KR101383377B1

KR101383377B1 - 유전자를 이용하여 벼의 분얼과 뿌리생장을 조절하는 방법

Info

Publication number: KR101383377B1
Application number: KR1020120064538A
Authority: KR
Inventors: 윤인선; 김둘이; 김범기; 이재옥; 허선미
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2012-06-15
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2014-04-10
Also published as: KR20130141261A

Abstract

본 발명은 식물체의 분얼수를 증가시키고 뿌리 생장을 촉진하는 유전자를 개발하기 위한 것으로, 벼(Oryza sativa) 고분얼 돌연변이체로부터 선별하여 유묘의 분열조직에서 분리한 OsTCP6 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현 벡터, 이 유전자를 이용하여 식물체의 분얼수를 증가시키고 뿌리생장을 촉진하는 방법 및 이런 방법으로 제작된 형질전환 식물체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 제작된 형질전환체는 청색광 등 인공광 조건에서 생장을 촉진하는 용도로 유용하게 이용될 수 있으며, 이러한 형질전환 식물체를 공급함으로써 생산성 향상 및 원활한 농산물 공급이 가능하게 될 것이다.

Description

유전자를 이용하여 벼의 분얼과 뿌리생장을 조절하는 방법{Method for controlling tillering and root-growth using a gene}

본 발명은 벼의 분얼 및 뿌리생장을 조절하는 유전자를 선별하고, 이러한 유전자를 이용해 벼의 분얼과 뿌리생장을 조절하는 방법, 및 이러한 방법으로 제작된 형질전환 벼에 관한 것이다.

식물의 생산구조는 영양생장기과 생식생장기의 다양한 줄기형성 패턴 (branching pattern)에 의해 결정된다. 줄기생성은 환경과 호르몬자극의 상호작용에 의해 측아 (axillary bud)의 발생과 생장이 조절되어 나타나는 매우 복잡한 농업형질이지만, 최근 모델식물인 애기장대와 토마토, 벼, 옥수수 등 주요 작물에서 줄기생성의 분자유전학적 기작이 밝혀지고 있는 단계에 있다 (Ongaro and Leyser 2008). 특히 돌연변이체 분석을 통해 줄기생성을 조절하는 주요 유전자가 일부 규명된 단계이다. 대표적인 예가 애기장대의 branching 신호전달 기구인 max (maximum branch) pathway (Bennett et al. 2006) 와 옥수수에서 알려진 tb1 (teosinte) pathway이다. Max pathway는 F box 단백질과 카로티노이드절단효소 (CCD)의 작용에 의해 만들어진 새로운 물질 (max factor)에 의해 측아의 발생이 억제되는 기작으로 오옥신이나 시토키닌이 아닌 제3의 호르몬이 관여할 것으로 추측되었다. 오랫동안 “줄기생성호르몬 (branching hormone)”으로 알려져 있던 이 물질이 터핀 계열의 스트리고락톤 (strigolactone)이라는 것이 최근 규명되었다 (Umehara et al. 2008).

분얼 (tiller)은 벼과식물의 줄기를 일컫는 용어로 줄기 아래쪽에 있는 마디의 측아가 자라서 여러 개의 줄기 (분얼)를 형성한다. 벼과식물의 밑동에 있는 각 줄기에서 형성되는 측아를 분얼눈 (tiller bud)이라 하며 환경과 호르몬자극에 의해 새로운 분얼로 발달하게 된다. 벼의 돌연변이체 분석을 통해 벼의 분얼을 조절하는 주요 유전자 (D3, D10, D27, HTD1, HTD2, TB1)가 규명되었는데, 애기장대와 옥수수에서 밝혀진 줄기형성 조절 유전자와 유사성이 높다 (Zou et al. 2006, Arite et al. 2007, 2009. Liu et al. 2009, Lin et al. 2009). 이처럼 쌍자엽 식물과 단자엽 식물의 줄기형성 조절기구가 공통적으로 보전되어있다는 사실은 이와 연관된 유전자 또는 물질이 다양한 작물의 분얼 혹은 측지분화를 조절하는데 광범위한 농업적 적용 가능성이 있음을 시사한다.

벼·보리 등에서는 보통 재배법으로 한 개체에서 4 ~ 10개의 분얼이 나오는데, 이삭이 생기는 분얼을 유효분얼, 성장이 약해서 이삭이 달리지 않는 분얼을 무효분얼이라고 한다. 밑동의 윗마디에서 나오는 분얼이나 제23차 분얼은 무효분얼이 되기 쉽다. 분얼의 수는 품종에 따라서도 다르지만 일조부족, 토양의 수분 과부족, 저온, 만식(晩植), 밀식(密植) 등으로 인하여 적어지며, 유효분얼이 적은 경우에는 수확량이 감소된다. 분얼생성은 벼과식물의 수량 관련 요소 중 가장 중요한 이삭의 수를 결정하므로, 분얼생성 조절에 관한 관심이 지대하다.

본 발명자들은 벼의 분얼수를 조절하는 유전자와 방법을 찾기 위해 벼의 고분얼 돌연변이체를 대상으로 연구를 하던 중, OsTCP6 유전자가 벼의 분얼수 및 뿌리생장을 조절할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, OsTCP6 유전자를 이용하여 벼를 포함하는 식물체의 분얼수를 증가시키고 뿌리생장을 촉진하여, 식물체 생산성을 향상시키고 농산물의 원활한 공급이 가능하도록 하는 데에 있다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명에서는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 OsTCP6 단백질의 세포 내 수준(level)을 증가시켜 식물체의 분얼수를 증가시키거나 뿌리생장을 촉진하는 방법을 제공한다.

상기 "세포 내 수준"이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 OsTCP6 단백질을 코딩하는 OsTCP6 유전자 또는 이들에 대한 상동 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 OsTCP6 단백질을 코딩하는 OsTCP6 유전자 또는 이들에 대한 상동 유전자의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 OsTCP6 단백질 또는 이의 기능적 동등물의 OsTCP6 유전자를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 단백질의 안정성을 증진하는 방법 또는 단백질의 활성을 증진하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 OsTCP6 단백질의 세포 내 수준(level)이 증가된 식물체를 청색광 조건 하에서, 즉, 청색광을 조사하며 생장시킬 경우 분얼 및/또는 뿌리생장이 더욱 촉진된다는 놀라운 발견에 기초한다.

바람직하게는, 본 발명에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이와 동등물의 세포 내 수준을 증가시키는 것은 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 식물체에서 과발현시키고 과발현된 식물체를 청색광 조건하에서 생장시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 과발현은 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이와 동등물을 암호화하는 유전자, 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자를 작동 가능하게 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 그 발현을 증진시킬 수 있다.

보다 바람직하게, 본 발명에서는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 식물체에서 과발현시키고, 과발현된 식물체를 청색광 조건하에서 생장시키는 것임을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어 “청색광”이란 청색 빛을 내는 광을 의미하며, 더욱 바람직하게는 400 내지 500nm 파장범위, 더욱더 바람직하게는 420 내지 470nm 파장범위의 광을 의미한다.

상기 단백질 동등물에는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 상동성을 갖는 상동 단백질이 포함된다.

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질은 410개의 아미노산으로 이루어진다.

상기 "상동 단백질"이란 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질로서 본 발명의 OsTCP6 단백질과 실질적으로 동질의 기능을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 상기 유전자 동등물에는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자와 상동성을 갖는 상동 유전자를 포함한다.

서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 OsTCP6 유전자 또는 이의 상동 유전자는 단백질로 암호화된다. 서열번호 1은 1233개의 뉴클레오티드로 이루어진다.

상기 "상동 유전자"란 서열번호 1의 염기서열과 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 유전자로서 본 발명의 OsTCP6 유전자와 실질적으로 동질의 기능을 나타내는 유전자를 말한다. 서열 상동성은 당업계에 공지된 방법으로 분석될 수 있다.

상기 "실질적으로 동질의 기능"이란 분얼생성 증가에 관여하는 것을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 OsTCP6의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 OsTCP6의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와 같은　다른　단백질과의　융합으로 만들어진　융합단백질　등이 이에 포함된다.

일 실시예에서, 본 발명자들은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 OsTCP6 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하여 벼 세포를 형질전환시킴으로써 OsTCP6 단백질의 벼 세포 내 발현 수준을 증가시켰다.

또한, 상기 본 발명에 따른 형질전환 유전자로는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자뿐만 아니라, 서열번호 1의 일부 염기가 치환, 결실 또는 부가된 변형서열로서, 본 발명의 서열번호 1의 염기서열로부터 암호화되는 단백질의 활성, 즉, 식물체의 분얼생성 증가와 동등한 정도의 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기서열이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 OsTCP6 유전자는 적합한 발현벡터, 즉 재조합 발현벡터 내로 삽입되어 식물 세포를 형질전환시킬 수 있다.

보다 구체적으로, 다른 양태로 본 발명은 또한 대상 식물체의 분얼생성을 현저히 증가시키는, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 OsTCP6 단백질을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 OsTCP6 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

상기 발현벡터는 본 발명에 따른 유전자가 삽입 또는 도입될 수 있는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 유전자는 발현조절서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현조절서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현벡터 내에 포함될 수 있다.

상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)된다"는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.

상기 "발현조절서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 조절하는 DNA 서열로써, 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

상기 "프로모터"란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으나, 바람직하게 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터를 사용하며, 그 예로는 이에 한정되지는 않으나, 바람직하게 p35S 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 단자엽 식물체나 목본 식물체에서 유전자를 과다발현하기 위해서는 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 재조합 발현 벡터는 OsTCP6의 ORF를 칼리플라워 모자익 바이러스의 35S 프로모터(CaMV35SP)의 하류에 삽입하여 OsTCP6 과발현 식물 발현 벡터를 제작하였다.

상기 재조합 발현벡터의 식물체로의 도입은 당분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 히트 쇼크법(heat shock), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 아그로박테리움-매개에 의한 방법, 즉 본 발명에 따른 발현벡터가 도입된 아그로박테리움을 이용하여 식물 세포를 형질전환시키는 방법을 통해 본 발명의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하였으나, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

또 다른 양태로, 본 발명은 상기 OsTCP6 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

본 발명의 재조합 발현벡터가 도입되는 식물 세포는 세포가 식물로 재생될 수 있는 한 특정한 형태로 특별히 제한되는 것은 아니다. 이들 세포는, 예를 들면, 배양된 세포 부유물, 원형질체(protoplast), 잎 절편(leaf section) 및 캘러스(callus)를 포함한다.

본 발명에 따른 대상 식물체로는 이에 제한되지 않지만, 벼, 옥수수, 사탕수수, 보리, 및 밀 등이 있을 수 있으며, 바람직하게는 벼이다.

보다 구체적으로 본 발명에 따른 분얼생성 및 뿌리생장이 증가된 식물체는 OsTCP6 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정을 통해 수득할 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명자들은 OsTCP6 유전자가 포함된 재조합 발현벡터로 아그로박테리움에 히트 쇼크법(heat shock)에 의해 도입시키고 상기 도입된 아그로박테리움을 이용하여 벼에 형질전환시켰다. OsTCP6 유전자 과발현 형질전환체를 수득해 이의 분얼생성 및 표현형을 분석한 결과, 야생형에 비해 형질전환된 벼의 분얼수가 증가하는 특징을 확인할 수 있었다.

본 발명은 식물체에서 분얼형성 또는 뿌리생장을 증가시키는 방법을 제공할 수 있으며, 종국에는 분얼형성 및 뿌리생장이 증가된 형질전환 식물체를 제공할 수 있다. 이러한 형질전환 식물체를 공급함으로써 생산성 향상 및 원활한 농산물 공급이 가능하게 될 것이다. 또한, 기후변화에 따라 일조량부족이 작물생산성을 제한하는 주요요인으로 대두되고 있는데 OsTCP6 유전자를 이용하여 청색광 등 인공 광조건에서 생장을 촉진하는 목적으로 이용할 수 있다.

도 1 및 도 2는 고분얼 돌연변이체 분얼조직에서 OsTCP6 유전자의 발현수준을 나타낸 것이다. 여기에서, WT는 닛폰바레이고; HTD는 고분얼 돌연변이체이다.
도 3은 OsTCP6 유전자의 효모균주에서의 발색반응을 나타낸 것이다.
도 4는 OsTCP6의 과발현용 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 5는 벼의 잎에서 RT-PCR 에 의한 OsTCP6 유전자의 발현 양상을 분석한 결과를 도시한 것이다. 여기에서, 35S:OsTCP6은 형질전환 벼이고; WT 야생형 벼이고; Hyg는 hygromycin phosphotransferase gene이다.
도 6은 OsTCP6 유전자 과발현 형질전환 벼 유묘의 표현형을 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 OsTCP6 유전자 과발현 형질전환 벼의 분얼형성과 뿌리생장을 비교하여 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 고분얼 돌연변이 벼 d10 에서 OsTCP6 유전자 선발

분얼의 발생과 생장이 매우 높게 유지되며 닛폰바레 기반 (background)의 고분얼 왜성 돌연변이 (HTD; high tillering and dwarf) 벼의 정단분열조직과 줄기 기저부를 포함하는 조직으로부터 전체 RNA를 분리하여 NSF 45K oligo DNA chip을 이용하여 microarray 실험을 수행하였다. DNA chip 데이터로부터 고분얼 돌연변이체 분열조직에서 발현이 증가하는 것으로 선발된 OsTCP6 유전자의 발현을 정량 RT-PCR (quantitative RT-PCR) 방법을 통해 상세히 확인하기 위하여 하기 한 쌍의 올리고 뉴클레오타이드 프라이머를 제작하였다.

정방향 프라이머: 5'-GCATAAGCACCAGCGACTCGTAG-3' (서열번호: 3)

역방향 프라이머: 5'-GTGAGTCCTTGCAAGCTCTTGCC-3' (서열번호: 4)

RNA 100 ng을 주형으로 하고 One step SYBR PCR script RT-PCR kit (Takara)와 프라이머를 이용하여 ABI real-time PCR 시스템으로 실험을 수행하였다. 이 때 PCR 회전 조건 (cycling parameter)은 42°C-5분 (RT 반응), 95°C-10분 (1 회전), 95°C-30초, 60°C-20초, 65°C-15초 (40회전)이었다. 정량 RT-PCR 결과에서 OsTCP6 유전자 전사체 수준이 대조구에 비해 d10 돌연변이체에서 높은 것으로 확인하였다 (도 1 및 도 2).

< 실시예 2> 벼 유래의 OsTCP6 유전자 클로닝 및 그 염기서열 분석

2주간 키운 낙동 벼 유식물의 줄기 기저부와 분열조직으로부터 RNA를 분리하여 RT-PCR을 수행하였다. 전체 RNA를 주형으로 올리고 (dT)₂₀와 역전사효소 (Superscript III, Invitrogen)를 사용하여 단일 cDNA 사슬을 합성하고, 하기 한 쌍의 올리고 뉴클레오타이드 프라이머를 제작하였다.

정방향 프라이머 : 5-ATGACCATGGACGTCGCCGGAGACGCAGG-3(서열번호: 5)

역방향 프라이머 : 5-CTACGAGTCGCTGGTGCTTATGCTCTG-3(서열번호 : 6)

단일 cDNA 사슬을 주형으로 상기 프라이머와 Taq 폴리머라제 (Pyrobest, Takara)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 증폭된 cDNA 절편을 pGEM-T vector (Promega)에 클로닝하여 OsTCP6로 명명하고 전체 염기서열을 결정하였다 (서열번호: 1).

< 실시예 3> OsTCP6 유전자의 전사촉진 활성 규명

OsTCP6 유전자의 전사촉진 활성을 효모 GAL4 system을 이용하여 증명하였다. OsTCP6 유전자의 ORF를 pBDGAL4 (Stratagene) 벡터에 삽입한 융합 플라스미드를 제작하여 효모균주 (AH109/pBDOsTCP6, Clontech)에 도입하였다. 도입 균주를 X-α-GAL을 포함하는 SD-T 배지에서 배양하여 리포터인 베타갈락토시다아제 효소활성을 분석한 결과로부터 OsTCP6가 GAL4DNA 결합부위에 붙어서 리포터유전자 발현을 증가시키는 전사촉진 활성 기능이 있음을 규명하였다 (도 3).

< 실시예 4> OsTCP6 식물 과발현용 형질전환 벡터 제작

OsTCP6 유전자가 칼리플라워 모자익 바이러스의 35S 프로모터의 하류에 연결되어 상시 발현되는 식물발현 벡터를 제작하였다. 이를 위하여 OsTCP6의 ORF를 BglII를 포함하는 하기 한 쌍의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다.

정방향 프라이머 : 5'-CAGATCTATGACCATGGACGTCGCCGG-3' (서열번호: 7)

역방향 프라이머 : 5'-CAGATCTACGAGTCGCTGGTGCTTATGC-3' (서열번호: 8)

증폭된 DNA 단편을 pGEMT vector에 클로닝 한 후 BglII로 절단한 유전자를 하이그로마이신 저항성을 가지는 pCAMBIA1300 유래의 식물발현 벡터의 35S 프로모터의 하류의 Bam HI site에 삽입된 식물 발현 벡터를 제작하였다 (도 4).

완성된 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(LBA4404)에 형질전환하기 위하여 동결과 해동(freeze and thaw)을 2-3번 반복한 후, 37℃의 열충격(heat shock)방법에 의해 형질전환한 후 YEP 배지(Yeast 10g, NaCl 5g, peptone 10g, Agar 15g /1L)에서 철야배양(overnight)하여 콜로니를 확인하였다.

콜로니 PCR에 의해 형질전환이 확인된 콜로니는 벼에 형질전환하기 위하여 AB 배지(AB buffer(K₂HPO₄ 60g, NaH₂PO₄ 20g/1L), AB Salts(NH₄Cl 60g, MgSO₄·7H₂O 6g, KCl 3g, CaCl₂·2H₂O 0.265g, FeSO₄·7H₂O 50mg/1L), Glucose 5g/1L)에서 배양하였다.

< 실시예 5> 아그로박테리움을 이용한 벼 형질전환

아그로박테리움에 의한 벼 형질전환은 2N6 배지에서 동진 벼의 캘러스를 유도하기 위하여 종자를 락스에 세척한 후 적당히 건조시켜 N6 배지 (Duchefa 사 vitamin 포함 배지)에 2,4-D 호르몬이 2 mg/L 첨가된 배지에 치상하였다. 27℃에서 3-4주간 암배양하여 캘러스를 유도한 후, 2N6 새 배지에 배형성 캘러스(embryogenesis callus)를 배양(sub-culture)하였다.

형질전환 유전자를 포함하는 아그로박테리움을 AB 액체배지에 배양한 후 배형성 캘러스와 20분간 공배양(coculture) 시킨 후 3일간 암배양하였다. 멸균수에 세포탁심(cefotaxime)을 첨가하여 아그로박테리움이 완전히 제거될 때까지 씻은 후 다시 2N6 배지에 세포탁심과 hyg (하이그로마이신, hygromycin)가 30 ㎍/L로 첨가된 배지에서 3주간 암 배양하였다. 세포탁심과 hyg가 첨가된 2N6 배지에서 갈변되지 않고 살아남은 캘러스를 다시 세포탁심과 hyg가 첨가된 2N6 배지에 옮겨 2 주간 암배양하였다. 캘러스에서 슈팅(shooting) 유도를 위해 세포탁심과 hyg가 첨가된 MSR 배지 (Duchefa MS 배지에 말토스와 솔비톨 첨가)에 옮겨 4주간 양 배양하여 슈팅된 후 발근이 되면 온실로 옮기기 이전에 순화처리를 실시하였다.

< 실시예 6> 벼 형질전환체의 OsTCP6 유전자 발현 양상 분석

OsTCP6 유전자가 삽입된 벼 형질전환체에서 OsTCP6 유전자의 발현 양상 분석을 위하여 선발한 OsTCP6 과발현 형질전환 벼의 잎에서 RNA를 분리하고, 전체 RNA를 주형으로 올리고 (dT)₂₀와 역전사효소 (Superscript III, Invitrogen)를 사용하여 단일 cDNA 사슬을 합성하였다. OsTCP6의 염기서열 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하였으며, 이때 PCR 회전 조건(cycling parameter)은 95°C-30초, 57°C-30초, 72°C-40초에서 40회전이었다.

정방향 프라이머 : 5'-CGAGTGGCTGCTGCAGCAGG-3' (서열번호: 9)

역방향 프라이머 : 5'-CCTCCTTGCGTGCTGTTGC-3' (서열번호: 10)

RT-PCR을 실시한 결과 도입한 OsTCP6 전사체가 대조구에 비해 높은 수준으로 발현되고 있음을 확인하였다 (도 5).

< 실시예 7> OsTCP6 과발현 형질전환 벼의 표현형 분석

OsTCP6 유전자의 과발현이 확인된 형질전환 벼 계통을 인공광 (LED) 조건에서 10일간 생장하여 유묘기 표현형을 분석한 결과, 야생형에 비해 분얼의 형성이 촉진되고 뿌리의 길이가 길어지는 특성을 보인다는 것을 알았다(도 6). 이처럼 분얼이 촉진되고 뿌리가 길어지는 OsTCP6의 효과는 인공광의 종류에 따라 강화되는 특성을 보였다. 특히 청색 단일 LED 광조건에서 생육하였을 때 혼합 백색 LED (적색, 청색 및 녹색 LED 3종 혼합) 광조건에 비해 OsTCP6 형질전환 벼의 분얼형성과 뿌리 생장이 크게 촉진되는 신규한 효과가 있다는 것을 증명하였다 (도 7). 따라서 OsTCP6 유전자의 발현조절을 통해 광질 등 인공광 조건에서 식물의 생장을 촉진하는 목적에 이용할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 OsTCP6 단백질의 세포 내 수준(level)을 증가시켜 식물체의 분얼수를 증가시키고 뿌리생장을 촉진하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법은 OsTCP6 단백질의 세포 내 수준(level)이 증가된 식물체를 청색광 조건 하에서 생장시키는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 세포 내 수준의 증가는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 OsTCP6 유전자를 식물체에서 과발현시키는 것임을 특징으로 하는 방법.
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제 3항에 있어서, 상기 OsTCP6 유전자를 과발현시키는 방법은 프로모터에 상기 유전자를 작동 가능하게 연결한 재조합 발현벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 OsTCP6 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환시킴으로써 분얼수가 증가되고 뿌리생장이 촉진된 식물체.
제 8항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 옥수수, 사탕수수, 보리, 또는 밀인 것을 특징으로 하는 식물체.