CN117535304A - Lrh基因在调控植物根毛伸长中的应用 - Google Patents

Lrh基因在调控植物根毛伸长中的应用 Download PDF

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CN117535304A CN202311484452.7A CN202311484452A CN117535304A CN 117535304 A CN117535304 A CN 117535304A CN 202311484452 A CN202311484452 A CN 202311484452A CN 117535304 A CN117535304 A CN 117535304A
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丁忠杰
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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及LRH基因在调控植物根毛伸长中的应用。本发明提供了LRH基因在调控植物根毛伸长中的应用，所述LRH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明发现LRH基因功能缺失株系的根毛明显长于野生型株系，而基因过表达株系的根毛长度显著短于野生型株系，进而验证了LRH基因在调控植物根毛伸长中的作用，明确LRH基因的新用途。

Description

LRH基因在调控植物根毛伸长中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及LRH基因在调控植物根毛伸长中的应用。
背景技术
随着我国粮食产量的增长，化肥的施用量也在成倍增加，不可否认化肥的施用对粮食的增产发挥着重要的作用，但化肥的过度施用和较低的利用率不仅造成资源的浪费和环境的污染，也是限制粮食增产的重要因素。因此，提高作物对养分的利用效率一直是分子育种的一个重要方向。
植物是固着生物，往往通过改变细胞的大小和形态来应对环境变化。根系是植物直接接触土壤的器官，旺盛的根系对植物获取水分、养分以及适应环境胁迫十分重要。根毛是特化的表皮细胞所形成的管状凸起，以模式植物拟南芥为例，其直径约为10μm，长度可达1mm甚至更长，可以有效增加根系表面积，增加根对土壤中水分和营养的利用效率。因此，深入研究根毛发育机制对培育养分/水分高效利用的作物新种质有着重要的理论意义和潜在的应用价值。
细胞大小对动物和植物细胞的状态与功能十分重要。细胞如何调节自身大小是现代生物学中的一个基本问题。根毛作为特殊的表皮细胞，在快速伸长阶段其伸长速率可达1μm/min以上，是研究细胞膨大的理想材料。植物根毛伸长分子机制的研究较为广泛，尤其是在模式植物拟南芥中，越来越多的证据已经建立起一个复杂的转录调控网络，将外部和内部信号联系起来。
蛋白质是生命和生命活动的物质基础，翻译是蛋白质的合成过程，在面对环境变化做出响应时，相较于转录水平的调控，翻译水平的调节则可以更直接和快速地调控蛋白的表达。翻译起始因子eIF4E1通过调控根毛伸长关键转录因子RSL4的翻译来调节根毛极性生长，但还未发现根毛伸长过程的翻译抑制因子。
发明内容
本发明的目的在于提供LRH基因在调控植物根毛伸长中的应用，本发明首次发现并验证了LRH基因在植物根毛伸长调控中的作用，增加LRH基因的新用途。
本发明提供了LRH基因在调控植物根毛伸长中的应用，所述LRH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述应用包括负调控LRH基因在促进植物根毛伸长中的应用。
优选的，所述促进植物根毛伸长包括提高植物根毛伸长的速率、延长植物根毛伸长的持续时间、促进植物根毛的长度和促进根系表面积中的一项或多项。
优选的，所述负调控LRH基因通过降低所述LRH基因在植物中的表达或降低LRH基因编码的蛋白含量实现。
优选的，所述植物包括拟南芥。
本发明还提供了提高植物中LRH基因表达或提高植物中LRH基因编码的蛋白含量的生物材料在抑制植物根毛伸长中的应用，所述LRH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述生物材料包括用于扩增所述LRH基因的引物、用于过表达所述LRH基因的重组表达载体和用于过表达所述LRH基因的重组工程菌中的一项或多项。
优选的，所述重组表达载体包括LRH基因和初始载体，所述初始载体包括pCAMBIA1301表达载体。
本发明还提供了一种调控植物根毛长短的方法，所述调控包括正调控或负调控，所述负调控包括：降低目的植物中LRH基因的表达，或降低目的植物中LRH基因编码的蛋白的含量，得到所述长根毛植物；所述正调控包括：提高目的植物中LRH基因的表达，或提高目的植物中LRH基因编码的蛋白的含量，得到所述长根毛植物。
优选的，所述降低目的植物中LRH基因的表达或降低目的植物中所述LRH基因编码蛋白的含量为向所述目的植物中导入敲除所述LRH基因的核酸分子；
所述提高目的植物中LRH基因的表达或提高目的植物中所述LRH基因编码蛋白的含量为向所述目的植物中导入所述LRH基因。
有益效果：
本发明提供了LRH基因在调控植物根毛伸长中的应用，所述LRH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明发现LRH基因功能缺失株系的根毛明显长于野生型株系，而基因过表达株系的根毛长度显著短于野生型株系，进而验证了LRH基因在调控植物根毛伸长中的作用，明确LRH基因的新用途。通过以增加或缩短根毛的长度以达到调控植物对土壤中水分和养分的利用效率，尤其在增加根毛长度时，可以促进植物对土壤中水分和养分的吸收和利用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例2提供的35s-pCAMBIA1301的示意图；
图2为本发明实施例2提供的转基因载体pOELRH的示意图；
图3为本发明实施例4和实施例5提供的野生型、两个LRH功能缺失突变体和LRH过表达转基因株系LRH基因表达量对比图；
图4为本发明实施例5提供的野生型、两个LRH功能缺失突变体和过表达转基因株系的根毛对比图；
图5为本发明实施例5提供的野生型、两个LRH功能缺失突变体和过表达转基因株系的根毛长度对比图；
图6为本发明实施例6提供的野生型和两个LRH功能缺失突变体根毛伸长过程对比图；
图7为本发明实施例6提供的野生型和两个LRH功能缺失突变体根毛伸长速率和持续时间对比图。
具体实施方式
本发明提供了LRH基因在调控植物根毛伸长中的应用，所述LRH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为LRH基因的cDNA序列，具体为5'-ATGGCTAACTCTTCCGCTGGCTCCGCCGCAGACCACCGCAACAAACACCTCTCCGTCAATCCACCGCACCAGATCTTCAAAGATATCCAAGGTTCTGACAATGCGATTCCTCTTTCACCACAGTGGCTTCTCTCCAAACCAGGGGAGAACAAGACTGGGATGGGAACTGGGGATCCTAATCAGTATGGAAACCATTCGGATGTTGTGAGAACAACAGGGAATGGGGAGGAGACACTGGATAATCTGAAGAAAAAAGATGTTTTCCGGCCATCCTTGCTTGATGCAGAAAGTGGTCGTCGTGATCGTTGGCGTGATGAGGAAAGGGACACCTTGTCCTCAGTCCGAAATGACCGCTGGCGGAATGGCGACAAAGACTCTGGTGATAATAAGAAGGTTGACCGGTGGGATAATGTGGCTCCTAAATTTGGGGAACAACGACGTGGTCCGAATGACCGGTGGACTGATTCAGGAAACAAGGATGCTGCGCCAGAGCAGAGGCGTGAGAGCAAGTGGAACTCTCGCTGGGGTCCTGATGACAAGGAAGCTGAGATTCCGCGTAATAAGTGGGATGAACCTGGTAAGGACGGTGAAATCATTCGTGAGAAGGGTCCATCTCTTCCTACTAGCGATGGAGACCATTACCGGCCCTGGAGACCCTCTCAAGGTCGAGGAAGAGGAGAAGCTCTTCACAACCAATCAACACCAAACAAACAGGTTACTTCCTTCTCCCACAGCAGGGGGCGTGGAGAGAACACTGCTATCTTTTCAGCTGGACGTGGAAGGATGAGTCCTGGTGGAAGCATTTTTACTAGCGCACCAAACCAGTCTCATCCCCCTGGATCTGCCTCTGACAAGGGGGAAAGTGGTCCTGGAGAACCTCCCCATCTGAGATATAGCAGAATGAAACTGTTGGATGTGTACAGGATGGCTGACACAGAGTGTTATGAAAAGTTTCCGGATGGGTTTATTGAGGTGCCTTCCCTAACGTCTGAGGAGCCAACGGATCCTCTGGCTCTTTGTGCTCCAAGTTCCGATGAAGTGAATGTTCTGGATGCGATTGAGAAAGGAAAAATAGTGAGCAGTGGTGCCCCTCAGACGTCCAAGGATGGCCCTACTGGACGAAATCCGGTCGAGTTTTCACAACCTAGACGGATCAGGCCTGCTGGAAGCAGAGAAGATATGACATTCGGTGCTGAGGAGTCTAAAGATGAAAGTGGAGAAACAAGGAACTATCCAGATGATAAGTTTAGGCCTGAAGCTTCTCATGAAGGTTATGCACCTTTTAGGAGAGGCAATGAGGCACCTGTCAGAGAACTGAAAGAACCCAGTATGCAGGGAAATGCTCATGTTCAATCTGCCTCTCCATGGCGTCAGTCTTCTGGGGGAGAAAGGTCGAATAGGAACTCACATGATTGGAATGACCCTTCAGCTGATAGCAGGCTGAAATCTTCTGACAGTGTTTGGTCGCATCCTAAAGATTCAATAAATCATTTAGGTGGCAATAATATGATGTTGCCGCAGTCGAAAGGTGAATCAAGATGGCAAATCAGTGAAGATCCTTCACTTAGAAGGCAGCCATCTCTGGTGTTCGACAGGGAGCAGGAAGTTAGAAAGCTTCTCCCATCTTCGCCTGAAGAACTTTCACTCTATTATAAAGATCCTCAGGGTCTAATTCAAGGCCCTTTTTCTGGATCTGATATCATTGGATGGTTTGAGGCTGGGTATTTTGGCATAGATTTGCTAGTTCGTCTTGCAAGTGCACCAAATGATTCTCCTTTTTCATTACTTGGTGATGTAATGCCACATTTACGGGCTAAGTCGGGTCCACCACCTGGTTTTACTGGTGCCAAGCAAAACGAATTTGTTGATGCAGCTGGTACATCAGCCTTCCCTGGTGTGGGGAAAGTTCATTCTGGGATGGGTGAGACTGATATGTTGCAAAATGATATGAGGTATAAGCATGTTGCAGGAACTGTAGCGGAGAACCGGTTTATTGAATCATTGATGTCTGGGGGTCTGACCAATTCAGCTCAAGGTGTTCAAGGATATGGAGTAAATAGTTCTGGTGGGTTGTCTTTACCAGTTACTGATGGTGGGGCTGATATGTATCTCCTGGCCAAGAAATTGGAACTTGAGCGGCAGAGATCAATACCTAGTCCGTATTCATATTGGCCTGGTCGGGAATCTGCAAACCTGATGCCAGGATCAGAGAATGTGTCAGAAAATGCTCAACAACCTACCCGTTCTCCAAGTTCTGATTTGTTGTCCATCCTCCAAGGTGTAACGGATAGGTCTTCTCCTGCTGTTAGTGGTCCTCTTCCTGCTTGGTCTCAACCCATTCAAAAGGAAAGTGATTTGCACCATGCTAAAACTTTCCAAACGCAAATTCCCTTTGGGGTCCAACAGCAGAGACTGCCAGAGCAGAATTTACCTTTGTCAGGTTTACTTGGTCAACCTATGGAAAATAATCCAGGTGGCATGTTATCTCCTGATATGATGCTCGCTGCTGGACTCTCTCAAGAGCATCAATCGCTCAATCTGTTGCAGCAGCAACAGCTCTTGTTGCAGTTGAATGCTCAGACACCACTTTCTGCCCAACATCAGCGTCTATTGGTGGAAAAGATGCTCTTGCTTAAACACCAACATAAACAAGAAGAGCAGCAGCAATTGTTACGACAGCAACAGCAGCTGTATTCTCAGGTTTTTGCTGATCAACAGCGTTCTCAGCAACGGTTTGGAGACCCATCTTATGGTCAGTTGCAGGCGTCTCTTGATGCGCTTAGGCTGCAACCATCAAAAGATATGTCACAAGTCAATCAGCAGGTGCAGGTTCCTGTTTCCCATGAGGAGCGAGGCATCAACTTAGCTGATTTGCTCCCAGTAACCCATGCCACTAATCAGACTGTTGCTTCTTTCGAAACCCCCTCTCTGCACCTGCAAAACCAGCTATTTGGTAATGTTGACCCTAGGATGGTTCTGCCTGATCAAATTGATGATACCCATAAAAAAGAGTCGAAATCAGAATATGAAAGAACAGTTTCTGCAGACTATGTGAACAGCTTGTACTCAGAAAAGCCTGTCCTTTCCCCTGGCTATCATGCTACACATAATGTGGAAGAACCTGTGAGCTATCCAAACAATGAAAGCTCCACTGCTACTATGACAGCTCCCGAAATAGTTGAAAGTAAGTTGCTGGAGGAGCAGTCTAAGGACATGTATGCTGGAAAGGGAGAGGTCAGTATTGAGTTATCTGGGGAGACTCCTGCAACTGAAGTTAAAAACAATGACGTTTCTGTAGCACGGAAGACTTCTGAGAAGAAGTCCAGGAAGCAGCGGGCTAAGCAGGCTGCTGACCTGGCTAAGTCAACTTCTAGAGCTCCTCTGCAGGAGACAAAGAAACCTCAACCAGGAAGTGCTGATGATTCTGAGATAAAGGGTAAAACTAAAAAGTCGGCTGACACTTTGATAGACAATGATACTCACCTCATTAAAAGCTCCACAGCCACAGCTTCAAACACTTCCCAAATGAGTTCTGAAGTAGATTCAGTCAGGGGAGAAGAGTCTTCACTGCAAAACACACGAACACAACCAGGACGAGCTTGGAAGCCTGCTCCTGGCTTTAAGCCGAAGTCATTACTGGAAATTCAAATGGAAGAACAGAGGGTAGCGCAAGCAGAAGCTTTAGCTCCAAAGATTTCTTCTACCGTGAATTCAGTGGGTTCGGCGGCTCCTTGGGCTGGAATTGTTACCAATTCAGATTCTAACATACTAAGGGAGACTCATGGAGAGTCAGCTATTACTCAAACCGGTGTTGTAAAGCCTGAAAGTGTTCCTACTCTTAAGGCTAAGAAAAGCCACTTGCATGACTTGCTGGCTGATGATGTTTTTGCCAAATCCAGTGACAAAGAGAGGGAAGTAATGGAAATCATCTCTAACAATGATGCATTTATGCAAGTCACGACCACTAATGCAGAGTCTTTCGACGATGATAACTTTATTGACGCTAGGGAAACAAAAAAGAGCCGTAAGAAATCTGCGAGGGCAAAAACTTCTGGTGCAAAAATTGCTGCACATGTTCCTGCTGTAGATACATCCCTCCAAACAAACTCTGTTGAGAAGGGAAAAAGTTCTCGTATTCTGCAGCAGCAGGAGAAGGAAGTTTTGCCGGCTATTCCTTCTGGGCCTTCTCTGGGAGATTTTGTTCTCTGGAAAGGAGAGTCTGTAAACAATCCTCCACCGGCTGCTGCATGGTCTTCTGGTCCCAAAAAATCTACAAAACCTAGCTCGCTTAGGGACATCGTGAAGGAGCAGGAGAAGATGACGACCTCATCTCATCCACCCCCTAGTCCAGTACCTACCACCCAGAAAGCTATTCCACCTCAGGCTCATCAGGGCGGTGCTTCCTGGTCGCGTTCTGCATCTTCACCATCGCAGGCTGTTTCTCAATCTTCCTCTCAGTCAAAATCCAAAGGAGATGATGACCTTTTCTGGGGTCCAGTTGAGCAATCAACCCAGGACACAAAACAGGGAGACTTTCCACATCTTACAAGTCAAAACAGTTGGGGAACCAAAAACACTCCTGGAAAAGTTAATGCAGGAACTTCACTGAATCGACAGAAATCAGTTTCAATGGGATCTGCGGATCGGGTTTTGTCTTCACCTGTTGTCACTCAGGCGTCACACAAAGGGAAAAAAGAGGCAGTAACAAAACTCACAGAGGCGAATGGCTTCAGAGATTGGTGCAAAAGCGAATGTCTCAGACTTCTTGGTTCCGAAGATACAAGTGTCTTGGAATTTTGTCTGAAGCTATCCCGATCAGAAGCTGAAACTCTTCTGATAGAAAATCTGGGGTCTCGTGACCCTGACCACAAGTTCATCGACAAATTTCTCAACTACAAAGACCTGTTACCATCAGAAGTAGTTGAGATTGCATTTCAATCAAAGGGCTCGGGAGTCGGGACCCGAAACAACACAGGTGAAGACTATTACTATAACACTACAGCTGCAAATGACGGGTTCTCGAAAGTTGGAGGAAAGAAAAAGGCGAAGAAAGGGAAGAAGGTTAGCTTGAGCGCATCGGTTCTGGGATTTAATGTGGTTAGTAACCGGATCATGATGGGAGAGATTCAGACAATTGAGGACTGA-3'。本发明所述LRH基因编码的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.2，具体为为：MANSSAGSAADHRNKHLSVNPPHQIFKDIQGSDNAIPLSPQWLLSKPGENKTGMGTGDPNQYGNHSDVVRTTGNGEETLDNLKKKDVFRPSLLDAESGRRDRWRDEERDTLSSVRNDRWRNGDKDSGDNKKVDRWDNVAPKFGEQRRGPNDRWTDSGNKDAAPEQRRESKWNSRWGPDDKEAEIPRNKWDEPGKDGEIIREKGPSLPTSDGDHYRPWRPSQGRGRGEALHNQSTPNKQVTSFSHSRGRGENTAIFSAGRGRMSPGGSIFTSAPNQSHPPGSASDKGESGPGEPPHLRYSRMKLLDVYRMADTECYEKFPDGFIEVPSLTSEEPTDPLALCAPSSDEVNVLDAIEKGKIVSSGAPQTSKDGPTGRNPVEFSQPRRIRPAGSREDMTFGAEESKDESGETRNYPDDKFRPEASHEGYAPFRRGNEAPVRELKEPSMQGNAHVQSASPWRQSSGGERSNRNSHDWNDPSADSRLKSSDSVWSHPKDSINHLGGNNMMLPQSKGESRWQISEDPSLRRQPSLVFDREQEVRKLLPSSPEELSLYYKDPQGLIQGPFSGSDIIGWFEAGYFGIDLLVRLASAPNDSPFSLLGDVMPHLRAKSGPPPGFTGAKQNEFVDAAGTSAFPGVGKVHSGMGETDMLQNDMRYKHVAGTVAENRFIESLMSGGLTNSAQGVQGYGVNSSGGLSLPVTDGGADMYLLAKKLELERQRSIPSPYSYWPGRESANLMPGSENVSENAQQPTRSPSSDLLSILQGVTDRSSPAVSGPLPAWSQPIQKESDLHHAKTFQTQIPFGVQQQRLPEQNLPLSGLLGQPMENNPGGMLSPDMMLAAGLSQEHQSLNLLQQQQLLLQLNAQTPLSAQHQRLLVEKMLLLKHQHKQEEQQQLLRQQQQLYSQVFADQQRSQQRFGDPSYGQLQASLDALRLQPSKDMSQVNQQVQVPVSHEERGINLADLLPVTHATNQTVASFETPSLHLQNQLFGNVDPRMVLPDQIDDTHKKESKSEYERTVSADYVNSLYSEKPVLSPGYHATHNVEEPVSYPNNESSTATMTAPEIVESKLLEEQSKDMYAGKGEVSIELSGETPATEVKNNDVSVARKTSEKKSRKQRAKQAADLAKSTSRAPLQETKKPQPGSADDSEIKGKTKKSADTLIDNDTHLIKSSTATASNTSQMSSEVDSVRGEESSLQNTRTQPGRAWKPAPGFKPKSLLEIQMEEQRVAQAEALAPKISSTVNSVGSAAPWAGIVTNSDSNILRETHGESAITQTGVVKPESVPTLKAKKSHLHDLLADDVFAKSSDKEREVMEIISNNDAFMQVTTTNAESFDDDNFIDARETKKSRKKSARAKTSGAKIAAHVPAVDTSLQTNSVEKGKSSRILQQQEKEVLPAIPSGPSLGDFVLWKGESVNNPPPAAAWSSGPKKSTKPSSLRDIVKEQEKMTTSSHPPPSPVPTTQKAIPPQAHQGGASWSRSASSPSQAVSQSSSQSKSKGDDDLFWGPVEQSTQDTKQGDFPHLTSQNSWGTKNTPGKVNAGTSLNRQKSVSMGSADRVLSSPVVTQASHKGKKEAVTKLTEANGFRDWCKSECLRLLGSEDTSVLEFCLKLSRSEAETLLIENLGSRDPDHKFIDKFLNYKDLLPSEVVEIAFQSKGSGVGTRNNTGEDYYYNTTAANDGFSKVGGKKKAKKGKKVSLSASVLGFNVVSNRIMMGEIQTIED；所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列优选由1714个氨基酸组成。
在本发明中，所述应用优选包括负调控LRH基因在促进植物根毛伸长中的应用。本发明所述促进植物根毛伸长优选包括提高植物根毛伸长的速率、延长植物根毛伸长的持续时间、促进植物根毛的长度和促进根系表面积中的一项或多项，更优选包括提高植物根毛伸长的速率、延长植物根毛伸长的持续时间。促进植物根毛的长度和促进根系的表面积，以增加植物对土壤中水分和养分的利用效率。
在本发明中，所述负调控LRH基因优选包括通过降低所述LRH基因在植物中的表达或降低LRH基因编码的蛋白含量实现。本发明对降低所述LRH基因在植物中的表达的具体方式没有特殊限定，任意可以降低LRH基因在植物中表达的方式均可，如基因敲除等。本发明所述植物优选包括但不限于拟南芥，在本发明的实施例中以模式植物拟南芥为材料进行说明，但不能仅仅将其认定为本发明中全部的保护范围。
本发明还提供了提高植物中LRH基因表达或提高植物中LRH基因编码的蛋白含量的生物材料在抑制植物根毛伸长中的应用。在本发明中，所述生物材料优选包括用于扩增所述LRH基因的引物、用于过表达所述LRH基因的重组表达载体和用于过表达所述LRH基因的重组工程菌中的一项或多项。在本发明中，所述重组表达载体优选包括LRH基因和初始载体，所述初始载体优选包括pCAMBIA1301表达载体，更优选为35s-pCAMBIA1301表达载体。本发明所述35s-pCAMBIA1301表达载体优选为将花椰菜花叶病毒组成型启动子CaMV35S插入双元载体pCAMBIA1301中获得，所述插入的位置为Sac I和Kpn I之间。本发明所述重组工程菌中的初始菌株优选包括农杆菌，更优选为GV3101。本发明所述重组工程菌优选为将所述重组表达载体转入到所述初始菌株中获得；所述转入的方式没有特殊限定，采用本领域中常规转入方式即可。
在本发明中，用于扩增所述LRH基因的引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列分别为：5'-ATGGCTAACTCTTCCGCTGGCTCCGCCGCAGACCACCGC-3'和5'-TCAGTCCTCAATTGTCTGAATCTCTCCCATCATGATCCGG-3'。本发明用于扩增所述LRH基因的反应程序优选为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸3min，32个循环；72℃终延伸7min。
本发明还提供了一种调控植物根毛长短的方法，所述调控包括正调控或负调控，所述负调控包括：降低目的植物中LRH基因的表达，或降低目的植物中LRH基因编码的蛋白的含量，得到所述长根毛植物；所述正调控包括：提高目的植物中LRH基因的表达，或提高目的植物中LRH基因编码的蛋白的含量，得到所述长根毛植物。本发明所述降低目的植物中LRH基因的表达或降低目的植物中所述LRH基因编码蛋白的含量为向所述目的植物中导入敲除所述LRH基因的核酸分子；所述提高目的植物中LRH基因的表达或提高目的植物中所述LRH基因编码蛋白的含量为向所述目的植物中导入所述LRH基因。本发明对所述导入的方式没有特殊限定，采用本领域中常规的方式即可，如农杆菌转入法，基因枪法等。
在本发明中，所述LRH基因以及所述LRH基因编码的蛋白的氨基酸序列已在上述技术方案中进行说明，不再进行赘述。本发明所述植物优选包括但不仅仅限于拟南芥。本发明实施例中仅仅以模式生物拟南芥作为试验材料进行说明，不能仅仅将其认定为本发明全部的保护范围。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
根毛伸长负调控因子LRH基因的克隆，步骤如下：
将表面消毒后的拟南芥种子种于1/2MS固体培养基，黑暗4℃条件下春化2～3天后移到光照条件下培养5天后，收集幼苗用于RNA的提取，采用试剂盒进行逆转录合成cDNA作为后续基因克隆的模板。
根据目前已公开的拟南芥全基因组测序结果，分别设计上游引物和下游引物：
上游引物：5'-ATGGCTAACTCTTCCGCTGGCTCCGCCGCAGACCACCGC-3'(SEQ ID NO.3)；
下游引物：5'-TCAGTCCTCAATTGTCTGAATCTCTCCCATCATGATCCGG-3'(SEQ ID NO.4)。
使用诺唯赞(vazyme)公司PhantaMax MasterMix酶进行PCR扩增，PCR扩增的反应程序为：预变性：95℃，3min；变性：95℃，15s；退火58℃，15s；延伸72℃，3min(32个循环)；终延伸：72℃，7min。PCR扩增的反应体系为：
将PCR扩增产物送至测序，得到LRH的CDS序列(SEQ ID NO.1)。
实施例2
组成型过表达转基因载体的构建，步骤如下：
利用DNA片段双酶切和连接的方法，通过酶切位点Sac I和Kpn I，在多克隆位点中正向插入一个花椰菜花叶病毒组成型启动子CaMV35S，使得启动子CaMV35S成功连接到pCAMBIA1301载体上，改造获得可用于构建组成型过表达转基因材料的载体35s-pCAMBIA1301(图1)。
使用引物LRH-F：5'-AGAGAACACGGGGGACGGTACCATGGCTAACTCTTCCGCTGGCTCCGCCGC-3'(SEQ ID NO.5)和LRH-R：5'-GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCAGTCCTCAATTGTCTGAATCTCTCCCATC-3'(SEQ ID NO.6)，以上述实施例1中获得的cDNA序列作为模板，参照上述实施例1中PCR扩增反应程序，扩增获得两端包含同源臂的拟南芥根毛伸长抑制因子LRH编码区序列。借助诺唯赞公司生产的ClonExpress IIOne Step Cloning Kit试剂盒将拟南芥根毛伸长抑制因子LRH编码区序列同源重组到组成型过表达载体35s-pCAMBIA1301上的启动子CaMV35S后，得到由启动子CaMV35S启动拟南芥基因LRH的转基因载体pOELRH(双元转基因载体pOELRH质粒)(图2)。
实施例3
拟南芥的转化，步骤如下：
将0.5μg实施例2制备的双元转基因载体pOELRH质粒转入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系GV3101感受态细胞中，依次冰浴5min，液氮5min，37℃水浴5min和冰浴5min后，涂布到包含50mg/L的卡那霉素(Kan)和50mg/L的利福平(Rif)的LB固体培养基平板上于28℃培养48小时，得含有双元质粒载体的农杆菌菌株。用制备的含有双元质粒载体的GV3101菌株来转化拟南芥，具体步骤如下：
将含有双元质粒载体的农杆菌在100mL含有50mg/L的卡那霉素(Kan)和50mg/L的利福平(Rif)的LB培养基中，28℃振荡过夜培养至OD600吸光值为1.0，在5000rpm/min条件下离心8min收集菌体，并用200mL含有50g/L蔗糖和40μL辅助转化剂Silwet L-77转化辅助试剂的1/2MS培养基重悬。选取已经抽薹并部分完成开花的野生型(Col-0)拟南芥作为转基因材料，减去已成熟的荚果，保留花和花苞，采用抽真空转化法，将拟南芥地上部分浸染到上述制备的菌液中，真空抽取5min后，在黑暗保湿、23℃条件下培养24h后，正常培养至角果成熟。在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上筛选1周后获得抗性苗，移栽土壤培养后收获转基因一代(T1代)种子。T1代种子通过在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上再筛选一代后得到纯合的转基因T2代材料(LRHox1)。
实施例4
目的基因表达的分子检测，步骤如下：
收集野生型和过表达转基因植株的幼嫩小苗提取RNA，经逆转录，采用TOYOBO公司SYBR Green Realtime PCRMasterMix进行荧光实时定量PCR检测，以Actin2基因作为内参；检测体系和所用引物如下：
所用荧光实时定量PCR反应引物为：
qLRH-F：5'-GCGAATGTCTCAGACTTCTTGG-3'(SEQ ID NO.7)
qLRH-R：5'-CTACTTCTGATGGTAACAGG-3'(SEQ ID NO.8)
qActin2-F:5'-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3'(SEQ ID NO.9)
qActin2-R:5'-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3'(SEQ ID NO.10)。
荧光实时定量PCR的反应程序如下：
预变性：95℃，1min；PCR循环：95℃，15s；60℃，15s；72℃，15s(40个循环)。
荧光实时定量PCR的反应体系为：
检测后发现，如图3所示(图3为野生型、两个LRH功能缺失突变体和LRH过表达转基因株系LRH基因表达量对比图)，未转基因株系(WT)中LRH基因的表达量为1.00±0.08，而过表达转基因植株(LRHox1)中LRH基因的表达量为7.70±0.58。相比未转基因株系，LRH基因在过表达转基因植株中有着8倍左右的高表达。
实施例5
该基因确实参与了根毛长度的调控，如下的对比实验：
根毛长度的检测：
从拟南芥生物资源中心(ABRC)购买获得的拟南芥T-DNA插入突变体SALK_034517C和SALK_060808C(此两个拟南芥T-DNA插入突变体表现为LRH基因的敲除)，如图3(图3为野生型、LRH功能缺失突变体和LRH过表达转基因株系LRH基因表达量对比图)所示，这两个突变体中LRH基因的表达水平降低，我们将这两个突变体重新命名为lrh-1和lrh-2。分别将野生型、两个拟南芥LRH基因的低表达突变体材料(lrh-1和lrh-2)和该基因的过表达转基因材料(即本发明实施例3所得)的种子用质量浓度75％酒精表面消毒后，再用灭菌水清洗3-5遍，将种子点播Johnson固体培养基平板上，然后将平板置于4℃冰箱2～3天，再将平板放置于光照培养箱(光照16h/黑暗8h)中生长5天。平板直接放在体视显微镜(Nikon)下拍照；利用Image J软件，在距成熟区起始点0到2mm的区域选取10个最长的根毛进行测量和统计，每个株系随机观察10个根。
如图4(图4为本发明提供的野生型、两个LRH功能缺失突变体和过表达转基因株系的根毛对比图；其中标尺长度均为500μm)和图5(图5为本发明提供的野生型、两个LRH功能缺失突变体和过表达转基因株系的根毛长度对比图)，转基因过表达(LRHox1)拟南芥根毛明显短于野生型对照，而LRH基因功能缺失突变体的根毛显著长于野生型。由此可见LRH确实参与了根毛长度的调控。
实施例6
根毛伸长速率和持续时间检测，步骤如下：
将生长5天的野生型，以及从拟南芥生物资源中心(ABRC)购买获得的拟南芥LRH基因的敲除突变体材料(lrh-1和lrh-2)直接放在体视显微镜下进行观察和拍照；选取一个形态正常、长度约为50μm的根毛拍下第一张照片，之后每隔7.5min拍一张照片，连续观察300min；利用Image J软件测量每一时段的根毛长度。
如图6(图6为本发明提供的野生型和两个LRH功能缺失突变体根毛伸长过程对比图，其中标尺长度为50μm)和图7(图7为本发明提供的野生型和两个LRH功能缺失突变体根毛伸长速率和持续时间对比图)，由图6和图7可以得出LRH突变体比野生型根毛伸长的速率和持续时间明显增加。由此可见，LRH确实抑制了根毛伸长的速率和持续时间，这也是LRH抑制根毛伸长和长度的直接原因。
由以上实施例可以得出：LRH基因对植物根毛伸长具有调控作用，过负调控LRH基因可以提高植物根毛伸长的速率和持续时间，抑制根毛的伸长；正调控LRH基因抑制根毛的伸长。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.LRH基因在调控植物根毛伸长中的应用，所述LRH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括负调控LRH基因在促进植物根毛伸长中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述促进植物根毛伸长包括提高植物根毛伸长的速率、延长植物根毛伸长的持续时间、促进植物根毛的长度和促进根系表面积中的一项或多项。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述负调控LRH基因通过降低所述LRH基因在植物中的表达或降低LRH基因编码的蛋白含量实现。
5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥。
6.提高植物中LRH基因表达或提高植物中LRH基因编码的蛋白含量的生物材料在抑制植物根毛伸长中的应用，所述LRH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生物材料包括用于扩增所述LRH基因的引物、用于过表达所述LRH基因的重组表达载体和用于过表达所述LRH基因的重组工程菌中的一项或多项。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体包括LRH基因和初始载体，所述初始载体包括pCAMBIA1301表达载体。
9.一种调控植物根毛长短的方法，其特征在于，所述调控包括正调控或负调控，所述负调控包括：降低目的植物中LRH基因的表达，或降低目的植物中LRH基因编码的蛋白的含量，得到所述长根毛植物；
所述正调控包括：提高目的植物中LRH基因的表达，或提高目的植物中LRH基因编码的蛋白的含量，得到所述长根毛植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述降低目的植物中LRH基因的表达或降低目的植物中所述LRH基因编码蛋白的含量为向所述目的植物中导入敲除所述LRH基因的核酸分子；
所述提高目的植物中LRH基因的表达或提高目的植物中所述LRH基因编码蛋白的含量为向所述目的植物中导入所述LRH基因。
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