CN112680457A - 一种膜联蛋白基因在植物热胁迫中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种膜联蛋白基因在植物热胁迫中的应用，属于植物抗逆技术领域。探究了其在植物热胁迫中的作用，为进一步研究膜联蛋白基因的作用提供了基础。

Description

一种膜联蛋白基因在植物热胁迫中的应用

技术领域

本发明属于植物抗逆技术领域，具体涉及膜联蛋白在植物热胁迫中的应用。

背景技术

膜联蛋白，英文名Annexin：膜联蛋白是一类同源的水溶性多功能蛋白，可以在依赖和不依赖Ca2+的环境下与内膜和质膜结合或形成跨膜结构，存在于部分原核生物以及全部的真核生物中，在大多数高等生物中以多基因家族形式存在。Annexin基因具有4个重复序列，每一个重复序列编码70-75个氨基酸。第一和第四个重复序列较为保守，其中存在钙结合位点(KGD区域)。第二和第三个重复序列保守性较低，大多缺乏钙结合位点，因其存在可被磷酸化的丝氨酸/苏氨酸位点及14-3-3蛋白识别位点，故第二和第三个重复序列被认为是蛋白功能调控区。

在功能上Annexin本身具有酶活性，如核苷酸磷酸二酯酶活性和过氧化物酶活性，参与催化细胞内代谢反应，也可能参与信号传递。研究发现，某些膜联蛋白Annexin参与植物的抗热胁迫过程，但是现有技术中并没有明确的文献和相关报道对该膜联蛋白Annexin参与植物热胁迫时该蛋白表达时会为植物带来哪些表型的改观及其信号途径进行过验证。

因此，如何利用膜联蛋白的抗热性能提高植物的抗热性是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明公开了一种膜联蛋白基因在植物热胁迫中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种膜联蛋白基因在植物热胁迫中的应用，所述膜联蛋白基因为AtAnn1，C DS序列如SEQ ID NO.1所示；

作为本发明优选的技术方案，所述膜联蛋白的基因编号为AT1G35720；

作为本发明优选的技术方案，在热胁迫下，所述膜联蛋白基因能提高幼苗的存活率；

作为本发明优选的技术方案，在热胁迫下，所述膜联蛋白基因能提高侧根的长度生长和数目生长。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了膜联蛋白基因在植物热胁迫中的应用。

附图说明

图1：为不同温度相同时间热胁迫后的Atann1突变体、恢复株系和野生型幼苗恢复生长5天后的生长状态；

图2：为相同温度(45℃)不同时间热胁迫后的Atann1突变体、恢复株系和野生型幼苗恢复生长5天后的生长状态；

图3：热胁迫下Atann1突变体、恢复株系和野生型幼苗的存活率；图A显示22、37、42、45、48、50℃处理条件下拟南芥幼苗的存活率；图B为45℃处理0、30、60、90、120min拟南芥幼苗的存活率；图C为45℃处理90min后处理组与对照组的比值统计结果；

图4：热胁迫后Atann1突变体、恢复株系和野生型根系的生长图片；

图5：热胁迫下Atann1相关突变体、恢复株系和野生型幼苗的主根长度；图A-C显示22、37、40℃处理1h拟南芥幼苗主根长度随时间变化的过程；图D为不同温度条件下处理5天后幼苗主根根长的统计结果；图E为37℃1h处理5天后处理组与对照组的比值统计结果；

图6：热胁迫下Atann1突变体、恢复株系和野生型侧根长度变化；图A-C显示22、37、40℃处理1h拟南芥幼苗侧根平均长度随时间变化的过程；图D为不同温度条件下处理5天后幼苗侧根平均长度的统计结果；图E为37℃1h处理5天后处理组与对照组的比值统计结果；

图7：热胁迫下Atann1突变体、恢复株系和野生型侧根数目变化；图A-C分别显示22、37、40℃处理1h拟南芥幼苗侧根数目随时间变化的过程；图D为不同温度条件下处理5天后幼苗侧根数目的统计结果；图E为37℃1h处理5天后处理组与对照组的比值统计结果；

图8：为本发明提供的AtAnn1的基因模式图；

图9：为本发明提供的纯合Atann1突变体和野生型Col-0的DNA水平鉴定扩增结果图；

图10：为本发明提供的对Col-0、Atann1和AtANN1/Atann1株系RNA水平鉴定扩增的结果图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

野生型Col-0为实验室继代繁殖；Atann1突变体购自Arabidopsis Biologica lResource Center(ABRC)，基因编号AT1G35720；恢复株系AtANN1/Atann1为自构建。

恢复株系AtANN1/Atann1的构建方法：

我们从拟南芥突变体库Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)购买了拟南芥Atann1缺失突变体材料(SALK_015426)，并成功克隆了AtAnn1基因，转化Atann1缺失突变体，构建恢复株系AtANN1/Atann1。

本申请对拟南芥膜联蛋白基因AtAnn1，进行了热胁迫相关实验。

实验所用材料鉴定

AtAnn1的基因模式图

AtAnn1基因由3个外显子2个内含子组成，Atann1(SALK_015426)突变体T-DNA插入在第3个外显子上，插入位点是第1192个碱基处(图8)。三角形表示T-DNA插入位点，黑色方框表示外显子，灰线表示内含子，黑线表示3’和5’端非编码区。

AtAnn1基因CDS序列为：

AtAnn1纯合突变体的鉴定

Atann1 DNA水平的鉴定

图9中M为DNA Marker，1为野生型Col-0，2为突变体Atann1，3为恢复株系AtANN1/Atann1，4为H₂O。在纯合Atann1中，用引物LP和RP扩不出条带，而用引物LBb1.3和RP则能扩出0.8Kb片段代表T-DNA插入，野生型C ol-0中用引物LP和RP扩出1.2Kb代表AtAnn1的片段(图9)；PCR鉴定结果表明Atann1是纯合突变体。

鉴定Atann1基因的T-DNA插入纯合突变体所用引物序列如下：

AtAnn1 RNA水平的鉴定

实验所用模板来源于播种后在光照培养箱中培养10天的幼苗全株提取RN A。PCR的反应体系为20μL，ACTIN做为参照扩增25个循环，AtAnn1扩增30个循环。

Col-0、Atann1和AtANN1/Atann1的ACTIN条带清晰一致，但Col-0和恢复株系AtANN1/Atann1中存在AtAnn1基因转录本，Atann1突变体中没有AtAnn1基因的转录本(图10)，说明Atann1突变体中的AtAnn1基因由于T-DNA的插入而被敲除，鉴定出来的Atann1突变体在RNA水平为纯合突变体。

鉴定AtAnn1基因转录本所用引物序列如下：

实施例1：AtAnn1在幼苗耐受热胁迫过程中的作用

为了探究AtAnn1基因在幼苗耐受热激胁迫中的过程中是否发挥作用，我们将Col-0、Atann1和AtANN1/Atann1三个材料种子播种在1/2MS培养基中22℃光照培养7天后进行37、42、45、48、50℃各30min热激处理，光照培养箱恢复生长5天后拍照，结果如图1所示；并计存活率结果如图3所示，发现当热激温度达到45℃以上时幼苗全部死亡。

所以我们进一步采用45℃进行不同时间点的处理：1/2MS培养基中22℃光照培养7天后进行45℃热激处理30、60、90、120min，光照培养箱恢复生长5天后拍照，结果如图2所示；并计存活率结果如图3所示。

发现随着处理时间的延长，幼苗的存活率不断降低。光照配养箱恢复生长5天后，非处理条件下，Col-0、Atann1和AtANN1/Atann1的存活率为100％。45℃处理30min，三个材料的存活率为100％，而48，50℃处理30min后三个材料的存活率为零(图3A)。45℃处理60min时三个材料的存活率分别为88.00±1.27％、88.00±2.92％和85.00±1.73％。45℃处理90min时三个材料的存活率分别为9.44±1.73％、2.22±0.83％和5.00±0.48％，差异显著(P<0.05)。120min三个材料全部死亡存活率为零(图3B)。为了消除样品的本身差异，我们用处理组(45℃处理90min)的数据除以对照组数据，求取每一个材料热胁迫下幼苗存活率的变化率，结果显示存Col-0的存活率是Atann1的2.8倍，差异显著(P<0.05)，AtANN1/Atann1的存活率是Atann1的1.6倍，差异不显著(P>0.05)(图3C)。

实施例2：AtAnn1在热胁迫下对根系生长发育的影响

为了探究AtAnn1幼苗对根系耐受热胁迫过程中所起的作用，我们用Col-0、Atann1和AtANN1/Atann1三个材料的种子在1/2MS培养基中生长4天，37℃和45℃下处理1h，随后转移到1/2MS培养基中，22℃光照培养4天后拍照，结果如图4所示；并记录了幼苗的主根长(结果如图5所示)和侧根数目和平均长度(结果如图6所示)。

AtAnn1未参与热胁迫下主根的生长过程：

将Col-0、Atann1和AtANN1/Atann1三个材料，在1/2MS培养基中培养5天的幼苗进行22、37、40℃热胁迫处理1h，热处理后连续记录后幼苗主根根长度，热处理后对于幼苗主根生长未产生显著抑制作用，随着培养天数的增加Co l-0、Atann1和AtANN1/Atann1三个材料的主根长度不断增加。热激处理，随着热激温度的升高，Col-0、Atann1和AtANN1/Atann1三个材料的主根长度受到抑制的程度增加，但三个材料之间差异不明显。在非处理条件下，第3天三个材料的主根长度达到20mm，第4天达到25mm。第5天，三个材料的主根长度分别为34.03±0.98mm、32.33±0.98mm和32.25±1.38mm(图5A)。37℃处理1h，移苗后第3天，三个材料的主根长度分别为20.39±0.92mm、20.28±0.34mm和20.04±0.67mm。第4天，三个材料的主根长度分别为25.98±0.85mm、25.29±0.37mm和25.93±0.75mm。第5天，三个材料的主根长度分别为34.03±0.98mm、32.33±0.66mm和32.25±1.38mm(图5B)。40℃处理1h，移苗后第3天，三个材料的主根长度分别为21.56±0.71mm、19.77±0.87mm和21.25±0.37mm。第4天，三个材料的主根长度分别为25.82±0.20mm、23.36±1.73mm和25.84±0.73。第5天，三个材料的主根长度分别为30.73±0.09mm、28.39±2.01mm和31.76±0.81mm(图5C)。移苗后第5天，在37℃处理1h下，Col-0、Atann1和AtANN1/Atann1的主根长度略高于非处理组和40℃处理1h，(图5D)，差异不显著(P>0.05)。为了消除样品的本身差异，我们用处理组(37℃处理1h)的数据除以对照组数据，求取每一个材料热胁迫下主根长度的变化率，结果显示Col-0、Atann1和AtANN1/Atann1的主根长度无明显差异(P>0.05)(图5E)。

AtAnn1参与热胁迫下侧根的发生过程：

将Col-0、Atann1和AtANN1/Atann1三个材料，在1/2MS培养基中培养5天的幼苗进行22、37、40℃热胁迫处理1h，热处理后连续记录后幼苗侧根长度，移苗后随着培养天数的增加，Col-0、Atann1和AtANN1/Atann1三个材料的侧根平均长度再不断增加。当热激处理后，与对照组相比随着处理时间的加长，低温促进Col-0、和AtANN1/Atann1的侧根生长高温抑制其生长，而Atann1则是相反，在移苗后第3天，三个材料的侧根平均长度不到2mm。第4天，三个材料的侧根平均长度分别为2.77±0.38mm、27±0.65mm和0.95±0.52mm。第5天，三个材料的侧根平均长度分别为3.88±0.26mm、3.31±0.44mm和3.42±0.50mm(图6A)。37℃处理1h，在移苗后第3天，Col-0、AtANN1/Atann1的侧根平均长度低于2mm，而Atann1为0。第4天，三个材料的侧根平均长度分别为3.16±0.03mm、0.26±0.18mm和2.31±0.20mm。第5天，三个材料的侧根平均长度分别为7.01±1.23mm、1.21±0.06mm和4.04±0.17mm(图6B)。40℃处理1h，在移苗后第3天，三个材料的侧根平均长度低于2mm。第4天，三个材料的侧根平均长度分别为0.27±0.19、1.67±1.18和1.57±0.27mm。第5天，三个材料的侧根平均长度分别为1.26±0.03mm、2.18±1.54mm和2.65±0.52mm(图6C)。37℃处理1h，恢复生长5天后Col-0和AtANN1/Atann1的侧根平均长度高于Atann1，差异显著(P<0.05)。40℃处理1h，恢复生长5天后，三个材料的侧根平均长度对热处理的反应无明显差异(图6D)。为了消除样品的本身差异，我们用处理组(37℃处理1h)的数据除以对照组数据，求取每一个材料在热胁迫下侧根平均长度的变化率，显示Col-0的侧根平均长度是Atann1的5倍，AtANN1/Atann1的侧根平均长度是Atann1的3.2倍，差异显著(P<0.05)(图6E)。

将Col-0、Atann1和AtANN1/Atann1三个材料，在1/2MS培养基中培养5天的幼苗进行22、37、40℃热胁迫处理1h，热处理后连续记录后幼苗侧根数目，非处理条件下，在移苗后第3天，三个材料的侧根数目低于0.5。第4天，三个材料的平均侧根数目分别为0.41±0.07、0.625±0.10和1.29±0.35。第5天，三个材料的平均侧根数目分别为0.79±0.07、1.125±0.10和1.54±0.53(图7A)。37℃处理1h，在移苗后第3、4天Col-0和AtANN1/Atann1的侧根数目低于0.5，Atann1的侧根数目为0。第5天，三个材料的侧根数目分别为0.5±0.001、0.06±0.04和0.43±0.04(图7B)。40℃处理1h，在移苗后第3、4、5天，三个材料的侧根数目低于0.2(图7C)。移苗后第5天，随着热处理时间的增加，三个材料的侧根数目不断降低，在37℃处理1h下，Col-0和AtANN1/Atann1的侧根数目高于Atann1(图7D)。为了消除样品的本身差异，我们用处理组(37℃处理1h)比对照组，比值显示Col-0的侧根数目是Atann1的12.6倍，AtANN1/Atann1的侧根数目是Atann1的5.6倍，差异显著(P<0.05)(图7E)。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 河北师范大学

河北省科学院地理科学研究所

<120> 一种膜联蛋白基因在植物热胁迫中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 954

<212> DNA

<213> CDS(编码序列)

<400> 1

atggcgactc ttaaggtttc tgattctgtt cctgctcctt ctgatgatgc tgagcaattg 60

agaaccgctt ttgaaggatg gggtacgaac gaggacttga tcatatcaat cttggctcac 120

agaagtgctg aacagaggaa agtcatcagg caagcatacc acgaaaccta cggcgaagac 180

cttctcaaga ctcttgacaa ggagctctct aacgatttcg agagagctat cttgttgtgg 240

actcttgaac ccggtgagcg tgatgcttta ttggctaatg aagctacaaa aagatggact 300

tcaagcaacc aagttcttat ggaagttgct tgcacaagga catcaacgca gctgcttcac 360

gctaggcaag cttaccatgc tcgctacaag aagtctcttg aagaggacgt tgctcaccac 420

actaccggtg acttcagaaa gcttttggtt tctcttgtta cctcatacag gtacgaagga 480

gatgaagtga acatgacatt ggctaagcaa gaagctaagc tggtccatga gaaaatcaag 540

gacaagcact acaatgatga ggatgttatt agaatcttgt ccacaagaag caaagctcag 600

atcaatgcta cttttaaccg ttaccaagat gatcatggcg aggaaattct caagagtctt 660

gaggaaggag atgatgatga caagttcctt gcacttttga ggtcaaccat tcagtgcttg 720

acaagaccag agctttactt tgtcgatgtt cttcgttcag caatcaacaa aactggaact 780

gatgaaggag cactcactag aattgtgacc acaagagctg agattgactt gaaggtcatt 840

ggagaggagt accagcgcag gaacagcatt cctttggaga aagctattac caaagacact 900

cgtggagatt acgagaagat gctcgtcgca cttctcggtg aagatgatgc ttaa 954

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgagcgtgat gctttattgg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgctccttca tcagttccag 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attttgccga tttcggaac 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcttaatcaa tcaatcctcc 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcaaaacac acaacagaaa c 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggcacctct taaccctaaa gc 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggacaacgga atctctcagc 20

Claims (3)

1.一种膜联蛋白基因在植物热胁迫中的应用，其特征在于，所述膜联蛋白基因为AtAnn1，CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种膜联蛋白基因在植物热胁迫中的应用，其特征在于，在热胁迫下，所述膜联蛋白基因能提高幼苗的存活率。

3.根据权利要求1所述的一种膜联蛋白基因在植物热胁迫中的应用，其特征在于，在热胁迫下，所述膜联蛋白基因能提高侧根的长度生长和数目生长。

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