CN103270165A - 包含具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合物及其用途 - Google Patents

包含具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN103270165A
CN103270165A CN2011800495348A CN201180049534A CN103270165A CN 103270165 A CN103270165 A CN 103270165A CN 2011800495348 A CN2011800495348 A CN 2011800495348A CN 201180049534 A CN201180049534 A CN 201180049534A CN 103270165 A CN103270165 A CN 103270165A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
polypeptide
preferred aspect
another preferred
cellulolytic enhancing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011800495348A
Other languages
English (en)
Inventor
徐丰
M.斯威尼
J.昆兰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novozymes Inc
Original Assignee
Novozymes Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novozymes Biotech Inc filed Critical Novozymes Biotech Inc
Publication of CN103270165A publication Critical patent/CN103270165A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
    • B01J31/02—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing organic compounds or metal hydrides
    • B01J31/06—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing organic compounds or metal hydrides containing polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/14—Multiple stages of fermentation; Multiple types of microorganisms or re-use of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K1/00—Glucose; Glucose-containing syrups
    • C13K1/02—Glucose; Glucose-containing syrups obtained by saccharification of cellulosic materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Processing Of Solid Wastes (AREA)
  • Soil Conditioners And Soil-Stabilizing Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及包含具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合物。本发明亦涉及使用所述组合物的方法。

Description

包含具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合物及其用途
关于对在联邦资助的研究和开发下完成的发明的权利的声明
本发明利用在能源部授予的合作协议(Cooperative Agreement)DE-FC36-08GO18080下的政府支持完成。政府对于本发明具有一定权利。
对相关申请的交叉引用
本申请要求2010年8月12日提交的美国临时申请系列号61/373,124、2010年8月12日提交的美国临时申请系列号61/373,128、2010年8月12日提交的美国临时申请系列号61/373,145、2010年8月12日提交的美国临时申请系列号61/373,150、2010年8月12日提交的美国临时申请系列号61/373,157、2010年8月12日提交的美国临时申请系列号61/373,166、2010年8月12日提交的美国临时申请系列号61/373,170和2010年8月12日提交的美国临时申请系列号61/373,210的权益，这些申请通过提述并入本文。
涉及序列表
本发明包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及包含具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合物，并涉及使用这些组合物的方法。
背景技术
纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其暴露于纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶继而从纤维素聚合物的末端释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
将含木素纤维素原料(lignocellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母发酵成乙醇。
WO 2005/074647，WO 2008/148131，WO 2011/035027公开了来自土生梭孢霉(Thielavia terrestris)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2005/074656和WO 2010/065830公开了来自桔橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2007/089290公开了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2009/085935，WO2009/085859，WO 2009/085864，和WO 2009/085868公开了来自嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2010/138754公开了来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2011/005867公开了来自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2011/039319公开了来自嗜热子囊菌属菌种(Thermoascus sp)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2011/041397公开了来自青霉属菌种(Penicillium sp)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO2011/041504公开了来自甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceous)的具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽及其多核苷酸。WO 2008/151043公开了通过将可溶性活化二价金属阳离子添加至包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的组合物来增加该多肽的活性的方法。
在本领域中，改善具有纤维素分解增强活性的多肽增强木素纤维素原料的酶水解的能力会是有利的。
本发明涉及包含具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合物，并涉及使用这些组合物的方法。
发明内容
本发明涉及组合物，其包含：(a)具有纤维素分解增强活性的多肽；和(b)醌化合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽和所述醌化合物的组合增强纤维素分解酶对纤维素材料的水解。
本发明亦涉及降解或转化纤维素材料的方法，其包括在具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的存在下用酶组合物处理纤维素材料，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合增强所述酶组合物对所述纤维素材料的水解。
本发明亦涉及用于产生发酵产物的方法，其包括：
(a)在具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的存在下用酶组合物糖化纤维素材料，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合增强所述酶组合物对所述纤维素材料的水解。
(b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和
(c)从发酵回收发酵产物。
本发明亦涉及发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料在具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的存在下经酶组合物糖化，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合增强所述酶组合物对所述纤维素材料的水解。
在一个方面，所述醌化合物是式(I)或(II)的化合物：
Figure BDA00003043605400031
或其盐或溶剂化物，
其中R1，R2，R3，和R4独立地是氢，卤素，-OH，-OR8，-NO2，-N(R9)(R10)，-CN，-C(O)R5，-C(O)OR6，-C(O)NHR7，-OC(O)R11，-NHC(O)R12，-OC(O)OR13，-NHC(O)OR14，-OC(O)NHR15，-NHC(O)NHR16，-SO2R17，-SO2N(R18)(R19)，-SR20，-NC(R21)(R22)，或任选取代的模块，其选自：烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；
R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11，R12，R13，R14，R15，R16，R18，R19，R20，R21，和R22独立地是氢，或任选取代的模块，其选自：烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；和
R17是任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；和
其中R1和R2，R2和R3，和R3和R4中的每一对可组合形成任选取代的稠环。
附图说明
图1A(2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌)，1B(1,4-萘醌)，1C(1,4-苯醌)，1D(吡咯并喹啉醌)，1E(2-hydroxy-1,4-萘醌)，和1F(1,4-二羟基蒽醌)显示对于1、3和7日：(1)在GH61多肽不存在下醌化合物对里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605400041
的作用(醌化合物作用(无GH61)，白色条)，(2)在GH61多肽存在下醌化合物对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605400042
的作用(醌化合物作用(+GH61)，灰色条)，和(3)在醌化合物存在下GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605400043
的作用(GH61作用，黑色条)。
图2A(2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌)和2B(1,4-萘醌)，显示对于1、3和7日：(1)在GH61多肽不存在下醌化合物对里氏木霉纤维素酶组合物水解PCS的作用(醌化合物作用(无GH61)，白色条)，(2)在GH61多肽存在下醌化合物对里氏木霉纤维素酶组合物水解PCS的作用(醌化合物作用(+GH61)，灰色条)，和(3)在醌化合物存在下GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解PCS的作用(GH61作用，黑色条)。
图3显示对于1和3日：(A)(1)在GH61多肽不存在下2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL的作用(醌化合物作用(无GH61)，白色条)，(2)在GH61多肽存在下2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605400045
的作用(醌化合物作用(+GH61)，灰色条)，和(3)在2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌存在下GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605400046
的作用(GH61作用，黑色条)，和(B)在第3日对于多种浓度的2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌，桔橙嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)GH61A多肽对GH61作用的作用。
图4显示：(A)对于1和3日，(1)在GH61多肽不存在下2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌对里氏木霉纤维素酶组合物水解经磨制、洗涤的PCS的作用(醌化合物作用(无GH61)，白色条)，(2)在GH61多肽存在下2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌对里氏木霉纤维素酶组合物水解经磨制、洗涤的PCS的作用(醌化合物作用(+GH61)，灰色条)，和(3)在2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌存在下GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解经磨制、洗涤的PCS的作用(GH61作用，黑色条)，和(B)在第3日对于多种浓度的2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽对GH61作用的作用。
图5显示对于1、3和7日：(1)在GH61多肽不存在下2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌对里氏木霉纤维素酶组合物水解经磨制、未经洗涤的PCS的作用(醌化合物作用(无GH61)，白色条)，(2)在GH61多肽存在下2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌对里氏木霉纤维素酶组合物水解经磨制、未经洗涤的PCS的作用(醌化合物作用(+GH61)，灰色条)，和(3)在2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌存在下GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解经磨制、未经洗涤的PCS的作用(GH61作用，黑色条)。
图6显示桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，米曲霉(Aspergillus oryzae)CEL3Aβ-葡糖苷酶，肾上腺素红(白色条)，4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌(黑色条)，或无醌(灰色条)对PASC转化的作用。
图7A(嗜松青霉(Penicillium pinophilum)GH61A多肽，0.4mg每g纤维素)，7B(嗜松青霉GH61A多肽，2mg每g纤维素)，7C(烟曲霉(Aspergillusfumigatus)GH61B多肽，0.4mg每g纤维素)，7D(烟曲霉GH61B多肽，2mg每g纤维素)，7E(Talaromyces stipitatus GH61A多肽，0.4mg每g纤维素)，7F(Talaromyces stipitatus GH61多肽，2mg每g纤维素)，7G(里氏木霉GH61B多肽，0.4mg每g纤维素)，7H(里氏木霉GH61B多肽，2mg每g纤维素)，7I(土生梭孢霉(Thielavia terrestris)GH61E多肽，0.4mg每g纤维素)，和7J(土生梭孢霉GH61E多肽，2mg每g纤维素)显示对于1、3和7日：(1)在GH61多肽不存在下醌化合物对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605400051
的作用(醌化合物作用(无GH61)，白色条)，(2)在GH61多肽存在下醌化合物对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605400052
的作用(醌化合物作用(+GH61)，灰色条)，和(3)在醌化合物存在下GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605400053
的作用(GH61作用，黑色条)。
图8显示：(A)含有所示的多种GH61多肽，和所示的化合物的组合的里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605400061
的水解分数；和(B)对于多种所示的GH61多肽，对于1mM和3mM浓度的化合物的混合物的GH61作用。白色条：3日水解；黑色条：7日水解。DHA：脱氢抗坏血酸；pyro：焦性没食子酚;quer：槲皮苷水合物(quercitin hydrate)；2AP：2-氨基苯酚；naph：2-羟基-1,4-萘醌；morin：桑色素水合物(morin hydrate)；narin：柚配基；Theau：桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽；Aspfu：烟曲霉GH61B多肽，而15B显示含有所示的多种GH61多肽，和化合物的组合的里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605400062
的水解分数。
定义
乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC 3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01%TWEENTM20(聚氧乙烯山梨坦单月桂酸酯)的50mM乙酸钠pH 5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH 5,25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。
烷基：术语“烷基”自身或作为另一个取代基一部分，除非另行声明，意指完全饱和的直链(线性；非支化)或直链，或其组合，若指定，其具有指明的碳原子数(即，C1-C10意指一至十个碳原子)。实例包括但不限于基团如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，异丁基，仲丁基，下述的同系物或异构体，例如，正戊基，正己基，正庚基，正辛基等。若未指定大小，本文中提及的烷基基团含有1至20个碳原子，通常为1至10个碳原子，或1至8个碳原子，或1至6个碳原子，或1至4个碳原子。术语“亚烷基”自身或与其它术语组合，代表衍生自烷基的二价基团，例如，但不限于，-CH2CH2CH2CH2-。
烯基：术语“烯基”指含有至少一个双键(-C=C-)的不饱和脂族基团，其包括直链(线性；非支化)，支链基团，及其组合，若指定，其具有指明的碳原子数。所有双链可独立地为(E)或(Z)几何异构体，及其组合。烯基基团的实例包括但不限于-CH2-CH=CH-CH3；-CH=CH-CH=CH2和-CH2-CH=CH-CH(CH3)-CH2-CH3。若未指定大小，本文中提及的烯基基团含有2至20个碳原子，通常为2至10个碳原子，或2至8个碳原子，或2至6个碳原子，或2至4个碳原子。术语“亚烯基”自身或与其它术语组合，代表衍生自烯基的二价基团，例如，但不限于，-CH2CHCHCH2-。
炔基：术语“炔基”指含有至少一个碳碳叁键(-C≡C-)的不饱和脂族基团，其包括直链(线性；非支化)，支链基团，及其组合，若指定，其具有指明的碳原子数。炔基基团的实例包括但不限于-CH2-C≡C-CH3；-C≡C-C≡CH和-CH2-C≡C-CH(CH3)-CH2-CH3。若未指定大小，本文中提及的炔基基团含有2至20个碳原子，通常为2至10个碳原子，或2至8个碳原子，或2至6个碳原子，或2至4个碳原子。术语“亚炔基”自身或与其它术语组合，代表衍生自炔基的二价基团，例如，但不限于，-CH2CCCH2-。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3.2.1.55)，其催化对α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl中的每ml的100mM乙酸钠pH 5中5mg的中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow,Ireland)在40℃进行30分钟，接着通过AMINEX
Figure BDA00003043605400071
HPX-87H柱层析(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析来确定的。
α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase)(EC 3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据de Vries,1998,J.Bacteriol.180:243-249确定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH 5，40℃每分钟释放出1μmol葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。
芳烷基：术语“芳烷基”定义为烷基取代的芳基基团，其中所述烷基部分附于母体结构。实例为苄基，苯乙基等。“杂芳烷基”定义为通过烷基残基附于母体结构的杂芳基模块。实例包括呋喃基甲基，吡啶基甲基，嘧啶基乙基等。芳烷基和杂芳烷基亦包括其中烷基基团的至少一个碳原子存在于烷基基团中，且其中烷基基团的另一个碳由例如氧，氮或硫原子替代(例如，苯氧甲基，2-吡啶基甲氧基，3-(1-萘基氧)丙基等)。
芳基：术语“芳基”，除非另行指明，意指多不饱和的、芳族烃取代基。芳基可含有其它稠合的环(例如1至3个环)，包括其它稠合的芳基，杂芳基，环烷基，和/或杂环烷基环。芳基基团的实例包括但不限于：苯基，1-萘基，2-萘基，和4-联苯基。
亚芳基/亚杂芳基：术语“亚芳基”和“亚杂芳基”意指分别衍生自芳基和杂芳基的二价基团。亚芳基和亚杂芳基的两个价键均可位于环任何合适的部分(例如，)且若合适，可稠合于另一个环。亚芳基的非限定性实例包括：亚苯基，亚联苯基，亚萘基等。亚杂芳基基团的实例包括但不限于：亚吡啶基，亚噁唑基，亚噻唑基，亚吡唑基，亚吡喃基，和亚呋喃基。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶根据Venturi等,2002,Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomiumthermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemicalproperties,J.Basic Microbiol.42:55-66的方法使用对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷作为底物确定。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃,pH4.8，在含有0.01%TWEEN
Figure BDA00003043605400082
20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃，pH 5从1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物在含有0.01%TWEEN20的100mM柠檬酸钠中每分钟产生1.0μmol对硝基苯酚阴离子。
cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工包括剪接，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.No.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维素寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystallinecellulose degradation:New insight into the function of cellobiohydrolases,Trendsin Biotechnology 15:160-167;Teeri等,1998,Trichoderma reeseicellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose?,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。就本发明而言，根据Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279；van Tilbeurgh等,1982,FEBS Letters 149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters 187:283-288；以及Tomme等,1988,Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法确定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，采用Lever等的方法来评估玉米秸秆中纤维素的水解，而van Tilbeurgh等和Tomme等的方法可用于确定对荧光二糖衍生物4-甲基伞形基-β-D-乳糖苷(4-methylumbelliferyl-β-D-lactoside)的纤维二糖水解酶活性。
纤维素分解增强活性：术语“纤维素分解增强活性”意指由GH61多肽催化的、增强具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的生物活性。就本发明而言，通过测量来自由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中纤维素，其中总蛋白包含50-99.5%w/w的纤维素分解酶蛋白，及0.5-50%w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在50℃历时1-7天，与用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的2-3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质量的2-3%的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的CELLUCLAST
Figure BDA00003043605400101
1.5L(Novozymes A/S,
Figure BDA00003043605400102
Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，更优选至少1.05倍，更优选至少1.10倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，且最优选至少20倍。
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，β-葡糖苷酶，或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等,Outlook for cellulaseimprovement:Screening and selection strategies,2006,Biotechnology Advances24:452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman No.1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman No.1滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由International Unionof Pure and Applied Chemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurement of cellulaseactivities,Pure Appl.Chem.59:257-68)确立的。
就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-20mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素(或其它经预处理的纤维素材料)在50℃进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。通常条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸钠pH 5，1mM MnSO4，50℃、55℃或60℃，72小时，通过AMINEX
Figure BDA00003043605400103
HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。
纤维素材料：术语“纤维素材料”意指包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，农业残余物、草本材料(包括能量作物)、城市固体废物、纸浆与造纸厂残余物、废纸和木材(包括林业残余物)(参见，例如，Wiselogel等,1995,于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编),pp.105-118,Taylor & Francis,Washington D.C.;Wyman,1994,BioresourceTechnology 50:3-16;Lynd,1990,Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25:695-719;Mosier等,,1999,Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume65,pp.23-40,Springer-Verlag,New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选的方面，所述纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。
在一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是林业残余物。在另一个方面，纤维素材料是草本材料(包括能量作物)。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是木材(包括林业残余物)。
在另一个方面，纤维素材料是芦竹(arundo)。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是竹材。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是芒草属。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。
在另一个方面，纤维素材料是白杨。在另一个方面，纤维素材料是桉树。在另一个方面，纤维素材料是枞树。在另一个方面，纤维素材料是松树。在另一个方面，纤维素材料是杨树。在另一个方面，纤维素材料是云杉。在另一个方面，纤维素材料是柳树。
在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cotton linter)。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是无定形的磷酸处理的纤维素。
在另一个方面，纤维素材料是水生生物质。如用于本文中，“水生生物质”意指在水生环境中由光合作用过程产生的生物质。水生生物质可为藻类、挺水植物(emergent plant)、浮叶植物(floating-leaf plant)或沉水植物(submerged plant)。
纤维素材料可以按原样使用或进行预处理，使用本领域已知的常规方法，如本文所述。在一个优选的方面，预处理纤维素材料。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或其它起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组多肽。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码多肽的多核苷酸表达是必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。
环烷基：术语“环烷基”自身或与其它术语组合，除非另行声明，代表饱和或不饱和的环状非芳族烃基团(例如，烷基、烯基或炔基的环状型式，或其组合)。环烷基可含有其它稠合的环(例如，1至3个环)，包括其它稠合的环烷基和/或杂环烷基环，但排除其它稠合的芳基和/或杂芳基基团。环烷基的实例包括但不限于：环丙基，环丁基，环戊基，环己基，1-环己烯基，3-环己烯基，环庚基，降莰烷基(norbomyl)等。若未指定大小，本文中提及的炔基基团含有3至9个碳原子，通常为3至7个碳原子。术语“亚环烷基”自身或作为另一个取代基的一部分意指衍生自环烷基的二价基团，例如，但不限于：-环己基-。
环烷基-烷基/杂环烷基-烷基：术语“环烷基-烷基”和“杂环烷基-烷基”分别定义为烷基取代的环烷基基团和烷基取代的杂环烷基，其中所述烷基模块附于母体结构。非限定性实例包括：环丙基乙基，环丁基-丙基，环戊基-己基，环己基-异丙基，1-环己烯基-丙基，3-环己烯基-叔丁基，环庚基-庚基，降莰烷基-甲基，1-哌啶基-乙基，4-吗啉基-丙基，3-吗啉基-叔丁基，四氢呋喃-2-基-己基，四氢呋喃-3-基异丙基等。环烷基-烷基和杂环烷基-烷基亦含有其中至少一个碳原子存在于烷基基团中，且其中烷基基团的另一个碳原子由例如氧，氮或硫原子替代的取代基(例如，环丙氧甲基，2-哌啶基氧-叔丁基等)。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006,Biotechnology Advances 24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，在pH 5,40℃使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的其它核苷酸可操作地连接。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”在本文中定义为根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolasesbased on amino-acid sequence similarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat B.,和Bairoch A.,1996,Updating the sequence-based classification ofglycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。该家族中的酶原先基于在一个家族成员测量到的非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性而归类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是非经典的，且它们无法视为真正的(bona fide)糖苷酶。然而，基于当与纤维素酶或纤维素酶的混合物一同使用时，其增强木素纤维素降解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶酶(EC 3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在“天然”底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acidesterase)、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH 5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH 5，25℃每分钟释放出1μmol对硝基苯酚阴离子的酶量。
卤素：术语“卤代”或“卤素”自身或作为另一个取代基的一部分，除非另行声明，意指氟，氯，溴，或碘原子。
杂环烷基：术语“杂环烷基”自身或与其它术语组合，代表饱和/或不饱和的环状非芳族烃基团，其含有至少一个碳原子和至少一个环上的(annular)杂原子，所述杂原子选自下组：O，N，P，Si和S，且其中氮和硫原子可任选地经氧化，且氮杂原子可任选地经季铵化。杂原子O，N，P，S和Si可置于杂环烷基的任何内部位置，或杂环烷基附于分子的其余部分的位置。杂环烷基可含有其它稠合的环(例如，1至3个环)，包括其它稠合的环烷基和/或杂环烷基环，但排除其它稠合的芳基和/或杂芳基基团。杂环烷基的实例包括但不限于：噻唑啉酮基(thiazolidinonyl)，1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)，1-哌啶基，2-哌啶基，3-哌啶基，4-吗啉基，3-吗啉基，四氢呋喃-2-基，四氢呋喃-3-基，四氢噻吩-2-基，四氢噻吩-3-基，1-哌嗪基，2-哌嗪基等。术语“亚杂环烷基”自身或作为另一个取代基的一部分意指衍生自杂环烷基的二价基团，例如，但不限于
Figure BDA00003043605400141
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom,D.和Shoham,Y.Microbial hemicellulases.Current Opinion In Microbiology,2003,6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是支化和直链多糖的混杂集团，这些多糖通过氢键键合于植物细胞壁中的纤维素微纤维，将其交联为鲁棒(robust)的网络。半纤维素亦共价地附于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素的可变的结构和组织形式需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基的酯连接的糖酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级结构的同源性，可指派为以数字标识的GH和CE家族。一些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。最具信息性和最新的这些和其他糖活性酶的分类可在Carbohydrate-Active Enzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure & Appl.Chem.59:1739-1752进行测量。
杂芳基：术语“杂芳基”指含有一至四个环上的杂原子的芳基基团(或环)，所述杂原子选自N，O，和S，其中所述氮和硫原子任选地经氧化，且氮原子任选地经季铵化。杂芳基基团可在环上的碳或环上的杂原子附于分子的剩余部分。杂芳基可含有其它稠合的环(例如，1至3个环)，包括其它稠合的芳基，杂芳基，环烷基，和/或杂环烷基环。杂芳基基团的非限定性实例是1-吡咯基，2-吡咯基，3-吡咯基，3-吡唑基，2-咪唑基，4-咪唑基，吡嗪基，2-噁唑基，4-噁唑基，2-苯基-4-噁唑基，5-噁唑基，3-异噁唑基，4-异噁唑基，5-异噁唑基，2-噻唑基，4-噻唑基，5-噻唑基，2-呋喃基，3-呋喃基，2-噻吩基，3-噻吩基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，2-嘧啶基，4-嘧啶基，5-苯并噻唑基，嘌呤基，2-苯并咪唑基，5-吲哚基，1-异喹啉基，5-异喹啉基，2-喹喔啉基，5-喹喔啉基，3-喹啉基，和6-喹啉基。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制中发生的突变而不与亲本细胞完全相同。
分离的或纯化的：术语“分离的”或“纯化的”意指从与其天然结合的至少一个组分移除的多肽或多核苷酸，举例而言，如通过SDS-PAGE确定，多肽可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，或至少95%纯，而如通过琼脂糖电泳确定，多肽可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，或至少95%纯。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端)的混合物。成熟多肽可使用SignalP程序(Nielsen等,1997,Protein Engineering10:1-6)来预测。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有生物活性活性的成熟多肽的核苷酸序列。成熟多肽编码序列可使用SignalP程序(Nielsen等,1997,见上)来预测。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因或其受修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的。当核酸构建体包含本发明的编码序列表达所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。
多肽片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽的氨基和/或羧基端缺失一个或多个(例如几个)氨基酸的多肽，其中所述片段具有生物活性。
预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指通过用热和稀硫酸处理、碱预处理或中性预处理的源自玉米秸秆的纤维素材料。
序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选3.0.0、5.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定。使用的任选参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的任选参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(例如几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有生物活性的片段。
取代：术语“取代”指用一价或二价基团替代模块的一个或多个(例如几个)氢原子。“任选取代”指所述模块可为取代的或未取代的。缺乏术语“任选取代”和“取代”的模块意指未取代的模块(例如，“苯基”意指未取代的苯基，除非表示为取代的苯基或任选取代的苯基)。对于所示的任选取代的模块的合适取代基基团包括，例如，羟基，硝基，氨基(例如，-NH2或二烷基氨基)，亚胺基，氰基，卤代(如F，CI，Br，I)，卤代烷基(如-CCl3或-CF3)，硫代，磺酰基，硫代酰胺基，脒基，亚脒基(imidino)，氧代，氧代脒基(oxamidino)，甲氧脒基(methoxamidino)，亚脒基，胍基，磺胺基(sulfonamido)，羧基，甲酰基，烷基，烷氧基，烷氧-烷基，烷基羰基，烷基羰基氧(-OCOR)，氨基羰基，芳基羰基，芳烷基羰基，羰基氨基，杂芳基羰基，杂芳烷基-羰基，烷基硫代，氨基烷基，氰基烷基，氨基甲酰基(-NHCOOR-或-OCONHR-)，脲基(-NHCONHR-)，芳基等，其中R是任何基团，例如烷基或亚烷基。在一些实施方案中，所述任选取代的模块仅任选用选定的基团取代，如下所述。在一些实施方案中，上述基团(例如烷基基团)用下述任选取代，例如，烷基(例如，甲基或乙基)，卤代烷基(例如，-CCl3，-CH2CHCl3或-CF3)，环烷基(例如，-C3H5，-C4H7，-C5H9)，氨基(例如，-NH2或二烷基氨基)，烷氧基(例如，甲氧基)，杂环烷基(例如，如吗啉，哌嗪，哌啶，吖丁啶)，羟基，和/或杂芳基(例如，噁唑基)。对于所示的任选取代的模块的其它合适的取代基基团如本文中所述。在一些实施方案中，取代基基团自身经任选取代。在一些实施方案中，取代基基团非自身取代。取代集团上的取代的基团可为，例如，羧基，卤素，硝基，氨基，氰基，羟基，烷基，烯基，炔基，烷氧基，氨基羰基，-SR，硫代酰胺基，-SO3H，-SO2R或环烷基，其中R是任何合适的基团，例如，氢或烷基。
当取代的取代基包含直链基团时，所述取代基可位于链内(例如，2-羟基丙基，2-氨基丁基等)或链末端(例如，2-羟基乙基，3-氰基丙基等)。取代的取代基可为共价键合的碳或杂原子(N，O或S)的直链，支化或环状排列。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如几个)位置包含一个或多个(例如几个)氨基酸残基的改变，即取代、插入和/或缺失的具有纤维素分解增强活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在邻接某位置的氨基酸之后添加一个或多个(例如几个)氨基酸，例如1至5个氨基酸。
含木聚糖材料：术语“含木聚糖材料”意指任何包含含有β-(1-4)连接的木糖残基骨架的植物细胞壁多糖的材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-吡喃木糖骨架的杂聚物，其由短的糖链分支。它们包含D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚，L-阿拉伯糖和/或多种包含D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖和D-葡萄糖的寡糖。木聚糖类型的多糖可分为均木聚糖(homoxylan)和杂木聚糖(heteroxylan)，后者包括葡糖醛酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和复合杂木聚糖。参见，例如Ebringerova等,2005,Adv.Polym.Sci.186:1–67。
在本发明的方法中，可使用任何含有木聚糖的材料。在一个优选的方面，所述含木聚糖材料是木素纤维素。
木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase))。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard,Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes,2006,Journal ofthe Science of Food和Agriculture86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006,Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllumcommune,FEBS Letters 580(19):4597-4601；Herrmann,Vrsanska,Jurickova,Hirsch,Biely和Kubicek,1997,The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is amultifunctional beta-D-xylan xylohydrolase,Biochemical Journal 321:375-381。
总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦斯佩耳特小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey,Biely,Poutanen,1992,Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity,Journal ofBiotechnology 23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在37℃在0.01%TRITON
Figure BDA00003043605400191
X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)中和200mM磷酸钠缓冲液pH 6来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在200mM磷酸钠pH 6缓冲液中在37℃，pH 6从作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。
就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加来确定的：1ml反应液，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠，pH5，50℃，24小时，如Lever,1972,A new reactionfor colorimetric determination of carbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是使用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在200mM磷酸钠pH6缓冲液中在37℃，pH 6从作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。
如用于本文中和在所附的权利要求中，单数形式“一个/一种”，“或”和“所述”包括对复数的指代，除非上下文明显另行指明。应理解的是，本文中所述的发明的方面包括“组成为(consisting)”和/或“基本上组成为(consistingessentially of)”的方面。
发明详述
本发明涉及组合物，其包含(a)具有纤维素分解增强活性的多肽；和(b)醌化合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合增强纤维素酶对纤维素材料的水解。在一个方面，所述组合物进一步包含(c)一个或多个(例如几个)选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
本发明亦涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括在具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的存在下用酶组合物处理纤维素材料，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合增强纤维素酶对纤维素材料的水解。在一个方面，上述方法进一步包括回收降解的和转化的纤维素材料。纤维素材料的降解或转化的可溶性产物可使用本领域公知的技术如例如离心、过滤和重力沉降来与不溶性纤维素材料分离。
本发明亦涉及用于产生发酵产物的方法，其包括：
(a)在具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的存在下用酶组合物糖化纤维素材料，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合增强所述酶组合物对所述纤维素材料的水解。
(b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和
(c)从发酵回收发酵产物。
本发明亦涉及发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料在具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的存在下经酶组合物糖化，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合增强所述酶组合物对所述纤维素材料的水解。在一个方面，纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个方面，本发明进一步包括从发酵回收发酵产物。
醌化合物
在本发明的方法和组合物中，所述醌化合物可为任何包含如本文中所述的醌模块的合适的化合物。
在一个方面，所述醌化合物是式(I)或(II)的化合物：
Figure BDA00003043605400211
或其盐或溶剂化物；
其中R1，R2，R3，和R4独立地是氢，卤素gen，-OH，-OR8，-NO2，-N(R9)(R10)，-CN，-C(O)R5，-C(O)OR6，-C(O)NHR7，-OC(O)R11，-NHC(O)R12，-OC(O)OR13，-NHC(O)OR14，-OC(O)NHR15，-NHC(O)NHR16，-SO2R17，-SO2N(R18)(R19)，-SR20，-NC(R21)(R22)，或任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；
R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11，R12，R13，R14，R15，R16，R18，R19，R20，R21，和R22独立地是氢，或任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；和
R17是任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；和
其中R1和R2，R2和R3，和R3和R4中的每一对可组合形成任选取代的稠合环。
在式(I)或(II)的一个方面，R1，R2，R3，和R4独立地是氢，卤素，-OH，-OR8，或任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；和其中R1和R2，R2和R3，和R3和R4的每一个可组合形成任选取代的稠合环。在另一个方面，R1，R2，R3，和R4独立地是氢，卤素，-OH，-OR8，或任选取代的烷基；和其中R1和R2，R2和R3，和R3和R4的每一对可组合形成任选取代的稠合环。在另一个方面，其中R1，R2，R3，和R4独立地是氢，-OH，任选取代的-O-(C1-C10)烷基，或任选地为-(C1-C10)烷基。
在式(I)或(II)的一些方面，R1，R2，R3，和R4的至少一个是氢。在一些方面，R1，R2，R3，和R4的一个是氢。在一些方面，R1，R2，R3，和R4的至少两个是氢。在一些方面，R1，R2，R3，和R4的仅仅两个是氢。在一些方面，R1，R2，R3，和R4的至少三个是氢。在一些方面，R1，R2，R3，和R4的仅仅三个是氢。在一些方面，R1，R2，R3，和R4的至少一个不是氢。在一些方面，R1，R2，R3，和R4的至少两个不是氢。在一些方面，R1，R2，R3，和R4的至少三个不是氢。
在式(I)或(II)的一些方面，R1，R2，R3，和R4的至少一个是任选取代的烷基(例如，任选取代的C1-C10烷基，如任选取代的甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，或正戊基)。在式(I)或(II)的一些方面，R1，R2，R3，和R4的一个是任选取代的烷基。在一些方面，R1，R2，R3，和R4的至少两个是任选取代的烷基(例如，任选取代的C1-C10烷基，如任选取代的甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，或正戊基)。在一些方面，R1，R2，R3，和R4的仅仅两个是任选取代的烷基。
在式(I)或(II)的一些方面，R1，R2，R3，和R4的至少一个是-OH。在一些方面，R1，R2，R3，和R4的一个是-OH。在一些方面，R1，R2，R3，和R4的至少两个是-OH。在一些方面，R1，R2，R3，和R4的仅仅两个是-OH。
在式(I)或(II)的一些方面，R1和R2，R2和R3，和R3和R4的至少一对组合形成任选取代的稠合环。在一些方面，R1和R2组合形成任选取代的稠合环。在一些方面，R1和R2组合形成任选取代的稠合的亚环烷基环。在一些方面，R1和R2组合形成任选取代的稠合的亚芳基环。在一些方面，R1和R2组合形成任选取代的稠合的亚杂芳基环。在一些方面，R1和R2组合形成任选取代的任选取代的模块，其选自亚苯基，亚吡唑基，亚呋喃基，亚咪唑基，亚异噁唑基，亚噁二唑基，亚噁唑基，亚吡咯基，亚吡啶基，亚嘧啶基，亚哒嗪基，噻唑基亚，亚三唑基，亚噻吩基，二氢噻吩-亚吡唑基，亚硫茚基，亚咔唑基，亚苯并咪唑基，亚苯并噻吩基，亚苯并呋喃基，亚吲哚基，亚喹啉基，亚苯并三唑基，亚苯并噻唑基，亚苯并噁唑基，亚苯并咪唑基，亚异喹啉基，亚异吲哚基，亚吖啶基，亚苯并异唑基(benzoisazolylene)，亚二甲基乙内酰脲(dimethylhydantoinene)，亚吡嗪基，亚四氢呋喃基，亚吡咯啉基，亚吡咯烷基，亚吗啉基，亚吲哚基，亚二氮杂环庚三烯基，亚氮杂环庚三烯基，亚硫杂环庚三烯基，亚哌啶基，和亚氧杂环庚三烯基。在一些方面，R1和R2组合形成任选取代的亚苯基。在一些方面，R1和R2组合形成任选取代的亚吡咯基。在一些方面，R1和R2组合形成任选取代的亚吡啶基。在一些方面，R1和R2组合形成任选取代的亚吡咯啉基。
在式(I)或(II)的一些方面，R2和R3组合形成任选取代的稠合环。在一些方面，R2和R3组合形成任选取代的稠合的亚环烷基环。在一些方面，R2和R3组合形成任选取代的稠合的亚芳基环。在一些方面，R2和R3组合形成任选取代的稠合的亚杂芳基环。在一些方面，R2和R3组合形成任选取代的模块，其选自亚苯基，亚吡唑基，亚呋喃基，亚咪唑基，亚异噁唑基，亚噁二唑基，亚噁唑基，亚吡咯基，亚吡啶基，亚嘧啶基，亚哒嗪基，亚噻唑基，亚三唑基，亚噻吩基，亚二氢噻吩并-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolylene)，亚硫茚基，亚咔唑基，亚苯并咪唑基，亚苯并噻吩基，亚苯并呋喃基，亚吲哚基，亚喹啉基，亚苯并三唑基，亚苯并噻唑基，亚苯并噁唑基，亚苯并咪唑基，亚异喹啉基，亚异吲哚基，亚吖啶基，亚苯并异唑基(benzoisazolylene)，亚二甲基乙内酰脲(dimethylhydantoinene)，亚吡嗪基，亚四氢呋喃基，亚吡咯啉基，亚吡咯烷基，亚吗啉基，亚吲哚基，亚二氮杂环庚三烯基，亚氮杂环庚三烯基，亚硫杂环庚三烯基，亚哌啶基，和亚氧杂环庚三烯基。在一些方面，R2和R3组合形成任选取代的亚苯基。在一些方面，R2和R3组合形成任选取代的亚吡咯基。在一些方面，R2和R3组合形成任选取代的亚吡啶基。在一些方面，R2和R3组合形成任选取代的亚吡咯啉基。
在式(I)或(II)的一些方面，其中R3和R4组合形成任选取代的稠合环。在一些方面，R3和R4组合形成任选取代的稠合的亚环烷基环。在一些方面，R3和R4组合形成任选取代的稠合的亚芳基环。在一些方面，R3和R4组合形成任选取代的稠合的亚杂芳基环。在一些方面，R3和R4组合形成任选取代的模块，其选自亚苯基，亚吡唑基，亚呋喃基，亚咪唑基，亚异噁唑基，亚噁二唑基，亚噁唑基，亚吡咯基，亚吡啶基，亚嘧啶基，亚哒嗪基，亚噻唑基，亚三唑基，亚噻吩基，亚二氢噻吩并-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolylene)，亚硫茚基，亚咔唑基，亚苯并咪唑基，亚苯并噻吩基，亚苯并呋喃基，亚吲哚基，亚喹啉基，亚苯并三唑基，亚苯并噻唑基，亚苯并噁唑基，亚苯并咪唑基，亚异喹啉基，亚异吲哚基，亚吖啶基，亚苯并异唑基(benzoisazolylene)，亚二甲基乙内酰脲(dimethylhydantoinene)，亚吡嗪基，亚四氢呋喃基，亚吡咯啉基，亚吡咯烷基，亚吗啉基，亚吲哚基，亚二氮杂环庚三烯基，亚氮杂环庚三烯基，亚硫杂环庚三烯基，亚哌啶基，和亚氧杂环庚三烯基。在一些方面，R3和R4组合形成任选取代的亚苯基。在一些方面，R3和R4组合形成任选取代的亚吡咯基。在一些方面，R3和R4组合形成任选取代的亚吡啶基。在一些方面，R3和R4组合形成任选取代的亚吡咯啉基。
在式(I)或(II)的一些方面，其中R1和R2组合形成任选取代的稠合环；和R3和R4组合形成任选取代的稠合环。在一些方面，R1和R2，R2和R3，和R3和R4的仅仅一对组合形成任选取代的稠合环。
在一个方面，所述醌化合物选自下组：
Figure BDA00003043605400241
(I-1)：1,4-苯醌；
Figure BDA00003043605400242
(I-2)：1,4-萘醌；
Figure BDA00003043605400243
(I-3)：2-羟基-1,4-萘醌；
Figure BDA00003043605400244
(I-4)：2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q0；
Figure BDA00003043605400245
(I-5)：2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或杜醌；
Figure BDA00003043605400246
(I-6)：1,4-二羟基蒽醌；
Figure BDA00003043605400251
(II-1)：3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺素红；
(II-2)：4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌；
Figure BDA00003043605400253
(II-3)：吡咯并喹啉醌；
或其盐或溶剂化物。
在一些方面，本文中所述的醌化合物(例如式I或II的化合物)是基本上纯的形式。对于醌化合物，除非另行声明，“基本上纯的”意指醌化合物的制备物含有不超过15%杂质，其中所述杂质意指除了醌化合物以外的化合物，但并不包括其它形式的醌化合物(例如描述的同系物的不同的盐形式或不同的立体异构体，构象异构体，旋转异构体或互变异构体)。在一个变化中，提供了基本上纯的醌化合物的制备物，其中所述制备物含有不超过25%杂质，或不超过20%杂质，或不超过10%杂质，或不超过5%杂质，或不超过3%杂质，或不超过1%杂质，或不超过0.5%杂质。
在一些方面，本文中所述的醌化合物(例如，式I或II的化合物)并非基本上纯的形式。例如，醌化合物可作为不纯组合物(例如，未纯化的生物材料)的一部分添加或补充，其中所述组合物富含所述化合物或其一种或多种(例如几种)化学前体。在一个方面，对包含一种或多种(例如几种)醌化合物的不纯组合物(例如，未纯化的生物材料)进行预处理，例如，如本文中所述对于纤维素材料的预处理，和/或将其添加至纤维素材料，和/或在纤维素材料的预处理之前与纤维素材料组合。在另一个方面，将包含一种或多种(例如几种)醌化合物的不纯组合物(例如，未纯化的生物材料)添加至纤维素材料，和/或在纤维素材料的预处理之前与纤维素材料组合。在另一个方面，将包含一种或多种(例如几种)醌化合物的不纯组合物(例如，未纯化的生物材料)添加至涉及糖化、糖化的增强、液化等的酶组合物。在另一个方面，将包含一种或多种(例如几种)醌化合物的不纯组合物(例如，未纯化的生物材料)添加至发酵或同时糖化-发酵反应。在任何这些方面，所述包含醌化合物的不纯化合物(例如，未纯化的生物材料)是含有多于0.5%杂质，或多于1%杂质，或多于3%杂质，或多于5%杂质，或多于10%杂质，或多于20%杂质，或多于30%杂质，或多于40%杂质，或多于50%杂质，或多于60%杂质，或多于70%杂质，或多于80%杂质，或多于90%杂质，或多于95%杂质，或多于97%杂质，或多于98%杂质，或多于99%杂质的制备物。
在另一个方面，所述醌是复合醌(complexed quinone)的组分，例如与2,6-二氯酚靛酚(DCIP)复合的醌。在另一个方面，所述醌是包含商业上可获得的染料、植物染料和/或颜料的组合物的租房呢。
本文中所述的醌化合物(例如，式I或II的化合物)和使用所述化合物的方法，除非另行声明，包括所有的溶剂化物和/或水合物形式。在一些方面，本文中所述的醌化合物可以以非溶剂化的形式以及溶剂化的形式(即溶剂化物)存在。所述醌化合物亦可包括水合形式(即水合物)。
本文中所述的醌化合物(例如，式I或II的化合物)，以及使用所述化合物的方法，除非另行声明，包括所述化合物的所有盐形式。所述化合物亦可包括是本文中所述的醌化合物的任何盐的任何非盐形式，以及本文中所述的醌化合物的任何盐的其它盐。醌化合物的碱性官能基团的所需的盐可通过本领域技术人员已知的方法通过用酸处理所述化合物来制备。醌化合物的酸性官能基团的所需的盐可通过本领域技术人员已知的方法通过用碱处理所述化合物来制备。酸化合物的无机盐的实例包括但不限于碱金属和碱土金属盐，如钠盐、钾盐、镁盐、铋盐和钙盐；铵盐；和铝盐。酸化合物的有机盐包括但不限于：普鲁卡因、二苄基胺、正乙基哌啶，N,N′-二苄基乙二胺，三甲胺，和三乙胺盐。碱化合物的无机盐的实例包括但不限于：盐酸和氢溴酸盐。碱化合物的有机盐的实例包括但不限于：酒石酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐和琥珀酸盐。
除非在化学结构或化学名称中明确地表明了立体化学，化学结构或名称旨在涵盖描述的醌化合物所有可能的立体异构体、构象异构体、旋转异构体和互变异构体。例如，含有手性碳原子的醌化合物旨在涵盖(R)对映异构体和(S)对映异构体，以及对映异构体的混合物，包括外消旋混合物；而含有两个手性碳的醌化合物旨在涵盖所有的对映异构体和非对映异构体(包括(R,R)，(S,S)，(R,S)，和(R,S)异构体)。在一些方面，本文中所述的醌化合物(例如，式I或II的混合物)是(R)对映异构体的形式。在一些方面，本文中所述的醌化合物(例如，式I或II的混合物)是(S)对映异构体。
对于所有本文中所述的醌混合物，所述醌化合物亦涵盖其还原(氢醌)形式。例如，如1,4-苯醌的结构旨在亦涵盖还原形式苯-1,4-二醇：
Figure BDA00003043605400271
在本文中公开的醌化合物的所有用途中包括的是如所述的混合物任何或所有立体化学、对映异构、非对映异构、构象异构、旋转异构、互变异构、溶剂化物、水合物和盐形式。
醌化合物的有效量可取决于一个或多个(例如几个)因素，其包括但不限于组分纤维素分解酶的混合物，纤维素底物，纤维素底物的浓度，纤维素底物的预处理，非纤维素组分(例如天然或降解的木质素或半纤维素)，非纤维素酶组分，温度和反应时间。
所述醌化合物优选以不针对所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、纤维素分解酶和纤维素而受限的量存在。在一个方面，所述醌化合物以不针对所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽而受限的量存在。在另一个方面，所述醌化合物以不针对所述纤维素分解酶而受限的量存在。在另一个方面，所述醌化合物以不针对所述纤维素而受限的量存在。在另一个方面，所述醌化合物以不针对所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和纤维素分解酶而受限的量存在。在另一个方面，所述醌化合物以不针对所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和纤维素而受限的量存在。在另一个方面，所述醌化合物以不针对所述纤维素分解酶和纤维素而受限的量存在。在另一个方面，所述醌化合物以不针对所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、纤维素分解酶和纤维素而受限的量存在。
在一个方面，醌化合物对纤维素材料的有效量作为对纤维素的糖苷单元的摩尔比是约10-6至约10，例如，约10-6至约7.5，约10-6至约5，约10-6至约2.5，约10-6至约1，约10-5至约1，约10-5至约10-1，约10-4至约10-1，约10-3至约10-1，或约10-3至约10-2。在另一个方面，醌化合物对纤维素材料的有效量作为对纤维素的糖苷单元的摩尔比是约10-6至约10。在另一个方面，醌化合物对纤维素材料的有效量作为对纤维素的糖苷单元的摩尔比是约10-6至约7.5。在另一个方面，醌化合物对纤维素材料的有效量作为对纤维素的糖苷单元的摩尔比是约10-6至约5。在另一个方面，醌化合物对纤维素材料的有效量作为对纤维素的糖苷单元的摩尔比是约10-6至约2.5。在另一个方面，醌化合物对纤维素材料的有效量作为对纤维素的糖苷单元的摩尔比是约10-6至约1。在另一个方面，醌化合物对纤维素材料的有效量作为对纤维素的糖苷单元的摩尔比是约10-5至约1。在另一个方面，醌化合物对纤维素材料的有效量作为对纤维素的糖苷单元的摩尔比是约10-5至约10-1。在另一个方面，醌化合物对纤维素材料的有效量作为对纤维素的糖苷单元的摩尔比是约10-4至约10-1。在另一个方面，醌化合物对纤维素材料的有效量作为对纤维素的糖苷单元的摩尔比是约10-3至约10-1。在另一个方面，醌化合物对纤维素材料的有效量作为对纤维素的糖苷单元的摩尔比是约10-3至约10-2。
在另一个方面，醌化合物对纤维素的有效量是约10-6至约10g每g的纤维素，例如，约10-6至约7.5，约10-6至约5，约10-6至约2.5，约10-6至约1，约10-5至约1，约10-5至约10-1，约10-4至约10-1，约10-3至约10-1，或约10-3至约10-2g每g的纤维素。在另一个方面，醌化合物对纤维素的有效量是约10-6至约10g每g的纤维素。在另一个方面，醌化合物对纤维素的有效量是约10-6至约10g每g的纤维素。在另一个方面，醌化合物对纤维素的有效量是约10-6至约7.5g每g的纤维素。在另一个方面，醌化合物对纤维素的有效量是约10-6至约5g每g的纤维素。在另一个方面，醌化合物对纤维素的有效量是约10-6至约2.5g每g的纤维素。在另一个方面，醌化合物对纤维素的有效量是约10-6至约1g每g的纤维素。在另一个方面，醌化合物对纤维素的有效量是约10-5至约1g每g的纤维素。在另一个方面，醌化合物对纤维素的有效量是约10-5至约10-1g每g的纤维素。在另一个方面，醌化合物对纤维素的有效量是约10-4至约10-1g每g的纤维素。在另一个方面，醌化合物对纤维素的有效量是约10-3至约10-1g每g的纤维素。在另一个方面，醌化合物对纤维素的有效量是约10-3至约10-2g每g的纤维素。
在另一个方面，醌化合物的有效量是约0.1μM至约1M，例如，约0.5μM至约0.75M，约0.75μM至约0.5M，约1μM至约0.25M，约1μM至约0.1M，约5μM至约50mM，约10μM至约25mM，约50μM至约25mM，约10μM至约10mM，约5μM至约5mM，或约0.1mM至约1mM。在另一个方面，醌化合物的有效量是约0.1μM至约1M。在另一个方面，醌化合物的有效量是约0.5μM至约0.75M。在另一个方面，醌化合物的有效量是约0.75μM至约0.5M。在另一个方面，醌化合物的有效量是约1μM至约0.25M。在另一个方面，醌化合物的有效量是约1μM至约0.1M。在另一个方面，醌化合物的有效量是约5μM至约50mM。在另一个方面，醌化合物的有效量是约10μM至约25mM。在另一个方面，醌化合物的有效量是约50μM至约25mM。在另一个方面，醌化合物的有效量是约10μM至约10mM。在另一个方面，醌化合物的有效量是约5μM至约5mM。在另一个方面，醌化合物的有效量是约0.1mM至约1mM。
在一个方面，将一种或多种(例如几种)醌化合物用于本发明的任何方法。
在本发明的另一个方面，可从完成的糖化或完成的糖化和发酵中将所述醌化合物再循环至新的糖化。醌化合物可使用本领域标准方法，例如在蒸馏之前或之后过滤/离心以去除剩余的固体，然后重新循环至新的糖化来进行回收。
具有纤维素分解增强活性的多肽及其多核苷酸
在本发明的方法中，可使用任何具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。
在第一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽具有下述基序：
[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ](SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:126)和[FW]-[TF]-K-[AIV],
其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5个连续位置的任何氨基酸，和X(4)是在4个连续位置的氨基酸。
包含上述标示的基序的分离的多肽可进一步包含：
H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128)，
[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQ ID NO:129)，或
H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:131)和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQ ID NO:132)，
其中X是任何氨基酸，X(1,2)是在1个位置或2个连续位置的任何氨基酸，X(3)是在3个连续位置的任何氨基酸，和X(2)是在2个连续位置的任何氨基酸。在上述基序中，使用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。
在一个优选实施方案中，所述具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽进一步包含H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:133或SEQID NO:134)。在另一个优选实施方案中，所述具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽进一步包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQID NO:135)。在另一个优选实施方案中，所述具有纤维素分解增强活性的分离的GH61多肽进一步包含H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV](SEQ ID NO:136或SEQ ID NO:137)和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV](SEQID NO:138)。
在第二个方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽包含下述基序：
[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ](SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:140)，
其中其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5个连续位置的任何氨基酸，和X(3)是在3个连续位置的任何氨基酸。在上述基序中，使用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。
在第四个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ IDNO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:142，SEQ ID NO:144，SEQ ID NO:146，SEQ ID NO:148，SEQ ID NO:150，SEQ ID NO:152，SEQ ID NO:154，SEQ ID NO:156，SEQID NO:158，SEQ ID NO:160，SEQ ID NO:162或SEQ ID NO:164的成熟多肽具有优选至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，或至少95%，或至少100%且甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%的同一性程度。
在一个优选的方面，所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸20至326，SEQ ID NO:4的氨基酸18至239，SEQ ID NO:6的氨基酸20至258，SEQ IDNO:8的氨基酸19至226，SEQ ID NO:10的氨基酸20至304，SEQ ID NO:12的氨基酸23至250，SEQ ID NO:14的氨基酸22至249，SEQ ID NO:16的氨基酸20至249，SEQ ID NO:18的氨基酸18至232，SEQ ID NO:20的氨基酸16至235，SEQ ID NO:22的氨基酸19至323，SEQ ID NO:24的氨基酸16至310，SEQ ID NO:26的氨基酸20至246，SEQ ID NO:28的氨基酸22至354，SEQ ID NO:30的氨基酸22至250，或SEQ ID NO:32的氨基酸22至322，SEQ ID NO:34的氨基酸24至444，SEQ ID NO:36的氨基酸26至253，SEQ ID NO:38的氨基酸20至223，SEQ ID NO:40的氨基酸18至246，SEQ ID NO:42的氨基酸20至334，SEQ ID NO:44的氨基酸18至227，SEQ ID NO:46的氨基酸22至368，SEQ ID NO:48的氨基酸25至330，SEQID NO:50的氨基酸17至236，SEQ ID NO:52的氨基酸17至250，SEQ ID NO:54的氨基酸23至478，SEQ ID NO:56的氨基酸17至230，SEQ ID NO:58的氨基酸20至257，SEQ ID NO:60的氨基酸23至251，SEQ ID NO:62的氨基酸19至349，SEQ ID NO:64的氨基酸24至436，SEQ ID NO:142的氨基酸21至344，SEQ ID NO:144的氨基酸21至389，SEQ ID NO:146的氨基酸22至406，SEQ ID NO:148的氨基酸20至427，SEQ ID NO:150的氨基酸18至267，SEQ ID NO:152的氨基酸21至273，SEQ ID NO:154的氨基酸21至322，SEQ ID NO:156的氨基酸18至234，SEQ ID NO:158的氨基酸24至233，SEQ ID NO:160的氨基酸17至237，SEQ ID NO:162的氨基酸20至484，或SEQ ID NO:164的氨基酸22至320。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:的氨基酸序列2或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸20至326，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸20至326。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:4的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:4的氨基酸18至239，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:4的氨基酸18至239。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:6的氨基酸20至258，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:6的氨基酸20至258。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:8的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:8的氨基酸19至226，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:8的氨基酸19至226。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为EQ ID NO:10的成熟多肽S。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:10的氨基酸20至304，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:10的氨基酸20至304。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为的氨基酸序列SEQID NO:12或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:12的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:12的氨基酸16至317，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:12的氨基酸16至317。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:14的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:14的氨基酸23至250，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:14的氨基酸23至250。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为EQ ID NO:16的氨基酸序列S或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:16的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:16的氨基酸20至249，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:16的氨基酸20至249。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:18的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:18的氨基酸18至232，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:18的氨基酸18至232。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:20的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:20的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:20的氨基酸16至235，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:20的氨基酸16至235。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:22的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:22的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:22的氨基酸19至323，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:22的氨基酸19至323。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:24的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:24的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:24的氨基酸16至310，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:24的氨基酸16至310。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:26的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:26的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:26的氨基酸20至246，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:26的氨基酸20至246。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:28的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:28的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:28的氨基酸22至354，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:28的氨基酸22至354。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:30的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:30的氨基酸22至250，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:30的氨基酸22至250。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:32的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:32的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:32的氨基酸22至322，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:32的氨基酸22至322。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:34的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:34的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:34的氨基酸24至444，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:34的氨基酸24至444。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:36的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:36的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:36的氨基酸26至253，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:36的氨基酸26至253。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:38的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:38的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:38的氨基酸20至223，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:38的氨基酸20至223。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:40的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:40的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:40的氨基酸18至246，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:40的氨基酸18至246。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:42的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:42的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:42的氨基酸20至334，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:42的氨基酸20至334。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:44的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:44的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:44的氨基酸18至227，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:44的氨基酸18至227。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:46的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:46的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:46的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:46的氨基酸22至368，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:46的氨基酸22至368。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:48的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:48的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:48的氨基酸25至330，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:48的氨基酸25至330。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:50的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:50的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:50的氨基酸17至236，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:50的氨基酸17至236。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:52的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为的SEQ ID NO:52氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:52的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:52的氨基酸19至250，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:52的氨基酸19至250。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:54的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:54的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:54的氨基酸23至478，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:54的氨基酸23至478。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:56的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:56的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:56的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:56的氨基酸17至230，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:56的氨基酸17至230。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:58的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:58的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:58的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:58的氨基酸20至257，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:58的氨基酸20至257。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:60的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:60的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:60的氨基酸23至251，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:60的氨基酸23至251。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:62的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:62的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:62的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:62的氨基酸19至349，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:62的氨基酸19至349。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:64的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:64的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:64的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:64的氨基酸24至436，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:64的氨基酸24至436。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:142的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:142的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:142的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:142的氨基酸21至344，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:142的氨基酸21至344。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:144的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:144的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:144的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:144的氨基酸21至389，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:144的氨基酸21至389。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:146的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:146的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:146的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:146的氨基酸22至406，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:146的氨基酸22至406。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:148的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:148的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:148的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:148的氨基酸20至427，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:148的氨基酸20至427。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:150的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:150的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:150的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:150的氨基酸18至267，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:150的氨基酸18至267。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:152的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:152的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:152的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:152的氨基酸21至273，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:152的氨基酸21至273。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:154的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:154的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:154的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:154的氨基酸21至322，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:154的氨基酸21至322。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:156的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:156的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:156的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:156的氨基酸18至234，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:156的氨基酸18至234。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:158的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:158的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:158的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:158的氨基酸24至233，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:158的氨基酸24至233。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:160的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:160的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:160的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:160的氨基酸17至237，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:160的氨基酸17至237。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:162的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:162的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:162的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:162的氨基酸20至484，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:162的氨基酸20至484。
具有纤维素分解增强活性的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:164的氨基酸序列或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:164的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:164的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:164的氨基酸22至320，或其等位变体；或它们具有纤维素分解增强活性的片段。在另一个优选的方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:164的氨基酸22至320。
优选地，SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段含有至少277个氨基酸残基，更优选至少287个氨基酸残基，和最优选至少297个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:4的成熟多肽的片段含有至少185个氨基酸残基，更优选至少195个氨基酸残基，和最优选至少205个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:6的成熟多肽的片段含有至少200个氨基酸残基，更优选至少212个氨基酸残基，和最优选至少224个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:8的成熟多肽的片段含有至少175个氨基酸残基，更优选至少185个氨基酸残基，和最优选至少195个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:10的成熟多肽的片段含有至少240个氨基酸残基，更优选至少255个氨基酸残基，和最优选至少270个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:12的成熟多肽的片段含有至少255个氨基酸残基，更优选至少270个氨基酸残基，和最优选至少285个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:14的成熟多肽的片段含有至少175个氨基酸残基，更优选至少190个氨基酸残基，和最优选至少205个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:16的成熟多肽的片段含有至少200个氨基酸残基，更优选至少210个氨基酸残基，和最优选至少220个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:18的成熟多肽的片段含有至少185个氨基酸残基，更优选至少195个氨基酸残基，和最优选至少205个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:20的成熟多肽的片段含有至少190个氨基酸残基，更优选至少200个氨基酸残基，和最优选至少210个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:22的成熟多肽的片段含有至少260个氨基酸残基，更优选至少275个氨基酸残基，和最优选至少290个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:24的成熟多肽的片段含有至少250个氨基酸残基，更优选至少265个氨基酸残基，和最优选至少280个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:26的成熟多肽的片段含有至少195个氨基酸残基，更优选至少205个氨基酸残基，和最优选至少214个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:28的成熟多肽的片段含有至少285个氨基酸残基，更优选至少300个氨基酸残基，和最优选至少315个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:30的成熟多肽的片段含有至少200个氨基酸残基，更优选至少210个氨基酸残基，和最优选至少220个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:32的成熟多肽的片段含有至少255个氨基酸残基，更优选至少270个氨基酸残基，和最优选至少285个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:34的成熟多肽的片段含有至少360个氨基酸残基，更优选至少380个氨基酸残基，和最优选至少400个氨基酸残基。优选地，SEQ IDNO:36的成熟多肽的片段含有至少200个氨基酸残基，更优选至少210个氨基酸残基，和最优选至少220个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:38的成熟多肽的片段含有至少170个氨基酸残基，更优选至少180个氨基酸残基，和最优选至少190个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:40的成熟多肽的片段含有至少190个氨基酸残基，更优选至少200个氨基酸残基，和最优选至少210个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:42的成熟多肽的片段含有至少265个氨基酸残基，更优选至少280个氨基酸残基，和最优选至少295个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:44的成熟多肽的片段含有至少180个氨基酸残基，更优选至少190个氨基酸残基，和最优选至少200个氨基酸残基。优选地，SEQ IDNO:46的成熟多肽的片段含有至少320个氨基酸残基，更优选至少335个氨基酸残基，和最优选至少350个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:48的成熟多肽的片段含有至少255个氨基酸残基，更优选至少270个氨基酸残基，和最优选至少285个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:50的成熟多肽的片段含有至少190个氨基酸残基，更优选至少200个氨基酸残基，和最优选至少210个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:52的成熟多肽的片段含有至少200个氨基酸残基，更优选至少210个氨基酸残基，和最优选至少220个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:54的成熟多肽的片段含有至少380个氨基酸残基，更优选至少400个氨基酸残基，和最优选至少420个氨基酸残基。优选地，SEQ IDNO:56的成熟多肽的片段含有至少180个氨基酸残基，更优选至少190个氨基酸残基，和最优选至少200个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:58的成熟多肽的片段含有至少210个氨基酸残基，更优选至少220个氨基酸残基，和最优选至少230个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:60的成熟多肽的片段含有至少190个氨基酸残基，更优选至少200个氨基酸残基，和最优选至少210个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:62的成熟多肽的片段含有至少270个氨基酸残基，更优选至少290个氨基酸残基，和最优选至少310个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:64的成熟多肽的片段含有至少340个氨基酸残基，更优选至少360个氨基酸残基，和最优选至少380个氨基酸残基。优选地，SEQ IDNO:142的成熟多肽的片段含有至少280个氨基酸残基，更优选至少295个氨基酸残基，和最优选至少310个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:144的成熟多肽的片段含有至少310个氨基酸残基，更优选至少330个氨基酸残基，和最优选至少350个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:146的成熟多肽的片段含有至少320个氨基酸残基，更优选至少340个氨基酸残基，和最优选至少360个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:148的成熟多肽的片段含有至少350个氨基酸残基，更优选至少370个氨基酸残基，和最优选至少390个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:150的成熟多肽的片段含有至少220个氨基酸残基，更优选至少230个氨基酸残基，和最优选至少240个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:152的成熟多肽的片段含有至少220个氨基酸残基，更优选至少230个氨基酸残基，和最优选至少240个氨基酸残基。优选地，SEQID NO:154的成熟多肽的片段含有至少255个氨基酸残基，更优选至少270个氨基酸残基，和最优选至少285个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:156的成熟多肽的片段含有至少185个氨基酸残基，更优选至少195个氨基酸残基，和最优选至少205个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:158的成熟多肽的片段含有至少180个氨基酸残基，更优选至少190个氨基酸残基，和最优选至少200个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:160的成熟多肽的片段含有至少190个氨基酸残基，更优选至少200个氨基酸残基，和最优选至少210个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:164的成熟多肽的片段含有至少385个氨基酸残基，更优选至少410个氨基酸残基，和最优选至少435个氨基酸残基。优选地，SEQ ID NO:166的成熟多肽的片段含有至少255个氨基酸残基，更优选至少270个氨基酸残基，和最优选至少285个氨基酸残基。
优选地，SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少831个核苷酸，更优选至少861个核苷酸，和最优选至少891个核苷酸。优选地，SEQID NO:3的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少555个核苷酸，更优选至少585个核苷酸，和最优选至少615个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少600个核苷酸，更优选至少636个核苷酸，和最优选至少672个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少525个核苷酸，更优选至少555个核苷酸，和最优选至少585个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少720个核苷酸，更优选至少765个核苷酸，和最优选至少810个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少765个核苷酸，更优选至少810个核苷酸，和最优选至少855个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列的亚序列的核苷酸67至796含有至少525个核苷酸，更优选至少570个核苷酸，和最优选至少615个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少600个核苷酸，更优选至少630个核苷酸，和最优选至少660个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少555个核苷酸，更优选至少585个核苷酸，和最优选至少615个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少570个核苷酸，更优选至少600个核苷酸，和最优选至少630个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少780个核苷酸，更优选至少825个核苷酸，和最优选至少870个核苷酸。优选地，SEQID NO:23的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少750个核苷酸，更优选至少795个核苷酸，和最优选至少840个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:25的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少585个核苷酸，更优选至少615个核苷酸，和最优选至少645个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:27的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少855个核苷酸，更优选至少900个核苷酸，和最优选至少945个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:29的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少600个核苷酸，更优选至少630个核苷酸，和最优选至少660个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:31的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少765个核苷酸，更优选至少810个核苷酸，和最优选至少855个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:33的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少1180个核苷酸，更优选至少1140个核苷酸，和最优选至少1200个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:35的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少600个核苷酸，更优选至少630个核苷酸，和最优选至少660个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:37的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少170个氨基酸残基，更优选至少180个氨基酸残基，和最优选至少190个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:39的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少570个核苷酸，更优选至少600个核苷酸，和最优选至少630个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:41的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少795个核苷酸，更优选至少840个核苷酸，和最优选至少885个核苷酸。优选地，SEQID NO:43的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少540个核苷酸，更优选至少570个核苷酸，和最优选至少600个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:45的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少960个核苷酸，更优选至少1005个核苷酸，和最优选至少1050个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:47的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少765个核苷酸，更优选至少810个核苷酸，和最优选至少855个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:49的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少570个核苷酸，更优选至少600个核苷酸，和最优选至少630个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:51的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少600个核苷酸，更优选至少630个核苷酸，和最优选至少660个核苷酸。优选地，SEQ IDNO:53的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少1140个核苷酸，更优选至少1200个核苷酸，和最优选至少1260个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:55的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少540个核苷酸，更优选至少570个核苷酸，和最优选至少600个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:57的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少630个核苷酸，更优选至少690个核苷酸，和最优选至少720个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:59的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少570个核苷酸，更优选至少600个核苷酸，和最优选至少630个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:61的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少810个核苷酸，更优选至少870个核苷酸，和最优选至少930个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少1020个核苷酸，更优选至少1080个核苷酸，和最优选至少1140个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:141的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少840个核苷酸，更优选至少885个核苷酸，和最优选至少930个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:143的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少930个核苷酸，更优选至少960个核苷酸，和最优选至少1050个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:145的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少960个核苷酸，更优选至少1020个核苷酸，和最优选至少1080个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:147的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少1050个核苷酸，更优选至少1110个核苷酸，和最优选至少1170个核苷酸。优选地，SEQID NO:149的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少660个核苷酸，更优选至少690个核苷酸，和最优选至少720个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:151的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少660个核苷酸，更优选至少690个核苷酸，和最优选至少720个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:153的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少765个核苷酸，更优选至少810个核苷酸，和最优选至少855个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:155的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少555个核苷酸，更优选至少585个核苷酸，和最优选至少615个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:157的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少540个核苷酸，更优选至少570个核苷酸，和最优选至少600个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:159的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少570个核苷酸，更优选至少600个核苷酸，和最优选至少630个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:161的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少1155个核苷酸，更优选至少1230个核苷酸，和最优选至少1305个核苷酸。优选地，SEQ ID NO:163的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少765个核苷酸，更优选至少810个核苷酸，和最优选至少855个核苷酸。
在第四个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少非常低严格条件，优选至少低严格条件，更优选至少中等严格条件，更优选至少中-高严格条件，甚至更优选至少高严格条件，和最优选至少非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:141，SEQ ID NO:143，SEQ IDNO:145，SEQ ID NO:147，SEQ ID NO:149，SEQ ID NO:151，SEQ ID NO:153，SEQ ID NO:155，SEQ ID NO:157，SEQ ID NO:159，SEQ ID NO:161，或SEQ ID NO:163的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:155，SEQ ID NO:157，或SEQID NO:159的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或SEQ ID NO:1，SEQID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:141，SEQID NO:143，SEQ ID NO:145，SEQ ID NO:147，SEQ ID NO:149，SEQ ID NO:151，SEQ ID NO:153，SEQ ID NO:161，或SEQ ID NO:163的成熟多肽编码序列的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全长互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatus,1989，见上文)。SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQID NO:59，SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:141，SEQ ID NO:143，SEQ ID NO:145，SEQ ID NO:147，SEQ ID NO:149，SEQ ID NO:151，SEQ ID NO:153，SEQ ID NO:155，SEQ ID NO:157，SEQ ID NO:159，SEQID NO:161，或SEQ ID NO:163的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少100个连续核苷酸或优选至少200个连续核苷酸。而且，所述亚序列可编码具有纤维素分解增强活性的多肽片段。在一个优选的方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸388至1332，SEQ ID NO:3的核苷酸98至821，SEQ ID NO:5的核苷酸126至978，SEQ ID NO:7的核苷酸55至678，SEQID NO:9的核苷酸58至912，SEQ ID NO:11的核苷酸46至951，SEQ ID NO:13的核苷酸67至796，SEQ ID NO:15的核苷酸77至766，SEQ ID NO:17的核苷酸52至921，SEQ ID NO:19的核苷酸46至851，SEQ ID NO:21的核苷酸55至1239，SEQ ID NO:23的核苷酸46至1250，SEQ ID NO:25的核苷酸58至811，SEQ ID NO:27的核苷酸64至1112，SEQ ID NO:29的核苷酸64至859，SEQ ID NO:31的核苷酸64至1018，SEQ ID NO:33的核苷酸70至1483，SEQ ID NO:35的核苷酸76至832，SEQ ID NO:37的核苷酸58至974，SEQ ID NO:39的核苷酸52至875，SEQ ID NO:41的核苷酸58至1250，SEQ ID NO:43的核苷酸52至795，SEQ ID NO:45的核苷酸64至1104，SEQ ID NO:47的核苷酸73至990，SEQ ID NO:49的核苷酸49至1218，SEQ ID NO:51的核苷酸55至930，SEQ ID NO:53的核苷酸67至1581，SEQID NO:55的核苷酸49至865，SEQ ID NO:57的核苷酸58至1065，SEQ IDNO:59的核苷酸67至868，SEQ ID NO:61的核苷酸55至1099，SEQ ID NO:63的核苷酸70至1483，SEQ ID NO:141的核苷酸61至1032，SEQ ID NO:143的核苷酸61至1167，SEQ ID NO:145的核苷酸64至1218，SEQ ID NO:147的核苷酸58至1281，SEQ ID NO:149的核苷酸52至801，SEQ ID NO:151的核苷酸61至819，SEQ ID NO:153的核苷酸61至966，SEQ ID NO:155的核苷酸52至702，SEQ ID NO:157的核苷酸70至699，SEQ ID NO:159的核苷酸49至711，SEQ ID NO:161的核苷酸76至1452，或SEQ ID NO:163的核苷酸64至1018。
SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ IDNO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:141，SEQ ID NO:143，SEQ ID NO:145，SEQ ID NO:147，SEQ ID NO:149，SEQ ID NO:151，SEQ ID NO:153，SEQ ID NO:155，SEQ ID NO:157，SEQID NO:159，SEQ ID NO:161，或SEQ ID NO:163的核苷酸序列，或其亚序列；以及SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQID NO:28，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQID NO:56，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:142，SEQ ID NO:144，SEQ ID NO:146，SEQ ID NO:148，SEQID NO:150，SEQ ID NO:152，SEQ ID NO:154，SEQ ID NO:156，SEQ ID NO:158，SEQ ID NO:160，SEQ ID NO:162，或SEQ ID NO:164的氨基酸序列，或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有纤维素分解增强活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，优选至少25，更优选至少35，和最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针是至少100个核苷酸的长度。例如，所述核酸探针可为至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸的长度。可使用甚至更长的探针，例如优选至少600个核苷酸，更优选至少700个核苷酸，甚至更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。
因此，可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有纤维素分解增强活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ IDNO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:63，SEQID NO:141，SEQ ID NO:143，SEQ ID NO:145，SEQ ID NO:147，SEQ IDNO:149，SEQ ID NO:151，SEQ ID NO:153，SEQ ID NO:155，SEQ ID NO:157，SEQ ID NO:159，SEQ ID NO:161，或SEQ ID NO:163，或其亚序列杂交的克隆或DNA，将所述载体材料优选用在Sounthern印迹中。
就本发明而言，杂交表明所述核苷酸序列在非常低至非常高严格条件下杂交于标记的核酸探针，所述探针对应于SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQID NO:61，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:141，SEQ ID NO:143，SEQ ID NO:145，SEQ ID NO:147，SEQ ID NO:149，SEQ ID NO:151，SEQ ID NO:153，SEQ ID NO:155，SEQ ID NO:157，SEQ ID NO:159，SEQ ID NO:161，或SEQ ID NO:163的成熟多肽编码序列；SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQID NO:11，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:155，SEQ ID NO:157，或SEQ ID NO:159的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ IDNO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:141，SEQ IDNO:143，SEQ ID NO:145，SEQ ID NO:147，SEQ ID NO:149，SEQ ID NO:151，SEQ ID NO:153，SEQ ID NO:161，或SEQ ID NO:163的成熟多肽编码序列的cDNA序列；其全长互补链；或其亚序列，如上文所述。
在一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸388至1332。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:1。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pEJG120的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30699，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pEJG120的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30699。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:3的核苷酸98至821。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:4的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:3。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pTter61C的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30813，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pTter61C的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30813。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:5的核苷酸126至978。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:6的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:5。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pTter61D的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30812，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pTter61D的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30812。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:7的核苷酸55至678。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:8的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:7。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pTter61E的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30814，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pTter61E的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30814。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:9的核苷酸58至912在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:10的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:9。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pTter61G的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30811，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pTter61G的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30811。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:11的核苷酸46至951。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:12的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:11。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pTter61F的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50044，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pTter61F的成熟多肽编码区，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50044。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:13的核苷酸67至796。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码的多肽的多核苷酸序列SEQ ID NO:14，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:13。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pDZA2-7的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30704，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pDZA2-7的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30704。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:15的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:15的核苷酸77至766。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码的多肽的多核苷酸序列SEQ ID NO:16，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:15。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pTr3337的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30878，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pTr3337的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-30878。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:17的核苷酸52至921。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码的多肽的多核苷酸序列SEQ ID NO:18，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:17。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai190的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50084，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai190的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50084。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:19的核苷酸46至851。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:20的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:19。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai192的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50086，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai192的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50086。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:21的核苷酸55至1239。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:22的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:21。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai191的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50085，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai191的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50085。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:23的核苷酸46至1250。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:24的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:23。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai193的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50087，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai193的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50087。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:25的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:25的核苷酸58至811。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:26的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:25。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai187的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50083，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai187的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50083。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:27的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:27的核苷酸64至1112。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:28的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:27。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pXYZ1473的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌DSM22075，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pXYZ1473的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌DSM 22075。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:29的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:29的核苷酸64至859。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:30的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:29。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:31的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:31的核苷酸64至1018。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:32的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:31。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pGEM-T-Ppin7的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌DSM 22711，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pGEM-T-Ppin7的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌DSM 22711。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:33的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:33的核苷酸70至1483。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:34的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:33。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pXYZ1483的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌DSM 22600，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pXYZ1483的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌DSM 22600。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:35的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:35的核苷酸76至832。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:36的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ IDNO:35。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pGEM-T-GH61D23Y4的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌DSM22882，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pGEM-T-GH61D23Y4的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌DSM 22882。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:37的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:37的核苷酸58至974。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:38的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:37。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai213的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50300，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai213的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50300。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:39的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:39的核苷酸52至875。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:40的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:39。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai216的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50301，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai216的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50301。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:41的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:41的核苷酸58至1250。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:42的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:41。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒p pSMai217的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50302，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai217的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50302。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:43的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:43的核苷酸52至795。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:44的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:43。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai218的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50303，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pSMai218的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50303。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:45的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:45的核苷酸64至1104。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:46的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:45。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pAG68的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50320，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pAG68的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50320。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:47的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:47的核苷酸73至990。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:48的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:47。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pAG69的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50321，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pAG69的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50321。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:49的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:49的核苷酸49至1218。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:50的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:49。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pAG75的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50322，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pAG75的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50322。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:51的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:51的核苷酸55至930。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:52的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:51。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pAG76的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50323，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pAG76的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50323。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:53的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:53的核苷酸67至1581。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:54的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:53。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pAG77的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50324，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pAG77的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50324。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:55的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:55的核苷酸49至865。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:56的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:55。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pAG78的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50325，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pAG78的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50325。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:57的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:57的核苷酸58至1065。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:58的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:57。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒p pAG79的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50326，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pAG79的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50326。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:59的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:59的核苷酸67至868。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:60的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ IDNO:59。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pGEM-T-GH61a51486的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌DSM22656，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pGEM-T-GH61a51486的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌DSM 22656。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:61的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:61的核苷酸55至1099。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:62的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ IDNO:61。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pGEM-T-GH61DYF的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌DSM22654，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pGEM-T-GH61DYF的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌DSM 22654。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:63的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:63的核苷酸70至1483。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:64的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ IDNO:63。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pGEM-T-GH61D14YH的多核苷酸序列，所述质粒包含于大肠杆菌DSM22657，其中其多核苷酸序列编码具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一个优选的方面，所述核酸探针是包含于质粒pGEM-T-GH61D14YH的成熟多肽编码序列，所述质粒包含于大肠杆菌DSM 22657。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:141的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:141的核苷酸61至1032。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:141的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:141。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:143的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:143的核苷酸61至1167。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:143的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:143。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:145的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:145的核苷酸64至1218。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:145的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:145。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:147的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:147的核苷酸58至1281。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:147的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:147。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:149的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:149的核苷酸52至801。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:149的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:149。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:151的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:151的核苷酸61至819。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:151的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:151。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:153的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:153的核苷酸61至966。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:153的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ IDNO:153。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:155的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:155的核苷酸52至702。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:155的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ IDNO:155。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:157的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:157的核苷酸70至699。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:157的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ IDNO:157。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:159的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:159的核苷酸49至711。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:159的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ IDNO:159。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:161的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:161的核苷酸76至1452。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:161的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ IDNO:161。
在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:163的成熟多肽编码序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:163的核苷酸64至1018。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:163的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是SEQ IDNO:163。
对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严格性为25%的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35%的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50%的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在45℃(非常低严格性)，在50℃(低严格性)，在55℃(中严格性)，在60℃(中-高严格性)，在65℃(高严格性)，和在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:1390)计算的Tm低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5%NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodiumpyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。将所述载体材料在6×SSC加0.1%SDS中最终洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的Tm低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。
在第五个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQID NO:59，SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:143，SEQ ID NO:143，SEQ ID NO:145，SEQ ID NO:147，SEQ ID NO:149，SEQ ID NO:151，SEQ ID NO:153，SEQ ID NO:155，SEQ ID NO:157，SEQ ID NO:159，SEQID NO:161，或SEQ ID NO:163的成熟多肽编码序列具有优选至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，或至少95%，和甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%同一性程度。
在第六个方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽是SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，或SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ IDNO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ IDNO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:142，SEQ ID NO:144，SEQ ID NO:146，SEQ ID NO:148，SEQ ID NO:150，SEQ ID NO:152，SEQ ID NO:154，SEQ ID NO:156，SEQ ID NO:158，SEQ ID NO:160，SEQ IDNO:162，或SEQ ID NO:164成熟多肽包含一个或多个(例如几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的人工变体；或其同源序列。优选地，氨基酸改变的性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(polyhistidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。
保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
或者，氨基酸改变具有这样的性质：使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改善多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。
能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的纤维素分解增强活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等,1992,Science255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与参照的亲本多肽相关。
能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法接着进行有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等,1991,Biochemistry 30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene 46:145；Ner等,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域中的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:12，或SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，SEQ IDNO:38，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:64，SEQ IDNO:142，SEQ ID NO:144，SEQ ID NO:146，SEQ ID NO:148，SEQ ID NO:150，SEQ ID NO:152，SEQ ID NO:154，SEQ ID NO:156，SEQ ID NO:158，SEQ IDNO:160，SEQ ID NO:162，或SEQ ID NO:164的成熟多肽中氨基酸取代、缺失和/或插入的综述不超过10个，例如1，2，3，4，5，6，7，8或9个。
具有纤维素分解增强活性的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思应为由多核苷酸编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的菌株产生。在一个方面，从给定来源获得的多肽是胞外分泌的。
具有纤维素分解增强活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可为具有纤维素分解增强活性的革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽；或具有纤维素分解活性的革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽。
在一个方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。
在另一个方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。
在另一个方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。
所述具有纤维素分解增强活性的多肽可为真菌多肽，并更优选具有纤维素分解增强活性的酵母多肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽；或更优选具有纤维素分解增强活性的丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。
在另一个方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。
在另一个方面，所述多肽是具有纤维素分解增强活性的解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)或褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)多肽。
可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)。
此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得具有纤维素分解增强活性的多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选此种微生物的基因组DNA或cDNA文库来得到所述多核苷酸。一旦用探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以使用本领域普通技术人员公知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
可分离和利用包含编码具有纤维素分解增强活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸来表达具有纤维素分解增强活性的多肽以在本发明的方法中进行衡量。
用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，并包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，Innis等,1990,PCR:A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从菌株或相关生物体克隆所述多核苷酸，并且因此可为例如多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。
所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1，SEQID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQID NO:59，SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:141，SEQ ID NO:143，SEQ ID NO:145，SEQ ID NO:147，SEQ ID NO:149，SEQ ID NO:151，SEQ ID NO:153，SEQ ID NO:155，SEQ ID NO:157，SEQ ID NO:159，SEQID NO:161，或SEQ ID NO:163的成熟多肽编码序列具有优选至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，或至少95%，和甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%同一性程度，其编码具有纤维素分解增强活性的多肽。
所述多核苷酸亦可为编码具有纤维素分解增强活性的多肽的多核苷酸，其在至少非常低严格条件，优选至少低严格条件，更优选至少中等严格条件，更优选至少中-高严格条件，甚至更优选至少高严格条件，和最优选至少非常高严格条件与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:141，SEQ ID NO:143，SEQ ID NO:145，SEQ IDNO:147，SEQ ID NO:149，SEQ ID NO:151，SEQ ID NO:153，SEQ ID NO:155，SEQ ID NO:157，SEQ ID NO:159，SEQ ID NO:161，或SEQ ID NO:163的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:155，SEQ ID NO:157，或SEQ ID NO:159的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列或SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3，SEQID NO:5，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，SEQID NO:41，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:141，SEQ ID NO:143，SEQ ID NO:145，SEQ ID NO:147，SEQ ID NO:149，SEQ ID NO:151，SEQID NO:153，SEQ ID NO:161，或SEQ ID NO:163的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；或其等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，见上文)，如本文中所定义。
如前所述，用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。
酶组合物
所述酶组合物可包含任何可用于降解或转化纤维素材料的蛋白。
在一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(例如几种)选自下组的蛋白：纤维素酶，半纤维素酶，酯酶，棒曲霉素(expansin)，漆酶，木质素分解酶(ligninolytic enzyme)，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶和膨胀素(swollenin)。在另一个方面，所述纤维素酶优选为一种或多种(例如几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述半纤维素酶优选为一种或多种(例如几种)选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(例如几种)纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含或进一步包含一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(例如几种)纤维素分解酶和一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含一种或多种(例如几种)选自下组的酶：纤维素分解酶和半纤维素分解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
在另一个方面，所述酶组合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面酶组合物包含阿拉伯聚糖酶(例如α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含阿拉伯呋喃糖苷酶(例如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含香豆酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含阿魏酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含葡糖醛酸糖苷酶(例如，α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含葡糖醛酸酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含甘露聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含甘露糖苷酶(例如β-甘露糖苷酶)。在另一个方面，所述酶组合物包含木聚糖酶。在一个优选的方面，所述木聚糖酶为家族10木聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物包含木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)。
在另一个方面，所述酶组合物包含酯酶。在另一个方面，所述酶组合物包含棒曲霉素。在另一个方面，所述酶组合物包含漆酶。在另一个方面，所述酶组合物包含木质素分解酶。在一个优选的方面，所述木质素分解酶是锰过氧化物酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是木质素过氧化物酶。在另一个优选的方面，所述木质素分解酶是H2O2产生酶。在另一个方面，所述酶组合物包含果胶酶。在另一个方面，所述酶组合物包含过氧化物酶。在另一个方面，所述酶组合物包含蛋白酶。在另一个方面，所述酶组合物包含膨胀素(swollenin)。
在本发明的方法中，酶可在发酵之前或过程中添加，例如在糖化过程中或在发酵微生物繁殖过程中或之后添加。
所述酶组合物的一种或多种(例如几种)组分可为野生型蛋白、重组蛋白或野生型蛋白和重组蛋白的组合。例如，一种或多种(例如几种)组分可为细胞的天然蛋白，其用作宿主细胞以重组表达酶组合物的一种或多种(例如几种)其他组分。酶组合物的一种或多种(例如几种)组分可作为单组分产生，然后将其组合以形成酶组合物。所述酶组合物可为多组分和单组分蛋白制备物的组合。
用于本发明方法中的酶可为任何适于使用的形式，例如去除或未去除细胞的粗发酵液，具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液，半纯化或纯化的酶制备物，或宿主细胞，作为酶的来源。所述酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶制备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。
酶可源自或获得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。术语“获得”在本文中意指该酶可从天然产生该酶作为天然酶的生物分离。术语“获得”在本文中还意指该酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重组产生，其中经重组产生的酶对于宿主生物是天然的或异源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个(例如几个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶，其为天然氨基酸序列的片段和/或突变体或通过本领域已知的氨基酸改组方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖的是天然变体，而外来酶的含义中涵盖的是重组(如通过定位诱变或重排)获得的变体
具有酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有酶活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有酶活性。
在一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。
具有酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽，其具有酶活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽，其具有酶活性。
在一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielaviaperuviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)或或褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)多肽。
还可以使用具有酶活性的多肽经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。
所述酶组合物的一种或多种(例如几种)组分可以是重组组分，亦即，通过克隆编码所述单组分的DNA序列并随后用该DNA序列转化细胞并在宿主中表达(参见，例如，WO91/17243和WO91/17244)而产生。所述宿主优选是异源宿主(酶对宿主是异源的)，但该宿主在一定条件下也可以是同源宿主(酶对宿主是天然的)。单组分纤维素分解酶还可以通过从发酵液中纯化这样的蛋白质来制备。
在一个方面，所述一种或多种(例如几种)纤维素分解酶包含商业的纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商业的纤维素分解酶制备物的实例包括，例如，CELLICTMCtec(Novozymes A/S)、CELLICTMCtec2(Novozymes A/S)、CELLUCLASTTM(Novozymes A/S)、NOVOZYMTM188(Novozymes A/S)、CELLUZYMETM(Novozymes A/S)、CEREFLOTM(Novozymes A/S)和ULTRAFLOTM(Novozymes A/S)，ACCELERASETM(Genencor Int.)、LAMINEXTM(Genencor Int.)、SPEZYMETMCP(Genencor Int.)，FILTRASE
Figure BDA00003043605400731
NL(DSM)；METHAPLUSS/L 100(DSM)，ROHAMENTTM7069 W(
Figure BDA00003043605400742
GmbH)，FIBREZYME
Figure BDA00003043605400743
LDI(Dyadic International,Inc.)、FIBREZYME
Figure BDA00003043605400744
LBR(Dyadic International,Inc.)或VISCOSTAR
Figure BDA00003043605400745
150L(Dyadic International,Inc.)。纤维素酶以固体的约0.001到约5.0wt.%，更优选固体的0.025到约4.0wt.%，且最优选固体的约0.005到约2.0wt.%的有效量添加。纤维素酶以固体的约0.001至约5.0wt%，更优选固体的约0.025至约4.0wt%，且最优选固体的约0.005至约2.0wt%的有效量添加。
可以用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO93/15186;美国专利5,275,944；WO 96/02551；美国专利5,536,655，WO00/70031，WO 05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO05/093050)；和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。
可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等,1986,Gene 45:253-263)；里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I；GENBANKTM登录号M15665；SEQ ID NO:66)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等,1988,Gene 63:11-22；里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II；GENBANKTM登录号M19373；SEQ ID NO:68)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等,1988,Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GENBANKTM登录号AB003694；SEQ ID NO:70)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等,1994,Molecular Microbiology 13:219-228；GENBANKTM登录号Z33381；SEQ ID NO:72)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等,1990,Nucleic Acids Research 18:5884)；川地曲霉(Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等,1995,CurrentGenetics 27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等,1990,Gene 90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号L29381)；灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号AB003107)；Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V(SEQ ID NO:74)；嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:76)；担子菌纲(basidiomycete)CBS 495.95内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:78)；担子菌纲CBS 494.95内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:80)；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL6B内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:82)；土生梭孢霉NRRL8126 CEL6C内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:84)；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL7C内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:86)；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL7E内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:88)；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL7F内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:90)；Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A内切葡聚糖酶(SEQ IDNO:92)；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:94；GENBANKTM登录号M15665)。上述SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:68，SEQ IDNO:70，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:84，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:88，SEQ ID NO:90，SEQ ID NO:92，和SEQ ID NO:94的内切葡聚糖酶分别由SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:71，SEQID NO:73，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:79，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:91，和SEQ ID NO:93的成熟多肽编码序列所编码。
可用于本发明的纤维二糖水解酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:96)；里氏木霉纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:98)；特异腐质霉纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:100)、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:104)、土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)(SEQ ID NO:106)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:108)以及嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II(SEQ ID NO:110)。上述SEQ ID NO:96，SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:102，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:106，SEQ ID NO:108，SEQ ID NO:110，和SEQ ID NO:112的纤维二糖水解酶分别由SEQ ID NO:97，SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:103，SEQ ID NO:105，SEQ ID NO:107，和SEQ ID NO:109的成熟多肽编码序列所编码。
可用于本发明的β-葡糖苷酶的实例包括但不仅限于米曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:112)；烟曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:114)；巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)IBT20888β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:116)；黑曲霉β-葡糖苷酶(SEQID NO:118)；以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:120)。上述SEQ ID NO:112，SEQ ID NO:114，SEQ ID NO:116，SEQ ID NO:118，和SEQ ID NO:120的β-葡糖苷酶分别由SEQ ID NO:111，SEQ ID NO:113，SEQ ID NO:115，SEQ ID NO:117，和SEQ ID NO:119的成熟多肽编码序列所编码。
可用于本发明的其它β-葡糖苷酶包括SEQ ID NO:122的米曲霉β-葡糖苷酶变体融合蛋白或SEQ ID NO:124的米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。SEQ IDNO:122和SEQ ID NO:124的β-葡糖苷酶融合蛋白分别由SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:123所编码。
具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根据WO 2002/095014获得。具有β-葡糖苷酶活性的烟曲霉多肽可根据WO 2005/047499获得。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可根据WO 2007/019442获得。具有β-葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可根据Dan等,2000,J.Biol.Chem.275:4973-4980获得。具有β-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可根据Kawaguchi等,1996,Gene 173:287-288获得。
其它可用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶使用根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities,Biochem.J.280:309-316和Henrissat B.和Bairoch A.,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem.J.316:695-696的分类公开于许多糖基水解酶家族中。
其它可用于本发明的纤维素分解酶描述于EP 495,257、EP 531,315、EP531,372、WO 89/09259、WO 94/07998、WO 95/24471、WO 96/11262、WO96/29397、WO 96/034108、WO 97/14804、WO 98/08940、WO 98/012307、WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 98/028411、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025846、WO 99/025847、WO 99/031255、WO2000/009707、WO 2002/050245、WO 2002/0076792、WO 2002/101078、WO2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、WO 2007/071818、WO2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、美国专利No.4,435,307、美国专利No.5,457,046、美国专利No.5,648,263、美国专利No.5,686,593、美国专利No.5,691,178、美国专利No.5,763,254以及美国专利No.5,776,757。
在一个方面，所述一种或多种(例如几种)半纤维素分解酶包含商业的半纤维素分解酶制备物。适用于本发明的商业性半纤维素分解酶制备物的实例包括，例如SHEARZYMETM(Novozymes A/S)、CELLICTM HTec(NovozymesA/S)、CELLICTM Htec2 (Novozymes A/S)、VISCOZYME
Figure BDA00003043605400761
(Novozymes A/S)、ULTRAFLO
Figure BDA00003043605400771
(Novozymes A/S)、PULPZYMEHC(Novozymes A/S)、MULTIFECT
Figure BDA00003043605400773
Xylanase(Genencor)、ACCELLERASE
Figure BDA00003043605400774
XY(Genencor)、ACCELLERASE
Figure BDA00003043605400775
XC(Genencor)、ECOPULP
Figure BDA00003043605400776
TX-200A(AB Enzymes)、HSP6000 Xylanase(DSM)、DEPOLTM 333P(Biocatalysts Limit,Wales,UK)、DEPOLTM 740L.(Biocatalysts Limit,Wales,UK)和DEPOLTM 762P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)。
可用于本发明方法的木聚糖酶的实例包括但不限于棘孢曲霉(Aspergillu saculeatus)木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790;WO 94/21785)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)木聚糖酶(WO 2006/078256)和土生梭孢霉(Thielavia terrestris)NRRL 8126木聚糖酶(WO 2009/079210)。
可用于本发明方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458),埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(SwissProt登录号Q8X212)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(SwissProt登录号Q7SOW4)。
可用于本发明方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)乙酰木聚糖酯酶(WO 2005/001036)、粗糙脉孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登录号q7s259)、土生梭孢霉NRRL8126乙酰木聚糖酯酶(WO2009/042846)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q2GWX4)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登录号AAB82124)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q0UHJ1)和特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800乙酰木聚糖酯酶(WO 2009/073709)。
可用于本发明方法的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于特异腐质霉DSM1800阿魏酸酯酶(WO 2009/076122)、粗糙脉孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登录号Q9HGR3)和费希新萨托菌(Neosartorya fischer)阿魏酸酯酶(UniProt登录号A1D9T4)。
可用于本发明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800阿拉伯呋喃糖苷酶(WO 2009/073383)和黑曲霉(Aspergillus niger)阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登录号AAR94170)。
可用于本发明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于棒曲霉(Aspergillus clavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号alcc12)、里氏木霉(Trichoderma reesei)α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q99024)、埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号Q8X211)、黑曲霉(Aspergillus niger)α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(Aspergillus terreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q0CJP9)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q4WW45)。
用于本发明方法的酶和蛋白可通过在含有合适碳源和氮源和无机盐的营养培养基上，使用本领域已知方法(参见，例如Bennett,J.W.和LaSure,L.(编),More Gene Manipulations in Fungi,Academic Press,CA,1991)发酵上述指出的微生物菌株来产生。合适的培养基可从供应商获得，或可根据已公开组成制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录)。适于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域是已知的(参见，例如Bailey,J.E.和Ollis,D.F.,BiochemicalEngineering Fundamentals,McGraw-Hill Book Company,NY,1986)。
所述发酵可以是任何其结果为酶表达或分离的培养细胞的方法。因此，发酵可以理解为包括在合适的培养基中并在允许所述酶得以表达或分离的条件下进行的摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中的小-或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。通过上述方法产生的所得的酶可从发酵培养基回收并通过常规方法纯化。
核酸构建体
可以以多种方式操作编码多肽，例如具有纤维素分解增强活性的多肽、纤维素分解酶、半纤维素分解酶等的分离的多核苷酸，以提供多肽的表达，即构建包含编码多肽的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个(例如几个)调控序列，所述调控序列指导编码序列在合适的宿主细胞中在与所述调控序列相容的条件下的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的序列的技术是本领域熟知的。
调控序列可为启动子序列，其是由用于表达编码多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别的多核苷酸。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25)。另外的启动子在″Useful proteinsfrom recombinant bacteria″于Gilbert等,1980,Scientific American,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上文中描述。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自在曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在曲霉属中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在构巢曲霉和米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast 8:423-488描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是合适的前导序列，当被转录时其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽，并且指导所述多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列异源的信号肽编码序列。异源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码区时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews 57:109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码区由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。前肽编码序列可从如下酶的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子。
当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的N端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。
同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸可与调节序列可操作地连接。
表达载体
多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(例如几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸，例如具有纤维素分解增强活性的多肽，纤维素分解酶，半纤维素分解酶等。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸构建体来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
所述载体优选地含有一个或多个(例如几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
所述载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene 98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的多核苷酸插入宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
宿主细胞
包含编码多肽，例如具有纤维素分解增强活性的多肽、纤维素分解酶、半纤维素分解酶等的多核苷酸的重组宿主细胞可有利地用于多肽的重组产生。将包含此种多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞，使载体如前所述作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是在多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques 6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic AcidsRes.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods 64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of TheFungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上文)。
真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238 023，Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474和Christensen等,1988,Bio/Technology 6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume194,pp 182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1920。
产生方法
产生多肽，例如具有纤维素分解增强活性的多肽、纤维素分解酶、半纤维素分解酶等的方法，包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。
或者，产生多肽，例如具有纤维素分解增强活性的多肽、纤维素分解酶、半纤维素分解酶等的方法包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。
在产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzyme assay)可用于测定多肽的活性。具有纤维素分解增强活性的多肽是使用本文中所述的方法检测的。
所得的培养液可按原样使用或可以使用本领域已知的方法回收多肽。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收多肽，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和LarsRyden编,VCH Publishers,New York,1989)。
在可选的方面，不回收多肽，而将表达多肽的宿主细胞用作多肽的来源。
处理纤维素材料的方法
本发明的组合物和方法可以用于将纤维素材料糖化成可发酵糖，并且将可发酵糖转化成很多有用的物质，例如燃料、饮用乙醇和/或发酵产物(例如酸、醇、酮、气体等)。从纤维素材料产生期望的发酵产物通常涉及预处理、酶水解(糖化)和发酵。
本发明亦涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物存在下用酶组合物处理纤维素材料。在一个方面，上述方法进一步包括回收经降解或转化的纤维素材料。纤维素材料的降解或转化的可溶性产物可使用本领域公知的技术如例如离心、过滤和重力沉降来与不溶性纤维素材料分离。
本发明亦涉及用于产生发酵产物的方法，其包括：(a)在具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的存在下用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
本发明亦涉及发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料在具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的存在下经酶组合物糖化。在一个方面，纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个方面，所述方法进一步包括从发酵回收发酵产物。
在一个方面，将醌化合物在糖化或发酵之后回收，并再循环回新的糖化反应。醌化合物的再循环可使用本领域中常规的工艺完成。
根据本发明的纤维素材料的处理可以使用本领域的常规过程完成。此外，本发明的方法能使用经配置以依照发明操作的任何常规生物质处理设备进行。
水解(糖化)和发酵，分别或同时，包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，和直接微生物转化(DMC)，有时亦称为统一生物加工(consolidated bioprocessing，CBP)。SHF使用分离的处理步骤以首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖，纤维二糖、纤维三糖和戊糖单体，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。在SSF中，将纤维素材料的酶水解和糖变为乙醇的发酵组合在一个步骤中(Philippidis,G.P.,1996,Cellulose bioconversion technology,于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor & Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan,J.,和Himmel,M.,1999,Enzymes,energy and the environment:A strategic perspective on the U.S.Department of Energy’s research and development activities for bioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同步糖化和水解步骤之外，还涉及单独的水解步骤，所述步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度进行，即，高温酶糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个(例如几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、水解和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将纤维素材料转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶(Lynd,L.R.,Weimer,P.J.,van Zyl,W.H.,和Pretorius,I.S.,2002,Microbial cellulose utilization:Fundamentals andbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews 66:506-577)。在本文可以理解的是，本领域中任何已知的方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵，或它们的组合，可用于实施本发明的方法。
常规设备包括补料批式搅拌反应器、批式搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器和/或连续活塞流柱式反应器(Fernanda de Castilhos Corazza,Flávio Faria de Moraes,Gisella Maria Zanin和Ivo Neitzel,2003,Optimal controlin fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis,Acta Scientiarum.Technology25:33-38;Gusakov,A.V.,和Sinitsyn,A.P.,1985,Kinetics of the enzymatichydrolysis of cellulose:1.A mathematical model for a batch reactor process,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反应器(Ryu,S.K.,和Lee,J.M.,1983,Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov,A.V.,Sinitsyn,A.P.,Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,O.V.,1996,Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactorwith intensive stirring induced by electromagnetic field,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反应器类型包括：流化床、升流层(upflowblanket)、固定化和用于水解和/或发酵的挤出机型的反应器。
预处理。在本发明的方法的实施中，可以使用本领域已知的任何预处理过程破坏植物细胞壁的纤维素材料组分(Chandra等,2007,Substratepretreatment:The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics?Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93;Galbe和Zacchi,2007,Pretreatment oflignocellulosic materials for efficient bioethanol production,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65;Hendriks和Zeeman,2009,Pretreatments to enhance thedigestibility of lignocellulosic biomass,Bioresource Technol.100:10-18;Mosier等,2005,Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosicbiomass,Bioresource Technol.96:673-686;Taherzadeh和Karimi,2008,Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production:A review,Int.J.of Mol.Sci.9:1621-1651;Yang和Wyman,2008,Pretreatment:the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol,Biofuels Bioproducts andBiorefining-Biofpr.2:26-40)。
纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、预浸泡、润湿、洗涤或调节。
常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿法氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧和γ辐射预处理。
可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料。预处理优选在水解前进行。或者，预处理可以与酶水解同时进行以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身使一些生物质转化成可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。
蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素和纤维素，使酶可接触纤维素和其它级分，例如，半纤维素。将纤维素材料通过或穿过反应容器，其中注入蒸汽以将温度增加至需要的温度和压力，并且在其中保持期望的反应时间。蒸汽预处理优选在140-230℃，更优选160-200℃，并且最优选170-190℃进行，其中最优的温度范围依赖于加入的任何化学催化剂。蒸汽预处理的停留时间优选1-15分钟，更优选3-12分钟，并且最优选4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范围和加入的任何化学催化剂。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，使纤维素材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的物质的爆炸放料(explosive discharge)组合，这称为蒸汽爆炸，即，快速闪变至大气压和物质的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray,1996,Bioresource Technology855:1-33;Galbe和Zacchi,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628;美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，切割半纤维素乙酰基团，并且得到的酸自催化纤维素部分水解成单糖和寡糖。去除木质素仅至有限的程度。
经常在蒸汽预处理之前加入催化剂如H2SO4或SO2(通常0.3至3%w/w)，其可减少时间，降低温度，增加回收率，并改进酶水解(Ballesteros等,2006,Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508;Varga等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523;Sassner等.,2006,Enzyme Microb.Technol.39:756-762)。
化学预处理：术语“化学处理“指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学预处理。合适的化学预处理步骤的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿法氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)和有机溶剂预处理。
在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流式反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray,1996,supra;Schell等,2004,BioresourceTechnol.91:179-188;Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。
还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱性预处理包括，但不限于，石灰预处理、湿法氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。
用碳酸钙、氢氧化钠或氨，在85-150℃的低温进行石灰预处理，停留时间从1小时到几天(Wyman等,2005,Bioresource Technol.96:1959-1966;Mosier等,2005,Bioresource Technol.96:673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900和WO 2006/110901公开了使用氨的预处理方法。
湿法氧化是热预处理，通常在180-200℃进行5-15分钟，加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen,1998,Bioresource Technol.64:139-151;Palonen等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17;Varga等,2004,Biotechnol.Bioeng.88:567-574;Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。预处理以优选1-40%干物质，更优选2-30%干物质，并且最优选5-20%干物质进行，并且由于加入碱如碳酸钠，初始pH经常会增加。
湿法氧化预处理方法的修改方法，称为湿爆炸(湿法氧化和蒸汽爆炸的组合)，能够处理高达30%的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO2006/032282)。
氨纤维爆炸(AFEX)涉及在中温如90-100℃和高压如17-20bar，用液体或气体氨将纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可高达60%(Gollapalli等,2002,Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35;Chundawat等,2007,Biotechnol.Bioeng.96:219-231;Alizadeh等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141;Teymouri等,2005,Bioresource Technol.96:2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素解聚，和半纤维素的部分水解。木质素-糖复合物得到切割。
有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40-60%乙醇)在160-200℃提取30-60分钟而将纤维素材料去木质素化(Pan等,2005,Biotechnol.Bioeng.90:473-481;Pan等,2006,Biotechnol.Bioeng.94:851-861;Kurabi等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。经常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，去除大部分半纤维素。
合适的预处理方法的其他实例如Schell等,2003,Appl.Biochem andBiotechn.Vol.105-108:69-85,和Mosier等,2005,Bioresource Technology 96:673-686,和美国专利公开申请2002/0164730所述。
在一个方面，化学预处理优选作为酸处理，并且更优选作为连续稀酸和/或弱酸(mild acid)处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。弱酸处理在优选1-5，更优选1-4，并且最优选1-3的pH范围内进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01至20wt%酸，更优选0.05至10wt%酸，甚至更优选0.1至5wt%酸，并且最优选0.2至2.0wt%酸的范围内。酸与纤维素材料接触，并在优选160-220℃，和更优选165-195℃范围内的温度保持数秒到数分钟，例如1秒-60分钟的时间。
在另一个方面，预处理作为氨纤维爆炸步骤(AFEX预处理步骤)进行。
在另一个方面，预处理发生在含水浆料中。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材料以优选10-80wt%，更优选20-70wt%，并且最优性30-60wt%，如约50wt%的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或者使用本领域任何已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。
机械预处理：术语“机械预处理”指各种类型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。
物理预处理：术语“物理预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何预处理。例如，物理预处理可涉及辐射(例如，微波辐射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)和它们的组合。
物理预处理可以涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在一个方面，高压指优选约300至约600psi，更优选约350至约550psi，并且最优选约400至约500psi，如约450psi的压力。在另一个方面，高温指约100至300℃，优选约140至235℃的温度。在一个优选的方面，机械预处理在使用如上所定义的高温和高压的分批过程、蒸汽枪水解器系统，例如来自Sunds Defibrator AB,Sweden的Sunds Hydrolyzer中进行。
组合的物理和化学预处理：可以对纤维素材料进行物理和化学预处理。例如，预处理步骤可以涉及稀酸或弱酸处理和高的温度和/或压力处理。根据需要，可以顺序或同时进行物理和化学预处理。还可以包括机械预处理。
因此，在一个优选的方面，对纤维素材料进行机械、化学或物理预处理，或者它们的任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
生物预处理：术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment ofbiomass,于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor & Francis,Washington,DC,179-212;Ghosh和Singh,1993,Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion oflignocellulosic biomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMillan,J.D.,1994,Pretreating lignocellulosic biomass:a review,于Enzymatic Conversion ofBiomass for Fuels Production,Himmel,M.E.,Baker,J.O.,和Overend,R.P.,编,ACS Symposium Series566,American Chemical Society,Washington,DC,第15章;Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production fromrenewable resources,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.,编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241;Olsson和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331;和Vallander和Eriksson,1990,Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of the art,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
糖化。在水解(也称作糖化)步骤中，将例如经预处理的纤维素材料水解以将纤维素或者还有半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶组合物以酶法在具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物存在下进行。组合物的酶和蛋白组分可顺序加入。
酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中进行。在一个优选的方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最优的条件下进行。水解可以作为补料批式或连续的工艺进行，其中将经预处理的纤维素材料(底物)逐渐补加至，例如，含酶的水解溶液中。
糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是通常优选进行约12至约96小时，更优选约16至约72小时，并且最优选约24至约48小时。温度优选约25℃至约70℃，更优选约30℃至约65℃，并且最优选约40℃至约60℃，特别是约50℃。pH优选约3至约8，更优选约3.5至约7，并且最优选约4至约6，特别是约pH5。干燥固体含量优选约5至约50wt%，更优选约10至约40wt%，并且最优选约20至约30wt%。
具有纤维素分解增强活性的多肽和酶的最优量取决于几种因素，包括但不限于组分纤维素分解酶的混合物，纤维素底物，纤维素底物的浓度，纤维素底物的预处理，温度，时间，pH和发酵生物的包含(例如用于同时糖化和发酵的酵母)。
在一个方面，纤维素分解或半纤维素分解酶蛋白对纤维素材料的有效量为约0.5至50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至约25mg，更优选约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约0.5至约10mg，且最优选约2.5至约10mg每g纤维素材料。
在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽对纤维素材料的有效量为约0.01至约50.0mg，优选约0.01至约40mg，更优选约0.01至约30mg，更优选约0.01至约20mg，更优选约0.01至约10mg，更优选约0.01至约5mg，更优选约0.025至约1.5mg，更优选约0.05至约1.25mg，更优选约0.075至约1.25mg，更优选约0.1至约1.25mg，甚至更优选约0.15至约1.25mg，且最优选约0.25至约1.0mg每g纤维素材料。
在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽对纤维素分解酶蛋白的有效量为约0.005至约1.0g，优选约0.01至约1.0g，更优选约0.15至约0.75g，更优选约0.15至约0.5g，更优选约0.1至约0.5g，甚至更优选约0.1至约0.5g，且最优选约0.05至0.2g每g纤维素分解酶蛋白。
发酵。可通过一种或多种(例如几种)能将糖直接或间接发酵成所需发酵产物的发酵微生物发酵自经水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳产品)、皮革业和烟草业的发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领域的技术人员容易地确定。
在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和发酵可以是单独或同时的。
在实施本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的经水解的纤维素材料。通常根据所需发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择所述材料，如本领域中所公知的。
术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同时糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。
“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法以产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是C6和/或C5发酵生物体，或它们的组合。C6和C5发酵生物体均在本领域公知。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所需的发酵产品。
可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等,2006,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。
能发酵C6糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种，优选酿酒酵母。
能发酵C5糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如一些酵母。优选的C5发酵酵母包括毕赤酵母属，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773；假丝酵母属，优选博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、芸薹假丝酵母(Candida brassicae)、休哈塔假丝酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。
其它发酵生物体包括发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)的菌株；克鲁维酵母属，如脆壁克鲁维酵母的菌株；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)的菌株；大肠杆菌，特别是已经经过遗传修饰而改进乙醇产量的大肠杆菌菌株；梭菌属(Clostridium)，如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、热纤维梭菌(Chlostridium thermocellum)和Chlostridiumphytofermentans的菌株；地芽孢杆菌属菌种的菌株；热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，如解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobactersaccharolyticum)的菌株；和芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌的菌株。
在一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在一个更优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个优选的方面，酵母是假丝酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在另一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversion technology,于Handbook on Bioethanol:Production andUtilization,Wyman,C.E.编,Taylor & Francis,Washington,DC,179-212)。
能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌、丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌、Chlostridium phytofermentans、地芽孢杆菌属菌种、解糖热厌氧杆菌和凝结芽孢杆菌(Philippidis,1996,见上文)。
在一个优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，细菌是热纤维梭菌。
商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如ETHANOL REDTM酵母(可从Red Star/Lesaffre,USA获得)、FALITM(可从Fleischmann’s Yeast,BurnsPhilp Food Inc.,USA获得)、SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(可从Ethanol Technology,WI,USA获得)、BIOFERMTMAFT和XR(可从NABC-North American Bioproducts Corporation,GA,USA获得)、GERTSTRANDTM(可从Gert Strand AB,Sweden获得)和FERMIOLTM(可从DSMSpecialties获得)。
在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
通过将异源基因克隆入多种发酵微生物已经构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho,1993,Cloning and improving theexpression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147;Ho等,1998,Genetically engineeredSaccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859;Kotter和Ciriacy,1993,Xylosefermentation by Saccharomyces cerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783;Walfridsson等,1995,Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiaestrains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose phosphatepathway enzymes transketolase and transaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190;Kuyper等,2004,Minimal metabolic engineering of Saccharomycescerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation:a proof of principle,FEMSYeast Research 4:655-664;Beall等,1991,Parametric studies of ethanolproduction from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli,Biotech.Bioeng.38:296-303;Ingram等,1998,Metabolic engineering of bacteria forethanol production,Biotechnol.Bioeng.58:204-214;Zhang等,1995,Metabolicengineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonasmobilis,Science 267:240-243;Deanda等,1996,Development of anarabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470;WO 2003/062430,xyloseisomerase)。
在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是克鲁维酵母属菌种。
本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。
通常向降解的木素纤维素或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96小时，如约24至约60小时发酵。温度通常为约26℃至约60℃，特别是约32℃或50℃，并且在约pH 3至约pH 8，如约pH 4-5、6或7。
在一个优选的方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在一个优选的方面，温度优选为约20℃至约60℃，更优选约25℃至约50℃，并且最优选约32℃至约50℃，特别是约32℃或50℃，并且pH通常为约pH 3至约pH 7，优选约pH 4-7。然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约105-1012，优选约107-1010，特别是约2x108活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可以在例如“The AlcoholTextbook”(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall编,Nottingham University Press,United Kingdom 1999)中找到，其通过提述并入本文。
对于乙醇生产，在发酵后蒸馏发酵的浆料以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；饮料乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。
发酵刺激剂可以与本文所述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵工艺，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等,Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by avitamin feeding strategy during fed-batch process,Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
发酵产物：发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可为，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、正丁醇、异丁醇，乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、甘油、山梨醇和木糖醇)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)，环烷烃(例如环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷)，烯烃(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含一个或多个羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是正丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是异丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。另一个更优选的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerin)。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerol)。在另一个更优选的方面，所述醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources,于Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.编,Springer-Verlag BerlinHeidelberg,Germany,65:207-241;Silveira,M.M.,和Jonas,R.,2002,Thebiotechnological production of sorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408;Nigam,P.,和Singh,D.,1995,Processes for fermentative production of xylitol–asugar substitute,Process Biochemistry 30(2):117-124;Ezeji,T.C.,Qureshi,N.和Blaschek,H.P.,2003,Production of acetone,butanol and ethanol by Clostridiumbeijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping,World Journal ofMicrobiology and Biotechnology 19(6):595-603。
在另一个优选的方面，发酵产物是烷烃。所述烷烃可为未支化或支化的烷烃。在另一个更优选的方面，所述烷烃是戊烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是己烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是庚烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是辛烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是壬烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是癸烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十一烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十二烷。
在另一个优选的方面，发酵产物是环烷烃。在另一个优选的方面，所述环烷烃是环戊烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环己烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环庚烷。在另一个更优选的方面所述环烷烃是环辛烷。
在另一个优选的方面，发酵产物是烯烃。所述烯烃可为未支化或支化的烯烃。在另一个更优选的方面，所述烯烃是戊烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是己烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是庚烯，在另一个更优选的方面，所述烯烃是辛烯。
在另一个优选的方面，发酵产物是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard,A.,和Margaritis,A.,2004,Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers,Biotechnology and Bioengineering87(4):501-515。
在另一个优选的方面，发酵产物是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如Kataoka,N.,A.Miya和K.Kiriyama,1997,Studies on hydrogen production bycontinuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria,WaterScience and Technology 36(6-7):41-47；以及Gunaseelan V.N.于Biomass andBioenergy,Vol.13(1-2),pp.83-114,1997,Anaerobic digestion of biomass formethane production:A review。
在另一个优选的方面，发酵产物是异戊二烯。
在另一个优选的方面，发酵产物是酮。应理解的是术语“酮”涵盖包含一个或多个酮模块的物质。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如Qureshi和Blaschek，2003，见上文。
在另一个优选的方面，发酵产物是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen,R.,和Lee,Y.Y.,1997,Membrane-mediatedextractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435-448。
在另一个优选的方面，所述物质是聚酮化合物。
回收 可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料分离并纯化醇。可以获得纯度高达约96vol%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。
通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
实施例
培养基
YP培养基包含10g的酵母提取物，20g的Bacto蛋白胨，和去离子水加至1升。
LB培养基包含10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，5g的氯化钠，和去离子水加至1升。
LB琼脂平板包含10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，10g的氯化钠，15g的琼脂，和去离子水加至1升。
LB氨苄青霉素平板包含10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，5g的氯化钠，去离子水加至1升，和50mg的氨苄青霉素(经过滤灭菌，在高压灭菌之后添加)。
实施例1：衡量醌化合物对具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的作用的方法
醌化合物对GH61多肽的纤维素分解增强活性的作用根据下述方法进行衡量。
将微晶纤维素，经磨制的、未洗涤的、经预处理的玉米秸秆(经磨制的、未洗涤的PCS)和经磨制、洗涤、预处理的玉米秸秆(经磨制、洗涤的PCS)用作纤维素材料的来源。微晶纤维素(AVICEL
Figure BDA00003043605401021
PH101)从Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)获得。经磨制、洗涤的或未洗涤的PCS根据下述方法制备。
将玉米秸秆在美国能源部National Renewable Energy Laboratory(NREL)使用1.4%(w/v)硫酸在165℃和107psi预处理8分钟。预处理的玉米秸秆(PCS)中的水不溶性固体含有57.5%纤维素，4.6%半纤维素，和28.4%木质素。纤维素和半纤维素组合物通过两阶段硫酸水解，接着使用NREL StandardAnalytical Procedure #002通过高效液相色谱分析糖来确定。木质素在使用NREL Standard Analytical Procedure #003用硫酸水解纤维素和半纤维素级分之后通过重量法来确定。全浆料PCS通过将pH通过添加10M NaOH并彻底混合调整至5.0，然后在120℃蒸汽灭菌20分钟来制备。全浆料PCS的干重量为29%TS(总固体)。经磨制的、未洗涤的PCS(干重量32.35%)通过在Cosmos ICMG 40湿式多用途研磨器(wet multi-utility grinder)(EssEmmCorporation，Tamil Nadu，India)中磨制全浆料PCS来制备。经磨制、洗涤的PCS(干重量32.35%)通过在Cosmos ICMG 40湿式多用途研磨器中磨制全浆料PCS，接着用去离子水洗涤并反复倾去上清级分直至pH大于4来制备。
将一种里氏木霉纤维素酶组合物(补充米曲霉β-葡糖苷酶的CELLUCLAST
Figure BDA00003043605401031
可从Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark获得)用作纤维素酶制备物。所述纤维素酶制备物在本文中在实施例中命名为“里氏木霉纤维素酶组合物”。
AVICEL
Figure BDA00003043605401032
经磨制、未洗涤的PCS，或经磨制、洗涤的PCS的水解使用2.0ml深孔板(Axygen Scientific，Union City，CA，USA)在1.0ml的总反应体积中进行。每一水解用每ml 50mM乙酸钠(含有1mM硫酸锰,pH 5.0)为14mgAVICEL(14mg的纤维素)或50mg PCS(总不溶性固体；28.8mg的纤维素)来进行。对于AVICEL
Figure BDA00003043605401034
和经磨制、洗涤的PCS的水解，在有或无指定浓度的醌化合物，且有或无在0.4mg/g纤维素(除非另行指明)处具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的情况下，将里氏木霉纤维素酶组合物以4mg蛋白每克纤维素给料。对于AVICEL和经磨制、未洗涤的PCS的水解，在有或无指定浓度的醌化合物，且有或无在0.2mg/g纤维素(除非另行指明)处具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的情况下，将里氏木霉纤维素酶组合物以2mg蛋白每克纤维素给料。然后使用ALPS-300TM或ALPS-3000TM平板热密封器(plate heat sealer)(Abgene,Epsom，United Kingdom)密封，充分混合，并在50℃在Isotemp Plus incubator(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA)中温育1至7日。所有实验至少一式两次进行。
在水解之后，将样品使用0.45μm MULTISCREEN
Figure BDA00003043605401036
96孔过滤平板(Millipore，Bedford，MA，USA)进行过滤，并对滤过物如下所述分析糖含量。当不立即使用时，将过滤的等分试样在-20℃冻结。在0.005M H2SO4中稀释至合适浓度的样品的糖浓度，其使用4.6x250mm AMINEX
Figure BDA00003043605401037
HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)，通过用0.05%w/w苯甲酸-0.005M H2SO4在65℃以0.6ml每分钟的流速洗脱，并通过整合来自藉由纯糖样品校正的折射率检测(CHEMSTATION
Figure BDA00003043605401038
AGILENT1100HPLC，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)的葡萄糖和纤维二糖信号来定量。将所得的葡萄糖和纤维二糖当量用于对于每个反应计算纤维素转化的百分比。将测得的糖浓度对于合适的稀释因子进行调整。在经磨制、洗涤的PCS的情况下，酶产生的糖的净浓度通过针对从未添加酶(如里氏木霉纤维素酶组合物)的对照获得的经磨制、洗涤的PCS中相应的背景糖浓度调整测得的糖浓度来确定。数据加工使用MICROSOFT EXCELTM软件(Microsoft，Seattle，WA，USA)进行。
纤维素转化的程度基于溶解的葡糖苷单元对不可溶性纤维素的起始质量的质量比来计算。对于可溶性糖，仅计算纤维素和纤维二糖，因为长于纤维二糖的纤维糊精以可忽略的浓度(由于酶水解)存在。总纤维素转化的程度使用下述方程计算：
Figure BDA00003043605401041
分别对于纤维素和纤维二糖的1.111和1.053的因子考虑了当纤维素中的葡糖苷单元(平均分子量162道尔顿)转化为葡萄糖(分子量为180道尔顿)或纤维二糖葡糖苷单元(平均分子量为171道尔顿)时质量的增加。
衡量的醌化合物包括1,4-苯醌，2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌(辅酶Q0)，2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌(杜醌)，2,6-二甲氧基-1,4-苯醌，1,4-萘醌，2-羟基-1,4-萘醌，吡咯并喹啉醌，1,4-二羟基蒽醌，4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌(肾上腺素红)。这些化合物从Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，MO，USA)获得。
实施例2：具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的制备
具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽根据WO2005/074656使用米曲霉JaL250作为宿主重组制备。将重组产生的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽首先通过使用10kDa膜(VIVASPIN
Figure BDA00003043605401042
GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)的超滤从60ml浓缩至7ml，缓冲液交换至20mMTris-HCl加上150mM NaCl pH 8.0，然后使用用20mM Tris-HCl加上150mMNaCl pH 8.0平衡的320ml SUPERDEX
Figure BDA00003043605401043
75柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)以1ml每分钟的流速纯化。收集20ml的级分并基于SDS-PAGE汇集。
具有纤维素分解增强活性的嗜松青霉GH61A多肽(SEQ ID NO:31[DNA序列]和SEQ ID NO:32[推导的氨基酸序列])根据WO 2011/005867使用米曲霉HowB101作为宿主制备。将重组产生的嗜松青霉GH61A多肽脱盐，并使用10kDa MWCO膜浓缩至20mM Tris pH 8.0，并通过使用SUPERDEXS75的大小排阻层析纯化。纯化缓冲液为150mM NaCl，20mM Tris 8.0。均一性通过SDS-PAGE确认。
具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61A多肽(SEQ ID NO:29[DNA序列]和SEQ ID NO:30[推导的氨基酸序列])根据WO 2010/138754使用米曲霉JaL355作为宿主重组制备。将重组产生的烟曲霉GH61B多肽脱盐，并使用10kDa MWCO膜浓缩至20mM Tris pH 8.0，并通过使用SUPERDEX
Figure BDA00003043605401051
S75(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)的大小排阻层析纯化。纯化缓冲液为150mM NaCl，20mM Tris 8.0。均一性通过SDS-PAGE确认。
具有纤维素分解增强活性的Talaromyces stipitatus GH61A多肽(SEQ IDNO:163[DNA序列]和SEQ ID NO:164[推导的氨基酸序列])如实施例3中所述重组制备。
具有纤维素分解增强活性的里氏木霉GH61B多肽(SEQ ID NO:15[DNA序列]和SEQ ID NO:16[推导的氨基酸序列])根据WO 2007/089290 A2使用米曲霉JaL250作为宿主重组制备。重组产生的里氏木霉GH61B多肽根据WO2007/089290 A2纯化。
具有纤维素分解增强活性的土生梭孢霉GH61E多肽(SEQ ID NO:7[DNA序列]和SEQ ID NO:8[推导的氨基酸序列])根据2005/074647A2使用里氏木霉RutC30作为宿主制备。重组产生的土生梭孢霉GH61E多肽根据WO2005/074647 A2纯化。
蛋白浓度使用Microplate BCATMProtein Assay Kit(Thermo FisherScientific Inc.，Rockford，IL，USA)确定，其中牛血清白蛋白用作蛋白标样。
实施例3：Talaromyces stipitatus Ts1 GH61多肽的克隆和表达
为了鉴定Talaromyces stipitatus ATCC 52271 GH61多肽基因，将T.stipitatus GH61多肽(SEQ ID NO:163[DNA序列]和SEQ ID NO:164[推导的氨基酸序列])的开读框从JCVI Institute(San Diego，CA，USA)发布的T.stipitatus ATCC 52271的基因组DNA序列鉴定。Ts1 GH61基因组序列通过对核酸序列使用几种已知的GH61蛋白序列作为查询物(query)进行TFasty检索来鉴定。Tfasty将蛋白序列比较至DNA序列数据库，用正向和反向移码计算类似性，并允许密码子内的移码。Tfasty是FASTA3程序套组(Pearson，2000，Methods Mol.Biol.132：185-219)的一部分。
将Talaromyces stipitatus ATCC 52271 GH61多肽基因如下所述从基因组DNA克隆。将来自T.stipitatus ATCC 52271的基因组DNA使用FASTDNA
Figure BDA00003043605401061
SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals，Solon，OH，USA)使用修改的生产商的指示来分离。简言之，将Kit与FASTPREP
Figure BDA00003043605401062
-24 Homogenization System(MPBiomedicals，Solon，OH，USA)一同使用。将T.stipitatus在5ml补充2%葡萄糖的YP培养基中在30℃生长48小时。将来自培养的2ml真菌材料通过在14,000xg离心2分钟来收获。去除上清，并将沉淀重悬于500μl的去离子水。将悬液转移至Lysing Matrix E试管(FASTDNA
Figure BDA00003043605401063
SPIN Kit)，并将790μl的硫酸钠缓冲液和100μl的MT缓冲液(FASTDNASPIN Kit)添加至试管。然后将样品置于FASTPREPTMSystem(MP Biomedicals，Solon，OH，USA)中，并以5.5m/秒的速度加工60秒。然后将样品以14,000xg离心两分钟，并将上清转移至EPPENDORF
Figure BDA00003043605401065
试管。添加来自FASTDNA
Figure BDA00003043605401066
SPIN Kit的250μl体积的PPS试剂，然后将样品通过倒置轻柔地混合。将样品再次在14,000xg离心5分钟。将上清转移至15ml FALCON
Figure BDA00003043605401067
2059试管。添加一ml的Binding Matrix悬液(FASTDNA
Figure BDA00003043605401068
SPIN Kit)，然后通过倒置混合两分钟。将样品置于静止的试管架，并允许Binding Matrix沉降3分钟。然后去除并弃去500μl的上清，并将剩余样品重悬于Binding Matrix中。然后将该样品转移至SPINTM过滤器(FASTDNASPIN Kit)并在14,000xg离心1分钟。将收集管倒空，并将剩余基质悬液添加至SPINTM过滤器。将样品再次在14,000xg离心1分钟。将500μl体积的SEWS-M溶液(FASTDNA
Figure BDA000030436054010610
SPIN Kit)添加至SPINTM过滤器，并将样品以相同速度离心1分钟。将收集管倒空，并将SPINTM过滤器重置于收集管中。将单元在14,000xg离心2分钟以干燥剩余SEWS-M洗涤溶液的基质。将SPINTM过滤器置于新鲜的收集管中，并允许在室温风干5分钟。将基质用移液尖轻柔地重悬于100μl的DES(FASTDNASPIN Kit)。将单元在14,000xg离心1分钟。从收集管收获的DNA的浓度在260nm确定。将基因组DNA稀释于TE Buffer(1mM EDTA-10mM Tris pH 8.0)至100ng/μl。
Talaromyces stipitatus Ts1 GH61多肽基因使用下示引物进行克隆。设计PCR引物以扩增从ATG起始密码子直至终止密码子的整个开读框。引物合成为具有同源于质粒pDau109(WO 2005/042735)的Hind III-Bam HI克隆位点的边界的15个碱基对的5’序列。
引物F-Ts1：
5’-CACAACTGGGGATCCACCATGCCTTCCACTAAAGTTGCTG-3’(SEQ ID NO:165)
引物R-Ts1：
5’-AGATCTCGAGAAGCTTATGCAACTTACAAATGAATAGATGCT-3’(SEQ ID NO:166)
粗体字母代表T.stipitatus Ts1 GH61多肽编码序列。下划线序列在正向引物(F-Ts1)上含有Hind III限制性位点而在反向引物(R-Ts1)上含有Bam HI限制性位点。
PCR反应(50μl)包含25μl的Extensor Long PCR Master Mix，Buffer 1，ReddyMixTM型式(ABgene，Epsom，United Kingdom)，1μl的引物F-Ts1(100μM)，1μl的引物R-Ts1(100μM)，1μl的T.stipitatus基因组DNA，和22μl的去离子水。Extensor Long PCR Master Mix含有缓冲液，dNTPs，和热稳定性聚合酶共混物。PCR反应在PTC-200DNA引擎(MJ Research，Waltham，MA，USA)中温育，其程序如下：1个循环，在94℃进行2分钟；25个循环，每个在94℃进行15秒，50℃进行30秒，和72℃进行2分钟；和1个循环，在70℃进行10分钟。将样品冷却至10℃，然后移除并进一步处理。
将5μl的PCR反应产物通过使用40mM Tris碱-20mM乙酸钠-1mMEDTA二钠盐(TAE)缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，其中观察到大约1460bp产物。将剩余的PCR反应产物使用ILLUSTRATMGFXTMPCR DNA和Gel Band Purification Kit(GE Healthcare，Buckinghamshire，UK)根据生产商的指示进行纯化。
使用IN-FUSIONTMPCR Cloning Kit(Clontech Laboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)以将PCR片段根据生产商的指示克隆入经Bam HI和Hind III消化的pDau109以生成Ts1 GH61构建体。然后将Ts1 GH61构建体使用JETQUICKTM2.0 Plasmid Mini/Midi/Maxi-Protocol(GenoMed GmbH，
Figure BDA00003043605401071
Germany)分离。
将Ts1 GH61构建体根据生产商的指示转化入FUSION-BLUETM大肠杆菌细胞(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)，并铺在用每ml 50μg氨苄青霉素补充的LB琼脂平板上。在37℃温育过夜之后，在LB氨苄青霉素平板上的选择下观察到菌落生长。将十个用Ts1 GH61构建体转化的菌落培养于用每ml 50μg氨苄青霉素补充的LB培养基中，并使用JETQUICKTMPlasmid Purification Spin Kit(GenoMed GmbH，
Figure BDA00003043605401085
Germany)根据生产商的指示分离质粒。
将分离的质粒用载体质粒测序以确定不含PCR错误的代表性质粒表达克隆。选择一个不含错误的包含SEQ ID NO:1的Ts1 GH61克隆以供进一步研究。然后将质粒DNA使用JETQUICKTM2.0 Plasmid Mini/Midi/Maxi-Protocol分离。将选定的质粒转化入米曲霉JaL355根据WO 2005/042735进行。选择一个产生可接受水平的Ts1 GH61多肽(根据依照生产商的指示使用NUPAGE10% Bis-Tris SDS凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的SDS-PAGE分析判断)的米曲霉转化体以供进一步研究，并命名为EXP02860。将EXP02860菌株在含100ml的补充2%葡萄糖的YP培养基的1000mlErlenmeyer摇瓶中在26℃以85rpm搅拌发酵4日。使用几个摇瓶以提供充足的培养液以供进一步过滤、浓缩和/或纯化重组产生的多肽。
实施例4：具有纤维素分解增强活性的GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解微晶纤维素或PCS的作用
GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605401082
或经磨制、洗涤的PCS的作用测定使用与实施例1中所述的相同实验条件和步骤在醌化合物不存在下进行。
桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在并未增强里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401083
的水解。AVICEL的转化百分比在1、3和7日在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽不存在下分别为16±1%，31±4%，和45±3%，与之相比，在1、3和7日在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽存在下分别为16±1%，30±4%，和45±4%。
桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在增强里氏木霉纤维素酶组合物对经磨制、洗涤的PCS的水解。经磨制、洗涤的PCS的转化百分比在1、3和7日在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽存在下分别为42±1%，72±1%，和88±2%，与之相比，在1、3和7日在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽不存在下分别为37±1%，55±1%，和67±0.2%。桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在在1、3和7日分别使里氏木霉纤维素酶组合物对经磨制、洗涤的PCS的水解增强14%，31%，和31%。
桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在增强里氏木霉纤维素酶组合物对经磨制、未洗涤的PCS的水解。经磨制、未洗涤的PCS的转化百分比在在1、3和7日在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽存在下分别为22.2±0.1%，34.3±0.3%，和44.0±0.2%，与之相比，在1、3和7日在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽不存在下分别为18.7±0.1%，28.2±0.3%，和36.9±0.3%。桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在在1、3和7日分别使里氏木霉纤维素酶组合物对经磨制、未洗涤的PCS的水解增强19%，21%，和19%。
嗜松青霉GH61A多肽的存在并未显著增强里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401091
的水解。在一个实验中，AVICEL
Figure BDA00003043605401092
的转化百分比在1、3和7日在嗜松青霉GH61A多肽不存在下分别为13.7±0.6%，28.6±0.4%，和44±1%，与之相比，在1、3和7日在嗜松青霉GH61A多肽存在下分别为14.1±0.4%，28.5±0.5%，和46±2%。
烟曲霉GH61B多肽的存在并未显著增强里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401093
的水解。在一个实验中，AVICEL
Figure BDA00003043605401094
的转化百分比在1、3和7日在烟曲霉GH61B多肽不存在下分别为13.7±0.6%，28.6±0.4%，和44±1%，与之相比，在1、3和7日在烟曲霉GH61B多肽存在下分别为13.7±0.2%，29±1%，和46±2%。
Talaromyces stipitatus GH61多肽的存在并未显著增强里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401095
的水解。在一个实验中，AVICEL
Figure BDA00003043605401096
的转化百分比在1、3和7日在T.stipitatus GH61多肽不存在下分别为13.7±0.6%，28.6±0.4%，和44±1%，与之相比，在1、3和7日在T.stipitatus GH61多肽存在下分别为13.6±0.4%，27.9±0.2%，和44.7±0.5%。
里氏木霉GH61B多肽的存在并未显著增强里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401097
的水解。在一个实验中，AVICEL
Figure BDA00003043605401098
的转化百分比在1、3和7日在里氏木霉GH61B多肽不存在下分别为13.7±0.6%，28.6±0.4%，和44±1%，与之相比，在1、3和7日在里氏木霉GH61B多肽存在下分别为13.6±0.4%，29±2%，和44±2%。
土生梭孢霉GH61E多肽的存在并未显著增强里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401099
的水解。在一个实验中，AVICEL的转化百分比在1、3和7日在土生梭孢霉GH61E多肽不存在下分别为14.7±0.2%，29.2±0.5%，和47.7±0.3%，与之相比，在1、3和7日在土生梭孢霉GH61E多肽存在下分别为14.7±0.3%，29.2±0.4%，和49.3±0.5%。
实施例5：醌化合物在里氏木霉纤维素酶组合物水解微晶纤维素过程中对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的作用
多种醌化合物在里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL过程中对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的纤维素分解增强活性的作用使用与实施例1中所述的相同的实验条件和方法确定，但具有下述例外。每种醌化合物的浓度是5mM，而桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的浓度是0.4mg每ml(等于10%(w/w)的里氏木霉纤维素酶组合物)，除了2-羟基-1,4-萘醌和1,4-二羟基蒽醌，它们以1mM的浓度用2mg每克纤维素的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(等于50%(w/w)的里氏木霉纤维素酶组合物)来测定。
在GH61多肽不存在下，醌化合物对里氏木霉纤维素酶组合物水解纤维素材料的作用通过确定在醌化合物存在下纤维素材料的转化百分比对醌化合物不存在下纤维素材料的转化百分比的比例来定量：
Figure BDA00003043605401102
醌化合物对水解的刺激产生>1的比例；对水解的抑制产生<1的比例，而对水解无作用产生=1的比例(图1，白色条)。
在GH61多肽存在下，醌化合物对里氏木霉纤维素酶组合物水解纤维素材料的作用通过确定在醌化合物存在下纤维素材料的转化百分比对醌化合物不存在下纤维素材料的转化百分比的比例来定量：
Figure BDA00003043605401103
在GH61多肽存在下醌化合物对水解的刺激产生>1的比例；对水解的抑制产生<1的比例，而对水解无作用产生=1的比例(图1，灰色条)。
在醌化合物存在下，GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解纤维素材料的作用通过确定在GH61多肽存在下纤维素材料的转化百分比对GH61多肽不存在下纤维素材料的转化百分比的比例来定量：
Figure BDA00003043605401104
在GH61对水解的增强产生>1的比例；对水解的抑制产生<1的比例，而对水解无作用产生=1的比例(图1，黑色条)。
图1A(2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌)，1B(1,4-萘醌)，1C(1,4-苯醌)，1D(吡咯并喹啉醌)，1E(2-羟基-1,4-萘醌)，和1F(1,4-二羟基蒽醌)显示对于1、3和7日：(1)在GH61多肽不存在下醌化合物对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605401111
的作用(醌化合物作用(无GH61)，白色条)，(2)在GH61多肽存在下醌化合物对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605401112
的作用(醌化合物作用(+GH61)，灰色条)，和(3)在醌化合物存在下GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605401113
的作用(GH61作用，黑色条)。
里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401114
的水解通过在水解中至晚期2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的存在略微减少，如醌化合物作用（无GH61)所示，其如通过方程2定义为少于1(图1A，3和7日，白色条)。里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL的水解亦通过2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌和桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在略微减少，如醌化合物作用（+GH61)所示，其如通过方程3定义为少于1(图1A，1和7日，灰色条)，尽管里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401116
的3日水解通过2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌和桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在略微增加，如醌化合物作用（+GH61)(其大于1)和醌化合物作用（无GH61)所示(图1A，3日，灰色条，与白色条相比)。此外，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的作用大于1(GH61作用，方程4)，表明当2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌存在时，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽增强水解(图1A，黑色条)，而桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌不存在下并不增强微晶纤维素的水解(实施例4)。
里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401117
的水解通过1,4-苯醌的存在略微减少，如醌化合物作用（无GH61)所示，其如通过方程2定义为少于1(图1B，白色条)。在1,4-萘醌存在下里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401118
的水解亦通过桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在略微改善，如醌化合物作用（+GH61)所示，其如通过方程2和3定义为大于醌化合物作用（无GH61)(图1B，灰色条，与白色条相比)。此外，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的作用(GH61作用)大于1(方程4)，表明当1,4-苯醌存在时，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽增强微晶纤维素的水解(图1B，黑色条)，而桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在1,4-苯醌不存在下并不增强微晶纤维素的水解(实施例4)。
里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401119
的总体水解，无论是否含桔橙嗜热子囊菌GH61A，均通过1,4-苯醌的存在略微减少，如醌化合物作用（无GH61)和醌化合物作用（+GH61)所示，其如通过方程2和3定义为少于1(图1C，灰色和白色条)。然而，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的作用(GH61作用)大于1(方程4)，特别是在水解较晚期，表明桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在1,4-苯醌存在时增强微晶纤维素的水解(图1C，黑色条)，而在1,4-苯醌不存在下桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽并不增强微晶纤维素的水解(实施例4)。
里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401121
的水解通过2-羟基-1,4-萘醌(与和不与GH61多肽)的存在显著减少。其结果，醌化合物作用（无GH61)如通过方程2定义为少于1(图1E，白色条)。然而，更重要的是，在2-羟基-1,4-萘醌存在下，在GH61存在下的水解得到增强，因此观察到GH61依存性纤维素分解增强(图1E，黑色条)。该增强通过GH61作用量化(方程4)，其在3日水解时为1.01±0.0147而在7日水解时为1.08±0.0155。
在GH61多肽不存在下，里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401122
的水解通过1,4-二羟基蒽醌的存在温和地抑制。醌化合物作用（无GH61)在3日水解时为0.932±0.0123，而在7日水解时为1.01±0.0120(图1F，白色条)。在1,4-二羟基蒽醌存在下，GH61多肽的添加在7日时增加水解分数。这通过醌化合物作用（+GH61)量化，其在3日水解时为0.912±0.00811，而在7日水解时为1.03±0.0225。因此，在2-羟基-1,4-萘醌存在下，GH61多肽添加的结果是明显的纤维素水解的增强。该增强通过GH61作用量化(方程4)，其在3日水解时为0.997±0.00816而在7日水解时为1.02±0.0173(图1F，黑色条)。
亦观察到来自2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌(杜醌)和2,6-二甲氧基-1,4-苯醌的类似GH61作用，但程度较低。
总体结果表明GH61多肽的纤维素分解增强活性在醌化合物的存在下在里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401123
的水解过程中是明显的。然而，在醌化合物不存在下，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605401124
并无可检测的作用。
实施例6：醌化合物在里氏木霉纤维素酶组合物对PCS的水解过程中对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的作用
在里氏木霉纤维素酶组合物对经磨制、洗涤的PCS的水解过程中多种醌化合物对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的纤维素分解增强活性的作用使用与实施例1中相同的实验条件和步骤来确定。每种醌化合物的浓度为5mM。
如实施例4中所示，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在在第1、3和7日分别使里氏木霉纤维素酶组合物对经磨制、洗涤的PCS的水解增强14，31，和31%。
图2A(2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌)和2B(1,4-萘醌)，显示对于1、3和7日：(1)在GH61多肽不存在下醌化合物对里氏木霉纤维素酶组合物水解PCS的作用(醌化合物作用(无GH61)，白色条)，(2)在GH61多肽存在下醌化合物对里氏木霉纤维素酶组合物水解PCS的作用(醌化合物作用(+GH61)，灰色条)，和(3)在醌化合物存在下GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解PCS的作用(GH61作用，黑色条)。计算如实施例5中所述进行。
里氏木霉纤维素酶组合物对PCS的水解通过2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌和桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在而增加，如醌化合物作用(+GH61)所示，其大于醌化合物作用(无GH61)(图2A，灰色条，与白色条相比)，特别是在1和3日时，如方程2和3所定义。此外，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的作用大于1(方程4)，表明当2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌存在时，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽增强水解(图2A，黑色条)。在7日时在2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌存在下，GH61作用的量级是大约1.46，其大于3日时在2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌不存在下的GH61作用，即1.31±0.030(实施例4)，表明2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌增强对经磨制、洗涤的PCS的GH61作用。
里氏木霉纤维素酶组合物对PCS的水解通过1,4-萘醌的存在而略微减少，如醌化合物作用(无GH61)所示，其如方程2定义为小于1(图2B，白色条)。在1,4-萘醌存在下里氏木霉纤维素酶组合物对PCS的水解通过桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在而改善，如醌化合物作用(+GH61)所示，其如方程2和3所示为大于醌化合物作用(无GH61)(图2B，灰色条，与白色条相比)。此外，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的作用大于1(方程4)，表明当1,4-萘醌存在时，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽增强水解(图2B，黑色条)。1,4-萘醌存在下在3日时GH61的作用的量级为大约1.52，其大于在3日时1,4-萘醌不存在下的GH61作用，即1.31±0.030(实施例4)，表明1,4-萘醌增强对经磨制、洗涤的PCS的GH61作用。
总体结果说明当醌化合物存在时，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽增强里氏木霉纤维素酶组合物对经磨制、洗涤的PCS的水解，相对于仅橘嗜热子囊菌GH61A多肽存在时。然而，在醌化合物不存在时，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽增强里氏木霉纤维素酶组合物所致的水解，表明在经磨制、洗涤的PCS中存在某化合物，其牵涉GH61多肽以增强里氏木霉纤维素酶组合物对经磨制、洗涤的PCS的纤维素组分的水解。
实施例7：2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌浓度在里氏木霉纤维素酶组合物水解微晶纤维素过程中对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的作用
多种浓度的2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌在里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605401141
过程中对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的纤维素分解增强活性的作用使用与实施例1中所述的实验条件和步骤进行，只不过使用0，5.6，14，或28mg每升的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(分别对应于0，10，25，或50%的里氏木霉纤维素酶组合物)。2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的浓度为0.01，0.1，1，或10mM。水解反应进行3日。
单独的多种浓度的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在并未增强里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401142
的水解。在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽不存在下，在1和3日时，AVICEL
Figure BDA00003043605401143
的转化百分比分别为14.4±0.9%和31±1%，与之相对，在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽占10%(w/w)的里氏木霉纤维素酶组合物的存在下，在1和3日时，分别为14.3±0.3%和30.4±0.6%，或在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽占25%(w/w)的里氏木霉纤维素酶组合物存在下，在1和3日时，分别为14.0±0.5%和29.4±0.9%，或在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽占50%(w/w)的里氏木霉纤维素酶组合物存在下，在1和3日时，分别为14.2±0.6%和29±1%。
图3A显示对于1和3日：(1)在GH61多肽不存在下2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605401144
的作用(醌化合物作用(无GH61)，白色条)，(2)在GH61多肽存在下2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605401145
的作用(醌化合物作用(+GH61)，灰色条)，和(3)在2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌存在下GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605401146
的作用(GH61作用，黑色条)。2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的浓度为10mM，而桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的浓度为28mg每升或50%w/w的里氏木霉纤维素酶组合物。
里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401147
的水解通过2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的存在略微减少(醌化合物作用(无GH61)小于1)(图3A，白色条)。在1日时，里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401148
的水解亦通过2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌和桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在而略微减少，但在3日时，水解的减少基本上恢复(醌化合物作用(+GH61)等于1)(图3A，灰色条)。在3日时，2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的存在在里氏木霉纤维素酶组合物的AVICEL
Figure BDA00003043605401151
水解过程中增加桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的纤维素分解增强活性(GH61作用大于1)(图3A，3日，黑色条)。在10mM相对于5mM的更高浓度的2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌表明与图1A相比与桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽更高的抑制，和桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽存在时更高的GH61作用。
图3B显示在3日时，对于多种浓度的2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌(辅酶Q0)桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽对GH61作用(方程4)的作用。将桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽以5.6，14，或28mg每升(分别对应于10，25，或50%的里氏木霉纤维素酶组合物)添加至2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌浓度为0(-+-)，0.01mM(-x-)，0.1mM(-o-)，1mM(-Δ-)，或10mM(-□-)的的里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401152
的水解反应。计算如实施例5中所述进行。结果表明当2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌浓度增加时，GH61作用更大。结果亦说明对于中等2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌浓度，GH61作用在大约14mg每升为最大。在2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌不存在下，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽在所有测试的GH61浓度对水解并无显著作用(GH61作用大约为1)。
当使用30g每升AVICEL
Figure BDA00003043605401153
0.12g每升里氏木霉纤维素酶组合物，和0，12，或60mg每升的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽时(对应于0，10，或50%w/w的里氏木霉纤维素酶组合物)，观察到来自2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的类似作用。
总体数据表明增加2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌浓度增加里氏木霉纤维素酶组合物对纤维素水解的GH61多肽依存性增强的效力。
实施例8：2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌浓度在里氏木霉纤维素酶组合物水解经磨制、洗涤的PCS过程中对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的作用
桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解经磨制、洗涤的PCS的作用使用与实施例7中所述的相同实验条件和步骤来确定，除了使用57.5mg每升的里氏木霉纤维素酶组合物(对应于2mg每g纤维素)，和0，5.6，14，或28mg每升的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(分别对应于0，10，25，或50%的里氏木霉纤维素酶组合物)。2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的浓度为0，0.01，0.1，1，或10mM。水解反应进行3日。
单独的多种浓度的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在增强里氏木霉纤维素酶组合物对经磨制、洗涤的PCS的水解。在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽不存在下，经磨制、洗涤的PCS的转化百分比在1和3日时分别为24±0.7%和41±2%，与之相比，在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽占10%(w/w)的里氏木霉纤维素酶组合物存在下，在1和3日时，分别为27±0.8%和55±3%，或桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽占25%(w/w)的里氏木霉纤维素酶组合物存在下，在1和3日时，分别为27±0.8%和57±0.5%，或在桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽占50%(w/w)的里氏木霉纤维素酶组合物存在下，在1和3日时，分别为27±0.8%和59±2%。
图4A显示对于1和3日：(1)在GH61多肽不存在下2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌对里氏木霉纤维素酶组合物水解经磨制、洗涤的PCS的作用(醌化合物作用(无GH61)，白色条)，(2)在GH61多肽存在下2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌对里氏木霉纤维素酶组合物水解经磨制、洗涤的PCS的作用(醌化合物作用(+GH61)，灰色条)，和(3)在2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌存在下GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解经磨制、洗涤的PCS的作用(GH61作用，黑色条)。2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的浓度为10mM，而桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的浓度为28mg每升(对应于50%的里氏木霉纤维素酶组合物)。计算如实施例5中所述进行。
里氏木霉纤维素酶组合物对经磨制、洗涤的PCS的水解通过2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌(辅酶Q0)的存在略微抑制(醌化合物作用(无GH61)少于1)(图4A，白色条)，并通过2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌和桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在中度增加(醌化合物作用(+GH61)大于1)(图4A，灰色条)。2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌在里氏木霉纤维素酶组合物对PCS的水解过程中在1和3日时显著地增加桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的纤维素分解增强活性(GH61作用大于1)(图4A，黑色条)。因为在图4A，黑色条中在3日时GH61作用等于1.73±0.019，其大于3日时2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌不存在下的GH61作用，即1.31±0.030(实施例4)，所以2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌升高对PCS的GH61作用。
图4B显示在3日时在多种2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的浓度下桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽浓度对GH61作用(方程4)的作用。将桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽以0，5.6，14，或28mg每升(分别对应于10，25，或50%的里氏木霉纤维素酶组合物)添加至2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的浓度为0(-+-)，0.01mM(-x-)，0.1mM(-o-)，1mM(-Δ-)，或10mM(-□-)的里氏木霉纤维素酶组合物对PCS的水解反应。计算如实施例5中所述进行。结果表明在2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌不存在下(-+-)，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽增强经洗涤、磨制的PCS的水解，而随着2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌浓度增加，GH61作用更大。在14mg每升(或25%的里氏木霉纤维素酶组合物)的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽，来自2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的作用开始饱和。
总体数据表明增加2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌浓度增加里氏木霉纤维素酶组合物所致的纤维素水解的GH61多肽依存性增强的效力。
实施例9：2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌在里氏木霉纤维素酶组合物对经磨制、未洗涤的PCS的水解过程中对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的作用
在里氏木霉纤维素酶组合物对经磨制、未洗涤的PCS的水解过程中2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌(辅酶Q0)对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的纤维素分解增强活性的作用使用实施例1中所述的实验条件和步骤确定。2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌的浓度为5mM。
如实施例4中所示，在1、3和7日时，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的存在分别使里氏木霉纤维素酶组合物对经磨制的PCS的水解增强19，21，和19%。
图5显示对于1、3和7日：(1)在GH61多肽不存在下2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌对里氏木霉纤维素酶组合物水解经磨制、未经洗涤的PCS的作用(醌化合物作用(无GH61)，白色条)，(2)在GH61多肽存在下2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌对里氏木霉纤维素酶组合物水解经磨制、未经洗涤的PCS的作用(醌化合物作用(+GH61)，灰色条)，和(3)在2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌存在下GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解经磨制、未经洗涤的PCS的作用(GH61作用，黑色条)。计算如实施例5中所述进行。
里氏木霉纤维素酶组合物对经磨制的PCS的水解通过2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌(与或不与桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽)的存在增加，如方程2和3所定义，醌化合物作用(无GH61)和醌化合物作用(+GH61)所示，其均大于1(图5，白色和灰色条)。此外，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽的作用大于1(方程4)，表明当2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌存在时，特别在3日时，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽增强水解(图5，黑色条)。
结果表明当醌化合物存在时，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽增强里氏木霉纤维素酶组合物对经磨制、未洗涤的PCS的水解，与单独的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽相比。然而，在醌化合物不存在下，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽增强里氏木霉纤维素酶组合物所致的水解，表明经磨制、未洗涤的PCS中存在某化合物，其牵涉GH61多肽以增强里氏木霉纤维素酶组合物对经磨制、未洗涤的PCS的纤维素组分的水解。
实施例10：米曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶的制备
米曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶(SEQ ID NO:111[DNA序列]和SEQ ID NO:112[推导的氨基酸序列])如WO 2004/099228中所述重组制备，并如Langston等，2006，Biochim.Biophys.Acta Proteins Proteomics 1764：972-978所述纯化。蛋白浓度使用Microplate BCATMProtein Assay Kit来确定。
实施例11：磷酸溶胀纤维素(PASC)的制备
1%磷酸溶胀的纤维素浆料使用Zhang等，2006，Biomacromolecules 7：644–648所述的实验方案从AVICEL
Figure BDA00003043605401181
PH101制备。
实施例12：磷酸溶胀纤维素(PASC)转化测定
1.0%磷酸溶胀纤维素(PASC)浆料如实施例11中所述制备，其通过振荡充分重悬。将1.0%PASC的500μl等分试样使用具有宽孔尖(wide aperture tip)(尖端从基部剪去2mm)的1000μl微移液管移液入2.0ml 96深孔板(Axygen，Union City，CA，USA)的孔中。然后将100μl的10mM MnSO4-500mM乙酸pH 5添加至每个孔。将300μl的去离子水或去离子水中的醌化合物悬液通过移液添加至每个孔。这些悬液是2.5mg每ml肾上腺素红(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)或5mg每ml4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)。制备酶混合物，然后以100μl的体积同时添加至所有的孔中，在每个反应中为1ml的总量。然后使用ALPS-300TM平板热密封器密封，充分混合，并在50℃温育约4日。所有报道的实验一式三次进行。
水解反应的初步分析使用AGILENT
Figure BDA00003043605401191
1100 HPLC用CHEMSTATION
Figure BDA00003043605401192
软件进行(配置有AMINEXTMHPX-87H柱)。在大约4日之后，将深孔板从培养箱移出，并冷却过夜至4℃。然后通过倒置将平板混合良好，并在SORVALL
Figure BDA00003043605401193
RT7离心机中以52xg短暂离心10秒。然后通过抽吸混合样品，并将来自每个孔的200μl转移至MULTISCREEN
Figure BDA00003043605401194
HV离心过滤平板装置。将离心过滤平板装置以2000rpm在SORVALL
Figure BDA00003043605401195
RT7离心机中离心20分钟。将滤过物转移至96孔自动取样器平板(Nunc，Roskilde，Denmark)，并用5mMH2SO4 1:1稀释，用硅胶密封垫密封，并插入HPLC注入模块(设为4℃)中以供将20μl注入CATION HTM保护柱，其连接至4.6x250mm AMINEX
Figure BDA00003043605401196
HPX-87H柱，然后用5mM H2SO4中的0.05%w/w苯甲酸洗脱。糖使用折射率检测器检测，其中定量通过相比于纯化的糖标样的整合来进行。
所有HPLC数据处理使用MICROSOFT EXCELTM软件进行。将测得的葡萄糖浓度针对合适的稀释因子进行调整。在该测定中，仅测量了葡萄糖，因为β-葡糖苷酶在所有样品但非对照中为高水平。转化百分比使用下述方程计算：
进行限制消化以确定使用每克纤维素100mg的里氏木霉纤维素酶(CELLUCLASTTMPlus，Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)可攻击的葡萄糖当量的总浓度。将一式三份数据点取平均值，并计算标准偏差。
实施例13：4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌或肾上腺素红对桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽和米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶的组合转化磷酸溶胀纤维素的作用
对桔橙嗜热子囊菌GH61A和4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌或肾上腺素红测试其增强米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶转化PASC的能力。磷酸溶胀纤维素水解测定如实施例12中所述进行。
米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(10mg蛋白每g纤维素)；米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(10mg蛋白每g纤维素)与4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌(0.15%w/w)或肾上腺素红(0.075%w/w)的组合；米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(10mg蛋白每g纤维素)与4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌(0.15%w/w)或肾上腺素红(0.075%w/w)的组合；和米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(10mg蛋白每g纤维素)与桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(10mg蛋白每g纤维素)与4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌(0.15%w/w)或肾上腺素红(0.075%w/w)的组合对PASC的转化如实施例12中所述测定。在50℃温育96小时之后，如实施例12中所述收集并分析数据。结果示于图6。
米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(10mg蛋白每g纤维素)的添加导致对PASC 1.5±0.3%的转化。桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(10mg蛋白每g纤维素)的添加未导致PASC的显著转化。桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(10mg蛋白每g纤维素)和米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(10mg蛋白每g纤维素)的组合的添加导致对PASC 2.1±0.7%的转化。
单独的肾上腺素红(0.075%w/w)的添加未导致PASC的显著转化。将肾上腺素红(0.075%w/w)添加至米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(10mg蛋白每g纤维素)导致对PASC 0.3±0.3%的转化。桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(10mg蛋白每g纤维素)和肾上腺素红(0.075%w/w)的添加导致对磷酸泡胀的纤维素0.1±0.1%的转化。将桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(10mg蛋白每g纤维素)添加至米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(10mg蛋白每g纤维素)和肾上腺素红(0.075%w/w)的组合导致对PASC 8.5±2.0%的转化。
单独的4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌的添加未导致PASC的显著转化。将4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌添加至米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(10mg蛋白每g纤维素)导致对PASC 1.6±0.1%的转化。桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(10mg蛋白每g纤维素)和4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌的添加导致对PASC 0.8±0.6%的转化。将桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(10mg蛋白每g纤维素)添加至米曲霉CEL3A β-葡糖苷酶(10mg蛋白每g纤维素)和4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌的组合导致对PASC 29.9±3.2%的转化。
实施例14：在里氏木霉纤维素酶组合物对微晶纤维素的水解过程中醌化合物对GH61多肽的作用
在里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401201
的水解过程中多种醌化合物对几种GH61多肽的纤维素分解增强活性的作用使用如实施例中所述的实验条件和步骤确定，但具有下述例外。每种醌化合物的浓度为5mM，而GH61多肽的浓度为0.4或2mg每ml(等价于10%(w/w)的里氏木霉纤维素酶组合物)。
图7A至7J显示对于1、3和7日：(1)在GH61多肽不存在下醌化合物对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL的作用(醌化合物作用(无GH61)，白色条)，(2)在GH61多肽存在下醌化合物对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL的作用(醌化合物作用(+GH61)，灰色条)，和(3)在醌化合物存在下GH61多肽对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605401213
的作用(GH61作用，黑色条)。
里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401214
的水解通过2-甲基-1,4-苯醌的存在略微减少(特别在水解中期)，如醌化合物作用(无GH61)所示，其如方程2所定义的为少于1(图7A和B，白色条)。里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401215
的水解亦通过2-甲基-1,4-苯醌和嗜松青霉GH61A多肽存在下略微减少，如醌化合物作用(+GH61)所示，其如方程3定义为少于1(图7A和7B，1和3日时，灰色条)，尽管在7日时，里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401216
的水解并未受到2-甲基-1,4-苯醌和嗜松青霉GH61A多肽存在的显著影响。此外，嗜松青霉GH61A多肽的作用大于1(GH61作用，方程4)，表明当2-甲基-1,4-苯醌存在时，嗜松青霉GH61A多肽增强水解(图7A和7B，3和7日时，黑色条)，而在2-甲基-1,4-苯醌不存在时嗜松青霉GH61A多肽并未增强微晶纤维素的水解(实施例3)。
里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401217
的水解通过2-甲基-1,4-苯醌和烟曲霉GH61B多肽的存在略微减少，如醌化合物作用(+GH61)所示，其如方程3定义的为少于1(图7C和7D，1和3日时，灰色条)，尽管里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401218
的水解在7日时并未受2-甲基-1,4-苯醌和烟曲霉GH61B多肽的存在显著影响。此外，烟曲霉GH61B多肽的作用大于1(GH61作用，方程4)，表明当2-甲基-1,4-苯醌存在时，烟曲霉GH61B多肽增强水解(图7C和7D，3和7日时，黑色条)，而2-甲基-1,4-苯醌不存在时，烟曲霉GH61B多肽并未增强微晶纤维素的水解(实施例3)。
里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401219
的水解通过2-甲基-1,4-苯醌和Talaromyces stipitatus GH61多肽的存在而略微减少，如醌化合物作用(+GH61)所示，其如方程3限定为少于1(图7E和7F，1和3日时，灰色条)，尽管在7日时，里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA000030436054012110
的水解并未受2-甲基-1,4-苯醌和T.stipitatus GH61多肽的存在显著影响。此外，T.stipitatus GH61多肽的作用大于1(GH61作用，方程4)，表明当2-甲基-1,4-苯醌存在时，T.stipitatusGH61多肽增强水解(图7E和7F，3和7日时，黑色条)，而在2-甲基-1,4-苯醌不存在下T.stipitatus GH61多肽并未增强微晶纤维素的水解(实施例3)。
里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL的水解通过2-甲基-1,4-苯醌和里氏木霉GH61B多肽的存在略微减少，如醌化合物作用(+GH61)所示，其如方程3定义为少于1(图7G和7H，1和3日时，灰色条)，尽管7日时里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401222
的水解并未受2-甲基-1,4-苯醌和里氏木霉GH61B多肽的存在显著影响。此外，里氏木霉GH61B多肽的作用大于1(GH61作用，方程4)，表明当2-甲基-1,4-苯醌存在时里氏木霉GH61B多肽增强水解(图7G和7H，3和7日时，黑色条)，而在2-甲基-1,4-苯醌不存在下，里氏木霉GH61B多肽并未增强微晶纤维素的水解(实施例3)。
在7日时，里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401223
的水解通过2-甲基-1,4-苯醌和土生梭孢霉GH61B多肽的存在略微减少，如醌化合物作用(+GH61)所示，其如方程3定义为少于1(图7I和7J，7日时，灰色条)。然而，土生梭孢霉GH61B多肽的作用大于1(GH61作用，方程4)，表明当2-甲基-1,4-苯醌存在时土生梭孢霉GH61B多肽增强水解(图7I和7J，3和7日时，黑色条)，而在2-甲基-1,4-苯醌不存在下，土生梭孢霉GH61B多肽并未增强微晶纤维素的水解(实施例3)。
总体结果说明在里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401224
的水解过程中，GH61多肽的纤维素分解增强活性在醌化合物存在下是明显的。然而，GH61多肽在醌化合物不存在下对里氏木霉纤维素酶组合物水解AVICEL
Figure BDA00003043605401225
并无可检测出的作用。
实施例41：通过使用化合物和多种GH61多肽的组合的里氏木霉纤维素酶组合物对微晶纤维素纤维素水解的增强
将包括：连苯三酚，2-氨基苯酚，quercitin，2-羟基-1,4-萘醌，桑色素水合物和柚配基(Sigma，St.Louis，MO)的化合物的组合与多种GH61多肽一同测试其组合的增强里氏木霉纤维素酶所致的纤维素水解的能力。糖化反应如(实施例1)所述，使用pH5.0的50mM乙酸钠，1mM硫酸锰中的29.5mg每ml微晶纤维素(AVICEL
Figure BDA00003043605401226
)和4mg每g纤维素的里氏木霉纤维素酶组合物以3mM的总化合物浓度(每种化合物1mM)或1mM的总浓度(每种化合物0.33mM)用GH61，包括桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽和烟曲霉GH61B多肽来进行。将每种化合物的溶液在含1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH 5.0中的20%或50%(v/v)甲醇中制备。将它们以如上所述1mM或3mM的终浓度加入糖化反应中。作为对照，将甲醇以相等的终浓度添加至糖化反应。
图8A显示含有所示的多种GH61多肽，和所示的化合物的组合的里氏木霉纤维素酶组合物对AVICEL
Figure BDA00003043605401231
的水解分数。图8B(B)显示对于这些混合物中每一种的GH61作用。化合物混合物包括：脱氢抗坏血酸(DHA)，连苯三酚(pyro)，和quercitin(quer)；连苯三酚，2-氨基苯酚(2-AP)，2-羟基-1,4-萘醌(naphtho)；2-氨基苯酚，quercitin，脱氢抗坏血酸，以及2-羟基-1,4-萘醌，桑色素水合物，柚配基。在每种情况下，总体水解通过化合物混合物和GH61多肽的组合的存在而增强。在每种情况下，表见的水解分数在1mM化合物的浓度要高于3mM化合物或对照糖化。对于大多数在1mM检查的化合物的混合物，桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽给出最大的总体转化，而在3mM，烟曲霉GH61B一般给出最高的总体转化。
本发明进一步通过下述编号的段落描述：
[1]一种组合物，其包含：(a)具有纤维素分解增强活性的多肽和(b)醌化合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽和所述醌化合物的组合增强纤维素分解酶对纤维素材料的水解。
[2]段1的组合物，其中所述醌化合物是式(I)或(II)的化合物：
Figure BDA00003043605401232
或其盐或溶剂化物；
其中R1，R2，R3，和R4独立地是氢，卤素，-OH，-OR8，-NO2，-N(R9)(R10)，-CN，-C(O)R5，-C(O)OR6，-C(O)NHR7，-OC(O)R11，-NHC(O)R12，-OC(O)OR13，-NHC(O)OR14，-OC(O)NHR15，-NHC(O)NHR16，-SO2R17，-SO2N(R18)(R19)，-SR20，-NC(R21)(R22)，或任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；
R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11，R12，R13，R14，R15，R16，R18，R19，R20，R21，和R22独立地是氢，或任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；和
R17是任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；和
其中R1和R2，R2和R3，和R3和R4的每一对可组合形成任选取代的稠合环。
[3]段2的组合物，其中R1，R2，R3，和R4独立地是氢，卤素，-OH，-OR8，或任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；和
其中R1和R2，R2和R3，和R3和R4的每一对可组合形成任选取代的稠合环。
[4]段2的组合物，其中R1，R2，R3，和R4独立地是氢，卤素，-OH，-OR8，或任选取代的烷基；和
其中R1和R2，R2和R3，和R3和R4的每一对可组合形成任选取代的稠合环。
[5]段2的组合物，其中R1，R2，R3，和R4独立地是氢，-OH，任选取代的-O-(C1-C10)烷基，或任选地为-(C1-C10)烷基。
[6]段2-5任一项的组合物，其中R1，R2，R3，和R4的至少一个是氢。
[7]段2-5任一项的组合物，其中R1，R2，R3，和R4的至少两个是氢。
[8]段2-5任一项的组合物，其中R1，R2，R3，和R4的至少三个是氢。
[9]段2-8任一项的组合物，其中R1，R2，R3，和R4的至少一个是任选取代的烷基(例如，任选取代的C1-C10烷基，如任选取代的甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，或正戊基)。
[10]段2-8任一项的组合物，其中R1，R2，R3，和R4的至少两个是任选取代的烷基(例如，任选取代的C1-C10烷基，如任选取代的甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，或正戊基)。
[11]段2-10任一项的组合物，其中R1，R2，R3，和R4的至少一个是-OH。
[12]段2-11任一项的组合物，其中R1和R2，R2和R3，和R3和R4的至少一对组合形成任选取代的稠合环。
[13]段2-11任一项的组合物，其中R1和R2组合形成任选取代的稠合环。
[14]段13的组合物，其中R1和R2组合形成任选取代的稠合的亚环烷基环。
[15]段13的组合物，其中R1和R2组合形成任选取代的稠合的亚芳基环。
[16]段13的组合物，其中R1和R2组合形成任选取代的稠合的亚杂芳基环。
[17]段13的组合物，其中R1和R2组合形成任选取代的任选取代的模块，其选自亚苯基，亚吡唑基，亚呋喃基，亚咪唑基，亚异噁唑基，亚噁二唑基，亚噁唑基，亚吡咯基，亚吡啶基，亚嘧啶基，亚哒嗪基，亚噻唑基，亚三唑基，亚噻吩基，亚二氢噻吩并-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolylene)，亚硫茚基，亚咔唑基，亚苯并咪唑基，亚苯并噻吩基，亚苯并呋喃基，亚吲哚基，亚喹啉基，亚苯并三唑基，亚苯并噻唑基，亚苯并噁唑基，亚苯并咪唑基，亚异喹啉基，亚异吲哚基，亚吖啶基，亚苯并异唑基(benzoisazolylene)，亚二甲基乙内酰脲(dimethylhydantoinene)，亚吡嗪基，亚四氢呋喃基，亚吡咯啉基，亚吡咯烷基，亚吗啉基，亚吲哚基，亚二氮杂环庚三烯基，亚氮杂环庚三烯基，亚硫杂环庚三烯基，亚哌啶基，和亚氧杂环庚三烯基。
[18]段13的组合物，其中R1和R2组合形成任选取代的亚苯基。
[19]段13的组合物，其中R1和R2组合形成任选取代的亚吡咯基。
[20]段13的组合物，其中R1和R2组合形成任选取代的亚吡啶基。
[21]段13的组合物，其中R1和R2组合形成任选取代的亚吡咯啉基。
[22]段2-21任一项的组合物，其中R2和R3组合形成任选取代的稠合环。
[23]段22的组合物，其中R2和R3组合形成任选取代的稠合的亚环烷基环。
[24]段22的组合物，其中R2和R3组合形成任选取代的稠合的亚芳基环。
[25]段22的组合物，其中R2和R3组合形成任选取代的稠合的亚杂芳基环。
[26]段22的组合物，其中R2和R3组合形成任选取代的模块，其选自亚苯基，亚吡唑基，亚呋喃基，亚咪唑基，亚异噁唑基，亚噁二唑基，亚噁唑基，亚吡咯基，亚吡啶基，亚嘧啶基，亚哒嗪基，亚噻唑基，亚三唑基，亚噻吩基，亚二氢噻吩并-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolylene)，亚硫茚基，亚咔唑基，亚苯并咪唑基，亚苯并噻吩基，亚苯并呋喃基，亚吲哚基，亚喹啉基，亚苯并三唑基，亚苯并噻唑基，亚苯并噁唑基，亚苯并咪唑基，亚异喹啉基，亚异吲哚基，亚吖啶基，亚苯并异唑基(benzoisazolylene)，亚二甲基乙内酰脲(dimethylhydantoinene)，亚吡嗪基，亚四氢呋喃基，亚吡咯啉基，亚吡咯烷基，亚吗啉基，亚吲哚基，亚二氮杂环庚三烯基，亚氮杂环庚三烯基，亚硫杂环庚三烯基，亚哌啶基，和亚氧杂环庚三烯基。
[27]段22的组合物，其中R2和R3组合形成任选取代的亚苯基。
[28]段22的组合物，其中R2和R3组合形成任选取代的亚吡咯基。
[29]段22的组合物，其中R2和R3组合形成任选取代的亚吡啶基。
[30]段22的组合物，其中R2和R3组合形成任选取代的亚吡咯啉基。
[31]段任一项的组合物1-30，其中R3和R4组合形成任选取代的稠合环。
[32]段31的组合物，其中R3和R4组合形成任选取代的稠合的亚环烷基环。
[33]段31的组合物，其中R3和R4组合形成任选取代的稠合的亚芳基环。
[34]段31的组合物，其中R3和R4组合形成任选取代的稠合的亚杂芳基环。
[35]段31的组合物，其中R3和R4组合形成任选取代的模块，其选自亚苯基，亚吡唑基，亚呋喃基，亚咪唑基，亚异噁唑基，亚噁二唑基，亚噁唑基，亚吡咯基，亚吡啶基，亚嘧啶基，亚哒嗪基，亚噻唑基，亚三唑基，亚噻吩基，亚二氢噻吩并-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolylene)，亚硫茚基，亚咔唑基，亚苯并咪唑基，亚苯并噻吩基，亚苯并呋喃基，亚吲哚基，亚喹啉基，亚苯并三唑基，亚苯并噻唑基，亚苯并噁唑基，亚苯并咪唑基，亚异喹啉基，亚异吲哚基，亚吖啶基，亚苯并异唑基(benzoisazolylene)，亚二甲基乙内酰脲(dimethylhydantoinene)，亚吡嗪基，亚四氢呋喃基，亚吡咯啉基，亚吡咯烷基，亚吗啉基，亚吲哚基，亚二氮杂环庚三烯基，亚氮杂环庚三烯基，亚硫杂环庚三烯基，亚哌啶基，和亚氧杂环庚三烯基。
[36]段31的组合物，其中R3和R4组合形成任选取代的亚苯基。
[37]段31的组合物，其中R3和R4组合形成任选取代的亚吡咯基。
[38]段31的组合物，其中R3和R4组合形成任选取代的亚吡啶基。
[39]段31的组合物，其中R3和R4组合形成任选取代的亚吡咯啉基。
[40]段2-39任一项的组合物，其中R1和R2组合形成任选取代的稠合环；和R3和R4组合形成任选取代的稠合环。
[41]段2-39任一项的组合物，其中的仅仅一对R1和R2，R2和R3，和R3和R4组合形成任选取代的稠合环。
[42]段2的组合物，其中所述醌化合物选自下组：(I-1)：1,4-苯醌；(I-2)：1,4-萘醌；(I-3)：2-羟基-1,4-萘醌；(I-4)：2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q0；(I-5)：2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或杜醌；(I-6)：1,4-二羟基蒽醌；(II-1)：3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺素红；(II-2)：4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌；和(II-3)：吡咯并喹啉醌；或其盐或溶剂化物。
[43]段1-42任一项的组合物，其进一步包含(c)一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[44]段43的组合物，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[45]段43的组合物，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
[46]一种用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的存在下用酶组合物处理纤维素材料，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合增强所述酶组合物对所述纤维素材料的水解。
[47]段46的方法，其中所述纤维素材料经预处理。
[48]段46或47的方法，其进一步包括回收经降解的纤维素材料。
[49]段46-48任一项的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[50]段49的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[51]段49的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
[52]段46-51任一项的方法，其中所述经降解的纤维素材料是糖。
[53]段52的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。
[54]一种用于产生发酵产物的方法，其包括：
(a)在具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的存在下用酶组合物糖化纤维素材料，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合增强所述酶组合物对所述纤维素材料的水解。
(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和
(c)从发酵回收发酵产物。
[55]段54的方法，其中所述纤维素材料经预处理。
[56]段54或55的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[57]段56的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[58]段56的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
[59]段54-58任一项的方法，其中步骤(a)和(b)在同时糖化和发酵中同时进行。
[60]段54-59任一项的方法，其中所述发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸或聚酮化合物。
[61]一种发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料在具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的存在下经酶组合物糖化，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合增强所述酶组合物对所述纤维素材料的水解。
[62]段61的方法，其中所述纤维素材料在糖化之前经预处理。
[63]段61或62的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
[64]段63的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
[65]段63的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
[66]段61-65任一项的方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。
[67]段66的方法，其进一步包括从发酵回收发酵产物。
[68]段66或67的方法，其中所述发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸或聚酮化合物。
[69]段46-68任一项的方法，其中所述醌化合物是式(I)或(II)的化合物：
Figure BDA00003043605401291
或其盐或溶剂化物；
其中R1，R2，R3，和R4独立地是氢，卤素，-OH，-OR8，-NO2，-N(R9)(R10)，-CN，-C(O)R5，-C(O)OR6，-C(O)NHR7，-OC(O)R11，-NHC(O)R12，-OC(O)OR13，-NHC(O)OR14，-OC(O)NHR15，-NHC(O)NHR16，-SO2R17，-SO2N(R18)(R19)，-SR20，-NC(R21)(R22)，或任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；
R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11，R12，R13，R14，R15，R16，R18，R19，R20，R21，和R22独立地是氢，或任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；和
R17是任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；和
其中R1和R2，R2和R3，和R3和R4的每一对可组合形成任选取代的稠合环。
[70]段69的方法，其中R1，R2，R3，和R4独立地是氢，卤素，-OH，-OR8，或任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；和
其中R1和R2，R2和R3，和R3和R4的每一对可组合形成任选取代的稠合环。
[71]段69的方法，其中R1，R2，R3，和R4独立地是氢，卤素，-OH，-OR8，或任选取代的烷基；和
其中R1和R2，R2和R3，和R3和R4的每一对可组合形成任选取代的稠合环。
[72]段69的方法，其中R1，R2，R3，和R4独立地是氢，-OH，任选取代的-O-(C1-C10)烷基，或任选地为-(C1-C10)烷基。
[73]段69-72任一项的方法，其中R1，R2，R3，和R4的至少一个是氢。
[74]段69-72任一项的方法，其中R1，R2，R3，和R4的至少两个是氢。
[75]段69-72任一项的方法，其中R1，R2，R3，和R4的至少三个是氢。
[76]段69-75任一项的方法，其中R1，R2，R3，和R4的至少一个是任选取代的烷基(例如，任选取代的C1-C10烷基，如任选取代的甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，或正戊基)。
[77]段69-75任一项的方法，其中R1，R2，R3，和R4的至少两个是任选取代的烷基(例如，任选取代的C1-C10烷基，如任选取代的甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，或正戊基)。
[78]段69-77任一项的方法，其中R1，R2，R3，和R4的至少一个是-OH。
[79]段69-78任一项的方法，其中R1和R2，R2和R3，和R3和R4的至少一对组合形成任选取代的稠合环。
[80]段69-79任一项的方法，其中R1和R2组合形成任选取代的稠合环。
[81]段80的方法，其中R1和R2组合形成任选取代的稠合的亚环烷基环。
[82]段80的方法，其中R1和R2组合形成任选取代的稠合的亚芳基环。
[83]段80的方法，其中R1和R2组合形成任选取代的稠合的亚杂芳基环。
[84]段80的方法，其中R1和R2组合形成任选取代的任选取代的模块，其选自亚苯基，亚吡唑基，亚呋喃基，亚咪唑基，亚异噁唑基，亚噁二唑基，亚噁唑基，亚吡咯基，亚吡啶基，亚嘧啶基，亚哒嗪基，亚噻唑基，亚三唑基，亚噻吩基，亚二氢噻吩并-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolylene)，亚硫茚基，亚咔唑基，亚苯并咪唑基，亚苯并噻吩基，亚苯并呋喃基，亚吲哚基，亚喹啉基，亚苯并三唑基，亚苯并噻唑基，亚苯并噁唑基，亚苯并咪唑基，亚异喹啉基，亚异吲哚基，亚吖啶基，亚苯并异唑基(benzoisazolylene)，亚二甲基乙内酰脲(dimethylhydantoinene)，亚吡嗪基，亚四氢呋喃基，亚吡咯啉基，亚吡咯烷基，亚吗啉基，亚吲哚基，亚二氮杂环庚三烯基，亚氮杂环庚三烯基，亚硫杂环庚三烯基，亚哌啶基，和亚氧杂环庚三烯基。
[85]段80的方法，其中R1和R2组合形成任选取代的亚苯基。
[86]段80的方法，其中R1和R2组合形成任选取代的亚吡咯基。
[87]段80的方法，其中R1和R2组合形成任选取代的亚吡啶基。
[88]段80的方法，其中R1和R2组合形成任选取代的亚吡咯啉基。
[89]段69-88任一项的方法，其中R2和R3组合形成任选取代的稠合环。
[90]段89的方法，其中R2和R3组合形成任选取代的稠合的亚环烷基环。
[91]段89的方法，其中R2和R3组合形成任选取代的稠合的亚芳基环。
[92]段89的方法，其中R2和R3组合形成任选取代的稠合的亚杂芳基环。
[93]段89的方法，其中R2和R3组合形成任选取代的模块，其选自亚苯基，亚吡唑基，亚呋喃基，亚咪唑基，亚异噁唑基，亚噁二唑基，亚噁唑基，亚吡咯基，亚吡啶基，亚嘧啶基，亚哒嗪基，亚噻唑基，亚三唑基，亚噻吩基，亚二氢噻吩并-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolylene)，亚硫茚基，亚咔唑基，亚苯并咪唑基，亚苯并噻吩基，亚苯并呋喃基，亚吲哚基，亚喹啉基，亚苯并三唑基，亚苯并噻唑基，亚苯并噁唑基，亚苯并咪唑基，亚异喹啉基，亚异吲哚基，亚吖啶基，亚苯并异唑基(benzoisazolylene)，亚二甲基乙内酰脲(dimethylhydantoinene)，亚吡嗪基，亚四氢呋喃基，亚吡咯啉基，亚吡咯烷基，亚吗啉基，亚吲哚基，亚二氮杂环庚三烯基，亚氮杂环庚三烯基，亚硫杂环庚三烯基，亚哌啶基，和亚氧杂环庚三烯基。
[94]段89的方法，其中R2和R3组合形成任选取代的亚苯基。
[95]段89的方法，其中R2和R3组合形成任选取代的亚吡咯基。
[96]段89的方法，其中R2和R3组合形成任选取代的亚吡啶基。
[97]段89的方法，其中R2和R3组合形成任选取代的亚吡咯啉基。
[98]段任一项的方法，其中R3和R4组合形成任选取代的稠合环。
[99]段98的方法，其中R3和R4组合形成任选取代的稠合的亚环烷基环。
[100]段98的方法，其中R3和R4组合形成任选取代的稠合的亚芳基环。
[101]段98的方法，其中R3和R4组合形成任选取代的稠合的亚杂芳基环。
[102]段98的方法，其中R3和R4组合形成任选取代的模块，其选自亚苯基，亚吡唑基，亚呋喃基，亚咪唑基，亚异噁唑基，亚噁二唑基，亚噁唑基，亚吡咯基，亚吡啶基，亚嘧啶基，亚哒嗪基，亚噻唑基，亚三唑基，亚噻吩基，亚二氢噻吩并-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolylene)，亚硫茚基，亚咔唑基，亚苯并咪唑基，亚苯并噻吩基，亚苯并呋喃基，亚吲哚基，亚喹啉基，亚苯并三唑基，亚苯并噻唑基，亚苯并噁唑基，亚苯并咪唑基，亚异喹啉基，亚异吲哚基，亚吖啶基，亚苯并异唑基(benzoisazolylene)，亚二甲基乙内酰脲(dimethylhydantoinene)，亚吡嗪基，亚四氢呋喃基，亚吡咯啉基，亚吡咯烷基，亚吗啉基，亚吲哚基，亚二氮杂环庚三烯基，亚氮杂环庚三烯基，亚硫杂环庚三烯基，亚哌啶基，和亚氧杂环庚三烯基。
[103]段98的方法，其中R3和R4组合形成任选取代的亚苯基。
[104]段98的方法，其中R3和R4组合形成任选取代的亚吡咯基。
[105]段98的方法，其中R3和R4组合形成任选取代的亚吡啶基。
[106]段98的方法，其中R3和R4组合形成任选取代的亚吡咯啉基。
[107]段69-106任一项的方法，其中R1和R2组合形成任选取代的稠合环；和R3和R4组合形成任选取代的稠合环。
[108]段69-107任一项的方法，其中的仅仅一对R1和R2，R2和R3，和R3和R4组合形成任选取代的稠合环。
[109]段69的方法，其中所述醌化合物选自下组：(I-1)：1,4-苯醌；(I-2)：1,4-萘醌；(I-3)：2-羟基-1,4-萘醌；(I-4)：2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q0；(I-5)：2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或杜醌；(I-6)：1,4-二羟基蒽醌；(II-1)：3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺素红；(II-2)：4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌；和(II-3)：吡咯并喹啉醌；或其盐或溶剂化物。
[110]段46-109任一项的方法，其中醌化合物对纤维素材料的有效量作为对纤维素的糖苷单元的摩尔比是约10-6至约10，例如，约10-6至约7.5，约10-6至约5，约10-6至约2.5，约10-6至约1，约10-5至约1，约10-5至约10-1，约10-4至约10-1，约10-3至约10-1，或约10-3至约10-2。
[111]段46-109任一项的方法，其中醌化合物对纤维素的有效量是约10-6至约10每g的纤维素，例如，约10-6至约7.5，约10-6至约5，约10-6至约2.5，约10-6至约1，约10-5至约1，约10-5至约10-1，约10-4至约10-1，约10-3至约10-1，或约10-3至约10-2每g的纤维素。
[112]段46-109任一项的方法，其中醌化合物的有效量是约0.1μM至约1M，例如，约0.5μM至约0.75M，约0.75μM至约0.5M，约1μM至约0.25M，约1μM至约0.1M，约5μM至约50mM，约10μM至约25mM，约50μM至约25mM，约10μM至约10mM，约5μM至约5mM，或约0.1mM至约1mM。
本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。
Figure IDA00003043605800011
Figure IDA00003043605800021
Figure IDA00003043605800031
Figure IDA00003043605800041
Figure IDA00003043605800051
Figure IDA00003043605800061
Figure IDA00003043605800071
Figure IDA00003043605800081
Figure IDA00003043605800091
Figure IDA00003043605800101
Figure IDA00003043605800111
Figure IDA00003043605800121
Figure IDA00003043605800131
Figure IDA00003043605800141
Figure IDA00003043605800151
Figure IDA00003043605800161
Figure IDA00003043605800171
Figure IDA00003043605800191
Figure IDA00003043605800201
Figure IDA00003043605800211
Figure IDA00003043605800221
Figure IDA00003043605800231
Figure IDA00003043605800241
Figure IDA00003043605800251
Figure IDA00003043605800261
Figure IDA00003043605800271
Figure IDA00003043605800281
Figure IDA00003043605800291
Figure IDA00003043605800301
Figure IDA00003043605800321
Figure IDA00003043605800331
Figure IDA00003043605800341
Figure IDA00003043605800351
Figure IDA00003043605800361
Figure IDA00003043605800371
Figure IDA00003043605800391
Figure IDA00003043605800401
Figure IDA00003043605800411
Figure IDA00003043605800421
Figure IDA00003043605800441
Figure IDA00003043605800451
Figure IDA00003043605800461
Figure IDA00003043605800471
Figure IDA00003043605800481
Figure IDA00003043605800491
Figure IDA00003043605800501
Figure IDA00003043605800511
Figure IDA00003043605800521
Figure IDA00003043605800531
Figure IDA00003043605800551
Figure IDA00003043605800561
Figure IDA00003043605800591
Figure IDA00003043605800601
Figure IDA00003043605800611
Figure IDA00003043605800621
Figure IDA00003043605800631
Figure IDA00003043605800641
Figure IDA00003043605800651
Figure IDA00003043605800661
Figure IDA00003043605800671
Figure IDA00003043605800681
Figure IDA00003043605800691
Figure IDA00003043605800701
Figure IDA00003043605800711
Figure IDA00003043605800721
Figure IDA00003043605800751
Figure IDA00003043605800771
Figure IDA00003043605800781
Figure IDA00003043605800791
Figure IDA00003043605800801
Figure IDA00003043605800821
Figure IDA00003043605800831
Figure IDA00003043605800841
Figure IDA00003043605800851
Figure IDA00003043605800871
Figure IDA00003043605800881
Figure IDA00003043605800891
Figure IDA00003043605800901
Figure IDA00003043605800911
Figure IDA00003043605800921
Figure IDA00003043605800931
Figure IDA00003043605800941
Figure IDA00003043605800951
Figure IDA00003043605800961
Figure IDA00003043605800971
Figure IDA00003043605800981
Figure IDA00003043605800991
Figure IDA00003043605801011
Figure IDA00003043605801031
Figure IDA00003043605801041
Figure IDA00003043605801051
Figure IDA00003043605801061
Figure IDA00003043605801081
Figure IDA00003043605801091
Figure IDA00003043605801101
Figure IDA00003043605801111
Figure IDA00003043605801121
Figure IDA00003043605801151
Figure IDA00003043605801171
Figure IDA00003043605801181
Figure IDA00003043605801191
Figure IDA00003043605801201
Figure IDA00003043605801211
Figure IDA00003043605801221
Figure IDA00003043605801231
Figure IDA00003043605801241
Figure IDA00003043605801251
Figure IDA00003043605801261
Figure IDA00003043605801271
Figure IDA00003043605801301
Figure IDA00003043605801311
Figure IDA00003043605801321
Figure IDA00003043605801341
Figure IDA00003043605801351
Figure IDA00003043605801361
Figure IDA00003043605801371
Figure IDA00003043605801381
Figure IDA00003043605801401
Figure IDA00003043605801421
Figure IDA00003043605801431
Figure IDA00003043605801441
Figure IDA00003043605801451
Figure IDA00003043605801461
Figure IDA00003043605801471

Claims (15)

1.一种组合物，其包含：(a)具有纤维素分解增强活性的多肽和(b)醌化合物，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽和所述醌化合物的组合增强纤维素分解酶对纤维素材料的水解。
2.权利要求1的组合物，其中所述醌化合物是式(I)或(II)的化合物：
Figure FDA00003043605300011
或其盐或溶剂化物；
其中R1，R2，R3，和R4独立地是氢，卤素，-OH，-OR8，-NO2，-N(R9)(R10)，-CN，-C(O)R5，-C(O)OR6，-C(O)NHR7，-OC(O)R11，-NHC(O)R12，-OC(O)OR13，-NHC(O)OR14，-OC(O)NHR15，-NHC(O)NHR16，-SO2R17，-SO2N(R18)(R19)，-SR20，-NC(R21)(R22)，或任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；
R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11，R12，R13，R14，R15，R16，R18，R19，R20，R21，和R22独立地是氢，或任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；和
R17是任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；和
其中R1和R2，R2和R3，和R3和R4的每一对可组合形成任选取代的稠合环。
3.权利要求2的组合物，其中所述醌化合物选自下组：(I-1)：1,4-苯醌；(I-2)：1,4-萘醌；(I-3)：2-羟基-1,4-萘醌；(I-4)：2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q0；(I-5)：2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或杜醌；(I-6)：1,4-二羟基蒽醌；(II-1)：3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺素红；(II-2)：4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌；和(II-3)：吡咯并喹啉醌；或其盐或溶剂化物。
4.权利要求1-3任一项的组合物，其进一步包含(c)一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
5.一种用于降解或转化纤维素材料的方法，其包括：在具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的存在下用酶组合物处理纤维素材料，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合增强所述酶组合物对所述纤维素材料的水解。
6.权利要求5的方法，其进一步包括回收经降解的纤维素材料。
7.权利要求5或6的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
8.一种用于产生发酵产物的方法，其包括：
(a)在具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的存在下用酶组合物糖化纤维素材料，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合增强所述酶组合物对所述纤维素材料的水解。
(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和
(c)从发酵回收发酵产物。
9.权利要求8的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
10.一种发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料是在具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的存在下用酶组合物糖化的，其中所述具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合增强所述酶组合物对所述纤维素材料的水解。
11.权利要求10的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。
12.权利要求10或11的方法，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。
13.权利要求12的方法，其进一步包括从发酵回收发酵产物。
14.权利要求5-13任一项的方法，其中所述醌化合物是式(I)或(II)的化合物：
Figure FDA00003043605300031
或其盐或溶剂化物；
其中R1，R2，R3，和R4独立地是氢，卤素，-OH，-OR8，-NO2，-N(R9)(R10)，-CN，-C(O)R5，-C(O)OR6，-C(O)NHR7，-OC(O)R11，-NHC(O)R12，-OC(O)OR13，-NHC(O)OR14，-OC(O)NHR15，-NHC(O)NHR16，-SO2R17，-SO2N(R18)(R19)，-SR20，-NC(R21)(R22)，或任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；
R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11，R12，R13，R14，R15，R16，R18，R19，R20，R21，和R22独立地是氢，或任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；和
R17是任选取代的模块，其选自烷基，烯基，炔基，环烷基，环烷基-烷基，杂环烷基，杂环烷基-烷基，芳基，芳烷基，杂芳基，和杂芳烷基；和
其中R1和R2，R2和R3，和R3和R4的每一对可组合形成任选取代的稠合环。
15.权利要求14的方法，其中所述醌化合物选自下组：(I-1)：1,4-苯醌；(I-2)：1,4-萘醌；(I-3)：2-羟基-1,4-萘醌；(I-4)：2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q0；(I-5)：2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或杜醌；(I-6)：1,4-二羟基蒽醌；(II-1)：3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺素红；(II-2)：4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌；和(II-3)：吡咯并喹啉醌；或其盐或溶剂化物。
CN2011800495348A 2010-08-12 2011-08-05 包含具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合物及其用途 Pending CN103270165A (zh)

Applications Claiming Priority (17)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37312410P 2010-08-12 2010-08-12
US37317010P 2010-08-12 2010-08-12
US37312810P 2010-08-12 2010-08-12
US37316610P 2010-08-12 2010-08-12
US37314510P 2010-08-12 2010-08-12
US37315010P 2010-08-12 2010-08-12
US37315710P 2010-08-12 2010-08-12
US37321010P 2010-08-12 2010-08-12
US61/373,157 2010-08-12
US61/373,124 2010-08-12
US61/373,166 2010-08-12
US61/373,210 2010-08-12
US61/373,145 2010-08-12
US61/373,170 2010-08-12
US61/373,150 2010-08-12
US61/373,128 2010-08-12
PCT/US2011/046720 WO2012021394A1 (en) 2010-08-12 2011-08-05 Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a quinone compound and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103270165A true CN103270165A (zh) 2013-08-28

Family

ID=44515021

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180049490.9A Active CN103261429B (zh) 2010-08-12 2011-08-05 包含具有纤维素分解增强活性的多肽和液剂的组合物及其用途
CN2011800495348A Pending CN103270165A (zh) 2010-08-12 2011-08-05 包含具有纤维素分解增强活性的多肽和醌化合物的组合物及其用途

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180049490.9A Active CN103261429B (zh) 2010-08-12 2011-08-05 包含具有纤维素分解增强活性的多肽和液剂的组合物及其用途

Country Status (7)

Country Link
US (9) US20130189747A1 (zh)
EP (7) EP2603596B1 (zh)
CN (2) CN103261429B (zh)
BR (2) BR112013002979A2 (zh)
DK (1) DK2603596T3 (zh)
MX (2) MX2013001540A (zh)
WO (8) WO2012021396A1 (zh)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012021396A1 (en) * 2010-08-12 2012-02-16 Novozymes, Inc. Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and an organic compound and uses thereof
US9458483B2 (en) 2010-08-12 2016-10-04 Novozymes, Inc. Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a bicyclic compound and uses thereof
EP3470514A1 (en) * 2010-08-30 2019-04-17 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
MX2013005654A (es) 2010-11-22 2013-07-17 Novozymes Inc Composiciones y metodos para la produccion de acido 3-hidroxipropionico.
WO2012135659A2 (en) * 2011-03-31 2012-10-04 Novozymes A/S Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
US8993274B2 (en) * 2011-08-18 2015-03-31 Andritz Inc. Enzymatic hydrolysis pretreatment of lignocellulosic materials
US20140234897A1 (en) * 2011-11-04 2014-08-21 Novozymes Inc. Polypeptides Having Cellobiohydrolase Activity and Polynucleotides Encoding Same
BR112014026625A2 (pt) 2012-04-27 2017-07-18 Novozymes Inc E Novozymes As variante do polipeptídeo, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira recombinante, métodos para produção de uma variante do polipeptídeo e para obtenção de uma variante do polipeptídeo, planta, parte de planta ou célula de planta transgênica, processos para degradação ou conversão de um material celulósico, para produção de um produto da fermentação e para fermentação de um material celulósico, composição, e, formulação ou composição de cultura celular de caldo inteiro
WO2013170017A2 (en) * 2012-05-09 2013-11-14 The University Of Akron Enzyme-based protein separation and enrichment from soy meal, wheat meal, and other protein-rich materials derived from plant seeds, fruits and other biomass
US9458440B2 (en) 2012-06-07 2016-10-04 Roal Oy Proteins for the treatment of cellulosic material
FI124477B (en) * 2012-06-07 2014-09-15 Roal Oy New proteins for the treatment of cellulose materials
WO2014000692A1 (en) * 2012-06-29 2014-01-03 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US9957492B2 (en) 2012-06-29 2018-05-01 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
BR112015005884A2 (pt) 2012-09-19 2017-08-08 Novozymes Inc E Novozymes As processos para degradação de um material celulósico, para produção de um produto da fermentação, e de fermentação de um material celulósico, composição, e, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células
US20150275194A1 (en) 2012-10-24 2015-10-01 Novozymes A/S Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same
US20150337347A1 (en) * 2012-11-30 2015-11-26 Novozymes A/S Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same
WO2014093835A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US20150337280A1 (en) 2012-12-19 2015-11-26 Novozymes A/S Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same
CN110628749A (zh) 2013-03-08 2019-12-31 诺维信公司 纤维二糖水解酶变体和编码它们的多核苷酸
US9556465B2 (en) 2013-05-10 2017-01-31 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
EP3052620B1 (en) 2013-09-04 2020-07-15 Novozymes A/S Processes for increasing enzymatic hydrolysis of cellulosic material
ES2968371T3 (es) 2013-10-10 2024-05-09 Eastern Virginia Medical School Derivados de 4-((2-hidroxi-3-metoxibencil)amino) bencenosulfonamida como inhibidores de la 12-lipoxigenasa
EP3074513A1 (en) 2013-11-26 2016-10-05 Novozymes A/S Enzyme compositions and uses thereof
EP3511418B1 (en) 2014-01-07 2020-07-15 Novozymes A/S Corollospora maritima mannanase and its use
US20150272184A1 (en) 2014-03-27 2015-10-01 International Flavors & Fragrances Inc. Naringenin and salts thereof for sweetness enhancement
MY182924A (en) 2014-06-06 2021-02-05 Novozymes As Enzyme compositions and uses thereof
EP3191597A1 (en) 2014-08-21 2017-07-19 Novozymes A/S Process for saccharifying cellulosic material under oxygen addition
EP3186373B1 (en) 2014-08-28 2020-12-16 Renescience A/S Solubilization of msw with blend enzymes
WO2016037096A1 (en) 2014-09-05 2016-03-10 Novozymes A/S Carbohydrate binding module variants and polynucleotides encoding same
DK3198001T3 (da) 2014-09-23 2021-11-08 Novozymes As Fremgangsmåde til fremstilling af ethanol og fermentering af organismer
US10557127B2 (en) 2015-02-24 2020-02-11 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
BR112017019331A2 (pt) 2015-03-12 2018-06-05 Beta Renewables Spa processos para sacarificação de múltiplos estágios de um material lignocelulósico e para melhorar um rendimento de glicose ou xilose de sacarificação de um material lignocelulósico em um reator de tanque continuamente agitado
EP3268486A1 (en) 2015-03-12 2018-01-17 Novozymes A/S Multi-stage enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass employing an oxidoreductase with an aa9 polypeptide
EP3268484B1 (en) 2015-03-12 2020-06-17 Novozymes A/S Multi-stage enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass
WO2016188459A1 (en) 2015-05-27 2016-12-01 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US10577594B2 (en) 2015-07-24 2020-03-03 Novozymes, Inc. Polypeptides having arabinofuranosidase activity and polynucleotides encoding same
US20180216089A1 (en) 2015-07-24 2018-08-02 Novozymes, Inc. Polypeptides Having Beta-Xylosidase Activity And Polynucleotides Encoding Same
CN107949637A (zh) 2015-09-04 2018-04-20 诺维信公司 抑制酶组合物的aa9溶解性多糖单加氧酶催化的失活的方法
CN108350044B (zh) 2015-09-22 2022-05-24 诺维信公司 具有纤维二糖水解酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸
WO2017070219A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Novozymes A/S Lytic polysaccharide monooxygenase (lpmo) variants and polynucleotides encoding same
CN114054481A (zh) 2015-11-02 2022-02-18 雷内科学有限公司 用混合酶溶解城市固体废物
CN105385667B (zh) * 2015-12-18 2019-01-11 江南大学 一种以木质素磺酸盐作为诱导剂提高栓菌产酶的方法
DK3416740T3 (da) 2016-02-19 2021-02-08 Intercontinental Great Brands Llc Fremgangsmåder til dannelse af multiple værdistrømme ud fra biomassekilder
BR112018067371A2 (pt) 2016-03-02 2019-01-15 Novozymes As variante de celobio-hidrolase, composição de enzimas, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células, polinucleotídeo, célula hospedeira recombinante, planta, parte de planta ou célula de planta transgênica, métodos para produção e para obtenção de uma variante de celobio-hidrolase, planta trangênica, e, processos para degradação de um material celulósico, para produção de um produto de fermentação e para fermentação de um material celulósico
EP3433358B1 (en) 2016-03-24 2022-07-06 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
WO2017205535A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
US10913938B2 (en) 2016-07-29 2021-02-09 Dsm Ip Assets B.V. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and uses thereof
WO2018026868A1 (en) 2016-08-01 2018-02-08 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
WO2018085370A1 (en) 2016-11-02 2018-05-11 Novozymes A/S Processes for reducing production of primeverose during enzymatic saccharification of lignocellulosic material
WO2018106656A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Danisco Us Inc Truncated lpmo enzymes and use thereof
WO2018106792A1 (en) 2016-12-06 2018-06-14 Novozymes A/S Improved processes for production of ethanol from xylose-containing cellulosic substrates using engineered yeast strains
CN108424896B (zh) * 2017-02-13 2021-11-09 中国科学院大连化学物理研究所 一种混菌发酵玉米秸秆糠醛渣生产纤维素酶的方法
US11267838B2 (en) 2017-04-17 2022-03-08 Board Of Trustees Of Michigan State University Methods for lignin depolymerization using thiols
US11091753B2 (en) 2017-05-31 2021-08-17 Novozymes A/S Xylose fermenting yeast strains and processes thereof for ethanol production
US20200157581A1 (en) 2017-06-02 2020-05-21 Novozymes A/S Improved Yeast For Ethanol Production
CA3089135A1 (en) 2018-01-29 2019-08-01 Novozymes A/S Microorganisms with improved nitrogen utilization for ethanol production
CN110386890B (zh) * 2018-04-12 2021-06-18 沈阳药科大学 一种基于胱氨酰胺衍生物的载药纳米水凝胶及其制备方法
EP3827088A1 (en) 2018-07-25 2021-06-02 Novozymes A/S Enzyme-expressing yeast for ethanol production
BR112021003156A2 (pt) 2018-08-23 2021-05-11 Seagen, Inc. composição, anticorpo que se liga ao tigit humano, formulação farmacêutica, polinucleotídeo isolado, vetor, célula hospedeira, métodos para a produção de um anticorpo que se liga ao tigit humano e de anticorpos afucosilados que se ligam a tigit e para o tratamento de um câncer, e, kit.
CA3114783A1 (en) 2018-10-08 2020-04-16 Novozymes A/S Enzyme-expressing yeast for ethanol production
CN113302293A (zh) 2018-12-12 2021-08-24 诺维信公司 具有木聚糖酶活性的多肽以及编码这些多肽的多核苷酸
US20220064228A1 (en) 2018-12-12 2022-03-03 Novozymes A/S Methods For Increasing The Productivity Of A Filamentous Fungal Cell In The Production Of A Polypeptide
EP4004029A1 (en) 2019-07-26 2022-06-01 Novozymes A/S Microorganisms with improved nitrogen transport for ethanol production
EP4009807A1 (en) 2019-08-05 2022-06-15 Novozymes A/S Enzyme blends and processes for producing a high protein feed ingredient from a whole stillage byproduct
CA3143527A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Novozymes A/S Fusion proteins for improved enzyme expression
WO2021055395A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucanase activity and polynucleotides encoding same
CN110542723B (zh) * 2019-09-17 2020-04-24 哈尔滨工业大学 一种基于导波信号稀疏分解及损伤定位的两阶段损伤位置识别方法
US11471426B2 (en) * 2019-10-16 2022-10-18 American River Nutrition, Llc Compositions comprising quinone and/or quinol and methods of preparations and use thereof
KR20220122648A (ko) * 2019-12-03 2022-09-02 차이나 메디칼 유니버시티 올리고펩티드, 이의 테스트 키트, 및 이의 의약 조성물
CN115175923A (zh) 2019-12-10 2022-10-11 诺维信公司 用于改善的戊糖发酵的微生物
CN115052477A (zh) 2020-01-24 2022-09-13 诺维信公司 在多肽生产中具有提高的生产力的丝状真菌细胞的突变体
US20240228996A1 (en) 2020-02-10 2024-07-11 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
AU2021338555A1 (en) 2020-09-04 2023-03-09 Microbiogen Pty. Ltd. Improved fermenting organism for ethanol production
US20230399632A1 (en) 2020-11-02 2023-12-14 Novozymes A/S Glucoamylase Variants and Polynucleotides Encoding Same
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
CN117795089A (zh) 2021-06-07 2024-03-29 诺维信公司 用于改善的乙醇发酵的工程化微生物
CN113368899B (zh) * 2021-07-03 2022-05-10 太原理工大学 一种高酸密度拟纤维素酶树脂固体酸催化剂的制备方法
WO2024064901A2 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Novozymes A/S Improved fermenting organism for ethanol production

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4178861A (en) * 1976-12-13 1979-12-18 Australian Paper Manufacturers Limited Method for the delignification of lignocellulosic material in an amine delignifying liquor containing a quinone or hydroquinone compound
WO2005074647A2 (en) * 2004-01-30 2005-08-18 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same

Family Cites Families (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4248663A (en) 1978-07-05 1981-02-03 Pulp And Paper Research Institute Of Canada Pulping with an alkaline liquor containing a cyclic keto compound and an amino compound
US4305566A (en) 1979-10-31 1981-12-15 Fluid Controls, Inc. Fluid control valve
US4310383A (en) 1979-11-23 1982-01-12 Crown Zellerbach Corporation Continuous countercurrent pretreatment of lignocellulose with anthraquinone prior to pulping
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
US4540664A (en) 1983-05-13 1985-09-10 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Method of saccharifying cellulose
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
WO1989009259A1 (en) 1988-03-24 1989-10-05 Novo-Nordisk A/S A cellulase preparation
US5776757A (en) 1988-03-24 1998-07-07 Novo Nordisk A/S Fungal cellulase composition containing alkaline CMC-endoglucanase and essentially no cellobiohydrolase and method of making thereof
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5110735A (en) 1989-09-26 1992-05-05 Midwest Research Institute Thermostable purified endoglucanase from thermophilic bacterium acidothermus cellulolyticus
US5275944A (en) 1989-09-26 1994-01-04 Midwest Research Institute Thermostable purified endoglucanas from acidothermus cellulolyticus ATCC 43068
US5536655A (en) 1989-09-26 1996-07-16 Midwest Research Institute Gene coding for the E1 endoglucanase
EP0531372B2 (en) 1990-05-09 2004-04-14 Novozymes A/S A cellulase preparation comprising an endoglucanase enzyme
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
EP0495257B1 (en) 1991-01-16 2002-06-12 The Procter & Gamble Company Compact detergent compositions with high activity cellulase
ATE262035T1 (de) 1992-10-06 2004-04-15 Novozymes As Zellulosevarianten
ATE258224T1 (de) 1993-03-10 2004-02-15 Novozymes As Enzyme mit xylanaseaktivität aus aspergillus aculeatus
DE4343591A1 (de) 1993-12-21 1995-06-22 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
DE69534513T2 (de) 1994-03-08 2006-07-27 Novozymes A/S Neuartige alkalische zellulasen
ATE206460T1 (de) 1994-06-03 2001-10-15 Novo Nordisk Biotech Inc Gereinigte myceliophthora laccasen und nukleinsäuren dafür kodierend
WO1996000787A1 (en) 1994-06-30 1996-01-11 Novo Nordisk Biotech, Inc. Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein
EP1995303A3 (en) 1994-10-06 2008-12-31 Novozymes A/S Enzyme preparation with endoglucanase activity
CN102080070B (zh) 1995-03-17 2016-01-20 诺沃奇梅兹有限公司 新的内切葡聚糖酶
US6313081B1 (en) 1995-04-28 2001-11-06 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien (Kgaa) Detergents comprising cellulases
US20030044956A1 (en) 1995-08-23 2003-03-06 Short Jay M. Enzymes having carboxymethyl cellulase activity and methods of use thereof
EP0857216B1 (en) 1995-10-17 2014-09-10 AB Enzymes Oy Cellulases, the genes encoding them and uses thereof
AU3938997A (en) 1996-08-26 1998-03-19 Novo Nordisk A/S A novel endoglucanase
EP1726644A1 (en) 1996-09-17 2006-11-29 Novozymes A/S Cellulase variants
US6451063B1 (en) 1996-09-25 2002-09-17 Genencor International, Inc. Cellulase for use in industrial processes
US6017870A (en) 1996-10-09 2000-01-25 Genencor International, Inc. Purified cellulase and method of producing
US7883872B2 (en) 1996-10-10 2011-02-08 Dyadic International (Usa), Inc. Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose
US5811381A (en) 1996-10-10 1998-09-22 Mark A. Emalfarb Cellulase compositions and methods of use
US5989899A (en) 1996-12-23 1999-11-23 Genencor International, Inc. Oversized cellulase compositions for use in detergent compositions and in the treatment of textiles
US5871663A (en) 1997-03-11 1999-02-16 Westvaco Corporation Additive composition for reducing anthraquinone requirements in pulping of lignocellulosic material
AU739445B2 (en) 1997-07-31 2001-10-11 Dsm Ip Assets B.V. Cellulose degrading enzymes of aspergillus
US5871550A (en) 1997-08-26 1999-02-16 Genencor International, Inc. Mutant Thermonospora spp. cellulase
US6562612B2 (en) 1997-11-19 2003-05-13 Genencor International, Inc. Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same
EP1032686B1 (en) 1997-11-19 2005-03-09 Genencor International, Inc. Cellulase produced by actinomycetes and method of producing same
KR20010032218A (ko) 1997-11-19 2001-04-16 마가렛 에이.혼 악티노미케테스에 의하여 제조되는 셀룰라제 및 이를제조하는 방법
WO1999031255A2 (en) 1997-12-16 1999-06-24 Genencor International, Inc. Novel egiii-like enzymes, dna encoding such enzymes and methods for producing such enzymes
DE69933561T2 (de) 1998-06-24 2007-08-16 Genencor International, Inc. Rekombinante herstellung von cellulase aus actinomycetes
AU6188599A (en) 1998-10-26 2000-05-15 Novozymes A/S Constructing and screening a dna library of interest in filamentous fungal cells
DE69939947D1 (de) 1998-12-23 2009-01-02 Novozymes As Verfahren zur herstellung von polypeptiden in mutierten aspergillus zellen
WO2000056900A2 (en) 1999-03-22 2000-09-28 Novo Nordisk Biotech, Inc. Promoter sequences derived from fusarium venenatum and uses thereof
EP1179051A4 (en) 1999-05-19 2003-04-23 Midwest Research Inst ENDOGLUCANASE E1 VARIANTS: Y245G, Y82R AND W42R
ES2166316B1 (es) 2000-02-24 2003-02-16 Ct Investig Energeticas Ciemat Procedimiento de produccion de etanol a partir de biomasa lignocelulosica utilizando una nueva levadura termotolerante.
US6983971B2 (en) 2001-03-26 2006-01-10 Magna International Inc. Mid structural module
JP2004527261A (ja) 2001-05-18 2004-09-09 ノボザイムス アクティーゼルスカブ セロビアーゼ活性を有するポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド
US6982159B2 (en) 2001-09-21 2006-01-03 Genencor International, Inc. Trichoderma β-glucosidase
US7045331B2 (en) 2001-12-18 2006-05-16 Genencor International, Inc. EGVII endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7049125B2 (en) 2001-12-18 2006-05-23 Genencor International, Inc. EGVIII endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7056721B2 (en) 2001-12-18 2006-06-06 Genencor International, Inc. EGVI endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7005289B2 (en) 2001-12-18 2006-02-28 Genencor International, Inc. BGL5 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7045332B2 (en) 2001-12-18 2006-05-16 Genencor International, Inc. BGL4 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same
JP4334352B2 (ja) 2002-01-23 2009-09-30 ロイヤル ネダルコ ベスローテン フェンノートシャップ ペントース糖の発酵
EP2305801B1 (en) 2002-08-16 2017-07-05 Danisco US Inc. Novel variant hyprocrea jecorina CBH1 cellulases
ES2601145T3 (es) 2002-11-07 2017-02-14 Danisco Us Inc. Beta-glucosidasa BGL6 y ácidos nucleicos que codifican la misma
US7407788B2 (en) 2002-11-21 2008-08-05 Danisco A/S, Genencor Division BGL7 beta-glucosidase and nucleic acids encoding the same
CA2770976C (en) 2003-03-21 2015-05-19 Genencor International, Inc. Cbh1 homologs and variant cbh1 cellulases
JP5427342B2 (ja) 2003-04-01 2014-02-26 ジェネンコー・インターナショナル・インク 変異体フミコーラ・グリセアｃｂｈ１．１
DK1622921T3 (da) 2003-05-02 2010-09-13 Novozymes Inc Varianter af beta-glucosidaser
WO2005001036A2 (en) 2003-05-29 2005-01-06 Genencor International, Inc. Novel trichoderma genes
ES2437198T3 (es) 2003-10-28 2014-01-09 Novozymes Inc. Polipéptidos con actividad de beta-glucosidasa y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos
ATE441705T1 (de) 2003-10-30 2009-09-15 Novozymes As Kohlenhydratbindende module
WO2006011899A1 (en) 2003-11-25 2006-02-02 L-3 Communications Security and Detection Systems Corporation Security system for detecting nuclear masses
WO2005056772A1 (en) 2003-12-09 2005-06-23 Novozymes Inc. Methods for eliminating or reducing the expression of genes in filamentous fungal strains
WO2005067531A2 (en) 2004-01-16 2005-07-28 Novozymes Inc. Methods for degrading lignocellulosic materials
CA2554784C (en) 2004-02-06 2013-05-28 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP1715736A4 (en) 2004-02-12 2008-09-03 Novozymes Inc POLYPEPTIDES HAVING XYLANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING SAME
CN1930294A (zh) 2004-03-25 2007-03-14 金克克国际有限公司 纤维素酶融合蛋白和编码该纤维素酶融合蛋白的异源纤维素酶融合构建物
US8097445B2 (en) 2004-03-25 2012-01-17 Danisco Us Inc. Exo-endo cellulase fusion protein
US20060004699A1 (en) 2004-06-30 2006-01-05 Nokia Corporation Method and system for managing metadata
EP1781681A4 (en) 2004-07-06 2007-08-22 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH ALPHA GLUCOSIDASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEREOF
DK176540B1 (da) 2004-09-24 2008-07-21 Cambi Bioethanol Aps Fremgangsmåde til behandling af biomasse og organisk affald med henblik på at udvinde önskede biologisk baserede produkter
EP1799819B1 (en) 2004-09-30 2011-03-23 Novozymes Inc. Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same
US8008056B2 (en) 2004-12-30 2011-08-30 Danisco Us Inc. Variant Hypocrea jecorina CBH2 cellulases
CN101160409B (zh) 2005-04-12 2013-04-24 纳幕尔杜邦公司 获得可发酵糖的生物质处理方法
BRPI0609906A8 (pt) 2005-04-29 2017-11-21 Ab Enzymes Oy proteína de fusão de celulase, seu processo de produção e composição detergente contendo a mesma, vetor de expressão, célula hospedeira, preparação de enzima, processos para desbotamento e para bioacabamento e métodos de tratamento de fibra celulósica contendo material têxtil, para tratar fibra ou polpa derivada de madeira e para melhorar a qualidade de ração animal
JP5221347B2 (ja) 2005-08-04 2013-06-26 ノボザイムス，インコーポレイティド β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチド
US7608689B2 (en) 2005-09-30 2009-10-27 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
FI120045B (fi) 2005-12-22 2009-06-15 Roal Oy Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit
ES2637008T3 (es) 2005-12-22 2017-10-10 Ab Enzymes Oy Enzimas nuevas
IES20060090A2 (en) * 2006-02-10 2007-06-13 Nat Univ Ireland Talaromyces emersonii enzyme systems
US8304212B2 (en) 2006-07-10 2012-11-06 Dyadic International, Inc. Methods and compositions for degradation of lignocellulosic material
US7464746B2 (en) 2006-08-09 2008-12-16 Nucor Corporation Method of casting thin cast strip
CN101809150B (zh) 2007-05-31 2013-09-04 诺维信股份有限公司 提高多肽的纤维素分解增强活性的方法
WO2008148131A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
JP2010536391A (ja) 2007-08-30 2010-12-02 アイオジェン エナジー コーポレイション 補助酵素を使用するリグノセルロース系原料の酵素的加水分解
CN101796247B (zh) * 2007-09-03 2014-01-22 诺维信公司 脱毒和再循环在含木素纤维素材料的预处理中使用的洗涤溶液
WO2009042622A2 (en) * 2007-09-25 2009-04-02 Novozymes A/S Process for the production of a fermentation product from a wood-containing material, wherein the wood-containing material is treated with esterases
WO2009042846A1 (en) 2007-09-28 2009-04-02 Novozymes A/S Polypeptides having acetylxylan esterase activity and polynucleotides encoding same
CA2707017A1 (en) 2007-11-30 2009-06-11 Novozymes A/S Polypeptides having arabinofuranosidase activity and polynucleotides encoding same
CN101932704A (zh) 2007-12-05 2010-12-29 诺维信公司 具有木聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
WO2009073709A1 (en) 2007-12-06 2009-06-11 Novozymes A/S Polypeptides having acetylxylan esterase activity and polynucleotides encoding same
WO2009076122A1 (en) 2007-12-07 2009-06-18 Novozymes A/S Polypeptides having feruloyl esterase activity and polynucleotides encoding same
CA2709490A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
BRPI0822031A2 (pt) 2007-12-19 2017-06-13 Novozymes As polipeptídeo e polinicleotídeo isolados, construção de ácido nucleico, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptídeo, um mutante de uma célula precursora, uma proteína e um produto de fermentação, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para degradar ou converter um material celulósico, e para fermentar um material celulósico, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, e, molécula de rna inibidora
CA2709371A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US8575426B2 (en) 2007-12-19 2013-11-05 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP2592151A3 (en) * 2007-12-21 2014-07-30 Inbicon A/S Non-sterile fermentation of bioethanol
US8435473B2 (en) 2008-02-18 2013-05-07 Japan Science And Technology Agency Superconducting compound and method for producing the same
WO2010059424A2 (en) 2008-11-18 2010-05-27 Novozymes, Inc. Methods and compositions for degrading cellulosic material
CN102300986A (zh) 2008-12-04 2011-12-28 诺维信股份有限公司 具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
US8338121B2 (en) * 2008-12-19 2012-12-25 Novozymes, Inc. Methods for determining cellulolytic enhancing activity of a polypeptide
CN102325879A (zh) 2008-12-19 2012-01-18 诺维信股份有限公司 在纤维二糖脱氢酶存在下增加纤维素材料水解的方法
MX2011012585A (es) 2009-05-29 2011-12-14 Novozymes Inc Metodos para incrementar la degradacion o conversion de material celulosico.
DK2449092T3 (en) * 2009-06-30 2015-11-23 Novozymes As Process for the hydrolysis of biomass
EP2451957B1 (en) 2009-07-07 2017-11-15 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP3805348A3 (en) 2009-09-17 2021-07-14 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2011041397A1 (en) 2009-09-29 2011-04-07 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2011039319A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP2977382A3 (en) 2009-09-30 2016-05-11 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US8883456B2 (en) * 2010-03-30 2014-11-11 Novozymes North America, Inc. Processes of producing a fermentation product
CN107435058A (zh) * 2010-08-06 2017-12-05 诺维信公司 降解或水解多糖的方法
WO2012021396A1 (en) * 2010-08-12 2012-02-16 Novozymes, Inc. Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and an organic compound and uses thereof
US8236551B2 (en) 2010-11-02 2012-08-07 Codexis, Inc. Compositions and methods for production of fermentable sugars

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4178861A (en) * 1976-12-13 1979-12-18 Australian Paper Manufacturers Limited Method for the delignification of lignocellulosic material in an amine delignifying liquor containing a quinone or hydroquinone compound
WO2005074647A2 (en) * 2004-01-30 2005-08-18 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEX BERLIN ET AL.,: "Inhibition of cellulose,xylanase and β-glucosidase activities by softwood lignin preparations", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 *
H. B. KLINKE ET AL.: "Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
VALDEIR ARANTES ET AL.: "Access to cellulose limits the efficiency of enzymatic hydrolysis: the role of amorphogenesis", 《ARANTES AND SADDLER BIOTECHNOLOGY FOR BIOFUELS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20210317494A1 (en) 2021-10-14
US8846351B2 (en) 2014-09-30
EP2603594B1 (en) 2018-04-25
US20130157314A1 (en) 2013-06-20
CN103261429A (zh) 2013-08-21
US9353391B2 (en) 2016-05-31
US20130157317A1 (en) 2013-06-20
EP2603594A1 (en) 2013-06-19
EP2603598A1 (en) 2013-06-19
EP2603595A1 (en) 2013-06-19
EP2603597A1 (en) 2013-06-19
WO2012021410A1 (en) 2012-02-16
US20130183723A1 (en) 2013-07-18
US9057086B2 (en) 2015-06-16
US20130217077A1 (en) 2013-08-22
EP2603593A1 (en) 2013-06-19
CN103261429B (zh) 2021-04-09
WO2012021408A1 (en) 2012-02-16
EP2603598B1 (en) 2018-04-18
EP2603596B1 (en) 2020-10-07
WO2012021395A1 (en) 2012-02-16
BR112013002982A2 (pt) 2016-06-07
WO2012021401A1 (en) 2012-02-16
DK2603596T3 (da) 2020-10-26
US20130183722A1 (en) 2013-07-18
US20130164791A1 (en) 2013-06-27
WO2012021399A1 (en) 2012-02-16
WO2012021396A1 (en) 2012-02-16
US9663808B2 (en) 2017-05-30
EP2603599A1 (en) 2013-06-19
BR112013002979A2 (pt) 2016-06-07
MX2013001540A (es) 2013-04-24
WO2012021394A1 (en) 2012-02-16
US9404137B2 (en) 2016-08-02
US9273335B2 (en) 2016-03-01
WO2012021400A1 (en) 2012-02-16
MX2013001580A (es) 2013-08-08
US20130189747A1 (en) 2013-07-25
US9394555B2 (en) 2016-07-19
EP2603596A1 (en) 2013-06-19
US20150125909A1 (en) 2015-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9353391B2 (en) Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a nitrogen-containing compound and uses thereof
CN105886485B (zh) β-葡糖苷酶变体及其编码多核苷酸
CN103608461B (zh) 增加多肽的纤维素分解增强活性的方法
CN102459582B (zh) 用于增强纤维素材料降解或转化的方法
US10570431B2 (en) Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a heterocyclic compound and uses thereof
CN103282504A (zh) 用家族61多肽预处理纤维素材料的方法
CN102325889A (zh) 增加纤维素材料水解的方法
CN102325879A (zh) 在纤维二糖脱氢酶存在下增加纤维素材料水解的方法
CN103930555A (zh) 水解和发酵纤维素材料的方法
CN103562382A (zh) 用于降解或转化纤维素材料的方法
CN104204213A (zh) 用于降解或转化纤维素材料的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20130828

RJ01 Rejection of invention patent application after publication