DE602004006477T2

DE602004006477T2 - Promotor aus reis

Info

Publication number: DE602004006477T2
Application number: DE602004006477T
Authority: DE
Inventors: Yves Hatzfeld; Willem Broekaert
Original assignee: CropDesign NV
Current assignee: CropDesign NV
Priority date: 2003-02-04
Filing date: 2004-02-04
Publication date: 2008-02-14
Anticipated expiration: 2024-02-05
Also published as: EP1801223A3; EP2182069A1; US7427676B2; WO2004070039A2; CN102586252A; ATE529524T1; CN102586251A; US8847015B2; EP1532257A2; EP2172554A1; US20090282587A1; CN104031918A; AU2004209624B2; EP2182070A1; ES2285423T3; EP2180055A1; US20060112442A1; CN1748032A; CN102586252B; US20150191737A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Pflanzenmolekularbiologie, insbesondere Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression einer operativ verknüpften Nukleinsäure in Pflanzen voranzutreiben und/oder zu regulieren vermag. Die Isolierung dieser Nukleinsäuresequenzen aus Reis sowie ihre Verwendung zum Vorantreiben und/oder Regulieren der Expression einer operativ verknüpften Nukleinsäure sind offenbart. Die vorliegende Erfindung betrifft daher Promoter, Hybridpromotoren, genetische Konstrukte, Expressionskassetten, Transformationsvektoren, Expressionsvektoren, Wirtszellen und transgene Pflanzen, welche die erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuren umfassen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zum Vorantreiben und/oder Regulieren der Expression einer Nukleinsäure und Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen.
Die Genexpression ist von der Initiation der Transkription abhängig, die über den Transkriptionsinitiationskomplex vermittelt wird. Die Genexpression ist auch von der Regulation der Transkription abhängig, wobei die Regulation bestimmt, wie stark, wann oder wo ein Gen exprimiert wird. Die Regulation der Genexpression kann über Transkriptionskontrollelemente vermittelt werden, die im allgemeinen in die Nukleinsäuresequenz eingebettet sind, die das exprimierte Gen an 5' flankiert oder stromaufwärts davon liegt. Dieser stromaufwärts gelegene Nukleinsäurebereich wird häufig als "Promoter" bezeichnet, da er die Bindung, Bildung und/oder Aktivierung des Transkriptionsinitiationskomplexes fördert und daher die Expression der 3' stromabwärts gelegenen Nukleinsäuresequenz voranzutreiben und/oder zu regulieren vermag.
Gentechnologische Veränderung von Pflanzen mit dem Ziel, einen verwendbaren Pflanzenphänotyp zu erhalten, umfaßt häufig heterologe Genexpression, die im allgemeinen durch einen Promoter vermittelt wird, der die Expression einer operativ verknüpften heterologen Nukleinsäure voranzutreiben und/oder zu regulieren vermag. Der Phänotyp der Wirtspflanze hängt lediglich von dem Beitrag der heterologen Nukleinsäure ab, aber auch von dem Beitrag des spezifischen Expressionsmusters des ausgewählten Promotors, der bestimmt, wie, wo und wann diese heterologe Nukleinsäure exprimiert wird. Demgemäß ist die Wahl des Promoters mit einem geeigneten Expressionsmuster von entscheidender Bedeutung, um den geeigneten Phänotyp zu erhalten. Ein Fachmann muß über verschiedene Promoter verfügen, um den optimalen Promoter für eine bestimmte Nukleinsäure zu bestimmen. Für viele verschiedene Wirtspflanzen ist diese Verfügbarkeit ziemlich beschränkt, und daher besteht ein andauernder Bedarf an der Bereitstellung neuer Promoter mit verschiedenen Expressionsprofilen.
Die in SEQ ID NO 18 dargestellte Nukleinsäure wurde aus Oryza sativa isoliert, und es wurde beobachtet, daß sie die Expression einer operativ verknüpften Nukleinsäure voranzutreiben und zu regulieren vermag; ihr Expressionsmuster ist ebenfalls charakterisiert worden. Daher bietet die vorliegende Erfindung eine bisher unbekannte isolierte Nukleinsäure an, die sich als Promoter eignet.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung einen isolierten Promoter bereit, der die Expression voranzutreiben und/oder zu regulieren vermag und der folgendes umfaßt:

(a) eine isolierte Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO ID 18 oder das Komplement von SEQ NO 18; oder
(b) eine isolierte Nukleinsäure mit mindestens 90% Sequenzidentität zur DNA-Sequenz gemäß ID SEQ NO 18; oder
(c) eine isolierte Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen spezifisch mit der ID DNA-Sequenz gemäß SEQ NO 18 hybridisiert; oder
(d) eine isolierte Nukleinsäure gemäß einer der Definitionen (a) bis (c), die durch eine dazwischenliegende Sequenz unterbrochen ist; oder
(e) ein Fragment von einer der Nukleinsäuren gemäß (a) bis (d), wobei dieses Fragment die Expression voranzutreiben und/oder zu regulieren vermag.

Der Begriff "isoliert", wie hier verwendet, bedeutet aus seiner ursprünglichen Quelle entfernt. Bevorzugt ist der "isolierte" Promoter frei von Sequenzen (wie proteincodierenden Sequenzen oder anderen Sequenzen am 3'-Ende), die gewöhnlich den Promoter in der genomischen DNA des Organismus, aus dem der Promoter stammt, flankieren. Weiterhin bevorzugt ist der "isolierte" Promoter auch frei von Sequenzen, die ihn natürlicherweise am 5'-Ende flankieren. Weiterhin bevorzugt kann der "isolierte" Promoter weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1,5 kb, 1,2 kb, 1 kb, 0,8 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb der Nukleotidsequenzen umfassen, die natürlicherweise mit dem Promoter in der genomischen DNA, aus dem Organismus, aus dem der Promoter stammt, vorkommen.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO 18 beschränkt. Ein Fachmann erkennt, daß Varianten oder Fragmente einer Nukleinsäure auftreten können, während die gleiche Funktionalität aufrechterhalten wird. Diese Varianten oder Fragmente können künstlich hergestellt sein (zum Beispiel mittels Gentechnologie) oder sogar in der Natur vorkommen. Daher erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf Nukleinsäurevarianten und Fragmente der SEQ ID NO 18, wobei die Varianten oder Fragmente für den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind. Solche Varianten und Fragmente sind u.a.:

(a) eine isolierte Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO ID 18 oder das Komplement von SEQ NO 18; oder
(b) eine isolierte Nukleinsäure mit mindestens 90% Sequenzidentität zur DNA-Sequenz gemäß ID SEQ NO 18; oder
(c) eine isolierte Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen spezifisch mit einer ID der DNA-Sequenzen gemäß SEQ NO 18 hybridisiert; oder
(d) eine isolierte Nukleinsäure gemäß einer der Definitionen (a) bis (c), die durch eine dazwischenliegende Sequenz unterbrochen ist; oder
(e) ein Fragment von einer der Nukleinsäuren gemäß (a) bis (d), wobei dieses Fragment die Expression voranzutreiben und/oder zu regulieren vermag.

Geeignete Varianten der SEQ ID NO 18 umfassen Homologa, die in der Reihenfolge der steigenden Bevorzugung mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit einer der Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO 18 haben.
Die prozentuale Identität kann unter Verwendung eines Alignment-Programms berechnet werden. Bevorzugt kann ein Programm zum paarweisen globalen Alignment verwendet werden, das den Algorithmus von Needleman-Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443–453, 1970) anwendet. Dieser Algorithmus maximiert die Anzahl der Übereinstimmungen und minimiert die Anzahl der Lücken. Solche Programme sind beispielsweise GAP, Needle (EMBOSS-Paket), Stretcher (EMBOSS-Paket) oder Align X (Vector NTI Suite 5.5) und können die Standardparameter (zum Beispiel eine Lückenöffnungsstrafe von 15 und eine Lückenvergrößerungsstrafe von 6,66) verwenden. Ersatzweise kann ein Programm für lokales Alignment verwendet werden, das den Algorithmus von Smith-Waterman (Advances in Applied Mathematics 2, 482–489 (1981)) anwendet. Solche Programme sind zum Beispiel Water (EMBOSS-Paket) oder Matcher (EMBOSS-Paket). "Sequenzidentität", wie hier verwendet, wird bevorzugt über die ganze Länge der Promoter berechnet, wie er durch eine der SEQ ID NO 18 dargestellt ist. Die Länge dieses Promoters beträgt 1130 Bp.
Die Suche nach und die Identifikation von homologen Nukleinsäuren lägen innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns. Solche Verfahren umfassen das Screening von Sequenz-Datenbanken mit den erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzen, zum Beispiel SEQ ID NO 18, bevorzugt in einer computerlesbaren Form. Verwendbare Sequenz-Datenbanken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank), die Nukleinsäure-Datenbank des European Molecular Biology Laboratory (EMBL) (hftp:/w.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db.html) oder Versionen davon oder die MIPS-Datenbank (http://mips.gsf.de/). Verschiedene Suchalgorithmen und unterschiedliche Software für das Alignment und den Vergleich von Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt. Solche Software umfaßt zum Beispiel GAP, BESTFIT, BLAST, FASIA und TFASTA. Bevorzugt wird BLAST-Software verwendet, die eine prozentuale Sequenzidentität berechnet und eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den Sequenzen durchführt. Die Folge von Programmen, die als BLAST-Programme bezeichnet werden, hat 5 verschiedene Anwendungen: drei wurden für Nukleotidsequenz-Abfragen entwickelt (BLASTN, BLASTX und TBLASTX) und zwei für Proteinsequenz-Abfragen (BLASTP und TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76–80, 1994; Girren et al., GenomeAnalysis, 1: 543, 1997). Die Software zur Durchführung einer BLAST-Analyse ist durch das National Centre für Biotechnology Information öffentlich zugänglich.
Die Sequenzen des Genoms von Arabidopsis thaliana und des Genoms von Oryza sativa sind nun in öffentlichen Datenbanken, wie Genbank, zugänglich. Andere Genome werden derzeit sequenziert. Daher wird erwartet, daß homologe Promoter durch Sequenzalignment mit SEQ ID NO 18 identifizierbar werden, je mehr Sequenzen von Genomen anderer Pflanzen verfügbar werden. Der Fachmann ist leicht in der Lage, homologe Promoter aus anderen Pflanzenspezies, zum Beispiel aus anderen Erntepflanzen, wie Mais, zu finden. Homologe Promoter aus anderen Erntepflanzen sind zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren bei Erntepflanzen ganz besonders geeignet.
Ein Beispiel für Homologa mit mindestens 90% Sequenzidentität mit der SEQ ID NO 18 sind allelische Varianten der SEQ ID NO 18. Allelische Varianten sind Varianten desselben Gens, die in zwei verschiedenen Individuen derselben Spezies auftreten, und gewöhnlich unterscheiden sich allelische Varianten durch geringe Sequenzänderungen. Allelische Varianten können Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) sowie kleine Insertions-/Deletionspolymorphismen (INDELs) umfassen. Die Größe der INDELs beträgt gewöhnlich weniger als 100 Bp. SNPs und INDELs bilden die größte Gruppe von Sequenzvarianten bei natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
Homologa, die zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, können mittels der PCR-Technik oder durch Hybridisierung leicht aus ihrem Ursprungsorganismus isoliert werden. Ihr Vermögen, die Expression voranzutreiben und/oder zu regulieren, kann leicht bestimmt werden, zum Beispiel indem nach den im Abschnitt Beispiele beschriebenen Verfahren vorgegangen und die im eigentlichen Beispiel verwendete Sequenz einfach durch das Homologon ersetzt wird.
Andere geeignete Varianten der SEQ ID NO 18, die von der vorliegenden Erfindung umfaßt werden, sind Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen spezifisch mit der Nukleinsäure der SEQ ID NO 18 hybridisieren. Der Begriff "hybridisieren" bedeutet das Hybridisieren im Wesentlichen homologer komplementärer Nukleotidsequenzen in einem Hybridisierungsverfahren. Werkzeuge der Molekularbiologie, die auf einem solchen Hybridisierungsverfahren beruhen, beinhalten die Polymerasekettenreaktion (PCR; und alle darauf basierenden Verfahren), subtraktive Hybridisierung, zufallsgemäße Primerverlängerung (random primer extension), Nuklease-S1-Kartierung, Primerverlängerung, reverse Transkription, cDNA-Synthese, differentielles Display von RNAs und DNA-Sequenzbestimmung, Northern-Blotting (RNA-Blotting), Southern-Blotting (DNA-Blotting). Das Hybridisierungsverfahren kann auch mit einer der komplementären Nukleinsäuren erfolgen, die an einer Matrix, wie Magnetkugeln, Sepharose-Kugeln oder jedem anderen Harz, immobilisiert sind. Werkzeuge der Molekularbiologie, die auf einem solchen Verfahren beruhen, beinhalten die Isolation von poly(A+)-mRNA. Das Hybridisierungsverfahren kann zudem mit einer der komplementären Nukleinsäuren erfolgen, die an einem festen Träger, wie einer Nitrocellulose- oder Nylon-Membran oder durch z.B. Photolithographie beispielsweise an einem Silikatglasträger immobilisiert sind (die letzteren sind als Nukleinsäurearrays oder Mikroarrays oder als Nukleinsäurechips bekannt). Werkzeuge der Molekularbiologie, die auf einem solchen Verfahren beruhen, beinhalten RNA- und DNA-Gelblotanalyse, Koloniehybridisierung, Plaquehybridisierung, In-situ-Hybridisierung und Mikroarray-Hybridisierung. Damit eine Hybridisierung erfolgen kann, werden die Nukleinsäuremoleküle im allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang in zwei Einzelstränge aufzuschmelzen und/oder Haarnadelschleifen oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen. Die Stringenz der Hybridisierung wird durch Bedingungen wie Temperatur, Salzkonzentration sowie die Hybridisierungspufferzusammensetzung, beeinflußt. Herkömmliche Hybridisierungsbedingungen sind zum Beispiel in Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, beschrieben, aber der Fachmann erkennt, daß viele verschiedene Hybridisierungsbedingungen je nach der bekannten oder erwarteten Homologie und/oder der Länge der Nukleinsäuresequenz gestaltet werden können. Hochstringenzbedingungen für die Hybridisierung sind u.a. eine hohe Temperatur und/oder eine niedrige Natrium-/Salzkonzentration (Salze umfassen Natrium, wie zum Beispiel in NaCl und Na₃-Citrat) und/oder das Hinzugeben von Formamid in den Hybridisierungspuffer und/oder das Verringern der Konzentration an Verbindungen, wie SDS (Natriumdodecylsulfat-Detergens), im Hybridisierungspuffer und/oder das Ausschließen von Verbindungen wie Dextransulfat oder Polyethylenglykol (welche die Molekülzusammenlagerung fördern), aus dem Hybridisierungspuffer. Spezifisch Hybridisieren unter stringenten Bedingungen bedeutet, daß die Sequenzen sehr ähnlich sein müssen. Eine spezifische Hybridisierung unter stringenten Bedingungen wird bevorzugt bei einer Temperatur von 60°C durchgeführt, gefolgt von Waschschritten in 0,1 bis 1 × SSC, 0,1 × SDS und 1 × SSC, 0,1 × SDS.
Eine weitere Variante der SEQ ID NO 18, die von der vorliegenden Erfindung umfaßt wird, sind Nukleinsäuren, die der SEQ ID NO 18 oder Varianten davon, wie hier vorstehend beschrieben, entsprechen, die durch eine dazwischenliegende Sequenz unterbrochen sind. Zum Beispiel kann die Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO 18 durch eine dazwischenliegende Sequenz unterbrochen sein. Mit "dazwischenliegenden Sequenzen" sind jede Nukleinsäure oder jedes Nukleotid gemeint, die/das eine andere Sequenz unterbrechen. Beispiele für dazwischenliegende Sequenzen umfassen Introns, Nukleinsäure-Tags, T-DNA und mobilisierbare Nukleinsäuresequenzen, wie Transposons oder Nukleinsäuren, die durch Rekombination mobilisiert werden können. Beispiele für bestimmte Transposons umfassen Ac (Aktivator), Ds (Dissoziation), Spm (Suppressor-Mutator) oder En. Die Einführung von Introns in Promoter wird nun weit verbreitet angewendet. Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch unter Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO 18, die mit einem Intron versehen ist, ausgeführt werden. Falls die dazwischenliegende Sequenz ein Intron ist, können alternative Spleißvarianten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren entstehen. Der Begriff "alternative Spleißvariante", wie hier verwendet, umfaßt Varianten einer Nukleinsäuresequenz, bei der dazwischenliegende Introns herausgeschnitten, ersetzt oder hinzugefügt worden sind. Solche Spleißvarianten können in der Natur zu finden oder künstlich hergestellt sein. Verfahren zur Herstellung solcher Promoter mit einem Intron oder zur Herstellung der entsprechenden Spleißvarianten sind im Stand der Technik bekannt.
Die durch eine dazwischenliegende Sequenz unterbrochenen Varianten, die sich für die Verwendung bei den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, können einfach bestimmt werden, zum Beispiel indem nach den Verfahren, die im Abschnitt Beispiele beschrieben sind, vorgegangen und einfach die in dem tatsächlichen Beispiel verwendete Sequenz durch die Variante ersetzt wird.
Die Nukleinsäurevarianten, wie hier vorstehend beschrieben, können in der Natur zu finden sein (zum Beispiel allelische Varianten oder Spleißvarianten). Zusätzlich und/oder alternativ können Varianten der SEQ ID NO 18, wie hier vorstehend beschrieben, über Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind und zum Beispiel Mutation, Substitution, Insertion, Deletionen oder Derivatisierung umfassen, künstlich hergestellt werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner solche Varianten sowie ihren Gebrauch bei den erfindungsgemäßen Verfahren.
Eine "Mutationsvariante" einer Nukleinsäure kann unter Verwendung von Verfahren zur Manipulation rekombinanter DNA oder durch Nukleotidsynthese leicht hergestellt werden. Beispiele für solche Verfahren umfassen ortspezifische Mutagenese über M13-Mutagenese, T7-Gen-In-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), ortsspezifische QuickChange-Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsspezifische Mutagenese oder andere Protokolle zur ortsspezifischen Mutagenese. Ersatzweise kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure zufallsgemäß mutiert werden.
Eine "Substitionsvariante" betrifft solche Varianten, bei denen mindestens ein Rest der Nukleinsäuresequenz entfernt worden ist und ein anderer Rest an seiner Stelle eingefügt wurde. Nukleinsäuresubstitutionen erfolgen gewöhnlich von einzelnen Resten, können aber je nach funktionellen Beschränkungen, die der Nukleinsäuresequenz auferlegt sind, als Cluster vorkommen; Insertionen liegen gewöhnlich in der Größenordnung von etwa 1 bis etwa 10 Nukleinsäureresten, und Deletionen können von etwa 1 bis etwa 20 Resten reichen.
Eine "Insertionsvariante" einer Nukleinsäure ist eine Variante, bei der ein oder mehrere Nukleinsäurereste an einer zuvor festgelegten Stelle in dieser Nukleinsäure eingebracht werden. Insertionen können 5'-terminale und/oder 3'-terminale Fusionen umfassen sowie Intra-Sequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Nukleotide. Im allgemeinen sind Insertionen innerhalb der Nukleinsäuresequenz kleiner als 5'- oder 3'-terminale Fusionen, nämlich in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Resten. Beispiele für 5'- oder 3'-terminale Fusionen sind u.a. die codierenden Sequenzen von Eindungs- oder Aktivierungsdomänen eines Transkriptionsaktivators, wie er im Two-Hybrid- oder One-Hybrid-System bei der Hefe verwendet wird, oder von Phagenhüllproteinen, (Histidin)₆-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltosebindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG^®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulinbindungspeptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.
Der Begriff "Derivat" einer Nukleinsäure kann Substitutionen und/oder Deletionen und/oder Additionen von natürlicherweise und nicht natürlicherweise vorkommenden Nukleinsäureresten verglichen mit der natürlichen Nukleinsäure umfassen. Derivate können zum Beispiel methylierte Nukleotide oder künstliche Nukleotide umfassen.
Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt sind Promoter, die ein Fragment der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO 18 oder Varianten davon, wie hier vorstehend beschrieben, umfassen. Ein "Fragment", wie hier verwendet, bedeutet einen Teil einer Nukleinsäuresequenz. Geeignete Fragmente, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sind, sind funktionelle Fragmente, die mindestens einen der funktionellen Teile des Promoters zurückbehalten und die folglich immer noch die Expression voranzutreiben und/oder zu regulieren vermögen. Beispiele für funktionelle Fragmente eines Promotors umfassen den minimalen Promoter, die stromaufwärts gelegenen regulatorischen Elemente oder jede Kombination davon.
Geeignete Fragmente können von mindestens etwa 20 Basenpaaren oder etwa 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 oder 1000 Basenpaaren bis zu etwa der erfindungsgemäßen Vollängensequenz reichen. Diese Basenpaare liegen gewöhnlich unmittelbar stromaufwärts des Transkriptionsinitiationsstarts, können aber ersatzweise von einer beliebigen Stelle in der Promotersequenz sein.
Geeignete Fragmente, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sind, können auf ihr Vermögen, die Expression voranzutreiben und/oder zu regulieren, durch dem Fachmann bekannte Standardverfahren oder durch das folgende, im Abschnitt Beispiele beschriebene Verfahren untersucht werden.
Der gemäß SEQ ID NO 18 offenbarte Promoter wird als eine Nukleinsäure von annähernd 1,2 kb aus dem stromaufwärts gelegenen Bereich einer bestimmten codierenden Sequenz von Reis (CDS) isoliert. Diese Nukleinsäure kann übliche Elemente eines Promoters umfassen, die in 1 dargestellt sind. Im Allgemeinen kann ein Promoter von der codierenden Sequenz in Stromaufwärtsrichtung folgendes umfassen: (i) eine 5'-UTR der Prä-Boten-RNA, (ii) einen minimalen Promoter, der das Transkriptionsinitiationselement (INR) und weiter stromaufwärts eine TATA-Box umfaßt, und kann (iii) regulatorische Elemente enthalten, die das spezifische Expressionsmuster des Promoters festlegen.
Der Begriff "Promoter", wie hier verwendet, wird in einem breiten Kontext verwendet und bezeichnet regulatorische Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der Sequenzen mit denen sie operativ verknüpft sind, zu bewirken (voranzutreiben und/oder zu regulieren) vermögen. Ein "Promoter" umfaßt Transkriptionsregulationssequenzen, die von einem klassischen genomischen Gen stammen. In der Regel umfaßt ein Promoter eine TATA-Box, die den Transkriptionsinitiationskomplex an die richtige Transkriptionsinitiationsstartstelle zu lenken vermag. Einige Promoter haben jedoch keine TATA-Box (TATA-freie Promoter), sind aber immer noch vollständig funktionsfähig beim Vorantreiben und/oder Regulieren der Expression. Ein Promoter kann zusätzlich eine CCAAT-Box-Sequenz und zusätzliche regulatorische Elemente (d.h. stromaufwärts gelegene, aktivierende Sequenzen oder cis-Elemente, wie Enhancer und Silencer) umfassen. Ein "Promoter" kann auch die Transkriptionsregulationssequenzen eines klassischen prokaryotischen Gens umfassen und umfaßt in diesem Fall eine -35-Box-Sequenz und/oder eine -10-Box-Transkriptionsregulationssequenzen.
"Vorantreiben der Expression", wie hier verwendet, bedeutet das Fördern der Transkription einer Nukleinsäure.
"Regulieren der Expression", wie hier verwendet, bedeutet das Beeinflussen der Höhe, der Zeit oder des Ortes der Transkription einer Nukleinsäure. Die erfindungsgemäßen Promoter können folglich dazu verwendet werden, die Transkription einer Nukleinsäure zu steigern, zu vermindern oder ihren Zeitpunkt und/oder ihren Ort zu verändern. Zum Beispiel können sie dazu verwendet werden, die Transkription auf bestimmte Zelltypen, Gewebe oder Organe, oder auf eine gewisse Zeitdauer oder auf eine Antwort auf bestimmte Umweltbedingungen zu beschränken.
Der Promoter ist vorzugsweise ein in Pflanzen expressionsfähiger Promoter. Der Begriff "in Pflanzen expressionsfähig" bedeutet, daß er in der Lage ist, die Expression in einer Pflanze, einer Pflanzenzelle, einem Pflanzengewebe und/oder einem Pflanzenorgan zu regulieren. Demgemäß umfaßt die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure, wie vorstehend erwähnt, welche die Transkription einer operativ verknüpften Nukleinsäure in einer Pflanze oder in einer oder mehreren bestimmten Zellen, Geweben oder Organen einer Pflanze zu regulieren vermag.
Die erfindungsgemäßen Promoter zeigen ein konstitutives Expressionsmuster. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung einen Promoter, wie hier vorstehend beschrieben, bereit, der ein konstitutiver Promoter ist. Der Begriff "konstitutiv" bedeutet, daß er keinen oder sehr wenigen räumlichen oder zeitlichen Beschränkungen unterliegt. Der Begriff "konstitutive Expression", wie hier verwendet, bezeichnet eine im wesentlichen kontinuierliche Expression in im wesentlichen allen Geweben des Organismus. Der Fachmann versteht, daß ein "konstitutiver Promoter" ein Promoter ist, der während der meisten, aber nicht notwendigerweise aller, Wachstums- und Entwicklungsphasen des Organismus und in den meisten, aber nicht notwendigerweise allen, Teilen eines Organismus aktiv ist.
Das "Expressionsmuster" eines Promotors wird nicht nur durch räumliche und zeitliche Aspekte beeinflußt, sondern auch durch die Höhe der Expression. Die Höhe der Expression wird durch die sogenannte "Stärke" eines Promotors bestimmt. Je nach der erhaltenen Expressionshöhe wird hier eine Unterscheidung zwischen "schwachen" und "starken" Promoter getroffen. Im Allgemeinen steht "schwacher Promoter" für einen Promoter, der die Expression einer operativ verknüpften Nukleinsäure in einer Höhe von etwa 1/10000 Transkripten bis etwa 1/100000 bis etwa 1/500000 Transkripten vorantreibt. Im Allgemeinen bezeichnet "starker Promoter" einen Promoter, der die Expression in einer Höhe von etwa 1/10 Transkripten bis etwa 1/100 oder bis etwa 1/1000 Transkripten vorantreibt.
Nach einer bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung einen isolierten Promoter, wie vorstehend erwähnt, bereit, der ein Hybridpromotor ist. Der Begriff "Hybridpromotor", wie hier verwendet, bezeichnet einen chimären Promoter, der zum Beispiel synthetisch hergestellt ist, zum Beispiel durch Gentechnik. Bevorzugte erfindungsgemäße Hybridpromotoren umfassen einen Teil, bevorzugt einen funktionellen Teil, von einem der erfindungsgemäßen Promoter und mindestens einen anderen Teil, bevorzugt einen funktionellen Teil, eines Promotors. Der letztere Teil kann ein Teil eines beliebigen Promotors, einschließlich eines beliebigen erfindungsgemäßen Promotors und anderer Promoter, sein. Ein Beispiel für einen Hybridpromotor umfaßt (ein) regulatori-sche(s) Element(e) eines erfindungsgemäßen Promotors in Kombination mit dem minimalen Promoter eines anderen Promotors. Ein weiteres Beispiel für einen Hybridpromotor ist ein Promoter, der zusätzliche regulatorische Elemente umfaßt, um seine Aktivität weiter zu steigern und/oder sein räumliches und/oder zeitliches Expressionsmuster zu verändern.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines funktionellen Fragments der SEQ ID NO 18 oder einer Variante davon zur Veränderung des Expressionsmusters eines Promotors bereit. Bei solchen Verfahren wird mindestens ein Teil einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit mindestens einem Fragment eines anderen Promotors kombiniert.
Zudem stellt die Erfindung ein Genkonstrukt bereit, das folgendes umfaßt:

(a) einen isolierten Promoter, wie hier vorstehend definiert; und
(b) eine heterologe Nukleinsäuresequenz, die mit dem isolierten Promoter von (a) operativ verknüpft ist; sowie gegebenenfalls
(c) einen 3'-Transkriptionsterminator.

Der Begriff "Genkonstrukt", wie hier verwendet, bedeutet eine Nukleinsäure, die durch Gentechnik hergestellt wird.
Der Begriff "operativ verknüpft" mit einem Promoter, wie hier verwendet, bedeutet, daß die Transkription durch diesen Promoter angetrieben und/oder reguliert wird. Ein Fachmann versteht, daß operativ verknüpft mit einem Promoter vorzugsweise bedeutet, daß der Promoter stromaufwärts (d.h. am 51 Ende) von der operativ verknüpften Nukleinsäure positioniert ist. Der Abstand zu der operativ verknüpften Nukleinsäure kann variabel sein, solange der erfindungsgemäße Promoter die Transkription der operativ verknüpften Nukleinsäure voranzutreiben und/oder zu regulieren vermag. Zum Beispiel kann sich zwischen dem Promoter und der operativ verknüpften Nukleinsäure eine Klonierungs-stelle, ein Adapter, ein Transkriptions- oder Translationsenhancer befinden.
Die operativ verknüpfte Nukleinsäure kann jede beliebige codierende oder nicht-codierende Nukleinsäure sein. Die operativ verknüpfte Nukleinsäure kann in Sense- oder Antisense-Richtung vorliegen. Im Fall einer gentechnologischen Veränderung von Wirtszellen muß die operativ verknüpfte Nukleinsäure in der Regel in die Wirtszelle eingebracht werden und soll den Phänotyp der Wirtszelle verändern. Alternativ ist die operativ verknüpfte Nukleinsäure eine endogene Nukleinsäure aus der Wirtszelle.
Der Begriff "heterolog", wie hier verwendet, soll "heterolog zu dem erfindungsgemäßen Promoter" bedeuten. Eine Nukleinsäure, die zu dem erfindungsgemäßen Promoter heterolog ist, kommt nicht natürlicherweise in den Nukleinsäuresequenzen vor, die den erfindungsgemäßen Promoter flankieren, wenn er sich in seiner biologischen Genomumgebung befindet. Zwar kann die Nukleinsäure für den erfindungsgemäßen Promoter heterolog sein, aber sie kann homolog oder nativ oder heterolog oder fremd für die Pflanzenwirtszelle sein. Die heterologe, operativ verknüpfte Nukleinsäure kann eine beliebige Nukleinsäure sein (die zum Beispiel ein Protein codiert), vorausgesetzt daß sie mindestens ein Nukleotid umfaßt oder von mindestens einem Nukleotid flankiert wird, das den erfindungsgemäßen Promoter normalerweise nicht flankiert.
Der Begriff "Transkriptionsterminator", wie in (c) verwendet, betrifft eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit, welche die Termination der Transkription signalisiert. Terminatoren sind 3'-untranslatierte DNA-Sequenzen, die gewöhnlich ein Polyadenylierungssignal enthalten, das die Anfügung von Polyadenylatsequenzen an das 3'-Ende eines Primärtranskripts erleichtert. Terminatoren, die in Viren, Hefen, Schimmelpilzen, Bakterien, Insekten, Vögeln, Säugern und Pflanzen aktiv und/oder aus diesen isoliert sind, sind bekannt und in der Literatur beschrieben. Beispiele für Terminatoren, die für die Verwendung bei den erfindungsgemäßen Genkonstrukten geeignet sind, sind u.a. der Terminator des Nopalinsynthase-(NOS-)Gens aus Agrobacterium tumefaciens, die Terminatorsequenz des Octopinsynthase-(OCS-)Gens aus Agrobacterium tumefaciens, die Terminatorsequenz des 35S-Gens aus dem Blumenkohlmosaikvirus (CaMV), die ADP-Glucosepyrophosphorylase-Terminatorsequenz (t3'Bt2) aus Oryza sativa, die Terminatorsequenz des Zein-Gens aus Zea mays, der Terminator des rbcs-1A-Gens und die Terminatorsequenzen des rbcs-3A-Gens.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Expressionskassette, einen Transformationsvektor oder einen Pflanzenexpressionsvektor bereit, die ein Genkonstrukt, wie vorstehend beschrieben, umfassen.
Hier ist mit einer "Expressionskassette" ein minimales Genkonstrukt gemeint, das für die Expression einer Nukleinsäure notwendig ist. Eine übliche Expressionskassette umfaßt eine Promoter-Gen-Terminator-Kombination. Eine Expressionskassette kann zusätzlich Klonierungsstellen, zum Beispiel Gateway^TM-Rekombinationsstellen oder Restriktionsenzymerkennungs stellen, umfassen, damit eine einfache Klonierung der operativ verknüpften Nukleinsäure oder der einfache Transfer der Expressionskassette in einen Vektor möglich werden. Eine Expressionskassette kann zudem 5'-untranslatierte Bereiche, 3'-untranslatierte Bereiche, einen selektierbaren Marker, Transkriptionsenhancer oder Translationsenhancer umfassen.
Mit "Transformationsvektor" ist ein Genkonstrukt gemeint, das durch Transformation in einen Organismus eingebracht und in diesem Organismus stabil aufrechterhalten werden kann. Einige Vektoren können zum Beispiel in Escherichia coli, A. tumefaciens, Saccharomyces cerevisiae oder Schizosaccharomyces pombe aufrechterhalten werden, während andere, wie Phagemide und Cosmidvektoren, in Bakterien und/oder Viren aufrechterhalten werden können. Transformationsvektoren können in ihren Wirtszellen vervielfältigt und daraus wieder isoliert werden, um in eine andere Wirtszelle transformiert zu werden. Im Allgemeinen umfassen Vektorsequenzen einen Satz von einzigartigen Stellen, die von Restriktionsenzymen erkannt werden, die Multiple Klonierungsstelle (MCS), in die eine oder mehrere Nicht-Vektorsequenz(en) inseriert werden kann (können). Vektorsequenzen können zudem einen Replikationsursprung umfassen, der zur Aufrechterhaltung und/oder Replikation bei einer spezifischen Wirtszelle erforderlich ist. Beispiele für Replikationsursprünge sind u.a., sind aber nicht beschränkt auf den f1-ori und colE1.
"Expressionsvektoren" bilden eine Untergruppe der Transformationsvektoren, welche die Expression der inserierten Nicht-Vektorsequenz(en) ermöglichen, weil sie die geeigneten regulatorischen Sequenzen umfassen. Es sind Expressionsvektoren beschrieben worden, die sich für die Expression in Bakterien (z.B. E. coli), Pilzen (z.B. S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris), Insektenzellen (z.B. Baculovirus-Expressionsvektoren), Tierzellen (z.B. COS- oder CHO-Zellen) und Pflanzenzellen eignen. Ein erfindungsgemäß geeigneter Expressionsvektor ist ein Pflanzenexpressionsvektor, der für die Transformation von Pflanzenzellen, die stabile Integration in das Pflanzengenom, die Aufrechterhaltung in der Pflanzenzelle und die Expression der Nicht-Vektorsequenzen in der Pflanzenzelle geeignet ist.
Gewöhnlich umfaßt ein erfindungsgemäßer Pflanzenexpressionsvektor eine Nukleinsäure der SEQ ID NO 18 oder eine Variante davon, wie hier vorstehend beschrieben, die gegebenenfalls operativ mit einer zweiten Nukleinsäure verknüpft ist. Üblicherweise umfaßt ein erfindungsgemäßer in Pflanzen exprimierbarer Vektor außerdem T-DNA-Bereiche für die stabile Integration in das Pflanzengenom (zum Beispiel die linken und rechten Grenzbereiche des Ti-Plasmids).
Die erfindungsgemäßen Genkonstrukte können zudem einen "selektierbaren Marker" umfassen. Wie hier verwendet, beinhaltet der Begriff "selektierbarer Marker" jedes Gen, das einer Zelle, in der es exprimiert wird, einen Phänotyp verleiht, so daß die Identifikation und/oder Selektion von Zellen, die transfiziert oder transformiert werden, erleichtert wird. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, die eine Antibiotika- oder Herbizidresistenz verleihen. Zellen, die das Genkonstrukt enthalten, überleben so Antibiotika- oder Herbizidkonzentrationen, die untransformierte Zellen abtöten. Beispiele für selektierbare Markergene sind u.a. Gene, die eine Resistenz gegen Antibiotika verleihen (wie nptII, das die Neomycinphospho-transferase codiert, die Neomycin und Kanamycin zu phosphorylieren vermag, oder hpt, das die Hygromycin-phosphotransferase codiert, die Hygromycin zu phospho-rylieren vermag), gegen Herbizide (zum Beispiel bar, das eine Resistenz gegen Basta bereitstellt; aroA oder gox, die Resistenz gegen Glyphosat bereitstellen), oder Gene, die ein Stoffwechselmerkmal bereitstellen (wie manA, das es der Pflanze ermöglicht, Mannose als alleinige Kohlenstoffquelle zu nutzen). Sichtbare Markergene führen zur Bildung von Farbe (zum Beispiel beta-Glucuronidase, GUS), Lumineszenz (wie Luciferase) oder Fluoreszenz (grün fluoreszierendes Protein, GFP, und Derivate davon). Weitere Beispiele für geeignete selektierbare Markergene sind u.a. die Ampicillinresistenz (Ampr), das Tetracyclin-Resistenzgen (Tcr), das bakterielle Kanamycin-Resistenzgen (Kanr), das Phosphinothricin-Resistenzgen und das Chloramphenicol-Resistenzgen (CAT).
Zudem umfaßt die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle, die einen erfindungsgemäßen isolierten Promoter oder ein erfindungsgemäßes Genkonstrukt oder eine erfindungsgemäße Expressionskassette oder einen erfindungsgemäßen Transformationsvektor oder einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor, wie hier vorstehend beschrieben, enthält. Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird die Wirtszelle aus bakteriellen, Algen-, Pilz-, Hefe-, pflanzlichen, Insekten- oder tierischen Wirtszellen ausgewählt.
Bei einer bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanzenzelle bereit, die einen erfindungsgemäßen isolierten Promoter oder eine erfindungsgemäße isolierte Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Genkonstrukt oder eine erfindungsgemäße Expressionskassette oder einen erfindungsgemäßen Transformationsvektor oder einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor, wie hier vorstehend beschrieben, enthält. Bevorzugt ist die Pflanzenzelle eine Dikotyledonen-Pflanzenzelle oder eine Monokotyledonen-Pflanzenzelle, stärker bevorzugt eine Zelle irgendeiner der hier erwähnten Pflanzen. Vorzugsweise ist in der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzelle der erfindungsgemäße Promoter oder das erfindungsgemäße Genkonstrukt stabil in das Genom der Pflanzenzelle integriert.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze bereit, das folgendes umfaßt:

(a) Einführen des erfindungsgemäßen isolierten Promotors der SEQ ID NO 18 oder einer Variante oder eines Fragments davon oder eines erfindungsgemäßen Genkonstrukts oder einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder eines erfindungsgemäßen Transformationsvektors oder eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors und wie hier vorstehend beschrieben in eine Pflanzenzelle, sowie
(b) Kultivieren dieser Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum fördern.

Das "Einführen" des vorstehend erwähnten isolierten Promotors oder des Genkonstrukts oder der Expressionskassette oder des Transformationsvektors oder des Expressionsvektors in eine Wirtszelle (z.B. eine Pflanzenzelle) wird vorzugsweise durch Transformation erreicht. Der Begriff "Transformation", wie hier verwendet, umfaßt den Transfer eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle unabhängig von dem für den Transfer verwendeten Verfahren. Bei Pflanzen sind insbesondere Gewebe, die entweder durch Organogenese oder Embryogenese zu klonaler Vermehrung in der Lage sind, für die Transformation mit einem erfindungsgemäßen Genkonstrukt geeignet, und eine komplette Pflanze kann daraus regeneriert werden. Das bestimmte ausgewählte Gewebe variiert je nach den klonalen Vermehrungssystemen, die für die bestimmte transformierte Pflanzenspezies verfügbar und am besten geeignet sind. Beispielhafte Gewebeziele sind u.a. Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallusgewebe, bestehendes Meristemgewebe (z.B. apikales Meristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z.B. Kotyledonenmeristem und Hypokotylmeristem). Das Polynukleotid kann in eine Pflanzenzelle vorübergehend oder stabil eingeführt werden und kann nicht-integriert aufrechterhalten werden, zum Beispiel als ein Plasmid. Ersatzweise kann es in das Pflanzengenom integriert werden.
Die Transformation einer Pflanzenspezies ist inzwischen praktisch ein Routineverfahren. Vorteilhafterweise kann eines von mehreren Transformationsverfahren verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in eine geeignete Vorläuferzelle einzuführen. Transformationsverfahren umfassen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, welche die Aufnahme freier DNA erhöhen, Injektion von DNA direkt in die Pflanze, Teilchenkanonenbeschuß, Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen und Mikroprojektion. Die Verfahren können aus dem Calcium/Polyethylenglykol-Verfahren für Protoplasten (Krens, F.A. et al., 1882, Nature 296, 72–74; Negrutiu I. et al., Juni 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363–373); Elektroporation von Protoplasten (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol 3, 1099–1102); Mikroinjektion in Pflanzenmaterial (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen Genet 202, 179–185); Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Partikeln (Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), Infektion mit (nicht-integrierenden) Viren und dergleichen ausgewählt werden. Ein bevorzugtes Transformationsverfahren für die Herstellung erfindungsgemäßer transgener Pflanzenzellen ist ein Agrobacterium-vermitteltes Transformationsverfahren.
Transgene Reispflanzen, die einen erfindungsgemäßen Promoter umfassen, werden vorzugsweise über eine Agrobacterium-vermittelte Transformation unter Verwendung eines der bekannten Verfahren zur Reistransformation hergestellt, wie die in einer der folgenden Veröffentlichungen beschriebenen: in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta, 199, 612–417, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3) 491–506, 1993); Hiei et al. (Plant J. 6 (2) 271–282, 1994); deren Offenbarungen hier durch Bezugnahme aufgenommen sind, als seien sie vollständig ausgeführt. Im Fall der Maistransformation ist das bevorzugte Verfahren, wie entweder in Ishida et al. (Nat. Biotechnol. Juni 1996; 14(6):745–50) oder Frame et al. (Plant Physiol. Mai 2002; 129(1):13–22) beschrieben, deren Offenbarungen hier durch Bezugnahme aufgenommen sind, als seien sie vollständig dargelegt.
Im Allgemeinen werden Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen nach der Transformation auf die Anwesenheit von einem oder mehreren Markern selektiert, die von durch Pflanzen exprimierbaren Genen codiert werden, die zusammen mit dem Gen von Interesse übertragen werden (und unter der Kontrolle eines erfindungsgemäßen Promoter stehen könnten), wonach das transformierte Material unter Bedingungen kultiviert werden kann, die das Pflanzenwachstum fördern.
Die erhaltene transformierte Pflanzenzelle kann dann dazu verwendet werden, eine transformierte Pflanze in einer dem Fachmann bekannten Weise zu regenerieren. Demgemäß kann das Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, wie hier vorstehend beschrieben, zudem das Regenerieren einer Pflanze aus der Pflanzenzelle von (a) umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem eine Pflanze bereit, die eine Pflanzenzelle, wie hier vorstehend beschrieben, umfaßt. Die Pflanzen vermögen auch zu wachsen oder sogar Reife zu erlangen, einschließlich zum Beispiel der Fruchtproduktion, Samenbildung, Samenreifung und des Samenabwurfs.
Zudem können Nachkommen aus diesen Samen erzeugt werden, wobei die Nachkommen fruchtbar sein können. Ersatzweise oder zusätzlich können die transformierten und regenerierten Pflanzen auch Nachkommen durch ungeschlechtliche Vermehrung, wie Klonierung, Pfropfung, erzeugen. Die erzeugten transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln vermehrt werden, wie mittels klonaler Vermehrung oder klassischer Zuchtverfahren. Zum Beispiel kann eine erste Generation (oder T1) transformierter Pflanzen selbstbestäubend sein, so daß homozygote Transformanten der zweiten Generation (oder T2) erhalten werden, und die T2 Pflanzen durch klassische Zuchtverfahren weiter vermehrt werden.
Die erzeugten transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen annehmen. Zum Beispiel können sie Chimären von transformierten Zellen und nicht-transformierten Zellen sein; klonale Transformanten (z.B. alle Zellen, die derart transformiert wurden, daß sie die Expressionskassette enthalten); Pfröpflinge von transformierten und untransformierten Geweben (bei Pflanzen z.B. ein transformierter Wurzelstock, der auf einem untransformierten Spross gepfropft wird).
Nach DNA-Transfer und Wachstum der transformierten Zellen können die mutmaßlich transformierten Pflanzenzellen oder Pflanzen zum Beispiel unter Verwendung von Southern-Analyse auf die Anwesenheit des Gens von Interesse, die Kopienzahl und/oder die genomische Organisation untersucht werden. Ersatzweise oder zusätzlich können die Expressionshöhen oder Expressionsmuster der neu eingeführten DNA unter Verwendung von Northern- und/oder Western-Analyse untersucht werden, wobei beide Verfahren dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf Pflanzen, die durch eines der erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind, wobei die Pflanzen einen der erfindungsgemäßen isolierten Promoter oder eines der erfindungsgemäßen Konstrukte umfassen. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich eindeutig auf alle Pflanzenteile und Ableger einer solchen Pflanze. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich derart weiter, daß sie die Nachkommen von einer primären transformierten Zelle, eines Gewebes, eines Organs oder der ganzen Pflanze umfaßt, die durch eines der vorstehend erwähnten Verfahren hergestellt wurden, wobei die einzige Anforderung ist, daß die Nachkommen das (die) gleiche(n) genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) zeigen, wie diejenigen, die in den Eltern durch die erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt wurden. Die Erfindung erstreckt sich auch auf erntefähige Teile einer Pflanze, wie Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängelkulturen, Stängel, Rhizome, Wurzeln, Wurzelknollen, Blumenzwiebeln und Baumwollfasern, sind aber nicht darauf beschränkt.
Der Begriff "Pflanze" oder "Pflanzen", wie hier verwendet, umfaßt ganze Pflanzen, Vorläufer und Nachkommen von Pflanzen und Pflanzenteile, einschließlich Samen, Schößlinge, Stängel, Wurzeln (einschließlich Wurzelknollen) und Pflanzenzellen, Gewebe und Organe. Der Begriff "Pflanze" umfaßt daher auch Suspensionskulturen, Embryonen, meristematische Bereiche, Kallusgewebe, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen. Pflanzen, die ganz besonders für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, umfassen alle Pflanzen, die zur Superfamilie der Viridiplantae gehören, insbesondere Monokotyledonen- und Dikotyledonen-Pflanzen, einschließlich einer Futter- oder Grobfutterleguminose, einer Zierpflanze, eines Futtergetreides, eines Baums oder einer Staude aus der Reihe Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, Amaranth, Artischocke, Spargel, Brokkoli, Rosenkohl, Kohl, Canola, Karotte, Blumenkohl, Sellerie, Staudenkohl, Flachs, Grünkohl, Linse, Raps, Okra, Zwiebel, Kartoffel, Reis, Sojabohne, Stroh, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Sonnenblume, Tomate, Kürbis und Tee, Bäume und Algen unter anderem. Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine Erntepflanze, wie Sojabohne, Sonnenblume, Canola, Alfalfa, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel, Tabak, Kürbis, Papaya, Pappel, Leguminosa, Flachs, Lupinus oder Sorghum. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine monokotyledone Pflanze, wie Zuckerrohr, weiterhin bevorzugt eine Getreidepflanze, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen oder Hafer.
Die Erfindung stellt zudem ein Verfahren bereit zum Vorantreiben und/oder zum Regulieren der Expression einer Nukleinsäure in einer Pflanze oder Pflanzenzelle, das folgendes umfaßt:

(a) Operatives Verknüpfen einer Nukleinsäure mit einer erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäure, wie vorstehend beschrieben, wie mit SEQ ID NO 18 oder einer Variante oder einem Fragment davon, sowie
(b) Einführen des erhaltenen Genkonstrukts in eine Pflanze oder Pflanzenzelle.

Vorzugsweise ist die operativ verknüpfte Nukleinsäure von (a) heterolog zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.
Dieses Verfahren kann zudem die Kultivierung der transformierten Pflanze oder Pflanzenzelle unter Bedingungen umfassen, die das Wachstum, die Regeneration und/oder die Reifung fördern.
Darüber hinaus kann die Expression der operativ verknüpften Nukleinsäure in bestimmten Zellen, Geweben oder Organen einer Pflanze vorangetrieben und/oder reguliert werden. Demgemäß stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, wie vorstehend beschrieben, wobei die Expression eine konstitutive Expression oder eine gewebespezifische Expression ist. Für diese Ausführungsformen wird auf den Abschnitt Beispiele Bezug genommen, in dem die spezifischen Expressionsmuster der erfindungsgemäßen Promoter beschrieben sind und verschiedene Typen der gewebespezifischen Expression ausführlich beschrieben sind.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner die Verwendung einer isolierten Nukleinsäure, wie hier vorstehend definiert, um die Expression einer operativ verknüpften Nukleinsäure voranzutreiben und/oder zu regulieren.
Der Fachmann erkennt, daß die Bereitstellung der SEQ ID NO 18 die Werkzeuge zur Isolation ähnlicher Promoter leicht zugänglich macht, die im wesentlichen Sequenzidentität zu SEQ ID NO 18 besitzen. Weiterhin macht die Bereitstellung der SEQ ID NO 40 (CDS, die dem erfindungsgemäßen Promoter entspricht, siehe Tabelle 1) die Werkzeuge zur Isolation ähnlicher Promoter leicht zugänglich, unter denen die verwandten CDSs im wesentlichen Sequenzidentität zur SEQ ID NO 40 aufweisen können. Daher umfaßt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Isolation von Nukleinsäuren, welche die Expression einer operativ verknüpften Nukleinsäure voranzutreiben und/oder zu regulieren vermögen, umfassend das Screening einer Nukleinsäuresequenz-Datenbank, um Homologa der Sequenz, die durch SEQ ID NO 18 oder SEQ ID NO 40 dargestellt wird, zu finden. Anschließend werden diese Homologa dazu verwendet, eine Bank mit genomischer DNA zu screenen, wobei die Bank zum Beispiel aus dem Ursprungsorganismus des vorstehend erwähnten Homologons hergestellt ist. Das Screeningverfahren kann zum Beispiel Hybridisierung umfassen. Anschließend wird die genomische DNA, die mit dem Homologon übereinstimmt, analysiert, um die Transkriptionsinitiationsstelle und die Translationsinitiationsstelle des Gens, das dem Homologon entspricht, zu identifizieren. Zuletzt werden spezifische Primer zur Amplifikation einer Nukleinsäure gestaltet, die in dem Bereich stromaufwärts (am 5'-Ende) der Translationsinitiationsstelle lokalisiert ist.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf die Identifikation regulatorischer Proteine, die an der Regulation der Aktivität der erfindungsgemäßen Promoter beteiligt sind. Eine solche Identifikation kann unter Verwendung eines Hefe-One-Hybrid-Systems erreicht werden. Bei einem solchen Hefe-One-Hybrid-System ist die Sequenz gemäß SEQ ID NO 18 operativ mit dem GAL-Transkriptionsaktivator verknüpft und wird in eine Hefezellkultur transformiert. Diese Hefezellkultur wird wiederum mit einer Bank von Konstrukten transformiert, die Kandidaten-Regulationsfaktoren codiert.
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die nachstehenden Figuren beschrieben, worin:
1 eine allgemeine schematische Darstellung eines Promoters zeigt. Regulatorische Elemente sind Sequenzen, die zum Beispiel für eine spezielle und/oder zeitliche Regulation der Promoteraktivität verantwortlich sein können. Der minimale Promoter ist die minimale Sequenz, die notwendig und ausreichend ist, um die Expression voranzutreiben. Er umfaßt eine TATA-Box, die notwendig ist, um die RNA-Polymerase II genau an die Transkriptionsinitiationsstelle zu lenken. Das Transkriptionsinitiationselement (INR) umfaßt die Transkriptionsinitiationsstartstelle. Der 5'-untranslatierte Bereich (5'UTR) ist der Bereich, der in Prä-Boten-RNA und gegebenenfalls in mRNA transkribiert wird, aber nicht in Protein translatiert wird. Das Translations-initiationscodon wird durch den Startcodon ATG dargestellt.
2 ist eine Karte des Vektors p4581, der zur Expression eines β-Glucuronidase-(GUS-)Gens in Pflanzen unter der Kontrolle eines der erfindungsgemäßen Promoter verwendbar ist. Dieser binäre Vektor umfaßt eine Gateway-Rekombinationskassette, die für die Rekombinationsklonierung eines der erfindungsgemäßen Promoter vor das Escherichia-coli-β-Glucuronidase-(GUS-)Gen geeignet ist. Diese Kassette enthält ein Chloramphenicolresistenzgen (CamR) und das Suizidgen ccdB zur Gegenselektion nicht-rekombinierter Plasmide. Diese GUS-Expressionkassette umfaßt zudem die doppelte Terminatorsequenz T-zein und T-rbcS-deltaGA. Diese Expressionskassette befindet sich im linken Rand (LB-Repeat, LB Ti C58) und im rechten Rand (RB-Repeat, RB Ti C58) des Nopalin-Ti-Plasmids. In diese Randbereiche sind auch selektierbare Markergene und ein screenbares Markergene kloniert, die jeweils unter der Kontrolle eines konstitutiven Promoters und einer Terminatorsequenz stehen. Dieser Vektor enthält auch einen Replikationsursprung (pBR322) für die Replikation in Bakterien und einen bakteriellen selektierbaren Marker (Spe/SmeR) für die Selektion in Bakterien.
Die folgenden Figuren zeigen die Ergebnisse der GUS-Färbungen von Pflanzen oder Pflanzenteilen, die mit dem Reportervektor p4581 transformiert wurden, der einen erfindungsgemäßen Promoter trägt, der operativ mit dem Reportergen GUS verknüpft ist. Pflanzen, die als "C-Pflanzen" bezeichnet sind, sind transgene Pflanzen, die bis zu etwa 5 cm gewachsen sind; Pflanzen, die als "B-Pflanzen" bezeichnet sind, sind bis etwa 10 cm gewachsen; und Pflanzen, die als "A-Pflanzen" bezeichnet sind, sind bis zur Reife ausgewachsen. Diese A-Pflanzen werden dazu verwendet, verschiedene Gewebeproben von alten Blättern, jungen Blättern und Samen zu sammeln.
3 zeigt das Expressionsmuster von PRO0170 (High-Mobility-Group-Protein, SEQ ID NO 18). Die GUS-Färbung ist in der ganzen Pflanze stark sichtbar, wie durch die "B-Pflanzen" (A) und verschiedene Gewebe, wie alte Blätter, junge Blätter und Samen (B) sowie Calli (C) (konstitutive Expression) veranschaulicht wird.
Beispiele
Der erfindungsgemäße Promoter wurde als eine DNA-Region isoliert, die etwa 1,2 kb der Sequenz stromaufwärts des Translationsinitiationscodons (d.h. des ersten ATG, wobei das Codon ausgeschlossen wurde) des Reisgens, welches das High-Mobility-Group-Protein (AP004004) codiert, überspannt. Zur Bestimmung der Nukleinsäuresequenz und des Expressionsmusters wurde nach dem folgenden Verfahren vorgegangen: Zuerst wurden In-silico-Untersuchungen an genomischen Reissequenzen durchgeführt. Verfahren, die auf automatisierten Vorhersageprogrammen beruhen, um promotorartige Nukleinsäuresequenzen zu lokalisieren, sind jedoch sogar für die Lokalisation der am besten charakterisierten Promoterkontrollelemente, wie der TATA-Box und das Transkriptionsinitiationselement (INR) höchst fehleranfällig. Auch ist die In-silico-Bestimmung des Expressionsmusters äußerst spekulativ. Um eindeutige Daten über die Nukleinsäuresequenz und das Expressionsmuster der Promoter zu erhalten, wurden daher In-vivo-Untersuchungen durchgeführt, die folgendes umfaßten: (i) die Isolation der Promoternukleinsäuresequenz; (ii) das operative Verknüpfen eines Reportergens mit dem Promoter und Einführen des entstandenen Genkonstrukts in einen Wirtsorganismus; (iii) Anziehen der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression des Reportergens erlauben, und (iv) Bestimmung der Reportergenaktivität in den verschiedenen Geweben des Wirtsorganismus. Diese Verfahren werden nun detaillierter beschrieben.
Beispiel 1. Identifizierung und Isolierung der Promoter Identifizierung von Reis-ESTs, der entsprechenden Gene und ihre Stellung im Reisgenom
Sequenzdatenbanken mit Reissequenzen wurden auf Expressed Sequence Tags (ESTs) aus Reis durchsucht. Anschließend wurde ein "In-silico"-Northern-Blot durchgeführt, um die Identifizierung der EST-Familien zu ermöglichen, die stark exprimiert werden oder für ein bestimmtes Organ spezifisch sind. Diese Analyse umfaßte die Standardisierung der Anzahl an ESTs, die aus verschiedenen Pflanzenorganen isoliert wurden. Die EST-Familien mit einer interessanten Verteilung unter den Quellen-cDNA-Banken wurden für die weitere Analyse und für Sequenzhomologiesuchen ausgewählt. Nach Sequenzhomologiesuchen in Kombination mit dem Durchsuchen wissenschaftlicher Daten wurden die Gene, die jenen Familien von ESTs entsprechen, aus Sequenzdatenbanken identifiziert, und eine (mutmaßliche) Funktion und ein entsprechender Genname wurden angegeben (siehe Tabelle 1). Anschließend wurde die entsprechende Promoterregion durch das nachstehende Verfahren isoliert. In einem ersten Schritt wurde die TIGR-Datenbank durchsucht, um ein Tentative Contig zu finden, das einer EST-Familie entspricht. Die Sequenzhomologie wurde unter Verwendung von Standard-Computerprogrammen, wie Blast N, unter Verwendung von Standardparametern gefunden (üblicherweise G Kosten zum Öffnen einer Lücke = 5, E Kosten zum Ausweiten einer Lücke = 2, q Strafe für einen Mismatch im Blast-Laufabschnitt = –3, r Belohnung für eine Übereinstimmung im Blast-Laufabschnitt = 1, e Erwartungswert = 10,0, W Wortlänge = 11, v Anzahl an One-Line-Beschreibungen = 100, b Anzahl an Alignments, die angezeigt werden können = 100, Matrix = BLOSUM62). Die TIGR-Datenbank (The Institute for Genomic Research) stellt Tentative Contigs (TC) bereit, die Sequenzvorhersagen sind, die auf dem Contigaufbau aller bekannter EST, sämtlicher bekannter cDNA und rekonstruierter mRNA basieren. Die zur Identifikation der erfindungsgemäßen Promoter verwendeten TCs sind in Tabelle 1 dargestellt. In einem zweiten Schritt wurden diese TCs dazu verwendet, das entsprechende Gen auf einer genomischen Sequenz zu lokalisieren, wobei das Gen die codierende Region sowie die Promoterregion umfaßte. Im Allgemeinen waren diese genomischen Sequenzen BAC-Klone, die hier durch ihre Genbank-Zugangsnummer (siehe Tabelle 1) dargestellt sind. Von diesen BAC-Klonen konnte die Sequenzidentität der Promoterregion bestimmt werden. Tabelle 1: Die Promotersequenz ist hier durch SEQ ID NO und Promoternummer (PRO) dargestellt. Die codierende Sequenz (CDS), die natürlicherweise durch den erfindungsgemäßen Promoter vorangetrieben wird, ist mit ihrem Namen, mit der SEQ ID NO und der Tentative-Contig-(TC-)Zugangsnummer der TIGR-Datenbank dargestellt. Die genomischen Sequenzen (BAC-Klone oder Gene), die eine erfindungsgemäße Promoterregion umfassen, sind durch ihre Genbank-Zugangsnummer dargestellt.

PROM SEQ ID NO Prom Nummer CDS Name CDS SEQ ID NO CDS TC BAC-Klon (*oder Gen)

18 PRO0170 High-Mobility-Group-Protein 40 TC89846 AP004004
Identifikation und Isolation der Promoterregionen aus Reisgenen
Ausgehend von der Sequenzinformation des Gens und seiner Lokalisation im Reisgenom wurde die Promoterregionen der Gene als die DNA-Region isoliert, die etwa 1,2 kb stromaufwärts des Translationsinitiationscodons (d.h. des ersten ATG) überspannte, wobei das Codon ausgeschlossen wurde. Wenn eine dazwischenliegende Sequenz, wie ein Intron, in der 5'-untranslatierten Region des Gens vorhanden war, wurde die isolierte DNA-Region als die Region verwendet, die etwa 1,2 kb plus die Länge der dazwischenliegenden Sequenz überspannte. Die Promoterregionen wurden aus genomischer DNA von Oryza sativa Japonica oder ausnahmsweise von Oryza sativa Indica über PCR unter Verwendung spezifischer Primer isoliert. Diese spezifischen Primer umfassen AttB-Rekombinationsstellen, die für die Rekombinationsklonierung der isolierten Promoterregion geeignet sind.
Diese spezifischen Primer sind hier als SEQ ID NO 45 bis 88 dargestellt und in Tabelle 2 aufgelistet. Die Bedingungen für die PCR waren wie folgt: 1 Zyklus von 2 min bei 94°C, 35 Zyklen von 1 min bei 94°C, 1 min bei 58°C und 2 min bei 68°C und 1 Zyklus von 5 min bei 68°C. Die Länge des erwarteten PCR-Fragments ist ebenfalls in Tabelle 2 angegeben. Das entsprechende PCR-Fragment wurde aus der PCR-Reaktionsmischung über Gelelektrophorese und anschließende Reinigung unter Verwendung des Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research, Orange, Kalifornien) gereinigt. Tabelle 2: Übersicht über die Primer, die zur Isolation der erfindungsgemäßen Reispromoter verwendet wurden, und die Länge der Reispromoterregionen

Promoter SEQ ID NO Promoter Nummer Prom Länge Vorwärts-Primer SEQ ID NO Vorwärts-Primer reverser Primer SEQ ID NO reverser Primer

18 PRO0170 1130 62 prm3772 84 prm3773
Beispiel 2. Klonierung von Promoter-GUS-Reportervektoren zur Pflanzentransformation
Das gereinigte PCR-Fragment des Beispiels 1, das den erfindungsgemäßen Promoterregionen entspricht, wurde in das Entry-Plasmid pDONR201 des Gateway^TM-Systems (Life Technologies) unter Verwendung der "BP-Rekombinationsreaktion" kloniert. Die Identität und die Basenpaarzusammensetzung des klonierten Inserts wurde durch Sequenzierung bestätigt, und zusätzlich wurde das erhaltene Plasmid über Restriktionsspaltungen getestet.
Um den erfindungsgemäßen Promoter vor ein Reportergen zu klonieren, wurde der Entry-Klon des Beispiels 1 anschließend in einer "LR-Rekombinationsreaktion" (Gateway^TM) mit dem Bestimmungsvektor p4581 verwendet. Dieser Bestimmungsvektor war derart gestaltet, daß er den erfindungsgemäßen Promoter über die Substitution der Gateway-Rekombinationskassette vor dem GUS-Gen operativ mit dem β-Glucuronidase-(GUS-)Gen aus Escherichia coli verknüpfte. Zudem ist dieser Bestimmungsvektor zur Transformation von Pflanzen geeignet und umfaßt innerhalb der linken und rechten Randbereiche der T-DNA die erhaltene Promoter-GUS- Kassette sowie selektierbare Marker und screenbare Markerkassetten (siehe 2). Der erhaltene Reportervektor, der den erfindungsgemäßen Promoter operativ mit GUS verknüpft umfaßt, wird anschließend in den Agrobacterium-Starm LBA4044 und danach in Reispflanzen unter Verwendung von Standardtransformationsverfahren transformiert.
Beispiel 3. Expressionsmuster der Promoter-GUS-Reporterkassette in Pflanzen
Aufzucht und Ernte von transgenen Pflanzen oder Pflanzenteilen in verschiedenen Stadien (C-Pflanzen, B-Pflanzen und A-Pflanzen)
Für das Promoter-GUS-Reporter-Konstrukt wurden 3 transgene T0-Reispflanzen aus transformierten Zellen erzeugt. Die Pflanzenaufzucht wurde unter normalen Bedingungen durchgeführt. Die erste transgene Pflanze wurde für die GUS-Färbung geopfert, als sie eine Größe von etwa 5 cm erreicht hatte, wobei die Pflanze hier als "C-Pflanze" bezeichnet wird. Die zweite transgene Pflanze wurde für die GUS-Färbung geopfert, als sie eine Größe von etwa 10 cm erreicht hatte, wobei die Pflanze hier als "B-Pflanze" bezeichnet wird. Die dritte transgene Pflanze wurde für die Samenbildung aufbewahrt und wird hier als "A-Pflanze" bezeichnet. Die GUS-Färbung wurde an vollständigen C- und B-Pflanzen durchgeführt. An A-Pflanzen wurde die GUS-Färbung an Blattstücken, Blüten und Abschnitten von Samen in verschiedenen Entwicklungsstadien durchgeführt. Man ließ A-Pflanzen Samen bilden, die nach der Ernte zur Bestätigung des Expressionsmusters in T1-Pflanzen verwendet wurden.
GUS-Färbung
Die geopferten Pflanzen oder Pflanzenteile wurden mit 90%igem eiskaltem Aceton bedeckt und 30 min bei 4°C inkubiert. Nach 3maligem Waschen für 5 min mit Tris-Puffer [15,76 g Trizma-HCl (Sigma T3253) + 2,922 g NaCl in 1 l bidest. Wasser, das mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt war] wurde das Material mit einer Tris/Ferricyanat/X-Gluc-Lösung [9,8 ml Tris-Puffer + 0,2 ml Ferricyanat-Stammlösung (0,33 g Kaliumferricyanat (Sigma P3667) in 10 ml Tris-Puffer) + 0,2 ml X-Gluc-Stammlösung (26,1 mg X-Gluc (Europa Bioproducts ML 113A) in 500 μl DMSO)] bedeckt. Es wurde für 15 bis 30 Minuten eine Vakuuminfiltration angewendet. Die Pflanzen oder Pflanzenteile wurden für bis zu 16 Stunden bei 37°C inkubiert, bis die Entwicklung von blauer Farbe sichtbar wurde. Die Proben wurden dreimal für 5 Minuten mit Tris-Puffer gewaschen. Das Chlorophyll wurde in einer Ethanol-Reihe von 50%, 70% und 90% (jeweils für 30 Minuten) extrahiert.
Expressionsmuster des erfindungsgemäßen Promoters
Das Expressionsmuster des erfindungsgemäßen Reispromoters ist in Tabelle 3 zusammengefaßt. Tabelle 3: Expressionsmuster des erfindungsgemäßen Reispromoters

PRO SEQ ID NO Promoternummer Promotorname Expressionsmuster

18 PRO0170 High-Mobility-Group-Protein stark konstitutiv
Die folgenden Absätze beschreiben ausführlicher die beobachteten Expressionsmuster der erfindungsgemäßen Promoter. Die Beobachtungen beruhen auf der visuellen Untersuchung der wie vorstehend beschrieben GUS-gefärbten Gewebe. Es sollte selbstverständlich sein, daß bei einigen Promoter die Expression schwach sein kann und daß die Expression in bestimmten Geweben nur mit sehr empfindlichen Nachweisverfahren sichtbar sein kann.
PRO170 – SEQ ID NO 18 – High-Mobility-Group-Protein
Es wurde 1 Konstrukt (OS1434) untersucht. 23 Calli, 21 C-, 21 B-Pflanzen und 14 A-Pflanzen wurden analysiert. Eine Expression wurde in den Calli (52%) und in den Wurzeln (51%) von C-Pflanzen beobachtet. Darüber hinaus wurde eine starke Expression in jungen Blättern (81%) von C-Pflanzen, in Wurzeln (86%) von B-Pflanzen und in jungen Blättern (86%) von B-Pflanzen beobachtet. In A-Pflanzen gab es eine starke Expression in jungen Blättern (75%), alten Blättern (43%), im Embryo und im Aleuron, aber eine schwächere Expression im Endosperm (82%). Es wurde geschlossen, daß der Promoter PRO170 zur starken konstitutiven Expression geeignet ist.
Beispiel 4. Stabilität des Expressionsmusters des erfindungsgemäßen Promoters in weiteren Generationen
Die vorstehend erwähnten Analysen wurden an T0-Pflanzen durchgeführt, die von den transformierten Geweben stammten. Die Stabilität der Promoteraktivität in den nächsten Generationen oder Nachkommenpflanzen der der ursprünglichen T0-Pflanze, den sogenannten T1- und T2-Pflanzen, wurde wie folgt untersucht. Die mit den Reporterkonstrukten wie in den vorstehenden Abschnitten des Beispiels 2 erwähnt transformierte T0-Pflanze wurden bis zur Reife herangezogen (A-Pflanzen), wovon die Samen (T1-Samen) geerntet und ausgesät wurden, um T1-Nachkommenpflanzen zu erzeugen. Diese Pflanzen wurden analysiert, wie vorstehend in Beispiel 3 beschrieben, und man ließ die A-T1-Pflanzen zur Reife kommen und T2-Samen abwerfen.
Das Expressionsmuster des erfindungsgemäßen Promoters wurde in T0-Pflanzen, T1-Samen, T1-Pflanzen und T2-Samen sowie in allen Geweben (einschließlich Samen und Samengeweben) untersucht, wie in Beispiel 3 beschrieben. Das spezifische Expressionsmuster, wie von den T0- und T1-Samen aufgezeichnet und in Beispiel 3 beschrieben, wurden in der folgenden T1-Generation und den T2-Samen bestätigt. Es wird geschlossen, daß das Expressionsmuster der erfindungsgemäßen Promoter an Pflanzen nachfolgender Generationen stabil vererbt wird.
Beispiel 5. Stabilität des Expressionsmusters des erfindungsgemäßen Promoters in anderen Pflanzen
Die vorstehend erwähnten Pflanzenanalysen wurden an Reispflanzen durchgeführt. Diese Wahl basierte auf der praktischen Überlegung, daß gentechnologische Veränderung von Pflanzen für Erntepflanzen am profitabelsten ist. Auch in andere Erntepflanzen, wie zum Beispiel Zea Mays, werden die Reporterkonstrukte, welche die erfindungsgemäßen Promoter umfassen, eingeführt, und transformierte Pflanzen werden untersucht, wie hier vorstehend beschrieben. Das Expressionsmuster der erfindungsgemäßen Promoter ist unter Pflanzen konserviert. Daher ist der erfindungsgemäße Promoter auch dazu geeignet, die Expression einer operativ verknüpften Nukleinsäure in Monokotyledonen, wie Mais, voranzutreiben und/oder zu regulieren.
Für viele andere Zwecke, wie Forschung und Gartenbau, werden (kleine) Kräuter genetisch verändert, wobei Promoter verwendet werden. Daher werden die Reporterkonstrukte, welche die erfindungsgemäßen Promoter umfassen, in andere Pflanzenspezies eingeführt, wie zum Beispiel in Arabidopsis thaliana, und transformierte Pflanzen werden wie vorstehend beschrieben untersucht. Die Expressionsmuster des erfindungsgemäßen Promoters ist unter Pflanzen konserviert. Daher ist der erfindungsgemäße Promoter auch dazu geeignet, die Expression einer operativ verknüpften Nukleinsäure in anderen Pflanzenspezies, wie zum Beispiel Dikotyledonen, wie Arabidopsis, voranzutreiben und/oder zu regulieren.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierter Promoter, der die Expression voranzutreiben und/oder zu regulieren vermag und der folgendes umfaßt: (a) eine isolierte Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO 18 oder das Komplement von SEQ ID NO 18; oder (b) eine isolierte Nukleinsäure mit mindestens 90% Sequenzidentität zur DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO 18; oder (c) eine isolierte Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen spezifisch mit der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO 18 hybridisiert; oder (d) eine isolierte Nukleinsäure gemäß einer der Definitionen (a) bis (c), die durch eine dazwischenliegende Sequenz unterbrochen ist; oder (e) ein Fragment von einer der Nukleinsäuren gemäß (a) bis (d), wobei dieses Fragment die Expression voranzutreiben und/oder zu regulieren vermag.
Promoter nach Anspruch 1, bei dem es sich um einen Hybridpromoter handelt, der mindestens einen Teil eines Promoters nach Anspruch 1 und weiterhin einen anderen Teil eines Promoters umfaßt.
Genkonstrukt, das folgendes umfaßt: (a) einen isolierten Promoter nach Anspruch 1 oder 2; und (b) eine heterologe Nukleinsäuresequenz, die mit dem Promoter von (a) operativ verknüpft ist; sowie gegebenenfalls (c) einen 3'-Transkriptionsterminator.
Expressionskassette, die ein Genkonstrukt nach Anspruch 3 umfaßt.
Transformationsvektor, der ein Genkonstrukt nach Anspruch 3 umfaßt.
Expressionsvektor, der ein Genkonstrukt nach Anspruch 3 umfaßt.
Wirtszelle, die einen isolierten Promoter nach Anpruch 1 oder 2 oder ein Genkonstrukt nach Anpruch 3 oder eine Expressionskassette nach Anspruch 4 oder einen Transformationsvektor nach Anpruch 5 oder einen Expressionsvektor nach Anpruch 6 umfaßt.
Wirtszelle nach Anpruch 7, aus der Reihe bakterielle, Algen-, pilzliche, Hefen-, pflanzliche, Insekten- und tierische Wirtszelle.
Transgene Pflanzenzelle, die einen isolierten Promoter nach Anpruch 1 oder 2 oder ein Genkonstrukt nach Anpruch 3 oder eine Expressionskassette nach Anspruch 4 oder einen Transformationsvektor nach Anpruch 5 oder einen Expressionsvektor nach Anpruch 6 umfaßt.
Transgene Pflanzenzelle nach Anpruch 9, bei der es sich um eine Monokotyledonen-Pflanzenzelle handelt.
Transgene Pflanzenzelle nach Anpruch 10, bei der es sich um eine Dikotyledonen-Pflanzenzelle handelt.
Transgene Pflanze, die eine transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 10 oder 11 umfaßt.
Transgene Pflanze nach Anpruch 12, wobei diese Pflanze aus der Reihe Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Hafer, Roggen, Sorghum-Hirse, Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Zuckerrohr, Luzerne, Bohne, Erbse, Flachs, Lupine, Raps, Tabak, Tomate, Kartoffel, Kürbis, Papaya, Pappel und Baumwolle stammt.
Transgener Pflanzenteil, vorzugsweise erntebarer transgener Pflanzenteil, transgenes Vermehrungsmaterial oder transgene Nachkommenschaft einer Pflanze nach Anpruch 12 oder 13.
Verfahren zum Vorantreiben und/oder Regulieren der Expression einer Nukleinsäure in einer Pflanze oder Pflanzenzelle, das folgendes umfaßt: (a) Operatives Verknüpfen dieser Nukleinsäure mit einer der isolierten Nukleinsäuren nach Anspruch 1, sowie (b) Einführen des erhaltenen Genkonstrukts in eine Pflanze oder Pflanzenzelle.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Expression konstitutiv oder gewebespezifisch ist.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, das folgendes umfaßt: (a) Einführen eines isolierten Promoters nach Anspruch 1 oder 2 oder eines Genkonstrukts nach Anspruch 3 oder einer Expressionskassette nach Anspruch 4 oder eines Transformationsvektors nach Anspruch 5 oder eines Expressionsvektors nach Anspruch 6 in eine Pflanzenzelle, sowie (b) Kultivieren dieser Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum fördern.
Verwendung einer der isolierten Nukleinsäuren nach Anspruch 1 zum Vorantreiben und/oder Regulieren der Expression einer operativ verknüpften Nukleinsäure.