MX2011002028A - Plantas que tienen rasgos relacionados con rendimiento mejoradas y un metodo para producirlas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere generalmente al campo de biología molecular y se refiere a un método para mejorar los rasgos relacionados con rendimiento en plantas modulando la expresión en una planta de uno o más ácidos nucléicos que codifican por lo menos dos polipéptidos iSYT (interactor de traslocación de sarcoma sinovial SYT). La presente invención también se refiere a plantas que tienen plantas tipo silvestre correspondientes u otras plantas de control. La invención también provee ácidos nucleicos desconocidos que codifican por lo menos dos polipéptidos iSYT y construcciones que comprenden los mismos, útiles para llevar a cabo los métodos de la invención. La invención también provee construcciones útiles en los métodos de la invención. Además, la presente invención también se refiere a un complejo de proteína basada en iSYT. También se refiere al uso del complejo para promover crecimiento de plantas y a un método para estimular la formación de complejos, sobre-expresando por lo menos dos miembros del complejo.

Description

PLANTAS QUE TIENEN RASGOS RELACIONADOS CON RENDIMIENTO MEJORADAS Y UN MÉTODO PARA PRODUCIRLAS Las presente invención se refiere generalmente al campo de biología molecular y se refiere a un método para mejorar los rasgos relacionados con rendimiento en plantas modulando la expresión en una planta de uno o más ácidos nucleótidos que codifican por lo menos dos polipéptidos de iSYT (interactor de traslocación de sarcoma sinovial -SYT) . La presente invención también se refiere a plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucléico que codifica por lo menos dos polipéptidos de iSYT, dichas plantas tienen rasgos relacionados con rendimiento mejorado en relación con las plantas de tipo silvestre correspondientes u otras plantas de control. La invención también provee construcciones útiles en los métodos de la invención. Además, la presente invención también se refiere a un complejo de proteínas basado en iSYT. Además se refiere al uso del complejo para promover crecimiento de plantas y a un método para estimular la formación de complejos, sobre-expresando por lo menos dos miembros del complejo.

La población mundial siempre creciente y el suministro escaso de tierra arable disponible para combustibles agrícolas buscan el incremento de la eficiencia de agricultura. Los medios convenciones para mejoras en cultivo y hortícolas usa técnicas de reproducción selectiva para identificar plantas que tienen características convenientes. Sin embargo, dichas técnicas de reproducción selectiva tienen varios inconvenientes, a saber, estas técnicas normalmente requieren mucha mano de obra y dan como resultado plantas que con frecuencia contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre pueden dar como resultado la característica conveniente que se pasa de las plantas madre. Los avances en biología molecular han permitido que la humanidad modifique el plasma germinal de animales y plantas. La ingeniería genética de plantas abarca el aislamiento y manipulación de material genético (normalmente en forma de ADN o ARN) y la introducción subsiguiente del material genético en una planta. Dicha tecnología tiene la capacidad de suministrar cultivos o plantas que tienen varios rasgos económicos, agronómico u hortícolas mejorados.

La. demanda de más productos derivados de plantas se ha incrementado espectacularmente. En el futuro cercano el reto de la agricultura ser cumplir con las demandas de crecimiento para alimentación y alimentos en. una forma sostenible. Además las plantas empiezan a jugar un papel importante como fuentes de energía. Para cumplir con estos rasgos principales, se logrará un incremento profundo en rendimiento de plantas. La producción e biomasa se un sistema multi-factorial en el cual se alimenta una plétora de procesos en la actividad de meristemos que dan origen a nuevas células, tejidos y órganos. Aunque se realiza una cantidad considerable .de búsqueda de desempeño se conoce poco acerca del rendimiento fundamental de redes moleculares (Van Camp, 2005) . Muchos genes han sido descritos en Arabidopsis thaliana que, cuando muta o se expresa ectópicamente, da como resultado la formación de estructuras mayores, tales como hoja so raices. Estos "genes de rendimiento intrínseco" así llamados están implicados en muchos proceso diferentes cuya interrelación es desconocida en su mayor parte.

Un rasco de interés económico particular es el rendimiento incrementado. El rendimiento normalmente se define como la producción mensurable de valor económico de un cultivo. Esto se puede definir en términos de cantidad y/o cualidad. El rendimiento depende directamente de varios actores, por ejemplo, el número y tamaño de los órganos, arquitectura de plantas (por ejemplo, el número de ramificaciones) , producción de semillas, senescencia de hojas y más. El desarrollo de raíces, absorción, de nutrientes, tolerancia al estrés y vigor temprano también pueden ser factores importantes para determinar el rendimiento. La optimización de los factores mencionados antes por lo tanto puede contribuir al incremento en rendimiento de cultivos.

El rendimiento de semillas es un rasgo particularmente importante, dado que las semillas de muchas plantas son importantes para nutrición humana y animal. Los cultivos tales como maíz, arroz, trigo, cañóla y soya aportan más de la mitad del consumo calórico humano total, ya sea por el consumo directo de las mismas semillas o mediante el consumo de productos de carne criados con semillas procesadas. También son una fuente de azúcares, aceites y muchas clases de metabolitos usados en procesos industriales. Las semillas contienen un embrión (la fuente de nuevos brotes y raices) y un endospermo (la fuente de nutrientes para el creciminto embrionario durante la germinación y el crecimiento temprano de plantas de semilleros) . El desarrollo de una semilla implica muchos genes y requiere la transferencia de metabolitos de las raices, hojas y tallos en la semilla en crecimiento. El endospermo, en particular, asimila los precursores metabólicos de carbohidratos, aceites y proteínas y los sintetiza en macromoléculas de almacenamiento para llenar el grano.

Otro rasgo importante para muchos cultivos es el vigor temprano. Mejorando el vigor temprano es un objetivo importante de modernos programas para cultivar arroz en cultivos de arroz templado y tropical. Las raices grandes son importantes para el ancla de suelo apropiado en arroz sembrado en agua. Cuando el arroz se muestra directamente en campos inundados y en donde las plantas deberán emerger rápidamente a través del agua, se asocian los brotes más largos con vigor. Cuando se practica la siembra por perforación, los mesocotiledoneos y coleótilos más largos son importantes para la emergencia de buen sembrado. La capacidad de tratar el vigor temprano en plantas puede tener mayor-importancia en la agricultura. Por ejemplo, el vigor temprano pobre ha. sido una limitación a la introducción de híbridos de maíz (Zea mayos L.) basado en plasma germinal de Corrí Be.lt en el Atlántico Europeo.

Un rasgo importante adicional es el de tolerancia de estrés abiótico mejorado. El estrés abiótico es una causa primaria de pérdida de cultivos mundial, reduciendo rendimientos promedio para la mayoría de las plantas de cultivos por más del 50% (Wang y otros, Planta 218, 1-14, 2003) . Las tensiones abióticas pueden ocasionarse por la sequía, salinidad, extremos de temperatura, toxicidad química y estrés oxidativo. La capacidad de mejorar la tolerancia de plantas a estrés abiótico puede tener una ventaja económica mayor a los granjeros mundialmente y pueden permitir la producción de cultivos durante condiciones adversas y en territorios en donde la producción de cultivos puede no ser posible de alguna manera.

El rendimiento de cultivos por lo tanto puede incrementarse optimizando uno de los factores mencionados antes .

Dependiendo del uso final, la modificación de ciertos rasgos de rendimiento pueden favorecerse sobre otros. Por ejemplo, para las aplicaciones tales como forraje o producción de madera, o recursos de biocombustible , un incremento en las partes vegetativas de una planta puede ser conveniente y para aplicaciones tales como producción, de harina, almidón o aceite, un incremento en parámetros d semillas puede ser particularmente conveniente. Aun entre los parámetros de semillas, algunos pueden favorecerse sobre otros, dependiendo de la aplicación. Varios mecanismos pueden contribuir al incremento de rendimiento de semillas, siempre que tenga la forma del tamaño de semillas incrementado o número de semillas incrementados.

Un enfoque para incrementar el rendimiento (rendimiento de semillas y/o biomasa) en pantas puede ser a través de la modificación de los mecanismos de crecimiento inherentes de una planta, tal como el ciclo celular de varias rutas de señalamiento implicadas en crecimiento de plantas o en mecanismos de defensa.

Ahora se ha encontrado que se pue.den mejorar varios rasgos relacionados con crecimiento en plantas modulando la expresión en una planta de uno o más ácidos nucléicos que codifican por lo menos dos polipéptidos iSYT seleccionados del grupo que consiste de cusilquier polipéptido de la Tabla A, homólogos del mismo y fusiones del mismo.

ANTECEDENTES Uno de los "genes de rendimiento intrínseco" AN3 (también conocido como GIF1 y también denominado en la presente como SYT - polipéptido de traslocación de sarcoma, sinovial) mencionados antes, se identificó en la búsqueda de interactores de GRF (factor de regulación de crecimiento (Kim y Kende, 2004) y mediante el análisis de mutantes de Arabidopsis de hoja estrecha (Horiguchi y otros, 2005). SYT es un homólogo de la proteína humana de SYT (traslocación de sarcoma sinovial) y se codifica por una familia de genes pequeña en el genoma Arabidopsis. SYT es un coactivador de transcripción cuya función biológica, a pesar de la implicación de su traslocación cromosoma! en tumorigénesis, aún no es clara (Clark y otros, 1994; de Bruijn y otros, 1996). El uso del sistema de levadura GAL , se mostró que SyT tiene actividad de transactivación (Kim y Kende, 2004). Esto junto con dos híbridos de levadura y análisis de unión in vitro que demuestran la interacción de SYT con varios GRF (Kim y Kande, 2004; Horiguchi y otros, 2005), sugiere un papel de SYT o co-activador de transcripción o GRF. Los genes de GRF (factor de regulación de crecimiento) ocurre en los genomas de todas las plantas sembradas así examinadas y codifican los factores de transcripción putativa que juega un papel regulador en el crecimiento y desarrollo de hojas (Kim y otros, 2003). Como apoyo de un GRF y complejo activador y coactivador de transcripción de SYT, las mutantes de grf y SYT exhiben fenotipos similares y combinaciones de mutaciones de grf y SYT mostraron un efecto cooperativo (Kim y Kende, 2004) . Se muestra que el fenotipo de hoja estrecha de mutante de SYT resulta de una reducción en números celulares. Además, la expresión ectópica de SYT da como resultado plantas transgénicas con hojas más largas que consisten de más células, indicando que SYT controla el número de células y hojas de órganos que consiste de más células, indicando que SYT controla el número de células y tamaño de órgano (Horiguchi y otros, 2005) . Aunque la función de SYT en regulación de crecimiento de plantas no se conoce, estos resultados muestran que SYT cumple con los requerimientos de un "gen de rendimiento intrínseco".

En nuestra ambición para descifrar el mecanismo de mejorar el rendimiento del fundamento de red molecular se sometió un enfoque centrado de proteína con amplio genoma para estudiar proteínas de interacción de SYT en cultivos de suspensión celular de Arabidopsis thaliana. La tecnología de purificación de afinidad en serie (TAP, por sus siglas en inglés) combinada con identificación de proteína basada en espectrometría de masas (MS) dio como resultado el aislamiento e identificación de proteínas de interacción de SYT que pueden funcionar en la regulación del crecimiento de placas (iSYT). Sorprendentemente, se aislaron varias proteínas que pertenecen a complejos de múltiples proteínas. Además, previamente no se podían caracterizar completamente muchos interactores . Los reportes en unos cuantos interactores de SYT muestran que están implicados en varios procesos de desarrollo (Wagner y Meyerow.it z , 2002; Meagher y otros, 2005; Sarnowski y otros, 2005; Hurtado y otros, 2006; Kwon y otros, 2006) , pero hasta ahora ninguno de los genes identificados (iSYT) han sido asociados con la estimulación del crecimiento de las plantas. Más sorprendente no se ha descrito previamente ninguna combinación específica de polipéptidos iSYT útiles para mejorar el rendimiento rasgos relacionados .

SUMARIO Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que la modulación de la expresión en una planta de uno o más de ácido (s) nucléico(s) que codifica al menos dos polipéptidos iSYT en donde el polipéptido iSYT se selecciona del grupo formado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A, homólogos del mismo y la fusión de las mismas, promueve el crecimiento de la planta y da las plantas que tienen rasgos de mayor producción relacionadas con el control en relación con las plantas.

De acuerdo con una modalidad, se proporciona un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en las plantas en relación con el control de las plantas, que comprende la expresión modular en una planta de uno o más de ácido (s) nucléico (s) que codifica al menos dos polipéptidos iSYT en donde el polipéptido iSYT se selecciona el grupo formado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A, homólogos del mismo y la fusión de la misma.

DEFINICIONES Polipéptido (s) / proteina (s) Los términos "polipéptido" y "proteina" se utilizan indistintamente en este documento y se refieren a los aminoácidos en una forma polimérica de cualquier longitud, unidos por enlaces peptidicos.

Polinucleótido (s) /ácido (s) nucléico (s) /secuencia de ácido (s) nucléico ( s ) /secuencia de nucleótidos ( s ) Los términos "polinucleótido ( s )" , "secuencia ácido (s) nucléico ( s )" , "secuencia de nucleótidos ( "ácido (s) nucléico ( s )" , "molécula de ácido nucléico" utilizan indistintamente en este documento y se refieren a los nucleótídos, o ribonucleótidos o desoxirribonucleót idos o una combinación de ambos, en una forma polimérica no ramificada de cualquier longitud.

ADN recombinante "ADN recombinante" significa una molécula de ADN que se hace por la combinación de dos segmentos de ADN separados de alguna manera, por ejemplo, por síntesis química o por la manipulación de segmentos aislados de los ácidos nucléicos mediante técnicas de ingeniería genética. El ADN recombinante puede incluir ADN exógeno o simplemente un ADN nativo manipulado. El ADN recombinante para la expresión de una proteína en una planta se proporciona normalmente en un cásete de expresión que tiene un promotor que se activa en las células de plantas ligadas operativamente a ADN que codifican una proteína de interés.

Homólogo (s) "Homólogos" de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos, en relación con la proteína no modificada en cuestión y que tienen actividad biológica similar y funcional de la proteína no modificada de la cual se derivan.

La supresión se refiere a la remoción de uno o más aminoácidos de una proteina.

Una inserción se refiere a uno o más residuos de aminoácidos que se introducen en un sitio predeterminado en una proteina. Inserciones puede abarcar fusiones N-terminales y/o C-terminales, asi como la secuencia inserciones dentro de aminoácidos individuales o múltiples. En general, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán menores que las fusiones N- o C-terminales, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos de proteínas de fusión C- o N-terminales de péptidos incluyen el dominio de unión o el dominio de activación de un activador transcripcional que se utiliza en el sistema de dos híbridos de levadura, proteínas de revestimiento del fago, etiqueta de (histidina) -6, etiquetas de glutationa S-transferasa , proteína A, proteína de unión a maltosa, dihidrofolato reductasa, epítope de Etiqueta»100 , epítope de c-myc, epítope de FLAG®, lacZ, CMP (péptido de unión de calmodulina) , epítope HA, epítope de proteína C y epítope VSV.

Una sustitución se refiere a. la sustitución de aminoácidos de la proteína con otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tales como hidrofobicidad, hidrofilia, antigenicidad similares, la propensión a formar o romper las estructuras -helicoidal o estructuras ß-laminar) . Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero pueden ser agrupados en función de las limitaciones funcionales colocados sobre el polipéptido ; las inserciones suele ser del orden de 1 a 10 residuos de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de amino ácidos preferiblemente conservadores. Las tablas de sustitución de conservadores son bien conocidos en. la materia (véase, por ejemplo Creighton (1984) Proteins. WH Freeman and Company (Eds) y en la Tabla 1 siguiente) .

Tabla 1 : Ej emplos de sustituciones de aminoácidos conservados Las sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos se pueden hacer fácilmente utilizando las técnicas de síntesis de péptidos bien conocidos en la materia, como la síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o por manipulación del ADN recombinante . Los métodos para la manipulación de secuencias de ADN para producir la sustitución, las variantes de inserción o supresión de una proteína son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, las técnicas para la torna de las mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el. ADN son bien, conocidos por los expertos en la materia e incluyen mutagénesis M13, mutagénesis in vitro T7-Ge.n (USB, Cleveland, OH), mutagénesis dirigida a sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA) , mutagénesis dirigida mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida a sitio.

Derivados Los "Derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos , polipéptidos que pueden, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la forma de origen natural de la proteína, como la proteína de interés, constituir sustituciones de aminoácidos con los residuos de aminoácidos no-naturales, o adiciones de los residuos de aminoácidos no-naturales. Los "Derivados" de una proteína también incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que comprenden residuos de aminoácidos alterados naturalmente (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados, etc.) o alterado no naturalmente en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma presente en la naturaleza en forma de polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes que no son aminoácidos o adiciones en comparación con la secuencia de aminoácidos de la que se derivan, por ejemplo, una molécula reportera u otro ligando, unida covalente o no covalentemente a la secuencia de aminoácidos, tales como una molécula reportera que está unida para facilitar su detección y residuos de aminoácidos no de origen natural en relación con la secuencia de aminoácidos de una proteina de origen natural. Por otra parte, los "derivados" también incluyen fusiones de la forma de origen natural de la proteina con péptidos marcados como FLAG, HIS6 o tio-redoxina (para una revisión de los péptidos de marcado, véase Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003).

Ortólogo ( s ) /parálogo ( s ) Los ortólogos y parálogos abarcan conceptos evolutivos que se utilizan para describir las relaciones ancestrales de los genes. Los parálogos son los genes dentro de la misma especie que se han originado a través de la duplicación de un gen ancestral; los ortólogos son genes de diferentes organismos que se han originado a través de la diferenciación de especies y también se derivan de un gen ancestral común.

Dominio, Motivos/Secuencia Consensual/F'irma El término "dominio" se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en las posiciones especificas a lo largo de una alineación de secuencias de proteínas relacionadas evolutivamente. Mientras que los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre homólogos, los aminoácidos que son altamente conservados en las posiciones especificas indican los aminoácidos que probablemente son esenciales en la estructura, estabilidad o función de una proteína. Identificados por su alto grado de conservación en las secuencias alineadas de una familia de proteínas homologas, pueden ser usados como identificadores para determinar si cualquier polipéptido en cuestión pertenece a una familia de polipéptidos previamente identificada.

El término "motivo" o "secuencia consensual" o "firma" se refieren a una pequeña región conservada de la secuencia de las proteínas relacionadas evolutivamente. Los motivos son con frecuencia partes altamente conservadas de los dominios, pero también pueden incluir sólo una parte del dominio, o se encuentran fuera del dominio conservado (si todos los aminoácidos del motivo están fuera de un dominio definido) .

Existen bases de datos especiales para la identificación de dominios, por ejemplo, SMART (Schultz y otros (1998) Proc Nati Acad Sci EE.UU. 95, 5857-5864; Letunic y otros (2002) Nucleic Acids Res. 30, 242 - 244), InterPro (Mulder y otros, (2003) Nucí. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher y Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in autornatic sequence interpretation . (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Irrtelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D . , Eds., págs. 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo y otros, Nucí. Acids. Res. 32:0134-0137, (2004)), or Pfam (Bateman y otros, Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002)). Un conjunto de herramientas para el análisis in silico de secuencias de proteínas está disponible en el servidor ExPASy proteómica (Instituto Suizo de Bioinformática (Gasteiger y otros, ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31 : 3784-3788 (2003) ) . Los dominios o motivos también pueden ser identificados mediante técnicas de rutina, por ejemplo, la alineación de secuencias.

Los métodos para la alineación de secuencias para la comparación son bien conocidos en la materia, estos métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA . GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443 a 453) para encontrar la alineación global (es decir, que abarcan la secuencia completa) de dos secuencias que maximiza el número de coincidencias y reduce al mínimo el número de espacios vacíos. El algoritmo BLAST (Altschul y otros (1990) J Mol Biol 215. 403-10) calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar el análisis BLAST esté disponible al público a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Los homólogos fácilmente pueden ser identificados utilizando, por ejemplo, el algoritmo de múltiples secuencias de alineación Clustal (versión 1.83), con los parámetros por defecto de alineación por parejas y un método de puntuación en el porcentaje. El porcentaje global de similitud e identidad también puede determinarse mediante uno de los métodos disponibles en el paquete de software MatGAT (Campanella y otros, BMC Bioinformatics 2003 Jul 10; 04:29 MatGAT: una aplicación que genera matrices de similitud/identidad con proteínas o secuencias de ADN.). La edición de manuales menores se puede realizar para optimizar la alineación entre los motivos conservados, como será evidente para un experto en la materia. Por otra parte, en lugar de utilizar secuencias de larga duración para la identificación de homólogos, también pueden ser utilizados los dominios específicos. Los valores de identidad de secuencia se pueden determinar sobre toda la secuencia del ácido nucléico o aminoácidos o más dominios seleccionados o motivos de secuencia conservado ( s ) , utilizando los programas mencionados anteriormente con los parámetros por omisión. Para alineaciones locales, el algoritmo de Smith-Waterman es particularmente útil (TF Smith, aterman MS (1981) J. Mol Biol 147 (1) ; 195-7) .

BLAST Reciproco Por lo general, se trata de un primer BLAST que implica, someter a. BLAST una secuencia en cuestión (por ejemplo, utilizando cualquiera de las secuencias listadas en la Tabla A de la sección de ejemplos) en contra de cualquier base de datos de secuencia, tal como la base de datos de NCBI a disposición del público. BLASTN o TBLASTX (utilizando los valores estándar por omisión) se utiliza generalmente cuando se parte de una secuencia de nucleótidos y BLASTP o TBLASTN (utilizando los valores estándar por omisión) cuando parte de una secuencia de la proteína. Los resultados de BLAST, opcionalmerite , se puede filtrar. Las secuencias de longitud completa de cualquiera de los resultados filtrados o los resultados no filtrados, son entonces respaldos de BLASTed (segundo BLAST) contra las secuencias del organismo del que se deriva la secuencia en cuestión. Se comparan los resultados de las primera y segunda explosiones. Un parálogo se identifica si un impacto de alto rango del primer Blast es de la misma especie a partir del cual se deriva la secuencia en cuestión, un respaldo de BLAST da como resultado entonces idealmente la secuencia en cuestión entre los impactos superiores; un ortólogo se identifica si un impacto de clasificación más alta en el primer BLAST no es de la misma especie que de cual se deriva la secuencia en cuestión y preferiblemente da como resultado el respaldo de BLAST en la secuencia en cuestión que está entre los impactos superiores.

Los impactos de alto rango son los que tienen una E de bajo valor. Cuanto menor sea el valor de E, será más significativa la puntuación (o en otras palabras, será menor la posibilidad de que el impacto sea encontrado por casualidad) . En la materia se conoce bien el cálculo del valor de E. Además de los valores de E, las comparaciones son también clasificadas por identidad de porcentaje. La identidad de porcentaje se refiere al número de nucleótidos idénticos (o aminoácidos) entre las dos secuencias de ácidos nucléicos comparados (o polipéptido) sobre una longitud particular. En el caos de familias grandes, se puede usar ClustalW, seguido por un árbol de unión cercano, para ayudar a visualizar la. agrupación. de genes relacionados e identificar ortólogos y paráiogos.

Hibridación El término "hibridación" como se define en este documento es un proceso en donde se templan las secuencias de nucleótidos complementariamente homologas de manera sustancial. El proceso de hibridación puede hacerse en su totalidad en la solución, es decir, ambos ácidos nucléicos están en solución. El proceso de hibridación también puede ocurrir con uno de los ácidos nucléicos complementarios inmovilizados a una matriz, como partículas magnéticas, perlas de Sepharose o cualquier otra resina. El proceso de hibridación, además, puede ocurrir con uno de los ácidos nucléicos complementarios inmovilizados en un soporte sólido, como una membrana de nitro-celulosa o nilón o inmovilizados por ejemplo, fotolitográficamente , por ejemplo, un soporte de vidrio silíceo (este último conocido como matrices de ácido nucléico o microdisposiciones o semiconductores de ácido nucléico) . A fin de permitir que se produzca la hibridación, las moléculas de ácidos nucléicos son generalmente térmicas o químicamente desnaturalizadas para fundir una cadena doble en dos cadenas simples y/o eliminar horquillas u otras estructuras secundarias de una sola cadena de ácidos nucléicos .

El término "restricción" se refiere a las condiciones en que se lleva a cabo una hibridación. La restricción, de la hibridación se ve influida por condiciones tales como temperatura, concentración de sales, fuerza iónica y composición de la solución reguladora de hibridación. Por lo general, se seleccionan condiciones de poca rigurosidad por estar cerca de 30°C más baja del punto de fusión térmico (TM) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Las condiciones de rigurosidad media es cuando la temperatura es de 20 °C por debajo de Tm, y las condiciones de rigurosidad alta son cuando la temperatura es de 10°C por debajo de la Tra. Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad se suelen utilizar para el aislamiento de secuencias de hibridación que tienen alta similitud de secuencia con la secuencia del ácido nucléico blanco. Sin embargo, los ácidos nucléicos pueden diferir de forma secuencial y aún codificar un polipéptido sustancialmente idéntico, debido a la degeneración del código genético. Por lo tanto las condiciones de hibridación de rigurosidad media a veces pueden ser necesarias para identificar dichas moléculas de ácido nucléico.

La Tm es la temperatura por debajo de la fuerza iónica y el pH definidos, en los cuales el 50% de la secuencia blanco híbrida con una sonda coincide perfectamente. La Tm depende de la condiciones de la solución y la composición de la base y la longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. El porcentaje máximo de hibridación se obtiene de aproximadamente 16°C a 32 °C por debajo de la Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electrostática entre las dos hebras de ácido nucléico promoviendo así la formación de híbridos, este efecto es visible a las concentraciones de sodio de hasta 0.4 M (para concentraciones más altas, este efecto puede ser ignorado) . La formamida reduce el régimen de fusión de los duplos ADN-ADN y ADN-ARN con 0.6 a 0.7°C para cada porcentaje de formamida. y la adición de 50% de formamida permite que la hibridación se realice entre 30 y 45°C, aunque el régimen de hibridación se bajo. Las desigualdades de los pares de bases reducen el régimen de hibridación y la estabilidad térmica de los duplos. En promedio y para sondas grandes la Tm disminuye aproximadamente 1°C por desigualdad de % base. La Tm puede calcularse usando las siguientes ecuaciones dependiendo de los tipos de híbridos: 1) Híbridos ADN-ADN (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138, 267-284, 1984) : Tra = 81.5°C + 16.6xlogio [Na']a + 0. 1x% [G/Cb] -500x [Lc] ~x- 0.61 x% formamida 2) Híbridos ADN-ARN o ARN-ARN: Tm = 79.8 + 18.5 ( logi0 [Ma+ ] a) + 0.58 (%G/Cb) + 11.8 (% G/Cj "¿- 820/Lc 3) Híbridos oligo-ADN o oligo-ARN: Para < 20 nucleótidos: Tm = 2 (In) Por 20 a 35 nucleótidos: Tm = 22 + 1.46 (In) a o para otro catión monovalente, pero sólo es precisa en el rango de 0.01 a 0.4 M. b sólo es precisa para GC% en la escala de 30% a 75% CL = longitud del duplo en pares de bases. d oligo, oligonucleótidos , In = longitud efectiva del iniciador = 2 x (no. de G/C) + (no. de A/T) .

La unión no especifica puede ser controlada mediante cualquiera de una serie de técnicas conocidas como, por ejemplo, el bloqueo de la membrana con soluciones que contienen proteínas, las adiciones de heteróloga ARN, el ADN, y SDS al buffer de hibridación y el tratamiento con ARNasa. Para los que no homologa sondas, una serie de hibridaciones se puede realizar mediante la variación de una de (i) reducir progresivamente la temperatura de recocido (por ejemplo de 68 0 C a 42 0 C) o (ii) reducir progresivamente la concentración de formamida (por ejemplo, de 50% a 0%) . El experto es consciente de los distintos parámetros que pueden modificarse durante la hibridación y que, o bien mantener o cambiar las condiciones de rigor.

Además de las condiciones de hibridación, la especificidad de la hibridación típicamente también depende de la función de lavado después de la hibridación. Para eliminar el fondo resultante de la hibridación no específica, las muestras se lavaron con soluciones de sal diluidas. Los factores críticos de lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final: a menor concentración de sal y mayor es la temperatura del agua, mayor es la severidad del lavado. Las condiciones de lavado se realizan normalmente en o por debajo la rigurosidad de la hibridación. Una hibridación positiva da una señal de que es por lo menos el doble de la del fondo. En general, las condiciones adecuadas de rigurosas pruebas de ácido nucléico de hibridación o procedimientos de amplificación de genes de detección son las establecidas anteriormente. Se pueden seleccionar condiciones más o menos estrictas. El experto es consciente de los distintos parámetros que pueden seralterados durante el lavado y que mantendrán o cambiarán las condiciones de rigor.

Por ejemplo, el típico rigor las condiciones de hibridación de alta para los híbridos de ADN de más de 50 nucleótidos abarcan hibridación a 65 0 C en Ix SSC o menos 42 0 C en lx SSC y formamida al 50%, seguido de un lavado a 65 0 C en 0.3x SSC. Ejemplos de medio de hibridación condiciones de rigor para los híbridos de ADN de más de 50 nucleótidos abarcan hibridación a 50 0 C en 4x SSC o en 40 0 C en 6x SSC y formamida al 50%, seguido de un lavado a 50 0 C en 2x SSC. La duración del híbrido es la duración prevista para la hibridación de ácidos nucléicos. Cuando los ácidos nucléicos de secuencia conocida son híbridos, la longitud de híbridos se puede determinar mediante la alineación de las secuencias y la identificación de las regiones conservadas se describe en este documento. 1 x SSC es 0.15 M de NaCl y 15 m.M de citrato de sodio, la solución de hibridación y soluciones de lavado, además, pueden incluir reactivo de Denhardt 5x, 0.5 a 1.0% SDS, 100 mg/ml, ADN de esperma de salmón desnaturalizado fragmentado, pirofosfato de sodio 0.5%.

A definir el nivel de restricción, se puede hacer-referencia a Sambrook y otros. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3aEdición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York o a protocolos actuales en Biología Molecular, John Wiley & Sons, New York (1989 y actualizaciones anuales) .

Variante de_ División El término "variante de división" que se utiliza en este documento abarca las variantes de una secuencia de ácido nucléico en el que los intrones y/o exones seleccionados han sido extirpados, sustituidos, desplazados o agregados, o en el que los intrones se han acortado o alargado. Tales variantes serán aquellos en los que es sustancialmente la actividad biológica de la proteína retenida, lo que puede lograrse mediante una selección de retención de los segmentos funcionales de la proteína. Tales variantes de división se pueden encontrarse en la naturaleza o pueden ser producidos por el hombre. Los métodos para predecir y aislar variantes de división son bien conocidos en la materia (véase, por ejemplo Foissac y Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).

Variantes alélicas Los alelos o variantes alélicas son formas alternativas de un gen determinado, que se encuentra en la posición cromosómica mismo. Las. variantes alélicas abarcan Polimorfismos de Nucleótido Único (SNP), asi como la Polimorfismos de Inserción/Supresión Pequeños (INDELs). El tamaño de INDELs suele ser inferior a 100 pb . SNPs e INDELs forman el mayor conjunto de variantes de la secuencia en cepas que ocurren naturalmente polimórficas de la mayoría de los organismos.

Gen endógeno Las referencias a un "endógeno" de genes no sólo se refiere al gen en cuestión, que se encuentran en una planta en su forma natural (es decir, sin ninguna intervención humana) , sino también se refiere a que un mismo gen (o un ácido nucléico/gen sustancialmente homólogo) en una forma aislada posteriormente (re) introducido en una planta (un transgén) . Por ejemplo, una planta transgénica que contiene un transgén puede encontrar una reducción sustancial de la expresión del transgén y/o reducción sustancial de la expresión del gen endógeno. El gen aislado se puede aislar de un organismo o puede ser producido por el hombre, por ejemplo, mediante síntesis química.

Intercambio de genes/evolución dirigida El intercambio de genes o la evolución dirigida consiste en repeticiones de transposición de ADN seguido de un examen adecuado y/o selección para generar variantes de los ácidos nucléicos o partes de ellos codifican proteínas con una actividad biológica modificada (Castle y otros, (2004) Science 304 (5674): 1151-4; patentes de E.U.A. 5811, 238 y 6, 395, 547) .

Construcción Los elementos de regulación adicionales pueden incluir mejoradores transcripcional , así como potenciadores de la traducción. Los expertos en la materia se darán cuenta de las secuencias de terminación y potenciador que pueden ser adecuados para su uso en la realización de la invención. Una secuencia de intrón también se puede agregar a la región 5' no traducida (UTR) o en la secuencia de codificación para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol, como se describe en la sección de definiciones. Otras secuencias de control (además de promotor, potenciador, silenciador, secuencias de intrón, 3' UTR y/o regiones 5 'UTR) pueden ser elementos de estabilización de proteína y/o AR . Tales secuencias se conocen o puede ser obtenidas por un experto en la materia.

Las construcciones genéticas de la invención pueden incluir un origen de la secuencia de replicación que se requiere para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo especifico de célula. Un ejemplo es cuando una construcción genética que se requiere para mantenerse en una célula bacteriana como un elemento episomal genético (por ejemplo, molécula de plásmido o cósmido) . Los orígenes preferidos de replicación incluyen, pero no se limitan a, el fl-oh y colEl.

Para la detección de la transferencia con éxito de la secuencias de ácido nucléico que se utilizan en los métodos de la invención y/o selección de plantas transgénicas que comprenden estos ácidos nucléicos, es conveniente utilizar genes marcadores (o genes reporteros). Por lo tanto, la construcción genética opcionalmente puede incluir un gen marcador de selección. Los marcadores seleccionables se describen con más detalle en la sección "Definiciones" en este documento. Los genes marcadores se pueden quitar o eliminar de la célula de transgénicos una vez que ya no son necesarios. Las técnicas para la eliminación del marcador se conocen en la materia, las técnicas útiles se han descrito ante iormente en la sección de definiciones.

Elementos Reglamentarios /Secuencia de Control/ Promotor Los términos "elemento regulador", "secuencia de control" y "promotor" son usados indistintamente en este documento y deben ser tomados en un contexto amplio para referirse a la reglamentación secuencias de ácidos nucléicos capaces de efectuar la expresión de las secuencias a las que se ligan. El término "promotor" típicamente se refiere a una secuencia de ácido nucléico de control situado corriente arriba del inicio de la transcripción de un gen y que está involucrado en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa y otras proteínas, dirigiendo así la transcripción de un ácido nucléico ligado operablemente. Dentro de los términos antes mencionados están la transcripción secuencias reguladoras derivadas de genes eucariotas genómicos clásicos (incluyendo la casilla TATA que se requiere para iniciar la transcripción exacta, con o sin una secuencia de casilla CCAAT) y otros elementos reguladores (es decir, secuencias de activación corriente arriba, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta a los estímulos de desarrollo y/o externos, o de una manera específica para el tejido. También se incluyen dentro del término una secuencia de regulación transcripcional de un gen procariótico clásico, en cuyo caso se puede incluir una secuencia de casilla -35 y/o casilla -10 de secuencias reguladoras de la transcripción. El término "elemento regulador" también comprende una molécula de fusión sintética o derivada que confiere, activa o aumenta la expresión de una molécula de ácido nucleico en la célula, tejido u órgano.

Un "promotor de planta" se compone de elementos reguladores, que median la expresión de un segmento de secuencia de codificación en las células de plantas. En consecuencia, un promotor de planta no tiene por qué ser de origen de planta, sino puede originarse de virus o microorganismos, por ejemplo, virus que atacan a las células de plantas. El "promotor de planta", también se puede originar a partir de una célula de planta, por ejemplo, de la planta que se transforma con la secuencia de ácido nucléico que se expresa en el proceso de de la invención y e describe en este documento. Esto se aplica también a otras señales de regulación de "plantas", tales como terminadores de "plantas". Los promotores corriente arriba de las secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de la presente invención pueden ser modificados por la sustitución de uno o más nucleótidos, inserciones y/o eliminaciones sin interferir con la funcionalidad o la. actividad de cualquiera de los promotores, el marco de lectura abierta (ORF) o en la región de regulación 3', tales como terminadores o regiones 3' reguladoras que se encuentran lejos de la ORF. Además, es posible que la actividad de los promotores se incrementa por la modificación de su secuencia, o que sean sustituidos completamente por los promotores más activos, incluso los promotores de los organismos heterólogos. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucléico que, corno se describe anteriormente, está vinculada operativamente a un promotor o comprende expresión adecuada del gen en el punto correcto en el tiempo y con el patrón de. expresión espacial requerida .

Para la identificación de los promotores funcionalmente equivalentes, la fuerza del promotor y/o patrón de expresión de un promotor candidato puede ser analizado por ejemplo, vincular operativamente el promotor de un gen reportero y analizar el nivel de expresión, la estructura del gen reportero en varios tejidos de la planta. Los genes reporteros convenientes más conocidas son, por ejemplo, beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La actividad promotora se analiza midiendo la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La fuerza del promotor y/o patrón de expresión a continuación, puede compararse a la de un promotor de referencia (como la utilizada en los métodos de la invención) . Por otra parte, la fuerza promotora se puede probar mediante la cuantificación de los niveles de mARN o mediante la comparación de los niveles de mARN del ácido nucléico utilizado en los métodos de la presente invención, con los niveles de mARN de genes de limpieza tales como 18S rARN, utilizando métodos conocidos en la materia, tales como análisis Northern con el análisis derisitométrico de autorradiogramas , PCR en tiempo real cuantitativo o RT-PCR (Heid y otros, 1996 Genome Methods 6:. 986-994). Generalmente por "promotor débil" se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia de codificación en un nivel bajo. Por " nivel bajo" se entiende un nivel de alrededor de 1/10,000 transcripciones a aproximadamente 1/100,000 transcripciones, a cerca de 1/500,000 transcripciones por célula. Por el contrario, un "promotor fuerte" expresa una secuencia de codificación de alto nivel, o de aproximadamente 1/10 transcripciones a aproximadamente 1/100 transcripciones a aproximadamente 1/1000 transcripciones por célula. En general, por "promotor de resistencia media" se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia de codificación a un nivel más bajo que un promotor fuerte, en particular, a un nivel que en todos los casos está por debajo de lo obtenido cuando están bajo el control de un promotor 35S CaMV .

Ligado operativamente El término "unido operativamente" como se usa en la presente, se refiere a una unión funcional entre la secuencia del promotor y el gen de interés, de manera que la secuencia del promotor está en condiciones de iniciar la transcripción del gen de interés.

Prornotor Const it ut ivo Un "promotor constitutivo" se refiere a un promotor que es transcripcionalmente activo durante la mayoría, pero no necesariamente todas, las fases de crecimiento y desarrollo y en la mayoría de las condiciones ambientales, por lo menos en una célula, tejido u órgano. La. Tabla 2a siguiente da ejemplos de promotores constitutivos.

Tabla 2a: Ejemplos de promotores constitutivos Fuente del Gen Referencia Actina McEIroy et al, Plant Cell. 2: 163-171 , 1990 HMGP WO 2004/070039 CA V 35S Odell et al, Nature, 313: 8 0-812; 1985 CaMV 19S Nilsson et al., Physiol. Plant. 100:456-462, 1997 GOS2 de Pater et al, Plant J Nov;2(6):837-44, 1992, WO 2004/065596 Ubiquitina Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992 Ciclofilina de arroz Buchholz et al, Plant Mol Biol. 25(5): 837-43, 1994 Historia H3 de maíz Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231 :276-285, 1992 Histona H3 de alfalfa Wu et al. Plant Mol. Biol. 11 :641 -649, 1988 Actina 2 An et al, Plant J . 10(1 ); 107-121 , 1996 34S FMV Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443 Subunidad pequeña de rubisco US 4,962,028 oes Leisner (1988) Proc Nati Acad Sci USA 85(5): 2553 SAD1 Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696 SAD2 Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696 nos Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20):7831 -7846 V-ATPase WO 01/14572 Super promotor WO 95/14098 Proteínas G-box WO 94/12015 Promotor Ubicuo Un promotor ubicuo es activo sustancialmente en todos los tejidos o células de un organismo.

Promotor Regulados Desarrolladamente Un promotor regulado desarrolladamente es activo durante ciertas etapas de desarrollo o en partes de la planta que se somete a cambios de desarrollo.

Promotor Inducible Un promotor inducible ha inducido o aumentado el inicio de la transcripción en respuesta a una sustancia química (para una revisión ver Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108), estímulo ambiental o físico, o puede ser " inducible por estrés", es decir, se activa cuando una planta se expone a diversas condiciones de estrés, o "inducible por patógeno", es decir se activa cuando una planta se expone a la exposición a diversos agentes patógenos .

Promotor Específico para Órganos/Específico para Tej idos Un promotor específico para órganos o específico para tejidos es aquel que es capaz de iniciar la transcripción preferiblemente en ciertos órganos o tejidos, tales como las hojas, raíces, tejidos, etc. de la semilla, por ejemplo, un "promotor de específico para raíces" es un promotor que es transcripcionalmente activo de manera predominante en las raíces de plantas, sustancialmente para la exclusión de cualquier otra parte de una planta, mientras que todavía permite que cualquier expresión de fugas en estas partes de la planta. Los promotores capaces de iniciar la transcripción en las células únicamente se hace referencia aquí como "células específicas".

Ejemplos de promotores específicos de la raíz se enumeran en la Tabla 2b a continuación: Tabla 2b: Ejemplos de promotores específicos de la raíz Fuente de Genes Referencia RCc3 Plant Mol. Biol. 1995 Ene; 27 (2 } : 237-48 Arabidopsís PHT1 Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002) Plant J. 31:341) Transportador de Xiao et al. 2006 fosfato Medicago Arabidopsís PyklO Nitz y otros (2001) plant Sci 161 (2) : 337: 346 Genes no expresibles Tingey et al., EMBO J. 6:1, 1987 por raíz Gen inducible por Van der Zaal y o tros, plant Mol. Bio.l 16, auxina de tabaco 983, 1991 ß-tubulina Oppenheimer, y otros, Gene 63: 87, 1988 genes específicos para Conkling, y otros, Plant Physiol. 93: 1203, raíces de tabaco 1990 gen Gl-3b B. napus Patente de Estados Unidos No. 5,401,836 Un promotor de semillas especificas es transcripcionalmente activo sobre todo en tejido de semillas, pero no necesariamente de forma exclusiva en el tejido de semillas (en los casos de expresión de fugas) . El promotor de semillas especificas pueden ser activos durante el desarrollo de semillas y/o durante la germinación. El promotor especifico de semillas puede ser especifica para endospermo/aleurona/embrión . Ejemplos de promotores específicos de semilla (específica para en.dospe.rmo/aleurona/ embrión) se muestran en la Tabla 2c a la Tabla 21 a continuación. Otros ejemplos de promotores específicos de semillas se dan en Qing Qu y Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113-125, 2004), cuya descripción es incorporada por referencia en este documento como se exhibe completamente.

Tabla 2c: Ejemplos de promotores específicos semillas Fuente del. Gen Referencia Simón et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, Genes específicos de semillas 1985; Scofield et al., J. Biol. Chern. 262: 12202, 1987; Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

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Wu et al., Plant Cell Fhysiology 39(8) prolamina NRP33 de arroz 885-889, 1998 Wu et al., Plant Cell Physiology 39(3) a-cjlobu.lin Glb-1 de arroz 885-889, 1998 Sato et al., Froc. Nati. Acad. Sci. arroz OSH1 USA, 93: 8117-8122, 1996 Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: a-globulina REB/OHP-1 de arroz 513-522, 1997 ADP-glucosa p.i rofosfori 1 asa de Trans Res 6:157-68,1997 arroz familia del gen ESR de maíz Plant J 12:235-46, 1997 DeRose et al., Plant Mol. Bioi a-kafirina de sorgo 32: 1029-35, 1996 Postma-Haarsma et al., Plant Mol.

KNOX Biol. 39:257-71, 1999 Wu et al., J. Biochem. 1.23:386, oleosina de arroz 1998 Cummins et al., Plant. Mol. Biol. óleos ina de gi raso1 19: 87.3-876, 1992 PR00117, proteina ribosontal 4oS WO 2004/070039 de. arroz putativa PR00136, alanina de arroz no publicado aminot rans feras PR00147, inhibidor de tripsina no publicado ÍTR 1 (cebada) PR0C151, WSI18 arroz WO 2004/070039 PR00175, RAB21 arroz WO 2004/070039 PROO05 WO 2004/070039 PROO095 WO 2004/070039 Lañaban et al., Plant Cell 4:203-211, Oí-amilasa (Amy32b) 1992; Skriver et al . , Proc Nati Acad. Sai USA 88: 7266-7270, 1991 Cejudo et al., Plant Mol catepsina similar a gen ß Biol 20:849-856, 1992 Cebada üp2 Kalla et al., Plant J. 6:849-60, 1994 Chi26 Leah et ai., Plant J. 4:579-39, 1994 Maiz B-Peru Selingeratal . , Genetics 149; .1125-38, 1998 Tabla 2d: ejemplo de promotores específicos para endospermos Fuente del Gen Referencia Takaiwa et al. (1986) Mol Gen glutelina (arroz) Genet 208:15-22; Takaiwa et al. (1987) FEBS Letts. 221 :43-47 Matzke et al., (1990) Plant zeina Mol Biol 14 (3) : 323-32 Colot et. al. (1989) Mol Gen trigo LMW y HMW Genet 216:81-90, Anderson et al. (1.989) NAR 17:461-2 wheat SPA trigo SPA Rafalski et al. (1984) EMBO gliadinas de trigo 3: 1409-15 Diaz et al. (1995) Mol Gen promotor Itrl de cebada Genet 248(5) : 592-8 Cho et al. (1999) Theor Appl cebada Bl, C, 0, hordeina Genet 98:1253-62; Muí 1er et al. (1993) Plant J 4 : 343-55; Sorenson el: al. (1996) Mol Gen Genet 250:750-60 Mena et al., (1998) Plant J cebada DOF 116(1) : 53-62 Onate et al. (1999) J Biol blz2 Chem 274 (14) : 9175-82 Vicente-Garbaj osa et al. promotor sintético (1998) Plant J 13:629-640 u et al., (1998) Plant Cell prolamina NRP33 de arroz Fysiol 39(8) 885-889 Wu et al. (1998) Plant Cell -globulina Glb-1 de arroz Fysiol 39(8) 885-889 a-globulina REB/OHP-1 de Nakase et al. (1997) Plant arroz Molec Biol 33: 51.3-522 ADP-glucosa pirofosforilasa Russell et al. (1997) Trans de arroz Res 6:157-68 Opsahl-Ferstad et al. (1997) familia del gen ESR de maíz Plant J 12:235-46 DeRose et al. (1996) Plant a-kafirina de sorgo Mol Biol 32:1029-35 Tabla 2e: Ejemplos de promotores específicos para embriones : Tabla 2f_:__ Ej emplos de Promotores específicos para aleuronas : Un promotor específico de tejido verde tal como se define en este documento es un promotor que es transcripcionalmente activo principalmente en el tejido verde, sustancialmente a la exclusión de cualquier otra parte de una planta, mientras que todavía permite cualquier expresión de fugas en estas partes de la planta.

Ejemplos de promotores específicos de tejido verde que puede ser utilizado para realizar los métodos de la invención se muestran en la siguiente Tabla 2g.

Tabla 2g: Ejemplos de promotores específicos de tejido verde Fuente del Gen Expresión del gen Referencia Diquinasa Fuk.ava.ma et ortofosfatos de Solo en la hoja. al. , 2001 maíz Fosfofenolpiruvato carboxilasa de Solo en la hoja Kausch et al. , 2001 maíz Fosfofenolpiruvato carboxilasa de Solo en la hoja Liu et al. ,2003 maíz Subunidad pequeña de rubi seo de Solo en. la hoja Nomura et al., 2000 arroz expansina beta Solo en brote WO 2004/070039 EXBP9 de arroz Subunidad pequeña Panguluri et de rubisco de Solo en la hoja al. , 2005 gandul guisante RBCS3A Solo en la hoja Otro ejemplo de un promotor específico para tejido es un promotor específico para meristemas, que es transcripcionalmente activo principalmente en el tejido meristemático, sustancialmente para la exclusión de cualquier otra parte de una planta, mientras que todavía permite cualquier expresión de fugas en estas partes de la planta. Ejemplos de promotores específicos de meristemas verde, que pueden ser utilizados para realizar los métodos de la invención se muestran en la siguiente Tabla 2h.

Tabla_ 2h : Ejemplos^ de promotores _ específicos para meristemas Terminador El término "terminador" comprende una secuencia de control que es una secuencia de ADN al final de una unidad transcripcional que las señales de procesamiento 3' y poliadenilación de la transcripción primaria y la terminación de la transcripción. El terminador se puede derivar de la genética natural, de una variedad de genes de otras plantas, o de T-ADN. El terminador que se añade se puede derivar de, por ejemplo, el de genes de nopalina sintasa u octopina sintasa, o bien de otro gen de plantas, o menos preferiblemente de cualquier otro gen eucariótico.

(Gen) de Marcadores seleccionables/Gen Reportero "Marcador seleccionable", "gen marcador seleccionable" o "gen reportero" incluye cualquier gen que confiere un fenotipo en una célula en la que se expresa a fin de facilitar la identificación y/o selección de células que son transíectadas o transformadas con una construcción de ácido nucléico de la invención. Estos marcadores genéticos permiten la identificación de una transferencia exitosa de las moléculas de ácidos nucléicos a través de una serie de principios diferentes. Los marcadores adecuados pueden ser-seleccionados de los marcadores que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas, que introducen una nueva característica metabólica o que permiten la selección visual. Ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a los antibióticos (por ejemplo, nptll que fosforila la neomicina y kanamicina, o HPT, higromícina de fosforilación, o genes que confieren resistencia a, por ejemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol , ampicilína, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina) , herbicidas (para la barra de ejemplos que proporciona resistencia a Basta®; aroA o gox que provee resistencia contra glifosato, o genes que confieren resistencia a, por ejemplo, imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea) , o genes que proporcionan una característica metabólica (como manA que permite que las plantas utilicen mañosa como única fuente de carbono o xilosa isomerasa para, la utilización de xilosa o marcadores antinutricionales tales como resistencia a 2-desoxiglucosa ) . La expresión de genes marcadores visuales dan como resultado la formación de color (por ejemplo ß-glucuronidasa, GUS o ß-galactosidasa con sus sustratos de color, por ejemplo X-Gal), luminiscencia (como el sistema de luciferina/luceferase) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP y sus derivados) . Esta lista representa sólo un pequeño número de posibles marcadores. El trabajador calificado está familiarizado con tales marcadores. Se prefieren diferentes marcadores, según el organismo y el método de selección.

Se sabe que en la integración estable o transitoria de los ácidos nucléicos en las células de plantas, sólo una minoría de las células toma el AD'N extraño y, si se desea, lo integra en su genona, según el vector de expresión utilizado y la técnica de transfección utilizado. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador de selección (como los descritos anteriormente) suele ser introducido en las células huésped, junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden ser utilizados, por ejemplo, en los mutantes en los que estos genes no son funcionales, por ejemplo, la eliminación por métodos convencionales. Además, el ácido nucleico que codifica moléculas de un marcador de selección se puede introducir en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o se usa en los métodos de la invención, o bien en un vector separado. Las células que han sido transíectadas establemente con el ácido nucléico introducido se pueden identificar, por ejemplo, por selección (por ejemplo, las células que han integrado el marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células mueren) .

Dado que los genes marcadores, en particular los genes de resistencia a los antibióticos y herbicidas, ya no son necesarios o no deseados en la célula huésped transgénica una vez que los ácidos nucléicos se han introducido con éxito, el proceso de acuerdo con la invención de la introducción de los ácidos nucléicos ventajoso emplea técnicas que permitir la eliminación o supresión de estos genes marcadores. Dicho método es lo que se conoce como co-transformación. El método de co-transformación emplea dos vectores de forma simultánea para la transformación, un vector que lleva el ácido nucléico de acuerdo con la invención y un segundo que contiene los genes marcadores. Una gran proporción de transformantes recibe o, en el caso de las plantas, consta de (hasta un 40% o más de los transformantes), ambos vectores. En caso de transformación con agrobacterias , los transformantes por lo general reciben sólo una parte del vector, es decir, la secuencia flanqueada por el T-ADN, que suele representar el cásete de expresión. Los genes marcadores posteriormente pueden ser retirados de la planta transformada mediante la realización de cruzas. En otro método, los genes marcadores integrados en un transposón se utilizan para la transformación junto con el ácido nucléico deseado (conocido como tecnología Ac/Ds) . Los transformantes se puede cruzar con una fuente de transposasa o los transformantes se transforman con una construcción de ácido nucléico que confiere la expresión de una transposasa, de forma temporal o estable. En algunos casos (aprox. 10%), el transposón salta del genoma de la. célula huésped una vez que la transformación ha tenido lugar con éxito y se pierde. En un número mayor de casos, el transposón salta a una ubicación diferente. En estos casos, el gen marcador debe ser eliminado mediante la realización de cruzas. En microbiología, se han desarrollado técnicas que hacen posible o facilitan la detección de tales eventos. Un método más ventajoso se basa en lo que se conoce como sistemas de recombinación, cuya ventaja es que se puede dispensar la eliminación por la cruza. El sistema más conocido de este tipo es lo que se conoce como el sistema Cre/Iox. Creí es una recombinasa que elimina las secuencias situadas entre las secuencias IoxP. Si el gen marcador se integra entre las secuencias IoxP, se retira una vez que la. transformación ha tenido lugar con éxito, por la expresión de la recombinasa. Además los sistemas de recombinación son los sistemas de HIN/Hi , FLP/FRT y REP/STB (Tribble y otros, J. Biol Chem, 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan y otros, J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Es posible una integración específica para sitio en el genoma de la planta de las secuencias de ácido nucléico de acuerdo con la invención. Naturalmente, estos métodos también se pueden aplicar a los microorganismos como la levadura, hongos o bacterias.

Transgénicos/Transgén/Recoirtbinante Para los fines de la invención, "transgénicos" , "transgén" o "recombinante" significa con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácido nucléico, un cásete de expresión, construcción genética o un vector que comprende la secuencia de ácido nucléico o un organismo transformado con las secuencias de ácidos nucléicos, la expresión de casetes o vectores de la invención, todas las construcciones provocados por métodos recombinantes en los que (a) la secuencias de ácido nucléico que codifican proteínas útiles en los métodos de la invención, o (b) secuencia de control genético que está unido operativamente a la secuencia de ácido nucléico de acuerdo con la invención, por ejemplo, un promotor, o (c) a) y b) no se encuentran en su ambiente genético natural o han sido modificadas por métodos recombinantes, siendo posible que la modificación a la forma de, por ejemplo, una sustitución, adición, eliminación, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótidos. El ambiente genético natural se entiende en el sentido del sitio genómico o crornosorna1 natural en la planta original o presencia en un genómico. En el caso de un banco genómico, se prefiere mantener el ambiente natural genético de la secuencia del ácido nucléico, al menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácidos nucléicos, por lo menos en un lado y tiene una longitud de la secuencia de al menos 50 pb, de preferencia al menos 500 pb, en especial preferencia por lo menos a 1000 pb, preferiblemente por lo menos a 5000 pb. Un cásete de expresión natural, por ejemplo, la combinación natural del promotor natural de las secuencias de ácidos nucléicos con la secuencia de ácido nucléico correspondiente que codifica un polipéptido útil en los métodos de la presente invención, según lo definido antes, se convierte en un cásete de expresión cuando este cásete de expresión transgénico es modificado por los métodos no naturales, sintéticos ("artificiales") como, por ejemplo, el tratamiento mutagénico. Los métodos adecuados se describen, por ejemplo, en US 5565350 o WO 00/15815.

Una planta transgénica para los fines de la invención es, pueden entenderse en el sentido, como antes, que los ácidos nucléicos utilizados en el método de la invención no se encuentran en su sitio natural en el genoma de dicha planta, siendo posible que los ácidos nucléicos se expresen homologa o heterólogamente . Sin embargo, como se ha mencionado, transgénico también significa que, mientras que los ácidos nucléicos de acuerdo con la invención o utilizados en el método de la invención se encuentran en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia se ha modificado con respecto a la secuencia natural, y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales han sido modificadas. Transgénicos se entiende preferiblemente como la expresión de los ácidos nucléicos de acuerdo con la invención en un sitio no natural en el genoma, es decir, se lleva a cabo la expresión homologa o, preferiblemente, heteróloga, de los ácidos nucléicos. Las plantas transgénicas recomendadas se mencionan en este documento.

Modulación El término "modulación" en relación con la expresión o la expresión de genes, se entiende como un proceso en el que se cambia el nivel de expresión por dicha expresión génica en comparación con el control de la planta, el nivel de expresión puede ser aumentado o disminuido. La expresión original no modulada puede ser de cualquier tipo de expresión de una estructura del ARN (rARN, tARN) o mARN con traducción posterior. El término "modulación de la actividad", cualquier cambio de la expresión de las secuencias de ácido nucléico de la invención o de las proteínas codificadas, lo que conduce a un mayor rendimiento y/o un mayor crecimiento de las plantas.

Expresión El término "expresión" o "expresión de genes", la transcripción de un gen específico o genes específicos o construcción genética específica. El término "expresión" o "la expresión de genes", en particular, mediante la transcripción de un. gen o los genes o la construcción genética en ARN (rARN, tAR ) o mARN estructurales con o sin traducción posterior de este último en una proteína. El proceso incluye la transcripción del ADN y el procesamiento del producto ARNm resultante.

Exprésión/Sobreexpresión Incrementada El término "expresión incrementada" o "sobre-expresión" como se usa aquí, toda forma de expresión que sea adicional al nivel de expresión original de tipo salvaje.

Los métodos para aumentar la expresión de genes o productos génicos están bien documentados en la técnica e incluyen, por ejemplo, la. sobreexpresión impulsada por los promotores de su caso, el uso de potenciadores de la transcripción o potenciadores de la traducción. Aislado ácidos nucléicos que sirven como elementos promotor o potenciador se puede introducir en una posición adecuada (por lo general corriente arriba) de una forma no de un polinucleótido heterólogo con el fin de regular ascendentemente la expresión de un ácido nucléico que codifica el polipéptido de interés. Por ejemplo, los promotores endógenos pueden ser modificados en vivo por la mutación, eliminación y/o sustitución (véase, Kmiec, US 5,565,350; Zarling y otros, W09322443), o promotores aislados pueden ser introducidos en una célula de la planta en la orientación adecuada y distancia de un gen de la presente invención con el fin de controlar la expresión del gen.

Si se desea la expresión del polipéptido, es generalmente conveniente incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región de codificación de polinucleótido. La región de poliadenilación se puede derivar de los genes naturales, a partir de una variedad de genes de otras plantas, o de T-ADN. La secuencia del extremo 3' que se añade se pueden derivar de, por ejemplo, los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa, o bien de otro gen de la planta, o menos preferiblemente de otro gen eucariótico.

Una secuencia de intrón también se puede agregar a la región 5' no traducida (UTR) o la secuencia de codificación de la secuencia parcial de codificación para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón divisible en la unidad de transcripción, tanto en construcciones de expresión de plantas y animales se ha demostrado que aumenta la expresión génica, tanto en el mARN y los niveles de proteína hasta 1000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell Biol . 8: 4395 -4405; Callis y otros (1987) Genes Dev. 1:1183-1200). Este mejoramiento en el intrón de la expresión génica es típicamente más grande cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de intrones de maíz Adhl-S intrón 1, 2, y 6, del Bronze-1 intrón son conocidos en la materia.

Para obtener información general, véase: The Maize Handbook Capítulo 116, y Freeling Walbot, Eds, Springer, New York (1994 ) .

Expresión Disminuida La referencia en la presente a "expresión disminuida" o "reducción o eliminación sustancial" de la expresión se entiende una disminución en la expresión de genes endógenos y/o los niveles de polipéptido y/o actividad del polipéptido en relación con el control de las plantas. La eliminación o reducción sustancial en orden creciente de preferencia es de por lo menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más reducido en comparación con la de las plantas de control.

Para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno en una planta, con una longitud suficiente de nucleótidos sustancialmente contiguo de una secuencia de ácido nucléico que se requiere. Para llevar a cabo el silenciamiento de genes, esto puede ser tan poco como 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 nucleótidos o menos, en su defecto que puede ser tanto como el gen completo (incluyendo el UTR 5' y/o 3', ya sea en parte o en su totalidad) . La extensión de nucleótidos sustancialmente contiguos puede ser derivada de ácido nucléico que codifica la proteína de interés (gen blanco) , o de cualquier ácido nucléico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés. Preferiblemente, la extensión de forma sustancial de los nucleótidos contiguos es capaz de formar puentes de hidrógeno con el gen blanco (hebra tanto en sentido como en contrasentido) , preferiblemente, la extensión de nucleótidos sustancialmente contigua tiene, en orden creciente de preferencia, 50%, 60%, 70 %, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidad de secuencia con el gen blanco (hebra tanto en sentido como en contrasentido) . Una secuencia de ácido nucléico que codifica un polipéptido (funcional) no es un requisito para los distintos métodos discutidos en este documento para la. reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno.

Esta eliminación o reducción sustancial de la expresión se puede lograr utilizando las herramientas y las técnicas de rutina. Un método preferido para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de genes endógenos es introducir y expresar en una planta de una construcción genética en la que el ácido nucléico (en este caso un tramo de nucleótidos contiguos sustancialmente derivadas del gen de interés, o de cualquier nucléicos ácido capaz de codificar un ortólogo, parálogo homólogo o de cualquiera de la proteina de interés) se clona como una repetición invertida (en parte o totalmente) , separados por un espaciador (ADN no codificante) .

En este método preferido, la expresión del gen endógeno se reduce o se elimina substancialmente a través de silenciamiento mediado por ARN con una repetición invertida de un ácido nucléico o una parte del mismo (en este caso una extensión de nucleótidos sustancialmente contiguo derivado del gen de interés, o de cualquier ácido nucléico capaz de codificar un ortólogo, parálogo o homólogo de la proteina de interés) , de preferencia capaz de formar una estructura de horquilla. La repetición invertida se clona en un vector de expresión que comprende secuencias de control. Una secuencia no codificante del ADN de ácido nucléico (un separador, por ejemplo, un fragmento de apego región de la matriz. (MAR), un intrón, un polientrelazador , etc.) se encuentra entre los dos invertida ácidos nucléicos que forman la repetición invertida. Después de la transcripción de la repetición invertida, se forma un ARN quimérico con una estructura auto-complementaria (parcial o completa) . Esta estructura de ARN de doble cadena se conoce como la horquilla de ARN (hpARN) . El hpARN es procesado por la planta en siARNs que se incorporan a un complejo inducido por silenciamiento de ARN (RISC) . El RISC además rompe las transcripciones de ARNm, por lo tanto reduce sustancialmente el número de transcripciones de ARNm para ser traducido en polipéptidos . Para más información general, véase por ejemplo, Grierson y otros. (1998) WO 98/53083; Waterhouse y otros. (1999) WO 99/53050).

El funcionamiento de los métodos de la invención no se basa en la introducción y expresión en una planta de una construcción genética en la que el ácido nucléico se clona como una repetición invertida, pero uno o más de varios métodos bien conocidos de "gen silenciador" pueden ser utilizados para lograr los mismos efectos. ?no de estos métodos para la reducción de la expresión de genes endógenos es el silenciamiento mediado por ARN de la expresión génica (desregulación) . El silenciamiento de este caso se activa en una planta por una secuencia de ARN de doble cadena (dsARN) que es sustancialmente similar al gen endógeno blanco. Este dsARN es procesado por la planta en aproximadamente 20 a 26 nucleótidos llamado ARN corto de interferencia (siARN). Los siARNs se incorporan a un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que rompe la transcripción del ARNm del gen endógeno blanco, lo que reduce considerablemente el número de transcripciones de ARNm y se traduce en un - polipéptido . Preferiblemente, la secuencia de ARN de doble cadena corresponde a un gen blanco.

Otro ejemplo de un método de silenciamiento de ARN consiste en la introducción de secuencias de ácidos nucléicos y sus partes (en este caso un tramo de nucleótidos contiguos sustancialmente derivadas del gen de interés, o de cualquier ácido nucléico capaz de codificar un ortólogo, parálogo o homólogo de la proteina de interés) en una orientación de sentido en una planta. "Sentido de orientación" se refiere a una secuencia de ADN que es homologa a una transcripción del ARNm de la misma. Introducido en una planta, por lo tanto, tiene por lo menos una copia de la secuencia del ácido nucléico. La secuencia de ácido nucléico adicional se reduce a la expresión del gen endógeno, dando lugar a un fenómeno conocido como co-supresión . La reducción de la expresión génica será más pronunciado si varias copias de una secuencia de ácido nucléico que se introducen en la planta, ya que existe una correlación positiva entre los niveles de transcripción de alta y la supresión de la co-acti ación .

Otro ejemplo de un método de silenciamiento de ARN implica el uso de secuencias de ácidos nucléicos en contrasentido. Un "contrasentido" secuencia de ácido nucléico que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un "sentido" secuencia de ácido nucléico que codifica una proteína, es decir, complementario a la cadena de codificación de una molécula de DNA de doble cadena o complementarios a una secuencia de la transcripción del ARNm. La secuencia de ácido nucléico contrasentido es preferiblemente complementaria ' al gen endógeno de ser silenciada. La complementariedad puede ser localizada en la región de "codificación" y/o en la región de "no-codificación" de un gen. El término "codificación regional" se refiere a una región de la secuencia de nucleótidos que comprende los codones que se traducen en residuos de aminoácidos. La "región no codificante" se refiere a 5' y 3' secuencias que flanquean la región de codificación que se transcriben pero no se traducen en los aminoácidos (también conocida como 5' y 3' regiones no traducidas) .

Las secuencias de ácidos nucléicos en contrasentido pueden ser diseñadas de acuerdo a las reglas de pares de base Watson y Crick. La secuencia de ácido nucléico en contrasentido puede ser complementaria a la secuencia de ácido nucléico entero (en este caso una extensión de nucleótidos contiguos sustancialmente derivados del gen de interés, o de cualquier ácido nucléico capaz de codificar un ortólogo, parálogo o homólogo de la proteína de interés) , pero también puede ser un oligonucleótido en contrasentido que es sólo una parte de la secuencia del ácido nucléico (incluyendo el mARN 5' y 3' UTR) . Por ejemplo, la secuencia de oligonucleótidos en contrasentido puede ser complementaria a la región que rodea el sitio de inicio de traducción de una codificación de la transcripción del mARN de un polipéptido. La longitud de una secuencia de oligonucleótidos en contrasentido adecuado es conocida en la técnica y puede iniciar desde aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 nucleótidos de longitud o menos. Una secuencia en contrasentido de ácido nucléico de la invención puede ser-construida con la síntesis de las reacciones de ligaduras químicas y enzimáticas mediante métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, una secuencia en contrasentido de ácido nucléico (por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos contrasentido) pueden ser sintetizados químicamente usando nucleótidos naturales o nucleótidos modificados de diversas diseñado para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre el contrasentido y las secuencias de ácidos nucléicos sentido, por ejemplo, los derivados fosforotioato y acridina nucleótidos sustituidos pueden ser utilizados. Ejemplos de nucleótidos modificados que puedan ser utilizados para generar las secuencias de ácidos nucléicos contrasentido son bien conocidos en la materia. Conocido modificaciones incluyen la metilación de nucleótidos, ciclación y "tapas" y la sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo como ínosina. Otras modificaciones de los nucleótidos son bien conocidas en la materia.

La secuencia de ácido nucléico en contrasentido puede ser producida biológicamente mediante un vector de expresión en la que se subclona una secuencia de ácido nucléico en una orientación contrasentido (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucléico insertado será de una orientación en contrasentido a un ácido nucléico blanco de interés) . Preferiblemente, la producción de secuencias de ácidos nucléicos contrasentido en las plantas se produce por medio de un ácido nucléico integrado de forma estable construcción que comprende un promotor, un oligonucleótido en contrasentido unido operativamente, y un terminador.

Las moléculas de ácido nucléico utilizadas para silenciar a los métodos de la invención (ya sea introducido en una planta o generados in sítu) se hibridizan con o se unen a las transcripciones de mARN y/o codificación del ADN genómico de un polipéptido para inhibir con ello la expresión de la proteína, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser por la complementariedad de nucleótidos convencionales para formar un duplo estable, o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de ácido nucléico en contrasentido que se une a duplo de ADN, a través de interacciones específicas en la ranura mayor de la doble hélice. Las secuencias de ácidos nucléicos en contrasentido se pueden introducir en una planta de transformación o de inyección directa en un tejido específico. Por otra parte, las secuencias de ácidos nucléicos contrasentido pueden ser modificados para apuntar las células seleccionadas y luego administran por vía sistémica. Por ejemplo, para la administración sistémica, las secuencias de ácidos nucléicos en contrasentido pueden ser modificadas de tal manera que se unen específicamente a los receptores o antígenos expresados en la superficie de la célula seleccionada, por ejemplo, mediante la vinculación de la secuencia de ácidos nucléicos en contrasentido a péptidos o anticuerpos que se unen a los receptores de la superficie celular o antígenos. Las secuencias de ácido nucléico en contrasentido también pueden ser transportadas a las células utilizando los vectores descritos en este documento.

Según un aspecto adicional, la secuencia de ácidos nucléicos en contrasentido es una secuencia de ácido nucléico a-anomérico. Una secuencia de ácido nucléico a-anomérico forma híbridos específicos de doble cadena con ARN complementario en el que, contrariamente a las b-unidades habituales, las hebras corren paralelas entre sí (Gaultier y otros (1987) Nucí Ac Res. 15:. 6625-6641) . La secuencia en contrasentido de ácido nucléico puede también abarcar un 2 ' -o-metilribonucleótido (Inoue y otros, (1987) Nucí Ac Res. 15, 6131-6148) o un análogo quimérico de ARN-ADN (Inoue y otros, (1987) FEBS Lett. 215, 327-330).

La eliminación o reducción sustancial de la expresión de genes endógenos también se puede realizar utilizando ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalítico con actividad de ribonucleasa que son capaces de dividir una secuencia de cadena sencilla de ácido nucléico, como un ARNm, que tienen una región complementaria. Por lo tanto, las ribozimas (por ejemplo, ribozimas (descrito en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334, 585-591) se puede utilizar para separar catalíticamente las transcripciones de ARNm que codifican un polipéptido, lo que reduce considerablemente el número de transcripciones de ARNm que se traduce en un polipéptido. Se puede diseñar una ribozima con especificidad para una secuencia de ácido nucléico (véase, por ejemplo: Cech y otros de Patentes de Patente de US No. 4,987,071, y Cech y otros, patente de E.U.A. No. 5,116,742). Por otra parte, las transcripciones de mARN que corresponden a una secuencia de ácido nucléico se pueden utilizar para seleccionar un ARN catalítico con una actividad de ribonucleasa especifica de un grupo de moléculas de ARN (Bartel y Szostak (1993) Science 261, 1411-1418). El uso de ribozirnas de silenciamiento de genes en las plantas que se conoce en la materia (por ejemplo, Atkins y otros (1994) WO 94/00012;. Lenne y otros (1995) WO 95/03404; Lutziger y otros (2000) WO 00/00619; Prinsen y otros (1997) WO 97/13865 y Scott y otros. (1997) WO 97/38116).

El silenciamiento de genes también puede lograrse mediante mutagénesis de inserción (por ejemplo, la inserción de T-ADN o la inserción del transposón) o por las estrategias como se describe por, entre otros, Angelí y Baulcombe ((1999) Plant J 20 (3): 357-62), (Amplicon VIGS WO 98/36083), o Baulcombe (WO 99/15682).

El silenciamiento de genes también puede ocurrir si hay una mutación en un gen endógeno y/o una mutación en un gen aislado/ácido nucléico que se introduce subsiguientemente en una planta. La reducción o eliminación sustancial puede ser causada por un polipéptido no funcional. Por ejemplo, el polipéptido pueden unirse a proteínas que interactúan de manera diferente, una o más mutaciones y/o truncamientos por lo tanto puede ofrecer un polipéptido que puede unirse a varias proteínas de interacción (como las proteínas del receptor) , pero que no pueden exhibir su función normal (como el ligando de señalización) .

Un enfoque para el silenciamiento de genes se dirige a secuencias de ácido nucléico complementarias a la región, reguladora del gen (por ejemplo, el promotor y/o potenciadores ) para formar tres estructuras helicoidales que impiden la transcripción del gen en las células blanco. Ver Helene, C. Anticancer Drug Res. 6, 569-84, 1991; Helene y otros, Ann. N.Y. Acad. Science. 660, 27-36, 1992; y Maher, L.J. Bioassays 14, 807-15, 1992.

Otros métodos, tales como el uso de anticuerpos dirigidos a un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o la interferencia en la vía de señalización en los que está involucrado un polipéptido, serán bien conocidos por el experto. En particular, puede preverse que las moléculas artificiales pueden ser útiles para la inhibición de la función biológica de un polipéptido blanco, o para interferir con la vía de señalización en los que está involucrado el polipéptido blanco.

Por otra parte, un programa de tamizado puede ser configurado para identificarse en una población de plantas de variantes naturales de un gen, que codifican variantes de polipéptidos con actividad reducida. Tales variantes naturales también pueden usarse, por ejemplo, para realizar la recombinación homologa.

Se pueden utilizar microRNAs (miRNAs) artificiales y /o naturales para eliminar la expresión de genes y/o traducción del mARN. Los miRNAs endógenos son ARN pequeños de cadena sencilla normalmente de 19 a 24 nucleótidos de largo. Funcionan principalmente para regular la expresión de genes y/o traducción del mARN. La mayoría de microARN (miRNAs) de planta tiene complementariedad perfecta o casi perfecta, con secuencias blanco. Sin embargo, hay blancos naturales de hasta cinco desigualdades. Se procesan de ARN sin codificación más largos con estructuras de retroplieges características por RNasas específicos de doble hebra de la familia Dicer. Después de procesarse, se incorporan en el ARN del complejo silenciador inducido (RISC) al unirse a su componente principal, una proteína Argonaute. Los miARNs sirven como los componentes de especificidad de RISC, dado forman pares de bases para orientar los ácidos nucléicos, principalmente de los mRNAs en el citoplasma. Los eventos posteriores de regulación incluyen división de destino del mARN y de la destrucción y/o inhibición de la traducción. Por lo tanto, los efectos de la sobreexpresión del miARN a menudo se reflejan en una disminución de los niveles de mARN de los genes blanco.

Los microARN artificiales (amiRNAs), que normalmente son de 21 nucleótidos de longitud, pueden ser genéticamente diseñados específicamente para regular negativamente la expresión genética de los genes de uno o varios de interés. Los factores determinantes de la selección blanco de microARN de planta son bien conocidos en la materia. Los parámetros empíricos para el reconocimiento de destino se han definido y se pueden utilizar para ayudar en el diseño de amiARNs específicos, (Schwab y otros, y Dev. Cell 8, 517-527, 2005). Las herramientas convenientes para el diseño y la generación de amiRNAs y sus precursores también están disponibles al público (Schwab y otros, Plant Cell 18, 1121-33, 2006) .

Para un rendimiento óptimo, las técnicas de silenciamiento de genes utilizadas para reducir la expresión en una planta de un gen endógeno requiere el uso de secuencias de ácidos nucléicos de las plantas monocotiledóneas para la transformación de plantas monocotiledóneas , y de las plantas dicotiledóneas para la transformación de plantas dicotiledóneas. Preferiblemente, una secuencia de ácido nucléico de cualquier especie de planta se ha introducido en esta misma especie. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucléico de arroz se transforma en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requisito indispensable que la secuencia de ácido nucléico que se introduzcan se origina de la misma especie de planta como la planta en la que se presentó. Es suficiente con que haya homología sustancial entre el objetivo de genes endógenos y el ácido nucléico que será introducido.

Anteriormente se describieron ejemplos de varios métodos para la reducción o eliminación sustancial de la expresión en una planta de un gen endógeno. Una persona experta en la materia está ya en condiciones de adaptar los métodos antes mencionados para silenciamiento a fin de lograr la reducción de la expresión de un gen endógeno en una planta entera o en partes de la misma mediante el uso de un promotor apropiado, por ejemplo.

Transformación El término "introducción" o "transformación" al que se hace referencia en este documento abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del método utilizado para la transferencia. El tejido de planta capaz de propagación clonal posterior, ya sea por organogénesis o embriogénesis , puede ser transformado con una construcción genética de la presente invención y una planta entera regenerada desde el mismo. El tejido especial elegido puede variar dependiendo de los sistemas disponibles para la propagación clonal, y mejor adaptada a la especie en particular está transformando. Los objetivos de ejemplares del tejido incluyen los discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos , tejido calloso, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo apical, las yemas axilares, y meristemos de raíz), y los tejidos de meristema inducido (por ejemplo, cotiledón de meristemas y hipocotilo de meristemas) . El polinucleótido puede ser transitoria o establemente introducido en una célula huésped y puede ser mantenido de manera no integrada, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede ser integrado en el genoma del huésped. El resultado de la célula de planta transformada a continuación, se puede utilizar para regenerar una planta transformada de una manera conocida por las personas expertas en la materia .

La transferencia de genes extraños en el genoma de una planta se llama transformación. La transformación de las especies de plantas es una técnica de rutina. Ventajosamente, cualquiera de los métodos de transformación de varios puede ser utilizado para introducir el gen de interés en una célula antepasado adecuado. Los métodos descritos para la transformación y regeneración de plantas a partir de tejidos de plantas o células de la planta se pueden utilizar para la transformación pasajera o estable. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposornas, electroporación, los productos químicos que aumentan la absorción del ADN libre, la inyección de ADN directamente en la planta, el bombardeo de partículas, los virus de la transformación o el uso de polen y nicroproyección . Los métodos pueden ser seleccionados del método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. y otros, (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I y otros (1987) Plant Mol Biol. 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito RD y otros (1985) Bio/Technol 3, 1099 a 1102.); microinyección en material de planta (Crossway A y otros, (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185), bombardeo de partículas revestidas con ADN o ARN (TM Klein y otros, (1987) Nature 327:70) infección de los virus (no integrales) y similares. Las plantas transgénicas , incluyendo las plantas de cultivos transgénicos , se producen preferiblemente a través de transformación mediada por Agrobacterium . Un método de transformación ventajosa es la transformación en plantaciones. Para ello, es posible, por ejemplo, permitir que el Agrobacterium actúe sobre las semillas o plantas para inocular el meristemo de la planta con agrobacterias . De acuerdo con la invención, se ha probado particularmente que se permite una suspensión de agrobcterias transformadas actuar sobre la planta intacta o por lo menos sobre los primordios florales. La planta está en cultivo hasta que se obtienen las semillas de la planta de tratamiento (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735 - 743). Los métodos para la transformación mediada por Agrobacteruim de arroz son también los métodos conocidos para la transformación del arroz, tales como los descritos en cualquiera de los siguientes: solicitud de patente europea EP 1 198985 Al, Aldemíta y Hodges (Planta 199: 612-617, 1996), Chan y otros. (Planta Mol Biol. 22 (3) : 491 -506, 1993), Hiei y otros. (Planta J 6 (2) : 271-282, 1994), cuyas descripciones se incorporan por referencia en este documento como está dispuesto. En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es como se describe en cualquiera Ishida y otros, (Nat. Biotechnol 14 (6) : 745-50, 1996) o Frame y otros, (Planta Physiol 129 (1) : 13-22, 2002), cuyas descripciones incorporan por referencia en este documento como está dispuesto. Dichos métodos se describen con más detalle a modo de ejemplo en B. Jenes y otros, Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, vol . 1, Engineering and ütilization, eds . SD Kung y Wu R., Academic Press (1993) 128-143 y en Annu Potrykus. Rey. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205 a 225) . Los ácidos nucléicos o la construcción que se expresa preferiblemente clonado en un vector, que es adecuado para la transformación de Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBinl9 (Bevan y otros, Nucí. Acids Res. 12 (1984) 8711) . Las Agrobacterias transformadas por un vector pueden ser utilizadas de manera conocida para la transformación de plantas, tales como las plantas utilizadas corno modelo, como la Arabidopsis thaliana de Arabidopsis {se encuentra dentro del ámbito de aplicación de la presente invención no se considera como una planta de cultivo) , o de cultivos plantas como, a modo de ejemplo, las plantas de tabaco, por ejemplo mediante la inmersión de las hojas molidas o las hojas cortadas en una solución agrobacterial y cultivadas en medios adecuados. La transformación de plantas mediante Agrobacteriurn turnefaciens se describe, por ejemplo, por Hofgen y Willmitzer en Nucí. Acid Res. (1988) 16, 9877 o es conocido entre otros de FF White, Vectors for Gen Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp 15-38.

Además de la transformación de células somáticas, que luego tienen que ser regeneradas en plantas intactas, también es posible transformar las células de los meristemas de plantas y en particular las células que se convierten en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen la evolución natural de la planta, dando lugar a plantas transgénicas . Asi, por ejemplo, las semillas de Arabidopsis son tratadas con agrobacterias y las semillas se obtienen de las plantas en desarrollo de que transforman una determinada proporción y, por tanto son transgénicas [Feldman, KA y arks (1987). Mol Gen Genet 208:274-289, Feldmann K (1992). En: C Koncz, N-H Chua y J Shell, eds., Methods in Arabidopsis Flesearch. Word S3cientific, Singapore, pp. 274-289]. Los métodos alternativos se basan en la extracción repetida de las inflorescencias y la incubación del sitio de escisión en el centro de la roseta con agrobacterias transformadas, por el que las semillas transformadas también se pueden obtener en un momento posterior en el tiempo ( (Chang (1994) . Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Sin embargo, un método especialmente eficaz es el método de la infiltración de vacio con sus modificaciones, como el método "sumergimiento en flores". En el caso de la infiltración al vacio de Arabidopsis, las plantas intactas bajo presión reducida son tratadas con una suspensión agrobacterial [Bechthold, N (1993) . CR Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194-1199], mientras que en el caso del método "inmersión de flores" se incuba el tejido en desarrollo floral brevemente con una suspensión agrobacterial tratado con agente tensioactivo [Clough, SJ y Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743] . Una cierta proporción de las semillas transgénicas se cosechan en ambos casos y estas semillas se pueden distinguir de las semillas no transgénicas de cultivo en las condiciones descritas selectivas. Además de la transformación estable de plastidios una de las ventajas es porque plastidos se heredan por via materna es la mayoría de los cultivos reduciendo o eliminando el riesgo del flujo de transgenes a través del polen. La transformación del genoma del cloroplasto generalmente se logra mediante un proceso que ha sido esquemáticamente exhibido en Klaus y otros., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229], En pocas palabras, las secuencias que se transforman son clonadas junto con un gen marcador de selección entre los que flanquean las secuencias homologas al genoma del cloroplasto. Estas secuencias homologas dirigen al sitio especifico la integración en el plastoma. La transformación plastidal se ha descrito para muchas especies de plantas diferentes y una. visión general se da en Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3) :425-38 or Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28. Los avances biotecnológicos más recientes ha sido reportados en forma de marcador sin transformantes de plástidos, que puede ser producido por un gen fabricante transitorio co-integrado (Klaus y otros, 2004, Nature Biotechnology, 22 (2), 225 - 229) .

Las células de las plantas genéticamente modificadas pueden ser regeneradas a través de todos los métodos con los que está familiarizado el experto. Los métodos convenientes se pueden encontrar en las publicaciones mencionadas por el DS Kung y Wu R. , Potrykus o Hófgen y Willmitzer .

Generalmente después de la transformación, las células o grupos de células de plantas se seleccionan para la presencia de uno o más marcadores que están codificadas pollos genes expresables por plantas co-transferidos con el gen de interés, tras lo cual el material vuelve a transformarse en una planta entera. Para seleccionar las plantas transformadas, el material de planta obtenido de la transformación es, por regla general, sometido a condiciones selectivas con el fin de que las plantas transformadas se puedan, distinguir de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas en la manera descrita se pueden plantar y, después de un período de crecimiento inicial, someterse a una selección adecuada por aspersión. Otra posibilidad consiste en el cultivo de las semillas, en su caso después de la esterilización, en placas de agar con un agente de selección adecuada, de modo que sólo las semillas transformadas pueden crecer en las plantas. Por otra parte, las plantas transformadas .son examinadas para detectar la presencia de un marcador de selección, tales como los descritos anteriormente.

Después de la transferencia y regeneración de ADN, las plantas supuestamente transformadas también pueden ser evaluadas, por ejemplo mediante el análisis Southern, por la presencia del gen de interés, número de copias y/o organización genómica. Como alternativa o además, los niveles de expresión del ADN introducido recientemente pueden ser controlados utilizando análisis Northern y/o Western, ambas técnicas son bien conocidas por las personas que tengan conocimientos en la materia.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar por una variedad de medios, como por la propagación clonal o técnicas de crecimiento clásicas. Por ejemplo, una planta transformada de la primera generación (o TI) puede ser autofecundada y los transformantes homocigotos de segunda generación (o T2) seleccionados, y las plantas de T2 a continuación, se pueden propagar además a través de técnicas de mejora clásicas. Los organismos generados transformados pueden adoptar diversas formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de las células transformadas y las células no transformadas; transformantes clónales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el cásete de expresión), los injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en las plantas, un patrón transformado injertado a un Scion no transformado).

Marcado de activación de T-ADN La activación de T-ADN marcado (Hayashi y otros, Science (1992) 1,350 - 1353), consiste en la inserción de T-ADN, por lo general contiene un promotor (también puede ser un potenciador de la traducción o un intrón) , en la región genómica del gen de interés o 10 kb corriente arriba o corriente abajo de la región codificante de un gen en una configuración tal que el promotor dirige la expresión del gen. Por lo general, la regulación de la expresión del gen blanco de su promotor natural se altera y el gen está bajo el control del promotor de reciente introducción. El promotor es sumergido en un T-ADN. Este T-ADN es insertado al azar en el genoma de la planta, por ejemplo, a través de infección de Agrobacterium y conduce a la expresión de los genes modificados, cerca del ADN-T insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la expresión de los genes modificados cerca del promotor introducido .

TILLING El cultivo de la expresión "TILLING" es una abreviatura de "lesiones Locales Inducidas Dirigidas al Blanco en Genomas" y se refiere a una tecnología útil para generar mutagénesis y/o identificar los ácidos nucléicos que codifican proteínas con expresión y/o actividad modificadas. TILLING también permite la selección de plantas portadoras de tales variantes mutantes. Estas variantes de mutantes pueden sufrir modificaciones de expresión, ya sea en fuerza o en ubicación o en el tiempo (si las mutaciones afectan al promotor, por ejemplo). Estas variantes mutantes pueden presentar mayor actividad que la que presenta el gen en su forma natural. TILLING combina mutagénesis de alta densidad con los métodos de selección de alto rendimiento. Los pasos que suelen seguirse en el cultivo son: (a) mutagénesis E S (Redei GP and Koncz C (1992) In ethods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds . Singapore, World Scientific Publishing Co, pp. 16-82; Feldmann et: al., (1994) In Meyerowitz EM, Sornerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J and Gaspar T (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91- 104); (b) preparación de ADN y combinación de individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización e hibridación para permitir la formación de heteroduplo; (e) DHPLC, donde se detecta la presencia de un heteroduplo en un pozo como un pico adicional en el cromatograma, (f) identificación de los mulantes individuales, y (g) secuencia, del producto de PCR imitante. Los métodos para TILLING son bien conocidos en la materia (McCallum y otros, (2000) Nat. Biotechnol 18: 455-457, revisado por Stemple (2004) de Nat Rev Genet 5 (2): 145-50) .

Recombinación homologa La recombinación homologa permite la introducción de un genoma de un ácido nucléico seleccionado a la posición seleccionada definido. La recombinación homologa es una tecnología estándar que se utiliza habitualmente en las ciencias biológicas de los organismos inferiores como la levadura o el musgo Physcomitrella . Los métodos para realizar recombinación homologa en las plantas se han descrito no sólo para las plantas modelo (Offringa y otros (1990) EMBO J 9 (10):. 3077-84) sino también para las plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada y otros (2002 ) Nat . Biotch 20 (10) : 1030-4; Lida y Terada (2004) Curr Opin Biotech 15 (2): 132-8), y los enfoques que existen son de aplicación general, independientemente del organismo blanco (Miller y otros, Nature Biotechnol. 25, 778-785, 2007).

Rasgos relacionados con el rendimiento Los rasgos relacionados con rendimiento comprenden uno o más de rendimiento, biomasa, rendimiento de semilla, vigor inicial, índice de verdor, aumento de la tasa de crecimiento, mejora de las características agronómicas (como la mejora de la Eficiencia del uso del Agua ( UE) , la eficiencia del uso del nitrógeno (NUE) , etc.) Rendimiento El término "rendimiento" en general significa un producto mensurable de valor económico, por lo general relacionado con un cultivo determinado, a un área y durante un período de tiempo. Las partes individuales de la planta contribuyen directamente al rendimiento en función de su número, tamaño y/o el peso o el rendimiento real es el rendimiento por metro cuadrado para un cultivo anual, lo que se determina dividiendo la producción total (incluye tanto la producción cosechada y de tasación) por plantado metros cuadrados. El término "rendimiento" de una planta puede estar relacionado con la biomasa vegetativa (raices y/o biomasa aérea) , a los órganos reproductivos, y/o propágulos (por ejemplo, semillas) de esa planta.

Tomando como ejemplo el maíz, un aumento del rendimiento puede manifestarse como uno o más de los siguientes: aumento del número de plantas establecidas por metro cuadrado, un aumento en el número de mazorcas por planta, con un incremento en el número de filas, el número de de granos por hilera, peso de mil semillas, peso de mil granos, longitud/diámetro de mazorca, aumento de la tasa de llenado de semilla (que es el número de semillas llenas, dividido por el número total de semillas y multiplicado por 100), entre otros. Tomando como ejemplo el arroz, un aumento del rendimiento puede manifestarse como un aumento de uno o más de los siguientes: número de plantas por metro cuadrado, número de panículas por planta, longitud de panícula, número de espiguillas por panícula, número de flores (flores) por panícula, el aumento de la tasa de llenado de semilla (que es el número de semillas llenas, dividido por el número total de semillas y multiplicado por 100), aumento de peso de mil granos, entre otros. En el arroz, la tolerancia a la inmersión también puede dar como resultado un mayor rendimiento .

Vigor Temprano El "vigor temprano" se refiere a crecimiento sano y equilibrado activo especialmente durante las primeras etapas del crecimiento de las plantas y pueden resultar de la idoneidad incrementada de la planta debido, por ejemplo, a que las plantas se adaptan mejor a su entorno (es decir, la optimización del uso de los recursos energéticos y compartimentación entre la parte aérea y raíz) . Las plantas que tienen el vigor temprano también muestran un aumento de supervivencia de las plántulas y un establecimiento mejor de la cosecha, lo que da como resultado campos altamente uniformes (con el cultivo en crecimiento de manera uniforme, o es decir, la mayoría de las plantas llegando a las diferentes etapas de desarrollo en forma prácticamente simultánea) , y muchas veces mejor y mayor rendimiento. Por lo tanto, el vigor temprano puede ser determinado mediante la medición de diversos factores, tales como el peso de mil granos, porcentaje de germinación, porcentaje de emergencia, crecimiento de las plántulas, altura de la plántula, longitud de la raíz, la raíz y la fitomasa aérea y muchos más.

Aumento de la tasa de crecimiento La tasa de crecimiento mayor puede ser especifica para una o más partes de una planta (incluyendo las semillas), o pueden ser sustancialmente a lo largo de toda la planta. Las plantas que tienen una tasa de crecimiento mayor pueden tener un ciclo de vida más corto. El ciclo de vida de una planta se puede tomar desde el tiempo necesario para crecer de una semilla madura seca hasta, la etapa en que la planta ha producido las semillas maduras en seco, similar al material de partida. Este ciclo de vida puede verse influido por factores tales como la velocidad de germinación, vigor inicial, tasa de crecimiento, índice de verdor, floración y velocidad de maduración de la semilla. El aumento de la tasa de crecimiento puede tener lugar en una o más etapas del ciclo de vida de una planta o en forma sustancial todo el ciclo de vida de las plantas. El aumento de la tasa de crecimiento durante las primeras etapas del ciclo de vida de una planta puede reflejar un mayor vigor. El aumento de la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta, permitiendo que las plantas sean sembradas más tarde y/o cosecharse lo más pronto posible (un efecto similar puede obtenerse con la época de floración anterior) . Si la tasa de crecimiento es lo suficientemente mayor, puede permitir la siembra de más de semillas de la misma especie de planta (por ejemplo la siembra y la cosecha de las plantas de arroz seguida de la siembra y la cosecha de las plantas de arroz más todo dentro de un periodo de crecimiento convencional). Del mismo modo, si la tasa de crecimiento es lo suficientemente mayor, puede permitir la siembra de más de semillas de especies de plantas diferentes (por ejemplo, la siembra y la cosecha de las plantas de maíz seguido de, por ejemplo, la siembra y la cosecha opcional de soya, papa o cualquier otra planta adecuada) . Los tiempos adicionales de recolección del mismo material de semilla en el caso de algunas plantas de cultivo también puede ser posible. La alteración del ciclo de cosecha de una planta puede dar lugar a un aumento de la producción anual de biomasa por metro cuadrado (debido a un aumento en el número de veces (digamos en un año) que cualquier otra planta en particular puede ser cultivado y cosechado) . Un aumento en la tasa de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más amplia que sus homólogos de tipo silvestre, ya que las limitaciones territoriales para el crecimiento de un cultivo suelen estar determinadas por las condiciones ambientales adversas, ya sea en el momento de la siembra (principios de la temporada) o en el momento de la cosecha (fines de temporada) . Estas condiciones adversas se pueden evitar si el ciclo de recolección se acorta. La tasa de crecimiento puede ser determinado mediante la derivación de los distintos parámetros de las curvas de crecimiento, estos parámetros pueden ser: T-media (el tiempo necesario para que las plantas alcancen el 50% de su tamaño máximo) y T-90 (tiempo necesario para que las plantas alcancen el 90% de su tamaño máximo), entre otros.

Resistencia al Estrés Un aumento en el rendimiento y/o tasa de crecimiento se produce si la planta está en condiciones sin estrés o si la planta está expuesta a varias tensiones en comparación con el control de las plantas. Las plantas suelen responder a la exposición al estrés por un crecimiento más lento. En condiciones de estrés severo, la planta puede incluso dejar de crecer en conjunto. El estrés leve, por otro lado, se define aqui como cualquier tensión a la que una planta se expone que no da lugar a que la planta deje de crecer por completo sin la capacidad de reanudar el crecimiento. El estrés leve en el sentido de la invención da lugar a una reducción en el crecimiento de las plantas estresadas de menos de 40%, 35%, 30% o 25% , as preferiblemente inferior al 20% o 15% en comparación con el control de la planta en las condiciones sin estrés. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (riego, fertilización, tratamientos fitosanitarios) a menudo no se encuentran graves tensiones en las plantas cultivadas. Como consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por el estrés leve es a menudo una característica indeseable para la agricultura. Destacan las tensiones leves bióticas y/o abióticas (ambientales) cotidianas a las que se expone una planta. El estrés abiótico puede ser debido a la sequía o el exceso de agua, estrés anaeróbico, estrés salino, toxicidad química, estrés oxidativo y altas temperaturas, el frío o la congelación. El estrés abiótico puede ser un estrés osmótico causado por un estrés hídrico (sobre todo debido a la sequía), estrés salino, estrés oxidativo o un estrés iónico. Los estreses bióticos son tensiones típicas causadas por patógenos, como bacterias, virus, hongos, nematodos e insectos .

En particular, los métodos de la presente invención se pueden realizar bajo condiciones de estrés o no en condiciones de sequía moderadas para obtener plantas con mayor rendimiento en relación con el control de las plantas. Como se informó en ang y otros. (Planta (2003) 218: 1-14), el estrés abiótico conduce a una serie de factores morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares que afectan negativamente el crecimiento de planta y la productividad. La sequía, la salinidad, temperaturas extremas y el estrés oxidativo se sabe que son interconectados y puede inducir el crecimiento y el daño celular a través de mecanismos similares. Rabbani y otros. (Planta Physiol (2003) 133: 1755 a 1767) describe un grado particularmente elevado de "charla cruzada" entre el estrés de la sequía y el estrés de alta salinidad. Por ejemplo, la sequía y/o la salinización se manifiestan principalmente como el estrés . osmótico, lo que resulta en la alteración de la homeostasis y la distribución de iones en la célula. El estrés oxidativo, que con frecuencia acompaña a alta o baja temperatura, la salinidad o la sequía, puede provocar la desnaturalización de las proteínas funcionales y estructurales. Como consecuencia, estas diversas presiones ambientales a menudo se activan las vías de señalización celulares similares y las respuestas celulares, tales como la producción de proteínas de estrés, sobre regulación de anti-oxidantes , la acumulación de solutos compatibles y detención del crecimiento. La expresión condiciones "sin estrés", que aparece aquí, son las condiciones ambientales que permiten un crecimiento óptimo de las plantas. Las personas expertas en la materia son conscientes de las condiciones del suelo y las condiciones climáticas normales para un lugar determinado. Las plantas con. las condiciones de crecimiento óptimo, (se cultivan en condiciones sin estrés) generalmente producen en orden creciente de preferencia al menos el 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% o 75% de la producción media de dichas instalaciones en un entorno determinado. La producción promedio puede ser calculada sobre la cosecha y/o base de la temporada. Las personas expertas en la materia son conscientes de las producciones promedio de producción de un cultivo .

La deficiencia de nutrientes puede ser consecuencia de la falta de nutrientes como el nitrógeno, fosfatos y otros compuestos que contienen fósforo, potasio, calcio, magnesio, manganeso, hierro y boro, entre otros.

El estrés salino término no se limita a la sal común (NaCl), pero puede ser uno o más de: NaCl, KC1, LiCl, MgCl2, CAC12, entre otros.

Incremento/Mej ora/Mej oramiento Los términos "incremento", "mejora" o "mejoramiento" son intercambiables y se entenderá en el sentido de la solicitud por lo menos un 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o el 10%, preferiblemente por lo menos el 15% o 20%, más preferiblemente 25%, 30%, 35% o 40% más de rendimiento y/o el crecimiento en comparación con el control de las plantas tal como se define en este documento.

Producción de semilla Un mayor rendimiento de semilla puede manifestarse como una o más de los siguientes: a) un aumento en la biomasa de la semilla (peso total de semillas) que puede ser sobre una base individual de las semillas y/o por planta y/o por metro cuadrado, b) aumento del número de flores por planta, c) aumento del número de las semillas (llenas), d) aumento de la tasa de llenado de semilla (que se expresa como el cociente entre el número de semillas llenas, dividido por el número total de semillas) , e) mayor índice de cosecha, que se expresa como una proporción de la producción de las piezas aprovechables, como las semillas, dividido por el total de la biomasa; y f ) peso de grano incrementado por mil (TKW) , que se extrapola a partir del número de semillas llenas contados y que su peso total. Un aumento de TKW puede ser consecuencia de un aumento de tamaño de la semilla y/o peso de la semilla, y también puede ser consecuencia de un aumento en el embrión y/o el tamaño del endospermo.

Un aumento en el rendimiento de semilla también puede manifestarse como un aumento de tamaño de la semilla y/o el volumen de semillas. Por otra parte, un aumento en el rendimiento de semilla también se manifiesta como un aumento de la superficie de siembra y/o longitud de la semilla y/o el ancho de semillas y/o perímetro de la semilla. El aumento de rendimiento también puede dar lugar a la arquitectura modificado, o se puede producir porque la arquitectura modificado . índice de Verdor El "índice de verdor" como se usa aquí es calculado a partir de imágenes digitales de las plantas. Para cada píxel perteneciente al objeto central de la imagen, la relación entre el valor ecológico con respecto al valor de color rojo (en el modelo de color RGB de codificación) se calcula. El índice de verdor se expresa como el porcentaje de píxeles para que la proporción de verde a rojo supera un determinado umbral. Bajo condiciones normales de crecimiento, en condiciones de crecimiento con estrés de salinidad, y bajo condiciones de reducción de la disponibilidad de nutrientes del crecimiento, el índice de verdor de las plantas se mide en la última imagen antes de la floración. Por el contrario, en condiciones de sequía el crecimiento estrés, el índice de verdor de las plantas se mide en la primera imagen después de la sequía.

Reproducción Asistida por Marcadores Estos programas de reproducción a veces requieren la introducción de la variación alélica por el tratamiento mutagénico de las plantas, utilizando, por ejemplo mutagénesis EMS, alternativamente, el programa puede comenzar con una colección de variantes alélicas del origen "natural" así llamado causado involuntariamente. La identificación de variantes alélicas entonces se lleva a cabo, por ejemplo, por PCR. Esto es seguido por un paso superior para la selección de variantes alélicas de la secuencia en cuestión y que dan mayor rendimiento. La selección se suele realizar por seguimiento de los resultados de crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión. El crecimiento puede ser controlado en un invernadero o en el campo. Más pasos opcionales incluyen plantas cruzadas en el que se identificó la variante alélica superior con otra planta. Esto podría ser utilizado, por ejemplo,. para hacer una combinación de interesantes características fenotípicas .

El uso como sondas en _(mape__ de genes ) El uso de ácidos nucléicos que codifican la proteína de interés para la mapeo genética y física de los genes sólo requiere una secuencia de ácido nucléico de al menos 15 nucleótidos de longitud. Estos ácidos nucléicos pueden utilizarse como polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) , marcadores. Las transferencias de Southern (Sambrook J, Fritsch EF y T Maniatis (1989) Molecular Cloning, Laboratory Manual) del ADN de la planta digerida por restricción genómica puede ser determinada con la codificación ISYT-LIKE de los ácidos nucléicos. Los patrones de bandas resultantes pueden ser sometidos a análisis genéticos utilizando programas de ordenador como Mapeador (Lander y otros (1987) Genomics 1:. 174-181) con el fin de construir un mapa genético. Además, los ácidos nucléicos puede ser utilizada para explorar el sur de manchas que contienen ADN genómico restricción tratados endonucleasa de un conjunto de personas que representan a los padres y la progenie de un cruce genético definido. La segregación de los polimorfismos de ADN se detectan y se utilizan para calcular la posición del polipéptido de codificación similar a iSYT del ácido nucléico en el mapa genético obtenido previamente con esta población (Botstein y otros (1980) Am. J. Hum Genet 32: 314-331).

La producción y el uso de sondas de genes derivados de plantas para su uso en la mapeo genética se describen en Bernatzky y Tankian (1986) Plant Mol. Biol. Reportero 4: 37-41. Numerosas publicaciones describen la mapeo genética especifica de los clones de cDNA utilizando la metodología descrita antes o por variaciones de las mismas. Por ejemplo, las poblaciones F2 se cruzan, las poblaciones de retrocruzamiento, acoplado al azar la población, cerca de las líneas isogénicas y otros conjuntos de individuos pueden ser utilizados para la asignación. Estas metodologías son bien conocidas por los expertos en la materia.

Las sondas de ácido nucléico también pueden ser utilizadas para el mapeo físico (es decir, la colocación de las secuencias en los mapas físicos, ver Hoheisel y otros en: Non-mammalian Genomic Analysís: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, y referencias citadas en la presente ) .

En otra modalidad, las sondas de ácido nucléico puede ser utilizadas en mapeo de hibridización in situ por fluorescencia directa (FISH) (Trask (1991) Trends Genet . 7:149-154). Aunque los métodos actuales de mapeo de FISH favorecen la asignación de los clones de gran tamaño (varios kb a varios cientos de kb, ver Laan y otros (1995) Genome Res. 5: 13-20), las mejoras en la sensibilidad pueden permitir el desempeño de la mapeo FISH utilizando sondas más cortas .

Una variedad de métodos basados en la amplificación de ácidos nucléicos, para el mapeo genético y físico puede llevarse a cabo utilizando los ácidos nucléicos. Los ejemplos incluyen la amplificación especifica para alelos (Kazazian (1989) J. Clin Lab Med 11:95-96.), El polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield y otros (1993) Genome 16:325-332.), el alelo ligadura específico (Landegren y otros (1988) Science 241:1077-1080), las reacciones de nucleótidos de extensión (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), Mapeo de Híbridos por Radiación (Walter y otros. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) y Mapeo Happy (Dear y Cook. (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). Para estos métodos, la secuencia de un ácido nucléico que se utiliza para diseñar y producir pares de iniciadores para su uso en la reacción de amplificación o en las reacciones de extensión del iniciador. El diseño de iniciadores es bien conocido por los expertos en la materia. En los métodos que emplean el mapeo genético basado en PCR, puede ser necesario para identificar las diferencias de secuencia de ADN entre los padres de la cruza por asignación en la región correspondiente a la secuencia de ácido nucléico instantánea. Esto, sin embargo, generalmente no es necesario para los métodos de asignación.

Planta El término "planta" que se utiliza en este documento abarca las plantas enteras, ancestros y descendientes de las plantas y partes de plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raices (tubérculos, incluidos), las flores y los tejidos y órganos, en donde cada uno de los mencionados comprenden el gen/ácido nucléico de interés. El término "plantas" incluye también las células de plantas, cultivos en suspensión, el tejido de callo, embriones, las regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas, de nuevo en donde cada uno de los mencionados comprende el gen/ácido nucléico de interés .

Las plantas que son especialmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia de Viridiplantae, en particular, las plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo leguminosas forrajeras o forraje, plantas ornamentales, cultivos, árboles o arbustos seleccionados de la lista compuesta por Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron. spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., ar aba. Ammophila, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, las especies de Arachis, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por ejemplo, Avena sativa, Avena fatua, byzantina Avena, Avena fatua var. Sativa, Avena hybrida) , carambola Averrhoa, Bambusa sp., Benincasa hispida, excelsea Bertholletia, Beta vulgaris, Brassica spp. (por ejemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Cañóla, la violación de semillas oleaginosas, nabo violación]), farinosa Cadaba, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp. , Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp. spp Cocos., Coffea spp., Colocasia esculenta, las especies de Cola, sp Corchorus., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucúrbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., longan Dimocarpus, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por ejemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleífera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp . , Eriobotrya japónica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp . (por ejemplo, Glycine max, Soja hispida o Soja max) , Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (Por ejemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por ejemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitat issimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Acutangula Luffa, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme) , Macrotyloma spp. , Malus spp. , Malpighia emarginata, americana Mammea, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp. spp Olea., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por ejemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia) , miliaceum Panicum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea., Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp. y Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Púnica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, rhabarbarum Rheum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharurn spp. Sallix sp. , Sambucus spp., Sécale cereale, Sesamum spp . , Sinapis sp., Solanum spp. (por ejemplo Solanum tuberosum, o Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum) , Sorghum bicolor, Spinacia spp. , Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Dactyloides Tripsacum, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum o Triticum vulgare) , Tropaeolum rninus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otros.

Plantas de Control La elección de las plantas de control adecuada es una parte rutinaria de un montaje experimental y puede incluir correspondientes plantas silvestres o plantas correspondientes sin el gen de interés. El control de la planta es típicamente de la misma especie de planta o incluso de la misma variedad que la planta que será evaluada. La planta de control también puede ser un nulicigoto de la planta que será evaluada. Los nulícitogos son individuos que carecen del transgen por la segregación. Una "planta de control" como se usa aquí, se refiere no sólo a las plantas completas, sino también a partes de la planta, incluidas las semillas y partes de la semilla.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que la modulación de la expresión en una planta de uno o más de ácidos nucléicos que codifica al menos dos polipéptidos iSYT seleccionados del grupo que consiste en cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A y la fusión de sus homólogos de los mismos da plantas que tienen rasgos relacionado con rendimiento principal de control en. relación con las plantas. Según una primera modalidad, la presente invención proporciona un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en las plantas en relación con el control de las plantas, que comprende la expresión modular en una planta de uno o más ácidos nucléicos que codifica al menos dos polipéptidos iSYT seleccionado del grupo consiste de cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A y la fusión de sus homólogos de la misma y, opcionalmente, la selección de plantas con rasgos mejorados relacionados con el rendimiento.

Un método preferido para modulación, aumento o disminución de la expresión de un ácido nucléico que codifica al menos dos polipéptidos iSYT seleccionados del grupo que consiste en cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A y la fusión de sus homólogos de la misma es introducir y expresar en una planta de una ácido nucléico que codifica un polipéptido iSYT similar.

Cualquier referencia de aquí en adelante a una "proteína útil en los métodos de la invención" se entiende como un polipéptido iSYT, homólogo del mismo o fusiones de los mismos tal como se define en este documento. Cualquier referencia de aquí en adelante a un "ácido nucléico útil en los métodos de la invención" se entiende como un ácido nucléico capaz de codificar, como un polipéptido iSYT homólogo del mismo o fusiones del mismo. El ácido nucléico que se introduce en una planta (y por lo tanto útil en el desempeño de los métodos de la invención) es cualquier ácido nucléico que codifica el tipo de proteína que ahora se describe, en adelante también es denominado "ácido nucléico iSYT" o "gen iSYT" .

Un "polipéptido iSYT" tal como se define aquí, se refiere a cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A y tal vez representada por la secuencia de aminoácido correspondiente conforme a lo dispuesto en la lista de secuencias. La descripción más detallada de un polipéptido iSYT se proporciona en la Tabla B.

Un "polipéptido similar a iSYT" tal como se define en este documento se refiere a cualquier polipéptido seleccionado del grupo que consiste en cualquiera de los polipéptidos de la tabla A, y la fusión de sus homólogos de la misma.

Los polipéptidos útiles en los métodos de la invención son polipéptidos iSYT asi como polipéptidos similares a iSYT.

Una fusión de iSYT y/o polipéptidos similares a iSYT preferiblemente es codificada por un ácido nucléico que se puede construir usando técnicas bien conocidas del ADN recombinante (Sambrook J, Fritsch EF y T Maniatis (1989) Molecular Cloning, Laboratory Manual). Por ejemplo, la proteína de fusión puede abarcar una fusión de iSYT completo y/o polipéptidos similares a iSYT o de sólo una porción del mismo, por ejemplo, la porción N-terminal o C-terminal. Preferiblemente, la porción comprende uno o más de los dominios conservados correspondientes a los dominios de las Tablas Cl a C20 del polipéptido iSYT correspondiente.

SYT Concerniente SYT tal como se define en este documento se refiere a la polipéptido codificado por el gen AN3 (ANGUS I FOLIA 3) de Arabidopsis tha liana. Los nombres alternativos para el gen AN3 son gen GIF1 y el gen SYT1. El sitio genómico y la referencia AGI del gen SYT es AT5g28640.

Los términos "SYT", "SYT1" y "A 3" tal como se utilizan en este documento son intercambiables.

Un "polipéptido SYT" como se hace referencia en este documento está representado por la secuencia: MQQHLMQMQPMMAGYYPSNVTSDHIQQYLDENKSLILKIVESQNSGKLSECAENQARLQ RNLMYLAAIADSQPQPPSVHSQYGSAGGGMIQGEGGSHYLQQQQATQQQQMTQQSLMA ARSSMLYAQQQQQQQPYATLQHQQLHHSQLGMSSSSGGGGSSGLHILQGEAGGFHDFG RGKPEMGSGGGGEGRGGSSGDGGETLYLKSSDDGN Un " polipéptido SYT" útil en los métodos de la invención es preferiblemente codificado por el siguiente ácido nucléico: ATGCAACAGCACCTGATGCAGATGCAGCCCATGATGGCTGGTTACTACCCCAGCAATG TTACCTCTGATCATATCCAACAGTACTTGGACGAAAACAAATCGTTGATTCTGAAGATT GTTGAGTCTCAAAACTCTGGAAAGCTTAGCGAATGCGCCGAGAATCAAGCAAGGCTTC AACGCAACCTAATGTACCTAGCTGCAATAGCAGATTCTCAGCCTCAGCCACCAAGTGT GCATAGCCAGTATGGATCTGCTGGTGGTGGGATGATTCAGGGAGAAGGAGGGTCACA CTATTTGCAGCAGCAACAAGCGACTCAACAGCAACAGATGACTCAGCAGTCTCTAATG GCGGCTCGATCTTCAATGTTGTATGCTCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCCTTACGCGA CGCTTCAGCATCAGCAATTGCACCATAGCCAGCTTGGAATGAGCTCGAGCAGCGGAG GAGGAGGAAGCAGTGGTCTCCATATCCTTCAGGGAGAGGCTGGTGGGTTTCATGATTT TGGCCGTGGGAAGCCGGAAATGGGAAGTGGTGGTGGCGGTGAAGGCAGAGGAGGAA GTTCAGGGGATGGTGGAGAAACCCTTTACTTGAAATCATCAGATGATGGGAATTGA Alternativa o adicionalmente, el término "polipéptido SYT o su homólogo" tal como se define en este documento se refiere a un polipéptido que comprende un dominio SNH que tiene en orden creciente de preferencia al menos el 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con el dominio SNH de la SEC ID No: 670.

SEQ ID NO: 670: IQQYLDENKSLILKIVESQNSGKLSECAENQARLQRNLMYLAAIAD Los homólogos preferidos de un polipéptido SYT útil en los métodos de la invención se enumeran en la Tabla Al.

Preferiblemente los métodos de interés de invención un homólogo de un polipéptido SYT derivado de una planta de cultivo más preferiblemente, en orden creciente de preferencia a partir del maíz, la caña de azúcar, soya, trigo, algodón y cañóla.

Además, o alternativamente, el homólogo de un polipéptido SYT útiles en el método de la invención tiene en orden creciente de preferencia al menos el 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33 %, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66% , el 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83 %, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia general para el aminoácido representado por cualquiera de las secuencias del polipéptido de la Tabla Al o del polipéptido SYT. La identidad de la secuencia general se determina mediante un algoritmo de alineamiento global, tales como el algoritmo de Needleman Wunsch en el programa GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), de preferencia con los parámetros por omisión y, preferiblemente, con secuencias de proteínas maduras (es decir, sin tener en cuenta las señales de la secreción o péptidos de tránsito) . En comparación con la secuencia de identidad global, la identidad de la secuencia general será mayor cuando sólo se consideran dominios conservados o motivos .

Preferiblemente un iSYT, un homólogo del mismo o una fusión de la misma utilidad en los métodos de la invención comprende un dominio que tiene en orden creciente de preferencia al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56 %, 57%, 5! 3%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87% , 88%, 89% , el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de uno o más de los de dominios conservadas que se colocan en coordenadas específicas de aminoácido de un polipéptido iSYT de acuerdo a las Tablas Cl a C20, preferiblemente al dominio identificado en la base de datos H MSmart.

Por ejemplo, un homólogo del polipéptido AT1G05370 iSYT útil en los métodos de la invención comprende un dominio que tiene en orden creciente de preferencia al menos un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57 %, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% , el 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de una o más de los dominios conservados de acuerdo a la Tabla Cl , preferiblemente al dominio SM00516 ubicado en las coordenadas 86 a 229 aminoácidos del polipéptido iSYT AT1G05370.

Los homólogos preferidos de un polipéptido iSYT útil en los métodos de la invención se dan en los cuadros Al a A26.

Además, o alternativamente, el homólogo de un polipéptido iSYT útil en el método de la invención tiene en orden ereciente de preferencia al menos el <25*6 / 26%, 27%, 28 , 29%, 30%, 31%, 32 "o , 33 %, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 1%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, E, O. 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66% , el 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, n / n Q. / o , 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83 %, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia general para el aminoácido representado por cualquiera de las secuencias del polipéptido seleccionado del grupo formado por los polipéptidos de la Tabla A y las Tablas Al a A26. La identidad de la secuencia general se determina mediante un algoritmo de alineamiento global, tales como el algoritmo de Needleman Wunsch en el programa GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), de preferencia con los parámetros por omisión y, preferiblemente, con secuencias de proteínas maduras (es decir, sin tener en cuenta las señales de la secreción o péptidos de tránsito) . En comparación con la secuencia de identidad global, la identidad de la secuencia general será mayor cuando se consideran sólo dominios conservados o motivos .

Preferiblemente los métodos en cuestión de la invención un homólogo de un polipéptido iSYT derivado de una planta de cultivo más preferiblemente, en orden creciente de preferencia a partir del maíz, la caña de azúcar, soya, trigo, algodón y cañóla.

Los términos "dominio", "firma" y "motivo se definen en la sección de "definiciones" de este documento.

En una modalidad preferida de combinaciones de dos polipéptidos iSYT cuya expresión ha. de ser modulada según los métodos de la invención que se proporcionan en la Tabla 3. En otra modalidad más preferida los homólogos de polipéptidos iSYT se combinan, preferiblemente de una planta de monocotiledóneas , preferiblemente de las plantas de arroz o maí z .

Tabla 3. Combinaciones de dos polipéptidos iSYT.

En la Tabla 4 se abarcan los polipéptidos similares a iSYT ortólogos correspondientes que se originan de células de álamo o maíz Otro aspecto de la invención es un complejo de proteína aislada basada en AN3, de los cuales al menos las proteínas AN3p y una o más de las proteínas seleccionadas del grupo codificado por G09270 AT4G16143, ATI , AT3G06720, AT5G53480, AT3G60830, G18450 ATI , AT2G46020, AT2G28290 , G21700 ATI, AT5G14170, AT4G17330, AT4G27550, G65980 ATI, AT5G55210, AT3G15000, AT4G35550, AT1G20670, G08730 ATI, AT5G13030, AT2G18876, AT5G17510, AT1G05370, AT4G21540, G23900 ATI y AT5G23690 (genes que figuran en la Tabla II) . Preferiblemente, dicho complejo proteico basadas en AN3 abarca por lo menos el proteínas AN3p y una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste de ARP4 (ATI G18450) , ARP7 (AT3G60830), SNF2 (AT2G46020), Syd (AT2G28290), S I3C (AT1G21700) y SWP73B (AT5G14170) . Aún más preferiblemente, dijo complejo proteico basado en AN3 abarca por lo menos AN3p, una proteína actina relacionada seleccionada del grupo que consiste en ARP4 y ARP7, una ATPasa seleccionada del grupo que consiste de SNF2 (BRM) y Syd y un dominio de la proteína que contiene SWIRM. Preferiblemente, dicho dominio SWIRM que contiene la proteína es SWI3C. Un complejo de proteínas basado en AN3 como se usa aquí significa que AN3p interactúa, directa o indirectamente, con las otras proteínas del complejo. Una interacción directa es una interacción donde al menos un dominio de AN3p interactúa con uno o más dominios o el compañero de interacción. Una interacción indirecta es una interacción en la AN3p si mismo no es la interacción con la proteína de interacción por uno de sus dominios, pero donde dicha proteína interactúa está ínteractuando con una proteína que está directa o indirectamente, relacionarse con AN3p.

Otro aspecto de la invención es el uso de un complejo de proteínas de acuerdo con la invención para promover el crecimiento de las plantas. Preferiblemente, dicho uso es una sobreexpresion de la proteína compleja, por sobreexpresion de al menos dos miembros del complejo de la proteína. La promoción de crecimiento de las plantas, tal como se usa aquí, es un aumento en la biomasa de plantas en las plantas donde se utiliza el complejo de proteínas, en comparación con la misma, planta en la que el complejo no se utiliza, que se cultiva. en las mismas condiciones, a excepción de las condiciones necesarias para, el uso del complejo, en su caso. Esas condiciones pueden ser, por ejemplo, no limitadas a, la adición de uno o más compuestos para inducir a uno o más promotores de uno o más genes que codifican una proteína del complejo. Por otra parte, la misma planta es una planta sin transformar los padres, cultivadas bajo las mismas condiciones que la planta transformada, en donde se utiliza el complejo. Preferiblemente, la promoción de los resultados de crecimiento de las plantas en un mayor rendimiento. Este rendimiento puede ser un aumento total de la biomasa de planta, o un aumento parcial de rendimiento, tales como, pero no limitado a rendimiento de semillas, rendimiento de hojas o rendimiento de raíz.

Otro aspecto de la invención es un método para promover la formación de proteínas complejas basadas AN3, por la sobreexpresión simultánea de al menos dos proteínas del complejo. Las proteínas del complejo, junto a la misma AN3p, se enumeran en la tabla II. Preferiblemente, dicha sobreexpresión es una sobreexpresión de AN3p y una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en ARP4 (ATI G 18450), ARP7 (AT3G60830 ) , SN F2 (AT2G46020 ) , Syd (AT2G28290) , S I3C (AT1G21700) y SWP73B (AT5G14170) . Aún más preferiblemente, dicha sobreexpresión es una sobreexpresión de por lo menos A 3p, una proteína actina relacionada seleccionada del grupo que consiste de ARP4 y ARP7, una ATPasa seleccionada del grupo que consiste en SNF2 (BRM) y Syd y un dominio de la proteína que contiene SWIRM. Preferiblemente, dicho dominio SWIRM que contiene la proteína es SWI3C.

Los métodos para la obtención de la sobreexpresión son conocidos por los expertos en la materia, e incluyen, pero no se limitan a, colocar el gen que codifica la proteína que se sobreexpresa después de un promotor fuerte como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor. La sobreexpresión simultánea como se usa aquí significa que existe una superposición en tiempos para todas las proteínas que se sobreexpresan, mediante el cual es mayor el nivel de dichas proteínas cuando se compara con un control no sobreexpresado. No significa necesariamente que todos los genes deben ser inducidos en el mismo momento. Dependiendo del volumen de negocios del ARN mensajero y/o la proteína, un gen puede ser inducido antes o después de otra, siempre que hay una superposición en el tiempo en que ambas proteínas están presentes en una concentración que es superior a la normal (no sobreexpresada) de concentración.

Además, dos o tres polipéptidos similar a iSYT, cuando se expresa en el arroz de acuerdo a los métodos de la presente invención como se indica en la sección de ejemplos, dan a las plantas un mayor rendimiento de los rasgos asociados, seleccionados a partir de bíomasa aérea aumentada o mayor rendimiento de semilla.

La presente invención se ilustra mediante la transformación de plantas con las secuencias de ácido nucléico que comprende el gen que codifica las combinaciones de los polipéptidos de la Tabla 4. Sin embargo, el rendimiento de la invención no se limita a estas secuencias, los métodos de la invención ventajosamente se puede realizar usando cualquier ácido nucléico similar a iSYT de codificación o polipéptido similar a iSYT como se define en este documento.

Ejemplos de ácidos nucléicos que codifican los polipéptidos similares a iSYT se dan en la Tabla A y Tablas A2 a A26 de la sección de ejemplos en este documento. Tales ácidos nucléicos son útiles en el desempeño de los métodos de la invención. Las secuencias de aminoácidos se listan en los cuadros las Tablas A2 y A26 de la sección de Ejemplos de las mismas son las secuencias de ejemplos de ortólogos y parálogos del polipéptido iSYT de la Tabla A, los términos "ortólogos" y "parálogos" con tal como se definen en este documento. Los ortólogos y parálogos adicionales fácilmente pueden ser identificados mediante la realización de una búsqueda reciproca explosión de la llamada como se describe en la sección de definiciones, donde la secuencia de consulta es SEC ID NO: 1 ó SEC ID NO: 2, la segunda BLAST (back-BLAST) se estar en contra de las secuencias de Arabidopsis thaliana.

La invención también proporciona ácidos nucléicos de codificación de iSYT desconocidos y polipéptidos de iSYT útiles para conferir rasgos relacionados con rendimiento en plantas en relación con las plantas de control.

De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, se provee por lo tanto, una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada de: (i) un ácido nucléico representado por cualquiera de los polinucleotidos de las Tablas A2 a A26; (ii) el complemento de un ácido nucléico de (i); (iii) un ácido nucléico que codifica un polipéptido similar a iSYT que tiene en orden creciente de preferencia por lo menos una identidad de secuencia de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% o 100% a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A2 a A26 y además confiere preferiblemente rasgos relacionados con rendimiento mejorados en relación con las plantas de control. (iv) una molécula de ácidos nucléicos que se hibridiza con una molécula de ácidos nucléicos de (i) a (iii) bajo condiciones de hibridización de alta restricción y preferiblemente confiere rasgos relacionados con rendimiento mejorados en relación d con las plantas de control.

De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, también se provee un polipéptido aislado seleccionado de: (i) una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de los polipéptidos de las Tablas A2 a A26; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de por lo menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias del polipéptido de la Tabla A2 a A26 y preferiblemente confiriendo además rasgos relacionados con rendimiento mejorados en relación con las plantas de control . (iii) derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en (i) o (ii) anterior.

Las variantes de ácidos nucléicos también pueden ser útiles en la práctica de los métodos de la invención. Ejemplos de tales variantes de ácidos nucléicos de homólogos y derivados de codificación de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, los términos "homólogos" y "derivados", como se define en el presente documento. También son útiles en los métodos de la invención ácidos nucléicos homólogos y derivados de ortólogos o parálogos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos de codificación. Los homólogos y derivados útiles en los métodos de la presente invención tienen apreciablemente la misma actividad biológica y funcional como la proteína no modificada de los que se hayan obtenido. Las variantes más útiles en la práctica de los métodos de la invención son variantes en las que el codón ha optimizado el uso o los que se han eliminado los sitios blanco de miRNA.

Las variantes de ácidos nucléicos más útiles en la práctica de los métodos de la invención incluyen porciones de los ácidos nucléicos que codifican polipéptidos similares a iSYT, hibridando a los ácidos nucléicos ácidos nucléicos que codifican polipéptidos similares a iSYT, variantes de división de ácidos nucléicos que codifican polipéptidos similares a iSYT, variantes alélicas de ácidos nucléicos que codifican polipéptidos similares a iSYT y variantes de ácidos nucléicos que codifican polipéptidos similares a iSYT obtenidas por combinación de genes. Los términos secuencia de hibridización, variante de división, variante alélica y combinación de genes son como se describe en este documento.

Los ácidos nucléicos que codifican polipéptidos similares a iSYT no necesitan ser ácidos nucléicos de longitud completa, ya que el rendimiento de los métodos de la invención no se basa en el uso de ácidos nucléicos de longitud completa. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en las plantas, que comprende la introducción y expresar en una planta de una parte de cualquiera de las secuencias de ácidos nucléicos dada en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o una porción de un ácido nucléico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos en la que el ácido nucléico codifica dos o tres pclipéptidos de iSYT.

Por ejemplo, se puede preparar una porción de un ácido nucléico haciendo eliminaciones de uno o más de los ácidos nucléicos. Las partes podrán utilizarse en forma aislada o pueden ser fusionadas a otras secuencias de codificación (o sin codificación), por ejemplo, para producir una proteina que combina varias actividades. Cuando se fusionan a otras secuencias de codificación, el polipéptido producido tras la traducción resultante puede ser mayor que el previsto para la porción de la proteina.

Las porciones útiles en los métodos de la invención, codifican un polipéptido similar a iSYT tal como se define en el presente documento y tienen apreciablemente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos dada en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Preferiblemente, la porción es una porción de alguno de los ácidos nucléicos dado en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o una porción de un ácido nucléico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se listan en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Preferiblemente la porción es al menos de 100, 200, 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 nucleótidos consecutivos de longitud, siendo los nucleótidos consecutivos de cualquiera de las secuencias de ácidos nucléicos dadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o de un ácido nucléico que codifican un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se muestran en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Más preferiblemente la porción es una porción del ácido nucléico de la SEC ID NO: 1.

Otra variante de ácidos nucléicos útil en los métodos de la invención es un ácido nucléico capaz de hibridizarse, en condiciones de menor rigor, preferiblemente bajo condiciones estrictas, con un ácido nucléico que codifica un polipéptido similar a iSYT, tal como se define en el presente documento, o con una. parte tal como se define en el presente documento.

Las secuencias de hibridización útiles en los métodos de la invención codifican un polipéptido similar a. iSYT tal como se define en el presente documento, tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos dada en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Preferiblemente, la secuencia de hibridización es capaz de hibridizarse para el complemento de cualquiera de los ácidos nucléicos que se muestran en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o a una parte de cualquiera de estas secuencias, de una parte como se definió anteriormente, o la secuencia de hibridización es capaz de hibridizarse para el complemento de un ácido nucléico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dada en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Más preferiblemente, la secuencia de hibridización es capaz de hibridizarse para el complemento de un ácido nucléico codificación cualquiera de polipéptido de la Tabla A y Tabla A2 a A6.

Otra variante de ácidos nucléicos útil en los métodos de la invención es una variante de división de codificación de un polipéptido similar a iSYT como se define anteriormente, una variante de división como se define en el presente documento.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar el rendimiento relacionado con rasgos en las plantas, que comprende la introducción y expresión en una planta de una variante de división de dos o tres secuencias de ácido nucléico dado en la Tabla A o Tablas A2 a A26 de la sección de Ejemplos, o una variante de división de un ácido nucléico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos.

Otra variante de ácidos nucléicos útil en el desempeño de los métodos de la invención es una variante alélica de un ácido nucléico un polipéptido similar a iSYT de codificación como se define anteriormente, una variante alélica como se define en el presente documento.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar el rendimiento relacionado con rasgos en las plantas, que comprende la introducción y expresión en una planta de dos o tres variantes alélicas de cualquiera de los ácidos nucléicos dada en la Tabla A o Tablas de A2 a A26 de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de un ácido nucléico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dada en la Tabla A de la sección de Ejemplos.

La combinación o evolución dirigida de genes también puede utilizarse para generar variantes de los ácidos nucléicos que codifican polipéptidos similares a iSYT definido anteriormente; el término "combinación de genes" está definido en el presente documento.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en las plantas, que comprende la introducción y expresión en una planta de una variante de cualquiera de las secuencias de ácidos nucléicos dadas en la Tabla A o Tablas A2 a A26 de la sección de Ejemplos, o que comprende la introducción y expresar en una planta de una variante de un ácido nucléico que codifica dos o tres de ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla A o Tablas A2 a A26 de la sección de Ejemplos, cuya variante de ácido nucléico es obtenida por combinación de genes.

Además, también pueden obtenerse variantes de ácidos nucléicos por mutagenesis dirigida al sitio. Varios métodos están disponibles para lograr mutagénesis dirigida al sitio, siendo los más comunes siendo los métodos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds . ) .

Los ácidos nucléicos que codifican polipéptidos similares a iSYT pueden derivarse de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucléico puede modificarse desde su forma nativa en la composición y/o ambiente genómico mediante la manipulación deliberada del ser humano. Preferiblemente el ácido nucléico de codificación de polipéptido similar a iSYT es de una planta, más preferiblemente de una planta monocotiledónea, más preferiblemente el ácido nucléico es de zea mays o de Oryza sativa.

El desempeño de de los métodos de la invención da plantas que tienen rasgos mejorados. En particular el rendimiento de los métodos de la invención da plantas que tienen rendimiento mejorado, especialmente aumentan el rendimiento de semillas en relación con las plantas de control. Los términos "rendimiento" y "rendimiento de semillas" se describen con más detalle en la sección de "definiciones" en el presente documento.

En la presente se hace referencia a rasgos relacionados con rendimiento mejorados lo cual significa un incremento en vigor temprano y/o biomasa (peso) de una o más partes de la planta, que puede incluir partes (cosechables ) aéreas o partes (cosechables) bajo tierra. En particular, estas partes cosechables son semillas y el desempeño de los métodos de la invención, da como resultado plantas que tienen rendimiento de semillas incrementado en relación con el rendimiento de semillas de las plantas de control.

Un método preferido para la expresión de modulación (aumento o disminución) de dos o tres ácidos nucléicos, codificación de los correspondientes dos o tres polipéptidos similar a iSYT es mediante la introducción y expresión en una planta de: (i) una secuencia de ácido nucléico que codifica un primer polipéptido similar a iSYT; y (ii) una secuencia de ácido nucléico que codifica un segundo polipéptido similar a iSYT. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar el rendimiento relacionado con rasgos en plantas, método que comprende la introducción y expresión en una planta de: (i) cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codifican los dos o tres polipéptidos similares a iSYT; o (ii) dos o tres ácidos nucléicos, cada uno codificando un polipéptido similar a iSYT único; o (iii) un ácido nucléico de acuerdo con (i) y un ácido nucléicos de acuerdo con (ii), en el cual dicho polipéptido similar a iSYT se selecciona del grupo conformado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A, homólogos y fusiones del mismo.

Los métodos para la introducción y expresión de dos o más transgenes (también llamados apilación de genes) en las plantas transgénicas son bien conocidos en la materia (véase, por ejemplo, una revisón por J Halpin (2005) Plant Biotech J (3): 141-155. El apilación de genes puede proceder por pasos interactivos, en donde dos o más transgenes pueden ser secuencialmente introducidos en una planta cruzando una planta que contiene un transgen con individuos que alojan otros transgenes o, alternativamente, por re-transformación (o super-trans formación) de una planta que contiene un transgen con nuevos genes.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar el rendimiento relacionado con rasgos en plantas, método que comprende secuencialmente introducción y expresión en una planta de: (i) cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codifican los dos o tres polipéptidos similares a iSYT correspondientes; o (ii) dos o tres ácidos nucléicos, cada uno codificando un polipéptido similar a iSYT único; o (iii) un nucléicos ácido de acuerdo con (i) y un ácido nucléico de acuerdo con (ii) , en el cual dicho polipéptido similar a iSYT se selecciona del grupo conformado por cualquiera de los polipéptidos ele la Tabla A, sus homólogos y fusiones de los mismos .

Preferiblemente, las secuencias de ácidos nucléicos de (i), (ii) y (iii) son secuencialmente introducidas y expresadas por cruzas. Se realiza una cruza entre una planta principal femenina compuesta por una secuencia aislada de ácidos nucléicos introducida y expresada para la codificación de uno o dos polipéptidos similares a iSYT y una planta madre que también incluye una secuencia de ácidos nucléicos aislados introducidas y expresadas que codifica uno o dos polipéptidos similares a iSYT y preferiblemente seleccionando de la descendencia de la presencia y la expresión de ambos transgenes. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar el rendimiento relacionado con rasgos en plantas, cruzando una planta principal femenina compuesta por una secuencia de aislados de ácido nucléico introducidos y expresados que codifican uno o dos polipéptidos similares a iSYT y una planta principal masculina compuesta por una secuencia de aislados de ácidos nucléicos introducidos y expresados que codifican uno o dos polipéptidos similares a iSYT, y preferiblemente seleccionados de la descendencia de la presencia y la expresión de al menos dos de los transgenes introducidos que codifican polipéptidos de similar a iSYT correspondientes, en donde las plantas han mejorado rasgos relacionados con el rendimiento relativo a las plantas de los madres, o a cualquier otras plantas de control tal como se define en el presente documento.

Alternativamente, las secuencias de ácidos nucléicos de (i), (ii) y (iii) son secuencialmente introducidas y expresadas por re-transformación. La retransformación se realiza mediante la introducción y expresión de una secuencia de ácidos nucléicos que' codifica uno o dos polipéptidos similares a iSYT, parte de la planta o células de plantas que comprende una secuencia de ácidos nucléicos introducida y expresada que codifica uno o dos polipéptidos similar a iSYT en segundo lugar y preferiblemente mediante la selección de la descendencia de la presencia y la expresión de ambos transgenes. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, hay siempre un método para mejorar el rendimiento relacionado con rasgos en las plantas, por re-transformación que se realiza mediante la introducción y expresión de una secuencia de ácidos nucléicos que codifican uno o dos polipéptidos similares a iSYT en una planta, parte de la planta o células de plantas que comprende un ácido nucléico introducido y expresado en su secuencia que codifica uno o dos polipéptido similar a iSYT en segundo lugar y seleccionado preferiblemente de la descendencia de la presencia y la expresión de ambos transgenes, en donde dichas plantas han mejorado rasgos relacionados con el rendimiento relativo a las plantas, habiendo aumentado la expresión de uno de : (i) cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos, que codifican los dos o tres polipéptidos similares a iSYT correspondientes; o (ii) dos o tres ácidos nucléicos, cada uno codificando un polipéptido similar a iSYT único; o (iii) un ácido nucléico de acuerdo con (i) y un ácido nucléico de acuerdo con (ii), en el cual dicho polipéptido similar a iSYT se selecciona del grupo conformado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A, homólogos y fusiones de los mismos.

Alternativamente, la apilación de genes puede ocurrir a través de la transformación simultánea, o co-transformación, que es más rápida y puede utilizarse en toda una serie de técnicas de transformación bien conocida, preferiblemente como se describe en este documento.

Como alternativa, la apilación de genes puede ocurrir a través de la transformación, o co-transformación simultánea, que es más rápida y puede utilizarse en toda una serie de técnicas de transformación, como se describe en la sección de "definición" en este documento.

Cuando se considera la transformación genética directa, usando sistemas de suministro físicos o químicos (por ejemplo, bombardeo de microproyectiles, PEG, electroporacxon, liposoma, agujas de vidrio, etc.), los transgenes (al menos dos) también pueden estar presentes en un número de conformaciones, pero esencialmente no es necesario que se compone en un vector capaz de que se está replicando en Agrobacteria o virus, intermedios de la transformación genética. Los dos transgenes pueden ser consistentes en una o más moléculas de ácido nucléico, pero al mismo tiempo se utiliza para el proceso de transformación genética .

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar el rendimiento relacionado con rasgos en plantas, el método que comprende simultáneamente introducción y expresión en una planta de: (i) una secuencia de ácido nucléico que codifica uno o dos polipéptidos similar a iSYT; y (ii) una secuencia de ácido nucléico que codifica un segundo polipéptido similar a iSYT, cuyas plantas han mejorado rasgos relacionados con el rendimiento relativo a las plantas, habiendo aumentado la expresión de uno de: (i) cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos, que codifican dos o tres polipéptidos similares a iSYT correspondientes; o (ii) dos o tres ácidos nucléicos, cada uno codificando un polipéptido similar a iSYT único; o (iii) un ácido nucléico de acuerdo con (i) y un ácido nucléico de acuerdo con (ii), en el cual dicho polipéptido de similar a iSYT se selecciona del grupo conformado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A, sus homólogos y fusiones de los mismos.

Las secuencias de ácidos nucléicos de (i), (ii) y (iii) que se introducen y expresan, simultáneamente se componen de una o más moléculas de ácidos nucléicos. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención se proveen rasgos relacionados con el rendimiento siempre creciente en las plantas, cuyo método comprende introducir y expresar simultáneamente en una planta: (i) cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codifican dos o tres polipéptidos similares a iSYT correspondientes; o (ii) dos o tres ácidos nucléicos, cada uno codificando un polipéptido similar a iSYT único; o (iii) un ácido nucléico de acuerdo con (i) y un nucléicos según a (ii) , en el cual dicho polipéptido similar a iSYT se selecciona del grupo conformado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A, sus homólogos y fusiones de los mismos.

La invención también proporciona construcciones y vectores genéticos para facilitar la introducción o la expresión (introducido de nuevo o aumentado la expresión ya existente) en plantas de cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codificación de la combinación correspondiente de dos o tres polipéptidos similar a iSYT. Las construcciones de gen pueden insertarse en vectores, que pueden ser adecuados para transformar en las plantas y para la expresión del gen de interés en las células transformadas, disponibles en el mercado. La invención también proporciona el uso de una construcción de gen tal como se define en el presente documento en los métodos de la invención.

Más concretamente, la presente invención proporciona una construcción que incluye: (a) cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codifican dos o tres polipéptidos correspondientes similares a iSYT definidos anteriormente; (b) una o más secuencias de control capaces de aumentar la expresión de la secuencia de ácido nucléico de (a) y (b) ; y, opcionalmente, (c) una secuencia de finalización de la transcripción .

La secuencia de ácidos nucléicos de (a) es preferiblemente una molécula de ácido nucléico que comprende una secuencia de ácidos nucléicos que codifica combinaciones de dos o tres polipéptidos similares a iSYT, preferiblemente aquellas combinaciones listadas en la Tabla 3. Las secuencias de ácidos nucléicos que codifican los polipéptidos de iSYT pueden ser fusionados entre sí o separados por la ADN de codificación o no codificador, tales como promotores, int roñes, señal dirigida subcelular, o ADN relleno, como las regiones de MAR (Regiones de conexión de Matriz) .

El término "secuencia de control" y la "secuencia de finalización" son como se define en el presente documento.

Preferiblemente, la secuencia de control de una construcción útil en los métodos de la invención se proporcionan en la Tabla 4, preferiblemente representada por SEC ID NO: 665 en SEC ID NO: 669.

Preferiblemente, una de las secuencias de control de una construcción es un promotor constitutivo. Un ejemplo de un promotor constitutivo es un promotor de la GOS2, preferiblemente un promotor de arroz GOS2, más preferiblemente un promotor GOS2 representado por SEC ID NO: 664.

Tabla 4. Promotores Preferidos Nombre de Promotor Organismo de SEC ID NO.

Fuente G0S2 Oryza sativa 665 HMGB Oryza sativa 666 ScBV Virus baciliforme 667 de caña de azúcar ScBV-METI Virus baciliforme 668 de caña de azúcar con intrón ZmUBI Zea mays 669 En una construcción preferida, se utiliza una secuencia de control única para impulsar la expresión de la secuencia de ácidos nucléicos que codifican dos o tres polipéptidos similares a iSYT, preferiblemente aquellas combinaciones que se enumeran en la Tabla 3.

La presente invención también prevé una mezcla de construcciones útiles por ejemplo, para la introducción y expresión simultánea en las plantas de dos o tres secuencias de ácidos nucléicos que codifican un polipéptido similar a iSYT, como se define anteriormente; en donde por lo menos una construcción comprende: (a) una secuencia de ácidos nucléicos que codifica un polipéptido similar a iSYT, como se define anteriormente; (b) una o más secuencias de control capaces de conducir la expresión de la secuencia de ácidos nucléicos; y, opcionalmente, (c) una secuencia de finalización de la transcripción, y según en donde se compone de al menos otra construcción : (d) una secuencia de ácido nucléico de secuencia de ácido nucléico que codifica un polipéptido similar a iSYT, corno se defi e anteriormente; (e) una o más secuencias de control capaces de conducir la expresión de la secuencia de ácido nucléico de (d) ; y, opcionalmente , (f) una secuencia de finalización de la transcripción .

Preferiblemente, una de las secuencias de control de una construcción es un promotor constitutivo. Un ejemplo de un promotor constitutivo es un promotor de GOS2, preferiblemente un promotor de arroz GOS2, más preferiblemente un promotor G0S2 representado por SEC ID NO: 664.

La invención también provee el uso de una construcción que incluye: (a) cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codifican dos o tres polipéptidos similares a iSYT correspondientes definidos anteriormente, o de una mezcla de construcciones como se describió antes, en un método para producir plantas que han mejorado rasgos relacionados con el rendimiento relativo a plantas habiendo aumentado la expresión de uno de los ácidos nucléicos que codifican dos o tres polipéptidos similares a iSYT correspondientes que aumentó el rendimiento relacionado con uno o más rasgos de: (i) aumento en vigor temprano; (ii) aumento de la biomasa aérea o biornasa de raíz; (iii) mayor rendimiento de semillas totales por planta; (iv) tasa de relleno de semillas incrementado; (v) número incrementado de semillas (rellenadas); (vi) índice de la cosecha incrementada; o (vii) peso de núcleo incrementado en miles (TKW) .

La invención también proporciona plantas, partes de plantas o células de plantas transformadas con una construcción que comprende cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codifican dos o tres polipéptidos similares a iSYT correspondientes como se definió antes o con una mezcla de construcciones como se definió anteriormente.

Las plantas se transforman con uno o más vectores integrados por cualquiera de las secuencias de ácidos nucléicos que se han descrito anteriormente. El experto en la materia está consciente de que los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector con el fin de transformar, seleccionar y propagar exitosamente las células huésped que contienen la secuencia de. interés. La secuencia de interés se une operablemente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor) .

Venta osamente, cualquier tipo de promotor, ya sea natural o sintético, puede utilizarse para aumentar la expresión de la secuencia de ácidos nucléicos . Un promotor constitutivo es particularmente útil en los métodos.

Otros promotores órgano-específicos, por ejemplo para la expresión preferida en hojas, tallos, tubérculos, meristemos, semillas (embrión o endospermo) , son útiles en la realización de los métodos de la invención. Consulte la sección "Definiciones" en. el presente documento para las definiciones de los diversos tipos de promotores.

La presente invención proporciona un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento especialmente de rendimiento de semillas de las plantas, en relación con las plantas de control, el método comprendiendo moduladores de expresión en una planta de ácido nucléico que codifica un polipéptido similar a iSYT, tal como se define en el presente documento.

Dado que las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención han aumentado el rendimiento (rasgos relacionados con rendimiento) , es probable que estas plantas presentan un mayor régimen de crecimiento (durante al menos una parte de su ciclo de vida) , relativa al régimen de crecimiento de las plantas de control en una etapa correspondiente en su ciclo de vida.

De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el rendimiento de los métodos de la invención tiene un régimen de crecimiento mayor en relación con plantas de control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para aumentar el régimen de crecimiento de las plantas, dicho método comprende moduladores de expresión en una planta de ácido nucléico que codifica un polipéptido similar a iSYT, tal como se define en el presente documento.

El rendimiento de los métodos de la invención da plantas desarrolladas bajo condiciones sin estrés o bajo el mayor rendimiento de las condiciones de sequía leve en relación con plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para aumentar el rendimiento en plantas cultivadas bajo condiciones sin estrés o en condiciones de sequía leve, el método que comprende expresión de modulación en una planta de un ácido nucléico que codifica un polipéptido similar a iSYT.

El rendimiento de los métodos de la invención da plantas cultivadas bajo condiciones de deficiencia de nutrientes, especialmente en condiciones de deficiencia de nitrógeno, mayor rendimiento relativo a control de plantas cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para aumentar el rendimiento en plantas cultivadas bajo condiciones de deficiencia de nutrientes, el método comprendiendo moduladores expresión en una planta de un ácido nucléico que codifica un polipéptido similar a iSYT.

El rendimiento de los métodos de la invención da plantas cultivadas bajo condiciones de estrés por sal, mayor rendimiento relativo al control de plantas cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para aumentar el rendimiento en plantas cultivadas bajo condiciones de estrés por sal, el método comprendiendo moduladores de expresión en una planta de un ácido nucléico que codifica un polipéptido similar a iSYT.

La invención también proporciona construcciones y vectores genéticas para facilitar la introducción o expresión en plantas de ácidos nucléicos que codifican polipéptidos similares a iSYT. Las construcciones de genes pueden insertarse en vectores, que pueden estar comercialmente disponibles, adecuados para transformarse en plantas y adecuados para la expresión del gen de interés en las células transformadas. La. invención también proporciona el uso de una construcción de gen tal como se define en el presente documento en los métodos de la invención.

Como se mencionó anteriormente, un método preferido para modular la expresión de un ácido nucléico que codifica un polipéptido similar a iSYT es mediante la introducción y expresión en una planta de un ácido nucléico que codifica un polipéptido similar a iSYT; sin embargo los efectos para llevar a cabo el método, es decir, mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento puede lograrse también usando otras técnicas bien conocidas, incluyendo pero no limitado a etiquetado de activación de T-ADN, TILLING, recombinación homologa. Se proporciona una descripción de estas técnicas en la sección de definiciones.

La presente invención se extiende claramente a cualquier célula vegetal o planta producida por cualquiera de los métodos descritos en este documento y a todas las partes de la planta y propágulos de la misma. La presente invención abarca plantas o sus partes (incluidas las semillas) que pueden obtenerse mediante los métodos de acuerdo con la presente invención. Las plantas o sus partes comprenden un transgen de ácido nucléico que codifica un polipéptido similar a iSYT definido anteriormente. La presente invención se extiende aún más para abarcar la progenie de una célula, tejido, órgano principal transformado o transfectado, o la planta completa que se ha producido por cualquiera de los métodos antes mencionados, el único requisito es que la progenie exhiba los mismos rasgos genotipicos y fenotipicos que los producidos por la madre en los métodos de acuerdo con la invención.

La invención también incluye las células huésped que contienen un ácido nucléico aislado que codifica un polipéptido similar a iSYT como se definió antes. Las células de huésped preferidas de acuerdo con la invención son células vegetales. Las plantas huéspedes para los ácidos nucléicos o el vector que se utiliza en el método de acuerdo con la invención, el cásete de expresión o construcción o vector son, en principio, ventajosamente todas las plantas, que son capaces de sintetizar los polipéptidos que se utilizan en el método de la invención.

Los métodos de la invención son ventajosamente aplicables a cualquier planta. Las plantas que son especialmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluyendo forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimentarios, árboles o arbustos .

Según una modalidad preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Ejemplos de las plantas de cultivo son soya, girasol, cañóla, alfalfa, colza, lino, algodón, tomate, papa y tabaco. Además preferiblemente, la planta es una monocotiledónea . Ejemplos de plantas son caña de azúcar. Más preferiblemente la planta es un cereal. Ejemplos de cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, farro, esparto, sécale, escaña, teff, milo y avena.

La invención se extiende también a partes cosechables de la planta como, pero sin limitarse a, las semillas, hojas, frutas, flores, tallos, raices, rizomas, tubérculos y bulbos, qué partes cosechables comprenden un ácido nucléico recombinante codificación un polipéptido similar a iSYT. La invención se refiere además a los productos derivados, preferiblemente directamente derivados, de una parte cosechable de la planta, tales como gránulos secos o en polvo, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas .

La presente invención abarca también el uso de los ácidos nucléicos codificación similar a iSYT polipéptidos, tal como se describe en este documento y el uso de estos polipéptidos similar a iSYT en la mejora de cualquiera de los mencionados rasgos relacionados con el rendimiento en las plantas. Por ejemplo, los ácidos nucléicos que codifican un polipéptido de similar a iSYT se describe en este documento o los polipéptidos similar a iSYT de los mismos, pueden encontrar uso en programas en los que se identifica un marcador de ADN que puede ser genéticamente vinculado a un gen de codificación de polipéptido similar a iSYT. Los ácidos nucléicos/genes, o los polipéptidos similar a iSYT por sí mismos pueden utilizarse para definir un marcador molecular.

Este marcador de ADN o proteínas puede usarse en programas de desarrollo para seleccionar las plantas con rasgos mejorados relacionados con el rendimiento como se definió anteriormente en los métodos de la invención. Además, las variantes alélicas de un ácido nucléico/gen que codifica polipéptido similar a iSYT posiblemente se usa en programas de reproducción asistida por marcadores. Los ácidos nucléicos que codifican polipéptidos similares a iSYT también pueden utilizarse como sondas para asignación genética y físicamente de los genes que son parte de y como marcadores de rasgos vinculados a esos genes. Esta información puede ser útil en el mejoramiento de plantas con el fin de desarrollar las líneas con fenotipos deseados.

Elementos La presente invención ahora se describirá con referencia a las modalidades de los siguientes elementos: 1. Un método para mejorar rasgo relacionados con el rendimiento en una planta relativo al control de plantas, que comprende la expresión de modulación en una planta de: (i) cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codifican los dos o tres polipéptidos similares a iSYT correspondientes; o (ii) dos o tres ácidos nucléicos, cada uno codificando un polipéptido similar a iSYT único; o (iii) un ácido nucléico de acuerdo con (i) y un ácido nucléico de acuerdo con (ii), en el cual dicho polipéptido similar a iSYT se selecciona del grupo conformado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A, homólogos de los mimos y fusiones de los mismos . 2. Un método de acuerdo al elemento 1, en el que al menos uno de los polipéptidos es un polipéptido de translocación de sarcoma sinovial (SYT) o un homólogo del mismo, dicho polipéptido SYT u homólogo del mismo preferiblemente comprende un dominio de SNH que tiene en orden creciente preferiblemente por lo menos el 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia al dominio de SNH de SEC ID NO: 670 ( IQQYLDENKSLILKIVESQNSGKLSECAENQARLQRNLMYLAAIAD) . 3. Un método de acuerdo con el elemento 1 o 2, en el cual dichos de los ácidos nucléicos codifican los polipéptidos correspondientes seleccionados del grupo formado por los polipéptidos listados en la Tabla 3. 4. El método de acuerdo a cualquiera de los elementos 1 a 3, en el que dicha expresión modulada se efectúa mediante la introducción y expresión en una planta de ácidos nucléicos. 5. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 4, en donde dichos ácidos nucléicos se seleccionan del grupo que consiste de los ácidos nucléicos que codifican cualquiera de las proteínas listadas en la Tabla A y las Tablas A2 a Tabla A26, o es una porción de dicho ácido nucléico, o un ácido nucléico capaz de hibridizarse con dicho ácido nucléico. 6. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 5, en el cual dichos ácidos nucléicos codifican un ortólogo o parálogo de cualquiera de las proteínas en la Tabla A. 7. El método de acuerdo con cualquier elemento anterior, en el cual dichos rasgos mejorados relacionados con el rendimiento comprenden un mayor rendimiento, preferiblemente biomasa incrementada y/o rendimiento incrementado de semillas en relación con las plantas de control . 8. El método de acuerdo con cualquier elemento anterior, en el cual dichos rasgos mejorados relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones sin estrés. 9. El método de acuerdo con cualquier elemento anterior, en el cual se obtienen dichos rasgos mejorados relacionados con el rendimiento en condiciones de estrés por sequía, salinidad o deficiencia de nitrógeno. 10. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos 4 a 9, en donde uno o más ácidos nucléicos están vinculados operablemente a un promotor de la planta, preferiblemente a un promotor constitutivo, más preferiblemente a un promotor de la GOS2, más preferiblemente a un promotor de la G0S2 de arroz. 11. El método de acuerdo con cualquiera de uno de los elementos 1 a 1.0, en el cual dichos uno o más ácidos nucléicos es de origen vegetal, preferiblemente de una planta de dicotiledóneas, más preferiblemente de la familia Brassicaceae, aún más preferiblemente del género Arabidopsis, todavía más preferiblemente de Arabidopsis thaliana. 12. La planta o parte del mismo, incluidas las semillas, que puede obtenerse mediante un método de acuerdo a cualquiera de los elementos 1 a 11, en donde dicha planta o parte del mismo comprende cualquier ácidos nucléicos dos o tres, codificación de los correspondientes dos o tres polipéptidos seleccionados del grupo formado por los polipéptidos enumeran en la Tabla A, sus homólogos y fusiones de los mismos. 13. La construcción que comprende: (i) Cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codifican los dos o tres polipéptidos correspondientes seleccionados del grupo formado por cualquiera de los polipéptidos listados en la Tabla A o sus homólogos y fusiones de los mismos; (ii) una o más secuencias de control capaces de conducir la expresión de la secuencia de ácidos nucléicos (i), preferiblemente un promotor de la planta, más preferiblemente un promotor constitutivo, incluso más preferiblemente un promotor de la GOS2, más preferiblemente un promotor de la GOS2 de arroz; y, opcionalmente , (iii) una secuencia de finalización de la transcripción. 14. La construcción de acuerdo con el elemento 12, en la que dicho ácido nucleico (i) codifica dos o tres polipéptidos seleccionados en el grupo, integrado por los polipéptidos listados en la Tabla 3. 15. El uso de una construcción de acuerdo con el elemento 13 ó 14 en un método para producir plantas que tienen rendimiento incrementado, particularmente biornasa incrementada y/o rendimiento de semillas incrementado en relación con las plantas de control. 16. La planta, parte de la planta o célula de planta transformada con una construcción de acuerdo con el elemento 13 ó 14. 17. El método para la producción de una planta transgénica que tiene rendimiento incrementado, particularmente biomasa incrementada y/o rendimiento de semilla incrementado en relación con las plantas de control, que comprenden: (i) introducción y expresión en una planta de cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codifican los polipéptidos correspondientes seleccionados del grupo formado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla ? o sus homólogos y fusiones de los mismos; y (ii) el cultivo de células de plantas bajo condiciones que promueven crecimiento y desarrollo de plantas . 18. Las plantas transgénicas que tienen rendimiento incrementado, particularmente biomasa incrementada y/o rendimiento de semillas incrementadas, con relación a las plantas de control, que dan como resultado una expresión modulada de cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codifican los polipéptidos correspondientes seleccionados del grupo formado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A o sus homólogos y fusiones de los mismos, o en una célula de plantas transgénicas derivadas de dichas planta transgénicas . 19. La planta transgénica de acuerdo con el elemento 12, 16 o 18 o una célula de planta transgénica derivada de los mismos, en donde la plana es una planta de cultivo o una monocotiledónea o un cereal, tales como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo Farro, esparto, sécale, escaña, teff, milo y avena. 20. Las partes cosechables de una planta de acuerdo con el elemento 19, en el que dichas partes cosechables son preferiblemente biomasa y/o semillas de brotes. 21. Los productos derivados de una planta de acuerdo con el elemento 18 o 19 y/o de partes cosechables de una planta de acuerdo con el elemento 20. 22. La construcción de acuerdo con el elemento 12, en la que dicho ácido nucléico de (i) codifica dos polipéptidos seleccionados del grupo formado por las combinaciones de la Tabla 3. 23. El uso de una construcción de acuerdo con el elemento 13 o 14 en un método para producir plantas que tienen rendimiento incrementado, particularmente biomasa incrementada y/o rendimiento de semillas incrementada en relación con las plantas de control. 24. La planta, parte de la planta o célula de planta transformada con una construcción de acuerdo con el elemento 13 ó 1 . 25. El método para la producción de una planta transgénica que tiene mayor rendimiento, especialmente biomasa incrementada y/o rendimiento de semillas incrementada en relación con las plantas de control, que comprenden: (iii) introducir y expresar en una planta uno o más ácidos nucléicos (aislados) que codifican por lo menos uno, preferiblemente polipéptidos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más seleccionados del grupo formado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A, sus homólogos y fusiones de los mismos; y (iv) cultivar la célula de la planta bajo condiciones que promueven el crecimiento y desarrollo de la planta . 26. Plantas transgénicas que tienen rendimiento incrementado, en particular biomasa incrementada y/o rendimiento de semillas incrementado, en relación con las plantas de control, que resultan de la expresión modulada de uno o más ácidos nucléicos (aislados) que codifican por lo menos uno, preferiblemente polipéptidos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más seleccionados del grupo formado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A, sus homólogos y fusiones de los mismos, o una celda de plantas transgénicas derivada de dicha planta transgénica. 27. La planta transgénica de acuerdo con el elemento 12, 16 o 18 o una célula de planta transgénica derivada de la misma, en donde la planta es una planta de cultivo o una monocotiledónea o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo Farro, esparto, sécale, escaña, teff, milo y avena. 28. Las partes cosechables de una planta de acuerdo con el elemento 19, en el que dichas partes cosechables son preferiblemente biomasa y/o semillas de brotes. 29. Los productos derivados de una planta de acuerdo con el elemento 18 o 19 y/o de partes cosechables de una planta de acuerdo con el elemento 20. 30. El uso de cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codifican dos o tres polipéptidos seleccionados del grupo consistente de cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A, sus homólogos y fusiones de los mismos con rendimiento incrementado, particularmente con rendimiento de semillas incrementado y/o biomasa de brotes de una planta de acuerdo con el elemento 20. 31. Un complejo de proteina basada en AN3 aislado, que comprende al menos las proteínas AN3p y una o más de las proteínas seleccionadas del grupo codificado por AT4G16143, AT1G09270, AT3G06720, AT5G53480,' AT3G60830, ATI G18450, AT2G46020, AT2G28290, AT1G21700, AT5G14170, AT4G17330, AT4G27550, AT1G65980, AT5G55210, AT3G15000, AT4G35550, AT1G20670, AT1G08730, AT5G13030, AT2G18876, AT5G17510, AT1G05370, AT4G21540, AT1G23900 y AT5G23690. 32. Un complejo de proteína basada en AN3 aislado, que comprende al menos las proteínas AN3p y una o más de las proteínas seleccionadas del grupo, integrado por ARP4 (AT1G18450), ARP7 (AT3G60830 ) , SNF2 (AT2G46020), SYD (AT2G28290), SWI3C (AT1G21700) y SWP73B (AT5G14170). 33. Un complejo de proteina basada en AN3 aislado, de acuerdo con el elemento 2, según la cual dicho complejo proteico comprende al menos AN3p, un actina relacionada con proteínas seleccionadas del grupo compuesto de ARP4 y ARP7, una ATPasa seleccionada del grupo integrado por SNF2 (BRM) , SYD y un. dominio SWIRM que contiene proteínas. 34. Un complejo de proteína basada en AN3 aislado, de acuerdo con el elemento 3, según la cual dicho dominio SWIRM que contienen proteínas es SWI3C. 35. El uso de un complejo de proteína de acuerdo con cualquiera de los elementos anteriores para promover el crecimiento de la planta. 36. Un método para promover la formación complejos de proteína basada en AN3 por sobreexpresion simultánea de al menos dos proteínas del complejo.

Descripción de las Figuras La presente invención ahora. será descrita con referencia a las siguientes figuras en las cuales: La Figura 1 es un análisis de la expresión de GFP etiquetada con GS y AN3 en cultivos celulares transgénicos de la suspensión.

El extracto de proteína total de tipo salvaje de 2-días de edad y GFP etiquetados con GSN - y C-terminales y cultivos de sobreexpresion de AN3 (60 yg) se separó por 12% SDS-PAGE y se inmunoanalizó. Para detección de proteínas etiquetadas con GS, se incubaron los análisis con plasma sanguínea humana seguido por incubación con IgG anti-humano acoplado a peroxidasa de rábano. Se desarrollaron análisis de gel de proteínas por detección quimioluminiscente . Las masas moleculares recombinantes esperadas para GFP etiquetadas por GS y AN3 son de 52.8 kD y 43.5 kDa, respectivamente (indicado con puntos negros).

La Figura 2 es el análisis de los eluatos de proteínas TAP.

Los complejos de proteína etiquetada por GS fueron purificados de cultivos de suspensión de células de plantas transgénicas , precipitados con TCA 25% (v/v) separados en geles de NuPAGE de 4-12% y visualizados con la tinción de Kumasi G-250 coloidal. Las proteínas de cebo se indican con un punto.

La Figura 3 representa el vector binario utilizado para la introducción y expresión en Oryza sativa de un ácido nucléico similar a codificación de iSYT bajo el control de un promotor de la planta.

Ejemplos Ahora se describirá la presente invención con referencia a los siguientes ejemplos, que por sí mismos son para ilustración. Los siguientes ejemplos no pretenden definir completamente o de lo contrario limitan el alcance de la invención.

Manipulación de ADN : a menos que se establezca de otra manera, técnicas de ADN recombinante se realizan de acuerdo con protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en Volúmenes 1 y 2 of Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales y métodos estándar para trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications (UK) .

Ejemplo 1: construcción de vectores: TAP Los vectores de construcción de GFP y AN3 etiquetados con GS N- y C-terminales bajo el control del promotor 35S (CaMV) se obtuvo por reacciones Multisite Gateway LR. Las regiones de codificación, sin (-) y con ( + ) codones de detención, se amplificaron por reacción de cadena de polimerasa (PCR) y se clonó en el vector de Compuesta pDONR221 (Invitrogen) que da como resultado en pEntryLlL2-GFP(-), pEntryLlL2-GFP (*) , pEntryLlL2-AN3 (-) y pEntryLlL2-AN3( + ). Se presentaron Pro35S: GFP-GS y Pro35s : AN3-GS que contienen vectores de transformación de plantas se obtuvieron por reacción de LR de Gateway de Múltiples sitios entre pEntryL4Rl-Pro35s y pEntryLlL2-GFP (*) o pEntryLlL2-AN3 ( * ) con pKNGSTAP .

Ejemplo 2 : Cultivo de suspensión celular Los cultivos de PSB-D de suspensión celular de Arabidopsis thaliana tipo silvestre y transgénico se mantuvieron en 50 mi de medio mismo (4.43 g/1 MISMO, Sigma-Aldrich) , 30 g/1 sacarosa, 0.5 mg/1 NAA, 0.05 mg/1 cinetina, pH 5.7 ajustado con 1M KOH) a 25°C en la obscuridad, por agitación suave (130 rpm) . Cada 7 dias las células se subcultivaron en medio fresco a dilución de 1/10.

Ejemplo 3: Transformación de cultivos celulares El cultivo de Arabidopsis se transformó por co-cultivo de Agrobacterium como se describió anteriormente (Van Leene y otros, 2007). El cultivo Agrobacterium se desarrolló exponencialmente en YEB (OD6oo entre 1.0 y 1.5) se lavó tres veces por centrifugación (10 min a SOOOrpm) con un medio MSMO de volumen igual y se resuspendió en medio de crecimiento de suspensión celular hasta un OD60o de 1.0. Dos dias después de subcultivo, 3 mL de cultivo en suspensión fue incubado con 200 µ? de lavado de Agrobacteria y 200µ de acetoseringona, durante 48 horas en la oscuridad a 25°C con agitación suave (130 rpm) . Dos días después del co-cultivo, 7 mi MSMO que contiene una mezcla de tres antibióticos (25µg/ml canamicina, 500 yg/ml carbenicelina y 500 µ?/ ?? vancomicina) se agregaron a los cultivos celulares y se desarrollaron en suspensión en condiciones estándar (25°C, 130 rpm y oscuridad continua) . Los cultivos transgénicos estables fueron seleccionados por dilución de secuencional en una proporción de 1:5 y 1:10 en 50 mi de medio MSMO fresco que contiene la mezcla de antibióticos, respectivamente, en 11 y 18 días después del co-cultivo. Después de contra seleccionar las bacterias, las células de plantas transgénicas fueron subcultivadas semanalmente en una proporción de 1:5 en 50 mi de medio MSMO que contenga 25 µg/ml de canamicina durante dos semanas más. A partir de entonces las células fueron subcultivadas semanalmente en medio fresco en una dilución de 1/10.

Ejemplo 4: Análisis de expresión de los cultivos de suspensión celular La expresión de transgen fue analizada en un extracto de la proteina total derivado de crecimiento exponencial de las células, cosechadas dos días después del subcultivo. Cantidades iguales de proteina total fueron separadas en geles de SDS-PAGE 12% y analizadas en las membranas de Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA) . Los análisis de gel de proteína fueron bloqueadas en 3% de leche descremada en Tris-HCl 20 mM, pH 7.4, 150 mM NaCl y 0.1% Tritón X-100. Para la detección de proteínas etiquetadas con GS, los análisis fueron incubadas con plasma humano de sangre seguido de incubación con IgG anti-hurnano junto con peroxidasa de rábano picante (HRP; GE-Healthcare) . Los análisis de gel de proteína fueron desarrollados por la detección de una microplaca (Perkin Elmer, Norwalk, CT) .

Ejemplo 5 : Preparación de extracto de proteínas El material celular (15 g) se molió a homogeneidad en nitrógeno líquido. Se preparó extracto de proteína cruda en un volumen igual (p/v) de solución reguladora de extracción 825 mM Tris-HCl, pH 7.6, 15 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 150 mM NaCl, 15 mM p-nitrofenilfosfato, 60 mM ß-glicerofosfato, 0.1% (v/v) Nonidet P-40 (NP-40), 0.1 nM vanadato de sodio, 1 mM NaF, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10pg/ml leupeptina, 10 ug/ml aprotinina, 5 g/ml antipaina, 5 ug/ml quirnkiostatina, 5 pg/ml pepstatina, 10 inhibidor de tripsina de soya, 0.1 mM benzamidina, 1 µ? trans-epoxisuccinil-L-leucilamido- ( -guanidino) butano (E64), 5% (v/v) etilenglicol) usando una batidora Ultra-Turrax T25 (IKA Works, ilington, NC) a 4°C. La fracción de proteína soluble se obtuvo por una centrifugación de dos pasos a 369000g durante 20 minutos y a 178000 g durante 45 minutos, a 4°C. El extracto pasó a través de un filtro de 0.45 µ?t? (Alltech, Deerfield, IL) y el contenido de proteina se determinó con el kit de Análisis de Proteínas (Bio-Rad, Hercules, CA) .

Ejemplo 6: Purificación de Afinidad Tándem Se realizaron purificaciones como se describió por Bürckstümmer y otros, (2006, con algunas modificaciones. En resumen, 200 mg de extracto de proteína total se incubó durante 1 h a 4°C bajo rotación suave con perlas ???µ? IgG Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) , pre-equilibrado con solución reguladora de extracción de 3 mL . Las perlas de IgG Sepharose fueron transferidas a una columna de Mobicol de 1 mi (MoBiTec, Goettingen, Alemania) y se lavaron con 10 mi de IgG de solución reguladora (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% NP-40, etilenglicol 5%) y 5 mi de tabaco (Nicotianas tabacum L. ) solución reguladora de Etch Virus (TEV) (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% (v/v) NP-40, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 µ? E64, 5% (v/v) etilenglicol). Los complejos unidos se eluyen a través de la recopilación de AcTEV (2 x 3U, Invitrogen) durante lh a 16°C. La fracción eluída de IgG se incuba durante lh a 4°C en virtud de una rotación suave con 100 µ? de resina estreptavídina (Stratagene, La Jolla, CA) , pre-equilibrada con 3 mi de solución reguladora de TEV. Las perlas de estreptavidina fueron embaladas en una columna de obicol y lavadas con 10 mi de solución reguladora de TEV. Los complejos unidos se eluyen con 1 mi de solución reguladora de elución de estreptavidina (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% (v/v) NP-40, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 µ? E64, 5% (v/v) de etilenglicol, 20 mM Destiobiotina ) y se precipitó utilizando TCA (25%v/v) . El sedimento de la proteína fue lavada dos veces con acetona helada que contiene 50 mM HC1, se redisolvió con solución reguladora de la muestra y se separó en geles de NuPAGE degradados a 4-12% ( Invitrogen ) . Las proteínas se visualizan con azul brillante tinción coloidal Kumasi.

Ejemplo 7: Aislamiento de proteólisis y péptidos Después de desmanchar, losas de gel fueron lavadas durante 1 hora en H2O, los puentes bisulfuro de polipéptido se redujeron durante 40 minutos en 25 mi de 6.66 mM TDT en 50 mM NH4HCO3 y secuencialmente los grupos tiol fueron convertidos durante 30 minutos en 25 mi, 55 mM IAM en 50 mM NH4HCO3. Después de lavar las losas de gel 3 veces con agua, carriles completos de los geles de proteína fueron cortados en rodajas, recolectados en placas de microtitulación y tratados esencialmente como se describió antes, con modificaciones menores (Van Leene y otros, 2007) . Por pozo de placas de microtitulación, se rehidrataron las partículas de gel deshidratadas en 20 µ? de solución reguladora de digestión que contiene 250 ng de tripsina (MS Gold; Promega, Madison, WL) , 50 rnM NH4HC03 y 10% CH3CN (v/v) durante 30 minutos a 4°C. Después de agregar 10 µ? de una solución reguladora que contiene 50 mM NH4HCO3 y 10% CH3CN (v/v) , las proteínas fueron digeridas a 37 °C durante 3 horas. Los péptidos resultantes se concentran y desalan con puntas de fase sólida de microcolumna (Punta PerfectPureTM C18, volumen de lecho 200 mi; Eppendorf, Hamburgo, Alemania) y se eluyó directamente en una placa de destino MALDI (Opti-TOF™ 384 Well Insert; Applied Biosystems, Foster City, CA) mediante 1.2 µ? de 50% CH3CN : 0.1% CF3COOH solución saturada de ácido a-ciano-4-hidroicinámico se picó con 20 fmol/µ? Glul-fibrinopéptido B ( Sigma-Aldrich ) , 20 fmol/µ? des-Oro2-Bradiquinina (Sigma-Aldrich) y 20 fmol/µ? de fragmento de hormona adrenocorticotrópica 18-29 (Sigma-Aldrich).

Ejemplo 8: Adquisición de espectro de masas Un instrumento de MS MALDI-tándem (4800 Proteomics Analyzer; Applied Biosystems) fue utilizado para adquirir las huellas de masa de péptidos y el espectro posterior de f agmentación 1 kV CID de péptidos seleccionados. Los espectros de secuencia de péptidos y espectrometría de masas de péptido se obtuvieron mediante la configuración esencialmente como fue presentado en Van Leene y otros. (2007) . Cada placa MALDI fue calibrada de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes. Todas los espectros de huellas masas de péptidos (PMF) fueron calibrados internamente con tres estándares internos en m/z 963.516 (des-Pro2-bradiquinina) , m/z 1570.677 (Glul - fibrinopéptido B) y m/z 2465,198 (fragmento de hormona adrenocort icot ropica 18-39) dando como resultado una precisión de masa promedio de 5 ppm ± 10 ppm para cada punto de péptido analizado en los objetivos MALDI analizados. Con los espectros PMF individuales, hasta dieciséis de péptidos, excediendo una relación de señal a ruido de 20 que pasa a través de un filtro de masa de exclusión fueron sometidos a análisis de fragmentación .

Ejemplo 9: Identificación de homología de Proteínas basada en MS Los espectros PMF y los espectros de secuencia de péptido de cada muestra se procesaron con el paquete de software anexo (GPS Explorer 3.6, Applied Biosystems) con la configuración de los parámetros esencialmente como se describe en Van Leene y otros (2007). Fueron generados y presentados archivos de datos de búsqueda para su identificación de homología de proteínas mediante el uso de un motor de búsqueda de la base de datos local (Mascot 2.1, Matrix Science) . Una base de datos interna de la proteina Arabidopsis no redundante llamada SNAPS Arabidopsis thaliana versión 0.4 (SNAPS= Ensamble Sencillo No redundante de Secuencias de Proteínas, 77488 entradas de secuencia, 30468560 residuos; disponible en http://www.ptools.ua.ac.be/snaps) fue recopilado de nueve bases de datos públicas. Las identificaciones de homología de proteínas de la entrada superior (primera clasificación) con una calificación relativa superior al 95% de probabilidad. Las identificaciones positivas adicionales (segunda clasificación y más) fueron retenidas cuando la puntuación superó el umbral de 98% de probabilidad.

Ejemplo 10 : Análisis de expresión de GFP y A 3 Etiquetadas con GS que sobreexpresan lineas celulares.

Antes de realizar purificaciones de TAP los cultivos de suspensión celular transformados establemente se tamizaron en el nivel de expresión de proteínas de los transgenes. Análisis de gel de proteínas de cantidades iguales con extracto de proteínas total derivado de cultivos tipo silvestre (PSB-D) y GS-GFP, GFP-GS, GS-AN3 y AN3-GS que sobreexpresan líneas celulares mostraron clara expresión de las proteínas etiquetadas con GS (Figura 1).

Ejemplo 11 : Purificación TAP de GFP tipo silvestre y Etiquetadas con GS sobreexpresando cultivos .

A pesar de que los dos pasos sucesivos de purificación se realizan dentro de la purificación de TAP, las proteínas de fondo co-purificadas por unión no especifica son un tema. La contaminación de proteínas debido a antecedentes experimentales fueron determinadas por la purificación sobre cultivos de tipo silvestre y transgénicos sobreexpresando proteína verde fluorescente (GFP) localizada nuclear etiquetada con GS N- y C-terminal. Las proteínas copurificadas no específicas se precipitaron, separaron en gel, tiñeron (Figura 2), digirieron con tripsina e identificaron inambiguamente por MALDI-TOF/TOF. La mayoría de los contaminantes son proteínas altamente abundantes, tales como chaperones, proteínas de citoesqueleto, proteínas ribosomales, enzimas metabólicas o factores de traslación de proteínas (Tabla 0). Las proteínas idénticas o similares se encontraron como contaminantes comunes en otros estudios de interacción, de proteína-proteína en plantas (Rohila y otros, 2006; Van Leene y otros, 2007) .

Ejemplo 12 : Aislamiento de TAP e identificación de MS de proteínas de interacción de AN3.

Con el fin de identificar los patrones de interacción de AN3 en vivo, se realizaron purificaciones de afinidad tándem (TAP) en fusiones GS N- y C-terminales de AN3 expresadas ectópicamente bajo control del promotor 35SCaMV constitutivo en cultivos de suspensión de Arabidopsis transgénico. Se realizaron dos purificaciones independientes de TAP en extractos de las lineas AN3-GS y GS-AN3, cosechadas dos días después del sub-cultivo en medio fresco. Las proteínas purificadas de afinidad fueron separadas en un gel de NuPAGE 4-12% y teñidas con azul brillante de Kumasi. Los perfiles de la purificación de los cultivos transgénicos sobreexpresando A 3 se muestran en la figura 2. Las bandas de proteina fueron cortadas, digeridas en gel con tripsina y sometidas a espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF para identificación de proteínas. Después de que se substrajeron las proteínas de fondo, identificadas por la purificación de control descrito en el Ejemplo 2 así como en otros análisis (GUS y GFP citosólica, Van Leene y otros, 2007), de la lista de resultados obtenida se identificaron 25 proteínas AN3 de interacción (Tabla A). Estas pueden dividirse en dos grupos: 1.4 proteínas fueron confirmadas experimentalmente y se identificaron 11 proteínas sólo en uno de cada cuatro experimentos TAP.

Ejemplo 13: Aislamiento e identificación de la subunidad de complejos de remodelación de cromatina SWI/SNF de interacción con A 3 en plantas .

Entre los interactores AN3 experimentalmente confirmados seis proteínas actúan como subunidades de máquinas macromoleculares que remodelan la estructura de la cromatina. Una investigación la base de datos (ChromDB, Gendler y otros, 2008) ilustra que todos ellos pertenecen a la familia SWI/SNF ATPasa. Las ARPasas de remodelación de cromatina SWI/SNF se conservan el reino animal y de las plantas y regulan los programas de transcripción en respuesta a señales endógenas y exógenas. Esto sugiere que la actividad transcripcional de AN3 está regulada a través de la remodelación de de la cromatina. De conformidad, el homólogo SYT humano de AN3 se mostró también que interactúa con los componentes complejos SWI/SNF, BRM y Brgl (Thaete y otros, 1999; Perani y otros, 2003; Ishida y otros, 2004).

Aunque el papel funcional de varios componentes complejos putativos de SWI/SNF ha sido estudiado en Arabidopsis, hasta ahora ningún complejo de remodelación de cromatina ha sido aislado y caracterizado. La co-purificación con AN3 da por primera vez la prueba de la comprobación física de complejos SWI/SNF de plantas en vivo, que se basaba únicamente en el análisis de homología y la interpretación de las interacciones genéticas in vitro.

Una investigación de la literatura ilustra que las subunidades ATPasa de SWI/SNF controlan múltiples vías del desarrollo en Arabidopsis. Las mutantes nulas de las dos ATPasas aisladas SYD (At2g28290) y BRM (SNF2) (At2g46020) muestran los defectos del desarrollo pleyotrópico . Ambas mutantes de crecimiento lento y enanas, tienen defectos en la separación de cotiledón y exposición reducida dominancia apical (Wagner & Meyerowitz, 2002; Farrona y otros, 2004; Hurtado y otros, 2006; Kwon y otros, 2006; Su y otros., 2006) . Las mutantes nulas en BRM (SNF2) también tienen defectos de crecimiento de la raíz única y son machos estériles (Wagner & Meyerowitz, 2002; Hurtado y otros, 2006; Kwon y otros, 2006) . Las mutantes Swi3c complejas de núcleo (Atlg21700) se parecen estrechamente a mutantes brm (Sarnowski y otros, 2005) . Las mutantes de componentes accesorios ARP4 y ARP7 exhiben defectos pleyotropicos ARP4 y ARP 7 con menos remembranza a fenotipos syd, brm y swi3c (Meagher y otros, 2005) . La desregulación de ARP4 dio como resultado fenotipos que incluyen organización alterada de órganos de plantas, floración temprana, senescencia de flor retardada y esterilidad parcial (Kandasamy y otros, 2005a) . La eliminación de ARP7 da como resultado plantas enanas con hojas de roseta pequeñas, crecimiento de la raíz altamente retrasado, desarrollo de la flor alterado y fertilidad reducida (Kandasamy y otros, 2005b) . Por último, el silenciamiento mediado por RNAi del componente complejo SWI/SNF accesorio SWP73B (At5gl4170) dio como resultado enanismo en plantas con raices más cortas (Crane & Gelvin, 2007) .

Ejemplo 14: Aislamiento e identificación de los interactores A 3 Con excepción de las subunidades de complejo de remodelación de cromatina SWI/SNF los otros 19 interactores AN3 identificados no se caracterizan o lo hacen pobremente. La Tabla B da una revisión general del proceso biológico GO y función molecular.

Entre ellos cuatro interactores (At4gl6143, Atlg09270, At3g06720 y At5g53480) están involucrados en el tráfico de nucleocitoplásmico con identificaciones AN3 como uno de los blancos de transportadores nucleares de plantas. De hecho, una localización precisa de celular es esencial para la función de las proteínas y la localización nuclear es clave para la función de los factores de transcripción. En las plantas, el tráfico nucleocitoplásmico desempeña un papel fundamental en diversos procesos biológicos (Meier, 2007; Xu & Meier, 2008) y transportadores nucleares han demostrado estar involucrados en la regulación de las rutas de transducción de diferentes señales durante el desarrollo de la planta (Bollman y otros, 2003) y en respuestas de plantas a tensiones bióticas (Palma y otros, 2005) y abióticas (Verslues y otros, 2006) .

Otro interactor de AN3, aún no caracterizado, es la fosfatase/sintasa trehalosa 4 (TPS4). Varios estudios en plantas implican un importante papel de la biosintesis de trehalosa para el crecimiento, desarrollo y tolerancia a la tensión de plantas (Greenan, 2007). En el caso de Arabidopsis TPS 1, las mutantes de eliminación exhiben un fenotipo letal de embriones, sugiriendo un papel. de este gen en el desarrollo de las plantas (Eastmond y otros, 2002) . Además, la sobreexpresión de TPSl resaltan su papel como un regulador de glucosa, ácido abscisico y estrés de señalización (Avonce y otros, 2004). Este último estudio, junto con un análisis reciente de TPS de arroz que desencadena la inducción de genes en respuesta a estrés abiótico cuando se sobreexpresan (Ge y otros, 2008), sugiere un posible papel para genes TPS en la regulación de rutas de señalamiento transcripcionales.

Los otros interactores identificados indican enlaces de función de AN3 en varios procesos. Varios estudios demuestran la participación de las esfingosina quinasas en la señalización celular de plantas (Coursol y otros, 2003; Coursol y otros, 2005; Worral y otros, 2008), mientras los informes sobre los homólogos de miosina (Peremyslov y otros, 2008; Jiang y otros, 2007) implican papeles de proteína y organelos que trafican en el desarrollo de la planta. Las genes, los otros interactores er interesantes para estudiarse en Tabla 0. Lista Proteínas de co-purificación durante experimentos de TAP de cultivos de células no transformadas y de cultivos que expresan ectópicamente la expresión de GFP localizada nuclear Número de Acceso Nomb e de la pro eína Mock GFP At4g00020 BRCA2A {cáncer de mama 2 similar a 2A) + At.4q09800 Proteína ribosomal 40S S18 + At.4gl4960 Cadena de alfa tubuiina + At4gl8Q80 Proteína hipotética At4g20160 Proteína expresada + At:: g20890 Cadena beta tubu1 i na + At g31820 Proteína de familia NF3 de respuesta + fototrótica At q33200 Miosina, pu t:a ti a + At5g02490 Proteína 2 de choque térmico afín a 70 + kDa, putativa At5g02500 Proteína 1 de choque térmico a fin a 70 + kDa, putativa At5g08670 Cadena beta ATP sintetasa, mitocondrial + At.5g08680 Cadena beta ATP sintetasa, mitocondrial + At5g08690 Cadena beta ATP sintetasa, mitocondrial + At.5g0981() Actina 7 (AC 7 ) / actina 2 + + At5gl8110 Nueva proteína de unión a hemisferio + ínCBP) At5g28540 Proteína 1 de unión luminosa (BiP-1) + (BP1) At5g35360 Acetil-CoA carboxilasa, subunidad de + carboxilasa de biotina (CAC2) At5g40Q60 Proteína resistente a enfermedad (de la + cíase TIR-NBS-LRR) , putativa At.5g42020 Proteína 2 de unión luminosa (BiP-2) + ÍBP2) At5g44340 Cadena beta tubuiina + At5g60390 Factor de elongación 1-alfa A1:5g62700 Cadena beta tubuiina + Tabla A. AN3 y lista de proteínas copurificadas con AN3 identificadas por MS . La última columna dice cuantos experimentos independientes se identificaron de in interactor Código AGI Descripción PM Cuenta Reí. Reí. (kDa) de cías . /umb. Mejor pépti- proteína cías . do /umb ion AT5G13030 proteína expresada 71,1 3 31/29 1 AT2G18876 proteina expresada 43,5 11 67/61 1 AT5G17510 proteína expresada 42, 5 3 37/28 1 AT1G05370 proteína expresada 49,9 12 66/61 1 AT4G21540 Quinasa esfingosina 141, 7 9 69/61 1 putativa (SfK) AT1G23900 Adaptina gamma 96, 4 19 78/61 1 AT5G23690 Proteína de familia 59, 6 11 66/61 1 adenililtransferasa polinucleótido Tabla B Código AGI Nombre /Descripción Proceso Biológico Función Molecular GO GO At4gl6143 Importe de Actividad Importina alfa-2 proteína al transportadora de (IMP2) núcleo proteína Atlg09270 Transporte de Actividad Importina alfa-1 proteína transportadora de (IMPA4) intracelular proteína At3g06720 Transporte de Actividad Importina alfa-1 proteína transportadora de (IMPA1) intracelular proteína At5g53480 Importina beta-2 Importe de Actividad proteína dentro transportadora de del núcleo proteína At4gl7330 Proteína G2484-1 desconocida Unión a RNA At4g27550 Trealosa Biosíntesis de Actividad de fosfatasa/sintasa 4 trealosa trealosa fosfato (TPS4 ) sintasa Atlg65980 Peroxidasa desconocida Actividad dependiente de antioxidante tioredoxina 1(TPX1) At5g55210 Proteína Expresada desconocida desconocida At3gl5000 Proteína Expresada desconocida desconocida similar a proteína DAG At4g35550 Casilla 13 Regulación de Unión a DNA relacionada a transcripción uschel (WOX13) Atlg20670 Proteína que desconocida Unión a DNA contiene dominio de bromo Atlg08730 Movimiento basado Unión a proteína Proteína XIC en filamento de similar a miosina actina At5gl3030 Proteína Expresada desconocida desconocida At2gl8876 Proteína Expresada desconocida desconocida At5gl7510 Proteína Expresada desconocida desconocida Atlg05370 Proteína Expresada desconocida desconocida At4g21540 Activación de Actividad de Quinasa esfingosina actividad de quinasa putativa proteína quinasa C Transporte Atlg23900 Adaptina Gamma mediado por Unión a Clatrina vesícula At5g23690 Proteína Procesamiento de Unión a RNA adenililtransferasa RNA de nucleótido Ejemplo 15 : Identificación de secuencias relacionadas con iSYT Las secuencias (ADNc de longitud completa, EST o genómica) relacionados con ácido nucléico iSYT y polipéptidos se identificaron entre los mantenidos en la base de datos Entrez Nucleotidos en el Centro Nacional para Información de biotecnología (NCBI) y otras bases de datos de secuencia mediante bases de datos de herramientas de búsqueda de secuencia, tales como la herramienta de alineación local básica (explosión) (Altschul et al. (1990). Mol J. Biol . 215:403-410; y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). El programa se utiliza para encontrar regiones de similitud local entre las secuencias mediante la comparación de ácidos nucléicos o secuencias de polipéptido a bases de datos de secuencia y calculando la significancia estadística de coincidencias. Por ejemplo, el polipéptido codificado por el ácido nucléico de SYT fue usado para el algoritmo TBLASTN, con ajustes por omisión y el filtro para ignorar secuencias de baja complejidad establecidas. El resultado del análisis fue visto por comparación por pares y ordenado según la puntuación de probabilidad (E-value), donde la puntuación refleja la probabilidad que produce por casualidad una alineación particular (mientras es menor el valor E, mayor es el éxito) . Además de valores E, comparaciones también fueron anotadas por porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere a las secuencias de número de idéntico de nucleótidos (o aminoácidos) entre los dos en comparación de ácidos nucléicos (o polipéptido) en una longitud determinada. En algunos casos, los parámetros por omisión pueden ser ajustados para modificar el rigor de la búsqueda. Por ejemplo el valor electrónico podrá aumentarse para mostrar coincidencias menos estrictas. De esta forma, pueden identificarse coincidencias cortas casi exactas.

Las Tablas A2 a A26 proporcionan una lista de secuencias de polipéptidos relacionados con los polipéptidos de Tabla a.

Las secuencias han sido reunidas provisionalmente y divulgadas públicamente por las instituciones de investigación, tales como el Instituto de Investigación Genómica (TIGR; iniciando con TA) . La base de datos de secuencia de genes eucariotos (EGO) puede utilizarse para identificar estas secuencias relacionadas, la búsqueda de palabra clave o utilizando el algoritmo de la explosión con la secuencia de ácidos nucléicos o secuencia de polipéptidos de interés. Las bases de datos de secuencia especial de ácidos nucléico se han creado para organismos particulares, como por el Instituto de Genoma Conjunto. Además, el acceso a bases de datos propietarias, ha permitido la identificación de ácidos nucléicos novedosos y secuencias de polipéptido.

Sobre SYT Tabla A2. Polipéptidos Homólogos Preferidos de SYT Nombre Fuente del Organismo No. acceso de base de datos Arath_SYT2 Arabidopsis thaliana AY102640.1 Arath_SYT3 Arabidopsis thaliana AY102641.1 Allce_SYT2 _ Allium cepa CF437485 Aqufo_SYT1 Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens DT758802.1 Aqufo_SYT2 Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens TA15831_338618 T25K16.15 Aspof_SYT1 Aspergillus offícinalis CV287542 Betvu_SYT2 Beta vulgaris BQ594749.1 BQ594658.1 Bradi_SYT3 Brachypodium distachyon DV480064.1 Brana_SYT1 Brassica napus CD823592 Brana_SYT2 Brassica napa CN732814 Chlre_SYT Chlamydomonas reinhardtii BQ814858, jg¡_.Chlre3_194013_éstExt_fg enesh2_pg.C_510025 Citsi_SYT1 Citrus sinensis CB290588 Citsi_SYT2 Citrus sinensis CV717501 Cryja_SYT1 Cryptomeria japónica TA3001_3369 _2 Curlo_SYT2 Cúrcuma longa TA2676J 36217 Eupes_SYT2 Euphorbia esula DV144834 Frave_SYT2 Fragaria vesca DY668312 Glyma_SYT1.1 Clycine max TA55102_3847 Glyma_SYT1.2 Glycine max TA51451_3847 Glyma_SYT2.1 Glycine max BQ612648 Glyma_SYT2.2 Glycine max TA48452_3847 Glyso_SYT2 Glycine soya CA799921 Gosar_SYT1 Gossypium arboreum BM359324 Goshi SYT1 Gossypium hirsutum DT558852 Goshi_SYT2 Gossypium hirsutum DT563805 Helan_SYT1 Helianthus annuus TA12738_4232 Horvu_SYT2 Hordeum vulgare CA032350 Lacse_SYT2 Lactuca sémola DW1 10765 Lyces_SYT1 Lycopersicon esculentum AW934450.1 BP893155.1 Maldo_SYT2 Malus domestica CV084230 DR997566 Medtr_SYT1 Medicago trunculata CA858507.1 Medtr_SYT2 Medicago trunculata CA858743 BI310799.1 AL382135.1 Orysa_SYT1 Oryza sativa AK058575 Orysa_SYT2 Oryza sativa AK105366 Orysa_SYT3 Oryza sativa BP 85008 Panvi_SYT3 Panicum virgatum DN152517 Phypa_SYT1.1 Physcomitrella patens TA28566_3218 P ypa_SYT1.2 Physcomitrella patens TA21282_3218 Phypa_SYT1.3 Physcomitrella patens TA20922_3218 P ypa_SYT1.4 Physcomitrella patens TA29452_3218 PicsLSYTI Picea sitchensis DR484100 DR478464.1 Pinta_SYT1 Pinus taeda DT625916 Poptr_SYT1 Populus tríchocarpa DT476906 Poptr_SYT2 Populus tríchocarpa scaff_XIV.493 Poptr_SYT1.2 Populus tríchocarpa CV257942.1 Prupe_SYT2 Prunus DT454880.1 pérsica DT455286.1 Sacof_SYT1 Saccharum officinarum CA078249.1 CA078630 CA082679 CA234526 CA239244 CA083312 Sacof_SYT2 Saccharum officinarum CA1 10367 Sacof_SYT3 Saccharum officinarum CA161933.1 CA265085 Soltu_SYT1.1 Solanum tuberosum CK265597 Soltu_SYT1.2 Solanum tuberosum BG590990 Soltu_SYT3 Solanum tuberosum CK272804 Sorbi_SYT1 Sorghum bicolor TA40712_4558 Sorbi_SYT2 Sorghum bicolor CF482417 CW376917 Sorbi_SYT3 Sorghum bicolor CX611 128 Taxof_SYT2 Taraxacum officinale TA1299_50225 Taxof_SYT3 Taraxacum officinale TA5000_50225 Triae_SYT1 Triticum aestivum TA105893_4565 Triae_SYT2 Triticum aestivum CD901951 Triae_SYT3 Triticum aestivum BJ246754 BJ252709 Vitvi SYT1.1 Vitis vinifera DV219834 Vitvi_SYT1.2 Vitis vinifera EE 108079 Vitvi_SYT2.1 Vitis vinifera EC939550 Vitvi_SYT2.2 Vitis vinifera EE094148.1 EC964169.1 Volca_SYT Volvox carteri JGLCBH011121.fwdJGLCB H011121.rev Welmi_SYT Welwitschia mirabilis DT598761 Zeama_SYT1 Zea mays BG874129.1 CA409022.1 Zeama_SYT2 Zea mays AY 106697 2eama_SYT3 Zea mays CO468901 Homsa_SYT Homo sapiens CR542103 Sobre el polipéptido AT1G05370 Tabla A2. Polipéptidos homólogos preferidos , de polipéptido AT1G05370 Sobre el polipéptido AT1G08730 Tabla A3. Polipéptidos homólogos preferidos polipéptido AT1G08730 Sobre el polipéptido AT1G09270 Tabla A4. Polipéptidos homólogos preferidos , de polipéptido AT1G09270 Sobre el polipéptido AT1G01850 Tabla A5. Polipéptidos homólogos preferidos polipéptido AT1G18450 Sobre el polipéptido AT1G20670 Tabla A6. Polipéptidos homólogos preferidos , de polipéptido AT1G20670 Sobre el polipéptido AT1G20670 Tabla A7. Polipéptidos homólogos preferidos , polipéptido AT1G20670 iSYT Nombre homólogo AT1G21700 >0.sativa_L0C_0s1 1g08080.1#1 AT1G21700 >P.trichocarpa_scaff_V.882#1 Sobre el polipéptido AT1G23900 Tabla A8. Polipéptidos homólogos preferidos , de polipéptido AT1G23900 Sobre el polipéptido AT1G65980 Tabla A10. Polipéptidos homólogos preferidos polipéptido AT1G65980 iSYT Nombre homólogo AT1 G 65980 >B.napus„TC6711 ií#1l AT1 G 65980 >G.hirsutum_BE055703#1 AT1 G 65980 >G.maxJ"C283792#1 AT1 G65980 >H.vulgare-TC156915#1 AT1 G 65980 > .truncatula_TC127082#1 AT1 G65980 >0.sativa_TC321488#1 AT1 G 65980 >P.patens_TC40270#1 AT1 G 65980 >P.trtchocarpa_scaff_XIII.916#1 AT1 G 65980 >S.lycopersicumL_TC196845#1 AT1 G 65980 >T.aestivum_TC288115#1 AT1 G 65980 >Z.mays_TC535995#1 Sobre el polipéptido AT1G18876 Tabla All. Polipéptidos homólogos preferidos, polipéptido AT1G18876 Sobre el polipéptido AT1G28290 Tabla A12. Polipéptidos homólogos preferidos, polipéptido AT1G28290 Sobre el polipéptido AT2G46020 Tabla A13. Polipéptidos homólogos preferidos , de polipéptido AT2G 6020 Sobre el polipéptido AT3G06720 Tabla A14. Polipéptidos homólogos preferidos, de polipéptido AT3G06720 Sobre el polipéptido AT3G15000 Tabla A15. Polipéptidos homólogos preferido Sobre el polipéptido AT3G60830 Tabla A16. Polipéptidos homólogos preferido iSYT Nombre homólogo AT3G60830 >B.napus_TC83795#1 AT3G60830 >G.hirsuJtum_ES802301 #1 AT3G60830 >G.max_Glyma12g01010.1 #1 AT3G60830 > .truncatula_TC123694#1 AT3G60830 >Q.sativa„TC300228#1 AT3G60830 >P.patens..TC39330#1 AT3G60830 >P.triehocarpa_ TC89949#1 AT3G60830 >S.lycopersicum_TC194794#1 AT3G60830 >T.aestivumJTC308484#1 AT3G60830 >Z.mays_TC515322#1 Sobre el polipeptido AT3G60830 Tabla A17. Polipéptidos homólogos preferidos.

Sobre el polipéptido AT3G17330 Tabla A18. Polipéptidos homólogos preferidos.

Sobre el polipéptido AT3G21540 Tabla A19. Polipéptidos homólogos preferidos.

Sobre el polipéptido AT4G27550 Tabla A20. Polipéptidos homólogos preferidos.

Sobre el polipéptido AT4G35550 Tabla A21. Polipéptidos homólogos preferidos.

Sobre el polipéptido AT5G13030 Tabla A21. Polipéptidos homólogos preferidos.

Sobre el polipéptido AT5G14170 Tabla A22. Polipéptidos homólogos preferidos Sobre el polipéptido AT5G23690 Tabla A2 . Polipeptidos homólogos preferidos Sobre el polipéptido AT5G53480 Tabla A25. Polipeptidos homólogos preferidos cSYT Nombre homólogo AT5G53480 >AT5G53480.1 Symbols: importin beta-2, putative ch r5:2173124:2- 21733935 FQRWARD AT5G53480 > A.iha liana JVT3G08943.1 #1 AT5G53480 >A.1halíana_AT3«GQ8'947.1#1 AT5G53480 >G.max_Glyma04g41230.1ff1 AT5G53480 >G. max_G Iyma05g36630.1 #1 AT5G53480 >G.max_Glym906g13620.1#1 AT5G53480 ^G.max Glyma08g02930.1#1 AT5G53480 > H . vu I ge re_c62767390hv270303@ 6375# 1 AT5G53480 >H.vulgare AK249047 AT5G53480 >O.sativa_LOC_Os12g381 10.1#1 AT5G53480 >P.paterts_TC30184#1 AT5G53480 >P.patens_TC31822#1 AT5G53480 >P.tr¡chocarpa„scaff_VL900#1 AT5G53480 P.trichocarpa=scaff=XIS.230ftí1 AT5G53480 >P.trichocarpa_scaff_X\.11801 AT5G53480 >P.trichocarpa_scaff_XVI.1 174#1 AT5G53480 >S.Wcol'or_XM_002442302.1 Sobre el polipéptido AT5G55210 Tabla A26. Polipéptidos homólogos prefi Ejemplo 16: Alineación de un polipéptido iSYT y sus homólogos La alineación de secuencias de polipéptido se realiza utilizando el algoritmo ClustalW 2.0 de alineamiento progresivo (Thompson et al (1997) Nucleic Acids Res 25:4876-4882; Chenna et al (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497-3500) con la configuración estándar (alineación lenta, matriz de similitud: o Blosum 62 (si se alinean los polipéptidos), la penalidad de la apertura de espacios 10, penalidad de extensión de espacios: 0.2) . La edición manual menor se realiza para optimizar aún más la alineación. Un árbol filogenético de un polipéptido iSYT y sus homólogos se construye utilizando un algoritmo de agrupación de unión con vecinos indicado en el programa AlignX entre el Vector NTI ( Invitrogen ) .

Ejemplo 17: Cálculo de identidad de porcentaje global entre secuencias de polipéptidos Porcentajes globales de identidad y similitud entre secuencias de longitud completa de polipéptidos útiles en el desempeño de los métodos de la invención fueron determinados utilizando uno de los métodos disponibles en la materia, el software atGAT (Herramienta de Alineación Global de Matriz) (BMC Bioinformatics . 2003 4: 29. MatGAT: una aplicación de secuencias que genera matrices de similitud/identidad usando ADN o proteina. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; software alojado por Ledion Bitincka) . El software MatGAT genera matrices de similitud/identidad para secuencias de ADN o proteínas sin necesidad de pre-alineación de los datos. El programa realiza una serie de alineamientos apareados mediante el algoritmo de alineación global yers y Miller (con una penalidad de apertura de espacios de 12 y una penalidad de extensión de espacios de 2), calcula la similitud e identidad utilizando por ejemplo Blosum 62 (para polipéptidos) y, a continuación, coloca los resultados en una matriz de distancias. La similitud de secuencias se muestra en la parte inferior de la mitad de la línea divisoria y la identidad de secuencia se muestra en la mitad superior de la linea divisoria diagonal.

Los parámetros utilizados en la comparación son: matriz de clasificación: Blosum62, primer espacio: 12, Espacio de Extensión: 2.

Ejemplo 18 : Identificación de dominios que se componen de secuencias de polipéptidos útiles en el desempeño de los métodos de la invención El Recurso Integrado de la Familia de Proteínas, Dominios y Bases de Datos de Sitios (InterPro) es una interfaz integrada para las bases de datos comúnmente usadas para búsquedas basadas en. textos y secuencias. La base de datos InterPro combina estas bases de datos, que utilizan diferentes metodologías y distintos grados de información biológica sobre proteínas bien caracterizadas para derivar las firmas de la proteína. Las bases de datos de colaboración incluyen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, impresiones, ProDom y Pfam, Smart y TIGRFAMs. Pfam es una gran colección de varias alineaciones de secuencia y modelos ocultos de arkov, que abarca muchos dominios de proteina común y las familias. Pfam está alojada en el servidor del Instituto Sanger en el Reino Unido, InterPro está alojado en el Instituto Europeo de bioinformática en el Reino Unido.

Los resultados del análisis de barrid de InterPro de la secuencia de polipéptidos que representa los polipéptidos de iSYT de la Tabla A que se presenta en Tablas Cl a C20.

El término iSYT (interactor de SYT) e "interactor AN3" en este documento son intercambiables.

Tabla Cl: Resultados de barrido InterPro (números de acceso mayores} del polipéptido AT1G05370.

Tabla C2: Resultados de barrido InterPro (números de acceso mayores} del polipéptido AT1G0873G.

Tabla C3: Resultados de barrido Inter-Pro (números de acceso mayores) del polipéptido AT1G09270 .

Td J i C4 : Resul lados d« ba xido IitLexPru (númeLos Ua acceso u.ayoxt:s) del pulijLépLidcj ATlGQ 18450.

Tabla C5: Resultados de barrido InterPro (números de acceso mayores) del polipéptido AT1G20670.

Tabla C6: Resultados de barrido Inter Pro (números de acceso mayores) del polipéptido AT1G21700.

Tabla C7: Resultados de barrido InterPro (números de acceso mayores} del polipéptido AT1G23900.

Tabla C8: Resultados de barrido InterPro (números de acceso mayores) del polipéptido AT1G65980.

Tabla C9: Resultados de barrido InterPro (números de acceso raayores) del polipéptido AT2G1 887 6 .

Tabla CIO: Resultados de barrido InterPro (números de acceso mayores} del polipéptido AT2G46020 .

Tabla Cll: Resultados de barrido InterPro (números de acceso mayores)- del polipéptido AT3GC 6720 .

Tabla C12: Resultados da barrido InterPro (mimaros de acceso mayores) dal polipéptido AT3G1S000.

Tabla C14: Resultadas de barrido InterPro (números de acceso mayores} del polipéptido AT4G16143.

Tabla C1S: Resultados de barrido InterPro (números de acceso mayores) del polipéptido AT4G21540.

Tabla C16: Resultados de barrido InterPro (números de acceso mayores} del polipéptido AT4G27550.

Tabla C17: Resjltados de barrido InterPro ¡números de acceso mayores) del polipéptido AT5G13030.

Tabla. 28; Resul ados de barrido InterPro íntimeros de acceso mayores) del polipéptido AT5G1751Q, Tabla Cid: Resultados de barrido In:er?ro (trímeros cíe accesc mayores ) del poüpéptido AT5G2369C.

Tabla C20: Resultados de barrido InterPro {números de acceso mayores) del polipéptido AT5G53480.

Ejemplo 19: Predicción de topología de las secuencias de polipéptido iSYT TargetP 1.1 predice la ubicación subcelular de proteínas eucariotas. La asignación de la ubicación se basa en la presencia prevista de cualquiera de las pre-secuencias N-terminales : péptido de tránsito de cloroplasto (cTP) , péptido dirigido a la mitocondria (mTP) o péptido de señal de ruta secretora (SP) . Las clasificaciones en las cuales se basa la predicción final no son realmente probabilidades y no se agregan a uno necesariamente. Sin embargo, la ubicación con la clasificación mayor es la mayor probabilidad de acuerdo con TargetP y la relación entre las clasificaciones (la clase de conflabilidad) puede se runa indicación de cuan cierta es la predicción. La clase de conflabilidad (RC) varía de 1 a 5, en donde 1 indica la predicción más fuerte. TargetP se mantienen en el servidor de la Technical University of Denmark .

Para las secuencias que se predice que contienen una presecuencia N-terminal será predicho un sitio de separación potencial.

Se selecciona un número de parámetros, como grupo de organismos (sin planta o planta) , conjuntos de corte (ninguno, conjunto de atajos predefinidos o conjunto especificado por el usuario) y el cálculo de la predicción de sitios de separación (sí o no) .

Muchos otros algoritmos pueden utilizarse para realizar estos análisis, incluyendo: • ChloroP 1.1 alojados en el servidor de Technical University of Denmark; · Predictor de Localización Subcelular Prowler de Proteínas versión 1.2 alojado en el servidor del Instituto de Biociencia Molecular, Universidad de Queensland, Brisbane, Australia; • Analista de Proteomas PENIQUES PA-GOSUB 2.5 alojado en el servidor de la Universidad de Alberta en Edmonton, Alberta, Canadá ; • TMHMM, alojado en el servidor de la Technical University of Denmark; • PSORT (URL: psort.org) · PLOC (Park y Kanehisa, Bioinformatics , 19, 1656-1663, 2003) .

Ejemplo 20: Clonación de la iSYT que codifica secuencia de ácidos nucléicos El método de codificación fue adaptada de Multisite Gateway© Pro ( InvitrogenTM) .

Cada vector de transformación de la planta fue construido en dos pasos: primero, las dos secuencias de codificación de genes de interés fueron amplificadas del ADN obtenido de la fuente adecuada mediante una PCR de alta fidelidad. Con este fin, fueron diseñados y sintetizados los iniciadores mediante los métodos estándar. A continuación, las secuencias fueron clonadas en pDO R201 P1-P4 y pDONR201 P3-P2 ( InvitrogenTM) , respectivamente, mediante el método de reacción estándar GatewayTM BP (InvitrogenTM). El otro clon resultante se llamó Clon de Entrada (EC) , de conformidad con la terminología de método de Gateway. El otro clon de entrada que llevó a un terminador y promotor fue producido mediante el uso de pDONR201 P4r-P3r. La identidad del clon fue verificada por análisis de digestión de restricción y secuenciación completa del inserto. Después de la verificación, el clon (EC) pasó por un segundo paso de método de Gateway que permite la transferencia de las inserciones de 3 ECs todos para el Vector llamado de Destino (DV) mediante el método de reacción estándar de Gateway LR (InvitrogenTM) . En el vector de destino, un promotor y un terminador diseñado para apilación de genes ya estaban en el lugar. La identidad del clon resultante fue verificada por análisis de digestión de restricción y luego por la secuenciación. Después de esta verificación, este vector binario se utilizó como vector de transformación de la planta. El vector de transformación de la planta contiene los siguientes casetes funcionales en su región de t-ADN: el gen marcador seleccionable, el marcador de gen visual (reportero) y dos genes de interés. Cada uno de estos genes fue impulsado por su promotor correspondiente y terminador. El vector binario, a continuación, se clona en un Agrobacterium tumefaciens desarmados, que se utiliza para transformar el arroz.

Ejemplo 21: Transformación de Plantas Transformación de arroz El Agrobacterium que contiene el vector de la expresión se utiliza para transformar plantas de Oryza sativa. Las semillas maduras secas del cultivo arroz japónica Nipponbare son descascaradas. La esterilización se lleva a cabo incubando durante un minuto en etanol del 70%, seguido por 30 minutos en 0.2% HgCl2, seguido por un lavado de 6 veces por 15 minutos con agua destilada estéril. Las semillas estériles, a continuación, se germinan en un medio que contiene 2,4-D (medio de inducción de callo). Después de incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, se cortan los callos derivados de escótelo embriogénico y se propagan en el mismo medio. Después de dos semanas, los callos se multiplican o propagan por subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. Las piezas de callos embriogénicos se subcultivan en medio fresco 3 días antes del co-cultivo (para reforzar la actividad de división celular) .

La cepa de Agrobacterium LBA4404 que contiene el vector de la expresión se utiliza para co-cultivo. El Agrobacterium fue inoculado en medio de AB con los antibióticos adecuados y cultivado durante 3 días en 28°C.

Las bacterias, a continuación, se recogen y se suspenden en medio de co-cultivo liquido a una densidad (??ß??) de alrededor de 1. La suspensión, a continuación, se transfiere a una placa de Petri y los callos se sumergen en la suspensión durante 15 minutos. Los tejidos de callos, a continuación, son secados por puntos sobre un papel de filtro y transferidos al medio de co-cultivo solidificado y se incuban durante 3 días en la oscuridad a 25ÜC. Los callos cocultivados se desarrollan en medio que contiene 2,4-D durante 4 semanas en la obscuridad a 28 °C en presencia de un agente de selección. Durante este periodo, se desarrollaron islas de callos resistentes a crecimiento rápido. Después de la transferencia de este material a un medio de regeneración e incubación en la luz, se libera el potencial embriogénico y se desarrollaron brotes en las siguientes cuatro a cinco semanas. Los brotes se cortan de los callos y se incuban durante 2 a 3 semanas en un medio que contiene auxina del cual se transfieren al suelo. Los brotes endurecidos se desarrollan bajo alta humedad y disminuye los días en un invernadero.

Se generan aproximadamente 35 transformantes de arroz T0 independientes para una construcción. Los transformantes primarios se transfieren de una cámara de cultivo de tejidos a un invernadero. Después de un análisis de PCR cuantitativo para verificar el número de copias del inserto de T-ADN, solo una copia unitaria de plantas transgénicas que exhibe tolerancia al agente de selección se mantienen para cultivar la semilla TI. Las semillas se cultivan luego de tres a cinco meses después del trasplante. El método dio transformantes de un solo sitio a un régimen de más del 50% (Aldemita y Hodgesl996, Chan et al. 1993, Hiei y otros, 199 ) .

Ejemplo 22 : Transformación de otros cultivos Transformación de maiz La transformación de maíz (Zea mays) se realiza con una modificación del método descrito por Ishida y otros, (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. La transformación es dependiente del genotipo en maíz y sólo genotipos específicos son aptos para la transformación y regeneración. La línea consanguínea A188 (Universidad de Minnesota) o híbridos con A188 como padre son buenas fuentes de material de donantes para la transformación, pero también pueden utilizarse con éxito otros genotipos. Las orejas se obtienen del maíz planta aproximadamente 11 días después de la polinización (DAP) cuando la longitud del embrión inmaduro es de alrededor de 1 a 1.2 mrn. Los embriones inmaduros son co-cultivados con Agrobacterium tumefaciens que contiene la expresión de vectores y las plantas transgénicas son recuperadas a través de la organogénesis. Los embriones cortados se cultivan en medio de inducción de callo y, a continuación, en medio de la regeneración de maíz, que contiene al agente de selección (por ejemplo imidazolinona pero varios marcadores de selección pueden utilizarse) . Las placas petri se incubaron en la luz a 25°C durante 2-3 semanas, o hasta desarrollar brotes. Los brotes verdes se transfieren de cada embrión a medio de enraizamiento de maíz y son incubados a 25°C durante 2-3 semanas, hasta desarrollar raíces. Los brotes de raíces son transplantados al suelo en el invernadero. Las semillas de TI se producen de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contiene una sola copia de inserto T-ADN.

Transformación de trigo La transformación de trigo se realiza con el método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. El cultivo Bobwhite (disponible del CI MYT, México) se utiliza comúnmente en transformación. Los embriones inmaduros son co-cultivados con Agrobacterium tumefaciens, que contiene el vector de la expresión y las plantas transgénicas son recuperadas a través de la organogénesis. Después de incubación con Agrobacterium, los embriones son cultivados in vitro en medio de inducción de callos y, a continuación, en medio de la regeneración, que contiene al agente de selección (por ejemplo imidazolinona pero varios marcadores de selección que pueden utilizarse) . Las placas Petri se incubaron a la luz a 25°C durante 2-3 semanas, o hasta desarrollar brotes. Los brotes verdes son transferidos de cada embrión a medio de enraizamiento a 25°C durante 2-3 semanas, hasta desarrollar raices. Los brotes de raices son transplantados al suelo en el invernadero. Las semillas de TI se producen de plantas que toleran la exhibición al agente de selección y contiene una sola copia de inserto de T-ADN.

Transformación de soya La soya se transforma de acuerdo con una modificación del método descrito en la Texas A & M U.S. 5,164,310 de patentes. Varias variedades de soya comercial son aptas para la transformación por este método. El cultivar Jack (disponible de la Fundación de la semilla de Illinois) se utiliza comúnmente para la transformación. Las semillas de soya son esterilizados para la siembra in vitro. El hipocotilo, la radícula y un cotiledón se extirpan de las plantas de semilleros jóvenes con 7 días de edad. El epicotilo y el cotiledón restantes se cultivan aún más para desarrollar nodos axilares. Estos nodos axilares se extirpan e incuban con Agrobacterium tumefaciens, que contiene el vector de la expresión. Después del tratamiento del co-cultivo, los explantes son lavados y transferidos a la selección de medios de comunicación. Los brotes regenerados se extirpan y colocan en un medio de elongación de brotes.

Los brotes no más largos de 1 cm se colocan en medio de raices hasta que se desarrollan raices. Los brotes con raices se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas TI se producen de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y contienen una sola copia del inserto de T-ADN.

Transformación de colza/canola Los peciolos cotiledonarios e hipocotilos de semilleros jóvenes de 5-6 días de edad se usan como explantes para cultivo de tejidos y se transforman de acuerdo con Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183 - 188). El cultivo comercial estar (Agriculture Canadá) es la variedad estándar utilizada para la transformación, pero también pueden utilizarse otras variedades. Las semillas de cañóla son esterilizadas superficialmente para siembra in vitro. Los explantes de peciolo de cotiledón con el cotiledón adjuntado se extirpan de las plantas de semillero in vitro y se inoculan con Agrobacterium (que contiene el vector de la expresión) por inmersión en el corte final del explante de peciolo en la suspensión bacteriana. Los explantes, a continuación, se cultivan durante 2 días en medio de MSBAP-3, que contiene 3 mg/1 BAP, 3% de sacarosa, 0.7% Phytagar a 23°C, con luz durante 16 hr. Después de dos días de co-cultivo con Agrobacterium, los explantes de peciolo son transferidos al medio que contiene 3 mg/1 BAP MSBAP-3, cefotaxima, carbenicilina o timentina (300 mg/1) durante 7 días y, a continuación, se cultivan en medio de MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina o agente timentina y se seleccionan hasta la regeneración de brotes. Cuando los brotes son de 5-10 mm de longitud, son cortados y transferidos al medio de elongación de brotes (MSBAP-O.S, que contiene 0.5 mg/1 BAP). Los brotes de 2 cm de longitud se transfieren a medio de formación de raíces (MSO) para la inducción de la raíz. Los brotes de raíces son transplantados al suelo en el invernadero. Las semillas de TI se producen de plantas que exhiben tolerancia para el agente de selección y contiene una sola copia del inserto de T-ADN.

Transformación de alfalfa Un clon de regeneración de alfalfa {Medicago sativa) se transforma mediante el método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) . La regeneración y transformación de alfalfa es dependiente del genotipo y por lo tanto, se requiere una planta de regeneración. Se han descrito los métodos para obtener plantas de regeneración. Por ejemplo, estas pueden seleccionarse en el cultivar Rangelander (Agriculture Canadá) o de cualquier otra variedad de alfalfa comercial según lo descrito por Brown DCW y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112). Alternativamente, la variedad de RA3 (University of Wisconsin) se ha seleccionado para usarse en cultivo de tejido (Walker y otros, 1978 Am J Bot 65:654-659). Los explantes de peciolos se co-cultivan con un cultivo durante la noche de Agrobacterium tumefaciens C58C1 p P90 (McKersie y otros, 1999 Plant Physiol 119: 839-847) o LBA4404 que contiene el vector de la expresión. Los explantes son cocultivados durante 3 días en la oscuridad en medio de inducción de SH con 288 mg/L de Pro, thioprolinea 53 mg/L, 4.35 g/L S04K2 y 100 ym acetosyringincna . Los explantes son lavados en medio de Murashige-Skoog de media fuerza (Murashige y Skoog, 1962) y revestidos en el mismo medio de inducción de SH sin acetosiringinona pero con un agente de selección adecuado y el antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Después de varias semanas, los embriones somáticos son transferidos a medio de desarrollo de B0I2Y que contiene no reguladores de crecimiento, sin antibióticos y 50 g/L de sacarosa. Los embriones somáticos son posteriormente germinados en medio de resistencia media Murashige-Skoog. Raíces de las plantas de semillero fueron transplantadas en macetas y desarrolladas en un invernadero. Las semillas de TI se producen de plantas que exhiben tolerancia para el agente de selección y que contiene una sola copia del inserto T-ADN.

Transformación de algodón El algodón se transforma mediante Agrobacterium tumefaciens de acuerdo con el método descrito en Estados Unidos 5,159,135. Las semillas de algodón son superficies esterilizados en solución de hipoclorito de sodio al 3% durante 20 minutos y se lava en agua destilada con 500 µ?????? de cefotaxima. Las semillas luego son transferidas a medio SH con 50 yg/ml de benomilo para la germinación. Los hipocotilos de las plantas de semillero de 4 a 6 dias de edad se eliminan, se cortada en pedazos de 0.5 cm y se colocan en 0.8% de agar. Una suspensión de Agrobacterium (aprox. 108 células por mi, diluido de una cultivo durante la noche transformado con el gen de interés y los marcadores de selección adecuados) se utilizan para la inoculación de los explantes de hipocotilo. Después de tres dias a temperatura ^.ambiente y con iluminación, los tejidos se transfieren a un medio sólido (1.6 g/1 Gelrite) con Sales de Murashige y Skoog con vitaminas B5 (Gamborg y otros, Exp . Cell Res. 50:151-158 (1968)), 0.1 mg/1 de 2,4-D, 0.1 mg/1 de 6-furfurilaminopurina y 750 ug/ml MgCl2 y con 50 a 100 pg/ml cefotaxima y 400-500 yg/ml carbenicilina para matar bacterias residuales. Las lineas de células individuales se aisladan después de dos a tres meses (con subcultivos cada cuatro a seis semanas) y además son cultivados en medio selectivo para amplificación de tejido (30°C, fotoperiodo de 16 h) . Los tejidos transformados son posteriormente cultivados en medio no selectivos durante 2 a 3 meses para dar lugar a embriones somáticos. Los embriones de aspecto saludables de al menos 4 mm de longitud se transfieren a los tubos con medio SH en vermiculita fina, complementado con ácido acético de 0.1 mg/1 indol, 6 furfurilaminopurina y ácido giberélico. Los embriones son cultivados en 30°C con un fotoperiodo de 16 horas y plántulas d 2 a 3 hojas se transfieren a macetas con vermiculita y nutrientes. Las plantas son endurecidas y posteriormente se trasladan al invernadero para cultivo adicional .

Ejemplo 23: Procedimiento de evaluación fenotipica 23.1 Establecimiento de Evaluación Se generan aproximadamente 35 transformantes de arroz T0 independientes. Las transformantes primarias se transfieren de una cámara de cultivo de tejidos a un invernadero para el cultivo y cosecha de semillas de TI. Se conservan los eventos, de los cuales la progenie de TI se segrega 3: 1 para presencia/ausencia del transgen. Para cada uno de estos eventos, aproximadamente 10 Plántulas de TI que contienen el transgen (hetero y homo-cigotos) y aproximadamente 10 plántulas de TI carecen del transgen (nullicigotos) son seleccionados por monitoreo de expresión de marcador visual. Las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes se cultivan por posiciones colocadas al azar. Las condiciones de invernadero son de pocos días (12 horas de luz) , 28°C a la luz y 22°C en la oscuridad y una humedad relativa del 70%. Las plantas cultivadas bajo condiciones de estrés no son regadas a intervalos regulares para garantizar que el agua no sea una limitante y se cumplen con las necesidades de las plantas para completar el crecimiento y el desarrollo.

Los eventos de TI se evalúan aún más en la generación de T2 siguiendo el mismo procedimiento de evaluación en cuanto a la generación de TI pero con más individuos por evento. De la etapa de siembra hasta la etapa de madurez, las plantas se pasan varias veces a través de un archivador de imágenes digital. En cada punto de tiempo se toman imágenes digitales (2048 x 1536 pixeles, 16 millones de colores) de cada planta, desde al menos 6 diferentes ángulos.

Tamiz de Sequía Las plantas de semillas T2 se cultivan en suelo en condiciones normales hasta que se acercan a la etapa principal. A continuación, se transfieren a una sección "seca", donde se mantiene irrigación. Las sondas de humedad se insertan en macetas escogidas de forma aleatoria para supervisar el contenido de agua del suelo (SWC) . Cuando S C va por debajo de umbrales determinados, las plantas son automáticamente regadas continuamente hasta que se alcanza un nivel normal de nuevo. Las plantas son entonces retransferidas a condiciones normales. El resto del cultivo (maduración de plantas, cosecha de semillas) es el mismo que para las plantas no cultivadas bajo condiciones de estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registran como se detalla para el crecimiento en condiciones normales .

Tamiz de Eficiencia de uso de nitrógeno Las plantas de arroz de semillas T2 se cultivan en el suelo en condiciones normales, excepto para la solución de nutrientes. Las macetas son regadas desde el trasplante hasta la maduración con una solución de nutrientes especifica que contiene contenido de nitrógeno N reducido (N), generalmente entre 7 a 8 veces menos. El resto del cultivo (maduraciónd e plantas, cosecha de semillas) es el mismo que para las plantas no cultivadas bajo estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registran como se detallada para el crecimiento en condiciones normales.

Tamiz de tensión por salinidad Las plantas se cultivan en un sustrato de fibras de coco y argex (proporción de 3 a 1) . Se utiliza una solución de nutrientes normal durante las dos primeras semanas después del trasplante de las plántulas en invernadero. Después de las primeras dos semanas, 25 mM de sal (NaCl) se agrega a la solución de nutrientes, hasta que las plantas son cosechadas. A continuación, se miden parámetros relacionados con semillas . 23.2 Análisis estadístico: Prueba F Se usa dos factores ANOVA (análisis de variantes) como un modelo estadístico para la evaluación general de características fenotípicas de plantas. Una prueba F se lleva a cabo en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con el gen de la presente invención. La prueba F se lleva a cabo para buscar un efecto del gen sobre todos los eventos de transformación y verificar un efecto global del gen, también conocido como un efecto del gen global. El umbral de importancia para cierto efecto de gen global se establece en un nivel de probabilidad de 5% para la prueba F. Un valor significativo de prueba F apunta a un efecto de genes, lo que significa que es no sólo la mera presencia o la posición de un gen lo que causa las diferencias en el fenotipo. 23.3 Parámetros medidos Medición de parámetros relacionados con biomasa Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez, las plantas se pasan varias veces a través de un archivador de imágenes digital. En cada punto de tiempo se toman imágenes digitales (2048 x 1536 pixeles, 16 millones de colores) de cada planta, desde por lo menos 6 diferentes ángulos. El área de superficie de las plantas (o biomasa frondosa) es determinada por el recuento que discrimina el número total de pixeles de las imágenes digitales de partes de plantas encima del fondo. Este valor es un promedio para las fotografías tomadas en el mismo punto de tiempo desde diferentes ángulos y se convirtió en un valor de superficie físico expresado en milímetros cuadrados por calibración. Los experimentos muestran que el área de superficie planta mide esta manera correlaciona con la biomasa de partes de plantas por encima del suelo. El área de terreno de arriba del área que se mide en el punto de tiempo en el que la planta había alcanzado su máxima biomasa frondosa. El vigor temprano es la post-germinación de tres semanas de zona aérea de la planta (semillero) . El aumento de la biomasa de raíz se expresa como un aumento en la biomasa total de raíz (medido como biomasa máxima de raíces observada durante la vida útil de una planta) ; o como un aumento en el índice de raíz/brote (medido como la relación entre la masa raices y masa de brotes en el periodo de crecimiento activo de raices y brotes) .

El vigor temprano es determinado por el recuento de que la cantidad total de pixeles de partes de plantas superficiales discriminados desde el fondo. Este valor fue un promedio para las fotografías tomadas en el mismo punto de tiempo desde diferentes ángulos y se convirtió en un valor de superficie físico expresado en milímetros cuadrados por calibración. Los resultados que se describen a continuación son para la post-germinación de tres semanas de plantas.

Mediciones de parámetros relacionados con semillas Las panículas primarias maduras se cosechan, cuentan, embolsan, etiquetan con código de barras y, a continuación, se secan durante tres días en un horno a 37°C. Las panículas, a continuación, se trillan y se recogen y se cuentan todas las semillas. Las cáscaras llenas se separan de las vacías usando un dispositivo de soplado de aire. Se desechan las cáscaras vacías y la fracción restante se cuenta de nuevo. La cáscara de relleno se pesa en una balanza analítica. El número de semillas de rellenos se determina contando el número de cáscaras rellenas que quedaron después del paso de separación. El rendimiento total de semillas se mide por todas cascarillas rellenas cosechadas a partir de del peso de una planta. El número total de semillas por planta se mide contando el número de hojas cosechadas a partir de una planta. El peso de Mil Granos (TKW) es extrapolado a partir de la cantidad de semillas rellenas contadas y su peso total. El índice de cosecha (HI) en la presente invención se define como la relación entre el rendimiento total de semillas y el área de terreno anterior (mm¿) , multiplicada por un factor de 106. El número total de flores por panícula tal como se define en la presente invención es la proporción entre el número total de semillas y el número de panículas primarias maduros. La tasa de relleno de semillas como se define en la presente invención es la proporción (expresada como %) del número de semillas de rellenos sobre el número total de semillas (o florales) .

Ejemplo 24: Resultados de la evaluación fenotipica de las plantas transgénicas Las plantas de arroz transgénicas que expresan un ácido nucléico, que comprende el marco abierto de lectura de al menos dos genes que codifican para, un polipéptido iSYT se evalúan en una o más de las mencionadas condiciones (las condiciones sin estrés, sequía, deficiencia de Nitrógeno) . El rendimiento de las plantas transgénicas superan a las plantas de control en uno o más rasgos relacionados con biomasa aérea (AreaMax) , raíz de biomasa (RootMax y RootThickMax) y para semillas de rendimiento (peso total de semillas, número semillas llenas, tipo de relleno, índice de cosecha) y peso de mil núcleos. Además, expresión de las plantas. Además las plantas transgénicas que comprenden ácidos nucléicos recombinantes que expresan por lo menos dos polipéptidos iSYT u homólogos de los mismos o fusiones de los mismos muestran un régimen de crecimiento más rápido (un tiempo más corto (en días) requerido entre la siembre y el día en que la planta alcanza el 90% de su biomasa final (AreaCycle) y un inicio temprano de florecimiento (Tiempo de Florecimiento: tiempo (en días) entre la siembre y la emergencia de la primera panícula) .

Claims (30)

REIVINDICACIONES

1. - Un método para mejorar rasgo relacionados con el rendimiento en una planta relativo al control de plantas, que comprende la expresión de modulación en una planta de: (i) cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codifican los dos o tres polipéptidos similares a iSYT correspondientes; o (ii) dos o tres ácidos nucléicos, cada uno codificando un polipéptido similar a iSYT único; o (iii) un ácido nucléico de acuerdo con (i) y un ácido nucléico de acuerdo con (ii), (iv) en el cual dicho polipéptido similar a iSYT se selecciona del grupo conformado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A, homólogos de los mimos y fusiones de los mismos.

2. - Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que al menos uno de los polipéptidos es un polipéptido de translocación de sarcoma sinovial (SYT) o un homólogo del mismo, dicho polipéptido SYT u homólogo del mismo preferiblemente comprende un dominio de SNH que tiene en orden creciente preferiblemente por lo menos el 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia al dominio de SNH de SEC ID NO: 670 ( IQQYLDENKSLILKIVESQNSGKLSECAENQARLQRNLMYLAAIAD) .

3. - Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el cual dichos de los ácidos nucléicos codifican los polipéptidos correspondientes seleccionados del grupo formado por los polipéptidos listados en la Tabla 3.

4. - El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha expresión modulada se efectúa mediante la introducción y expresión en una planta de ácidos nucléicos.

5. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichos ácidos nucléicos se seleccionan del grupo que consiste de los ácidos nucléicos que codifican cualquiera de las proteínas listadas en la Tabla A y las Tablas A2 a Tabla A26, o es una porción de dicho ácido nucléico, o un ácido nucléico capaz de hibridizarse con dicho ácido nucléico.

6. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual dichos ácidos nucléicos codifican un ortólogo o parálogo de cualquiera de las proteínas en la Tabla A.

7. - El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el cual dichos rasgos mejorados relacionados con el rendimiento comprenden un mayor rendimiento, preferiblemente biomasa incrementada y/o rendimiento incrementado de semillas en relación con las plantas de control.

8. - El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el cual dichos rasgos mejorados relacionados con el rendimiento se obtienen en condiciones sin estrés.

9. - El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el cual se obtienen dichos rasgos mejorados relacionados con el rendimiento en condiciones de estrés por sequía, salinidad o deficiencia de nitrógeno.

10. - El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en donde uno o más ácidos nucléicos están vinculados operablemente a un promotor de la planta, preferiblemente a un promotor constitutivo, más preferiblemente a un promotor de la GOS2, más preferiblemente a un promotor de la G0S2 de arroz.

11. - El método de acuerdo con cualquiera de uno de las reivindicaciones 1 a 10, en el cual dichos uno o más ácidos nucléicos es de origen vegetal, preferiblemente de una planta de dicotiledóneas, más preferiblemente de la familia Brassicaceae, aún más preferiblemente del género Arabidopsis, todavía más preferiblemente de Arabidopsis thaliana.

12. - La planta o parte del mismo, incluidas las semillas, que puede obtenerse mediante un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicha planta o parte del mismo comprende cualquier ácidos nucléicos dos o tres, codificación de los correspondientes dos o tres polipéptidos seleccionados del grupo formado por los polipéptidos enumeran en la Tabla A, sus homólogos y fusiones de los mismos.

13.- La construcción que comprende: (i) Cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codifican los dos o tres polipéptidos correspondientes seleccionados del grupo formado por cualquiera de los polipéptidos listados en la Tabla A o sus homólogos y fusiones de los mismos; (ii) una o más secuencias de control capaces de conducir la expresión de la secuencia de ácidos nucléicos (i), preferiblemente un promotor de la planta, más preferiblemente un promotor constitutivo, incluso más preferiblemente un promotor de la GOS2, más preferiblemente un promotor de la G0S2 de arroz; y, opcionalmente, (iii) una secuencia de finalización de la transcripción .

14.- La construcción de acuerdo con la reivindicación 12, en la que dicho ácido nucléico (i) codifica dos o tres polipéptidos seleccionados en el grupo, integrado por los polipéptidos listados en la Tabla 3.

15.- El uso de una construcción de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14, en un método para producir plantas que tienen rendimiento incrementado, particularmente biomasa incrementada y/o rendimiento de semillas incrementado en relación con las plantas de control.

16. - La planta, parte de la planta o célula de planta transformada con una construcción de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14.

17. - El método para la producción de una planta transgénica que tiene rendimiento incrementado, particularmente biomasa incrementada y/o rendimiento de semilla incrementado en relación con las plantas de control, que comprenden: (i) introducción y expresión en una planta de cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codifican los polipéptidos correspondientes seleccionados del grupo formado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A o sus homólogos y fusiones de los mismos; y (ii) el cultivo de células de plantas bajo condiciones que promueven crecimiento y desarrollo de plantas .

18.- Las plantas transgénicas que tienen rendimiento incrementado, particularmente biomasa incrementada y/o rendimiento de semillas incrementadas, con relación a las plantas de control, que dan como resultado una expresión modulada de cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codifican los polipéptidos correspondientes seleccionados del grupo formado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A o sus homólogos y fusiones de los mismos, o en una célula de plantas transgénicas derivadas de dichas planta transgénicas.

19.- La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 12, 16 ó 18, o una célula de planta transgénica derivada de los mismos, en donde la plana es una planta de cultivo o una monocotiledónea o un cereal, tales como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo Farro, esparto, sécale, escaña, teff, milo y avena.

20.- Las partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dichas partes cosechables son preferiblemente biomasa y/o semillas de brotes .

21.- Los productos derivados de una planta de acuerdo con la reivindicación 18 o 19 y/o de partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 20.

22. - La construcción de acuerdo con la reivindicación 12, en. la que dicho ácido nucléico de (i) codifica dos polipéptidos seleccionados del grupo formado por las combinaciones de la Tabla 3.

23. - El uso de una construcción de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en un método para producir plantas que tienen rendimiento incrementado, particularmente biomasa incrementada y/o rendimiento de semillas incrementada en relación con las plantas de control.

24. - La planta, parte de la planta o célula de planta transformada con una construcción de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14.

25. - El método para la producción de una planta transgénica que tiene mayor rendimiento, especialmente biomasa incrementada y/o rendimiento de semillas incrementada en. relación con las plantas de control, que comprenden: (iü) introducir y expresar en una planta uno o más ácidos nucléicos (aislados) que codifican por lo menos uno, preferiblemente polipéptidos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más seleccionados del grupo formado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A, sus homólogos y fusiones de los mismos; y (iv) cultivar la célula de la planta bajo condiciones que promueven el crecimiento y desarrollo de la planta .

26. - Las plantas transgénicas que tienen rendimiento incrementado, en particular biomasa incrementada y/o rendimiento de semillas incrementado, en relación con las plantas de control, que resultan de la expresión modulada de uno o más ácidos nucléicos (aislados) que codifican por lo menos uno, preferiblemente polipéptidos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más seleccionados del grupo formado por cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A, sus homólogos y fusiones de los mismos, o una celda de plantas transgénicas derivada de dicha planta transgénica.

27.- La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 12, 16 o 18, o una célula de planta transgénica derivada de la misma, en donde la planta es una planta de cultivo o una monocotiledónea o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo Farro, esparto, sécale, escaña, teff, milo y avena.

28.- Las partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dichas partes cosechables son preferiblemente biomasa y/o semillas de brotes .

29. - Los productos derivados de una planta de acuerdo con la reivindicación 18 o 19 y/o de partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 20.

30. - El uso de cualquiera de dos o tres ácidos nucléicos que codifican dos o tres polipéptidos seleccionados del grupo consistente de cualquiera de los polipéptidos de la Tabla A, sus homólogos y fusiones de los mismos con rendimiento incrementado, particularmente con rendimiento de semillas incrementado y/o biomasa de brotes de una planta de control . RESUMEN La presente invención se refiere generalmente al campo de biología molecular y se refiere a un método para. mejorar los rasgos relacionados con rendimiento en plantas modulando la expresión en una planta de uno o más ácidos nucléicos que codifican por lo menos dos polipéptidos iSYT (interactor de traslocación de sarcoma sinovial SYT ) . La presente invención también se refiere a plantas que tienen plantas tipo silvestre correspondientes u otras plantas de control. La invención también provee ácidos nucléicos desconocidos que codifican por lo menos dos polipéptidos iSYT y construcciones que comprenden los mismos, útiles para llevar a cabo los métodos de la invención. La invención también provee construcciones útiles en los métodos de la invención. Además, la presente invención también se refiere a un complejo de proteína basada en iSYT. También se refiere al uso del complejo para promover crecimiento de plantas y a un método para estimular la formación de complejos, sobre-expresando por lo menos dos miembros del complejo.