CN117965607A - 水稻低镉高产基因OsCd5及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻低镉高产基因OsCd5及其应用，属于作物基因工程技术领域。所述OsCd5基因的核苷酸序列和其编码蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明通过在水稻体内差异表达OsCd5基因发现：提高OsCd5表达，水稻籽粒和茎秆中镉含量显著降低，水稻的二次枝梗和穗长、单株产量显著高于野生型对照粤泰B(YB)，表明OsCd5与水稻产量也密切相关，提高OsCd5的表达水平可同时提高水稻产量并降低镉含量。因此OsCd5基因为利用分子标记辅助育种及利用基因工程的方法培育低镉、高产水稻新品种提供了强有力的手段和工具，具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于作物基因工程技术领域，具体涉及OsCd5基因调控水稻低镉和高产的方法及应用。
背景技术
镉作为一种常见的重金属，在矿业和工业废水中通常含量较高，当其污染农田后，镉很容易为水稻等农作物所吸收，进而通过消化道进入人体。镉可与富含巯基、氨基或羧基的蛋白质分子结合形成镉结合蛋白，抑制多种酶的活性，并逐渐在肝和肾等重要器官中进行富集，从而干扰肝、肾功能。同时，镉富集会取代骨中钙，使骨骼严重软化；并降低人体内锌镉比，从而导致高血压的上升。因此，镉毒性对人类健康构成严重威胁。
水稻作为世界一半以上人口的主食，也是镉摄入的主要来源。据报道，人类从大米中摄取的镉占总镉摄入量的40-65％。因此，降低水稻镉含量，对于确保稻米等主食安全至关重要。降低水稻镉含量的途径有多种，而挖掘水稻低镉性状相关优势基因来降低稻米中镉含量是一个最经济有效的途径。
金属硫蛋白家族基因在水稻、小麦等农作物中广泛存在。大量研究表明金属硫蛋白基因家族可参与作物籽粒发育、维持金属离子平衡以及生物和非生物胁迫等多种生物学功能。
发明内容
本发明通过水稻全基因组关联分析鉴定到了一个降低稻米中镉积累的基因OsCd5，它编码一个金属硫蛋白基因OsMT2b的一个新转录本LOC_Os05g02070.2。提高该转录本表达，可显著降低水稻籽粒镉含量并提升水稻产量。这为同时调控水稻低镉和高产提供了新的遗传和基因工程手段，可广泛应用于水稻低镉和高产品种的选育和利用。
本发明目的是提供一种调控水稻低镉和高产的方法，进而提供OsCd5基因在育种上的应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种调控水稻低镉和高产的方法，所述方法包括：
将OsCd5基因在水稻体内高表达，或提高OsCd5蛋白在水稻体内的活性；其中，所述OsCd5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述调控水稻低镉指降低水稻地上部分、水稻籽粒的镉含量。
进一步地，所述将OsCd5基因在水稻体内高表达，包括：
构建OsCd5基因高表达载体；将OsCd5基因高表达载体转化到作物组织或细胞中。
进一步地，所述OsCd5基因高表达载体的基础载体包括作物改造载体，所述作物改造载体包括双元农杆菌载体和可用于作物微弹轰击的载体中的任一种，所述双元农杆菌载体包括但不限于pCAMBIA1301。
进一步地，所述转化方法包括但不限于显微注射、农杆菌介导的遗传转化、通过Ti质粒、Ri质粒或病毒载体中的任一种所介导的遗传转化。
进一步地，所述将OsCd5基因在水稻体内高表达，具体包括：
获得核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的基因片段；
将所述基因片段插入含有强启动子的表达载体pCAMBIA1301-35SN中，利用所述表达载体上的标记基因筛选阳性克隆，获得重组表达载体OsCd5-OE；
将所述重组表达载体OsCd5-OE转入EHA105农杆菌中，利用表达载体及所述农杆菌自身特性筛选得到可用于侵染水稻组织的阳性农杆菌菌株；
将所述阳性农杆菌菌株侵染水稻愈伤组织，在潮霉素的筛选培养基上暗培养，获得阳性转基因愈伤组织；
将所述阳性愈伤组织进行分化、生根、移栽培养获得T0代转基因植株；
通过常规的分子标记检测以及水稻栽培方法获得水稻低镉、高产的T1代植株。
在本发明的第二方面，提供了一种低镉、高产基因OsCd5，所述低镉、高产基因OsCd5具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种OsCd5蛋白，所述OsCd5蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
在本发明的第四方面，提供了一种包含所述的低镉、高产基因OsCd5的重组载体。
进一步地，所述重组载体包括上述重组表达载体OsCd5-OE。
在本发明的第五方面，提供了一种包含所述基因或重组载体的生物材料，所述生物材料包括细胞、转化体、转基因系。
在本发明的第六方面，提供了所述的低镉、高产基因OsCd5、所述的OsCd5蛋白、所述的生物材料在水稻低镉、高产品种培育上的应用。
本发明至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供一种调控水稻低镉、高产的方法，通过过量表达OsCd5的方法来调控水稻低镉及高产，说明该基因可作为水稻调控低镉和高产的标记应用于水稻低镉、高产农作物育种当中。因此OsCd5基因为利用分子标记辅助育种及利用基因工程的方法培育水稻低镉、高产新品种提供了强有力的手段和工具，具有巨大的应用潜力。
附图说明
图1是OsCd5基因结构图。
图2是OsCd5基因在高表达水稻材料中的模型结构。
图3是OsCd5高表达水稻材料镉含量检测；其中a、b、c为OsCd5高表达材料的镉处理前后及复水后表现，d为OsCd5高表达材料的表达水平检测，e为OsCd5高表达材料的地上部分镉含量表现，f为OsCd5高表达材料的复水后存活率统计。
图4是OsCd5高表达水稻材料在成熟期的农艺性状；其中a为OsCd5高表达材料的植株和穗型示图，b为OsCd5高表达材料的穗长表现，c为OsCd5高表达材料的二次枝梗表现，d为OsCd5高表达材料的每穗穗粒数表现，e为OsCd5高表达材料单株产量表现，f为OsCd5高表达材料千粒重表现，g为OsCd5高表达材料籽粒中镉含量表现。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
下述实施例中的水稻按照正常的管理方法培养：首先新鲜的水稻种子需要浸种催芽，种子露白后在准备好的秧田里播种，秧苗4叶一心期移栽到大田。
本发明的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
本实验室前期对水稻低镉、高产机制的研究中鉴定出一个新的金属硫蛋白(metallothionein)基因OsCd5(图1)。研究表明该基因参与水稻低镉、高产的调控。
本发明通过在水稻体内差异表达OsCd5基因发现：水稻体内高表达OsCd5，水稻的地上部分镉含量显著降低，其存活率明显高于粤泰B(YB)，表明OsCd5与水稻低镉密切相关；在水稻体内高表达OsCd5，水稻的二次枝梗、穗长、每穗穗粒数及单株产量显著高于粤泰B(YB)，表明OsCd5与水稻产量密切相关，提高OsCd5的表达量可以在提高水稻产量的同时降低镉含量。
因此，根据本发明一种典型的实施方式，提供一种参与水稻低镉、高产调控的OsCd5基因，所述OsCd5基因具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
所述OsCd5基因具有如下特征：
(1)其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示基因组碱基序列；
(2)其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示转录序列；
(3)其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示cDNA序列；
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列由1112个碱基组成，其中包含外显子、内含子和3’UTR。
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为转录序列。
SEQ ID NO.3所示核苷酸序列为cDNA编码序列。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供一种OsCd5蛋白，参与水稻低镉、高产调控的蛋白，为了使OsCd5蛋白质便于研究和利用，可在该蛋白序列的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。所述OsCd5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
表1-标签及其氨基酸序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tagⅡ | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
OsCd5为能够调控水稻低镉、高产的基因，其在水稻低镉、高产品种的培育上具有重要意义。
根据本发明又一典型的实施方式，提供一种调控水稻低镉、高产的方法，所述方法包括下述步骤：将OsCd5基因在水稻体内高表达，其中，所述OsCd5基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
上述技术方案中，所述将OsCd5基因在水稻体内高表达，包括：
构建OsCd5基因高表达载体；
将OsCd5基因高表达载体转化到作物组织或细胞中。
所述OsCd5基因高表达载体的基础载体包括作物改造载体，所述作物改造载体包括但不限于双元农杆菌载体和可用于作物微弹轰击的载体中的任一种，所述双元农杆菌载体包括pCAMBIA1301；所述转化方法包括但不限于显微注射、农杆菌介导的遗传转化、通过Ti质粒、Ri质粒或病毒载体中的任一种所介导的遗传转化。
为了达到利用OsCd5基因改造农作物产量的目的，在构建载体时可以在基因起始位点前添加任何一种有助于增强OsCd5基因表达的启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，此外还可以通过添加增强子的方式达到差异表达的目的。无论采用何种方式必须保证编码序列的正确性从而获得正确的OsCd5蛋白结构。
可采用那些含有标记基因如：GUS基因、GFP基因，抗潮霉素基因、抗除草剂基因等的载体构建重组载体，这样更有利于实验操作以及后期的作物筛选及选择。
作为一种具体的实施方式，所述将OsCd5基因在水稻体内高表达，具体包括：
获得核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的基因片段；具体可直接合成或通过PCR获得核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示基因片段；
将所述基因片段插入含有强启动子的表达载体pCAMBIA1301-35SN中，利用所述表达载体上的标记基因筛选阳性克隆，获得重组表达载体OsCd5-OE；
将所述重组表达载体OsCd5-OE转入EHA105农杆菌中，利用表达载体及所述农杆菌自身特性筛选得到可用于侵染水稻组织的阳性农杆菌菌株；
将所述阳性农杆菌菌株侵染水稻愈伤组织，在潮霉素的筛选培养基上暗培养，获得阳性转基因愈伤组织；
将所述阳性愈伤组织进行分化、生根、移栽培养获得T0代转基因植株；
通过常规的分子标记检测以及水稻栽培方法获得水稻低镉、产量提高的T1代植株。
所述的低镉、高产基因OsCd5，含OsCd5基因的生物材料(重组载体、细胞、转化体、转基因系)均可在水稻低镉和高产的培育上进行应用。
下面将结合实施例及实验数据对本发明的一种调控水稻低镉和产量的方法进行详细说明。
实施例1
1、OsCd5基因片段的获得
利用水稻粤泰B(YB)cDNA为模板，设计引物对OsCd5-F/R并在各自5’端添加相应的重组序列(引物序列见表2)，进行PCR扩增，对产物进行测序分析，扩增得到的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。在其他实施方式中，可直接合成核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的基因片段。
表2-引物序列
2、OsCd5基因高表达载体的构建
将上述用引物对OsCd5-F/R通过PCR扩增得到的基因片段通过重组反应插入到含有强启动子的表达载体pCAMBIA1301-35SN(可购买自淼灵质粒平台，货号P0380)中，利用载体上的标记基因筛选阳性克隆，得到重组表达载体OsCd5-OE。
3、OsCd5基因高表达转基因植株的获得
构建好的OsCd5-OE载体可以通过电转或热激的方法转入EHA105农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中，利用载体及农杆菌自身特性筛选得到可用于侵染水稻组织的阳性农杆菌菌株。
用含有重组质粒OsCd5-OE的重组农杆菌菌株侵染水稻粤泰B(YB)愈伤组织，在含50mg/L潮霉素的筛选培养基上暗培养，获得阳性转基因愈伤组织。将阳性愈伤分化、生根、移栽获得T0代转基因植株。通过常规的分子标记检测以及水稻栽培方法获得T1代植株。OsCd5基因在高表达水稻材料中的模型结构如图2所示。
4、OsCd5基因高表达植株的镉含量及产量检测
(1)通过qRT-PCR检测OsCd5基因的表达量：
35S启动子作为植物强启动子，可以提升目的基因在植物体内的表达含量。利用常规的RNA提取方法获得OsCd5高表达植株及野生型植株的总RNA，并利用反转录试剂盒(购自Invitrogen公司)获得相应的cDNA。利用引物对OsCd5-RT-F/R进行qRT-PCR检测OsCd5的表达水平；以引物对Actin-RT-F/R扩增的PCR产物作为内参；上述引物序列见表3。
表3-引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| OsCd5-RT-F | ATGGATGCAGATGCAAGATG |
| OsCd5-RT-R | AAGCTCTGATCGACAGTAGC |
| Actin-RT-F | GGAAGTACAGTGTCTGGATTGGAG |
| Actin-RT-R | TCTTGGCTTAGCATTCTTGGGT |
(2)OsCd5基因高表达植株的镉含量检测及单株产量统计：
通过常规方法对OsCd5高表达材料及粤泰B(YB)种子进行浸种、催芽。随后移栽进水培盒中，并转入28℃培养箱中。当材料苗期(四叶一心)时，将材料在含1mM CdCl2的Yoshida营养液中培养72小时，OsCd5高表达材料在镉处理条件下的性状表现，如图3所示。镉处理后，OsCd5高表达植株相对于野生植株叶片黄化程度显著减轻；OsCd5高表达植株地上部分镉含量相对于野生植株显著降低，其存活率明显高于粤泰B(YB)。
通过常规方法对OsCd5高表达材料及野生型粤泰B(YB)的种子进行浸种、催芽、移栽。当材料穗部发育成熟后，分别将材料进行收种。然后对OsCd5高表达材料和野生型材料进行考种，统计其穗长、二次枝梗、穗粒数、单株产量及籽粒镉含量。OsCd5高表达材料在成熟期的籽粒及产量、镉含量表现如图4所示。OsCd5高表达植株穗长、二次枝梗、穗粒数及单株产量都显著高于粤泰B(YB)，表明OsCd5通过影响水稻二次枝梗、穗长及穗粒数，进而提高水稻产量；OsCd5高表达植株籽粒的镉含量较对照粤泰B显著下降，表明提高OsCd5的表达量显著降低水稻的镉含量。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种调控水稻低镉和高产的方法，其特征在于，所述方法包括：提高OsCd5基因在水稻体内的表达，或提高OsCd5蛋白在水稻体内的活性；其中，所述OsCd5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的调控水稻低镉和高产的方法，其特征在于，
所述将OsCd5基因在水稻体内高表达，包括：构建OsCd5基因高表达载体，将其转化到水稻组织或细胞中。
3.根据权利要求2所述的调控水稻低镉和高产的方法，其特征在于，所述OsCd5基因高表达载体的基础载体包括作物改造载体，所述作物改造载体包括双元农杆菌载体和用于作物微弹轰击的载体中的任一种，所述双元农杆菌载体包括pCAMBIA1301；所述转化方法包括但不限于显微注射、农杆菌介导的遗传转化、通过Ti质粒、Ri质粒或病毒载体中的任一种所介导的遗传转化。
4.根据权利要求1所述的调控水稻低镉和高产的方法，其特征在于，
所述将OsCd5基因在水稻体内高表达，包括：
获得核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的基因片段；
将所述基因片段插入含有强启动子的表达载体pCAMBIA1301-35SN中，利用所述表达载体上的标记基因筛选阳性克隆，获得重组表达载体OsCd5-OE；
将所述重组表达载体OsCd5-OE转入EHA105农杆菌中，利用表达载体及所述农杆菌自身特性筛选得到可用于侵染水稻组织的阳性农杆菌菌株；
将所述阳性农杆菌菌株侵染水稻愈伤组织，在潮霉素的筛选培养基上暗培养，获得阳性转基因愈伤组织；
将所述阳性愈伤组织进行分化、生根、移栽培养获得T0代转基因植株；
通过常规的分子标记检测以及水稻栽培方法获得水稻光合效率和产量提高的T1代植株。
5.一种低镉、高产基因OsCd5，其特征在于，所述基因OsCd5具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
6.一种OsCd5蛋白，其特征在于，所述OsCd5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.一种包含权利要求5所述的低镉、高产基因OsCd5的重组载体。
8.一种包含权利要求5所述基因或权利要求7所述重组载体的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括细胞、转化体、转基因系。
9.权利要求5所述的基因或权利要求6所述的蛋白在低镉、高产水稻品种培育上的应用。
10.权利要求7所述的重组载体或权利要求8所述的生物材料在低镉、高产水稻品种培育上的应用。
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