagg atgagtttgt tgcactattg agggccacca taaaaggtct tgtctaccct 720 gagcactatt tcgtggaggt tcttcgtgat gcaattaaca ggagaggaac agaggaagat 780 catctgagcc gagttatcgc tacaagggct gaggtggatc tgaagactat cgctaacgag 840 taccagaaga gggatagcat tcctctgggt cgcgccattg ccaaagatac aggaggagat 900 tatgagaata tgctggtggc tttacttgga caagaggagg aatga 945 <210> 113 <211> 314 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 113 Met Ala Ser Leu Thr Val Pro Ala Glu Val Pro Ser Val Ala Glu Asp 1 5 10 15 Cys Glu Gln Leu Arg Ser Ala Phe Lys Gly Trp Gly Thr Asn Glu Lys 20 25 30 Leu Ile Ile Ser Ile Leu Ala His Arg Asn Ala Ala Gln Arg Lys Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Thr Tyr Ala Glu Thr Phe Gly Glu Asp Leu Leu Lys Glu 50 55 60 Leu Asp Arg Glu Leu Thr His Asp Phe Glu Lys Leu Val Leu Ile Trp 65 70 75 80 Thr Leu Asp Pro Ser Glu Arg Asp Ala Tyr Leu Ala Lys Glu Ala Thr 85 90 95 Lys Arg Trp Thr Lys Ser Asn Phe Val Leu Val Glu Ile Ala Cys Thr 100 105 110 Arg Ser Pro Lys Glu Leu Val Leu Ala Arg Glu Ala Tyr His Ala Arg 115 120 125 Asn Lys Lys Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala Tyr His Thr Thr Gly Asp 130 135 140 His Arg Lys Leu Leu Val Pro Leu Val Ser Ser Tyr Arg Tyr Gly Gly 145 150 155 160 Asp Glu Val Asp Leu Arg Leu Ala Lys Ala Glu Ser Lys Val Leu His 165 170 175 Glu Lys Ile Ser Asp Lys Ala Tyr Ser Asp Asp Glu Val Ile Arg Ile 180 185 190 Leu Ala Thr Arg Ser Lys Ala Gln Leu Asn Ala Thr Leu Asn His Tyr 195 200 205 Lys Asp Glu Tyr Gly Glu Asp Ile Leu Lys Gln Leu Glu Asp Glu Asp 210 215 220 Glu Phe Val Ala Leu Leu Arg Ala Thr Ile Lys Gly Leu Val Tyr Pro 225 230 235 240 Glu His Tyr Phe Val Glu Val Leu Arg Asp Ala Ile Asn Arg Arg Gly 245 250 255 Thr Glu Glu Asp His Leu Ser Arg Val Ile Ala Thr Arg Ala Glu Val 260 265 270 Asp Leu Lys Thr Ile Ala Asn Glu Tyr Gln Lys Arg Asp Ser Ile Pro 275 280 285 Leu Gly Arg Ala Ile Ala Lys Asp Thr Gly Gly Asp Tyr Glu Asn Met 290 295 300 Leu Val Ala Leu Leu Gly Gln Glu Glu Glu 305 310 <210> 114 <211> 1160 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 114 atggcaagtc ttacagttcc ggcagaagtt ccttcagtcg ctgaagactg tgaacaactc 60 cgatctgcct tcaaaggatg gggaacgaat gagaagttga ttatatcaat tttggctcat 120 agaaatgcgg ctcaacgcaa attgattcga cagacttatg ctgagacttt tggggaagat 180 ctgcttaaag agttggacag agaacttact catgattttg agaaattggt ggtagtatgg 240 acactggatc ctgcagaacg tgatgcctat ttggctaagg aagctactaa gagatggaca 300 aaaagcaact ttgttcttgt ggagatagct tgtaccagat ctcctaaaga actggttttg 360 gcaagagaag cttatcatgc tcgtaacaag aaatctctcg aagaggacgt tgcttatcac 420 actactgggg atcaccgcaa gcttttggta cctcttgtga gctcctaccg atatggggga 480 gatgaggtgg acttgcgact tgctaaagca gaatctaaag tgctgcatga gaagatctcc 540 gataaggctt acagtgacga tgaggtcatt agaattttag ccacaaggag caaagcgcaa 600 ctcaatgcta ctttgaatca ttacaaagat gaatatggtg aggatatcct aaagcaatta 660 gaagatgagg atgagtttgt tgcactgtta agggccacca taaaaggtct tgtctacccc 720 gagcactatt tcgtggaggt tcttcgtgat gcaattaaca ggagaggaac agaggaagat 780 catctaaccc gagttatcgc tacaagggct gaggtcgatc tgaagactat cgctaacgag 840 taccagaaga gggatagcgt tcctctgggt cgcgccattg ccaaagatac aggaggagat 900 tatgagaata tgctggtggc tttacttgga caagaggagg aataagaagc ggattggctc 960 acttctgttt ataatgacca gataatatgc cattctccat atatttcaga gttggcatgt 1020 gtttgatgat tgagagtggt ctgttcacat gagctttagt ccttttcttc ttgtgagaaa 1080 ctttgaatat gaatctttgt gctgtctaaa aatgttctct aatgatttgc atccactaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1160 <210> 115 <211> 314 <212> PRT <213> Lycopersicon esculentum <400> 115 Met Ala Ser Leu Thr Val Pro Ala Glu Val Pro Ser Val Ala Glu Asp 1 5 10 15 Cys Glu Gln Leu Arg Ser Ala Phe Lys Gly Trp Gly Thr Asn Glu Lys 20 25 30 Leu Ile Ile Ser Ile Leu Ala His Arg Asn Ala Ala Gln Arg Lys Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Thr Tyr Ala Glu Thr Phe Gly Glu Asp Leu Leu Lys Glu 50 55 60 Leu Asp Arg Glu Leu Thr His Asp Phe Glu Lys Leu Val Val Val Trp 65 70 75 80 Thr Leu Asp Pro Ala Glu Arg Asp Ala Tyr Leu Ala Lys Glu Ala Thr 85 90 95 Lys Arg Trp Thr Lys Ser Asn Phe Val Leu Val Glu Ile Ala Cys Thr 100 105 110 Arg Ser Pro Lys Glu Leu Val Leu Ala Arg Glu Ala Tyr His Ala Arg 115 120 125 Asn Lys Lys Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala Tyr His Thr Thr Gly Asp 130 135 140 His Arg Lys Leu Leu Val Pro Leu Val Ser Ser Tyr Arg Tyr Gly Gly 145 150 155 160 Asp Glu Val Asp Leu Arg Leu Ala Lys Ala Glu Ser Lys Val Leu His 165 170 175 Glu Lys Ile Ser Asp Lys Ala Tyr Ser Asp Asp Glu Val Ile Arg Ile 180 185 190 Leu Ala Thr Arg Ser Lys Ala Gln Leu Asn Ala Thr Leu Asn His Tyr 195 200 205 Lys Asp Glu Tyr Gly Glu Asp Ile Leu Lys Gln Leu Glu Asp Glu Asp 210 215 220 Glu Phe Val Ala Leu Leu Arg Ala Thr Ile Lys Gly Leu Val Tyr Pro 225 230 235 240 Glu His Tyr Phe Val Glu Val Leu Arg Asp Ala Ile Asn Arg Arg Gly 245 250 255 Thr Glu Glu Asp His Leu Thr Arg Val Ile Ala Thr Arg Ala Glu Val 260 265 270 Asp Leu Lys Thr Ile Ala Asn Glu Tyr Gln Lys Arg Asp Ser Val Pro 275 280 285 Leu Gly Arg Ala Ile Ala Lys Asp Thr Gly Gly Asp Tyr Glu Asn Met 290 295 300 Leu Val Ala Leu Leu Gly Gln Glu Glu Glu 305 310 <210> 116 <211> 1242 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 116 atgtctagtc ttaaagttcc agcatcagtt ccagatcctt atgaagatgc tgagcaactc 60 aaaaaagctt ttaaaggatg gggcacaaat gaggaactta ttattcagat tctggctcat 120 aggaatgcca gacaacgcaa gttaatccga gattcttatg ctgctgctta tggagaggat 180 cttctcaagg acttggattc tgaactgaca agtgattttc agcgtgtggt gcttctctgg 240 actttgagtc ctgctgagcg cgacgcctac ttggttaatg aggctaccaa acgtctgact 300 gctagcaatt ggggtatcat ggaaattgct tgtaccaggt cttctgatga tctttttaag 360 gcgaggcagg cctaccatgc tccatacaag aaatcacttg aagaagatgt tgcttatcat 420 acagtggggg atttccgtaa gcttttggtt cctcttataa ctgcattcag atatgaagga 480 gatgaggtga acatgacatt agcaagaaag ggaagcaaat atctgcatga gaagatctct 540 gacaaggctt accatgacga ggagatcatc cgaatcattt ctactaggag taaagcacag 600 ctgagtgcta cgttcaacca ctaccatgat caccatggcc atgaaatcat caaggatctg 660 gaagctgatg atgacgatga gtacctgaaa ctactcagag cagcaataga atgcttgaaa 720 cccagagaac actttgagaa agttcttcga ttggctatca agaagctggg tacagacgaa 780 tgggatctta ctagagttgt tgccactcgg gctgaagttg acatggagcg tatcaaagaa 840 gagtaccata ggaggaacag tgttacattg gaccgtgcaa ttgctggaga cacttcagga 900 gactatgaaa aaatgcttct ggctctgatt gggcacggag atgcttgaat tacatgtgct 960 gaaaccttaa gataataaaa aactctactt attttctgaa ctttcatttg cttttatgat 1020 ctatggtgtg tactctcaga gtttggttct gtgtttatat gaactaaaaa cactcgggag 1080 ttgagttgtg ttttgttttc gccttcactt ttcatttcgg acttctactg gttttgcctg 1140 ctaaataagc atagcttcaa ctttggcttg aacggatctt gtttctttat aactcagaaa 1200 tagattatgt atcttggttc gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1242 <210> 117 <211> 315 <212> PRT <213> Lycopersicon esculentum <400> 117 Met Ser Ser Leu Lys Val Pro Ala Ser Val Pro Asp Pro Tyr Glu Asp 1 5 10 15 Ala Glu Gln Leu Lys Lys Ala Phe Lys Gly Trp Gly Thr Asn Glu Glu 20 25 30 Leu Ile Ile Gln Ile Leu Ala His Arg Asn Ala Arg Gln Arg Lys Leu 35 40 45 Ile Arg Asp Ser Tyr Ala Ala Ala Tyr Gly Glu Asp Leu Leu Lys Asp 50 55 60 Leu Asp Ser Glu Leu Thr Ser Asp Phe Gln Arg Val Val Leu Leu Trp 65 70 75 80 Thr Leu Ser Pro Ala Glu Arg Asp Ala Tyr Leu Val Asn Glu Ala Thr 85 90 95 Lys Arg Leu Thr Ala Ser Asn Trp Gly Ile Met Glu Ile Ala Cys Thr 100 105 110 Arg Ser Ser Asp Asp Leu Phe Lys Ala Arg Gln Ala Tyr His Ala Pro 115 120 125 Tyr Lys Lys Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala Tyr His Thr Val Gly Asp 130 135 140 Phe Arg Lys Leu Leu Val Pro Leu Ile Thr Ala Phe Arg Tyr Glu Gly 145 150 155 160 Asp Glu Val Asn Met Thr Leu Ala Arg Lys Gly Ser Lys Tyr Leu His 165 170 175 Glu Lys Ile Ser Asp Lys Ala Tyr His Asp Glu Glu Ile Ile Arg Ile 180 185 190 Ile Ser Thr Arg Ser Lys Ala Gln Leu Ser Ala Thr Phe Asn His Tyr 195 200 205 His Asp His His Gly His Glu Ile Ile Lys Asp Leu Glu Ala Asp Asp 210 215 220 Asp Asp Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Arg Ala Ala Ile Glu Cys Leu Lys 225 230 235 240 Pro Arg Glu His Phe Glu Lys Val Leu Arg Leu Ala Ile Lys Lys Leu 245 250 255 Gly Thr Asp Glu Trp Asp Leu Thr Arg Val Val Ala Thr Arg Ala Glu 260 265 270 Val Asp Met Glu Arg Ile Lys Glu Glu Tyr His Arg Arg Asn Ser Val 275 280 285 Thr Leu Asp Arg Ala Ile Ala Gly Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Glu Lys 290 295 300 Met Leu Leu Ala Leu Ile Gly His Gly Asp Ala 305 310 315 <210> 118 <211> 1226 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 118 ttacttaagt aggacgacgt gcgtctgctt cgtctcatta caaagcagaa gaaacacaaa 60 cagaggcaga gatcttaaga gttaaagact aatcccaaca atggcgtctc tcaaagtccc 120 aagcaatgtt cctcttcccg aagatgacgc cgagcaactc cacaaggctt tttcaggatg 180 gggtaccaac gagaagctga tcatatcaat actagctcac aggaacgcag cacaacgcag 240 cttgatccgc agcgtttatg cagctaccta caatgaggat cttctcaaag cattagacaa 300 agagctttct agcgactttg agagagctgt gatgttgtgg actcttgatc caccagagag 360 agatgcttat ttggctaaag aatccaccaa gatgttcacc aagaacaatt gggttcttgt 420 tgaaatcgct tgcacaaggc ctgctcttga gcttatcaag gtcaagcaag cttaccaagc 480 tcgatacaag aaatcaatcg aggaagatgt cgcgcaacac acatctggtg accttcgtaa 540 gctcttgctt cctcttgtga gcactttcag gtatgaagga gatgatgtga acatgatgct 600 tgcaagatct gaagctaaga tacttcacga gaaggtctca gagaaatctt acagtgacga 660 tgacttcatc agaatcttga caacaagaag caaagcacag ctcggtgcaa cactcaacca 720 ctacaacaac gagtatggaa acgccattaa caagaacttg aaggaagagt cggacgacaa 780 tgactacatg aaactactaa gagctgtaat cacatgtttg acataccctg agaagcattt 840 tgagaaggtt cttcgtctat caatcaacaa aatgggaaca gacgaatggg gactaacccg 900 agtcgtgact acacgaactg aagttgacat ggaacgcatc aaagaggaat atcagcgaag 960 aaacagcatt cctttggacc gtgctatcgc caaagacact tctggtgact atgaggacat 1020 gcttgttgct cttctcggac atggcgatgc ttgaaactgt ttcaactttc gagttcctcc 1080 tttctcttac tgcatggttt gttttaaata aaagagttgt gaaactggtt ctgcaactat 1140 ttatcaatga tcgtttgagt ttgttaaatt tgaatcaaaa tctgtttttc tttcttttaa 1200 atacaatcta aagcacaaac taaagc 1226 <210> 119 <211> 317 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 119 Met Ala Ser Leu Lys Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Pro Glu Asp Asp 1 5 10 15 Ala Glu Gln Leu His Lys Ala Phe Ser Gly Trp Gly Thr Asn Glu Lys 20 25 30 Leu Ile Ile Ser Ile Leu Ala His Arg Asn Ala Ala Gln Arg Ser Leu 35 40 45 Ile Arg Ser Val Tyr Ala Ala Thr Tyr Asn Glu Asp Leu Leu Lys Ala 50 55 60 Leu Asp Lys Glu Leu Ser Ser Asp Phe Glu Arg Ala Val Met Leu Trp 65 70 75 80 Thr Leu Asp Pro Pro Glu Arg Asp Ala Tyr Leu Ala Lys Glu Ser Thr 85 90 95 Lys Met Phe Thr Lys Asn Asn Trp Val Leu Val Glu Ile Ala Cys Thr 100 105 110 Arg Pro Ala Leu Glu Leu Ile Lys Val Lys Gln Ala Tyr Gln Ala Arg 115 120 125 Tyr Lys Lys Ser Ile Glu Glu Asp Val Ala Gln His Thr Ser Gly Asp 130 135 140 Leu Arg Lys Leu Leu Leu Pro Leu Val Ser Thr Phe Arg Tyr Glu Gly 145 150 155 160 Asp Asp Val Asn Met Met Leu Ala Arg Ser Glu Ala Lys Ile Leu His 165 170 175 Glu Lys Val Ser Glu Lys Ser Tyr Ser Asp Asp Asp Phe Ile Arg Ile 180 185 190 Leu Thr Thr Arg Ser Lys Ala Gln Leu Gly Ala Thr Leu Asn His Tyr 195 200 205 Asn Asn Glu Tyr Gly Asn Ala Ile Asn Lys Asn Leu Lys Glu Glu Ser 210 215 220 Asp Asp Asn Asp Tyr Met Lys Leu Leu Arg Ala Val Ile Thr Cys Leu 225 230 235 240 Thr Tyr Pro Glu Lys His Phe Glu Lys Val Leu Arg Leu Ser Ile Asn 245 250 255 Lys Met Gly Thr Asp Glu Trp Gly Leu Thr Arg Val Val Thr Thr Arg 260 265 270 Thr Glu Val Asp Met Glu Arg Ile Lys Glu Glu Tyr Gln Arg Arg Asn 275 280 285 Ser Ile Pro Leu Asp Arg Ala Ile Ala Lys Asp Thr Ser Gly Asp Tyr 290 295 300 Glu Asp Met Leu Val Ala Leu Leu Gly His Gly Asp Ala 305 310 315 <210> 120 <211> 1172 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 120 ctgcttgcat tttcgagtct tgacaatcat aaaaatggct agtcttactg ttccggcaga 60 agttccttca gtagctgaag actgtgaaca actccgatct gccttcaaag ggtggggaac 120 aaacgagaag ttgatcatat caattttggc tcatagaaat gctgctcaac gcaagttgat 180 tcaacagact tatgctgaga cttttggtga agatctcctt aaagagttgg acagagaact 240 taccaatgat tttgagaaat tggtggtagt gtggacattg gatccttcag aacgcgatgc 300 ctatttggct aaggaagcta ctaagagatg gacaaaaagc aattttgttc ttgtggaaat 360 agcttgtacc agatctccta aagaattggt tttggcacgg gaagcttatc atgctcgtta 420 caagaaatct cttgaagagg acgttgctta tcacactact ggggaacacc gcaagctttt 480 ggtagctctt gtgagctcct atcgatatgg aggagacgag gtggacttgc gtcttgctaa 540 agctgaagct aaaatactgc atgagaagat ctccgataag gcttacagtg acaatgaggt 600 catcagaatt ctagccacaa ggagtaaagc acagatcaat gctactctga atcattacaa 660 agatgaatat gaagaggata tcctaaagca attggaagag ggggatgagt ttgttggact 720 attgagggca accataaaag gtcttgtcta caccgagcac tacttcgtgg aggttcttcg 780 agatgcaatt aacaggagag gaacagagga agatcatctg accagagtta tcgctacaag 840 ggctgaggtt gatatgaaga ctatcgctga tgagtaccag aagagggata gcatccatct 900 gggtcgcgcc attgccaaag atacaagagg agattatgag agtatgttgt tggctctgct 960 tggacaagag gaggactaag aaggatttgc tttataatga ccggaataaa tatgatatcc 1020 cctatatttg agagttggca tccgctgtat gtttgatgat tgagcgtggt ctgtttaacg 1080 tgagcgttga gtccttttct tctcactttg aatatgcaac tttatgctat ctaagaatat 1140 ttttttataa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1172 <210> 121 <211> 314 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 121 Met Ala Ser Leu Thr Val Pro Ala Glu Val Pro Ser Val Ala Glu Asp 1 5 10 15 Cys Glu Gln Leu Arg Ser Ala Phe Lys Gly Trp Gly Thr Asn Glu Lys 20 25 30 Leu Ile Ile Ser Ile Leu Ala His Arg Asn Ala Ala Gln Arg Lys Leu 35 40 45 Ile Gln Gln Thr Tyr Ala Glu Thr Phe Gly Glu Asp Leu Leu Lys Glu 50 55 60 Leu Asp Arg Glu Leu Thr Asn Asp Phe Glu Lys Leu Val Val Val Trp 65 70 75 80 Thr Leu Asp Pro Ser Glu Arg Asp Ala Tyr Leu Ala Lys Glu Ala Thr 85 90 95 Lys Arg Trp Thr Lys Ser Asn Phe Val Leu Val Glu Ile Ala Cys Thr 100 105 110 Arg Ser Pro Lys Glu Leu Val Leu Ala Arg Glu Ala Tyr His Ala Arg 115 120 125 Tyr Lys Lys Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala Tyr His Thr Thr Gly Glu 130 135 140 His Arg Lys Leu Leu Val Ala Leu Val Ser Ser Tyr Arg Tyr Gly Gly 145 150 155 160 Asp Glu Val Asp Leu Arg Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys Ile Leu His 165 170 175 Glu Lys Ile Ser Asp Lys Ala Tyr Ser Asp Asn Glu Val Ile Arg Ile 180 185 190 Leu Ala Thr Arg Ser Lys Ala Gln Ile Asn Ala Thr Leu Asn His Tyr 195 200 205 Lys Asp Glu Tyr Glu Glu Asp Ile Leu Lys Gln Leu Glu Glu Gly Asp 210 215 220 Glu Phe Val Gly Leu Leu Arg Ala Thr Ile Lys Gly Leu Val Tyr Thr 225 230 235 240 Glu His Tyr Phe Val Glu Val Leu Arg Asp Ala Ile Asn Arg Arg Gly 245 250 255 Thr Glu Glu Asp His Leu Thr Arg Val Ile Ala Thr Arg Ala Glu Val 260 265 270 Asp Met Lys Thr Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Lys Arg Asp Ser Ile His 275 280 285 Leu Gly Arg Ala Ile Ala Lys Asp Thr Arg Gly Asp Tyr Glu Ser Met 290 295 300 Leu Leu Ala Leu Leu Gly Gln Glu Glu Asp 305 310 <210> 122 <211> 1215 <212> DNA <213> Solanum tuberosum <400> 122 atcactctgc attttcgagt cttcacaatc atatcctcct aaccacacac agaagaaaaa 60 aaaatggcaa gtcttacagt tccggcagaa gttccttccg tcgctgaaga ctgtgaacaa 120 ctccgatctg ccttcaaagg atggggaacg aacgagaagt tgattatatc aattttggct 180 catagaaatg ctgctcagcg caaattgatt cgacagactt atgctgaaac ttttggggaa 240 gatctactta aagagattgg gacaggaaga aacttaaccc atgattttga gaaattggtg 300 ctaatatgga cactggatcc gtcagaacgt gatgcctatt tggctaagga agctactaag 360 agatggacaa aaagcaactt tgttcttgtg gagatagctt gtactagatc tcctaaagaa 420 ctggttttgg caagggaagc ttatcatgct cgtaacaaga aatctctcga agaggacgtt 480 gcttatcaca ctactgggga tcaccgcaag cttttggtac ctcttgtgag ctcctaccga 540 tatggaggag acgaggtgga cttgcgcctt gctaaagcag aatctaaagt actgcatgag 600 aagatctccg ataaggctta cagtgacgat gaggtcatta gaattttagc cacaaggagc 660 aaagcgcaac tcaatgctac tttgaatcat tacaaagatg aatatggtga ggatatccta 720 aagcaattgg aagatgagga tgagtttgtt gcactattga gggccaccat aaaaggtctt 780 gtctaccctg agcactattt cgtggaggtt cttcgtgatg caattaacag gagaggaaca 840 gaggaagatc atctgagccg agttattgct acaagggctg aggtcgatct gaagactatc 900 gctaacgagt accagaagag ggatagcatt cctctgggtc gcgccattgc caaagataca 960 ggaggagatt atgagaatat gctggtggct ttacttggac aagaggagga atgaggagga 1020 ttggctcact tctgtgttat aatgaccaga ataaatatgc catctcccat atatttcaga 1080 gttggcatct gtttgatgat tgagtgtggt ctgttttcac atgagctttt agtccttttc 1140 ttcgtgtgag aaactttgaa tatgcatctt tgtgctgtct aaaaatattt tctaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaa 1215 <210> 123 <211> 316 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 123 Met Ala Ser Leu Thr Val Pro Ala Glu Val Pro Ser Val Ala Glu Asp 1 5 10 15 Cys Glu Gln Leu Arg Ser Ala Phe Lys Gly Trp Gly Thr Asn Glu Lys 20 25 30 Leu Ile Ile Ser Ile Leu Ala His Arg Asn Ala Ala Gln Arg Lys Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Thr Tyr Ala Glu Thr Phe Gly Glu Asp Leu Leu Lys Glu 50 55 60 Ile Gly Thr Gly Arg Asn Leu Thr His Asp Phe Glu Lys Leu Val Leu 65 70 75 80 Ile Trp Thr Leu Asp Pro Ser Glu Arg Asp Ala Tyr Leu Ala Lys Glu 85 90 95 Ala Thr Lys Arg Trp Thr Lys Ser Asn Phe Val Leu Val Glu Ile Ala 100 105 110 Cys Thr Arg Ser Pro Lys Glu Leu Val Leu Ala Arg Glu Ala Tyr His 115 120 125 Ala Arg Asn Lys Lys Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala Tyr His Thr Thr 130 135 140 Gly Asp His Arg Lys Leu Leu Val Pro Leu Val Ser Ser Tyr Arg Tyr 145 150 155 160 Gly Gly Asp Glu Val Asp Leu Arg Leu Ala Lys Ala Glu Ser Lys Val 165 170 175 Leu His Glu Lys Ile Ser Asp Lys Ala Tyr Ser Asp Asp Glu Val Ile 180 185 190 Arg Ile Leu Ala Thr Arg Ser Lys Ala Gln Leu Asn Ala Thr Leu Asn 195 200 205 His Tyr Lys Asp Glu Tyr Gly Glu Asp Ile Leu Lys Gln Leu Glu Asp 210 215 220 Glu Asp Glu Phe Val Ala Leu Leu Arg Ala Thr Ile Lys Gly Leu Val 225 230 235 240 Tyr Pro Glu His Tyr Phe Val Glu Val Leu Arg Asp Ala Ile Asn Arg 245 250 255 Arg Gly Thr Glu Glu Asp His Leu Ser Arg Val Ile Ala Thr Arg Ala 260 265 270 Glu Val Asp Leu Lys Thr Ile Ala Asn Glu Tyr Gln Lys Arg Asp Ser 275 280 285 Ile Pro Leu Gly Arg Ala Ile Ala Lys Asp Thr Gly Gly Asp Tyr Glu 290 295 300 Asn Met Leu Val Ala Leu Leu Gly Gln Glu Glu Glu 305 310 315 <210> 124 <211> 1176 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 124 catacagaaa tttcacttgt tcgaaaaatg gcttctctca aagttcccgc cactgttcct 60 cttcccgaag aagacgctga gcaactctac aaagccttta aaggatgggg aaccaatgag 120 aggatgatca tatcaatctt ggctcacaga aatgcaacgc aacgtagttt cattcgtgcc 180 gtttatgctg ctaactacaa taaggatctt ctcaaggaat tagacagaga gctttccggt 240 gactttgagc gagctgtgat gttgtggact tttgaaccag cggagagaga tgcttatttg 300 gcaaaagaat ctaccaaaat gttcaccaaa aacaattggg ttcttgtcga aatcgcttgt 360 actagatctg ctcttgaact ctttaatgcc aagcaagcat accaagcccg ctacaagacc 420 tccctcgagg aagacgtcgc ataccacaca tctggagaca ttcgaaagct cttggtacct 480 cttgtgagca cttttaggta cgatggagat gaagtgaaca tgacgttagc taggtccgag 540 gctaagatac ttcacgagaa gatcaaggaa aaggcttatg ctgatgatga tctcataaga 600 atcttgacaa ccaggagcaa agcacaaatc agcgcaactc tcaatcacta caaaaacaat 660 ttcggaactt ccatgagcaa atacctaaag gaggattcgg aaaacgaata cattcaattg 720 ctcaaagccg tgatcaaatg cttgacatat ccagagaagt attttgagaa agttctacgt 780 caagccatca acaaattggg aacagatgag tggggactaa cgagagtggt cactacacga 840 gcagagtttg acatggaacg gatcaaagag gaatatatac gtagaaacag tgttcctctt 900 gatcgagcca ttgctaaaga cactcatggt gactatgagg atatacttct cgctcttctc 960 ggacatgacc atgcttgaaa taacatttgc aagttttgtt taagaaaaaa aactaaattt 1020 tatcgctttg tgtttaataa aacagttgtg gttggacttg caacttggtc atgttaagaa 1080 tttagtgtct tcagtttcat ttgtcgtcga tgttttcagt tatttttttt tttaaatcta 1140 aaaattataa aaccatatca aaaattatta ttgatc 1176 <210> 125 <211> 316 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 125 Met Ala Ser Leu Lys Val Pro Ala Thr Val Pro Leu Pro Glu Glu Asp 1 5 10 15 Ala Glu Gln Leu Tyr Lys Ala Phe Lys Gly Trp Gly Thr Asn Glu Arg 20 25 30 Met Ile Ile Ser Ile Leu Ala His Arg Asn Ala Thr Gln Arg Ser Phe 35 40 45 Ile Arg Ala Val Tyr Ala Ala Asn Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Lys Glu 50 55 60 Leu Asp Arg Glu Leu Ser Gly Asp Phe Glu Arg Ala Val Met Leu Trp 65 70 75 80 Thr Phe Glu Pro Ala Glu Arg Asp Ala Tyr Leu Ala Lys Glu Ser Thr 85 90 95 Lys Met Phe Thr Lys Asn Asn Trp Val Leu Val Glu Ile Ala Cys Thr 100 105 110 Arg Ser Ala Leu Glu Leu Phe Asn Ala Lys Gln Ala Tyr Gln Ala Arg 115 120 125 Tyr Lys Thr Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala Tyr His Thr Ser Gly Asp 130 135 140 Ile Arg Lys Leu Leu Val Pro Leu Val Ser Thr Phe Arg Tyr Asp Gly 145 150 155 160 Asp Glu Val Asn Met Thr Leu Ala Arg Ser Glu Ala Lys Ile Leu His 165 170 175 Glu Lys Ile Lys Glu Lys Ala Tyr Ala Asp Asp Asp Leu Ile Arg Ile 180 185 190 Leu Thr Thr Arg Ser Lys Ala Gln Ile Ser Ala Thr Leu Asn His Tyr 195 200 205 Lys Asn Asn Phe Gly Thr Ser Met Ser Lys Tyr Leu Lys Glu Asp Ser 210 215 220 Glu Asn Glu Tyr Ile Gln Leu Leu Lys Ala Val Ile Lys Cys Leu Thr 225 230 235 240 Tyr Pro Glu Lys Tyr Phe Glu Lys Val Leu Arg Gln Ala Ile Asn Lys 245 250 255 Leu Gly Thr Asp Glu Trp Gly Leu Thr Arg Val Val Thr Thr Arg Ala 260 265 270 Glu Phe Asp Met Glu Arg Ile Lys Glu Glu Tyr Ile Arg Arg Asn Ser 275 280 285 Val Pro Leu Asp Arg Ala Ile Ala Lys Asp Thr His Gly Asp Tyr Glu 290 295 300 Asp Ile Leu Leu Ala Leu Leu Gly His Asp His Ala 305 310 315 <210> 126 <211> 1182 <212> DNA <213> Medicago sativa <400> 126 ctctcacgtt ccgtctccat cagaagacag tgaacaattg cgcggtgctt ttcaaggatg 60 gggaacgaat gaaggcttga taatatcgat cctggctcat agaaatgcag ctcagcgtaa 120 gtcgatccgc gaaacttaca cgcagaccca tggagaagat cttcttaaag atcttgacaa 180 agaactttca agtgattttg agaaagctgt gctgctgtgg acattggatc cggccgagcg 240 tgatgcattt ttagccaatc aagcaactaa aatgttgact tcaaacaatt cgatcatcgt 300 ggaaattgct tccacaagat ctccacttga acttcttaag gcaaagcaag catatcaagt 360 ccgtttcaaa aagtcccttg aagaagatgt tgcctatcat acttctggtg acatccgcaa 420 gcttttggtt cctcttgtgg gcatacaccg ttatgaggga gatgaggtga acatgacatt 480 ggcaaaatct gaagctaaat tgcttcatga gaagattgcg gataaggctt acaatcatga 540 tgacctgatc aggattgtaa caacaaggag taaagcgcaa ttaaatgcaa ctttgaatca 600 ctataacaat gagtttggga atgtaataga caaggatttg gaaactgatt cggatgatga 660 atatctgaaa ttattgaggg cagcaattaa gggcttgacc taccctgaga aatattttga 720 ggaactcctt aggctggcta taaacaagat gggaaccgat gaaaatgctc ttactagagt 780 ggtgacaact agagctgagg ttgatttgca gcgaattgcg gaggaatacc agagaagaaa 840 cagtgttcct ctggaccgtg caattgacaa agacacttct ggagactatc agaaaattct 900 ccttgcactg atgggacatg atgagtaagt tcttaatctg tccagtagtc atggagtggc 960 tgtttggact atctgttttc ccttcatcat cagcgtgatt ttgctgcgga tctcttgata 1020 gtatacagaa ttcggtgact tgctgtggta actatgcttg tgatatgtat gaactattgt 1080 ggttttaaat aatatgtttt gaatatggac tgaaattcaa aacagaactt tgccttctta 1140 aataatgaaa cagctatcat atttctctcc ttaaaaaaaa aa 1182 <210> 127 <211> 308 <212> PRT <213> Medicago sativa <400> 127 Ser His Val Pro Ser Pro Ser Glu Asp Ser Glu Gln Leu Arg Gly Ala 1 5 10 15 Phe Gln Gly Trp Gly Thr Asn Glu Gly Leu Ile Ile Ser Ile Leu Ala 20 25 30 His Arg Asn Ala Ala Gln Arg Lys Ser Ile Arg Glu Thr Tyr Thr Gln 35 40 45 Thr His Gly Glu Asp Leu Leu Lys Asp Leu Asp Lys Glu Leu Ser Ser 50 55 60 Asp Phe Glu Lys Ala Val Leu Leu Trp Thr Leu Asp Pro Ala Glu Arg 65 70 75 80 Asp Ala Phe Leu Ala Asn Gln Ala Thr Lys Met Leu Thr Ser Asn Asn 85 90 95 Ser Ile Ile Val Glu Ile Ala Ser Thr Arg Ser Pro Leu Glu Leu Leu 100 105 110 Lys Ala Lys Gln Ala Tyr Gln Val Arg Phe Lys Lys Ser Leu Glu Glu 115 120 125 Asp Val Ala Tyr His Thr Ser Gly Asp Ile Arg Lys Leu Leu Val Pro 130 135 140 Leu Val Gly Ile His Arg Tyr Glu Gly Asp Glu Val Asn Met Thr Leu 145 150 155 160 Ala Lys Ser Glu Ala Lys Leu Leu His Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala 165 170 175 Tyr Asn His Asp Asp Leu Ile Arg Ile Val Thr Thr Arg Ser Lys Ala 180 185 190 Gln Leu Asn Ala Thr Leu Asn His Tyr Asn Asn Glu Phe Gly Asn Val 195 200 205 Ile Asp Lys Asp Leu Glu Thr Asp Ser Asp Asp Glu Tyr Leu Lys Leu 210 215 220 Leu Arg Ala Ala Ile Lys Gly Leu Thr Tyr Pro Glu Lys Tyr Phe Glu 225 230 235 240 Glu Leu Leu Arg Leu Ala Ile Asn Lys Met Gly Thr Asp Glu Asn Ala 245 250 255 Leu Thr Arg Val Val Thr Thr Arg Ala Glu Val Asp Leu Gln Arg Ile 260 265 270 Ala Glu Glu Tyr Gln Arg Arg Asn Ser Val Pro Leu Asp Arg Ala Ile 275 280 285 Asp Lys Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Gln Lys Ile Leu Leu Ala Leu Met 290 295 300 Gly His Asp Glu 305 <210> 128 <211> 951 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 128 atggcgtctc tcaaagttcc tgctagtgtt cctcttccag aagaagatgc cgagcagctc 60 cagaaggcct ttaaaggatg gggaaccaac gagaggatga tcatatcaat cttggctcac 120 agaaatgccg agcaacgcag cttcatccgt gctgtttatg ctgctaacta caataaggat 180 cttctcaagg aattagacaa agagctatcc ggtgacttcg agcgagctgt gatgttgtgg 240 acacttgaac cagcggagag agatgcgtat ttggctaagg aatcaacaaa aatgttcact 300 aaagacaatt gggttctagt tgaaatcgct tgtactagat cttcccttga gtttttcaag 360 gccaagcaag cataccaagt tcgctacaag acatctattg aggaagatgt cgcctaccac 420 acatctggag atgtccgaaa gctcttggtt cctcttgtga gtacctttag gtacgatgga 480 gatgaagtaa acatgatgat tgctaagtct gaggctaaga tacttcacga gaagatggag 540 gcgaaggatt acaatgatgg agatctcatt agaatcctga caacaagaag caaagctcaa 600 atcagtgcaa cactcaacca cttcaaaaat aagttcggaa cttccattac aaaatacctt 660 aaagaggatt ccgacaacga atatgttcag ctacttaaag ccgtgatcaa atgcttgact 720 tatccagaga aatattttga gaaagttctt cgtcaagcca tcaacaaaat gggaactgac 780 gagtggggac ttactagagt ggtcaccaca cgagctgagc tcgacatgga acggatcaaa 840 gaggaatact tgcgcaggaa cagtgtccca cttgaccgag ccattgccaa agacactcat 900 ggtgactatg aggatattct tctagctctt atcggacatg gccatgcttg a 951 <210> 129 <211> 316 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 129 Met Ala Ser Leu Lys Val Pro Ala Ser Val Pro Leu Pro Glu Glu Asp 1 5 10 15 Ala Glu Gln Leu Gln Lys Ala Phe Lys Gly Trp Gly Thr Asn Glu Arg 20 25 30 Met Ile Ile Ser Ile Leu Ala His Arg Asn Ala Glu Gln Arg Ser Phe 35 40 45 Ile Arg Ala Val Tyr Ala Ala Asn Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Lys Glu 50 55 60 Leu Asp Lys Glu Leu Ser Gly Asp Phe Glu Arg Ala Val Met Leu Trp 65 70 75 80 Thr Leu Glu Pro Ala Glu Arg Asp Ala Tyr Leu Ala Lys Glu Ser Thr 85 90 95 Lys Met Phe Thr Lys Asp Asn Trp Val Leu Val Glu Ile Ala Cys Thr 100 105 110 Arg Ser Ser Leu Glu Phe Phe Lys Ala Lys Gln Ala Tyr Gln Val Arg 115 120 125 Tyr Lys Thr Ser Ile Glu Glu Asp Val Ala Tyr His Thr Ser Gly Asp 130 135 140 Val Arg Lys Leu Leu Val Pro Leu Val Ser Thr Phe Arg Tyr Asp Gly 145 150 155 160 Asp Glu Val Asn Met Met Ile Ala Lys Ser Glu Ala Lys Ile Leu His 165 170 175 Glu Lys Met Glu Ala Lys Asp Tyr Asn Asp Gly Asp Leu Ile Arg Ile 180 185 190 Leu Thr Thr Arg Ser Lys Ala Gln Ile Ser Ala Thr Leu Asn His Phe 195 200 205 Lys Asn Lys Phe Gly Thr Ser Ile Thr Lys Tyr Leu Lys Glu Asp Ser 210 215 220 Asp Asn Glu Tyr Val Gln Leu Leu Lys Ala Val Ile Lys Cys Leu Thr 225 230 235 240 Tyr Pro Glu Lys Tyr Phe Glu Lys Val Leu Arg Gln Ala Ile Asn Lys 245 250 255 Met Gly Thr Asp Glu Trp Gly Leu Thr Arg Val Val Thr Thr Arg Ala 260 265 270 Glu Leu Asp Met Glu Arg Ile Lys Glu Glu Tyr Leu Arg Arg Asn Ser 275 280 285 Val Pro Leu Asp Arg Ala Ile Ala Lys Asp Thr His Gly Asp Tyr Glu 290 295 300 Asp Ile Leu Leu Ala Leu Ile Gly His Gly His Ala 305 310 315 <210> 130 <211> 1235 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 130 ccttgaggaa aaaaaactaa aacggctcta aattgaaaac aaaagaagag agagagagag 60 agagacgaag aaacagagag attctctcga aaatggccac cattagagta ccaaacgaag 120 ttccttctcc agctcaggat tctgaaactc tcaaacaagc tattcgcgga tggggaacag 180 atgagaaggc gattatacga gttttagggc aaagagacca gagccagaga aggaagatta 240 gagaaagttt tagagagatt tatggcaaag atcttatcga tgttctatcc tccgaactgt 300 ctggtgattt catgaaagct gtggtttcgt ggacgtatga tccagcagag agagacgcaa 360 ggcttgtgaa caagattttg aacaaggaga agaagaagaa aagcttagag aatttgaagg 420 ttatagtaga gatctcttgc acgacttccc caaaccattt gattgctgtg aggaaagctt 480 attgttcact ctttgactct tctcttgaag aacacattgc ttcttctctg ccttttcctc 540 ttgcaaagtt actggtgaca ttggcaagta cattcagata tgacaaagat aggactgatg 600 cagaagtagc tactattgag gcggctatgc tacgtgaagc catagagaag aaacaattag 660 atcatgacca tgtcctgtac atattaggaa cgcgtagtat ctatcagctc agagaaactt 720 ttgttgctta caagaagaat tatggggtca caattgataa ggatgttgat ggatgtccag 780 gagatgctga tctgagaagt ctattgaagg tggcaatctt ttgtattgat actcctgaga 840 aacactttgc aaaggtggta agagattcga ttgagggttt tggaacagat gaggattcgt 900 tgacgagggc gattgtgacg cgtgcagaga tcgatttgat gaaagtaaga ggagagtatt 960 tcaacatgta taatacaagc atggacaatg ctattactgg tgatatttct ggagactaca 1020 aggacttcat tatcacctta cttggatcca aaatctgatc gttctttcgt ttctttgtca 1080 gttgttatat tcttggcttt gcttgtgact tgtataatca atcaatacat tgtattccaa 1140 ctccagtttg aattgtttaa aaaataatca aatttctctt gattcttgca tttttgaatc 1200 aaagcaaatc tatgtttaat tttgttttca aaatt 1235 <210> 131 <211> 321 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 131 Met Ala Thr Ile Arg Val Pro Asn Glu Val Pro Ser Pro Ala Gln Asp 1 5 10 15 Ser Glu Thr Leu Lys Gln Ala Ile Arg Gly Trp Gly Thr Asp Glu Lys 20 25 30 Ala Ile Ile Arg Val Leu Gly Gln Arg Asp Gln Ser Gln Arg Arg Lys 35 40 45 Ile Arg Glu Ser Phe Arg Glu Ile Tyr Gly Lys Asp Leu Ile Asp Val 50 55 60 Leu Ser Ser Glu Leu Ser Gly Asp Phe Met Lys Ala Val Val Ser Trp 65 70 75 80 Thr Tyr Asp Pro Ala Glu Arg Asp Ala Arg Leu Val Asn Lys Ile Leu 85 90 95 Asn Lys Glu Lys Lys Lys Lys Ser Leu Glu Asn Leu Lys Val Ile Val 100 105 110 Glu Ile Ser Cys Thr Thr Ser Pro Asn His Leu Ile Ala Val Arg Lys 115 120 125 Ala Tyr Cys Ser Leu Phe Asp Ser Ser Leu Glu Glu His Ile Ala Ser 130 135 140 Ser Leu Pro Phe Pro Leu Ala Lys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ser Thr 145 150 155 160 Phe Arg Tyr Asp Lys Asp Arg Thr Asp Ala Glu Val Ala Thr Ile Glu 165 170 175 Ala Ala Met Leu Arg Glu Ala Ile Glu Lys Lys Gln Leu Asp His Asp 180 185 190 His Val Leu Tyr Ile Leu Gly Thr Arg Ser Ile Tyr Gln Leu Arg Glu 195 200 205 Thr Phe Val Ala Tyr Lys Lys Asn Tyr Gly Val Thr Ile Asp Lys Asp 210 215 220 Val Asp Gly Cys Pro Gly Asp Ala Asp Leu Arg Ser Leu Leu Lys Val 225 230 235 240 Ala Ile Phe Cys Ile Asp Thr Pro Glu Lys His Phe Ala Lys Val Val 245 250 255 Arg Asp Ser Ile Glu Gly Phe Gly Thr Asp Glu Asp Ser Leu Thr Arg 260 265 270 Ala Ile Val Thr Arg Ala Glu Ile Asp Leu Met Lys Val Arg Gly Glu 275 280 285 Tyr Phe Asn Met Tyr Asn Thr Ser Met Asp Asn Ala Ile Thr Gly Asp 290 295 300 Ile Ser Gly Asp Tyr Lys Asp Phe Ile Ile Thr Leu Leu Gly Ser Lys 305 310 315 320 Ile <210> 132 <211> 951 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 132 atggcaacaa tgaaaatacc aatgacggta ccttctcctc gagtcgatgc tgaccaactc 60 tttaaggcct tcaaaggaag aggctgcgat acttcggtga tcatcaacat cttagctcat 120 cgcaatgcaa cacaacgagc tctcatcgaa caagaatacg aaaccaaatt ctcggatgac 180 ctccgaaaac gtctccactc tgagcttcat ggtcatctca agaaagccgt tcttttgtgg 240 atgcctgaag cagtggagcg agacgcttca atactgaaac gctccttaag aggagccgtg 300 actgatcata aagcgattgc tgagattata tgcacacgat ctggctctca gcttcgtcag 360 atcaaacagg tctactcaaa cactttcggt gtgaaacttg aagaggacat cgaatccgaa 420 gcttctggca atcacaaaag agttttgctc gcgtatttga acactacgcg atatgaagga 480 ccagagatcg ataatgcgag tgtagagaac gatgctagga ctctcaagag cgcggttgca 540 aggaagcata aatctgatga ccagacgttg attcagatat tcactgaccg aagcaggact 600 catttggtcg ctgtaagatc tacttaccgt tccatgtacg gcaaagaact tggaaaggcc 660 ataagagatg agactcgcgg gaacttcgag catgtccttc taacaatttt acaatgtgct 720 gaaaactctt gtttctattt cgcaaaggca ttgaggaaat caatgaaagg attaggaaca 780 gatgacacgg cgttgataag aatcgtggtg acgagagcag aggtggatat gcagttcatc 840 atcacagaat accgtaagag atacaagaag actttgtaca atgctgttca ttctgataca 900 actagtcatt acaggacttt tctcctctct cttttaggcc ccaacgtttg a 951 <210> 133 <211> 316 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 133 Met Ala Thr Met Lys Ile Pro Met Thr Val Pro Ser Pro Arg Val Asp 1 5 10 15 Ala Asp Gln Leu Phe Lys Ala Phe Lys Gly Arg Gly Cys Asp Thr Ser 20 25 30 Val Ile Ile Asn Ile Leu Ala His Arg Asn Ala Thr Gln Arg Ala Leu 35 40 45 Ile Glu Gln Glu Tyr Glu Thr Lys Phe Ser Asp Asp Leu Arg Lys Arg 50 55 60 Leu His Ser Glu Leu His Gly His Leu Lys Lys Ala Val Leu Leu Trp 65 70 75 80 Met Pro Glu Ala Val Glu Arg Asp Ala Ser Ile Leu Lys Arg Ser Leu 85 90 95 Arg Gly Ala Val Thr Asp His Lys Ala Ile Ala Glu Ile Ile Cys Thr 100 105 110 Arg Ser Gly Ser Gln Leu Arg Gln Ile Lys Gln Val Tyr Ser Asn Thr 115 120 125 Phe Gly Val Lys Leu Glu Glu Asp Ile Glu Ser Glu Ala Ser Gly Asn 130 135 140 His Lys Arg Val Leu Leu Ala Tyr Leu Asn Thr Thr Arg Tyr Glu Gly 145 150 155 160 Pro Glu Ile Asp Asn Ala Ser Val Glu Asn Asp Ala Arg Thr Leu Lys 165 170 175 Ser Ala Val Ala Arg Lys His Lys Ser Asp Asp Gln Thr Leu Ile Gln 180 185 190 Ile Phe Thr Asp Arg Ser Arg Thr His Leu Val Ala Val Arg Ser Thr 195 200 205 Tyr Arg Ser Met Tyr Gly Lys Glu Leu Gly Lys Ala Ile Arg Asp Glu 210 215 220 Thr Arg Gly Asn Phe Glu His Val Leu Leu Thr Ile Leu Gln Cys Ala 225 230 235 240 Glu Asn Ser Cys Phe Tyr Phe Ala Lys Ala Leu Arg Lys Ser Met Lys 245 250 255 Gly Leu Gly Thr Asp Asp Thr Ala Leu Ile Arg Ile Val Val Thr Arg 260 265 270 Ala Glu Val Asp Met Gln Phe Ile Ile Thr Glu Tyr Arg Lys Arg Tyr 275 280 285 Lys Lys Thr Leu Tyr Asn Ala Val His Ser Asp Thr Thr Ser His Tyr 290 295 300 Arg Thr Phe Leu Leu Ser Leu Leu Gly Pro Asn Val 305 310 315 <210> 134 <211> 1337 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 134 acagaaacca aaccaagagc cggaaatcaa aaacagtaat aaaagatcaa ctgcaagaaa 60 atggctcttc ctctcgagct cgaaagcctc actgaagcca tctcagctgg gatgggaatg 120 ggagttgatg agaatgcatt gataagcaca ctggggaaat cgcaaaagga acatagaaaa 180 ttgtttagga aagcaagcaa aagtttcttt gttgaagatg aggaaagagc ttttgagaaa 240 tgtcatgatc acttcgtcag acacctcaag cttgagttct cccgcttcaa tactgcggtg 300 gtgatgtggg caatgcatcc atgggagaga gatgcaaggt tggtgaagaa agctttgaag 360 aaaggagaag aagcttacaa cctcatcgtt gaggtctcat gcacacgctc tgctgaggat 420 ctcctcggtg cacgtaaagc ttaccactct ctcttcgacc aatcaatgga agaagacatt 480 gcctctcacg tccacggtcc tcagcgcaag ttgcttgtgg ggctcgtgag tgcttataga 540 tacgaaggaa ataaggtgaa ggatgattct gccaaatccg atgctaagat tctagccgaa 600 gcagtggctt cttcaggcga agaagccgtg gagaaggatg aggttgttag gattttgacc 660 acaagaagca aacttcatct ccaacatctc tacaaacact ttaacgaaat caaaggctct 720 gatcttcttg ggggtgtatc taagtcttct cttctcaatg aagcattgat ttgtttgctc 780 aaaccggctc tgtatttcag caagattttg gatgcgtctc tgaacaaaga cgcagacaag 840 actaccaaga aatggttgac aagagtgttc gttacaagag cagatcatag tgatgagatg 900 aatgagatca aagaagagta caataacctt tatggtgaga ctttggctca aagaatccaa 960 gagaagataa aagggaacta cagagatttc ttgctcacac ttctctccaa atccgattga 1020 tttcgtgttg agaaacctat taccaatact tttggttatt gaagatttat gatttccctt 1080 tttatggttt tatgtttcta attcctaaat ttgcgttttc tctaccgttt ggtaataaag 1140 acatgaaaat ttgatgaact cggtgaatcg agagtaagag ttttgcgatt gtgacaatga 1200 gtgattaata caaggattaa gctccaataa aaaaatgttg cataaatcag aaatgaaact 1260 tgtaactctt cttttcttta tgtgaaactt gtaactctat ttgaaagatt ctatgtgacc 1320 actaaaccga attacgg 1337 <210> 135 <211> 319 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 135 Met Ala Leu Pro Leu Glu Leu Glu Ser Leu Thr Glu Ala Ile Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Gly Met Gly Val Asp Glu Asn Ala Leu Ile Ser Thr Leu Gly 20 25 30 Lys Ser Gln Lys Glu His Arg Lys Leu Phe Arg Lys Ala Ser Lys Ser 35 40 45 Phe Phe Val Glu Asp Glu Glu Arg Ala Phe Glu Lys Cys His Asp His 50 55 60 Phe Val Arg His Leu Lys Leu Glu Phe Ser Arg Phe Asn Thr Ala Val 65 70 75 80 Val Met Trp Ala Met His Pro Trp Glu Arg Asp Ala Arg Leu Val Lys 85 90 95 Lys Ala Leu Lys Lys Gly Glu Glu Ala Tyr Asn Leu Ile Val Glu Val 100 105 110 Ser Cys Thr Arg Ser Ala Glu Asp Leu Leu Gly Ala Arg Lys Ala Tyr 115 120 125 His Ser Leu Phe Asp Gln Ser Met Glu Glu Asp Ile Ala Ser His Val 130 135 140 His Gly Pro Gln Arg Lys Leu Leu Val Gly Leu Val Ser Ala Tyr Arg 145 150 155 160 Tyr Glu Gly Asn Lys Val Lys Asp Asp Ser Ala Lys Ser Asp Ala Lys 165 170 175 Ile Leu Ala Glu Ala Val Ala Ser Ser Gly Glu Glu Ala Val Glu Lys 180 185 190 Asp Glu Val Val Arg Ile Leu Thr Thr Arg Ser Lys Leu His Leu Gln 195 200 205 His Leu Tyr Lys His Phe Asn Glu Ile Lys Gly Ser Asp Leu Leu Gly 210 215 220 Gly Val Ser Lys Ser Ser Leu Leu Asn Glu Ala Leu Ile Cys Leu Leu 225 230 235 240 Lys Pro Ala Leu Tyr Phe Ser Lys Ile Leu Asp Ala Ser Leu Asn Lys 245 250 255 Asp Ala Asp Lys Thr Thr Lys Lys Trp Leu Thr Arg Val Phe Val Thr 260 265 270 Arg Ala Asp His Ser Asp Glu Met Asn Glu Ile Lys Glu Glu Tyr Asn 275 280 285 Asn Leu Tyr Gly Glu Thr Leu Ala Gln Arg Ile Gln Glu Lys Ile Lys 290 295 300 Gly Asn Tyr Arg Asp Phe Leu Leu Thr Leu Leu Ser Lys Ser Asp 305 310 315 <210> 136 <211> 1110 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 136 gtctcatcta gagagctaga gaaatattca gtggtcggag aatggcgtct ctcaaaattc 60 cagcaaatat tcctcttccc gaagaagact ccgagcagct ccacaaggca ttcaaaggat 120 ggggaactaa tgaagggatg atcatatcaa ttttggctca tagaaacgca acgcaacgca 180 gtttcattcg tgccgtttat gctgctaact acaataagga tcttctcaag gaattagacg 240 gagagctttc tggtgacttt gagagagttg tgatgttgtg gactcttgat ccaacggaga 300 gagatgcgta tttggccaat gaatctacca aattgttcac caaaaacatt tgggtcctag 360 ttgaaatcgc ttgtactaga ccttctcttg agtttttcaa gaccaagcaa gcataccatg 420 ttcgctacaa gacctctctc gaggaagatg ttgcatacca tacatctgga aatatccgaa 480 agctattggt tcctcttgtg agcaccttca ggtacgatgg aaatgctgat gaggtcaacg 540 tgaagctggc tagatccgaa gctaagacac ttcacaagaa gatcactgag aaggcttaca 600 ctgatgaaga tctcatcaga atcttgacaa caaggagcaa agcacagatc aatgcaacac 660 tcaatcactt caaggacaag tttggaagtt ccattaacaa gtttctcaaa gaagattcga 720 acgatgatta tgttcaatta ctcaaaaccg cgatcaaatg cttgacatat ccagagaagt 780 actttgagaa ggttctacgt cgagccatca acaggatggg aacagacgag tgggcactta 840 ctagagtggt cactacaaga gcagaggtcg acctggagcg gatcaaagaa gaatacttac 900 gcaggaacag tgttcctctt gatcgagcca ttgctaatga cacttctggt gactacaagg 960 atatgcttct cgcccttctt ggacatgacc atgcttgaaa caacatcatc gtttcatagt 1020 cttttataag acagttgtta tttgtttttc attttctttg aactttggtc cttagttttt 1080 acattttact gcaacaactt attctggttt 1110 <210> 137 <211> 318 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 137 Met Ala Ser Leu Lys Ile Pro Ala Asn Ile Pro Leu Pro Glu Glu Asp 1 5 10 15 Ser Glu Gln Leu His Lys Ala Phe Lys Gly Trp Gly Thr Asn Glu Gly 20 25 30 Met Ile Ile Ser Ile Leu Ala His Arg Asn Ala Thr Gln Arg Ser Phe 35 40 45 Ile Arg Ala Val Tyr Ala Ala Asn Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Lys Glu 50 55 60 Leu Asp Gly Glu Leu Ser Gly Asp Phe Glu Arg Val Val Met Leu Trp 65 70 75 80 Thr Leu Asp Pro Thr Glu Arg Asp Ala Tyr Leu Ala Asn Glu Ser Thr 85 90 95 Lys Leu Phe Thr Lys Asn Ile Trp Val Leu Val Glu Ile Ala Cys Thr 100 105 110 Arg Pro Ser Leu Glu Phe Phe Lys Thr Lys Gln Ala Tyr His Val Arg 115 120 125 Tyr Lys Thr Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala Tyr His Thr Ser Gly Asn 130 135 140 Ile Arg Lys Leu Leu Val Pro Leu Val Ser Thr Phe Arg Tyr Asp Gly 145 150 155 160 Asn Ala Asp Glu Val Asn Val Lys Leu Ala Arg Ser Glu Ala Lys Thr 165 170 175 Leu His Lys Lys Ile Thr Glu Lys Ala Tyr Thr Asp Glu Asp Leu Ile 180 185 190 Arg Ile Leu Thr Thr Arg Ser Lys Ala Gln Ile Asn Ala Thr Leu Asn 195 200 205 His Phe Lys Asp Lys Phe Gly Ser Ser Ile Asn Lys Phe Leu Lys Glu 210 215 220 Asp Ser Asn Asp Asp Tyr Val Gln Leu Leu Lys Thr Ala Ile Lys Cys 225 230 235 240 Leu Thr Tyr Pro Glu Lys Tyr Phe Glu Lys Val Leu Arg Arg Ala Ile 245 250 255 Asn Arg Met Gly Thr Asp Glu Trp Ala Leu Thr Arg Val Val Thr Thr 260 265 270 Arg Ala Glu Val Asp Leu Glu Arg Ile Lys Glu Glu Tyr Leu Arg Arg 275 280 285 Asn Ser Val Pro Leu Asp Arg Ala Ile Ala Asn Asp Thr Ser Gly Asp 290 295 300 Tyr Lys Asp Met Leu Leu Ala Leu Leu Gly His Asp His Ala 305 310 315 <210> 138 <211> 951 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 138 atggccacca ttgtttctcc tccacatttc tcccctgtcg aagacgctga aaacatcaag 60 gcggcttgtc aaggatgggg aaccaatgaa aatgccatca tctcgatctt aggacaccgg 120 aatttgttcc agaggaagct cataagacaa gcttaccagg agatttacca tgaggatctc 180 attcaccagc tcaaatctga gctctctggc aattttgaga gagctatttg cttgtgggtc 240 ttggatcctc cagagagaga tgctctcttg gctaacttgg ctcttcaaaa gcctattcct 300 gactacaagg ttcttgtcga aattgcctgc atgagatccc ctgaagatat gttagctgct 360 agacgtgctt accgttgcct ctacaagcat tctcttgagg aagacttggc ctcccgtact 420 attggcgaca tcaggagact cttggttgca atggtgtctg cttataaata tgatggagaa 480 gaaattgatg agatgctggc gcaatcagag gctgcgattc ttcatgatga aatccttggt 540 aaggctgttg atcacgaaga aacgatcagg gtgttaagta caaggagcag catgcagctt 600 agcgcaatct tcaaccgcta caaggatata tatggcacat cgatcactaa ggatctcctc 660 aatcacccta caaatgagta cctgagtgca ctacgtgcag ccatcaggtg catcaaaaac 720 cctacccggt attatgcaaa ggttttgcgc aattcaatca acacggtggg gactgatgaa 780 gatgctctga accgtgtgat tgtcacacga gcagaaaagg acctgacgaa tataactggg 840 ctgtacttta agaggaacaa tgtgagtctc gatcaagcta tagcaaaaga gacatcaggg 900 gactacaagg cctttcttct agctttgcta ggacatggaa aacaacttta g 951 <210> 139 <211> 316 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 139 Met Ala Thr Ile Val Ser Pro Pro His Phe Ser Pro Val Glu Asp Ala 1 5 10 15 Glu Asn Ile Lys Ala Ala Cys Gln Gly Trp Gly Thr Asn Glu Asn Ala 20 25 30 Ile Ile Ser Ile Leu Gly His Arg Asn Leu Phe Gln Arg Lys Leu Ile 35 40 45 Arg Gln Ala Tyr Gln Glu Ile Tyr His Glu Asp Leu Ile His Gln Leu 50 55 60 Lys Ser Glu Leu Ser Gly Asn Phe Glu Arg Ala Ile Cys Leu Trp Val 65 70 75 80 Leu Asp Pro Pro Glu Arg Asp Ala Leu Leu Ala Asn Leu Ala Leu Gln 85 90 95 Lys Pro Ile Pro Asp Tyr Lys Val Leu Val Glu Ile Ala Cys Met Arg 100 105 110 Ser Pro Glu Asp Met Leu Ala Ala Arg Arg Ala Tyr Arg Cys Leu Tyr 115 120 125 Lys His Ser Leu Glu Glu Asp Leu Ala Ser Arg Thr Ile Gly Asp Ile 130 135 140 Arg Arg Leu Leu Val Ala Met Val Ser Ala Tyr Lys Tyr Asp Gly Glu 145 150 155 160 Glu Ile Asp Glu Met Leu Ala Gln Ser Glu Ala Ala Ile Leu His Asp 165 170 175 Glu Ile Leu Gly Lys Ala Val Asp His Glu Glu Thr Ile Arg Val Leu 180 185 190 Ser Thr Arg Ser Ser Met Gln Leu Ser Ala Ile Phe Asn Arg Tyr Lys 195 200 205 Asp Ile Tyr Gly Thr Ser Ile Thr Lys Asp Leu Leu Asn His Pro Thr 210 215 220 Asn Glu Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Ala Ala Ile Arg Cys Ile Lys Asn 225 230 235 240 Pro Thr Arg Tyr Tyr Ala Lys Val Leu Arg Asn Ser Ile Asn Thr Val 245 250 255 Gly Thr Asp Glu Asp Ala Leu Asn Arg Val Ile Val Thr Arg Ala Glu 260 265 270 Lys Asp Leu Thr Asn Ile Thr Gly Leu Tyr Phe Lys Arg Asn Asn Val 275 280 285 Ser Leu Asp Gln Ala Ile Ala Lys Glu Thr Ser Gly Asp Tyr Lys Ala 290 295 300 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Gly His Gly Lys Gln Leu 305 310 315 <210> 140 <211> 1298 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 140 gttgcagatt actaccacca cctccccaaa atcccaatcg aatcgaaatc gaatcgagtc 60 gagtcgccgc cggagccgga gacggaggcg gcagcggcgc agcggtaatg gcgagcctca 120 ccctgccgcc ggcgcccacc aaccctcgcc aggacgccat cgacctccac aaggccttca 180 aagggtttgg ctgtgatagt acaacagtta taaatatact tactcatcgt gactcgatgc 240 aacgcgcgct cattcaacag gaatacagga ctatgtattc tgaggatctc tctcgccgta 300 tatcatctga actcagtgga caccacaaga aagcaatgct gctatggatt cttgatcctg 360 ctggacgaga tgcaactgtt ttgagagaag ctctgagtgg tgatactatt gacctgagag 420 cagccactga gataatatgt tccaggacac catcgcagct gcaaataatg aaacagactt 480 atcatgcaaa atttggtact tatcttgagc acgacattgg tcagcgcaca tcaggcgacc 540 atcagaagct cttgcttgct tatgtgggga ttccacgcta tgaaggtcct gaggttgatc 600 ctactatagt gacacacgat gcaaaggacc tctataaagc tggtgagaaa aggctgggca 660 ctgatgagaa gaccttcatc cgcattttca ctgaacgcag ctgggcacac atggcatctg 720 ttgcctctgc ttaccatcat atgtatgatc ggtcactgga gaaggttgtg aagagcgaaa 780 catctggaaa ctttgaactt gctctgctaa ctatcctcag atgcgctgag aatccagcca 840 agtattttgc aaaggtcttg cggaagtcca tgaaaggtat gggcactgat gatagtacac 900 ttataagggt tgtagtaaca aggactgaga tcgacatgca atatatcaag gctgagtact 960 acaagaaata caaaaaatca ttagctgaag ctatccattc cgagacctca ggaaattatc 1020 gaacattcct cctttctcta gttggtagcc attaggctac atttcgtcga ccctgtggca 1080 cttgacgttc catgactatc ctaaatgcag tggttctacc tggaaactgt aaaatttcgc 1140 catcattgtg ctctctattc gtgtgtgctt gcttaaaaat gtgtgtatat atataacctg 1200 ggcattaaat agttggtgct taatatggtt tggtggttcc atctgacaag tcactcgtta 1260 ctcggtgcat ttattcgaat aagtgatggt atttggtc 1298 <210> 141 <211> 315 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 141 Met Ala Ser Leu Thr Leu Pro Pro Ala Pro Thr Asn Pro Arg Gln Asp 1 5 10 15 Ala Ile Asp Leu His Lys Ala Phe Lys Gly Phe Gly Cys Asp Ser Thr 20 25 30 Thr Val Ile Asn Ile Leu Thr His Arg Asp Ser Met Gln Arg Ala Leu 35 40 45 Ile Gln Gln Glu Tyr Arg Thr Met Tyr Ser Glu Asp Leu Ser Arg Arg 50 55 60 Ile Ser Ser Glu Leu Ser Gly His His Lys Lys Ala Met Leu Leu Trp 65 70 75 80 Ile Leu Asp Pro Ala Gly Arg Asp Ala Thr Val Leu Arg Glu Ala Leu 85 90 95 Ser Gly Asp Thr Ile Asp Leu Arg Ala Ala Thr Glu Ile Ile Cys Ser 100 105 110 Arg Thr Pro Ser Gln Leu Gln Ile Met Lys Gln Thr Tyr His Ala Lys 115 120 125 Phe Gly Thr Tyr Leu Glu His Asp Ile Gly Gln Arg Thr Ser Gly Asp 130 135 140 His Gln Lys Leu Leu Leu Ala Tyr Val Gly Ile Pro Arg Tyr Glu Gly 145 150 155 160 Pro Glu Val Asp Pro Thr Ile Val Thr His Asp Ala Lys Asp Leu Tyr 165 170 175 Lys Ala Gly Glu Lys Arg Leu Gly Thr Asp Glu Lys Thr Phe Ile Arg 180 185 190 Ile Phe Thr Glu Arg Ser Trp Ala His Met Ala Ser Val Ala Ser Ala 195 200 205 Tyr His His Met Tyr Asp Arg Ser Leu Glu Lys Val Val Lys Ser Glu 210 215 220 Thr Ser Gly Asn Phe Glu Leu Ala Leu Leu Thr Ile Leu Arg Cys Ala 225 230 235 240 Glu Asn Pro Ala Lys Tyr Phe Ala Lys Val Leu Arg Lys Ser Met Lys 245 250 255 Gly Met Gly Thr Asp Asp Ser Thr Leu Ile Arg Val Val Val Thr Arg 260 265 270 Thr Glu Ile Asp Met Gln Tyr Ile Lys Ala Glu Tyr Tyr Lys Lys Tyr 275 280 285 Lys Lys Ser Leu Ala Glu Ala Ile His Ser Glu Thr Ser Gly Asn Tyr 290 295 300 Arg Thr Phe Leu Leu Ser Leu Val Gly Ser His 305 310 315 <210> 142 <211> 1222 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 142 ctccccgccg cataaatccc cttcgcctcc ccgccgcgcc ccgcggcgtc gcacgatctc 60 actgaggcat aaagtgagag accgtgattg gatcgatcac cggagcgacg atcaatggcg 120 acgctcaccg tgcccgccgc cgtgccgccc gtcgccgagg actgcgagca gctgcgcaag 180 gcgttcaaag ggtggggcac gaacgagaag ctcatcatct ccatcctcgc ccaccgcgac 240 gcggcgcagc gccgggcgat ccgccgcgcc tacgccgagg cgtacggcga ggagctgctc 300 cgcgccctca acgacgagat ccacggcaaa ttcgagaggg cggtgatcca gtggacgctg 360 gacccggcgg agcgggacgc ggtgctggcg aacgaggagg cgaggaagtg gcacccgggg 420 ggccgcgcgc tcgtcgagat cgcgtgcacg cgcactccat cgcagctctt cgctgcgaag 480 caggcgtacc acgagcgctt caagaggtcg ctcgaggagg acgtcgcggc gcacatcacc 540 ggcgactacc gtaagctttt ggtgccactt gtgactgtat atcgctatga tgggccagag 600 gtgaacacat cgttggcaca ttctgaagcc aaaatactcc atgagaagat ccatgacaag 660 gcttacagtg acgatgaaat catcaggatt ctcaccacaa ggagcaaagc acagttacta 720 gcaacattca atagttacaa tgatcagttc ggccatccaa tcactaagga tcttaaagct 780 gatcctaagg acgagttcct tggtacacta agggcgatca taagatgctt cacttgccct 840 gacagatact ttgagaaagt cattcgattg gctctaggag gaatgggcac agacgagaac 900 tctcttacaa ggatcataac aactcgtgcc gaggtagacc tgaagctgat aaaggaggcc 960 taccagaaga gaaacagtgt cccattggag cgagctgttg ctaaagatac aaccagagac 1020 tacgaggata tactccttgc cctccttgga gcagagtgag gtgtatatct gctccatctc 1080 gtctgtctga tcctccttgt ttgatcggaa aataagatct gcatagaact gtgttctatt 1140 ttgttgtttc tgaatgatac aagtgagcta gtctgcatag cagtgctcat ataataaaat 1200 ctgtcctgca tactggtttg tc 1222 <210> 143 <211> 314 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 143 Met Ala Thr Leu Thr Val Pro Ala Ala Val Pro Pro Val Ala Glu Asp 1 5 10 15 Cys Glu Gln Leu Arg Lys Ala Phe Lys Gly Trp Gly Thr Asn Glu Lys 20 25 30 Leu Ile Ile Ser Ile Leu Ala His Arg Asp Ala Ala Gln Arg Arg Ala 35 40 45 Ile Arg Arg Ala Tyr Ala Glu Ala Tyr Gly Glu Glu Leu Leu Arg Ala 50 55 60 Leu Asn Asp Glu Ile His Gly Lys Phe Glu Arg Ala Val Ile Gln Trp 65 70 75 80 Thr Leu Asp Pro Ala Glu Arg Asp Ala Val Leu Ala Asn Glu Glu Ala 85 90 95 Arg Lys Trp His Pro Gly Gly Arg Ala Leu Val Glu Ile Ala Cys Thr 100 105 110 Arg Thr Pro Ser Gln Leu Phe Ala Ala Lys Gln Ala Tyr His Glu Arg 115 120 125 Phe Lys Arg Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala Ala His Ile Thr Gly Asp 130 135 140 Tyr Arg Lys Leu Leu Val Pro Leu Val Thr Val Tyr Arg Tyr Asp Gly 145 150 155 160 Pro Glu Val Asn Thr Ser Leu Ala His Ser Glu Ala Lys Ile Leu His 165 170 175 Glu Lys Ile His Asp Lys Ala Tyr Ser Asp Asp Glu Ile Ile Arg Ile 180 185 190 Leu Thr Thr Arg Ser Lys Ala Gln Leu Leu Ala Thr Phe Asn Ser Tyr 195 200 205 Asn Asp Gln Phe Gly His Pro Ile Thr Lys Asp Leu Lys Ala Asp Pro 210 215 220 Lys Asp Glu Phe Leu Gly Thr Leu Arg Ala Ile Ile Arg Cys Phe Thr 225 230 235 240 Cys Pro Asp Arg Tyr Phe Glu Lys Val Ile Arg Leu Ala Leu Gly Gly 245 250 255 Met Gly Thr Asp Glu Asn Ser Leu Thr Arg Ile Ile Thr Thr Arg Ala 260 265 270 Glu Val Asp Leu Lys Leu Ile Lys Glu Ala Tyr Gln Lys Arg Asn Ser 275 280 285 Val Pro Leu Glu Arg Ala Val Ala Lys Asp Thr Thr Arg Asp Tyr Glu 290 295 300 Asp Ile Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ala Glu 305 310 <210> 144 <211> 1152 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 144 agcacagcac agcacacatc tcgtccagtc catccatggc gagcctgagc gtgccgccgg 60 tgccgacgga cccgcggcgc gacgcgatcg acctccacag ggcgttcaag gggttcggct 120 gcgacgccac ggcggtgacc gccatcctcg cccaccgcga cgcctcccag cgcgccctaa 180 tccggcgcca ctacgcggcg gtctaccacc aggacctcct ccaccgcctc gccgccgagc 240 tctcgggcca ccacaagcgc gccgtcctgc tctgggtgct cgacccggcg tcccgcgacg 300 ccgccgtcct ccaccaggcg ctcaacggcg acgtcaccga catgagggcg gccaccgagg 360 tggtgtgctc caggacgccg tcgcagctgc tcgtggtgag gcaggcctac ctcgccaggt 420 tcggcggcgg cggcggcggc ggcctcgagc acgacgtcgc cgtcagggcg tccggcgacc 480 accagaggct gcttctggcg tacctgcgct cgccgcggta cgaggggccc gaggtggtcg 540 acatggcggc ggcggcgcgc gacgccaggg agctgtacag ggccggcgag aggcggctcg 600 gcaccgacga gaggacgttc atccgcgtct tctccgagcg cagcgccgcc cacatggcgg 660 ccgtcgccgc cgcgtaccac cacatgtacg accgctccct cgagaaggct gtgaagagtg 720 aaacttcagg gaactttggg tttggcctgc tgacaatcct caggtgcgcc gagagcccgg 780 ccaagtactt cgccaaggtg ctccacgagg cgatgaaggg gctgggcacc aacgacacga 840 cgctgatcag ggtggtgacg acgagggcgg aggtggacat gcagtacatc aaggcggagt 900 accaccggag ctacaagcgc tcgctcgccg acgccgtcca ctccgagacc tccggcaact 960 accgcacctt cctcctctcc ctcatcggcc gcgaccgcta acgtcgattg gtttcggtct 1020 ctttgagcgt gtgttaaggg acgcatttgt tccatagcgc acaaacatgg caattattta 1080 tgtgcgtgtg tagtggtgtg ttcgaacgtt cgtttttcgt gtaataaaaa aaattgagtt 1140 tgctgtcttg tg 1152 <210> 145 <211> 321 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 145 Met Ala Ser Leu Ser Val Pro Pro Val Pro Thr Asp Pro Arg Arg Asp 1 5 10 15 Ala Ile Asp Leu His Arg Ala Phe Lys Gly Phe Gly Cys Asp Ala Thr 20 25 30 Ala Val Thr Ala Ile Leu Ala His Arg Asp Ala Ser Gln Arg Ala Leu 35 40 45 Ile Arg Arg His Tyr Ala Ala Val Tyr His Gln Asp Leu Leu His Arg 50 55 60 Leu Ala Ala Glu Leu Ser Gly His His Lys Arg Ala Val Leu Leu Trp 65 70 75 80 Val Leu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Ala Ala Val Leu His Gln Ala Leu 85 90 95 Asn Gly Asp Val Thr Asp Met Arg Ala Ala Thr Glu Val Val Cys Ser 100 105 110 Arg Thr Pro Ser Gln Leu Leu Val Val Arg Gln Ala Tyr Leu Ala Arg 115 120 125 Phe Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Glu His Asp Val Ala Val Arg 130 135 140 Ala Ser Gly Asp His Gln Arg Leu Leu Leu Ala Tyr Leu Arg Ser Pro 145 150 155 160 Arg Tyr Glu Gly Pro Glu Val Val Asp Met Ala Ala Ala Ala Arg Asp 165 170 175 Ala Arg Glu Leu Tyr Arg Ala Gly Glu Arg Arg Leu Gly Thr Asp Glu 180 185 190 Arg Thr Phe Ile Arg Val Phe Ser Glu Arg Ser Ala Ala His Met Ala 195 200 205 Ala Val Ala Ala Ala Tyr His His Met Tyr Asp Arg Ser Leu Glu Lys 210 215 220 Ala Val Lys Ser Glu Thr Ser Gly Asn Phe Gly Phe Gly Leu Leu Thr 225 230 235 240 Ile Leu Arg Cys Ala Glu Ser Pro Ala Lys Tyr Phe Ala Lys Val Leu 245 250 255 His Glu Ala Met Lys Gly Leu Gly Thr Asn Asp Thr Thr Leu Ile Arg 260 265 270 Val Val Thr Thr Arg Ala Glu Val Asp Met Gln Tyr Ile Lys Ala Glu 275 280 285 Tyr His Arg Ser Tyr Lys Arg Ser Leu Ala Asp Ala Val His Ser Glu 290 295 300 Thr Ser Gly Asn Tyr Arg Thr Phe Leu Leu Ser Leu Ile Gly Arg Asp 305 310 315 320 Arg <210> 146 <211> 1272 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 146 cgggtctcct ctcctccccc gccgacgcgc actcgatccc ccccgcctcc gcctccgcct 60 ccgcctccgc gtcgcccatc tcgagatccc ccgcatggcg acgctcaccg tcccctccgc 120 cgtcccgccc gtcgccgacg actgcgacca gctccgcaag gccttccaag ggtggggcac 180 gaacgaggcg ctcatcatct ccatcctggc ccaccgcgac gcggcgcagc ggcgcgccat 240 ccgccgcgcc tacgccgaca cctacggcga ggagctcctc cgcagcatca ccgacgagat 300 ctccggcgac ttcgagaggg ccgtgatcct gtggacgctg gacccggcgg agcgcgacgc 360 ggtgctcgcc aacgaggtcg cgaggaagtg gtacccaggg agcgggagcc gcgtgctggt 420 cgagatcgcg tgcgcgcgcg gccccgcgca gctgttcgcg gtcaggcagg cctaccacga 480 gcgcttcaag cgctcgctcg aggaggacgt cgcggcgcac gccactggtg acttccgcaa 540 gctcttggtg ccacttataa gtgcttaccg ctatgagggg ccggaagtca acacaaagtt 600 ggcacattca gaagccaaaa ttctgcatga gaagatccag cataaggcat atggtgatga 660 tgagatcatc agaattctca ctactaggag caaggctcag ttgattgcga cattcaatcg 720 ttacaatgat gaatatggtc acccaatcaa caaggatctc aaggctgatc ccaaggacga 780 gttcctttcc acgctgcgtg caatcatccg ctgcttctgt tgccctgaca ggtacttcga 840 gaaagtcatc aggttggcca tcgcaggcat gggaacagac gagaactccc tcactaggat 900 cattaccact cgtgccgagg tggatctgaa gctgatcacg gaggcgtacc agaagaggaa 960 cagtgtcccg ctggagcgtg cggtcgcagg ggacacctcc ggggactacg agaggatgct 1020 tcttgctctt ctgggtcagg agcagtgagc catgcctatc ttgcccagtc acacacttca 1080 tgtgatcatg tcatatcaga gaataaacct gttatgcagg ggacacagcc gtggtgatta 1140 tgatgttgtt tttccagtgt acggtactgt ttgctgcagc ttgcataaca gtgacgatga 1200 aataaatcat agtggaatgc gttggctcat gggacctcac ttattttgca actttttgac 1260 aggtcttatt tc 1272 <210> 147 <211> 317 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 147 Met Ala Thr Leu Thr Val Pro Ser Ala Val Pro Pro Val Ala Asp Asp 1 5 10 15 Cys Asp Gln Leu Arg Lys Ala Phe Gln Gly Trp Gly Thr Asn Glu Ala 20 25 30 Leu Ile Ile Ser Ile Leu Ala His Arg Asp Ala Ala Gln Arg Arg Ala 35 40 45 Ile Arg Arg Ala Tyr Ala Asp Thr Tyr Gly Glu Glu Leu Leu Arg Ser 50 55 60 Ile Thr Asp Glu Ile Ser Gly Asp Phe Glu Arg Ala Val Ile Leu Trp 65 70 75 80 Thr Leu Asp Pro Ala Glu Arg Asp Ala Val Leu Ala Asn Glu Val Ala 85 90 95 Arg Lys Trp Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Arg Val Leu Val Glu Ile Ala 100 105 110 Cys Ala Arg Gly Pro Ala Gln Leu Phe Ala Val Arg Gln Ala Tyr His 115 120 125 Glu Arg Phe Lys Arg Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala Ala His Ala Thr 130 135 140 Gly Asp Phe Arg Lys Leu Leu Val Pro Leu Ile Ser Ala Tyr Arg Tyr 145 150 155 160 Glu Gly Pro Glu Val Asn Thr Lys Leu Ala His Ser Glu Ala Lys Ile 165 170 175 Leu His Glu Lys Ile Gln His Lys Ala Tyr Gly Asp Asp Glu Ile Ile 180 185 190 Arg Ile Leu Thr Thr Arg Ser Lys Ala Gln Leu Ile Ala Thr Phe Asn 195 200 205 Arg Tyr Asn Asp Glu Tyr Gly His Pro Ile Asn Lys Asp Leu Lys Ala 210 215 220 Asp Pro Lys Asp Glu Phe Leu Ser Thr Leu Arg Ala Ile Ile Arg Cys 225 230 235 240 Phe Cys Cys Pro Asp Arg Tyr Phe Glu Lys Val Ile Arg Leu Ala Ile 245 250 255 Ala Gly Met Gly Thr Asp Glu Asn Ser Leu Thr Arg Ile Ile Thr Thr 260 265 270 Arg Ala Glu Val Asp Leu Lys Leu Ile Thr Glu Ala Tyr Gln Lys Arg 275 280 285 Asn Ser Val Pro Leu Glu Arg Ala Val Ala Gly Asp Thr Ser Gly Asp 290 295 300 Tyr Glu Arg Met Leu Leu Ala Leu Leu Gly Gln Glu Gln 305 310 315 <210> 148 <211> 1491 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 148 agtaatacgc aaggaatacc tggatcatac gatacgaata tctagagaca aaacatgatt 60 tgagtgattg atgatcgaga aagaagctca aaaggtcttg aaaagtcgaa acgtccatca 120 ctgaaattcg gtttcatgcc ctcagatccc attgctgagt aggacgcaga ttttcttcct 180 tcctaccatt tcctttctct tgcttccttt ttggtcattt gagatagctt tatccatcct 240 ttagcaaaaa ggaaaccaat agctagcaat acttgccatc atatatacct gggcaatggc 300 cggccaagca aactcagttc tctacattga acacttcagg tttgagtaga catggcctct 360 cggtgtcttg ttaccacagg ttttgaggat gagtgcagag agatccatga tgcgtgcaac 420 cagccacgcc gtttgagcgt tctcttggct catcggagcc catcggagag gcagaaaatc 480 aaggcgactt accgtacagt gttcggcgaa gatctcgccg gagaagtgca gaaaatcctc 540 atggtcaacc aggaagatga gctctgcaag ctgctctacc tgtgggtgct cgacccgtcg 600 gagcgcgacg cgatcatggc tcgggacgcc gtcgagaatg gcggcgccac ggattaccgg 660 gtcctggtgg agatcttcac acgccggaag cagaaccagc tcttcttcac caatcaggca 720 taccttgcca ggttcaagaa gaacctggag caggacatgg tcacagagcc gtctcatcct 780 taccagaggc tattggtagc acttgcaacc tcccacaagt cgcaccacga tgaacttagt 840 cggcacattg caaaatgtga cgccaggagg ctctatgatg cgaagaacag cggcatggga 900 tcggtcgacg aggctgtcat tcttgagatg ttcagcaaga ggagcatccc acagctcagg 960 ctagcattct gcagttacaa gcacatatat gggcatgact acaccaaggc actgaagaaa 1020 aatggcttcg gtgagtttga acaatctttg agggttgttg tgaagtgcat ctacaatcct 1080 tccatgtatt tctccaagct gctgcataga agtctgcaat gctcagcgac caataaaagg 1140 ttggttacaa gggctatttt gggcagtgac gatgtcgata tggacaagat caagtcagtg 1200 ttcaaaagta gttatggaaa ggaccttgag gatttcatcc ttgaaagctt gcctgagaat 1260 gattacagag actttctttt aggtgcggcc aaggggtcaa gggcctcatg aagtctgtgg 1320 agagagatcc ttgaattatc tagggaaagt aaagggtgca tatactgctt tgcatgtaag 1380 agcaaattga ccatcaaaaa cagcagtttt atgttatctg agaataggat ttaggtgaga 1440 acatcatgct cattttgttt attttgggtg aaaaaagtta tcagttcaac t 1491 <210> 149 <211> 319 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 149 Met Ala Ser Arg Cys Leu Val Thr Thr Gly Phe Glu Asp Glu Cys Arg 1 5 10 15 Glu Ile His Asp Ala Cys Asn Gln Pro Arg Arg Leu Ser Val Leu Leu 20 25 30 Ala His Arg Ser Pro Ser Glu Arg Gln Lys Ile Lys Ala Thr Tyr Arg 35 40 45 Thr Val Phe Gly Glu Asp Leu Ala Gly Glu Val Gln Lys Ile Leu Met 50 55 60 Val Asn Gln Glu Asp Glu Leu Cys Lys Leu Leu Tyr Leu Trp Val Leu 65 70 75 80 Asp Pro Ser Glu Arg Asp Ala Ile Met Ala Arg Asp Ala Val Glu Asn 85 90 95 Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Arg Val Leu Val Glu Ile Phe Thr Arg Arg 100 105 110 Lys Gln Asn Gln Leu Phe Phe Thr Asn Gln Ala Tyr Leu Ala Arg Phe 115 120 125 Lys Lys Asn Leu Glu Gln Asp Met Val Thr Glu Pro Ser His Pro Tyr 130 135 140 Gln Arg Leu Leu Val Ala Leu Ala Thr Ser His Lys Ser His His Asp 145 150 155 160 Glu Leu Ser Arg His Ile Ala Lys Cys Asp Ala Arg Arg Leu Tyr Asp 165 170 175 Ala Lys Asn Ser Gly Met Gly Ser Val Asp Glu Ala Val Ile Leu Glu 180 185 190 Met Phe Ser Lys Arg Ser Ile Pro Gln Leu Arg Leu Ala Phe Cys Ser 195 200 205 Tyr Lys His Ile Tyr Gly His Asp Tyr Thr Lys Ala Leu Lys Lys Asn 210 215 220 Gly Phe Gly Glu Phe Glu Gln Ser Leu Arg Val Val Val Lys Cys Ile 225 230 235 240 Tyr Asn Pro Ser Met Tyr Phe Ser Lys Leu Leu His Arg Ser Leu Gln 245 250 255 Cys Ser Ala Thr Asn Lys Arg Leu Val Thr Arg Ala Ile Leu Gly Ser 260 265 270 Asp Asp Val Asp Met Asp Lys Ile Lys Ser Val Phe Lys Ser Ser Tyr 275 280 285 Gly Lys Asp Leu Glu Asp Phe Ile Leu Glu Ser Leu Pro Glu Asn Asp 290 295 300 Tyr Arg Asp Phe Leu Leu Gly Ala Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ser 305 310 315 <210> 150 <211> 1393 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 150 atggaaaaat accatgaaat acaaatggaa aaaatagggt agagcccaga gcattggatg 60 tgcagattaa agctatacta ctagcattca agtttttttc aactctgctg cgtaggaggc 120 gtgtgtgtgc catgtgttgc tggtgctgct gcctggactg catccataac atacctccac 180 tcaatctcct cttcctccat ttctcccccc attctctctc ctcctcagct gcttctgcag 240 gtggaggaga agcagcagca gcagcagctg ttgctcccat ggcttccatc tctgtcccaa 300 acccagctcc ttcccctaca gaggatgcag agagcataag aaaggcagtg caaggatggg 360 gaacggacga gaatgcgctg atcgagatcc tcggccaccg gacggcggcg cagcgggcgg 420 agatcgccgt cgcctacgag ggcctctacg acgagaccct cctcgacagg ctccactccg 480 agctctccgg cgacttccgt agcgcgttga tgctgtggac gatggacccg gcggcgcggg 540 acgccaagct ggccaacgag gccctgaaga agaagaagaa gggcgagctc cgccacatct 600 gggtgctcgt cgaggtcgcc tgcgcgtcgt cgccggacca cctcgtcgcc gtcaggaagg 660 cctaccgcgc cgcctacgcc tcgtcgctgg aggaggacgt ggcgtcgtgc tcgctgttcg 720 gggacccgct caggcggttc ctggtgcgcc tcgtgagctc ctaccggtac ggcggcggtg 780 gcgtcgacgg cgagctggcg atcgccgagg cggcggagct gcacgacgcg gtggtgggca 840 gggggcaggc gctgcacggc gacgacgtcg tccgcatcgt cggcacgagg agcaaggcgc 900 agctcgcggt gacgctggag cggtacaggc aggagcacgg caagggcatc gacgaggtcc 960 tcgacggccg ccgcggcgac cagctcgcgg cggtgctcaa ggccgcgctc tggtgcctca 1020 cctcgccgga gaagcatttc gctgaggtga tccggacatc gattctaggg cttggcaccg 1080 acgaggagat gctgacgaga gggatcgtgt cgcgggcgga ggtggacatg gagaaggtga 1140 aggaggagta caaggtcagg tacaacacca cggtcaccgc cgacgtccgc ggcgacacgt 1200 cggggtacta catgaacacg cttctcaccc tcgtcggccc tgagaagtag ccatgtagca 1260 gcttggacat tttattgctt gctcatttga tttgaacaaa atacaccgtg tgatgttgca 1320 gttattagta aaatgcgagt aggatcgatg ttgttttcgt tgggtggatt aataatggag 1380 catgttttat cgc 1393 <210> 151 <211> 372 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 151 Met Cys Cys Trp Cys Cys Cys Leu Asp Cys Ile His Asn Ile Pro Pro 1 5 10 15 Leu Asn Leu Leu Phe Leu His Phe Ser Pro His Ser Leu Ser Ser Ser 20 25 30 Ala Ala Ser Ala Gly Gly Gly Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala 35 40 45 Pro Met Ala Ser Ile Ser Val Pro Asn Pro Ala Pro Ser Pro Thr Glu 50 55 60 Asp Ala Glu Ser Ile Arg Lys Ala Val Gln Gly Trp Gly Thr Asp Glu 65 70 75 80 Asn Ala Leu Ile Glu Ile Leu Gly His Arg Thr Ala Ala Gln Arg Ala 85 90 95 Glu Ile Ala Val Ala Tyr Glu Gly Leu Tyr Asp Glu Thr Leu Leu Asp 100 105 110 Arg Leu His Ser Glu Leu Ser Gly Asp Phe Arg Ser Ala Leu Met Leu 115 120 125 Trp Thr Met Asp Pro Ala Ala Arg Asp Ala Lys Leu Ala Asn Glu Ala 130 135 140 Leu Lys Lys Lys Lys Lys Gly Glu Leu Arg His Ile Trp Val Leu Val 145 150 155 160 Glu Val Ala Cys Ala Ser Ser Pro Asp His Leu Val Ala Val Arg Lys 165 170 175 Ala Tyr Arg Ala Ala Tyr Ala Ser Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala Ser 180 185 190 Cys Ser Leu Phe Gly Asp Pro Leu Arg Arg Phe Leu Val Arg Leu Val 195 200 205 Ser Ser Tyr Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Val Asp Gly Glu Leu Ala Ile 210 215 220 Ala Glu Ala Ala Glu Leu His Asp Ala Val Val Gly Arg Gly Gln Ala 225 230 235 240 Leu His Gly Asp Asp Val Val Arg Ile Val Gly Thr Arg Ser Lys Ala 245 250 255 Gln Leu Ala Val Thr Leu Glu Arg Tyr Arg Gln Glu His Gly Lys Gly 260 265 270 Ile Asp Glu Val Leu Asp Gly Arg Arg Gly Asp Gln Leu Ala Ala Val 275 280 285 Leu Lys Ala Ala Leu Trp Cys Leu Thr Ser Pro Glu Lys His Phe Ala 290 295 300 Glu Val Ile Arg Thr Ser Ile Leu Gly Leu Gly Thr Asp Glu Glu Met 305 310 315 320 Leu Thr Arg Gly Ile Val Ser Arg Ala Glu Val Asp Met Glu Lys Val 325 330 335 Lys Glu Glu Tyr Lys Val Arg Tyr Asn Thr Thr Val Thr Ala Asp Val 340 345 350 Arg Gly Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Met Asn Thr Leu Leu Thr Leu Val 355 360 365 Gly Pro Glu Lys 370 <210> 152 <211> 1341 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 152 ggtcttttcc ggccgctccc ggcgcccgcc ggccatgtca acaacaagct cgtcaaaaac 60 cgccacgtgc cctctctgcc acgccgacgt gctgctgcca cggcggcggt cagccggctc 120 ctcgacgcac agaagccacg acctcgacga cggccccgct ccgccgtcgc cggagtccag 180 ctgccgcagc aacgccgcgg tgtgcgggtg cgcccgctgc cggcgccctg atctgatcag 240 tcccggaacc ggcatgcgga tgaggaacag attcggcgat ggccccaaca ggatatcagc 300 ccagagtgga gcatggctgt gccgagagcg cacggcggag acttgccgga gcacaagtag 360 ccggtccggc cgctaccggc gcctgcagcc tgcagcggtc gccggaacac gacgcgccga 420 actcataaag cggctgcaag agctctgcca cccagcaaat aaccttccaa attgttctgc 480 ttcttggcaa ccacagcgac agcggcagaa aacaattgat cgaattccag atagcctaga 540 ttgtggggtg acaatggaaa ggggcaagaa caagcgtgat ggaagtgaca atgggctcat 600 cttctctaac ctaatgcacg gtgttgctgc cggcatctat gggtatcctc ctcaccaggg 660 atacactcag gctcagagct acctactgct gccggaagca tatccacctc ctccgtggac 720 ataccctctt tctagtgctt accctcctca acctgttggt tacccttcag gtggctaccc 780 tcctgcagtc tactctgact cgtatctgca ccaaggtagc agagttgcgc gggagcaatg 840 ccctctatca tattccaata atgctgtcac ttgcagggag gatgggcaaa tgaactgtga 900 aaatggaaca gtaaatatgg agaaaagtgc aatgtcctca aataagatgg ctactagtct 960 actaaagagt tgcggcaatg tgatgccatg cagaaatatg gagagaagtg gcccagccat 1020 gtataaggtg gacatgcgcg gcagtacgaa gcaattctct atgggcagca agatgatgat 1080 gtgtctgatt gtgtttggat gtctgatagc tgccttggat atgtttagaa atgttgcaca 1140 aaaacagatg ttttctgtcg ttagtttact ttcttttgta gtcgcgacct atgtctgcta 1200 ggagtctcta catgtaccgt aaaattgctc tttgtgtaat gtgtacttct tcatcctgta 1260 aaaatagaat cccaatcaaa ctatatatgg tttgtctgtc gggctttcaa tacaatctga 1320 gtgtcctctc tttacctttg t 1341 <210> 153 <211> 388 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 153 Met Ser Thr Thr Ser Ser Ser Lys Thr Ala Thr Cys Pro Leu Cys His 1 5 10 15 Ala Asp Val Leu Leu Pro Arg Arg Arg Ser Ala Gly Ser Ser Thr His 20 25 30 Arg Ser His Asp Leu Asp Asp Gly Pro Ala Pro Pro Ser Pro Glu Ser 35 40 45 Ser Cys Arg Ser Asn Ala Ala Val Cys Gly Cys Ala Arg Cys Arg Arg 50 55 60 Pro Asp Leu Ile Ser Pro Gly Thr Gly Met Arg Met Arg Asn Arg Phe 65 70 75 80 Gly Asp Gly Pro Asn Arg Ile Ser Ala Gln Ser Gly Ala Trp Leu Cys 85 90 95 Arg Glu Arg Thr Ala Glu Thr Cys Arg Ser Thr Ser Ser Arg Ser Gly 100 105 110 Arg Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ala Ala Val Ala Gly Thr Arg Arg Ala 115 120 125 Glu Leu Ile Lys Arg Leu Gln Glu Leu Cys His Pro Ala Asn Asn Leu 130 135 140 Pro Asn Cys Ser Ala Ser Trp Gln Pro Gln Arg Gln Arg Gln Lys Thr 145 150 155 160 Ile Asp Arg Ile Pro Asp Ser Leu Asp Cys Gly Val Thr Met Glu Arg 165 170 175 Gly Lys Asn Lys Arg Asp Gly Ser Asp Asn Gly Leu Ile Phe Ser Asn 180 185 190 Leu Met His Gly Val Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Tyr Pro Pro His Gln 195 200 205 Gly Tyr Thr Gln Ala Gln Ser Tyr Leu Leu Leu Pro Glu Ala Tyr Pro 210 215 220 Pro Pro Pro Trp Thr Tyr Pro Leu Ser Ser Ala Tyr Pro Pro Gln Pro 225 230 235 240 Val Gly Tyr Pro Ser Gly Gly Tyr Pro Pro Ala Val Tyr Ser Asp Ser 245 250 255 Tyr Leu His Gln Gly Ser Arg Val Ala Arg Glu Gln Cys Pro Leu Ser 260 265 270 Tyr Ser Asn Asn Ala Val Thr Cys Arg Glu Asp Gly Gln Met Asn Cys 275 280 285 Glu Asn Gly Thr Val Asn Met Glu Lys Ser Ala Met Ser Ser Asn Lys 290 295 300 Met Ala Thr Ser Leu Leu Lys Ser Cys Gly Asn Val Met Pro Cys Arg 305 310 315 320 Asn Met Glu Arg Ser Gly Pro Ala Met Tyr Lys Val Asp Met Arg Gly 325 330 335 Ser Thr Lys Gln Phe Ser Met Gly Ser Lys Met Met Met Cys Leu Ile 340 345 350 Val Phe Gly Cys Leu Ile Ala Ala Leu Asp Met Phe Arg Asn Val Ala 355 360 365 Gln Lys Gln Met Phe Ser Val Val Ser Leu Leu Ser Phe Val Val Ala 370 375 380 Thr Tyr Val Cys 385 <210> 154 <211> 1276 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 154 ataggtcaac ttgaatcttg ttcaaaaatt cttttcaagt cttaggtagg tcactgttgg 60 tgccaccttc ttgagaagtt tatgatctgc atgttcacct aagatatcca gtcaagtgct 120 aaaaaggtca caaaaatggg aggcagaaag gacaatcatg actcctcaaa tgccgacaaa 180 gggttccatg gagcgtatcc aagcggttac cctggtgcat atcccctaat gcaaggatac 240 cctaattcac ctggacaata tccgactccc ggtggatacc ctagtgcacc accgggacaa 300 tacccaccag ccggtgggta ccctggtgca caatatccac caagcggtta ccctccatca 360 caaggtgggt accctccagg agcgtatcca ccatcaggat atccacaaca accaggctac 420 ccgccagctg gttacccagg tcatggccat ggtccaccca tgcaaggagg tgggcatggt 480 gcaggcgcat ctggctatgg agcgctgctc gccggaggcg ccgcggtggc ggctgctgcg 540 gtgggagctc acatggtacg acccggcggc ggtggcggcc acgggatgtt cggccaccat 600 ggtggcaaat tcaagaaagg aaagttcaag catggcaagt acggcaagca caagaagttt 660 gggcgcaagt ggaagtgata agcaaactaa attgcactgc agtttgcctc cggtttcttg 720 tttggttgaa gtgctatagc atgatgggat taagtgtcca tttaccatat atatatatat 780 atattcatcg aaatataacc atacgagatc ttattttaaa gataattgta ataaatataa 840 tggtgtaatg gatcacaaat tagaaaaaag gtttaggaga aaaaacattt tgagcttgct 900 aacagaaaat taaacccacc ataagcaatc agaataggcc acatgtgaat ggctatatcc 960 ggttaaatcc gccgaatcca atcatcgaac tcttatttcc cacaaaccaa actcatccag 1020 cctcatgcac ctaactaatc acatccatcc ttagacgatg catgcgtgtg gacattcttg 1080 ccaaaaccaa caattagccg tgagagccca aacaactgag tactccagcc tacgattgtc 1140 aggatatttt ctcatctaac ttattctagt attaggagtt atgaagatat gaaaagccat 1200 tttagttcag aaaattgtac gataaatcat gtaacctgtt tctgaaatgg aaataaaata 1260 tgagaaaaag atacta 1276 <210> 155 <211> 180 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 155 Met Gly Gly Arg Lys Asp Asn His Asp Ser Ser Asn Ala Asp Lys Gly 1 5 10 15 Phe His Gly Ala Tyr Pro Ser Gly Tyr Pro Gly Ala Tyr Pro Leu Met 20 25 30 Gln Gly Tyr Pro Asn Ser Pro Gly Gln Tyr Pro Thr Pro Gly Gly Tyr 35 40 45 Pro Ser Ala Pro Pro Gly Gln Tyr Pro Pro Ala Gly Gly Tyr Pro Gly 50 55 60 Ala Gln Tyr Pro Pro Ser Gly Tyr Pro Pro Ser Gln Gly Gly Tyr Pro 65 70 75 80 Pro Gly Ala Tyr Pro Pro Ser Gly Tyr Pro Gln Gln Pro Gly Tyr Pro 85 90 95 Pro Ala Gly Tyr Pro Gly His Gly His Gly Pro Pro Met Gln Gly Gly 100 105 110 Gly His Gly Ala Gly Ala Ser Gly Tyr Gly Ala Leu Leu Ala Gly Gly 115 120 125 Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Val Gly Ala His Met Val Arg Pro Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Gly His Gly Met Phe Gly His His Gly Gly Lys Phe Lys 145 150 155 160 Lys Gly Lys Phe Lys His Gly Lys Tyr Gly Lys His Lys Lys Phe Gly 165 170 175 Arg Lys Trp Lys 180

Claims (49)

  1. 서열번호 2의 2-Cys PRX(2-Cysteine peroxiredoxin)를 암호화하는 핵산 서열을 식물 뿌리에 도입 및 발현하는 단계를 포함하는 대조구 식물에 비해 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 도입 및 발현은 T-DNA 활성화 태킹, TILLING, 또는 상동 재조합의 하나 이상에 의해 수행되는(effected) 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 향상된 수확량 관련 형질은 하기 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 향상된 초기 활력; (ii) 증가된 지상부 생물량(biomass); (iii) 증가된 뿌리 생물량(biomass); (iv) 원추화서당 증가된 꽃의 수; (v) 증가된 종자 충만율(fill rate); (vi) 식물체당 증가된 총 종자 수확량; (vii) 증가된 (충만된) 종자 수; (viii) 증가된 수확 지수; 또는 (ix) 증가된 천립당 중량 (TKW).
  10. 제1항에 있어서, 상기 향상된 수확량 관련 형질은 비생물적 스트레스 조건하에서 얻어진 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 비생물적 스트레스는 하나 이상의 수분 스트레스, 염 스트레스, 산화적 스트레스 및 이온 스트레스로부터 선택된 삼투 스트레스인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 비생물적 스트레스 내성은 하기 중 하나 이상으로부터 선택된 향상된 수확량 관련 형질로서 나타나는 것을 특징으로 하는 방법: 대조구 식물에 비해 각각 (i) 향상된 초기 활력; (ii) 증가된 지상부 생물량(biomass); (iii) 증가된 뿌리 (굵은 및 가는) 생물량(biomass); (iv) 원추화서당 증가된 꽃의 수; (v) 증가된 종자 충만율; (vi) 식물체당 증가된 총 종자 수확량; (vii) 증가된 (충만된) 종자 수; (viii) 증가된 수확 지수; 또는 (ix) 증가된 천립당 중량 (TKW).
  13. 제1항에 있어서, 상기 핵산 서열은 뿌리 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 삭제
  15. 뿌리 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된, 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 외래도입유전자(transgene)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항에 따른 방법에 의해 수득된 대조구 식물에 비해 수확량 관련 형질이 향상된 종자를 포함하는 식물 또는 식물의 일부.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 하기 단계를 포함하는 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 형질전환 식물의 제조 방법:
    (i) 뿌리 특이적 프로모터의 조절하에서 제1항에 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에 도입 및 발현하는 단계; 및
    (ii) 식물의 생장 및 발달을 촉진하는 조건 하에서 식물 세포를 배양하는 단계.
  20. 제19항에 있어서, 상기 향상된 수확량 관련 형질이 증가된 비생물적 스트레스 조건하에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항에 정의된 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 조절된 발현으로 인해, 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질을 가진 형질전환 식물, 또는 상기 형질전환 식물 유래의 형질전환 식물 세포 또는 식물의 일부.
  22. 제21항에 있어서, 상기 식물이 작물 식물 또는 단자엽 식물 또는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 기장, 호밀, 라이밀, 수수 및 귀리 같은 곡물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물, 또는 상기 형질전환 식물 유래의 형질전환 식물 세포 또는 식물의 일부.
  23. 제22항에 따른 2-Cys PRX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 식물의 종자.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
KR1020097026438A 2007-05-23 2008-05-23 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법 KR101255413B1 (ko)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07108768 2007-05-23
EP07108768.8 2007-05-23
US93222607P 2007-05-29 2007-05-29
US60/932,226 2007-05-29
EP07110086 2007-06-12
EP07110086.1 2007-06-12
US93799407P 2007-06-29 2007-06-29
US60/937,994 2007-06-29
PCT/EP2008/056381 WO2008142163A2 (en) 2007-05-23 2008-05-23 Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100035688A KR20100035688A (ko) 2010-04-06
KR101255413B1 true KR101255413B1 (ko) 2013-04-17

Family

ID=39735038

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097026438A KR101255413B1 (ko) 2007-05-23 2008-05-23 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법

Country Status (11)

Country Link
US (2) US8878006B2 (ko)
EP (2) EP2172556B1 (ko)
KR (1) KR101255413B1 (ko)
CN (2) CN101688214A (ko)
AR (1) AR066714A1 (ko)
AU (1) AU2008252852B2 (ko)
BR (1) BRPI0811185A2 (ko)
CA (1) CA2685848A1 (ko)
DE (1) DE112008001326T5 (ko)
MX (1) MX2009012451A (ko)
WO (1) WO2008142163A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11674148B2 (en) 2021-08-03 2023-06-13 Seoul National University R&Db Foundation OSNF-YA5 gene from Oryza sativa for increasing nitrogen availability of plant and uses thereof

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102811617A (zh) 2010-01-22 2012-12-05 拜耳知识产权有限责任公司 杀螨和/或杀虫活性物质结合物
EP2353387A1 (de) 2010-02-05 2011-08-10 Bayer CropScience AG Verwendung von Succinat-Dehydrogenase (SDH)-Inhibitoren in der Behandlung von Pflanzenarten der Familie der Süßgräser
EA201290937A1 (ru) * 2010-03-19 2013-06-28 Басф Плант Сайенс Компани Гмбх Растения с улучшенными характеристиками урожайности и способ их получения
KR101329224B1 (ko) * 2011-02-25 2013-11-13 경상대학교산학협력단 벼로부터 유래한 1 시스테인 퍼록시레독신 프로모터
CN102229662B (zh) * 2011-06-14 2013-02-20 中山大学 一种莲膜联蛋白及其表达载体和应用
CN103717076B (zh) 2011-08-10 2016-04-13 拜耳知识产权股份有限公司 含有特定特特拉姆酸衍生物的活性化合物组合物
KR101383377B1 (ko) * 2012-06-15 2014-04-10 대한민국 유전자를 이용하여 벼의 분얼과 뿌리생장을 조절하는 방법
JP2016514964A (ja) * 2013-03-14 2016-05-26 モンサント テクノロジー エルエルシー 植物調節エレメントおよびその使用
KR101700619B1 (ko) 2014-11-14 2017-01-31 대한민국 Ｈｏｘ２５ 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 과발현 벡터로 형질전환된 식물체
MX2018001408A (es) 2015-08-07 2018-03-15 Bayer Cropscience Nv Uso de anexina para para mejorar el rendimiento en condiciones de estres en plantas.
CN105132440B (zh) * 2015-09-23 2018-08-21 安徽农业大学 与小麦叶片叶绿素含量和粒重相关的基因、其Indel标记及应用
EP3494223B1 (en) * 2016-08-05 2023-02-15 Limagrain Europe Constructs and methods for controlling stomatal closure in plants
US11613762B2 (en) * 2017-08-25 2023-03-28 Université Catholique de Louvain Plants with modified lipid metabolism and methods for making the same
US11720638B2 (en) 2019-05-30 2023-08-08 Onlineseedsales Llc Embryonic plant listing system
CN112813072A (zh) * 2021-02-02 2021-05-18 河北师范大学 一种膜联蛋白基因在植物水分胁迫中的应用
CN112680457A (zh) * 2021-02-02 2021-04-20 河北师范大学 一种膜联蛋白基因在植物热胁迫中的应用
CN114605514B (zh) * 2022-03-31 2023-06-13 河北师范大学 蛋白质VvANN1在提高植物抗旱性中的应用
CN116724877B (zh) * 2023-04-27 2024-06-21 广西壮族自治区农业科学院 一种保持巴马火麻雌雄异株群体纯合的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005116082A1 (en) 2004-05-27 2005-12-08 Industry-Academic Cooperation Foundation Gyeong Sang National University 2-cysteine peroxiredoxin complex exhibiting function acting as molecular chaperone and uses thereof

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
AU3756889A (en) 1988-06-01 1990-01-05 The Texas A & M University System Method for transforming plants via the shoot apex
AU4115693A (en) 1992-04-24 1993-11-29 Sri International In vivo homologous sequence targeting in eukaryotic cells
WO1994012015A1 (en) 1992-11-30 1994-06-09 Chua Nam Hai Expression motifs that confer tissue- and developmental-specific expression in plants
AU687961B2 (en) 1993-11-19 1998-03-05 Biotechnology Research And Development Corporation Chimeric regulatory regions and gene cassettes for expression of genes in plants
EP0733059B1 (en) 1993-12-09 2000-09-13 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6395547B1 (en) 1994-02-17 2002-05-28 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
GB9703146D0 (en) 1997-02-14 1997-04-02 Innes John Centre Innov Ltd Methods and means for gene silencing in transgenic plants
GB9720148D0 (en) 1997-09-22 1997-11-26 Innes John Centre Innov Ltd Gene silencing materials and methods
JP2004527201A (ja) * 1998-04-09 2004-09-09 アリゾナ ボード オブ リーゼンツ アルフィン１の発現、ならびに根の生長および根の特定の遺伝子活性化の増大したトランスジェニック植物を生産する方法
US6555732B1 (en) 1998-09-14 2003-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Rac-like genes and methods of use
CA2366104C (en) 1999-07-22 2010-07-06 Japan As Represented By Director General Of National Institute Of Agrobiological Resources, Ministry Of Agriculture, Forestry And Fisheries Ultra-fast transformation technique for monocotyledons
AU780117B2 (en) 1999-08-26 2005-03-03 Basf Plant Science Gmbh Plant gene expression, controlled by constitutive plant V-ATpase promoters
WO2001064928A2 (en) * 2000-03-01 2001-09-07 Research & Development Institute, Inc. Transgenic plants with increased seed yield, biomass and harvest index
ATE357517T1 (de) * 2000-08-01 2007-04-15 Temasek Life Sciences Lab Ltd Isolierung und charakterisierung eines fiber- spezifischen ss-tubulin-promoters aus baumwolle
AUPR221300A0 (en) 2000-12-20 2001-01-25 Malaysian Palm Oil Board A molecular marker
WO2004013304A2 (en) * 2002-08-02 2004-02-12 Basf Plant Science Gmbh Sugar and lipid metabolism regulators in plants iv
EP1433854A1 (fr) * 2002-12-23 2004-06-30 Universite Libre De Bruxelles Plante génétiquement modifiée présentant une floraison accélérée
WO2004065596A2 (en) 2003-01-21 2004-08-05 Cropdesign N.V. Use of the regulatory sequence of the rice gos2 gene for the gene expression in dicotyledonous plants or plant cells
DE602004006477T2 (de) 2003-02-04 2008-02-14 Cropdesign N.V. Promotor aus reis
JP2004283028A (ja) 2003-03-19 2004-10-14 Japan Science & Technology Agency 植物における活性窒素ストレスの抑制方法
US20060143729A1 (en) * 2004-06-30 2006-06-29 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and polypeptides encoded thereby useful for modifying plant characteristics
EP2302062A1 (en) * 2003-10-20 2011-03-30 CropDesign N.V. Identification of E2F target genes and uses thereof
KR20030086551A (ko) 2003-10-22 2003-11-10 금호석유화학 주식회사 식물로부터의 아넥신을 인코드하는 핵산 분자

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005116082A1 (en) 2004-05-27 2005-12-08 Industry-Academic Cooperation Foundation Gyeong Sang National University 2-cysteine peroxiredoxin complex exhibiting function acting as molecular chaperone and uses thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11674148B2 (en) 2021-08-03 2023-06-13 Seoul National University R&Db Foundation OSNF-YA5 gene from Oryza sativa for increasing nitrogen availability of plant and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CN105112441A (zh) 2015-12-02
MX2009012451A (es) 2009-12-02
EP2172556A2 (en) 2010-04-07
KR20100035688A (ko) 2010-04-06
EP2069508A2 (en) 2009-06-17
BRPI0811185A2 (pt) 2014-10-07
AU2008252852A1 (en) 2008-11-27
DE112008001326T5 (de) 2010-07-01
CN101688214A (zh) 2010-03-31
AU2008252852B2 (en) 2014-08-07
EP2172556B1 (en) 2015-07-22
CA2685848A1 (en) 2008-11-27
US20100170011A1 (en) 2010-07-01
US8878006B2 (en) 2014-11-04
WO2008142163A3 (en) 2009-02-26
EP2172556A3 (en) 2010-06-23
WO2008142163A2 (en) 2008-11-27
US20150033412A1 (en) 2015-01-29
AR066714A1 (es) 2009-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101255413B1 (ko) 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법
US9617557B2 (en) Plants having increased yield-related traits by expressing a growth-regulating factor (GRF) polypeptide and method for making the same
KR101255415B1 (ko) 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법
EP2193203B1 (en) Plants having increased yield-related traits and a method for making the same
US8697948B2 (en) Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same
KR101754083B1 (ko) 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법
AU2009209600B2 (en) Plants having increased yield-related traits and a method for making the same
KR101269929B1 (ko) 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법
US9175303B2 (en) Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same
MX2011001475A (es) Plantas que tienen rasgos mejorados relacionados con el rendimiento y un metodo para obtenerlas.
US20090019606A1 (en) Plants Having Increased Yield And A Method For Making The Same
MX2011002028A (es) Plantas que tienen rasgos relacionados con rendimiento mejoradas y un metodo para producirlas.
MX2011006178A (es) Plantas que tienen mejores rasgos relacionados con el rendimiento y/o mejor tolerancia al estres abiotico y un metodo para producirlas.
US20130019347A1 (en) Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same
EP2225378B1 (en) Plants having increased yield-related traits and a method for making the same
US20130025002A1 (en) Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160308

Year of fee payment: 4

LAPS Lapse due to unpaid annual fee