KR20030086551A - 식물로부터의 아넥신을 인코드하는 핵산 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 칼슘-의존적 멤브레인 결합 단백질의 멀티유전자 패밀리에 속하는 아넥신 1(ANX1) 및 아넥신 4(ANX4)를 인코드하는 핵산 분자를 제공한다. ANX1 및 ANX4는 앱시스산(ABA), 염 및 다른 다양한 스트레스 처리에 의해 유도될 수 있다.anx1및anx4돌연변이 식물은 종자 발아 및 초기 묘목 생장 동안 염 및 ABA에 대한 그들의 과민성에 의해 특성화된다. 본 발명은 환경 스트레스에 내성적인 형질전환 식물을 생성하는데 이용될 수 있다.

Description

식물로부터의 아넥신을 인코드하는 핵산 분자{Nucleic acid molecules encoding annexins from plants}
본 발명은 식물에서 스트레스 저항성에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 환경적 스트레스로부터 식물을 보호하기 위해 삼투압 스트레스 및 ABA 시그날링에 관련된 칼슘-의존적 멤브레인 결합 단백질, ANX1 및 ANX4을 인코드하는, 식물로부터의 신규한 유전자를 제공한다.
토양 염도는 생산율의 감소를 이끄는 특히 농작 식물에 있어서 가장 유의적인 무생물적 스트레스 중 하나이다. 식물은 염도에 의해 유발된 이온 및 삼투압 스트레스에 적응하는 능력을 지닌다. 염 스트레스는 K+의 결핍과 함께 과도한 독성적 Na+의 축적 및 세포질 내에서의 팽압 변화를 유발하여 각각 이온 및 삼투압 항상성의 분열을 이끈다. 염-유도된 이온 스트레스는 다른 스트레스와 분명히 구별되는 반면 삼투압 스트레스는 일반적으로 염, 추위 및 가뭄에 의해 유도된다.
이온 스트레스 시그날링에 대한 염 과도한 민감성(Salt Overly Sensitive(SOS)) 경로가 유전적 분석을 통해 밝혀졌다(Wu et al., 1996; Liu and Zhu, 1997; Zhu et al., 1998). SOS3, 칼슘2+-결합 단백질은 염 스트레스에 의해 유도된 Ca2+변화를 감지한다(Quinero et al., 2002). SOS3-SOS2 키나제 복합체는 SOS1, 플라스마 멤브레인 Na+/H+교환자, 실질적으로 세포질로부터의 Na+의 제거와 같은 이온 운반자의 발현 및 운반 활성을 조절한다(Qiu et al., 2002).
삼투압 스트레스에 의해 활성화된 일부 단백질 키나제의 확인으로 삼투압 스트레스가 SOS 경로와 구별되는 시그날링 경로를 활성화한다 증거가 나타났다(Zhu, 2002). 미토젠(mitogene)-활성화된 단밸질 키나제(MAPKs)는 고삼투압 스트레스에 의해 활성화된다(Xiong et al., 2002). 아라비돕시스에서 적어도 3개 이상의 MAPKs가 염 및 다른 스트레스에 의해 활성화된다(Ichimura et al., 2000; Drolliard et al., 2002). Ca2+-의존적 단백질 키나제(CDPKs)는 Ca2+시그날링과 관련된 삼투압 스트레스 반응에 연관되었다(Romeis et al., 2001).
식물 호르몬, 앱시스산(ABA)은 스트레스 반응에 중요한 역할을 한다(Giraudat et al., 1994). 삼투압 및 추위 스트레스는 ABA의 증가된 레벨을유도한다(Zeevaart and Creelman, 1998). 물 부족 또는 높은 염에 의해 유도된 삼투압 스트레스는 많은 유전자의 발현을 변화시킨다(Skriver and Mundy, 1990). 이들 유전자의 일부는 ABA에 의해서도 유도되어 호르몬이 스트레스 시그날링을 매개하는 것을 제안한다(Skriver and Mundy, 1990). 분자적 연구는 ABA-의존적 및 독립적 경로에 관련된 스트레스-유도성 유전자를 제어하는 시스(cis)- 및 트랜스(trans)-작용 요소의 확인을 이끌었다(Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 1994; Grill and Himmelbach, 1998; Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 2000)/
ABA, 추위, 가뭄 및 염 스트레스는 식물 세포 내에서의 세포질 Ca2+레벨의 증가를 시작시킨다(Knight et al., 1996; Knight and Knight, 2001). 두 번째 메신저로서 Ca2+는 시그날링 경로를 활성화시켜 세포 기능의 다양한 측면에 영향을 미친다(Knight et al., 1996; Knight et al., 1997; Trewavas, 1999). Ca2+-결합 단백질은 Ca2+시그날링의 변환기로 작용한다. Ca2+-결합 단백질은 칼모듈린(Zielinski, 1998; Luan et al., 2002), CDPKs(Harmon et al., 2000), 칼시뉴린 B-유사 단백질(CBLs)(Luan et al., 2002) 및 SOS3(Liu and Zhu, 1998)과 같이 식물 내에서 확인되었다. 많은 이들 단밸질은 ABA 및 무생물 스트레스 반응에 관련된다(Sheen, 1996; Sajio et al., 2000; Townely and Knight, 2002).
스트레스 시그날 변환의 이해에 상당한 진보에도 불구하고 스트레스 반응의 메카님즘에 대해 거의 모른다. 신규한 시그날링 구성성분의 확인이 스트레스 시그날링의 해명에 기여할 것이다. 아라비돕시스에서의 게놈 서열화의 완성에 따라 스트레스-반응성 단백질의 확인이 현재 프로테오믹스(proteomics)로 실행가능하다. 본 연구에서 아라비돕시스 뿌리로부터의 마이크로솜 프로테옴이 분리되었고 2차원(2D) 겔 전기영동 및 플라이트(flight) 매스 스펙트로메트리의 매트릭스-원조 레이저 제거(desorption)/이온화-시간(MALDI-TOF MS)을 이용하여 분석되었다. 염 스트레스에 관련된 멤브레인 단백질을 확인하는 시도에서 미이크로솜 프로테옴 내에서의 염-유도된 변화를 조사하였고 스트레스 반응의 시그날링 구성성분으로서 아넥신으로 명명된 Ca2+-의존적 멤브레인 결합 단백질을 확인하였다. 웨스턴 블럿팅과 결합된 2D 겔 분석은 아넥신 1(ANX1)의 레벨이 삼투압 스트레스에 반응하여 Ca2+-의존적 방식으로 마이크로솜 내에서 유의적으로 증가함을 나타내었다.anx1및anx4돌연변이 식물은 종자 발아 및 초기 묘목 생장 동안 염 및 ABA에 과민성이었다. 이들 관찰에 기초하여 ANXs이 식물 내에서 ABA-매개된 스트레스 반응에 중요한 역할을 하는 Ca2+-결합 단백질의 신규한 부류로 구성됨을 제안한다.
본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 칼슘-의존적 멤브레인 결합 단백질의 멀티유전자 패밀리에 속하는 아넥신 1(ANX1) 및 아넥신 4(ANX4)를 인코드하는 핵산 분자를 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 환경 스트레스에 내성적인 형질전환 식물을 생성하는데 이용될 수 있다.
도 1은 뿌리 마이크로솜 단백질의 2D 겔 전기영동 분석을 나타낸 것이다. (A) pH 4∼7의 범위에서 분석된 마이크로솜 단백질. (B) NaCl-반응성 마이크로솜 단백질. 단백질 발현 내에서의 염-반응성 변화는 2시간 동안 비처리(좌측) 또는 250mM NaCl로의 처리(우측) 묘목으로부터의 마이크로솜 단백질로 준비된 겔 내에서 분석되었다.
도 2는 조직 내에서의 ANX1의 발현을 나타낸 것이다. 다양한 조직으로부터의 천연 추출물은 SDS 겔 전기영동에 의해 분리되었고 Coomassie 염색(우측) 및 항-ANX1 항체로의 웨스턴 분석(좌측)되었다.
도 3은 무생물적 스트레스에 반응한 ANX1의 발현을 나타낸 것이다. MS 액체 배지 내에서 생장된 2주령 묘목이 2시간 동안 표시된 처리로 인큐베이트되었다. 뿌리 조직으로부터 준비된 마이크로솜 단백질이 2D 겔 전기영동 및 항-ANX1 항체로의 웨스턴 블럿팅되었다. (A) 마이크로솜 ANX1 단백질의 NaCl 반응 투여량. (B) 20% PEG, 0.25M 만니톨 및 100μM ABA으로의 처리.
도 4는 ANX1 단백질의 염 및 칼슘 반응을 나타낸 것이다. 2주령 묘목의 뿌리로부터 준비된 마이크로솜(마이크로솜) 및 세포질(세포질) 프랙션 내 단백질 및 총 단백질 추출물(총)이 2D 겔 전기영동 및 항-ANX1 항체로의 웨스턴 블럿팅되었다. (A) NaCl에 반응한 ANX1의 위치. (B) Ca2+에 반응한 시험관 내에서의 ANX1의 위치. 총 단백질 추출물은 마이크로솜 및 세포질 내로의 프랙션화 전에 2mM CaCl2또는 2mM EGTA로 15분간 처리되었다. (C) Ca2+에 반응한 생체 내에서의 ANX1의 위치. 30분간 10mM EGTA로의 비처리된(-) 또는 처리된(+) 식물이 2시간 동안 250mM NaCl로(+) 또는 없이(-) 더욱 인큐베이트되었다. (D) NaCl에 반응한ANX1발현의 노던 분석.
도 5는ANX유전자의 T-DNA 삽입 돌연변이를 나타낸 것이다. (A)ANX유전자의 개요. 화살표는ANX1, ANX2및ANX4대립 유전자 내에서의 T-DNA 삽입(삼각형)의 위치를 나타낸다. (B) 야생형,anx1,anx2, anx4식물 내에서의ANX유전자 발현의 RNA 분석. (C) 야생형 및anx1식물 내에서의 ANX1 발현의 웨스턴 분석.
도 6은 NaCl에 대한anx돌연변이 식물의 민감성을 나타낸 것이다. 야생형(WT) 및anx돌연변이의 종자가 MS 배지 단독 또는 다양한 농도의 NaCl이 보충된 배지 상에 놓였다. 발아된 종자의 백분율이 다양한 시간에 측정되었다. (A) MS 배지 상에서의 야생형 및anx돌연변이의 발아율. (B) 50mM NaCl을 함유한 MS 배지 상에서의 야생형 및anx돌연변이의 발아율. (C) 75mM NaCl을 함유한 MS 배지 상에서의 야생형 및anx돌연변이의 발아율. (D) 발아의 NaCl 반응 투여량. (E) 발아 상의 NaCl의 효과. 야생형 및anx돌연변이의 종자는 MS 배지 단독 또는 75mM의 NaCl이 보충된 배지 상에 놓여서 4일간 발아되었다.
도 7은 삼투압 스트레스에 대한anx1및anx4식물의 민감성. 야생형 및 anx 돌연변이의 종자는 MS 배지 단독 또는 다양한 농도의 만니톨(A), KCl(B), LiCl(C) 또는 CsCl(D)이 보충된 배지 상에 놓였다. 발아된 종자의 백분율이 플레이팅 후 4일에 측정되었다.
도 8은 ABA에 대한anx1및anx4식물의 민감성. (A) 0.5μM ABA를 함유한 MS 배지 상에서의 야생형 및 anx 돌연변이의 발아율. 발아된 종자의 백분율은 표시된 시간에 측정되었다. (B) 발아의 ABA 반응 투여량. (C) 발아 상의 ABA의 효과. 야생형,abi1및anx돌연변이의 종자가 0.25 및 0.5μM ABA를 함유한 MS 배지에 놓였고 4일간 발아되었다. (D) 초기 묘목 생장 상의 ABA 효과. 야생형 및anx돌연변이 종자가 발아되었고 0.25μM ABA를 함유한 MS 배지 상에서 7일간생장되었다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 3에 나타난 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 핵산 분자는 서열번호 2 및 서열번호 4에 나타난 아미노산 서열을 지닌 ANX1 및 ANX4 또는 이러한 단백질의 생물학적으로 활성인 단편을 우선적으로 인코드한다.
본 발명은 상기 핵산 분자에 의해 인코드된 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드의 생물학적으로 활성인 단편에 관한 것이다. 상기 핵산 분자에 의해 코드된 ANX1 및 ANX4 단백질은 칼슘-의존적 멤브레인 단백질의 멀티유전자 패밀리에 속하고 환경적 스트레스로부터 식물을 보호하는 ABA-매개 스트레스 반응에 중요한 역할을 한다. 또한 본 발명은 염-반응성 마이크로솜 단백질로 확인되고 뿌리 조직에서 강하게 발현하는 폴리펩타이드를 기술한다. 상기-기술된 핵산 분자에 의해 코드된 폴리펩타이드는 ABA, 염 및 다른 삼투압 스트레스에 반응하여 Ca2+-의존적 방식으로 마이크로솜 내에서 유의적으로 증가한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따라 상기 기술된 핵산 분자를 포함한 유전공학에 사용된 벡터, 발현 카세트 및 플라스미드에 관한 것이다.
하나의 관점에서 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함한 형질전환 식물 세포 및 식물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 핵산 분자의 공급은 형질전환 식물에 환경 스트레스에 대한 증가된 저항성을 생성하는 잠재력을 제공한다. 이는anx1및anx4돌연변이 식물이 종자 발아 및 초기 묘목 생장 동안 염 및 ABA에 과민성이라는 것의 발견에 기초한다.
본 발명으로 ANX1 및 ANX4을 기관-특이적인 방식으로 경제적으로 중요한 농작물에 도입시킴으로서 환경적 손상에 대한 저항성의 증가에 관하여 식물 생장을 설계하는 것이 가능하다.
따라서 본 발명은 :
서열번호 1 및 서열번호 3에 나타난 뉴클레오타이드 서열로 구성된, 칼슘-의존적 멤브레인 단백질의 멀티유전자 패밀리이고 환경 스트레스로부터 식물을 보호하는 삼투압 스트레스 및 ABA 시그날링에 관련된 ANX1 및 ANX4를 인코드하는 핵산 분자를 제공한다.
멤브레인 단백질은 다양한 세포 과정에 중요한 역할을 하고 다양한 시그날링 경로를 조절한다. 많은 시그날이 초기에 감지되고 멤브레인 내에 위치한 활성 분자를 통해 도입되고 이는 환경에 대한 세포-세포 상호작용 및 반응을 조절한다. 따라서 분석을 위해 수용체, 채널 및 멤브레인-관련 시그날링 분자와 같은 활성 단백질을 포함한 마이크로솜 프로테옴(microsomal proteome)을 타겟으로 삼았다. 본 연구에서 프로테옴 분석은 ANX1 단백질의 확인을 이끌었다. ANX1의 레벨이 아라비돕시스로부터의 뿌리 마이크로솜 프로테옴 내에서 NaCl 처리시 증가하였다. 아넥신(annexin)은 진균으로부터 인간까지 거의 모든 종에 존재하는 Ca2+-의존적 멤브레인 결합 단백질의 패밀리이다(Gerke and Moss, 2002). 아넥신은 동물 세포 내에서 광범위하게 연구되었다. 이들 단백질은 다기능성이고, 멤브레인 트래피킹(trafficking) 및 조직화, 이온 채널 활성의 조절, 인지질 대사, 염증 반응 및 유사분열 시그날링을 포함한 다양한 세포 과정에 중요한 역할을 한다(Raynal and Pollard, 1994).
따라서 본 발명은 칼슘-의존적 멤브레인 결합 단백질의 멀티유전자 패밀리이도 식물 내 삼투압 및 ABA 시그날링에 관련된 ANX1 및 ANX4 또는 이러한 단백질의 생물학적으로 활성인 단편을 인코드하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자는 상기-논의된 ANX1 및 ANX4의 활성을 소유한 서열번호 2 및 서열번호 4에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 단편을 지닌 단백질을 우선적으로 인코드한다. 서열번호 1및 서열번호 3에 나타난 핵산 분자가 바람직하다. 더욱이 본 발명은 원핵 및 진핵 세포 내에서 기능적인 발현을 위해 서열번호 1 및 서열번호 3에 나타난 뉴클레오타이드 서열을 포함한 핵산 분자로 구성된 플라스미드 및 발현 카세트에 관한 것이다. 핵산 분자는 당분야에 잘 알려진 mRNA를 이용한 역전사효소-매개 PCR(RT-PCR)과 같은 다양한 통상적이 방법 또는 프로브로서 부분적-크기 cDNA 클론을 이용한 cDNA 라이브러리의 스크리닝에 의해 전체-크기 cDNA 클론으로서 분리될 수 있다. RT-PCR 방법에 있어서, 폴리(A)+mRNA는 역전사효소 및 프라이머로서 올리고(dT)16-18을 이용한 초기 cDNA 내로 먼저 전환될 수 있다. 방해되지 않은 이중 나선 cDNA가 특정한 프라이머 쌍을 이용하여 PCR에 의해 합성될 수 있다.
또한 본 발명은 높은 스트린전트(stringent) 조건 하에서 서열번호 1 및 서열번호 3에 나타난 핵산 분자에 하이브리다이즈하는 핵산 분자에 관한 것이다. "높은 스트린전트 조건 하에 하이브리다이즈"라는 용어는 Sambrook et al.,(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989)에 기술된 바와 같이 핵산 분자가 통상적인 하이브리디제이션 조건 하에서 상보적 염기쌍을 통해 하이브리다이즈함을 의미한다. 상기 핵산 분자와 하이브리다이즈하는 핵산 분자는 일반적으로 어떠한 식물, 바람직하게는 쌀, 보리, 소맥, 오일씨드 레이프(oilseed rape), 감자, 토마토, 양배추, 상추, 시금치, 메론, 수박, 녹색 양파, 무, 콜리플라워, 사탕수수, 오이 및 사탕무와 같은 농업, 임업 및 원예 식물로부터의 것을 포함한다. 목재 식물도 바람직한 원료이다. 서열번호 1 및 서열번호 3 에 나타난 핵산 분자에 하이브리다이즈하는 핵산 분자를 분리하기 위해 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리는 프로브로서 상기-기술된 핵산 분자를 이용하여 스크린된다.
본 발명에 따라 "퇴화"라는 용어는 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열이 하나 이상의 염기 위치에 있어서 상기-기술된 핵산 분자와 다르고 상기 핵산 분자에 매우 상동적임을 의미한다. "상동적"은 70% 이상, 특히 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 나타낸다. 또한 상기 용어는 상기 기술된 바와 같이 삽입, 삭제, 염기 치환 및 재조합에 의한 다양한 핵산 분자도 한다. "상동적"은 상기 핵산 분자에 의해 코드된 핵산 분자 또는 폴리펩타이드가 구조적으로 및 기능적으로 동일함을 나타내기도 한다.
더욱이 본 발명은 단백질 분석 및 생화학 분석에 사용되기 위한 상기 핵산 분자에 의해 코드된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 생물학적으로 활성인 단편에 관한 것이다. 이러한 폴리펩타이드를 얻기 위한 효과적인 방법의 하나는 재조합 발현 시스템을 이용하는 것이다. 이렇게 하기 위해 핵산 분자가 먼저 프로모터, 종결자 및 폴리아데닐레이션 시그날과 같은 상기 핵산 분자에 의해 코드된 폴리펩타이드의 효과적인 발현에 필요한 조절 요소를 포함한 발현 벡터 내로 삽입된다. 발현 카세트는 이후 적다한 숙주 세포 내로 세포감염된다. 숙주 세포는 원핵세포성 또는 진핵세포성일 수 있다. 발현된 폴리펩타이드의 숙주 세포 배양액으로부터의 효과적인 분리를 위해 어피니티 태크가 폴리펩타이드에 부착된다. 태그는 당 분야에 최근 잘 알려진 효소적 또는 생화학적 방법에 의해 분리 후 융합 단백질로부터 용이하게 제거될 수 있다.
상기 핵산 분자에 의해 코드된 ANX1 및 ANX4의 단백질 활성은 칼슘-의존적 방식으로 멤브레인 또는 인지질에 결합하는 성질에 기초하여 분석될 수 있다. 상기-기술된 핵산 분자에 의해 코드된 폴리펩타이드는 아넥신과 일반적인 구조적 및 기능적 성질을 공유한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 기술된 핵산 분자를 포함한 유전공학에 사용되는 벡터, 발현 카세트 및 플라스미드에 관한 것이다.
본 발명은 상기 핵산 분자를 함유한 형질전환 식물 세포 및 식물을 생성하고, ABA-매개 스트레스 시그날링에 관련된 다른 단백질 및 분자 이벤트를 설명하기 위한 과정 및 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 분자의 진보는 다양한 스트레스에 대해 감소되거나 증가된 저항성을 지닌 형질전환 식물을 생성하는 잠재력을 제공한다. 형질전환 식물 세포 및 식물의 생성을 위한 기술은 당분야에 잘 알려져 있다.
식물 조직 배양 및 유전적 물질의 조작에서의 최근 기술적 진보로 현재 식물 생산성 및 질을 향상시키기 위해 경제적으로 중요한 식물 내로 원하는 새로운 유전자를 도입시키는 통상의 절차가 있다. 본 발명 내의 핵산 분자는 이러한 목적으로 잠재적인 타겟이 될 수 있다. 예를 들어 이들은 환경 스트레스 및 손상에 대한 식물 저항성을 설계하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 실시태양에 있어서 바람직한 식물은 쌀, 옥수수, 사탕수수, 터프 그래스, 메론, 수박, 오이, 후추 및 일반적이 나무와 같은 농업, 임업 및 원예의 어떠한 다양한 식물도 포함한다. 그의 질이 스트레스 저항성을 설계함으로서 향상된 원예 식물은 본 발명의 실시태양에 대한 좋은 타겟 식물이다.
따라서 본 발명은 :
서열번호 1 및 서열번호 3에 나타난 뉴클레오타이드 서열로 구성된, 칼슘-의존적 멤브레인 단백질의 멀티유전자 패밀리이고 환경 스트레스로부터 식물을 보호하는 삼투압 스트레스 및 ABA 시그날링에 관련된 ANX1 및 ANX4를 인코드하는 핵산 분자를 제공한다.
(실시예)
식물 물질 및 생장 조건
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 콜롬비아(Col-0)가 장일 조건 하의 그로스 챔버 내에서 생장되었다(16h/8h, 광/어둠 사이클). T-DNA 삽입 돌연변이,anx1(SALK_015426),anx2-1(SALK_054223),anx2-2(SALK_054238),anx4-1(SALK_109725),anx4-2(SALK_039476) 및anx4-3(SALK_073121)이 Arabidopsis Biological Resources Center(ABRC)(Columbus, OH, USA)로부터 수득되었다. 식물 물질을 위해 식물은 토양에서 3주 동안 또는 Murashige and Skoog(1962)(MS)-슈크로스(2%) 액체 배지에서 2주 동안 생장되었다.
발아 시험
종자 발아 분석을 위해 멸균된 종자가 MS-슈크로스(2%) 한천 배지 상에 놓였다. 결과 섹션에 기술된 바와 같이 다양한 농도의 NaCl, KCl, ABA, 만니톨, LiCl 및 CsCl이 첨가되었다. 발아(잔뿌리의 출현)는 5일간 매일 점수를 기록하였다. 3반복 플레이트가 재생 데이터를 확신하기 위해 각 처리별로 사용되었다.
마이크로솜 및 세포질 단백질의 준비
아라비돕시스 묘목이 연속적인 진탕으로 액체 MS 배지 내에서 2주 동안 생장되었고 표시된 시간 동안 다양한 농도의 NaCl, ABA, PEG 및 만니톨로 처리되었다. 뿌리가 수확되었고 액체 질소 내에서 즉시 동결되고 가루로 만들어졌다. 빻아진뿌리 분말은 추출 완충액(50mM 트리스, pH 8.0, 2mM EDTA, 2mM DTT, 0,25M 슈크로스 및 프로테아제 억제자 칵테일) 내에서 인큐베이트되었고 15분 동안 8,000g에서 원심분리되었다. 상청액(총 단백질 추출물)은 1시간 동안 100,000g에서 반복적으로 원심분리되었다. 원심분리후 상청액(세포질 프랙션)이 제거되었고, 펠렛(마이크로솜 프랙션)은 1시간 동안 100,000g에서 더한 원심분리에 의해 추출 완충액으로 재-세척되었고 적당한 부피의 추출 완충액 내에 용해되었다. 분리된 세포질 및 마이크로솜 프랙션은 알리쿼트로 나눠졌고 즉시 사용되거나 -80℃에서 동결되었다. 2D-겔의 웨스턴 분석을 위해 80㎍의 마이크로솜 단백질 및 40㎍의 세포질 및 총 단백질이 사용되었다.
2차원적 겔 전기영동
이소일렉트릭 포커싱(isoelectric focusing, IEF)을 방해하는 액체를 제거하기 위해 200μL 내의 마이크로솜 단백질 200㎍이 동일한 부피의 TE(10mM 트리스, pH 8.0, 및 1mM EDTA)-포화된 페놀로 추출되었다. 12,000g에서 10분간 원심분리후 상부 수성 상이 인터페이스를 교란시키지 않고 제거되었다. 인터페이스를 포함한 하부 상은 2 부피의 차가운 페놀-포화된 TE 완충액으로 재추출되었다. 원심분리 후 상부 상이 제거되었고 단백질은 메탄올 내에서 5 부피의 0.1M 아세트산암모늄으로 침전되었다. 침전된 단백질은 메탄올 내에서 0.1M의 아세트산암모늄으로 3회, 80% 아세톤으로 1회 세척되었다.
펠렛은 건조되었고 IEF 표본 완충액(7M 우레아, 2M 티오우레아(thiourea), 0.05% 도데실말토시드(dodecylmaltoside), 4% CHAPS, 20mM 트리스, 20mM DTT, 0.5% IPG 완충액 및 0.001% 브로모페놀 블루) 내에 용해되었다. ImmobilineTMDryStrips(pH 4∼7)(Amersham Biosciences, Uppsala, 스웨덴)이 단백질로 재수화되었고 IPGphor system(Amersham Biosciences) 상에 초점이 맞춰졌다. 스트립트는 평형 완충액(50mM 트리스, pH 8.8, 6M 우레아, 30% 글리세롤, 2% SDS 및 20mM 트리부틸포스파인(tributylphophine))으로 옮겨졌고 15분간 인큐베이트되었다. 평형이 맞춰진 스트립트는 수직상의 폴리아크릴아마이드 겔의 정상에 놓였고 SDS 러닝 완충액 내 0.5%의 아가로스로 오버레이되었다. 전기영동 후 단백질이 은 염색에 의해 시각화되었다.
MALDI-TOF MS를 위한 표본 준비
펩타이드 표본이 이전에 기술된 바와 같이 준비되었다(Jensen et al., 1999). 단백질 스팟은 겔로부터 삭제되었고 알킬화되었고 트립신으로 분해되었다. 트립신-분해된 펩타이드는 추출 단계 시리즈를 통해 회수되었다. 25mM의 중탄산암모늄 및 아세토니트릴로의 추출은 5%의 트리플루오로아세트산(TFA) 및 아세토니트릴로 두 번째 추출되었다. 추출물은 수집되었고 진공 동결건조기 내에서동결건조되었다. 동결건조된 트립신성 펩타이드는 물, 아세토니트릴 및 TFA(93 : 5 : 2)를 함유한 용액 내에 재용해되었고 5분간 배쓰-소니케이트되었다. 펩타이드 추출물은 "용액-상 니트로셀룰로스" 방법(Landry et al., 2000)을 이용하여 준비되었다.
MALDI-TOF MS 및 데이터베어스 검색
펩타이드 질량들이 MALDI-TOF MS(Vayager-DE STR, Perceptive Biosystems, NA, 미국) 상에서 측정되었다. 펩타이드 질량 지문 데이터는 UCSF 서버(http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm)에서 유용한 MS-Fit 프로그램을 이용하여 NCBI 비과다성 데이트베이스 엔트리와 매치되었다. 하기 검색 파라미터가 적용되었다. 질량 허용오차는 50 ppm으로 맞춰졌고 하나의 불완전한 분열이 허용되었다. N-물단의 아세틸화, 카바미도메틸레이션(carbamidomethylation)에 의한 시스테인의 알킬화, 메티오닌의 산화 및 N-말단 Gln의 pyroGlu 형성이 가능한 변형으로 셋팅되었다.
항체 생성 및 단백질 분석
폴리클론 항체가 ANX1-특이적 펩타이드(아미노산 204-215, NRYQDDHGEEIL)로 래트에서 생성되었다. 단백질은 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 상에서 분리되었고, 니트로셀룰로스 멤브레인으로 옮겨졌고 4℃에서 오버나이트로 항-ANX1 항체와 인큐베이트되었다. 항체-결합된 단백질은 ECL 시스템(Amersham Biosciences)를 이용하여 양고추냉이 퍼옥시다제에 컨쥬게이트된 두 번째 항체와의 인큐베이션 후 검출되었다.
RNA 분석
RNA는 제조사의 지시에 따라 TRI 시약(MRC, 오하이오, 미국)을 이용하여 분리되었다. RNA 겔 블럿 분석을 위해 30㎍의 총 RNA가 1.2%의 포름알데하이드-아가로스 겔 상에서 프랙션화되었고, 나일론 멤브레인(Hybond N+, Amersham Biosciences)으로 옮겨졌고, UV 크로스링커(crosslinker)(Stratagene, 미국)을 이이용하여 고정되었다. 동일한 양의 RNA의 로딩은 에티듐 브로마이드 염색에 의해 확인되었다. 하이브리디제이션은 Rapid-Hyb 완충액(Amersham Biosciences) 내에서 65℃에서 16∼24시간 동안 수행되었다. 하이브리디제이션 후 멤브레인은 2 x SSC/0.1% SDS, 1 x SSC/0.1% SDS, 마지막으로 0.1% SSC/0.1% SDS 내에서 시리즈로 세척되었다. RAN 밴드는 방사능사진촬영에 의해 시각화되었다. 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)은 Access RT-PCR 시스텝(Promega, WI, 미국)을 이용하여 각각ANX4및Actin의 검출을 위해 총 RNA의 0.4 및 0.1㎍으로 수행되었다.
결과
아라비돕시스 내 염 스트레스-반응성 마이크로솜 단백질의 프로테옴적 확인
염 스트레스-조절된 마이크로솜 단백질을 확인하기 위해 비교 프로테옴 분석을 수행하였다. 마이크로솜 단백질은 2시간 동안 250mM의 NaCl로 비처리 및 처리된 아라비돕시스 묘목의 뿌리로부터 분리되었고 2D 겔 전기영동에 의해 분석되었다. 본 연구에서 많은 원인에 대해 뿌리 조직에 초점을 맞췄다. 뿌리는 염 축적 사이트이고 따라서 이의 염 반응의 생리학이 잘 특성화되어있다(Davies and Zhang, 1991; Kiegle et al., 2000). 더욱이 뿌리는 잎 단백질 내에 가장 풍부하고 2D 겔 상에 단백질 로딩을 제한하는 리블로스 1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제(Rubisco)가 거의 결여되고 따라서 낮은-수량 단백질의 시각화를 방지한다.
뿌리 마이크로솜 단백질의 2D-겔이 도 1에 나타나있다. 단백질 스팟은 pH 4∼7 및 20∼120 kDa 분자량 사이에서조차 분포되었다. 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 약 350개 스팟을 재생할 수 있게 검출되었다. 염 처리에 반응하여 34개 단백질이 2-배 변화보다 더 크게 상향- 또는 하향-조절되었다(데이터는 나타내지 않음). 변화된 스팟의 예는 도 1B에 나타나 있다.
염-반응성 단백질 중에서 더한 특성화를 위해 p33 및 p34(스팟 #33, 34)를먼저 선택하였다. p33과 p34 모두 ANX1의 이론적인 분자량(36 kDa)보다 약간 큰 40 kDa의 분자량으로 이동된 동일한 단백질, ANX1. p33 및 p34 단백질을 나타낸다. 2D 겔 상에서의 p33 및 p34의 분명한 pI 수치는 이론적인 pI(5.19)와 일치한다. 아넥신은 동물 세포에서 잘 특성화된(Gerke and Moss, 2002) Ca2+-의존적 멤브레인 결합 단백질의 멀티유전자 패밀리이다. ANX1이 2개의 스팟(p33 및 p34)으로 존재한다는 발견은 단백질의 후번역적 변형(즉, 인산화)을 나타낸다(도 1B).
조직 내 ANX1의 발현
ANX1을 더욱 특성화하기 위해 ANX1-특이적 펩타이드(아미노산 204∼215)에 대한 항체를 생성하였다. 항-ANX1 항체의 특이성은 웨스턴 블럿 분석에 의해 측정되었다. 항체는E. coli내에서 생성된 재조합 ANX1 단백질을 인식하였다. 더욱이 p33과 p34 단백질 스팟 모두 식물 추출물로 제조된 2D-겔 상의 항체에 의해 검출되었다(도 3).
조직 내 ANX1의 발현 패턴은 웨스턴 블럿 분석에 의해 측정되었다. ANX1은 꽃, 줄기 또는 잎 조직이 아닌 뿌리 내에서 우세하게 발현되었다(도 2). 토양에서 생장된 아라비돕시스로부터의 뿌리 내 ANX1의 레벨은 실험 전체에 사용된 Murashige and Skoog(MS) 배지 내에서 배양된 아라비돕시스 뿌리와 유사하였다.
NaCl 및 다른 무생물 스트레스에 반응하는 ANX1 단백질의 발현
ANX1 발현의 염 반응은 웨스턴 블럿팅에 의해 더욱 조사되었다. 뿌리 마이크로솜 단백질로 준비된 2D-겔은 항-ANX1 항체로 프로브되었다. 투여량-반응 실험에서 ANX1 단백질은 다른 농도에서 NaCl로 처리됨으로서 유도되었다. 단백질은 250mM NaCl에서 가장 강하게 유도되었다(도 3A).
다음으로 ANX1 발현이 ABA 및 다른 스트레스에 의해 영향을 받는지 여부를 조사하였다. ANX1 단백질은 ABA에 의해 유도되었다(도 3B). 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로의 처리는 ANX1 레벨을 부가적으로 증가시켰고(도 3B) 이는 단백질이 ABA 및 일반적인 삼투압 스트레스에 민감함을 제안하였다.
항-ANX1 항체로의 2D-겔 면역블럿팅은 은 염색에 의해 시각화된 p33 및 p34를 포함한 적어도 4개 이상의 스팟을 나타내었고 면역블럿팅의 증가된 민감성을 입증하였다(도 3 및 4). ANX1은 2D-겔 상에서 관찰된 수평 스팟의 배열에 기초하여 후번역적으로 변형된 단백질의 일반적인 패턴인 후번역적 변형을 겪음을 제안한다.
염 스트레스에 반응한 ANX1 단백질 내 후번역적 변화
세포 내 ANX1 단백질의 분포는 일반 조건 하에서 생장된 아라비돕시스 뿌리로부터의 마이크로솜 및 세포질 프랙션 내에서 조사되었다. ANX1은 세포질과 마이크로솜 모두에서 검출되었으나 세포질에서 10-배 이상 더 풍부하였다(도 4A 및 4B). ANX1이 기능과 구조에 있어서 세포질 형태와 구별되는지 여부는 해명되어야 한다.
2D-겔의 웨스턴 분석에 의해 마이크로솜 및 세포질 프랙션의 ANX1 단백질 내 염-유도된 변화를 비교하였다. ANX1 단백질 레벨은 2시간 동안 염 처리 후 마이크로솜 내에서 상당히 증가되었고 24시간에 충분히 회복되었다(도 4A). 발현 패턴은 세포질 내에서 역전되었고 2시간의 염 처리에서 거의 완전하게 없어졌고 이후 회복되었다. 총 ANX1의 발현 패턴은 세포질 ANX1과 유사하였고 세포질이 대부분의 프랙션을 구성한다는 관찰과 일치하였다. 결과는 염 처리가 2가지 방법, 특히 세포질에서 멤브레인으로의 전위 및 세포질 내에서의 단백질 전도로 ANX1 단백질에 영향을 미침을 나타낸다.
ANX1 단백질 내 후번역적 변화의 Ca2+의존성이 조사되었다. 식물 추출물은 프랙션화 전에 Ca2+또는 EGTA로 인큐베이트되었다. Ca2+이 ANX1 단백질의 멤브레인으로의 이동을 자극시키면 EGTA는 전위의 방향을 역전시킨다(도 4B). 생체 내에서 ANX1 단백질의 염 반응에 대한 Ca2+의 효과를 조사하였다. ANX1의 하위세포 분포는 EGTA 함유 MS 배지 내에서 인큐베이트된 Ca2+-고갈된 식물에서 측정되었다. ANX1 단백질의 멤브레인으로의 전위 및 분해는 모두 억제되었다(도 4C). ANX1 분해는 단지 부분적으로 영향을 받았고 이는 식물 내 불완전한 Ca2+킬레이션에 기인한 것이었다. 결과는 ANX1 단백질의 염 반응이 Ca2+에 의해 매개됨을 강하게 제안하였다.
ANX1 단백질의 염 반응이 전사 레벨에서 관찰되는지 여부를 조사하였다. 노던 블럿 분석은 단백질 내에서 염-유도된 변화와 대조적으로 전사체는 영향을 받지 않음을 나타내었다(도 4D).ANX1레벨은 시간이 지남에 따라 다소 감소하였다. 데이터는 ANX1이 발현에 의해서가 아니라 단백질의 전위 및 전도에 의해 후번역적으로 조절됨을 나타낸다.
ANX 유전자의 T-DNA 삽입 돌연변이
ANX1의 생체내 기능을 측정하기 위해anx1T-DNA 삽입 돌연변이에 대한 Salk Institute 삽입 서열 데이터베이스를 검색하였다.anx2및anx4,아넥신 패밀리 멤버의 다른 돌연변이뿐만 아니라anx1돌연변이를 수득하였다.anx2및anx4의 경우 2 및 3개의 다른 대립유전자가 각각 분리되었다(도 5A).anx1돌연변이는 세 번째 엑손 내에 T-DNA를 포함하는 반면 2개의anx2대립유전자(anx2-1및anx2-2대립유전자)는 네 번째 엑손 내에 삽입을 포함한다. 3개의anx4돌연변이에서 T-DNA는 여섯 번째 엑손 내(anx4-1및anx4-2대립유전자) 및 5'-비번역된 구역 내(UTR)(anx4-3)에 존재한다. RNA 분석은 일부 분리된 돌연변이 내에서 각각의 상응하는anx유전자가 야생형에 비교하여 거의 완전하게 억제됨을 나타내었고(도 5B), 이는anx1의 경우 웨스턴 분석에 의해 부가적으로 증명되었다(도 5C). 따라서anx1, anx2및anx4가 각각 더한 실험에 선택되었다.
NaCl에 대한 anx T-DNA 삽입 돌연변이의 민감성
무생물적 스트레스 시그날링에서의 아넥신의 기능을 평가하기 위해 NaCl에 대한anx돌연변이의 종자 발아의 민감성을 측정하였다.anx1, anx2및anx4돌연변이는 다양한 농도의 NaCl을 함유한 배지 내에서 발아되었다. MS 배지 내에서anx1은 85% 비율로 약간 감소된 발아를 나타내었다(도 6A).anx2-1및anx4-1돌연변이는 야생형과 유사하게 정상적으로 발아하였다.anx1종자의 반만이 50mM의 NaCl의 존재시 발아된 반면anx4 -1은 처리 후 4일에 야생형과 비교가능한 레벨로 발아가 지연되었다(도 6B). 그러나anx1및anx4-1돌연변이 종자는 야생형 및anx2-1보다 75mM의 NaCl에서 더욱 심하게 결함있는 발아를 나타내었다(도 6C).anx2-1돌연변이는 염 측정된 모든 농도에서 야생형과 유사한 발아 패턴을 나타내었다. ANX2는 ANX1 및 ANX4와는 대조적으로 염 반응 외에 다른 역할을 하는 것으로 보인다. 염 반응에 있어서anx4-1및anx4-2사이에 어떤 차이점도 검출되지않았다(데이터는 나타내지 않음).
anx1와anx4-1모두 NaCl에 대한 과민성을 나타내나 염에 반응하여 약간 다른 패턴이 수득되었다.anx1과는 달리anx4 -1은 75mM의 NaCl에서 갑작스런 발아의 감소를 나타내었다(도 6D). 도 6E에 나타난 바와 같이anx1및anx4-1의 종자 발아는 75mM의 NaCl을 함유한 MS 배지 내에서 다소 영향을 받았다(80% 억제). 발아된anx1및anx4-1식물의 생장은 잔뿌리가 출현한 후 저지되었고 MS 배지 내로 옮긴 후 회복되었다(데이터는 나타내지 않음). 결과는 ANX1 및 ANX4가 식물 내 염 스트레스 반응에 연관됨을 나타낸다.
일반적인 삼투압 스트레스에 대한 anx1 및 anx4 의 민감성
anx1와anx4-1의 염 반응이 이온성 또는 삼투압 효고 또는 이 둘 모두로부터 초래되는지 여부를 결정하기 위해 발아가 KCl, LiCl 및 CsCl을 포함한 여러 다른 이온 및 삼투압 시약으로서 만니톨의 존재하에서 측정되었다.anx4-1은 다소 덜 민감하였으나anx1와anx4-1식물 모두 NaCl에서 관찰된 데이터와 유사하게 만니톨에 민감하였다(도 7A). 흥미롭게도anx1은 KCl 및 CsCl의 존재시 결함있는 발아를 나타내었으나 LiCl에는 덜 민감하였다. 이와는 대조적으로anx4-1은 LiCl 및 CsCl에 민감하였으나 KCl에는 그렇지 않았다(도 7B, 7C 및 7D). 결과는 차별적인 이온 특이성에 의해 제안된 바와 같이anx1및anx4-1이 일반적인 삼투압 스트레스및 부분적으로 이온-특이적 방식으로 영향을 받음을 나타낸다.
ABA에 대한 anx1 및 anx4 의 민감성
ABA는 가뭄 및 염 스트레스 반응을 매개한다고 초기 연구들이 제안한다(Leung and Giraudat, 1998; Shinozaki and Yamagucho-Shinozaki, 2000). 이를 시험하기 위해 다양한 농도의 ABA를 함유한 배지 내에서의anx1및anx4-1돌연변이 식물의 발아를 조사하였다.anx1및anx4-1모두 ABA의 존재시 결함있는 발아를 나타내었다(도 8). 일반적으로anx1은anx4-1보다 특히 낮은 농도의 ABA에서 더욱 민감하였다(도 8B). 이러한 결과는 NaCl 처리에서 수득된 것과 일치한다(도 6).
anx1및anx4-1식물의 발아는 야생형 및 ABA-둔감성 돌연변이 라인인abil과 비교하여 ABA를 함유하 배지 내에서 억제된다(Koornneef et al., 1984)(도 8C). 더욱이anx1및anx4-1식물의 생장은 잔뿌리 출현 후 감소된 반면 야생형 식물은 생장을 계속하였고 초록색이 되었다(도 8D). 또한anx1및anx4-1은 NaCl에서 관찰된 바와 같이 ABA 존재시 생장 상태로 저지되었고 ABA-결핍된 MS 배지로 옮긴 후 정상적 생장을 회복하였다(데이터는 나타내지 않음).
토론
뿌리 마이크로솜 프로테옴의 ANX1의 확인
멤브레인 단백질은 다양한 세포 과정에 중요한 역할을 하고 다양한 시그날링 경로를 조절한다. 많은 시그날이 초기에 감지되고 멤브레인 내에 위치한 활성 분자를 통해 도입되고 이는 환경에 대한 세포-세포 상호작용 및 반응을 조절한다. 따라서 분석을 위해 수용체, 채널 및 멤브레인-관련 시그날링 분자와 같은 활성 단백질을 포함한 마이크로솜 프로테옴(microsomal proteome)을 타겟으로 삼았다. 본 연구에서 프로테옴 분석은 ANX1 단백질의 확인을 이끌었다. ANX1의 레벨이 아라비돕시스로부터의 뿌리 마이크로솜 프로테옴 내에서 NaCl 처리시 증가하였다. 아넥신은 진균으로부터 인간까지 거의 모든 종에 존재하는 Ca2+-의존적 멤브레인 결합 단백질의 패밀리이다(Gerke and Moss, 2002). 아넥신은 동물 세포 내에서 광범위하게 연구되었다. 이들 단백질은 다기능성이고, 멤브레인 트래피킹(trafficking) 및 조직화, 이온 채널 활성의 조절, 인지질 대사, 염증 반응 및 유사분열 시그날링를 포함한 다양한 세포 과정에 중요한 역할을 한다(Raynal and Pollard, 1994).
ANX1의 발현
ANX1은 마이크로솜에 결합되어 있으나 단백질은 세포질 내에 더욱 풍부하다. 마이크로솜 프랙션은 액포, 엽록체, 골지 및 플라스미드 멤브레인과 같은 다른 기관으로부터 기원한 멤버로 구성된다. 이전의 보고서는 아넥신이 플라스미드 멤브레인, 액포 및 핵 페리페리(periphery) 내에 하위세포적으로 위치됨을 나타낸다(Clark and Roux, 1995). 하위세포적 위치를 확인하기 위해 초록색 형광 단백질(GFP)-융합된 ANX1이 BY-2 원형질체 내에서 일시적으로 발현되었다. ANX1은 세포질과 플라스마 멤브레인 모두에서 검출되었고 GFP 시그날은 염 및 ABA 처리 후 플라스마 멤브레인 내에서 유의적으로 증가되었다(데이터는 나타내지 않음).
ANX1 단백질의 후번역적 변화
배지 내로 NaCl의 첨가시ANX1RNA 발현은 영향을 받지 않았으나 단백질 레벨은 유의적으로 변하였고 이는 단백질이 번역적 및/또는 후번역적 조절됨을 나타낸다. 염 처리 2시간 내에 ANX1 단백질 레벨은 멤브레인 내에서 상당히 증가하였고 동시에 세포질 내에서 사라졌다. 이러한 염-유도된 하위세포적 변화는 총 ANX1 단백질의 순수 감소가 동반되고 이는 ANX1의 주요 프랙션 세포질 내에 존재한다는 관찰과 일치한다. 이들 결과는 염 스트레스가 ANX1 단백질 내 역동적 변화 즉, 존재하는 단백질의 하위세포적 재분포 및 전도를 포함함을 나타낸다.
많은 시그날링 과정에서 조절 단백질은 세포질로부터 멤브레인까지보충된다(Didichenko et al., 1996; Park et al., 2000; Oancea et al., 2003). 멤브레인 결합은 인산화, 지질화 및 글리코실레이션 및/또는 단백질-단백질 상호작용과 같은 후번역적 변형에 의해 시작된다(Iwata et al., 1998). ANX1은 2D-겔 상에 다른 pIs를 지닌 적어도 4개 이상의 스팟으로 관찰되었고 이는 후번역적 변형을 제안한다. 현재 동물 세포에서 증명된 바와 같이 ANX1 단백질의 인산화 및 다른 변형을 조사하고 있다(Gerke and Moww, 2002). 스트레스 처리 후 ANX1 스팟은 함께 멤브레인으로 이동하였고 이는 변형이 멤브레인 결합에 직접적으로 관련되지 않음을 나타낸다. 세포질 내에 남아있는 ANX1 스팟은 멤브레인 내에 있는 것과 구별되고 이는 이러한 발견을 지지한다. ANX1은 단백질-단백질 상호작용을 통해 멤브레인으로부터 보충되는 것으로 추측된다. 초기 데이터는 천연 겔 상의 ANX1-결합된 복합체의 크기가 세포질 프랙션과 및 멤브레인 프랙션 사이에서 구별되고 스트레스 자각에 대한 식물의 노출 전과 후에 달라진다(데이터는 나타내지 않음). 따라서 ANX1 복합체 내에서 상호작용하는 구성성분의 확인은 스트레스 반응과 관련된 단백질의 특이적인 기능 및 멤브레인의 기능적 유의성의 설명을 촉진시킨다. 단백질 전도, 단백질 가수분해(proteolysis)에 관련하여 특히 유비퀴틴/26S 프로테아솜(Ub/26S)이 식물 내 가장 중요한 세포 기능을 조절하는 조절 메카니즘 중 하나이다(Vierstra, 2003). phyA, HY5/HYH, AUX/IAA, NAC1, E2F 및 ABI5를 포함한 일부 알려진 시그날링 성분이 타겟 기질로 확인되었다. 아넥신이 래트 폐 조직에서 리소좀 경로를 통하는 것과 같이 단백질 가수분해에 의해 조절된다는 이전의 보고가 있다(Barnes and Gomes, 2002). ANX1이 Ub/26S 또는 다른 단백질 분해성 경로에 선택적이 타겟인지 여부는 흥미로운 질문이다.
아넥신은 Ca2+-의존적 방식으로 인지질에 결합하는 능력에 의해 특성화된다. 본 연구에서 Ca2+이 멤브레인로의 ANX1 단백질 결합을 매개한다는 증거를 제공한다. 식물 추출물 내의 Ca2+의 포함은 멤브레인으로의 ANX1의 결합을 포함하였고 이는 EGTA의 첨가에 의해 역전되었다. Ca2+-킬레이트된 배지 내에서 인큐베이트된 식물에서 ANX1은 멤브레인 내에서의 축적과 세포질 내에서의 분해 모두가 억제되기 때문에 염 스트레스에 대한 반응 능력을 상실한다. 이들 결과는 염 스트레스-유도된 ANX1의 반응이 Ca2+에 의해 특이적으로 조절된다.
ANX1 및 ANX4의 융합
본 연구에서 ANX1이 삼투압 스트레스 반응에 관련됨을 증명한다.anx1돌연변이는 ABA 및 NaCl, LiCl, CsCl, KCl 및 만니톨과 같은 삼투압 스트레스에 과민성을 나타내었다.anx1외에도anx4는 스트레스 조건 하에서 발아가 불완전하였다.anx1및anx4식물이 스트레스에 유사하게 반응하는 반면 이들은 다른 이온 선택성 및 발아 키네틱스로 다양한 삼투압 스트레스에 약간 다른 반응을 나타내었다. 이는 단백질의 시간적 및 공간적 발현 및 발현 레벨에서의 차이점에 기인한것이다. ANX1 및 ANX4는 식물 내에서 스트레스에 반응하여 차별적인 더욱 한정된 역할을 지닌다.
따라서 ANX1이 ABA 및 스트레스에 의해 유도된 Ca2+시그날을 감지하고 단백질 분해 및 멤브레인으로의 전위의 이중 메카니즘을 통해 다운스트림 시그날링 경로로 이를 전달함을 제안한다. 분해는 상호작용하는 분자를 방출하고 전위는 멤브레인 내 다른 분자와의 결합을 증가시키고 이둘 모두는 다운스트림 시그날링 케스케이드를 활성화시킨다. 수용체, 채널 및 키나제가 상호작용하는 파트러의 좋은 후보이다.
본 발명의 효과는 환경적 스트레스로부터 식물을 보호하기 위해 삼투압 스트레스 및 ABA 시그날링에 관련된 칼슘-의존적 멤브레인 결합 단백질, ANX1 및 ANX4을 인코드하는, 식물로부터의 신규한 유전자를 제공하는 것이다.

Claims (6)

  1. ⅰ) 서열번호: 2의 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산 분자;
    ⅱ) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산 분자;
    ⅲ) 서열번호: 1의 뉴클레오타이드 서열의 코딩 구역으로 구성된 핵산 분자;
    ⅳ) 서열번호: 3의 뉴클레오타이드 서열의 코딩 구역으로 구성된 핵산 분자;
    ⅴ) 스트린전트 조건 하에서 (ⅰ), (ⅱ), (ⅲ) 또는 (ⅳ)의 핵산 분자에 하이브리다이즈하는 핵산 분자; 및
    ⅵ) (ⅰ), (ⅱ), (ⅲ), (ⅳ) 또는 (ⅴ)의 어느 하나의 핵산 분자로 퇴화된 핵산 분자:
    로 구성된 군으로부터 선택된, 아넥신의 활성을 지닌 단백질을 인코드하거나 이러한 생물학적 활성을 지닌 단백질의 단편을 인코드하는 분리된 핵산 분자
  2. 제 1항에 있어서, 상기 인코드된 단백질은 삼투압 스트레스 및 앱시스산(ABA) 시그날링에 관련된 아넥신임을 특징으로 하는 핵산 분자
  3. 서열번호: 2 또는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드의 감소가 안티센스에 의해 달성됨을 특징으로 하는, 제 1항의 핵산에 의해 형질전환된 형질전환 식물
  4. 서열번호: 2 또는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드의 증가가 센스에 의해 달성됨을 특징으로 하는, 제 1항의 핵산에 의해 형질전환된 형질전환 식물
  5. 제 3항에 있어서, 상기 형질전환 식물은 환경 스트레스에 대해 감소된 저항성을 지님을 특징으로 하는 형질전환 식물
  6. 제 4항에 있어서, 상기 형질전환 식물은 환경 스트레스에 대해 증가된 저항성을 지님을 특징으로 하는 형질전환 식물
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