CN117210488B - 拟南芥AtFLZ13基因在植物抗高温育种中的应用 - Google Patents
拟南芥AtFLZ13基因在植物抗高温育种中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117210488B CN117210488B CN202311321471.8A CN202311321471A CN117210488B CN 117210488 B CN117210488 B CN 117210488B CN 202311321471 A CN202311321471 A CN 202311321471A CN 117210488 B CN117210488 B CN 117210488B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- atflz13
- gene
- high temperature
- seq
- rice
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 81
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 title claims abstract description 73
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 title claims abstract description 29
- 238000009395 breeding Methods 0.000 title abstract description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 title abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 15
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims abstract description 3
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims description 32
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 29
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 28
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 13
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 10
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020005089 Plant RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 2
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 2
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002635 electroconvulsive therapy Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 101500006437 Arabidopsis thaliana Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 240000008467 Oryza sativa Japonica Group Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101150014818 UBQ10 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 230000004034 genetic regulation Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000012256 transgenic experiment Methods 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Abstract
本发明公开了拟南芥AtFLZ13基因在调控植物抗高温和/或培育抗高温植物品种中的应用，属于基因工程技术领域。AtFLZ13基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1所示序列完全互补配对，或为编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。本发明通过过量表达AtFLZ13可以提高植物对高温胁迫的抗性，可应用于植物遗传工程育种，为植物抗高温新种质的创制或改良提供新的方法。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及拟南芥AtFLZ13基因在植物抗高温育种中的应用。
背景技术
近年来，由于全球气候变暖，高温已经成为全球关注的热点问题之一。高温热害已经成为世界范围内主要灾害之一，在多国家多地区频繁发生。高温胁迫严重影响经济作物的正常生长发育、产量和品质，例如光合效率下降，生命周期缩短，生产力下降等，导致农作物大面积减产。培育优良的抗高温作物品种是解决抗高温问题的重要途径。植物抗高温胁迫的遗传调控网络错综复杂，不同遗传背景的植物的分子调控机制差异较大，因此发掘和克隆研究更多新的，且在不同遗传背景中具有调控植物抗高温胁迫功能的基因，以及开发新的培育植物抗高温植物品种的方法，仍是亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种拟南芥AtFLZ13基因在调控植物抗高温和/或培育抗高温植物品种中的应用。
本发明通过转基因实验和表型分析验证了拟南芥AtFLZ13基因对于拟南芥和水稻抗高温的调控作用，AtFLZ13基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1所示序列完全互补配对，或为编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。该基因有望应用于植物的遗传工程育种，为植物耐高温新种质的创制或改良提供理论基础。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述核苷酸序列的碱基进行修改，也属于本发明的保护范围。
一方面，本发明提供一种拟南芥AtFLZ13基因在调控植物抗高温中的应用，AtFLZ13基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1所示序列完全互补配对，或为编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。
进一步地，所述调控植物抗高温为通过过量表达AtFLZ13基因提高植物对高温的抗性。
优选方案中，本发明通过过量表达AtFLZ13基因提高单子叶植物对高温的抗性。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13基因提高禾本科植物对高温的抗性。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13基因提高稻亚科植物对高温的抗性。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13基因提高稻属植物对高温的抗性。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13基因提高水稻对高温的抗性。
在另一优选方案中，本发明通过过量表达AtFLZ13基因提高双子叶植物对高温的抗性。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13基因提高十字花科植物对高温的抗性。
另一方面，本发明提供一种拟南芥AtFLZ13基因编码的蛋白在调控植物抗高温能力中的应用，AtFLZ13蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述调控植物对高温抗性为通过过量表达AtFLZ13基因编码的蛋白提高植物对高温的抗性。
优选方案中，本发明通过过量表达AtFLZ13蛋白提高单子叶植物对高温的抗性。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13蛋白提高禾本科植物对高温的抗性。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13蛋白提高稻亚科植物对高温的抗性。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13蛋白提高稻属植物对高温的抗性。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13蛋白提高水稻对高温的抗性。
在另一优选方案中，本发明通过过量表达AtFLZ13蛋白提高双子叶植物对高温的抗性。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13蛋白提高十字花科植物对高温的抗性。
另一方面，本发明提供一种拟南芥AtFLZ13基因在培育抗高温植物品种中的应用,AtFLZ13基因序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示序列完全互补配对的核苷酸序列，或为编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。
进一步的，所述培育抗高温植物品种为通过过量表达AtFLZ13基因培育抗高温植物品种。
优选方案中，本发明通过过量表达AtFLZ13基因培育抗高温的单子叶植物品种。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13基因培育抗高温的禾本科植物品种。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13基因培育抗高温的稻亚科植物品种。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13基因培育抗高温的稻属植物品种。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13基因培育抗高温水稻品种。
在另一优选方案中，本发明通过过量表达AtFLZ13基因培育抗高温的双子叶植物品种。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13基因培育抗高温的十字花科植物。
另一方面，本发明提供一种拟南芥AtFLZ13基因编码的蛋白在培育抗高温植物品种中的应用,AtFLZ13基因序列为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示序列完全互补配对的核苷酸序列，或为编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。
进一步的，所述培育抗高温植物品种为通过过量表达AtFLZ13蛋白培育抗高温的植物品种。
优选方案中，本发明通过过量表达AtFLZ13蛋白培育抗高温的单子叶植物品种。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13蛋白培育抗高温的禾本科植物品种。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13蛋白培育抗高温的稻亚科植物品种。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13蛋白培育抗高温的稻属植物品种。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13蛋白培育抗高温水稻品种。
在另一优选方案中，本发明通过过量表达AtFLZ13蛋白培育抗高温的双子叶植物品种。
进一步地，本发明通过过量表达AtFLZ13蛋白培育抗高温十字花科植物品种。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1)本发明提供了一种的新的调控植物抗高温性和/或培育抗高温植物品种的方法，即通过过量表达AtFLZ13基因或其编码的蛋白提高植物对高温的抗性进行调控和/或获得抗高温植的物品种。
2)本发明提供的新的调控植物对高温的抗性和/或培育抗高温植物品种的方法可用于不同遗传背景的植物。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明用于调控植物对高温的抗性和/或培育抗高温植物品种的方法及其有益效果进行详细说明。
图1所示为AtFLZ13过量表达载体表达框示意图；
图2所示为转基因拟南芥中AtFLZ13基因表达分析；
其中，Col-0表示哥伦比亚型拟南芥；OE#1和OE#4表示过表达植株。
图3所示为AtFLZ13转基因和Col-0植株高温处理表型；
其中，Col-0表示哥伦比亚型拟南芥；OE#1、OE#4表示过表达植株。
图4所示为转基因水稻中AtFLZ13基因表达分析；
其中，Nip表示日本晴；OE#3和OE#6表示过表达植株。
图5所示为AtFLZ13转基因和Nip植株高温处理表型；
其中，Nip表示日本晴；OE#3、OE#6表示过表达植株。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本申请所使用的所有技术和科技术语具有本申请所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。
实施例中拟南芥AtFLZ13基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
ATGATACTAAGCAAGAGACCTCATCTAATGATCCGTAAATTGTCTGAGATGTTGGTTCCAAGAAGCAGATCTGCTGCTATTAAACCGGAGGAGTACACGGCCAGTCCGAGAAGTCCGTTGGATTTGAACTTCCCCTCCCCGGTTCACTCGAAGCGGTTCGGTTCTGGTGGTGTCGGTTTGGGTATTGTTGCTGCGTTGGAGGAAACTAGCAACGGGATTAACCGGCATGATCCGGTTCGTTACTCCGGGAGATTCAGGTGCCCGGAGATTGATCTGTCGGATGAGGAATACACTTATGTTACGAGCCCAAACGGGCCGACCAAAGTGTATTACAACGACGACGGGTTTGAATTGTCTGAAAATGATTATCGGAGAGTTCATAAACCGATGGTTACCGTCGATGAACCACCGGTTATTGAAAGACAGAGTGTTAGGGGTCCAACAGAGTTTCTGAGTTCGTGTTGCTTGTGTAAGAAGAAACTTCAAGGCAAAGACATATACATGTACAAAGGAGAGATGGGATTTTGTAGTGCCGAATGCAGATCAGTGCAAATAATGAATGACGAACGACAAGAGCAATGTAAAACGCAAGTTTCAAGAAACGCCGACGTTTTGAGCTCTCCTTACGCCGCCGGACAGAGATTATCTGCCGGAGTATTCGTATTTTAG。
拟南芥AtFLZ13蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
MILSKRPHLMIRKLSEMLVPRSRSAAIKPEEYTASPRSPLDLNFPSPVHSKRFGSGGVGLGIVAALEETSNGINR HDPVRYSGRFRCPEIDLSDEEYTYVTSPNGPTKVYYNDDGFELSENDYRRVHKPMVTVDEPPVIERQSVRGPTEFLSSCC LCKKKLQGKDIYMYKGEMGFCSAECRSVQIMNDERQEQCKTQVSRNADVLSSPYAAGQRLSAGVFVF。
实施例1
拟南芥AtFLZ13基因过量表达载体的构建
取在1/2MS固体培养基上萌发并生长7天大小的拟南芥幼苗0.5g，并使用植物RNA提取试剂盒(Magen公司)提取总RNA，然后进行目的基因的扩增，具体实验如下：
取1μg高质量(OD260/OD280:1.8-2.0；OD260/OD230≈2.0)的RNA进行反转录(诺唯赞公司反转录试剂盒)获得第一链cDNA。以cDNA为模板，使用KOD FX高保真酶(ToYoBo公司)进行PCR扩增。反应体系为：2×PCR buffer 10μL,2mM dNTPs 2μL，F引物(5’-CTGATTAACAGGGATCCCCCATGATACTAAGCAAGAGACCTC-3’)0.5μL，R引物(5’-TCGAGACTAGTGGTACCCCCAAATACGAATACTCCGGCAGAT-3’)0.5μL，cDNA模板1μL，KOD FX(1U/μl)0.4μL，加水补足至20μL。反应条件为：98℃5min；98℃15sec，56℃30sec，68℃30sec，35个循环；68℃5min。反应结束后，胶回收试剂盒(Magen公司)回收PCR产物。
用限制性内切酶SmaⅠ(NEB公司)对pCAMBIA1300-GFP载体(由pCAMBIA1300载体改造而来，含有拟南芥Ubiquitin 10启动子和GFP标签)进行线性化处理，酶切体系为：载体2μg，SmaI内切酶2μL，10×rCutSmart buffer 10μL，补足水至100μL。酶切条件为：25℃，2小时。载体酶切产物和PCR产物经过纯化回收后，使用NanoDrop 2000测定DNA浓度，使用重组试剂盒(诺唯赞公司)进行重组，重组体系为：目的片段：14ng，载体片段：130ng，5×buffer2μL，Exnase II 1μL，加水补足至10μL。重组条件为：37℃，30min。取全部产物，加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态中，转化产物涂布于LB固体培养基(含有卡那霉素抗性，卡那霉素的浓度为50mg/L)。37℃培养过夜，挑4个单克隆进行菌落PCR鉴定。选择2个阳性克隆进行测序，得到含有AtFLZ13基因序列的阳性克隆，最终获得含有AtFLZ13目的基因的过量表达载体(图1)。
AtFLZ13转基因拟南芥的获得和鉴定
采用农杆菌GV3101介导的遗传转化方法，将实施例1中构建的过量表达载体，通过浸花法转入哥伦比亚0(Col-0)拟南芥中。实验方法参考文献：农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究；张赵一淳；农家科技,2017年，第9期。
收获浸花后的拟南芥种子，使用2％次氯酸钠表面消毒后，播种在含有25μg/L潮霉素的1/2MS固体平板上，筛选出具有抗性的苗子(根长且可以长出真叶)，认定为转基因阳性苗。将10株阳性的T1代转基因苗进行繁种得到T2代。将T2代种子使用含有潮霉素的培养基发芽，如果种子能全部正常生长，则证明该株系为纯合株。挑选2个转基因株系(OE#1和OE#4)进行qRT-RCR检测，并进行后续试验及分析。
其中qRT-RCR鉴定AtFLZ13基因在转基因拟南芥中过表达效果过程如下：
1、植物RNA提取试剂盒(Magen公司)提取7天大小的拟南芥幼苗总RNA，取1μg高质量(OD260/OD280:1.8-2.0；OD260/OD230≈2.0)的RNA进行反转录(诺唯赞公司反转录试剂盒)获得第一链cDNA。
2、以上述步骤1中的cDNA为模板，通过AtFLZ13-qF(ATTCAGGTGCCCGGAGATTG)和AtFLZ13-qR(CGGTGGTTCATCGACGGTAA)引物对检测AtFLZ13基因的表达情况，并采用拟南芥管家基因UBQ10基因的AtUBQ10-qF(CGGAAAGCAGTTGGAGGATGG)和AtUBQ10-qR(CGGAGCCTGAGAACAAGATGAAG)引物对检测拟南芥AtUBQ10基因的表达作为内参。定量PCR试剂为Premix Ex TaqTM(TAKARA公司)，定量PCR仪器为CFX 96(Bio RAD公司)。反应体系为：2×PCR buffer 5μL，qF引物0.4μL，qR引物0.4μL，cDNA模板1μL，灭菌水3.2μL，反应体系总体积10μL。反应程序：95℃30sec；95℃5sec,68℃30sec，45个循环。
结果如图2所示，挑选的2个株系中AtFLZ13基因的表达量均有大幅度提高，后续选择这2个过表达株系进行实验。
AtFLZ13过表达拟南芥抗高温表型分析
将纯合的过量表达和野生型Col-0植物种子使用2％次氯酸钠表面消毒后，播种在1/2MS固定培养基上，4℃冰箱冷处理3天后，放置于植物培养箱(22℃，16h光照/8h黑暗)萌发并生长。将8天大小的拟南芥幼苗转移到42℃植物培养箱热击处理3小时，之后放回22℃的植物培养箱恢复生长6天后拍照，并统计存活率。
表型结果见图3，结果表明，AtFLZ13过表达拟南芥植物相比野生型抗高温能力明显增强，表现为恢复生长6天后存活率明显比野生型高(图3)。
实施例2
AtFLZ13转基因水稻的获得和鉴定
采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将实施例1中构建的过量表达载体转入粳稻品种日本晴中。经过选择培养、分化、生根、炼苗得到的T0代转基因苗。实验方法参考文献：农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究；郑杰；湖南农业科学，2008年，第2期。
对所有的转基因苗进行PCR鉴定，扩增GFP载体片段，将10株阳性的转基因苗进行繁种得到T1代、T2代。将T2代种子使用含有潮霉素的培养基发芽，如果种子能全部正常生长，则证明该株系为纯合株。挑选2个转基因株系(OE#3和OE#6)进行qRT-RCR检测，并进行后续试验及分析。
其中qRT-RCR鉴定AtFLZ13基因在转基因水稻中过表达效果过程如下：
1、植物RNA提取试剂盒(Magen公司)提取四叶期的水稻叶片总RNA，取1μg高质量(OD260/OD280:1.8-2.0；OD260/OD230≈2.0)的RNA进行反转录(诺唯赞公司反转录试剂盒)获得第一链cDNA。
2、以上述步骤1中的cDNA为模板，通过AtFLZ13-qF(ATGGCAGCTGAATCCTCCCT)和AtFLZ13-qR(GCATCCAGCTCAATCAAACA)引物对检测AtFLZ13基因的表达情况，并采用水稻管家基因EF1α基因的OsEF1α-qF(TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT)和OsEF1α-qR(GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA)引物对检测水稻OsEF1α基因的表达作为内参，定量PCR试剂为Premix Ex TaqTM(TAKARA公司)，定量PCR仪器为CFX 96(Bio RAD公司)。反应体系为：2×PCR buffer 5μL，qF引物0.4μL，qR引物0.4μL，cDNA模板1μL，灭菌水3.2μL，反应体系总体积10μL。反应程序：95℃30sec；95℃5sec,68℃30sec，45个循环。
结果如图4所示，挑选的2个株系中AtFLZ13基因的表达量均有大幅度提高，后续选择这2个过表达株系进行实验。
AtFLZ13过表达水稻抗高温表型分析
将纯合的过量表达植株和野生型日本晴种子打破休眠，催芽2天后挑选大小一致的幼苗，播种在96孔培养皿中，放置于植物培养箱(30℃，12h光照/12h黑暗)继续生长。生长2周后，将水稻苗放置于42℃的植物培养箱热击处理65小时左右，之后放回30℃的植物培养箱中恢复生长3-4天后拍照并统计存活率。
表型结果见图5，结果表明，AtFLZ13过表达水稻比野生型日本晴更加抗高温，在恢复生长后3.5天存活率显著高于野生型水稻。
>SEQ ID NO.1
ATGATACTAAGCAAGAGACCTCATCTAATGATCCGTAAATTGTCTGAGATGTTGGTTCCAAGAAGCAGATCTGCTGCTATTAAACCGGAGGAGTACACGGCCAGTCCGAGAAGTCCGTTGGATTTGAACTTCCCCTCCCCGGTTCACTCGAAGCGGTTCGGTTCTGGTGGTGTCGGTTTGGGTATTGTTGCTGCGTTGGAGGAAACTAGCAACGGGATTAACCGGCATGATCCGGTTCGTTACTCCGGGAGATTCAGGTGCCCGGAGATTGATCTGTCGGATGAGGAATACACTTATGTTACGAGCCCAAACGGGCCGACCAAAGTGTATTACAACGACGACGGGTTTGAATTGTCTGAAAATGATTATCGGAGAGTTCATAAACCGATGGTTACCGTCGATGAACCACCGGTTATTGAAAGACAGAGTGTTAGGGGTCCAACAGAGTTTCTGAGTTCGTGTTGCTTGTGTAAGAAGAAACTTCAAGGCAAAGACATATACATGTACAAAGGAGAGATGGGATTTTGTAGTGCCGAATGCAGATCAGTGCAAATAATGAATGACGAACGACAAGAGCAATGTAAAACGCAAGTTTCAAGAAACGCCGACGTTTTGAGCTCTCCTTACGCCGCCGGACAGAGATTATCTGCCGGAGTATTCGTATTTTAG。
>SEQ ID NO.2
MILSKRPHLMIRKLSEMLVPRSRSAAIKPEEYTASPRSPLDLNFPSPVHSKRFGSGGVGLGIVAALEETSNGINR HDPVRYSGRFRCPEIDLSDEEYTYVTSPNGPTKVYYNDDGFELSENDYRRVHKPMVTVDEPPVIERQSVRGPTEFLSSCC LCKKKLQGKDIYMYKGEMGFCSAECRSVQIMNDERQEQCKTQVSRNADVLSSPYAAGQRLSAGVFVF。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (4)
1.拟南芥AtFLZ13基因在提高植物对高温的抗性中的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或水稻，AtFLZ13基因序列为编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列，所述提高植物对高温的抗性是通过使编码的序列如SEQ ID NO.2 所示氨基酸序列蛋白的在拟南芥或水稻中过表达实现的。
2.拟南芥AtFLZ13基因编码的蛋白在提高植物对高温抗性中的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或水稻，AtFLZ13基因编码的蛋白序列为如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，所述提高植物对高温的抗性是通过使编码的序列如SEQ ID NO.2 所示氨基酸序列蛋白的在拟南芥或水稻中过表达实现的。
3.拟南芥AtFLZ13基因在培育抗高温植物品种中的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或水稻，AtFLZ13基因序列为编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列，所述培育抗高温植物品种是通过使编码的序列如SEQ ID NO.2 所示氨基酸序列蛋白的在拟南芥或水稻中过表达实现的。
4.拟南芥AtFLZ13基因编码的蛋白在培育抗高温植物品种中的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或水稻，AtFLZ13基因编码的蛋白序列为如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，所述培育抗高温植物品种是通过使编码的序列如SEQ ID NO.2 所示氨基酸序列蛋白的在拟南芥或水稻中过表达实现的。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311321471.8A CN117210488B (zh) | 2023-10-13 | 2023-10-13 | 拟南芥AtFLZ13基因在植物抗高温育种中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311321471.8A CN117210488B (zh) | 2023-10-13 | 2023-10-13 | 拟南芥AtFLZ13基因在植物抗高温育种中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117210488A CN117210488A (zh) | 2023-12-12 |
| CN117210488B true CN117210488B (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=89048232
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311321471.8A Active CN117210488B (zh) | 2023-10-13 | 2023-10-13 | 拟南芥AtFLZ13基因在植物抗高温育种中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117210488B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111187778A (zh) * | 2020-02-10 | 2020-05-22 | 济南大学 | 小麦耐盐基因TaFLZ2及其应用 |
| CN112662682A (zh) * | 2021-01-15 | 2021-04-16 | 广东省农业科学院水稻研究所 | 水稻OsFLZ18基因及其在调控植物抗淹水胁迫中的应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9029523B2 (en) * | 2000-04-26 | 2015-05-12 | Ceres, Inc. | Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof |
| US20130305398A1 (en) * | 2012-02-16 | 2013-11-14 | Marie Coffin | Genes and uses for plant enhacement |
-
2023
- 2023-10-13 CN CN202311321471.8A patent/CN117210488B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111187778A (zh) * | 2020-02-10 | 2020-05-22 | 济南大学 | 小麦耐盐基因TaFLZ2及其应用 |
| CN112662682A (zh) * | 2021-01-15 | 2021-04-16 | 广东省农业科学院水稻研究所 | 水稻OsFLZ18基因及其在调控植物抗淹水胁迫中的应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Comprehensive Evolutionary and Expression Analysis of FCS-Like Zinc finger Gene Family Yields Insights into Their Origin, Expansion and Divergence;Muhammed Jamsheer K 等;《PLoS One》;20150807;第10卷(第8期);参见全文 * |
| Expression of Arabidopsis FCS-Like Zinc finger genes is differentially regulated by sugars, cellular energy level, and abiotic stress;Muhammed Jamsheer K 等;《Frontiers in Plant Sciences》;20150924;参见全文 * |
| FCS-like zinc finger proteins maintain energy homeostasis during stresses;Anthony Artins 等;《Trends in Plant Science》;20230922;第28卷(第12期);参见全文 * |
| FCS-Like锌指蛋白OsFLZ18在调控水稻抽穗期中的作用;马雅美 等;《中国农业科学》;20221231;第55卷(第20期);参见全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117210488A (zh) | 2023-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110904071B (zh) | Raf49蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用 | |
| CN113549632B (zh) | 水稻OsFLZ2基因在调控禾本科植物抽穗期中的应用 | |
| CN112662682B (zh) | 水稻OsFLZ18基因及其在调控植物抗淹水胁迫中的应用 | |
| WO2024021768A1 (zh) | 玉米ZmRAFS基因用于提高作物抗热能力的应用 | |
| CN111574605A (zh) | 水稻基因OsLAT5在调节敌草快的吸收积累中的应用 | |
| CN112342236B (zh) | 水稻组蛋白甲基转移酶在增强作物干旱抗性及改善单株产量中的应用 | |
| CN112646011A (zh) | 一种与植物抗逆性相关的蛋白PHD-Finger17及其编码基因与应用 | |
| CN117210488B (zh) | 拟南芥AtFLZ13基因在植物抗高温育种中的应用 | |
| CN108218967B (zh) | 水稻抽穗期相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN110684757A (zh) | 控制囊泡发育的拟南芥RabGAP3基因及其重组构建体和应用 | |
| CN112538486B (zh) | 控制玉米株高的基因、其编码的蛋白质以及应用 | |
| CN115724934B (zh) | 拟南芥AtFLZ13基因在植物抗旱育种中的应用 | |
| CN110616226B (zh) | 梨PbELF3b基因的特异性分子标记及其应用 | |
| CN116334093B (zh) | 拟南芥AtFLZ13基因在调控植物开花时间中的应用 | |
| CN116376964B (zh) | 一种调控水稻低温发芽的基因及其应用 | |
| CN117586369B (zh) | 一种用于延迟开花或延长生育期的ScFT2蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN117402877B (zh) | 长链非编码rna natal57在调节水稻产量相关性状中的应用 | |
| CN113234730B (zh) | 重组基因片段4IIA1bZIP及其应用 | |
| US20240035043A1 (en) | Application of maize ZmRAFS gene to improve crop heat stress tolerance | |
| CN114516905B (zh) | 植物光合调控基因tl7及其蛋白与应用 | |
| CN117535304A (zh) | Lrh基因在调控植物根毛伸长中的应用 | |
| CN116731140A (zh) | 水稻OsERF103蛋白及其编码基因在提高植物干旱耐受性中的应用 | |
| CN117187257A (zh) | 水稻hdt701基因在培育植物砷胁迫高耐受性或高敏感性品种中的应用 | |
| CN115807025A (zh) | OsXMK1基因在调控水稻细菌性条斑病抗性中的应用 | |
| CN117305266A (zh) | 一种与水稻抗逆相关的基因OsBDG1及其编码蛋白的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |