CN117343955A - OsZNF9基因提高水稻耐盐的方法及应用 - Google Patents
OsZNF9基因提高水稻耐盐的方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117343955A CN117343955A CN202311346144.8A CN202311346144A CN117343955A CN 117343955 A CN117343955 A CN 117343955A CN 202311346144 A CN202311346144 A CN 202311346144A CN 117343955 A CN117343955 A CN 117343955A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- osznf9
- rice
- gene
- vector
- salt tolerance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 116
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 116
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 102
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 115
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 15
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 55
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 27
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 20
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 19
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims description 15
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 13
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 8
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 7
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 claims description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 3
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 2
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 108010028230 Trp-Ser- His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 230000008117 seed development Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了OsZNF9基因提高水稻耐盐的方法及应用，所述方法包括：降低OsZNF9基因在水稻体内的表达或将OsZNF9基因在水稻体内敲除，所述OsZNF9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明通过在水稻体内差异表达OsZNF9基因发现：水稻体内敲除OsZNF9，水稻的耐盐性显著提升，其存活率明显高于粤泰B(YB)；在水稻体内过表达OsZNF9，水稻的耐盐性明显下降，其存活率低于YB。表明OsZNF9与水稻耐盐密切相关，降低OsZNF9的表达量可以提高水稻耐盐。因此OsZNF9基因为利用分子标记辅助育种及利用基因工程的方法培育水稻耐盐新品种提供了强有力的手段和工具，具有巨大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及作物基因工程技术领域，特别涉及OsZNF9基因提高水稻耐盐的方法及应用。
背景技术
水稻是世界上主要的农作物，在世界各地广泛种植，养活了世界一半以上的人口。我国是一个盐碱地大国，面积超过5亿亩，提高盐碱地的利用，对于提高水稻产量十分重要。因此，鉴定、克隆参与耐盐调控网络的相关基因，通过遗传突变和基因工程等方法发掘新型耐盐基因，从而培育新的耐盐水稻品种。
ZNF(zinc finger)转录因子家族在植物中尤其是水稻、拟南芥等植物中广泛存在。前期的研究表明该基因家族可参与植物籽粒发育、花期调控以及生物和非生物胁迫，具有相当多的生物学功能。而OsZNF9基因是我们鉴定的一个新的C3HC4 type zinc finger基因。研究表明该基因参与水稻调控耐盐的调控，可广泛应用于水稻耐盐品种的选育和利用。
发明内容
基于本发明发现的水稻OsZNF9基因与水稻耐盐的关系，本发明的目的在于提供提高水稻耐盐的方法，进而提供OsZNF9基因在育种上的应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种提高水稻耐盐的方法，所述方法包括下述步骤：降低OsZNF9基因在水稻体内的表达或将OsZNF9基因在水稻体内敲除，或降低OsZNF9蛋白在水稻体内的活性。其中，所述OsZNF9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。降低OsZNF9基因在水稻体内的表达或将OsZNF9基因在水稻体内敲除优选通过RNAi技术或CRISPR/Cas9技术实现。
进一步地，所述将OsZNF9基因在水稻体内敲除，包括下述步骤：构建OsZNF9基因敲除载体，将其转化到水稻组织或细胞中。
进一步地，所述OsZNF9基因敲除载体的基础载体包括作物改造载体，所述作物改造载体包括双元农杆菌载体和可用于作物微弹轰击的载体中的一种，所述双元农杆菌载体包括pYLCRISPR/Cas9Pubi-B、pYLCRISPR/Cas9P35S-H、pYLCRISPR/Cas9P35S-N或其他编辑技术相关载体，如TALENs、ZFNs等。
进一步地，所述转化方法包括显微注射、农杆菌街道的遗传转化、通过Ti质粒、Ri质粒或病毒载体中的一种。
进一步地，所述将OsZNF9基因在水稻体内敲除，具体包括下述步骤：
敲除载体的构建：以OsZNF9基因上的CDS区域序列为靶标，设计敲除位点。利用CRISPR/Cas9系统对该基因进行编辑，利用Overlapping PCR法构建gRNA表达盒，通过“金门”连接法将表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9载体上，从而得到含有敲除位点的OsZNF9-KO敲除载体；
将敲除载体OsZNF9-KO转入EHA105农杆菌中，利用敲除载体及所述农杆菌自身特性筛选得到可用于侵染水稻组织的阳性农杆菌菌株；
将所述阳性农杆菌菌株侵染水稻愈伤组织，在潮霉素的筛选培养基上暗培养，获得阳性转基因愈伤组织；
将所述阳性愈伤组织进行分化、生根、移栽培养获得T0代转基因植株；
通过常规的分子标记检测以及水稻栽培方法获得水稻耐盐性提高的T1代植株。
在本发明的第二方面，提供了一种参与水稻耐盐调控的OsZNF9基因，所述OsZNF9基因具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种OsZNF9蛋白，所述OsZNF9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的第四方面，提供了一种包含所述OsZNF9基因的敲除位点的敲除载体。
在本发明的第五方面，提供了一种包含所述敲除载体的转化体、转基因系。
在本发明的第六方面，提供了所述的OsZNF9基因、所述的OsZNF9蛋白、所述的敲除载体或所述的转化体、转基因系在提高水稻耐盐性或培育水稻耐盐品种上的应用，所述的应用通过降低OsZNF9基因在水稻体内的表达、将OsZNF9基因在水稻体内敲除或降低OsZNF9蛋白在水稻体内的活性实现。进一步的，提供了OsZNF9在单子叶禾本科作物中的同源基因在提高单子叶禾本科作物耐盐中的应用。
在本发明的第六方面，提供了OsZNF9基因作为分子标记在水稻育种中的应用。
本发明至少具有如下技术效果或优点：本发明提供一种提高水稻耐盐的方法及应用，通过降低OsZNF9的表达量来提高水稻耐盐性，说明该基因可作为提高耐盐性标记应用于水稻耐盐农作物育种当中。因此OsZNF9基因为利用分子标记辅助育种及利用基因工程的方法培育水稻耐盐新品种，提供了强有力的手段和工具，具有巨大的应用潜力。
附图说明
图1是OsZNF9基因结构图，含有C3HC4类型RING finger结构域；
图2是OsZNF9基因在过表达水稻材料中的模型结构；
图3是OsZNF9过表达水稻材料在盐处理前后的OsZNF9表达量鉴定；
图4是OsZNF9基因在敲除水稻材料中的碱基编辑情况；
图5是OsZNF9过表达和敲除水稻材料在盐处理条件下的性状表现。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
下述实例中的水稻按照正常的管理方法培养：首先新鲜的水稻种子需要浸种催芽，种子露白后可在准备好的水培盒中进行播种，待幼苗至四叶一心期时可进行处理。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
本实验室前期对水稻耐盐机制的研究中鉴定出一个新的C3HC4 type zinc finge基因OsZNF9(图1)。研究表明该基因参与水稻耐盐的调控。
本发明通过在水稻体内差异表达OsZNF9基因发现：在水稻粤泰B(YB)体内敲除OsZNF9后，水稻的耐盐性显著提升，其存活率明显高于YB，表明OsZNF9与水稻耐盐密切相关，降低OsZNF9的表达量可以提高水稻耐盐。
OsZNF9的功能结构域在其他重要粮食作物(小麦、玉米等)中高度保守，表明该基因在其他作物的耐盐调控中有类似的分子机制。因此OsZNF9在其他重要粮食作物中的同源基因同样可以应用于其他粮食作物中改良作物的耐盐性。
因此，根据本发明一种典型的实施方式，提供一种参与水稻盐调控的OsZNF9基因，所述OsZNF9基因具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
所述OsZNF9基因具有如下特征：
(1)其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示基因组碱基序列
(2)其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示转录序列；
(3)其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示cDNA序列；
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列由3636个碱基组成，其中包含外显子、内含子和3’UTR。
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为转录序列。
SEQ ID NO.3所示核苷酸序列为cDNA编码序列。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供一种OsZNF9蛋白，参与水稻耐盐调控的蛋白，为了使OsZNF9蛋白质便于研究和利用，可在该蛋白序列的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。所述OsZNF9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
表1-标签及其氨基酸序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tagⅡ | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
OsZNF9为能够调控水稻的耐盐性的基因，其在水稻耐盐品种的培育上具有重要意义。
根据本发明又一典型的实施方式，提供一种提高水稻耐盐的方法，所述方法包括下述步骤：降低OsZNF9基因在水稻体内的表达或将OsZNF9基因在水稻体内敲除，或降低OsZNF9蛋白在水稻体内的活性。其中，所述OsZNF9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。降低OsZNF9基因在水稻体内的表达或将OsZNF9基因在水稻体内敲除可通过RNAi技术或CRISPR/Cas9技术实现。
上述技术方案中，所述将OsZNF9基因在水稻体内敲除，包括下述步骤：构建OsZNF9基因敲除载体，将其转化到水稻组织或细胞中。
所述OsZNF9基因敲除载体的基础载体包括作物改造载体，所述作物改造载体包括双元农杆菌载体和可用于作物微弹轰击的载体中的一种，所述双元农杆菌载体包括pYLCRISPR/Cas9Pubi-B、pYLCRISPR/Cas9P35S-H、pYLCRISPR/Cas9P35S-N或其他编辑技术相关载体，如TALENs、ZFNs等；所述转化方法包括显微注射、农杆菌街道的遗传转化、通过Ti质粒、Ri质粒或病毒载体中的一种。
作为一种具体的实施方式，所述将OsZNF9基因在水稻体内敲除，具体包括下述步骤：在CRISPR-GE网站(http://skl.scau.edu.cn/)，进入靶点设计(targetDesign)子程序，以OsZNF9基因上的CDS区域序列为靶标，一般选择GC含量45％～70％，脱靶估值小于0.6，位置符合要求的靶点设计敲除位点。利用CRISPR/Cas9系统对该基因进行编辑，利用Overlapping PCR法构建gRNA表达盒，通过“金门”连接法将表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9载体上，从而得到含有敲除位点的OsZNF9-KO敲除载体；
将载体OsZNF9-KO转入EHA105农杆菌中，利用敲除载体及所述农杆菌自身特性筛选得到可用于侵染水稻组织的阳性农杆菌菌株；
将所述阳性农杆菌菌株侵染水稻愈伤组织，在潮霉素的筛选培养基上暗培养，获得阳性转基因愈伤组织；
将所述阳性愈伤组织进行分化、生根、移栽培养获得T0代转基因植株；
通过常规的分子标记检测以及水稻栽培方法获得水稻耐盐性提高的T1代植株。
所述的OsZNF9基因、所述的OsZNF9蛋白、所述的敲除载体和所述的转化体、转基因系均可在提高水稻耐盐性或培育水稻耐盐品种上进行应用。所述的应用通过降低OsZNF9基因在水稻体内的表达、将OsZNF9基因在水稻体内敲除或降低OsZNF9蛋白在水稻体内的活性实现。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种提高水稻耐盐的方法及应用进行详细说明。
实施例1
1、OsZNF9基因全长片段的获得
利用水稻粤泰B(YB)cDNA为模板，设计引物对OsZNF9-F/R并在各自5’端添加相应的重组序列，引物序列见表2，进行PCR扩增，对产物进行测序分析，扩增得到的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。在其他实施方式中，可直接合成核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的基因片段。
表2-引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| OsZNF9-F | GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATGAGTACTGTCAGCGGCACT |
| OsZNF9-R | AGAGATGAGTTTCTGCTC GGATCCTTAACTATCAGAGTTTGGAAG |
2、OsZNF9基因过表达载体的构建
将上述用引物对OsZNF9-F/R扩增得到的产物通过重组反应插入含有强启动子的表达载体pCAMBIA1301-35SN(可购买自淼灵质粒平台，货号P0380)中，利用载体上的标记基因筛选阳性克隆，得到重组表达载体OsZNF9-OE。
3、OsZNF9基因过表达转基因植株的获得
构建好的OsZNF9-OE载体可以通过电转或热激的方法转入EHA105农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中，利用载体及农杆菌自身特性筛选得到可用于侵染水稻组织的阳性农杆菌菌株。
用含有重组质粒OsZNF9-OE的重组农杆菌菌株侵染水稻YB愈伤组织，在含50mg/L潮霉素的筛选培养基上暗培养，获得阳性转基因愈伤组织。将阳性愈伤分化、生根、移栽获得T0代转基因植株。通过常规的分子标记检测以及水稻栽培方法获得T1代植株。OsZNF9基因在过表达水稻材料中的模型结构如图2所示。
4、OsZNF9基因过表达植株的产量检测
(1)通过qRT-PCR检测OsZNF9基因的表达量：
35S启动子作为植物强启动子，可以提升目的基因在植物体内的表达含量。利用常规的RNA提取方法获得OsZNF9过表达植株及野生型植株的总RNA，并利用反转录试剂盒(购自Invitrogen公司)获得相应的cDNA。利用引物OsZNF9-RT-F/R引物对进行qRT-PCR检测OsZNF9的表达水平；利用引物Actin-RT-F/R的PCR产物作为内参；上述引物序列见表3。
表3-引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| OsZNF9-RT-F | GTTGGAACAAGTTGGAGGAGC |
| OsZNF9-RT-R | TTTGGAAGGTAAATACGGTGG |
| Actin-RT-F | GGAAGTACAGTGTCTGGATTGGAG |
| Actin-RT-R | TCTTGGCTTAGCATTCTTGGGT |
OsZNF9过表达材料OsZNF9的表达量鉴定结果如图3所示。结果显示，在过表达材料中OsZNF9的表达量明显提升尤其是盐处理后表达量进一步提升。
(2)转基因植株的耐盐性检测：
通过常规方法对过表达材料及YB种子进行浸种、催芽。随后移栽进水培盒中，并转入28℃培养箱中。当材料苗期(四叶一心)时，将材料在含200mM NaCl的Yoshida营养液中培养3天，随后转入正常的营养液中继续复水5-10天，统计分析材料的存活率。
OsZNF9过表达材料在在盐处理条件下的性状表现如图5所示。在水稻体内过表达OsZNF9，水稻的耐盐性明显下降，其存活率低于YB，表明OsZNF9负调控水稻的耐盐性。
实施例2
1、OsZNF9基因敲除位点的选择
以OsZNF9基因上的CDS区域序列为靶标，设计敲除位点。利用CRISPR/Cas9系统对该基因进行编辑，从而达到改变OsZNF9结构影响生物学功能的目的。涉及引物序列见表4
表4.引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| Pgs-L | AGCGTGGGTCTCGCTCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGC |
| Pps-R | TTCAGAGGTCTCTACCGACTAGTCACGCGTATGGAATCGGCAGCAAA |
| U-F | CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG |
| gR-R | CGGAGGAAAATTCCATCCAC |
| gRT#+U6a | ACGGCTTCCAACCACTGGGGGTTTTAGAGCTAGAAA |
| U6aT# | CCCCAGTGGTTGGAAGCCGTCGGCAGCCAAGCCAGCA |
| CRISPR-F | GGTCATTTAGCCCACCACC |
| CRISPR-R | TAGCATATTCCCATGTTTCC |
2、OsZNF9基因敲除载体的构建
利用Overlapping PCR法以U6aT#、gRT#+U6a、U-F、gR-R、Pgs-L和Pps-R引物构建gRNA表达盒，通过“金门”连接法将表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9载体上。从而得到含有敲除位点的pYLCRISPR/Cas9载体OsZNF9敲除载体，用于基因转化。
3、OsZNF9基因敲除材料的获得
将构建成功的OsZNF9敲除载体通过电转或热激的方法转入EHA105农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系中，利用利福平霉素及卡那霉素对其进行筛选从而得到含有敲除载体的阳性农杆菌菌株。
用含有敲除载体的阳性农杆菌菌株侵染YB愈伤组织，在含50mg/L潮霉素的筛选培养基上暗培养，获得阳性转基因愈伤。将阳性愈伤分化、生根、移栽获得T0代植株。通过常规的分子检测以及水稻栽培方法获得T1代植株。
4、OsZNF9基因敲除材料的检测
(1)通过PCR测序的手段检测OsZNF9的编辑情况：
利用引物CRISPR-F/R扩增得到水稻基因组中含有敲除位点的产物，并测序确定敲除位点的编辑情况。由于敲除位点位于该基因的编码区，因此CRISPR/Cas9体系对该位点的编辑可以高效的改变该基因的功能。OsZNF9基因在敲除水稻材料中的碱基编辑情况如图4所示。
(2)敲除材料的耐盐性检测：
通过常规方法对敲除材料及YB种子进行浸种、催芽。随后移栽进水培盒中，并转入28℃培养箱中。当材料苗期(四叶一心)时，将材料在含200mM NaCl的Yoshida营养液中培养3天，随后转入正常的Yoshida营养液中继续复水5-10天，统计分析材料的存活率。
OsZNF9敲除材料在在盐处理条件下的性状表现，如图5所示。在水稻YB体内敲除OsZNF9后，水稻的耐盐性显著提升，其存活率明显高于YB，表明敲除或降低OsZNF9的表达量显著提升控水稻的耐盐性。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种提高水稻耐盐的方法，其特征在于，所述方法包括：降低OsZNF9基因在水稻体内的表达或将OsZNF9基因在水稻体内敲除，或降低OsZNF9蛋白在水稻体内的活性；其中，所述OsZNF9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的提高水稻耐盐的方法，其特征在于，所述将OsZNF9基因在水稻体内敲除，包括：构建OsZNF9基因敲除载体，将其转化到水稻组织或细胞中。
3.根据权利要求2所述的提高水稻耐盐的方法，其特征在于，所述OsZNF9基因敲除载体的基础载体包括作物改造载体，所述作物改造载体包括双元农杆菌载体和用于作物微弹轰击的载体中的一种，所述双元农杆菌载体包括pYLCRISPR/Cas9Pubi-B、pYLCRISPR/Cas9P35S-H、pYLCRISPR/Cas9P35S-N或其他基因编辑技术载体；所述转化方法包括显微注射、农杆菌街道的遗传转化、通过Ti质粒、Ri质粒或病毒载体中的一种。
4.根据权利要求1所述的提高水稻耐盐的方法，其特征在于，所述将OsZNF9基因在水稻体内敲除，包括：
以OsZNF9基因上的CDS区域序列为靶标，设计敲除位点，利用CRISPR/Cas9系统对该基因进行编辑，利用Overlapping PCR法构建gRNA表达盒，将表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9载体上，得到含有敲除位点的OsZNF9-KO敲除载体；
将敲除载体OsZNF9-KO转入EHA105农杆菌中，利用敲除载体及所述农杆菌自身特性筛选得到用于侵染水稻组织的阳性农杆菌菌株；
将所述阳性农杆菌菌株侵染水稻愈伤组织，在潮霉素的筛选培养基上暗培养，获得阳性转基因愈伤组织；
将所述阳性愈伤组织进行分化、生根、移栽培养获得T0代转基因植株；
通过分子标记检测以及水稻栽培方法获得水稻耐盐性提高的T1代植株。
5.一种参与水稻耐盐调控的OsZNF9基因，其特征在于，所述OsZNF9基因具有如SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列。
6.一种包含权利要求5所述OsZNF9基因的敲除位点的敲除载体。
7.一种包含权利要求6所述敲除载体的转化体、转基因系。
8.一种权利要求5所述的OsZNF9基因、权利要求6所述的敲除载体或权利要求7所述的转化体、转基因系在提高水稻耐盐性或培育水稻耐盐品种上的应用。
9.权利要求5所述的OsZNF9基因在单子叶禾本科作物中的同源基因在提高单子叶禾本科作物耐盐中的应用。
10.OsZNF9基因作为分子标记在水稻育种中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311346144.8A CN117343955A (zh) | 2023-10-18 | 2023-10-18 | OsZNF9基因提高水稻耐盐的方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311346144.8A CN117343955A (zh) | 2023-10-18 | 2023-10-18 | OsZNF9基因提高水稻耐盐的方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117343955A true CN117343955A (zh) | 2024-01-05 |
Family
ID=89362629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311346144.8A Pending CN117343955A (zh) | 2023-10-18 | 2023-10-18 | OsZNF9基因提高水稻耐盐的方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117343955A (zh) |
-
2023
- 2023-10-18 CN CN202311346144.8A patent/CN117343955A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110904071B (zh) | Raf49蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用 | |
| CN109750047B (zh) | 茶树己糖转运体基因CsSWEET17及其在调控植物营养生长和种子大小中的应用 | |
| CN109385431B (zh) | OsERF2基因调控水稻籽粒大小的应用 | |
| CN107541520A (zh) | 与水稻根发育和抗逆性相关OsSAUR11基因及编码蛋白与应用 | |
| CN109486830A (zh) | 水稻snb基因及应用、调控籽粒大小的方法 | |
| CN110358772B (zh) | 提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因及制备方法与应用 | |
| CN110128514A (zh) | 水稻孕穗期耐冷性相关蛋白CTB4b及编码基因与应用 | |
| CN110004154B (zh) | 茶树CsJAZ1基因的应用 | |
| CN111662366A (zh) | 一种早花高产番茄材料的制备方法 | |
| CN107253980B (zh) | OsGRF7基因在水稻株型调控中的应用 | |
| CN107325161B (zh) | 一种与耐低氮胁迫和高盐胁迫相关的蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN107446928A (zh) | 一个花椰菜器官发育调控miRNA序列及其应用 | |
| CN103172717B (zh) | 植物耐低钾胁迫相关蛋白GmWRKY50及其编码基因与应用 | |
| CN112410314B (zh) | 乙酰转移酶OsG2基因及其编码的蛋白质的应用 | |
| CN114292855A (zh) | 一种调控杨树木质部发育的PagARR9基因及其应用 | |
| CN117343955A (zh) | OsZNF9基因提高水稻耐盐的方法及应用 | |
| CN109371041B (zh) | 一种增加穗粒数的水稻基因OsHGN及其应用 | |
| CN106434692A (zh) | 水稻OsPCF7基因在培育高分蘖水稻品种中的应用 | |
| CN116789785B (zh) | 长雄蕊野生稻高产、高光效基因FarL1及其应用 | |
| CN114807162B (zh) | 一种提高水稻光合效率和产量的方法 | |
| CN115851821B (zh) | Bbx16基因在提高植物盐耐受性中的应用 | |
| CN114516906B (zh) | 玉米与菌根真菌共生相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN116536286B (zh) | 水稻OsCTK1蛋白及其编码基因的应用 | |
| CN110499326B (zh) | Rgga在调控作物农艺性状中的应用 | |
| CN117965607A (zh) | 水稻低镉高产基因OsCd5及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |