KR20220122648A

KR20220122648A - 올리고펩티드, 이의 테스트 키트, 및 이의 의약 조성물

Info

Publication number: KR20220122648A
Application number: KR1020227022155A
Authority: KR
Inventors: 헝 시-치에; 우 한-청; 린 친-위; 치 이-쑤안
Original assignee: 차이나 메디칼 유니버시티
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2020-12-03
Publication date: 2022-09-02
Also published as: EP4069272A2; TWI783314B; CN115348967A; JP2023509581A; US20230026969A1; EP4069272A4; WO2021113440A3; TW202128730A; WO2021113440A2; JP7471688B2

Abstract

본 개시는 올리고펩티드에 관한 것이다. 올리고펩티드는 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3 또는 서열번호: 4의 전장 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 50% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 본 개시는 또한 올리고펩티드를 포함하는 테스트 키트 및 올리고펩티드를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.

Description

올리고펩티드, 이의 테스트 키트, 이의 의약 조성물 및 의약 조성물의 용도

본 출원은 2019년 12월 3일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/942,847에 대한 우선권을 주장하며, 그 출원은 본원에 참조로 포함된다.

EFS를 통해 제출된 서열 목록은 본원에 참조로 포함된다. EFS를 통해 제출된 서열 목록 텍스트 파일은 1,069 바이트 크기인, 2020년 11월 30일에 생성된 파일 "CP-4648-PCT_SequenceListing"을 함유한다.

기술분야

본 개시는 올리고펩티드, 의학적 테스트 키트 및 의약 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는 콜라겐 XII에 특이적인 올리고펩티드, 이의 테스트 키트 및 의약 조성물에 관한 것이다.

관절 연골은 자가 복구 능력이 없기 때문에, 골관절염(osteoarthritis, OA)의 발병률이 증가하고 있으며, 특히 60세 이상의 사람들의 경우 증가하고 있다. 항염증 약물을 사용한 약물치료, 윤활 보조제를 사용한 관절내 주사, 및 미세골절술(microfracture) 및 안면성형술(osaicplasty)을 포함한 수술은 OA 치료의 현재 방식으로 남아 있으며, 단지 증상을 완화할 뿐이다. OA에 대한 질환 변형제(disease modifying agent)는 없다. 자가 연골세포 이식을 이용하는 세포 기반 요법은 국소 관절 연골 결함을 치료하는 데에만 효과적이었다. 줄기 세포 또는 전구 세포의 이식은 이제 OA 및 골연골 결함, 특히 큰 병변의 치료에서 연골세포에 대한 대안으로서 부상하였다.

자기 재생 및 다능 분화 능력을 가진 중간엽 줄기 세포(MSC)는 중간엽 조직을 복구하기 위해 사용될 뿐만 아니라 연골과 뼈의 조직 엔지니어링에도 사용된다. MSC의 관절내 주사의 장기간 안전성은 무릎 0A가 있는 41명의 환자에서 입증되었다. 나아가, OA 치료를 위한 MSC 이식의 임상 효능 및 안전성은 11건의 적격 시험 및 582명의 무릎 OA 환자를 포함한 메타 분석으로 입증되었다.

무릎 OA의 치료를 위한 관절내 주사의 효능과 관련한 2년 후속 연구는 치료의 저- 및 중간 용량 그룹에서 임상 및 구조적 결과의 지속성에 관한 잠재적 우려를 드러냈고, 이것은 추가 연구에 대한 필요성을 시사한다. 비히클로서 히알루론산(HA)을 사용한 MSC의 관절내 주사는 전방 십자 인대(ACL) 횡절단에 의해 유도된 OA의 치료를 위한 HA 단독 주사보다 우수한 효과를 나타냈다. 이 연구 및 다른 연구는 활막(synovium), 반월상 연골(meniscus), 및 인대 조직(ligamentous tissue)에 대한 MSC의 비특이적 결합이 손상된 관절 연골로의 세포의 국소 전달을 향상시키는 방법의 개발의 중요성을 강조하였음을 드러냈다. 그러나, 이것에 초점을 맞춘 연구는, 있다 해도, 거의 없다. 관절 연골 복구를 위해 자기로 표지화된(magnetically labeled) MSC가 적용되었다. 비록 자기 입자로 표지화된 MSC가 연골 분화의 악화를 나타내지 않지만, 조직에 의한 철의 흡수에 대한 우려가 있다.

현재 연구에서, 본 발명자들은 인간 OA 표본을 사용하여 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리의 바이오 패닝(bio-panning)을 통해 OA-표적화 펩티드를 확인하였다. OA-표적화 펩티드를 효소-유도된 OA 래트 모델 및 ACL-횡절단 OA 돼지 모델에서, 진단제, 윤활 보조제, 및 MSC의 관절 표면로의 전달에서의 적용에 대해 추가로 조사하였다.

본 개시의 일 측면에 따르면, 올리고펩티드는 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3 또는 서열번호: 4의 전장 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 50% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.

본 개시의 다른 측면에 따르면, 테스트 키트는 전술된 측면의 올리고펩티드를 포함한다.

본 개시의 또 다른 측면에 따르면, 의약 조성물은 전술된 측면의 올리고펩티드 및 올리고펩티드에 결합하는 치료 분자 또는 줄기 세포를 포함한다.

본 개시의 추가의 또 다른 측면에 따르면, 전술된 측면의 의약 조성물은 골관절염의 치료에 사용하기 위한 것이다.

본 개시는 다음과 같이 첨부되는 도면을 참조로, 다음의 구현예의 상세한 설명을 읽음으로써 보다 완전하게 이해될 수 있다:
도 1은 생체내 영상(intravital imaging)이 C5-24 펩티드의 OA 연골에 대한 결합 능력을 입증하는 결과를 나타낸다.
도 2는 초기 OA 진단에서 C5-24 펩티드의 적용 결과를 나타낸다.
도 3은 관절 윤활(joint lubrication)에서 C5-24 펩티드의 적용 결과를 나타낸다.
도 4는 OA 재생 의학(regenerative medicine)에서 C5-24 펩티드의 적용 결과를 나타낸다.
도 5는 MRI 분석 및 MSC 추적을 위한 프러시안 블루 염색의 결과를 나타낸다.
도 6은 C5-24 펩티드의 결합 단백질의 확인 결과를 나타낸다.

본 개시는 과도한 해석 및 과도한 실험 없이 기술 분야에 숙련된 사람에 의해 본 개시가 완전하게 활용되고 실시되는 것을 용이하게 하기 위하여 다음의 특정 구현예에 의해 한층 더 예시화될 것이다. 그러나, 이들 실제적인 세부사항은 본 개시의 물질 및 방법을 실행하는 방법을 기술하기 위해 사용되며 반드시 필요한 것은 아니다.

I. 결과

<OA-표적화 펩티드의 확인>

파지 디스플레이 펩티드 라이브러리를 사용하여, 본 발명자들은 무릎 관절을 전체적으로 교체한 환자들로부터의 무릎 관절의 연골하골(subchondral bone)로부터 절단된 OA 관절 연골을 조사하였다. OA 연골 표본을 균질화하여 조직 용해물을 얻거나 5 mm x 5 mm 크기의 사각형 조직으로 절단하였다. 조직 용해물 및 조직 조각에 대해 결합하는 파지 디스플레이 펩티드(바이오 패닝)의 5회기의 선택을 통해, 결합된 파지의 역가는 각각 388배, 및 864배로 상당히 증가되었다. 제5 회기의 바이오 패닝으로부터 수집된 파지 클론에 추가로 ELISA 스크리닝이 적용되었고, 조직 용해물 또는 조각에 대해 고친화도를 가진 클론이 선택되었고, 서열분석되었으며, 정렬되었다. 마지막으로, 본 발명자들은 뚜렷한 공통 모티프를 공유하는 표적화 파지의 5개 그룹을 확인하였다. 선택된 파지 클론의 결합 능력은 면역세포형광 염색에 의해 인간 연골 세포주, hPi-GL10에서 검증되었다. M13-PE(형광 염료에 콘쥬게이션된 항체)로 표지화된 확인된 모든 파지 클론은 용량 의존 방식으로 hPi-GL에 결합되었다. 특히, C5-24 및 C5-91 펩티드는 hPi-GL에서 특이적이고 현저한 결합 시나리오를 나타냈다. 다른 연조직, 예컨대 활막 및 반월상 연골보다 OA 연골에 특이적으로 결합하는 파지 클론을 조사하기 위하여, 인간 OA 조직 섹션을 양고추냉이 과산화효소(HRP)-표지된 파지 클론을 이용하여 면역염색한 후, 침착된 3,3-다이아미노벤지딘(DAB) 강도의 반정량화가 이어졌다(- 내지 +++). 특히, C5-24(서열번호: 1의 아미노산 서열로 제시됨) 및 C5-91(서열번호: 2의 아미노산 서열로 제시됨) 펩티드는 연골에 대한 우수한 결합 활성을 나타냈지만, 반월상 연골 및 활막에 대한 결합 활성은 나타내지 않았다. 더욱이, C5-24 펩티드는 OA 연골의 점유 영역(territorial region)을 표적화하는 최상의 특이성을 나타냈고 후속 연구를 위해 선택되었다.

C5-24 펩티드의 OA-특이적 표적화 활성을 입증하기 위하여, 형광 및 2차 고조파 발생(second harmonic generation, SHG) 신호의 2-12 광자 현미경 관찰을 위한 래트 모델에서 로다민-표지된 C5-24 펩티드 및 스크램블 펩티드(scrambled peptides)가 별도로 OA 관절에 주사되었다. 스크램블 펩티드는 원래의 펩티드와 동일한 아미노산을 모두 함유하지만, 새로운 무작위 순서로 함유한다. 연골의 표면-렌더링된 3D 재구성 이미지 및 횡단 합성물 이미지(transversal composite images)는 C5-24 펩티드가 주사된 대조군 연골, 스크램블 펩티드가 주사된 대조군 연골, 및 스크램블 펩티드가 주사된 OA 연골에 무작위로 존재하는 드문 적색 점을 나타냈다. 역으로, 적색 점은 C5-24 펩티드가 주사된 OA 연골에서 관찰되었다. SHG로 타입 II 콜라겐을 조사했을 때, 적색 점은 OA 연골의 점유 영역에 상응하는, SHG 신호가 없는 영역에서 국지화되었다(도 1a). z-축 평면으로부터, C5-24 펩티드가 OA 연골에서 적어도 50 μm 깊이에 도달한 것으로 측정된다(도 1a). 더불어, 모든 슬라이스에서 전체 형광 펩티드 결합 영역(도 1b) 및 결합 강도(도 1c)가 추가로 계산되었고, OA와 대조군 연골 사이에서 C5-24 펩티드 표적화에 상당한 차이를 보여주었다. 이들 데이터는 OA 연골의 점유 영역을 표적화하기 위한 C5-24 펩티드의 차별화된 인식 능력(recognition capability) 및 특이성을 입증한다.

<초기 OA 진단에서의 적용>

OA의 초기 진단을 위한 다양한 진단제에서 OA-표적화 펩티드의 적용 가능성을 입증하기 위하여, C5-24 및 스크램블 펩티드가 초상자성 산화철(superparamagnetic iron oxide, SPIO)과 콘쥬게이션되었다(도 2a). 푸리에 변환 적외선 분광법(Fourier-transform infrared spectroscopy, FTIR)은 증가된 N-H 밴드/C-O 구간 비율을 나타냈고, 이것은 효소 분해(enzyme digestion)에 의해 확립된 래트 모델의 OA 관절로 관절내 주사된 C5-24 및 스크램블 펩티드로의 SPIO의 성공적인 설치를 나타낸다(도 2b). 펩티드 콘쥬게이션된 SPIO 주사가 없는 OA 무릎 관절의 자기 공명 이미징(Magnetic resonance imaging, MRI)은 모의(sham) 대조군 무릎 관절과 비교하여 차이를 보이지 않았고, 이것은 관절 연골이 중증으로 벗겨지지 않았을 때인 초기 OA 진단에 대한 MRI의 문제점을 나타낸다. 유사하게, OA 연골에 결합하지 않은 스크램블 펩티드 콘쥬게이션된 SPIO, 및 MRI 신호 감소 또한 모의 대조군으로부터 초기 OA를 구별하지 못하였다. 역으로, C5-24 펩티드 콘쥬게이션된 SPIO는 OA 연골에 결합하여 OA 연골에서 MRI 신호 감소를 유발하였지만 건강한 연골에서는 그렇지 않았다(도 2c). 임상 환경(clinical setting)에 한 발짝 더 가까이 가기 위하여, 초기 OA 진단에 대한 C5-24 펩티드 콘쥬게이션된 SPIO의 실현 가능성이 Lanyu 미니피그에서 ACL-절단에 의해 확립된 큰 동물 OA 모델에서 추가로 확인되었다. ACL-절단 후 2개월 후, C5-24 펩티드 콘쥬게이션된 SPIO을 받았거나 받지 않은 모의 대조군 무릎 관절 또는 C5-24 펩티드 콘쥬게이션된 SPIO을 받지 않은 OA 무릎 관절은 T1- 및 T2-편중 MR 이미지(weighted MR images)에 차이를 보이지 않았고(도 2d), 이것은 초기 OA 진단에 MRI를 사용하는 데 어려움이 있음을 나타낸다. 그러나, C5-24 펩티드 콘쥬게이션된 SPIO를 받은 OA 무릎은 T1- 및 T2-편중 MR 이미지에서 증강된 신호 감소를 보였고, 이것은 초기 OA 진단에 대한 C5-24 펩티드 콘쥬게이션된 SPIO의 민감성을 입증한다. 함께 고려하면, 이들 데이터는 영상 조영제, 예컨대 SPIO가 C5-24 펩티드와 콘쥬게이션되었을 때, MR 영상 시스템과 함께 초기 OA 진단에 적용될 수 있음을 시사한다.

<관절 윤활에서의 적용>

윤활을 위해 OA 연골로 HA를 전달하는 C5-24 펩티드의 잠재력을 조사하기 위하여, C5-24 펩티드 또는 스크램블 펩티드를 HA로 콘쥬게이션하고, 본원에서 각각 C5-24-HA 및 스크램블-HA로 언급하였다(도 3a). HA-MA의 메타크릴화가 1 H 광자-NMR(핵 자기 공명)에 의해 약 28.1%인 것으로 측정되었고, 그것을 후속 C5-24 펩티드(도 3b) 및 스크램블 펩티드 콘쥬게이션에 대한 중간 생성물로서 사용하였다. 정적마찰계수(static friction coefficient)(μs) 및 운동마찰계수(kinetic friction coefficient)(μk)을 포함한 유변학적 윤활 특성(rheological lubrication properties)이 이전 보고서로부터 변형된 회전 테스트 프로토콜(rotational test protocol)을 사용하여 평가되었고, 비변형 HA(non-modified HA), 스크램블-HA, 또는 C5-24-HA로 처리된 쌍을 이룬 인간 OA 연골 실린더 디스크(13명의 개인으로부터 수집됨) 중에서 비교되었다. 비변형 HA, 스크램블-HA, 및 C5-24-HA에 대한 총 마찰 계수는, 1.2s 완화 시나리오(1.2s relaxation scenario)에서는: 각각 μs에서 0.065, 0.073, 및 0.044 및 μk에서 0.045, 0.052, 및 0.034였고, 비변형 HA와 비교하여 C5-24-HA에서 32.3% 및 24.4% 감소되었으며; 120s 완화 시나리오에서는: 각각 μs에서 0.072, 0.075, 및 0.043 및 μk에서 0.045, 0.052, 및 0.033이었고, 비변형 HA와 비교하여 C5-24-HA에서 40.3% 및 26.7% 감소되었으며; 120s 완화 시나리오에서는: 각각 μs에서 0.077, 0.079, 및 0.044 및 μk에서 0.048, 0.055, 및 0.034였고, 비변형 HA와 비교하여 C5-24-HA에서 42.9% 및 29.2% 감소되었으며; 1200s 완화 시나리오에서는: 각각 μs에서 0.094, 0.102, 및 0.066 및 μk에서 0.060, 0.067, 및 0.042였고, 비변형 HA와 비교하여 C5-24-HA에서 29.8% 및 30% 감소되었다(도 3c). 간단히 설명하면, C5-24-HA는 모든 완화 단계에서 비변형 HA 및 스크램블-HA와 비교하여 통계적으로 상당히 우수한 정적 및 운동 마찰 특징을 보였고, 이것은 우수한 윤활을 입증한다. 더욱이, C5-24-HA는 유변학적 사전 조건 단계 및 토크 측정에서 비변형 HA 및 스크램블-HA보다 더 나은 윤활을 나타냈다. 대표적인 개별 환자 데이터는 보충 정보에 배치되어, 사전 조건화 단계에서 3600s 완화 시간에서 연골 디스크 높이가 점차적으로 손실되는 동일한 시나리오를 보여주었지만, 완화 기간의 이어지는 4개 단계에서 일관된 연골 디스크 높이로 복귀하였고, 그것은 마찰 측정에 영향을 미치는 인자를 감소시켰다. 또한, 이들 데이터는 OA에 대한 신규하고 효과적인 관절 윤활제의 개발에서 C5-24 펩티드의 적용 가능성을 시사한다.

C5-24-HA는 MSC 세포 표면 상에서 광범위하게 발현되는 HA 수용체인 CD33에 결합하고, MSC를 OA 연골 표면에 전달함으로써 MSC 재생 의학에 적용될 수 있다. 더욱이, HA의 연골발생 활성은 이전에 입증된 것과 같이 MSC 연골발생을 유도할 가능성이 있다. 이것을 입증하기 위하여, 후속 추적을 위해 래트 MSC에 SPIO가 공급되고 형광 콘쥬게이션된 C5-24-HA 또는 스크램블-HA와 함께 인큐베이션되었다(도 4a). 형광 현미경 관찰은 MSC가 녹색 형광에 의해 밀접하게 둘러싸여 있는 것을 입증하였다(도 4b, 흑백 스키마로 도시됨). 나아가, C5-24-HA 또는 스크램블-HA와의 인큐베이션 후에, MSC는 즉시 래트 모델의 OA 관절에 주사되고, 관절에 이식 후 8주 후에 조직학적 검사가 수행되었다. 조직형태측정 분석(Histomorphometric analysis)은 모의 대조군 그룹과 OA 그룹을 비교했을 때 OA의 성공적인 유도를 나타냈다(도 4c, 4d). 더욱이, C5-24-HA에 의해 전달된 MSC를 받은 무릎 관절은 분명한 연골 재생 및 사프라닌-O 염색을 보인 반면(도 4c), 스크램블-HA에 의해 전달된 MSC를 받은 것은 여전히 중증의 OA를 나타냈고, 이것은 사프라닌-O 염색의 손실과 함께 연골 표면 상에 다수의 균열을 보여준다. 변형된 Mankin 점수에 의한 OA 정도의 정량화는 또한 전자가 후자보다 OA의 더 나은 개선을 가졌음을 나타냈다(도 4d). OA 관절에 이식된 SPIO 공급 MSC의 세포 추적을 위해, 래트에 이식 후 3일 후에 MRI 스캐닝(도 5a) 및 프러시안 블루 염색(도 5b)이 수행되었고, C5-24-HA 보조 그룹(C5-24-HAassisted group)에서 OA 연골로의 MSC의 특이적 호우밍(homing)이 나타났지만, 스크램블-HA 보조 그룹(scrambled-HA-assisted group)에서는 그렇지 않았다. 이들 데이터는 MSC 재생 의학을 증강시키는 데 C5-24-HA의 적용 가능성을 시사한다.

<결합 단백질의 확인>

C5-24 펩티드에 결합하는 인간 OA 연골 조직으로부터 유래된 추정되는 표적 단백질을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 화학적 교차-링커(cross linker)인 3,3'-다이티오비스(설포석신이미딜프로피오네이트)(DTSSP)와 조합된 비오티닐화된 C5-24 펩티드, 및 후속해서 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 텐덤 질량분석과 함께 액체 크로마토그래피(LC-MS/MS)를 이용하여 결합 표적을 확인하였다(도 6a). 은 염색은 여러 예리한 밴드, 예컨대 공동면역침전된 단백질(coimmunoprecipitated proteins) COIP-1, COIP-3, 및 COIP-5를 드러냈고(도 6b), 그것들은 별도로 수집되고, 트립신으로 분해되고, LC-MS/MS에 의해 분석되었다. 단편은 MASCOT 및 TurboSequest 검색 엔진을 사용하는 알고리즘을 통해 스위스 단백질 데이터베이스(Swiss Protein Database)를 검색함으로써 확인되었다. 본 발명자들은 확률 점수(probability score)로 콜라겐 알파-1(XII) 및 콜라겐 알파-3(VI) 단편을 포함한, 여러 후보 단백질을 발견하였고, 그것은 그 펩티드가 다른 대부분의 확인된 펩티드보다 높은, 각각 최대 850 및 372의 단백질에 속할 가능성을 나타낸다. 이들 단백질 단편을 C5-24 펩티드의 표적 단백질로서 추가로 확인하기 위하여, 본 발명자들은 표적 단백질과 비오티닐화된 C5-24 펩티드 사이의 상호 결합 활성을 ELISA를 이용하여 조사하였다. 본 발명자들은 처음에 ELISA 플레이트를 특정 콜라겐 농도로 사전 코팅하여 펩티드 결합에 대한 최적의 콜라겐 농도를 확인하였고(도 6c), 후속적으로 콜라겐 알파-1(XII)을 3.3 μg/mL로 사용하여 펩티드 결합을 조사하였다(도 6d). 본 발명자들은 비오틴-C5-24 펩티드가 콜라겐 알파-1(XII) 및 콜라겐 알파-3(VI) 단편에 결합하였지만, 비오틴-스크램블 펩티드는 그렇지 않은 것을 발견하였다. 그러나, 상호 용량 의존성 결합은 콜라겐 알파-1(XII)과 비오틴-C5-24 펩티드 사이에서만 관찰되었다(도 6c, 6d). 더불어, 비오틴-C5-24 펩티드 및 비오틴-스크램블 펩티드의 소 혈청 알부민(BSA)에 대한 결합에서는 차이가 없었다. 또한, 이들 데이터는 콜라겐 알파-1(XII)이 C5-24 펩티드의 표적 단백질인 것을 시사한다.

단백질-펩티드 복합체(protein-peptide complex)의 구조를 예측하기 위하여, 단백질-펩티드 도킹이 상동성 모델링 및 서열 2 유사성에 대한 검색을 토대로 한, 인간 콜라겐 XII를 표적화하는 믿을 수 있는 여러 구조적 모델의 확립을 통해 접근되었다. 이들 구조적 모델은 후속해서 가장 유망한 펩티드 사슬이고 본 발명자들의 연구에서 추후 실험을 위해 선택될 수 있는 C5-24 및 C5-91 펩티드 사슬이 있는 가능한 분자 도킹 포즈(docking pose)를 계산하기 위해 적용되었다. 단백질-펩티드 도킹 모델은 표적 단백질과의 펩티드 사슬 결합 후에, 주로 최저 Gibbs 자유 에너지 및 화학적 열역학에 따르는 알고리즘을 토대로 하였다. 본 발명자들의 데이터는 C5-24 및 C5-91 펩티드 사슬이 모두 각각 포즈 125 및 포즈 68로 L1385 - S2285의 영역에서 콜라겐 XII의 포켓 부위로 표적화되었고, 포즈 34 및 42로 S2506 - P2724의 C-말단으로 표적화된 것을 보였으며, 이것들은 C5-24 및 C5-91에 대한 동일한 도킹 부위를 최고 포즈 빈도로 공유한다(도 6e). 나아가, 이들 예측된 포즈는 펩티드 사슬과 콜라겐 XII 사이의 주요 도킹 친화도를 지배할 수 있는 중요한 공통 결합 모티프인 WXPXW를 공유한다. 더불어, 인간, 돼지, 토끼, 래트, 및 마우스 사이에서 콜라겐 XII의 서열 상동성은 90.3% 유사성 및 83.7% 동일성에 도달하였고, 계통발생학적 분석은 이들 5가지 종 사이의 콜라겐 XII의 높은 유전적 상관관계를 드러냈다. C5-24 펩티드는 설치류, 토끼, 및 돼지 OA 모델 조사에서 매우 신뢰할만하였다. 더욱이, 표 1에서의 공통 도메인에 따르면, 동일한 그룹의 펩티드 서열은 중요하고 동일한 모티프, 예컨대 각각 그룹 1과 3에서 FVEW 및 DTH를 공유하였다.

마지막으로, 본 발명자들은 OA 관절 연골에서 콜라겐 XII의 배타적인 발현을 입증하였다. 콜라겐 XII의 발현은 래트 OA 연골에서만 관찰되었고, 정상적인 관절 연골에서는 관찰되지 않았다. 더불어, 콜라겐 XII의 발현은 인간 OA 연골에서만 관찰되었지만, 비-OA 연골에서는 그렇지 않았다. C5-24 펩티드가 결합하는 영역과 일치되게(도 1a), 콜라겐 XII는 주로 클러스터링된 연골세포의 점유 영역에서 발현된다. 이들 데이터는 또한 161명의 OA 환자 및 29명의 비-OA 환자를 포함한 집단 연구(cohort study)에 의해 지지된다. 예비 분석은 비-OA 연골에 비해 조합된 OA 엉덩이 및 OA 무릎 연골에서 COL12A1 mRNA 수준의 상당한 증가를 나타냈다.

<질환 변형 OA 약물(disease-modifying OA drugs, DMOAD)에서의 적용>

현재 승인된 DMOAD 약물은 없다. 그러므로 OA는 기저 병태생리학을 변형시키고 장기간, 임상적으로 관련된 이점으로 해석되는 치료법에 대한 충족되지 않은 의학적 요구가 있는 심각한 질환일 수 있다. 현재, 연골 재생을 표적화하는 섬유모세포 성장 인자-18(스프리퍼민(Sprifermin)), 및 코어 결합 인자 베타(core binding factor beta, CBFβ)의 분해 및 핵 내재화를 촉진하며 계단식 연골형성을 자극하는 카르토게닌(Kartogenin)을 포함한, 2상 또는 3상 또는 전임상 단계에 있는 여러 약물이 있다. 이들 개발중인 DMOAD는 모두 OA 조직으로의 전달을 가속화하기 위해 본 연구에서 개발된 OA-표적화된 펩티드에 의해 추가로 보조될 수 있다. 그 외에도, 이들 약물의 대부분은 전신성 약물요법과는 반대로 투여의 관절내 경로에 초점이 맞춰져 있으며, 약물의 국소 생체이용률을 향상시키고 종래의 장벽을 우회하며, 전신성 독성을 최소화하고 표적외 효과를 감소시킴에 의해 안전성 프로파일을 향상시키는 것을 목적으로 한다. 그러나, 국소 관절내 투여로부터의 표시된 위약 효과가 효능의 평가를 더 어렵게 만드는 것을 인식하는 것이 중요하다. 치료제를 OA 부위에 전달하기 위해 적용된 기술의 정확성의 개선, 예컨대 본 연구에서 발견된 펩티드는 OA에 대한 효과적인 치료법의 성공적인 개발로 이어질 수 있다. 미래의 노력은 DMOAD의 개발을 향상시키기 위하여 OA-표적화 펩티드가 장착된 정교한 담체로 질환 변형 약물을 전달하는 데 향해져야 한다.

본 발명자들은 활액 조직(synovial tissues), 반월상 연골, 및 인대를 포함한 다른 관절의 연 조직에 대한 어떠한 유의미한 표적화 없이 OA 관절에 선택적으로 귀소하는 여러 파지-암호화된 펩티드 모티프(WXPXW 및 DTH)를 확인하였다. 더욱이, 본 발명자들은 OA 관절에서 연골세포의 점유 영역에 특이적으로 결합하는 C5-24 및 C5-91 펩티드를 확인하였다. C5-24는 OA 진단 및 윤활 목적에 대해 각각 SPIO 및 HA에 성공적으로 콘쥬게이션되었다. 비록 C5-91 펩티드가 OA 관절의 관절 표면으로 진단제 또는 윤활제를 전달하는 것으로 확인되진 않았지만, C5-91 펩티드는 그것이 C5-24 펩티드와 동일한 크기를 가지고 동일한 모티프를 공유하기 때문에 동일한 기능을 가질 것으로 여겨졌다.

비록 콜라겐 II가 관절 연골의 모든 단백질의 85-90%를 구성하는 유리질 연골(hyaline cartilage)의 기초이긴 하지만, 노화 또는 OA는 관절 표면의 연골세포(점유 영역) 주변에서 시작하여 점진적인 퇴행과 함께 전체 연골로 확장되는 손상으로 이어진다. 콜라겐 II가 OA에서 특이적으로 발현되지 않는 것을 감안하면, 콜라겐 II-표적화 펩티드는 AO 진단, 치료, 윤활, 및 재생 의학에 적용될 수 없다. 대조적으로, 결합 모티프 WXPXW를 공유하는 OA-표적화 펩티드는 선택적으로 점유 영역으로 귀소하고 본 연구에서 입증되는 바 OA 연골에서 독점적으로 발현되는 콜라겐 XII에 결합하는 것으로 실험적으로 및 인실리코로 입증되었다. 항체를 사용한 면역형광 연구는 콜라겐 XII가 힘줄, 인대, 연골막, 및 배아 조직의 골막과 같은 콜라겐 I 함유 조밀한 결합 조직 구조에 국지화되는 것을 입증하였고, 관절의 관절 퇴행 및 재생 중에 그것의 출현을 시사한다(타입 XII 콜라겐은 또한 각막, 추간판 및 기관의 조직에서 발현됨). OA 재생에서 콜라겐 XII의 역할을 명확하게 하기 위해 추가 연구가 필요하다. 결론적으로, 본 발명자들은 OA 윤활, 진단, 치료, 및 재생 의학의 개선을 위해 콜라겐 XII를 표적화하는 신규한 전달 플랫폼을 개발하였다.

비록 콜라겐 XII에 결합하는 펩티드가 OA의 진단, 윤활 및 재생 의학을 위해 개발되었지만, 그것은 다른 질환, 예컨대 중증의 안구 건조증에서 발생할 수 있는 각막 궤양 및 천공, 유리질 연골, 예컨대 추간판 및 기관 연골을 함유한 다른 조직과 관련된 손상 또는 퇴행성 질환에 대해서 적합할 수 있다. 예를 들어, 보우만 각막층(Bowman's layer of cornea)에서 발현된 콜라겐 XII는 각막 궤양 및 흉터 형성 중에 과다발현되고, 따라서 기능화된 콜라겐 XII 표적화 펩티드가 각막 궤양의 치료를 위해 윤활제, 항염증 약물 및 줄기 세포의 전달을 도울 수 있다. 결론적으로, 본 발명자들은 OA 윤활, 진단, 치료, 및 재생 의학의 개선을 위해 콜라겐 XII를 표적화하는 신규한 전달 플랫폼을 개발하였다. 플랫폼은 또한 다른 질환, 예컨대 눈 궤양 및 유리질 연골을 함유한 다른 조직과 관련된 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

<재료 및 방법>

본 출원의 전술된 구현예는 다음의 방법 및 재료를 토대로 수행되며, 그것의 상세한 설명이 다음과 같이 기술된다.

<바이오 패닝 및 ELISA 스크리닝을 위한 연골 표본의 제조>

환자 사이의 개별적인 차이로부터의 간섭을 피하기 위하여, 본 발명자들은 파지 디스플레이 실험에서 5회기의 바이오 패닝을 위해 동일한 OA 환자로부터의 외과적 관절 연골 표본을 사용하였다. 5회기의 바이오 패닝을 위해 사용된 연골의 입자 크기 조성은 일관된 것을 보장하기 위하여 다음의 과정이 사용되었다. 3.2 g의 무게인 인간 외과적 OA 표본을 2 부피의 인산염 완충 식염수(PBS)에 첨가하고 균질화하였다. 연골 균질물을 800 x g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 침전물을 "큰 입자 연골 샘플(C1)"로서 수집하였다. 상층액을 새로운 원심분리 튜브에 첨가한 후, 1,500 x g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 펠릿을 "중간 입자를 가진 연골 샘플(C2)"로서 수집하였다. 상층액을 다시 2,000 x g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리한 후, 침전물을 "작은 입자 연골 샘플(C3)"로서 수집하였다. 이때 상층액을 "연골 조직 조각(cartilage tissue pieces)"에 대해 수행된 바이오 패닝과 상이한 또 다른 5회기의 바이오 패닝을 위해 별도로 "연골 조직 용해물(cartilage tissue lysate)"로서 수집하였다. "연골 조직 용해물" 바이오 패닝을 위해, C1, C2, 및 C3의 무게를 측정하고 5개의 동등한 부분으로 각각 부분표본화하였다. 각각의 회기의 바이오 패닝은 5회기에 대해 C1, C2, 및 C3의 부분표본의 혼합물을 사용하였다.

"연골 조직 조각" 바이오 패닝에 대해, 연골 표본을 또한 사각형 조각(5 x 5 mm 크기)으로 절단하고 연골세포 결합 스크리닝을 위해 웰당 한 조각으로, 네일 폴리시(nail polish)로 96-웰 ELISA 플레이트에 부착시켰다.

"연골 조직 용해물" 바이오 패닝을 위해, 조직 용해물 상층액을 코팅 완충액[0.1 M NaHC03, pH 8.6]으로 10배 희석하고 사용 전에 새로운 10 cm 페트리 접시에 바이오 패닝을 위해(그리고 스크리닝을 위해 96-웰 ELISA 플레이트에) 4℃에서 24시간 동안 코팅하였다. 조직 용해물 코팅된 플레이트를 PBS 중의 1% BSA로 4℃에서 밤새 차단하고, 10 pfu의 Ph.D.-12TM 파지(New England BioLabs, Ipswich, MA, USA) 디스플레이 펩티드 라이브러리를 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 결합된 파지를 1 ml의 로그 단계(log-phase) ER2738 배양물로 37℃에서 20분 동안 100 rpm으로 흔들어주면서 용출하였다. 이 용출된 파지 풀(pool)을 증폭시키고 ER2738 밤샘 배양물로 적정하였다. 회수된 파지를 다음 회기의 패닝에 대한 투입물(input)로 사용하였고, 총 130개의 파지 클론을 ELISA 스크리닝을 위해 배양될 바이오 패닝의 제5 회기로부터 무작위로 선택하였다.

처리된 연골 표본을 각 회기의 "연골 조직 조각" 바이오 패닝을 위하여 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA)로 4℃에서 1시간 동안 차단하였다. 초기에 10개의 플라크 형성 단위(pfu)를 함유한 Ph.D.-12TM(New England BioLabs, Ipswich, MA, USA) 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리를 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 결합된 파지를 1 ml의 로그 단계 대장균 ER2738 배양물(New England BioLabs)로 37℃에서 30분 동안 100 rpm으로 흔들어주면서 용출하였다. 이 용출된 파지 모음을 증폭시키고 ER2738 밤샘 배양물로 적정하였다. 회수된 파지를 다음 회기의 패닝에 대한 투입물로서 사용하였고, 총 95개의 파지 클론을 ELISA 스크리닝을 위해 배양될 바이오 패닝의 제5 회기로부터 무작위로 선택하였다.

선택된 파지 클론의 연골 조직 용해물 및 연골 조직 조각에 대한 결합 활성을 ELISA에 의해 조사하였다. 최고 결합 친화도(연골 조직 용해물의 경우 >0.15의 A490 값 및 연골 조직 조각의 경우 >2.0의 A490 값)를 가진 파지 클론을 선택하고 서열분석하였다. 본 발명자들은 아미노산 서열 정렬에 의해 상이한 공통 모티프를 가진 5개의 구별되는 그룹을 확인하였다(표 1에 제시됨).

<hPi-GL 연골세포 세포주의 면역형광을 이용하는 OA 연골을 표적화하는 펩티드의 검증>

이들 파지 클론의 조사를 위해, 슬라이드 배양된 hPi-GL 세포를 실온에서 15분 동안 PBS 중의 4% 파라포름알데하이드로 고정하고, PBS로 세척하고 실온에서 30분 동안 0.1% Triton X-100으로 투과화하고, 비특이적 결합에 대해 1% BSA/PBST로 차단하였다. 슬라이드 배양된 hPi-GL 세포를 4 x 108 pfu, 8 x 108 pfu, 및 109 pfu의 선택된 파지 클론과 함께 별도로 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 미결합 파지를 세척에 의해 제거한 후, 세포를 일차 항체로서 항-M13 마우스 mAb(GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) 및 이차 항체로서 R-파이코에리트린-아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch Inc.)와 함께 각각 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 후, PBST로 세척하고, Hoechst 33258(1 μg/ml; Sigma-Aldrich)로 실온에서 10분 동안 대조염색하였다. 세포를 파지 결합 및 국지화에 대해 공초점 현미경검사(Zeiss LSM 700)를 사용하는 형광에 의해 분석하였다.

<활막 및 반월상 연골이 아닌 OA 연골을 표적화하는 펩티드의 선택>

관절 조직에 결합된 파지를 표적화하는 국지화를 조사하기 위하여, 인간 OA 연골 표본을 조사에 사용하였다. 파라핀-내장된 인간 OA 조직, 활막, 및 반월상 연골 섹션을 중국 의과대학 병원 기관 심사 위원회의 승인(IRB no. CMUH108-REC1-046 및 T-CMU-23728) 하에 인간 OA 외과적 처리의 표본으로부터 회수하였다. 서면 동의서를 얻었고, 모든 인간 조직 샘플을 익명성을 위해 코딩하였다. 모든 섹션을 표준 프로토콜에 의해 건조시키고, 파라핀을 제거하고 재수화하고, 후속해서 C5-87, C5-66, C5-83, C5-91, C5-24, E5-8, 및 C5-46 파지 클론, 또는 대조군 파지 (5 x 108 pfu/μl)와 인큐베이션하였다. 세척 후, 섹션을 항-M13 마우스 mAb(GE Healthcare)로 1시간 동안 실온에서 처리하였다. 여러 번의 세척 단계 후에, 비오틴-프리 초민감성 중합체-HRP 검출 시스템(Biogenex, Fremont, CA, USA)을 사용하여 면역반응성을 검출하였다. 슬라이드를 헤마톡실린으로 가볍게 대조염색하고, Aquatex(Merck, Darmstadt, Germany)에 장착하고, 광현미경으로 조사하였다. 활막 또는 반월상 연골이 아닌 연골세포에 영구적인 결합을 나타낸 파지 클론 상에 나타난 펩티드 서열을 선택하여 후속 연구를 위해 합성하였다.

<래트 OA 모델 확립>

래트 모델에서 OA는 약간 변형시켜서 이전에 기술된 것과 같이 확립되었다. 간단히 설명하면, 체중이 약 300 그램인 수컷 SD 래트를 이 연구에 사용하였다. 모든 동물 실험은 중국 의과대학 동물 사용 및 관리 위원회의 승인을 받았다. 래트를 표준 실험실 조건(온도 24℃, 12시간 명암 사이클) 하에 유지하였고, 표준 식단을 공급하고 수돗물을 마시게 하였다. 래트를 매 주사 전에 70 ml/분 유량으로 2.5% 아이소플루오란(Abott, USA)으로 마취하였다. 래트 관절 OA를 각 그룹에서 우측 무릎에서 활성자로서 0.1 ml의 0.03 M 시스테인(Sigma-Aldrich, USA)과 함께 0.2 ml의 4% 파파인 용액(Sigma-Aldrich, USA)을 주사함으로써 유도하였다. 동일한 양의 식염수를 각 그룹에서 좌측 무릎에 주사하였다. 주사는 각각 제4일 및 제7일에 반복하였고, 마지막 파파인 주사 후 2주 후에 조직학적 분석을 위해 래트 무릎을 제거하여 OA의 형성을 확인하였다. 래트에서 확립된 OA 모델을 추가로 관절내 주사를 위한 다음 실험에 사용하였다.

<로다민 표지화된 C5-24 펩티드의 제조 및 2-광자 현미경 관찰>

C5-24 펩티드의 OA 특이적 표적화 활성을 입증하기 위하여, OA 연골에 결합할 수 없는 DYLWQYPDITWH 펩티드를 스크램블 펩티드로서 사용하였다. 로다민 표지화된 C5-24 및 스크램블 펩티드를 효소 유도된 OA가 없거나(대조군) 있는 래트 관절에 별도로 주사하였다. C5-24 및 스크램블 펩티드를 따라서 화학적으로 합성하고(ABI, USA), 클릭 반응을 통해 HEPES 완충액 pH 8.0 중의 비오틴-PEG2-요오도아세틸 가교 링커(Thermo Fisher Scientific, USA)로 변형시키고, 추가로 아비딘 표지화된 로다민(Jacksonlmmuno, USA)과 연결시키고 분자량 4 K 컷오프로 ddH2O에서 투석을 실행하여 표지화되지 않은 로다민을 제거하고, 추가로 동결건조하여 -20℃에서 보관하였다. 40 μl의 PBS 중의 1 μg의 로다민 표지화된 펩티드의 부분표본을 30 G 주사기를 사용하여 관절내 주사에 사용하였다.

래트 무릎을 주사 후 1일 후에 제거하고, 대퇴골과(femoral condyles) 및 경골(tibias)을 모두 철저하게 세정하고, PBS에 침지하고 2-광자 현미경 관찰을 위해 3.5 cm 접시에 정교하게 부착하였다. 현미경 시스템을 영상화를 위해 810 nm의 중심 파장, 76 MHz의 펄스 반복율, 및 200 fs의 펄스 폭에서 근적외선 팸토초 레이저(Mira 900, Coherent, USA)를 사용하여 작동시켰다. 레이저 파워를 SHG 및 TPEF를 생성하기에 충분하고, 연속적인 조명 중에 광손상을 또한 방지하는 20 mW로 제어하였다. 그러므로, 콜라겐 섬유로부터의 SHG의 파장은 405 nm인 한편, 콜라겐, 엘라스틴, FAD, 및 NADH로부터의 TPEF는 대략 450 내지 650 nm이다. 모든 이미지를 레이저 스캐닝 유닛(Fluoview 300, Olympus, Japan), 레이저 포커싱 및 광자의 수집 둘 다를 위한 한 쌍의 2개의 대물렌즈(UPlanSApo20x/0.75, Olympus, Japan), 및 각각 SHG 및 TPEF 검출을 위한 2개의 광전자 증배관(photomultiplier tubes)으로 얻었다. SHG 및 TPEF는 밴드-패스 필터(FF01-405/10, Semrock, USA)와 컬러 글래스(BG39, Schott, Germany)의 조합에 의해 강렬한 여기 레이저 백그라운드로부터 여과되었다. 그리고, 그런 다음 다이크로익 미러(dichroic mirror, FF435-Di01, Semrock, USA)로 분할되고 전방으로 검출되었다. 본 발명자들이 LP 및 CP 이미징을 입증하기 위하여 각각 절반 (AHWP05M-980, Thorlabs, USA) 및 1/4 (AQWP05M-980, Thorlabs, USA) 파장판(waveplates)과 조합된 큐브 편광 빔 스플리터(GT10-B, Thorlabs, USA)를 사용한 것이 주지된다. 대물 렌즈의 초점을 맞춘 후 50:1보다 큰 선형 편광(linear polarization)의 소광비(extinction ratio)와 1.1 미만의 원편광의 타원율(ellipticity of circular polarization, Imax/lmin)만이 다음의 2-광자 이미징에 사용될 수 있다. 획득된 이미지는 주로 ImageJ/FiJi 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 처리되고 분석되었다. 이차 고조파 생성 이미지(도 1a)를 통해 재구성된 타입 II 콜라겐 구조는 중첩된 연골세포(검은색 영역)를 둘러싸고 있는 다공성 콜라겐 섬유 상호 연결된 구조(녹색)를 보여주었다.

< C5-24 펩티드 콘쥬게이션된 초상자성 산화철(SPIO)의 제조 및 IR 분광법>

C5-24 및 스크램블 펩티드를 화학적으로 합성하는 한편, 직경이 50 nm인 아미노실란 변형된 SPIO 입자(Chemicell GmBH, Germany)를 먼저 중탄산 나트륨 완충액 pH 8.5에서 석신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-테트라에틸렌글리콜] 에스테르(succinimidyl-[(N-maleimidopropionamidc])tetraethyleneglycol]ester, Thermo Fisher Scientific, USA)와 가교시켜 아미드 결합을 형성하고, 후속적으로 pH 7.2에서 펩티드의 시스테인 상의 설프하이드릴 기와 상호작용시켜 안정적인 티오에테르 결합을 형성하고 분자량 10 K 컷오프로 ddH2O에서 투석을 실행하여 유리-형태(free-form)의 펩티드, 가교 링커 및 염, 이탈기를 제거하고, 추가로 감압에서 농축하고, PBS에 재현탁하여 2주 이내의 실험을 위해 4℃에서 보관하였다. SPIO 상에서 펩티드의 설치를 분석하기 위하여, 제조된 SPIO의 일부를 동결건조하고, 브롬화 칼륨(KBr)으로 1:100 wt./wt.으로 철저하게 분쇄하고 200 pound/inch2으로 압축하여 추후 적외선 방사선 분광분석(Perkin Elmer, USA)을 위해 얇은 펠릿을 형성하였다. 적외선을 400-4000 1/cm 주파수로 스캐닝하여 투과 모드에서 특징적인 기 및 핑거 프린트 영역 분자 그룹을 각각 기록하였다.

<래트 모델에서 OA의 자기 공명 영상(MRI) 분석>

제시된 결과와 같이 표시된 시점에서의 래트를 흡입에 의해 마취하고 MRI 스캐닝을 실행하였다. MRI 스캔을 대만 중앙연구원 생의학 연구소(Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica in Taiwan)에서 4.7T MR 스캐닝 시스템(Bruker BioSpin, Germany)을 사용하여 수행하였다. T1-무게가 측정된 및 T2-무게가 측정된 시상 절편(sagittal section)은 다음의 설정을 사용하여 만들었다: 2000 ms의 반복 시간 및 72 ms의 에코 시간을 갖는 고속 스핀 에코 시퀀스(fast spin echo sequence); 슬라이스 두께는 1 mm였고; 슬라이스간 갭 1 mm; 매트릭스 256; TE 60; TR 2000; 시야 60 mm; 평균 2의 수. 60 mm 부피 공진기 및 2 cm 직경의 표면 수신 코일을 사용하여 이미지 해상도 및 품질을 극대화하였다. MRI의 단층촬영 DICOM을 Osirix MD(Osirix Ltd., USA)에 의해 분석하였다.

<미니 피그 모델의 OA, C5-24 펩티드 콘쥬게이션된 SPIO의 관절내 주사 및 3T-MRI 분석>

OA를 확립하기 위한 전방 십자 인대(ACL) 횡절단 수술을 위해, 대만 Lan-Yu 미니피그(생후 9개월, 체중은 대략 50-60 kg)를 스트레스닐(20 mg/kg) 및 아트로핀 설페이트(0.02 mg/kg)의 조합된 근육내(i.m.) 주사와, 이어서 15분 후 Zoletil® 50(4 mg/kg, Virbac Animal Health, France)의 근육내 주사에 의해 마취시켰다. 보다 균질한 무릎 관절 그룹을 얻기 위하여, 암컷 피그만을 본 연구에 포함시켰다. 수술 중에, 동물을 계속해서 산소(1.5 L/분의 유량), 아산화질소(1 L/분의 유량) 및 1% 아이소플루란을 함유한 가스로 마취시켰다. 우측 뒷다리를 씻고 멸균적으로 덮었다. 세파졸린(2 g)의 정맥내 투여 후, 슬개골(patella)부터 경골결절(tuberositas tibiae)까지 우측 무릎에서 대략 7 cm의 피부를 절개하였다. 그런 후 관절을 슬개골 인대의 내측으로 개방하였고 슬개골이 부분적으로 탈구된다. 그런 후 ACL을 클램프에 의해 고정하고 메스(scalpel)를 사용하여 말단부를 절단한다. 이 횡절단 후 ACL의 자연적인 치유(spontaneous healing)를 피하기 위하여, 전기 관절절개술(electrical arthrosector)을 사용하여 근위부 절제술(proximal resection)을 추가적으로 수행하였다. 멸균 0.9% 식염수 용액으로 성공적으로 세정한 후, 피부 절개를 1-0 VICRYL® 봉합사(Ethicon, USA)를 사용하여 층으로 봉합하였다. 미니피그는 이 절차 후에 정상적으로 걷고 움직일 수 있었다. MRI 스캔을 표시된 시점에 대만 기기 기술 연구 센터(Instrument Technology Research Center) NARLab에서 3T MR 스캐닝 시스템(Achieva x 3.0, Philips, Germany)을 사용하여 수행하였다. T1-무게가 측정된 및 T2-무게가 측정된 시상 절편은 다음의 설정을 사용하여 만들었다: 2000 ms의 반복 시간 및 72 ms의 에코 시간; 슬라이스 두께는 3 mm였고; 매트릭스 512; TE 200; TR 3500; 시야 60 mm; 평균 2의 수. MRI의 단층촬영 DICOM을 Osirix MD(Osirix Ltd., USA)에 의해 분석하였다.

<C5-24 및 스크램블 펩티드 콘쥬게이션된 히알루론산(HA)의 제조>

펩티드 콘쥬게이션된 HA를 약간 변형하여 이전에 기술된 것과 같이 합성하였다. 간단히 설명하면, MeHA를 먼저 메타크릴산 무수물(94%, M.W. 154.17; Sigma)과 pH 8의 탈이온수 중의 1%(wt/vol) HA(히알루론산 나트륨 분말, 분자량은 대략 110-150 kDa; Kikkoman, Japan)와의 반응을 통해 합성하고, 투석(분자량 컷오프 6-8 kDa)을 통해 정제한 후, 동결건조하였다. 중간체 MeHA 매크로머의 메타크릴화 효율을 1H NMR에 의해 평가하였다. C-말단에 시스테인 잔기가 있는 C5-24 및 스크램블 펩티드는 설프하이드릴기가 마이클 부가 반응을 통해 MeHA와 반응하는 것을 허용한다. MeHA 매크로머 및 펩티드를 트리에탄올아민 완충 식염수(TEOA 완충액, 0.2 M TEOA, 0.3 M 총 오스몰 농도, pH 8.0)에 용해시키고 펩티드 결합을 위해 37℃에서 밤새 유지하였다. 펩티드 콘쥬게이션된 HA를 분자량 12 K 컷오프로 ddH20에서 투석을 실행하여 유리 형태의 펩티드, TEOA, 염 및 MA를 제거하고, 추가로 동결건조하여 실온에서 보관하였다. 펩티드 콘쥬게이션된 HA를 0.1 M 산에 용해시키고 1H NMR을 수행하여 펩티드의 콘쥬게이션 효율을 평가하였다.

<윤활제 성능 분석>

연골의 대퇴골과(femoral condyles of cartilage)로부터 수집한 인간 관절 연골 샘플을 이전의 간행물로부터 약간 변형시킨 윤활 테스트를 위해 준비하였다. 인간 골관절 연골 샘플을 슬관절 전치환술(total knee arthroplasty)을 받은 환자로부터 중국 의과대학 병원으로부터의 IRB 위원회에 의한 엄격한 감독 하에(IRB 번호: CMUH108-REC1-046, 및 T-CMU-23728) 섹션화하였다. 해부 중에 관절 표면이 손상되는 것을 피하기 위해 주의를 기울였다. 개별 환자로부터의 OA 연골의 표층은 온전하게 유지되었고, 펀치 절단으로 직경이 각각 8.0 mm 및 6.0 mm인 실린더 디스크를 얻었고, 연골의 심부층만을 절단하여 레오미터에서 마찰 측정을 수행하는 동안 특별히 설계된 테스트 모듈의 금속 반대 표면에 접착하기 위한 평평한 디스크를 얻었다. 연골을 동결시키지 않고 신선하게 사용하거나 표면 윤활 특성을 변화시키지 않기 위해 프로테아제 억제제를 첨가하였다. 샘플을 PBS에서 밤새 격렬하게 세척하여 연골 표면에서 어떠한 잔류하는 활액을 고갈시킨 후, 적어도 3개 그룹으로 분리하였다. 비변형 HA 또는 펩티드 변형된 HA와 연골 디스크와의 결합에 대한 결과에서 표시된 것과 같이 연골 디스크를 1 ml의 원래의 HA 또는 펩티드 변형된 HA(PBS 중에 1% HA)에서 2시간 동안 사전 인큐베이션한 후, 그것을 테스트 모듈에서 10 ml PBS에 침지하고 마찰 측정을 위해 레오미터(HR-1, TA Instrument Ltd., USA)에 장착한다.

레오미터는 제조사의 지침을 따라 표준 프로토콜을 사용하여 초기에 0으로 설정되었고, 그런 후, 본 발명자들은 전자 캘리퍼스로 연골 샘플의 초기 높이를 계산한 다음 샘플을 레오미터 상에 로딩하였다. 샘플을 시아노아크릴레이트 접착제로 병렬 플레이트 구성의 상단 및 바닥 레오미터 고정물(rheometer fixtures)에 접착하였다. 얇은 접착제 층만이 연골 및 금속 고정물 표면에 결합하였다. 6.0 mm 샘플 표면을 8.0 mm 표면의 상부에 배치하였다. 샘플 표면 사이의 불충분한 접촉, 하중 값 변동을 피하고 높이 측정의 오류를 최소화하기 위하여, 상단 샘플을 낮추고 하중 값이 ~0.01 N이 될 때까지 바닥 샘플에 대해 프레스하였다. 레오미터에 의해 자동으로 감지된, 상응하는 기록된 높이를 변형률 계산(strain calculation)에 사용하였다. 기구는 총 연골 두께를 기록하고 대략 14% 압축에 대한 높이를 계산하도록 프로그래밍되었다. 인간 OA 연골 샘플의 총 두께는 대략 2.5 - 3.5 mm의 범위였는데, 건조를 방지하기 위해 보호 뚜껑으로 덮인 HA/PBS 용액(10mL)의 욕조에서 테스트하였다. 각각의 샘플을 적절한 정렬 및 표면 불규칙성에 대해 확인하였고, 평평한 표면을 가진 샘플에 대해 실험을 수행하였다. 샘플을 테스트 윤활제에 담그고, 원래 조합된 높이의 86%로 압축하고 각속도 곱하기 고리의 유효 반경 Reff = 2/3[(Ro3-Ri3)/(Ro2-Ri2)]로 정의되는 0.3 mm/s의 유효 슬라이딩 속도로 각 방향으로 2바퀴를 회전시킴으로써 사전 조건화하였다. 이런 사전 조건화를 2회 더 반복한 후, 3,600초의 스트레스 완화 기간(stress-relaxation period)으로 압축된 연골에 있는 유체의 압력이 완전히 가라앉도록 하였다. 평형 수직 응력 데이터(equilibrium normal stress data) 기록 및 측정을 각 실험 그룹에 대해 수행하였다. 윤활 테스트는 14 단계로 수행되었다. 처음 두 단계는 무시할 수 있을 것으로 간주되었고 세정 또는 전단 전 단계(pre-shear stage)로서 사용하였다. 단계 3, 6, 9 및 12를 수행하여 상이한 이완 기간의 효과를 분석하였다. 샘플을 1200, 120, 12 및 1.2초 동안 테스트 사이에 이완되도록 허용하였다. 윤활 데이터를 단계 4-5, 7-8, 10-11 및 13-14 중에 기록하였고; 각각의 단계는 상이한 회전 방향 및 일정한 전단 속도에 있었다. 각각의 테스트 중에, 토크(torque,τ) 및 축력(axial force, N)을 측정하였고, 운동 마찰 계수인 μk의 순간 측정은 다음의 방정식으로부터 결정되었다: μk = τ/(Reff x N). 순간 μk 값을 비교에 사용된 평균 μk를 생성하기 위해 각각의 방향으로 두 번째 회전에 대해 평균을 구하였다. 정적 마찰 계수를 테스트를 시작하는 기간 중에 발견된 최대 토크 값에서의 순간 μs = τmax/(Reff x N)로서 계산하였다. 실험 후에 대략 14%의 연골 표면 상의 압축으로 인한 중앙 압입(central indentation)을 확인하였다.

<래트 MSC 분리 및 SPIO로의 표지화, 및 C5-24 펩티드 콘쥬게이션된 HA를 통한 전달>

래트 MSC를 분리하고 이전에 기술된 것과 같이 팽창시켰다. 간단히 설명하면, 생후 8 내지 10주령의 2마리의 암컷 스프래그 다우리(Sprague-Dawley) 래트(BioLASCO Taiwan Co Ltd, Taipei, Taiwan)로부터 수집한 대퇴골(femora), 및 연조직을 무균적으로 분리하였다. 골수 단핵 세포를 밀도 구배 원심분리 방법에 의해 분리하고 완전 배양 배지(CCM: 16.6% 소 태아 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 2 mM L-글루타민이 보충된 α-MEM)에 현탁시킨 후, 배양 접시에 1 x 105/cm2의 밀도로 시딩하였다. 비부착 세포는 세척 및 24시간 후의 배지 교체로 제거하였다. 세포는 서브-컨플루언스(sub-confluence)에 도달하였을 때, 세포(계대 0)를 추후 하위배양(subcultures)을 위해 수득하였다. 그런 후, 세포를 100 세포/cm2의 밀도로 시딩하고 CCM에서 주 2회 배지를 교체하면서 성장시켰다. 이 연구에서 사용한 MSC는 계대 3-4였다.

초상자성 산화철 나노입자(SPIO)로 MSC 표지화를 위해, 50 μg/mL의 SPIO(Chemicell GmbH, Gemany)를 0.75 μg/mL의 폴리-L-리신(Sigma Aldrich, USA)과 배양 배지에서 실온에서 1시간 동안 사전 혼합하였다. SPIO 나노입자의 엔도시토시스(endocytosis)를 위해, MSC를 6-웰 플레이트에 4 x 104/웰의 밀도로 시딩하고 24시간 동안 성장시킨 후, PBS로 철저하게 세척하였다. 그런 후, MSC를 마이크로튜브에 수집하고 2% C5-24 펩티드 콘쥬게이션된 HA와 함께 혈청-프리 배지에서 1 x 106 세포/200 μl의 농도로 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 관절내 주사를 위해, HA 캡슐화된 MSC의 부피를 1 x 106 세포를 함유한 25 μl로 감소시키고, OA 래트 무릎 관절 활액낭(synovium capsule)에 정교하게 주사하였다.

<조직학적, 면역세포형광 및 면역조직화학적 분석 및 공초점 현미경 관찰>

HA 캡슐화된 MSC 이식의 조직학적 분석을 위해, 래트를 결과에서 표시된 것과 같은 이식 후 시점에 희생시키고, 전체 무릎 관절을 제거하여, PBS 중의 4% 파라포름알데하이드(PFA)에 고정시키고, 0.5 M EDTA에서 2주 동안 석회질을 제거하고, 파라핀에 묻어놓고 시상 방향(sagittal direction)으로 5 μm 두께로 연속 섹션화하였다. H&E 염색, 프러시안 블루 염색 및 사프라닌-0 염색을 위해 표준 프로토콜에 의해 대퇴골과의 중간 지대에서 연속 섹션을 준비하고 위상차 현미경(Carl Zeiss)에 의해 관찰하였다. H&E 염색의 경우, 파라핀 제거된 슬라이드를 연속적으로 재수화하고, 릴리 메이어(Lillie Mayer) 헤마톡실린(Sigma Aldrich, USA)으로 10분 동안 염색한 후, 에오신 Y(Sigma Aldrich, USA)로 30초 동안 염색하고, 연속 탈수로 마무리하고, 세정하고 장착하였다. 프러시안 블루 염색의 경우, H&E와 유사하게 슬라이드를 준비하고, 재수화된 슬라이드를 10% HCl 용액(Sigma Aldrich, USA) 중의 5% 페로시안화 칼륨으로 20분 동안 염색하고, 패스트 레드(Fast Red)로 대조 염색하고 탈수로 마무리하고, 세정하고 수지 겔 및 커버슬립으로 장착하였다. 사프라닌-O 염색의 경우, 재수화된 슬라이드를 0.05% 패스트 그린 용액으로 3분 동안 염색하고, 0.1% 사프라닌-O 용액으로 5분 동안 염색하고, 세정으로 마무리하여 수지 겔로 장착하였다.

HA 캡슐화된 MSC의 공초점 현미경 관찰을 위해, HA를 메타크릴화하고 Alexa-488 형광 염료로 콘쥬게이션하고, PBS 중에 2%로 제조하였다. MSC를 마이크로튜브에 수집하고, Dil3 형광 염료(Invitrogen, USA)로 제조사의 지침을 따라 표지화하고 HA 용액과 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 후속해서, 슬라이드 위에 떨어뜨리고 즉시 공초점 현미경(Leica)으로 관찰하여 3D 이미지를 ImageJ Fiji(NIH)에 의해 재구성하였다.

<친화성 트래핑, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석(LC-MS/MS) 및 ELISA에 의한 C5-24 펩티드의 표적 단백질의 확인>

C5-24 펩티드 사슬의 결합 표적을 확인하기 위하여, 인간 OA 연골 표본을 친화성 트래핑(affinity trapping)에 대해 균질화하였다. PBS 중의 1 mg/ml의 비오티닐화된 C5-24 펩티드를 연골 균질물에 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, DTSSP 용액을 펩티드-표적 단백질 교차 결합을 위해 2 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 반응 혼합물을 인큐베이션하고 실온에서 30분 동안 회전시켰다. 반응을 1 M 트리스 염기를 사용하여 중단시켰다. 연골세포를 제1 용해 완충액(100 mM 트리스 아세테이트, pH 8.0 중의 1 M NaCl)으로 4℃에서 24시간 동안 용해시킨 후, 용해물을 원심분리하고, 펠릿을 제2 용해 완충액(50 mM 아세트산 나트륨, pH 5.8 중의 4 M 구아니딘 HCl, 65 mM DTT, 10 mM EDTA)으로 4℃에서 다시 24시간 동안 재처리하였다. 원심분리 후, 구아니딘 추출물을 -20℃에서 100% 에탄올과(5:1 부피비) 16시간 동안 혼합하여, 잔류하는 구아니딘 HCl의 제거를 보장하였다. 표적 단백질 분획을 16,000 x g 및 4℃에서 45분 동안 원심분리함으로써 침전을 형성하고, 펠릿을 90% 에탄올로 세척하고, 건조시키고, 100 μg/ml 펩신을 함유한 100 mM 아세트산으로 재용해시켰다. MyOne 스트렙트아비딘 C1 다이나비드(MyOne Streptavidin C1 Dynabeads, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 단백질 용해물에 첨가하고 1시간 동안 철저하게 혼합하였다. 면역-자기 분리를 사용하여 펩티드-단백질 복합체를 아래로 끌어당겼다. 마지막으로, 정제된 단백질을 도데실 황산 나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)(Bio-Rad) 구배에 의해 분리하고 SilverQuest 은 염색 키트(Invitrogen)로 은 염색을 하였다.

염색된 단백질 밴드를 작은 조각으로 절단하고 50% ACN을 함유한 10 mM 중탄산 암모늄(ABC, Sigma, St Louis, MO)으로 5분 동안 3회 세척하였다. 겔 조각을 100% CAN으로 탈수하고 1 ng/μl 트립신(Promega, Madison, Wl)을 함유한 25 mM ABC(pH 8.2) 용액으로 재수화한 후 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 분해시킨 후, 트립신 처리된 펩티드를 겔로부터 50% ACN 중의 1% FA를 사용하여 추출하고 원심분리 농축기를 사용하여 건조시켰다. 펩티드 단편을 LC-MS/MS에 의해 확인하였다. LC-MS/MS를 Ultimate 3000 nanoLC 시스템(Dionex, Sunnyvale, CA)과 온라인으로 결합된 이온 트랩 질량 분석기(HCTultra PTM discovery, Bruker, Billerica, MA)를 사용하여 수행하였다. 샘플을 트랩 칼럼(C18, 5 μm, 1mm x 5 mm, Dionex, Sunnyvale, CA)에 주입하고 역상 칼럼(Atlantis C18, 3 μm, 75 μm x 150 mm, Waters, Milford, MA)으로 300 nl/분의 유량으로 온라인으로 분리하였다. 펩티드를 2 내지 40%의 용매 B(100% ACN, 0.1% FA)의 H20/ACN 구배로 6분 내에 및 40 내지 70%의 B의 구배로 24분 내에 용출하였다. MS 및 MS/MS 스캔 범위는 각각 400-1600 m/z 및 100-2500 m/z이다. 단백질 후보를 MASCOT(Matrix Science, London, UK) 및 TurboSequest 검색 엔진(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 Swiss 단백질 데이터베이스를 검색함으로써 확인한 후, ELISA에 의해 검증하였다.

처음에, ELISA 플레이트를 코팅 완충액(0.5 M NaHC03)에서 콜라겐 알파-3(VI) 및 콜라겐 알파-1(XII)로 실온에서 2시간 동안 코팅하고 5% 우유/TBST로 4℃에서 밤새 차단하였다. 비오티닐화된 펩티드를 ELISA 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 세척하고 비오티닐화된 펩티드를 HRP 콘쥬게이션된 마우스 항-MIS 항체(GE Healthcare Biosciences)로 프로브(probe) 하였다. 비오티닐화된 펩티드의 인식된 콜라겐 알파-3(VI) 또는 콜라겐 알파-1(XII)에 대한 결합을 HRP 콘쥬게이션된 스트렙트아비딘(Thermo Pierce Biotechnology Scientific)에 의해 검출하였다. 플레이트를 PBS로 세척하고 후속해서 과산화효소 기질 오페닐렌다이아민 디히드로클로라이드(ophenylenediamine dihydrochloride, OPD; Sigma)과 함께 인큐베이션하였다. 반응을 3 N HCl에 의해 종결하고, 490 nm에서의 흡광도를 ELISA 판독기로 측정하였다.

<C5-24 펩티드 도킹 표적의 상동성 모델링>

연골 조직 상에서 선택된 파지 클론의 결합 표적을 추가로 확인하기 위한 분자 모델링을 Dassault 시스템(BIOVIA, Discovery Studio Modeling Environment, Release 2019, San Diego, USA)에 의해 개발자의 지침에 따라 수행하였다. 간단히 설명하면, Uniprot 데이터베이스로부터 검색된 인간, 마우스, 및 돼지 ColXII의 표준 서열 코드는 각각 Q99715, Q60847, F1RQI0였다. 인간 ColXII 상동성 모델의 3개의 상이한 부분을 BLAST 결과로부터 주형(PDB 코드: 1FNF, 2B2X, 2UUR)을 토대로 MODELER을 사용하여 구축하였다. 제1 인간 ColXII 모델의 길이는 L1385에서 S2285까지였고, 주형 1FNF에 30% 동일하며, 이것은 피브로넥틴 구조를 나타냈고 고도로 보존된 구조적 위상(structural topology)으로 인해 모델 확립에 사용할 수 있었다. 제2 및 제3 인간 ColXII 모델은 K2321에서 L2513까지 및 S2506에서 P2724까지였고 각각 주형 2B2X 및 2UUR과 31% 및 36% 서열 동일성을 가졌다. 모든 상동성 모델을 먼저 PDF 총 에너지, DOPE(Discrete Optimized Protein Energy) 및 점수 확인, 라마찬드란(Ramachandran) 플롯 및 개선된 구조에 의해 확인하여 타당한 백본 및 측쇄 입체구조(sidechain conformation)를 얻었다. 가장 대표적인 단백질 주형을 결합 부위를 예측하고 IHC에서의 가장 유망한 결과로 인해 C5-24 및 C5-91 펩티드 사슬의 포즈를 정하는 데 사용하였다. 후속해서, 잠재적인 결합 영역을 검색하기 위해 ZDOCK를 사용하는 단백질-펩티드 도킹을 수행하였다. Z_Dock 점수 및 E_R_Dock 점수를 사용하여 펩티드와 표적 단백질 주형 사이의 도킹 능력 및 정확성을 검증하였다.

<통계적 분석>

데이터는 평균 ± SD로서 제시하고, 통계적 비교를 스튜던트 t-검정 또는 일원분산분석(ANOVA)에 의해 수행하였으며 <0.05의 p 값을 유의미한 것으로 간주하였다. 모든 계산을 중국 의과 대학에 대해 인가된 통계 분석 시스템(SAS)을 사용하여 수행하였다. 모든 생체내 데이터는 표시된 대로 적어도 3회의 독립적인 실험을 나타낸다.

비록 본 개시가 특정 구현예를 참조하여 상당히 상세하게 기술되었지만, 다른 구현예가 가능하다. 그러므로, 첨부된 청구범위의 사상 및 범주는 본원에 포함된 구현예의 설명으로 제한되지 않아야 한다.

기술분야에 숙련된 사람들에게는 다양한 변형 및 변동이 본 개시의 범주 또는 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본 개시의 구조에 대해 이루어질 수 있음이 분명해질 것이다. 전술한 설명에 비추어, 본 개시는 본 개시의 변형 및 변동이 다음의 청구범위의 범주 내에 있다면 본 개시의 변형 및 변동을 포함하는 것으로 의도된다.

<110> China Medical University ACADEMIA SINICA SHIH, Ming-Che <120> OLIGOPEPTIDE, TESTING KIT THEREOF, MEDICAL COMPOSITION THEREOF AND USE OF MEDICAL COMPOSITION <130> CP-4648-PCT <150> US 62/942,847 <151> 2019-12-03 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 Asp Leu Gln Tyr Trp Tyr Pro Ile Trp Asp Thr His 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 Asp Ala Tyr Trp His Pro Val Trp Val His Asp Pro 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 His Val Tyr Gln Lys Pro Ser Tyr Trp Trp Tyr Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 Thr Trp His Phe Val Asp Phe Ser Ala Asp Thr His 1 5 10

Claims

서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3 또는 서열번호: 4의 전장 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 50% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는, 올리고펩티드.
제1항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3 또는 서열번호: 4의 전장 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 70% 동일성을 가지는 것인, 올리고펩티드.
제2항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3 또는 서열번호: 4의 전장 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 80% 동일성을 가지는 것인, 올리고펩티드.
제3항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3 또는 서열번호: 4의 전장 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90% 동일성을 가지는 것인, 올리고펩티드.
제4항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3 또는 서열번호: 4의 전장 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 95% 동일성을 가지는 것인, 올리고펩티드.
제5항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 3 또는 서열번호: 4의 전장 아미노산 서열 중 적어도 하나와 동일한 것인, 올리고펩티드.
제6항에 있어서, 아미노산 서열은 서열번호: 1의 전장 아미노산 서열과 동일한 것인, 올리고펩티드.
제1항에 있어서, 아미노산 서열은 결합 모티프를 포함하며, 결합 모티프는 식 (i)에 의해 표시되고:
WX1PX2W (i),
식에서 W는 트립토판이며, P는 프롤린이고, X1 및 X2는 각각 아미노산이며, X1 및 X2는 서로 동일하거나 상이한 것인, 올리고펩티드.
제1항에 있어서, 아미노산 서열은 결합 모티프를 포함하며, 결합 모티프는 식 (ii)에 의해 표시되고:
DTH (ii),
식에서 D는 아스파르트산이며, T는 트레오닌이고, H는 히스티딘인 것인, 올리고펩티드.
제1항에 있어서, 올리고펩티드의 길이는 5 내지 12개 아미노산 잔기 범위인 것인, 올리고펩티드.
제1항에 있어서, 올리고펩티드의 결합 표적은 콜라겐 XII인 것인, 올리고펩티드.
제11항에 있어서, 올리고펩티드는 골관절염으로 고생하는 연골 조직에 대해 결합 특이성을 가지는 것인, 올리고펩티드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 올리고펩티드를 포함하는, 테스트 키트.
제13항에 있어서, 올리고펩티드는 초상자성 산화철(superparamagnetic iron oxide, SPIO) 또는 이미지 현상제에 결합되는 것인, 테스트 키트.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 올리고펩티드; 및
올리고펩티드에 결합하는 치료 분자 또는 줄기 세포
를 포함하는, 의약 조성물.
제15항에 있어서, 치료 분자는 골관절염 치료 약물, 척추 질환 치료 약물, 안구 질환 치료 약물, 히알루론산, 연골 성장 인자 또는 이들의 조성물인 것인, 의약 조성물.
제15항에 있어서, 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포(MSC)인 것인, 의약 조성물.
제15항에 있어서, 올리고펩티드는 초상자성 산화철(SPIO) 또는 이미지 현상제에 결합되는 것인, 의약 조성물.
제15항에 있어서, 골관절염의 치료에 사용하기 위한 것인, 의약 조성물.