CN105112443A - 水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK5的基因工程应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK5的基因工程应用。水稻K⁺转运蛋白基因OsHAK5在创建耐低钾胁迫，提高水稻有效分蘖的养分高效和水稻高产的新的水稻种质中的应用。本发明中，世界上首次发现由水稻K⁺转运蛋白基因OsHAK5构建的重组表达载体，通过农杆菌介导的水稻转基因技术转染到野生型水稻日本晴(Oryza？sativa.ssp.cv.Japonica)中，OsHAK5转基因水稻材料的总分孽、有效分蘖数、生物量和籽粒产量比野生型水稻极显著提高。

Description

水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK5的基因工程应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK5的基因工程应用。

背景技术

作为作物生产的三大必须矿质元素之一，钾(K)是植物体内最为丰富的阳离子，大约占植株干重的4-10％(1-2)，同时K是主要的渗透调节物质，调控植物细胞膨压和细胞膜电位平衡(3-5)，此外，K还参与植物体各种生理生化过程。例如，超过60多种酶的激活剂(6)，调节植物的气孔开闭，促进植物的光合作用，有利于光合产物在植物体内的积累和运输(7-8)，K还作为“伴侣离子”参与和促进硝态氮的吸收和利用(9-11)。由于全球钾矿资源大量耗竭和分布不均匀(12)，加上土地盐渍化严重(13)，作物缺K和Na毒害成为限制全球粮食生产的两大限制因子，如何通过生物技术手段增强作物在低K和高Na环境下K的吸收，维持作物体内的K的稳态平衡，提高K利用效率，减少钠的吸收和往地上部的转运从而减轻盐害对于提高作物产量和品质意义重大。

植物在长期的进化过程中产生一套复杂的K素吸收系统(14)，随着分子生物学技术手段和植物基因工程的发展，植物细胞膜上有编码K离子通道基因和K转运体基因被克隆出来(15-18)，据文献报道，对K的亲和性的不同可分为低亲和和高亲和两套系统(19),目前研究认为当外界环境K浓度较高时,主要是有根系细胞膜上的K通道基因顺电化学势梯度吸收K,而当外界环境K浓度较低时,根细胞膜上的K转运蛋白需要在H⁺-ATPase酶提供能量逆电化学势梯度将K通过细胞膜往细胞内转运。其中，KT/HAK/KUP家族被认为是高亲和K转运体，同时也是植物K转运体最大的家族(20-21)。在模式植物拟南芥中，该家族成员的生理功能在异源系统和拟南芥体内被鉴定出来，而单子叶模式作物水稻中，关于该家族的成员的生理功能报道不多，最近，我们钾营养研究小组发表的关于水稻该成员之一OsHAK5基因在水稻低钾吸收和转运及抗盐胁迫方面的生理功能(23)，我们的研究结果也于之前报道的该基因在酵母异源系统的功能相一致(18)。通过对拟南芥和水稻两个不同类型的模式物种研究，揭示了该家族成员在植钾营养吸收和抗盐斜迫方面的重要生理功能。

除了矿质养分之外，在影响作物产量和品质的因素当中，植物株型无疑是其中不可或缺的要素，植物地上部的株型包括株高、有效分蘖数、分蘖角度及穗粒数等(22)，这些参数对于籽粒产量有重要作用。由于决定植株产量的是有效分蘖数，以此提高植株的有效分蘖数对于提高植株产量的研究受到特别的关注。

在水稻中，目前推测有27个家族成员，属于高亲和的KT/HAK/KUP家族(21)。对于这个家族成员的在水稻体内的生理功能分析报道还比较少(23,24-25)，主要集中在关于该家族生理功能的研究，尤其是在水稻中关于该家族成员影响植株地上部株的作用国际上还没有报道，是一个比较新颖的研究领域。

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发明内容

本发明的目是提供水稻K⁺转运蛋白基因OsHAK5的工程应用，主要是控制分蘖，具备同时提高产量及其钾素吸收利用的双重功能。

本发明的目的通过如下技术实现：

水稻K⁺转运蛋白基因OsHAK5在增加植物的有效分蘖数，提高植物产量中的应用。所述的水稻K⁺转运蛋白基因OsHAK5在Genebank中登录号为AK241580。

水稻K⁺转运蛋白基因OsHAK5在增强植物的耐低钾能力，提高植物的钾素养分高效利用和增加植物有效分蘖数，增加植物产量的协同的双重功能。

水稻K⁺转运蛋白基因OsHAK5在创建耐低钾胁迫，提高水稻有效分蘖的养分高效和水稻高产的新的水稻种质中的应用。

本发明的有益效果：

1.本发明中，世界上首次发现由水稻K⁺转运蛋白基因OsHAK5构建的重组表达载体，通过农杆菌介导的水稻转基因技术转染到野生型水稻日本晴(Oryzasativa.ssp.cv.Japonica)中，我们惊讶得发现在OsHAK5转基因材料在田间和桶培出现株高降低，水稻植株的有效分蘖和总分蘖数较野生型材料有大幅度增加，且能够提高水稻植产量。这一表型的出现，目前在国际钾离子转运体研究方面还没有报到类似的功能，具有很强的创新性。

2.本发明中的OsHAK5基因来源于水稻，不是外源基因，因此具有生物安全性，所构建的水稻K⁺转运蛋白基因OsHAK5植物表达载体可以直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，获得OsHAK5基因增加植物有效分蘖的新种质。

3.本发明中的OsHAK5转基因水稻根毛及侧根数显著高于野生型水稻，增强了转基因水稻材料的耐低钾能力。

4.本发明中的OsHAK5基因能够提高水稻根系吸收和将钾由根系向地上部转运，并且能够在盐胁迫条件下将提高水稻地上部的K⁺/Na⁺提高转基因水稻材料的耐盐能力，这部分功能已经被报道了，这部分的功能比较明确，在此基础上，我们提供了一种既能够耐低钾胁迫，又能提高水稻有效分蘖的养分高效和水稻高产的新的水稻种质资源。

附图说明

图1OsHAK5转基因材料的分子鉴定。

图2OsHAK5转基因水稻材料的田间表型(A)和农艺性状指标统计(B)。

图3OsHAK5基因在加钾和缺钾下在侧根和侧根原基组织定位图。

其中，LRP表示侧根原基，LR表示侧根。

图4OsHAK5转基因水稻材料缺钾条件下的根系表型分析。

图5OsHAK5转基因材料在桶培低钾处理(上图)及其田间正常供钾条件(下图)下的表型及主要农艺性状指标统计。

图6pTCK303表达载体图谱。

具体实施方式

实施例1OsHAK5基因的克隆

1.模板：提取正常水培2周大小的日本晴野生型水稻叶片的RNA并反转录成cDNA，作为克隆OsHAK5基因的PCR扩增的模板；

2.PCR引物设计：在KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)找到OsHAK5的基因序列，利用引物设计软件Primer5.0设计引物序列，在OsHAK5基因引物序列两端加上酶切位点KpnI(GGTACC)和NheI(GCTAGC)。

OsHAK5上游引物：F:5'-ATTGGTACCATGACCGAGCCTCTGCACAC-3'(SEQIDNO.1)；

OsHAK5下游引物：R:5'-ATAGCTAGCAGATTTCCAAGAACATCACCATC-3'(SEQIDNO.2)。

3.OsHAK5基因PCR扩增：PCRBuffer2.5μl，dNTPMix2μl，上下游引物各1μl，模板1μl,KOD高保真酶0.5μl，双蒸水17μl。

PCR扩增程序如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃复性延伸2min，35个循环后，72℃10min充分延伸，10℃保持。扩增的PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测OsHAK5基因的大小为2346b序列如GeneBankaccessionNO.AK241580所示。

实施例2植物表达载体pTCK303-OsHAK5的构建及水稻转基因

1.OsHAK5基因中间载体的构建将OsHAK5基因PCR产物经琼脂糖电泳分离后切胶回收，将纯化后片段分别与pEASY-Blunt中间载体连接，酶连体系包含1μl的pEASY-Blunt载体，4μl的PCR纯化产物，25-28℃连接25min；再转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中涂在含有50μg/mLkana(卡那霉素)的LB固体培养基上生长12h-16h后，挑取阳性菌落进行测序。将测序正确的菌液加入等体积体积比30％甘油于-70℃保存备用，获得含有OsHAK5基因全长序列的重组质粒，命名为OsHAK5-P。

2.OsHAK5基因表达载体的构建用KpnI和NheI(SpecI同尾酶)双酶切OsHAK5基因片断中间载体切下，回收片段。同时用KpnI和SpecI双酶切表达载体pTCK303(EamensAL,BlanchardCL,DennisES,etal.AbidirectionalgenetrapconstructsuitableforT‐DNAandDs‐mediatedinsertionalmutagenesisinrice(OryzasativaL.)[J].Plantbiotechnologyjournal,2004,2(5):367-380.)，回收片段，与从中间载体上切下的OsHAK5基因片断通过T4DNA连接酶定向连接。连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上生长12-16h后，挑取阳性克隆，保存阳性克隆，提取大肠杆菌质粒送公司测序。最后通过电击法将pTCK303-OsHAK5质粒转化至EHA105农杆菌感受态细胞中，转化后涂在含有利弗平(Rfp)、卡那霉素(Kana)和链霉素(Str)均为50μg/ml的YEP固体培养基上生长48-72h后，挑取阳性菌落，提取质粒，回转大肠杆菌，提取质粒经测序验证无误后，将农杆菌菌液加入等体积30％甘油于-70℃冰箱保存，后续试验备用。

3.转基因水稻的获得将以上获得的转有pTCK303-OsHAK5质粒的农杆菌，侵染水稻愈伤组织，共培养(暗培)2.5天后洗菌，将晾干的愈伤转入含500mg/L羧苄青霉素(Car)和50mg/L潮霉素(Hyg)的选择培养基上进行第一轮选择培养，28℃光照培养2周，将长有抗性愈伤的愈伤转到含500mg/L羧苄青霉素和80mg/L潮霉素的选择培养基上进行第二轮选择培养，28℃光照培养，直到长出颗粒性的抗性愈伤组织。挑取同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤转入装有分化培养基的塑料广口瓶中分化培养，等待分化成苗(25-30d)，待苗长至2-3cm左右，放入生根培养基中壮苗。将分化好的苗从生根管挑出，加入适量无菌水，炼苗一周。洗去根部琼脂培养基，移栽到水稻营养液中生长并进行阳性苗鉴定，阳性苗转入大田至收获，得到T1代转基因种子。

其中使用的培养基均为现有技术。

4.转基因水稻Southernblot拷贝数鉴定。

分别采用2种核酸限制性内切酶BamHI、EcoRI，对野生型和转基因水稻DNA样品进行基因组DNA的消化，在1.0％琼脂糖凝胶上分离消化产物，并进行Southern印迹，结果见图1B，鉴定出的T1代单拷贝转基因水稻三个独立的株系(OX1,OX2,OX3图1B)扩繁后，T2代用于后续表型观察和生理指标的测定。

5.OsHAK5转基因水稻材料超表达效果鉴定将野生型和T2代转基因水稻种子(去颖壳)放入50ml无菌离心管中，加30％次氯酸钠溶液浸泡10min；倒去次氯酸钠溶液，无菌水清洗4-5遍，最后一遍浸泡30min。将种子小心转移到无菌滤纸上吸干，用无菌的镊子将种子小心地置入灭菌的IRRI固体培养基上(0.4％phytagel)，在组培室中28℃培养2周。野生型和转基因水稻OsHAK5基因的超表达效果鉴定：

取2周的野生型和转基因根系和地上部迅速置于液氮中冷冻保存，按照常规方法提取总RNA，用质量比为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并用分光光度计检测总RNA的浓度和纯度利用上一步提取的总RNA反转录合成总cDNA，反转录试剂盒购自Fermentas公司，Canada。半定量PCR(RT-PCR)和定量PCR(qPCR)分别以反转录出来的野生型和转基因水稻的根和叶片cDNA为模板，设计特异性水稻内参和OsHAK5基因引物，引物序列见表1。按表2组份配制PCR反应液(冰上配制反应液)。

表1水稻内参和K⁺转运体基因OsHAK5的半定量和定量引物

表2荧光定量PCR反应体系

PCR反应条件如下:

为了检测转基因水稻中OsHAK5基因的超表达效果，我们正常水培2周的野生型和转基因水稻根和叶片的中OsHAK5基因表达的半定量(RT-PCR)和定量(qPCR)检测结果发现，转基因水稻植株根部和地上部中的OsHAK5基因表达显著高于野生型(图1C-D)。与野生型水稻相比，转基因T1代水稻植株代呈现出株高降低，分蘖增加的表型(图1B)。

实施例3野生型和转基因水稻的桶培表型及主要农艺性状指标统计

为了明确转基因水稻T1代水稻材料出现的株高降低，分蘖增加的表型是否可以重复，我们通过分子手段鉴定了三个单拷贝且OsHAK5基因的超表达效果稳定的三个独立的T2代水稻株系，使用1/2MS培养基发苗10天，挑选长势一致的水稻幼苗转移到完全水稻营养液中，水培2周后进行正常施肥条件下的桶培试验，在水稻成熟期对野生型和转基因水稻进行相关的农艺性状指标统计，统计结果表明，转基因水稻在T1代的桶培表型是能够进行稳定遗传的，具体表现为与野生型水稻相比，转基因水稻株高降低，总分蘖和有效分蘖数增多，尽管结实率较野生型有所降低，但由于有效分蘖比野生多，最后单株产量比野生型显著提高，具体的的表型和农艺性状指标见图2A-B。

实施例4野生型和转基因水稻根系构型的比较分析

钾素营养对根系的正常生长具有重要作用，与氮、磷不同，缺钾能够引起水稻根系发育不良，根冠比减小，地上部的糖分往根部运输受阻(Maetal.,2012；Caietal.,2012)。前期研究结果表明OsHAK5在根部表皮以及中柱部分高度表达，且受外界环境的缺钾诱导。将OsHAK5的启动子融合GUS进行染色发现，该基因在侧根和侧根发生原基处高度表达，且受缺钾诱导表达增强(图3)。通过对野生型和转基因水稻材料进行正常和缺钾处理7天观察主根的表型，发现正常供钾(1mM)的情况下，野生型材料和超表达材料根尖有大量的根毛产生，且表现出相似的侧根密度和侧根长度，缺钾(0mM)的情况下野生型材料根毛减少，根尖根毛长度缩短，侧根伸长受到抑制。相比较超表达材料根尖根毛的生长则受到促进，增加约一倍，侧根的影响不大(图4A-B)。因为不同材料根系形态不同，为了探明此种表型是否跟根系内特定部位的钾浓度相关，进一步将根系分段采样，利用ICP测定不同部位K⁺浓度，结果表明，在相同钾素条件下与野生型材料相比，超表达材料根系的相同部位钾离子的浓度基本一致(图4C)，K⁺浓度测定说明转基因水稻根系形态的变化与其根部K⁺浓度没有直接的关系。

实施例5野生型和转基因水稻加K和缺K下的桶培表型及农艺性状指标统计

为了研究OsHAK5在钾素营养和增加有效分蘖，增加家水稻产量方面的协同作用，我们对野生型和转基因水稻材料进行桶培实验，试验地点在南京农业大学牌楼基地的温室中进行，桶培所用土壤取自南京市地区的酸性黄棕壤，经测定其pH为5.08，用1M的NH4OAc浸提法测定土壤中速效钾含量为32.03mg/kg属于极度缺钾土(查阅土壤农化分析书如果土壤速效钾含量(mg/kg)<50极低；51-83低；84-116中；>116高)，每桶装土7.5kg，不外源施加钾肥的缺钾土壤作为-K处理，外源施加0.2g/kg的KCl的土壤作为+K处理，IRRI培养3周大的苗挑选长势一致的单株移栽，每桶2株苗，8个重复，直至培养到成熟收获，桶培农艺性状表明：转基因水稻在正常供K和缺K处理下，株高降低，有效分蘖数增多，从图上看，OsHAK5转基因植株表现为更加耐低钾，具体的农艺指标统计见表3。桶培试验结果表明，转基因水稻表现出增加有效分蘖和耐低钾胁迫能力比野生行水稻要强，从而达到了水稻增产和养分高效的协同作用(图5)。

表3野生型和转基因水稻加K和缺K下的桶培表型及农艺性状指标统计

Claims (3)

1.水稻K⁺转运蛋白基因OsHAK5在增加植物的有效分蘖数和/或提高植物产量中的应用，所述的水稻K+转运蛋白基因OsHAK5GeneBank登录号为AK241580。

2.水稻K⁺转运蛋白基因OsHAK5在增强植物的耐低钾能力，提高植物的钾素养分高效利用中的应用，所述的水稻K⁺转运蛋白基因OsHAK5GeneBank登录号为AK241580。

3.水稻K⁺转运蛋白基因OsHAK5在创建耐低钾胁迫，提高水稻有效分蘖的养分高效和水稻高产的新的水稻种质中的应用。