CN108210904A - 治疗动脉粥样硬化及其并发症的药物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗受试者动脉粥样硬化及其相关病症的方法，包括给药受试者预防和/或治疗有效量的纤溶酶原，所述受试者患有或怀疑患有动脉粥样硬化及其相关病症。本发明还涉及用于治疗受试者动脉粥样硬化及其相关病症的包含纤溶酶原的药物、药物组合物、制品、试剂盒。

Description

治疗动脉粥样硬化及其并发症的药物及其用途

技术领域

本发明涉及纤溶酶原在预防和/或治疗动脉粥样硬化及其相关病症方面的作用，进而为预防和/或治疗动脉粥样硬化及其相关病症提供全新的治疗策略。

背景技术

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。脂质代谢障碍为动脉粥样硬化的病变基础，其特点是受累动脉病变从内膜开始，一般先有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成，进而纤维组织增生及钙质沉着，并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄。病变常累及大中肌性动脉，一旦发展到足以阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。

动脉粥样硬化是众多心脑血管疾病共同的病理基础，也是心血管系统疾病中最常见的疾病，严重危害人类健康。动脉粥样硬化的发生发展包括脂质入侵、血小板活化、血栓形成、内膜损伤、炎性反应、氧化应激、血管平滑肌细胞(VSMC)激活、选择性基质代谢及血管重建等^[1]。虽经历了近一个世纪的研究，很多学者也提出了关于AS发病机制的不同学说，如脂质渗入学说、巨噬细胞受体缺失学说、致平滑肌突变学说、损伤应答学说、炎性反应学说、血流动力学说及免疫学说等，但任何一种学说均不能单独全面的解释AS的发生发展。近年来，大量细胞及分子水平的实验研究资料扩展了人们对内皮细胞、 VSMC、单核巨噬细胞及血小板正常自稳态的认识，从而对其在AS 的形成和发病机制方面的作用有了进一步的认识。

1.血管内皮细胞损伤的作用

研究发现，动脉粥样硬化斑块出现前很长时间血管内皮功能损伤就早已形成。Esper等^[2]报道，内皮细胞能够产生大量具有双向功能的分子，能够使促进和抑制效应达到平衡。当内皮细胞失去维持这一细微平衡的能力时，脂质和白细胞(主要是单核细胞和T淋巴细胞)就会侵入到内皮，从而引起炎性反应的发生和脂纹的形成。内皮细胞的功能障碍、活化及形态学损伤，可引发血液中的单核细胞、血小板及血管壁中膜VSMC的变化而最终形成AS。其具体机制如下：(1)内皮细胞的通透性增加是AS的主要的起始环节，是脂质进入动脉壁内皮下的最早病理变化^[3]；(2)使血小板和单核细胞的黏附增加。Ott等^[4]报道，一个功能失调的内皮细胞由于其表面的细胞黏附分子表达增加可能会促进单核细胞的黏附，从而促使含有细菌的单核细胞从循环血渗入到AS斑块中；(3)分泌多种生长因子，如单核细胞趋化蛋白 21(MPC21)、成纤维细胞生长因子、转化生长因子(TGF)和血小板源性生长因子(PDGF)等，从而吸引单核细胞聚集并黏附于内皮，并迁入内皮下的间隙，经其表面的清道夫受体、CD36受体和Fc受体介导，大量摄取进入内膜下被氧化的脂质，形成单核细胞源性的泡沫细胞。 Boos等^[3]研究指出，内皮损伤程度在某种程度上可作为AS的发病指征及其严重程度的新型指标。

2.血小板的作用

动脉内皮细胞损伤后，可促进血小板黏附到受损的内皮细胞上，从而促进PDGF的释放，导致肌内膜细胞不断增生，最终导致胶原合成，形成AS斑块。在AS血栓形成的最终阶段，血小板的黏附、活化和聚集可导致动脉闭塞和继发性缺血^[5]。血小板与内皮细胞、结缔组织相互作用，对局部管壁AS的发生有重要意义。血小板在AS中的作用主要表现在：(1)任何形式的内皮损伤，均能使血小板大量黏附聚集于内皮局部，激活凝血系统,引起血栓形成。(2)分泌和释放多种活性物质，如PDGF、血小板第4因子、β血栓球蛋白等对VSMC 及单核细胞均具有强烈的化学趋化作用，参与VSMC游出、增殖及修饰主动脉内膜，吸引单核细胞黏附内皮。有学者指出PDGF具有趋化成纤维作用和促进单核细胞增殖各自的抗原决定簇，在致AS过程中起重要作用。(3)静脉内皮细胞能产生一氧化氮和前列环素，并不断在肺内释放，调节血小板的功能。

3.脂质在动脉粥样硬化发生、发展中的作用

大量研究证明，AS的病理改变与血脂水平，特别是血浆胆固醇及三酰甘油水平密切相关^[6]。有学者提出，脂质和脂肪酸的沉积是内皮细胞功能障碍和AS形成过程中重要的病理机制。研究发现，与正常动脉相比，有AS斑块的动脉载脂蛋白C1和载脂蛋白E的蛋白和基因表达均明显升高，这可能是AS形成的原因而不单单是一种结果^[7]。现已得到公认的是，高脂血症在AS发病中的作用机制除直接引起内皮细胞损伤外，主要是使内皮细胞的通透性增加，这与低密度脂蛋白(LDL)的氧化修饰成为氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)有关。当 ox-LDL穿过未受损的内皮时，血浆LDL被运输到内皮下间隙进行氧化修饰。LDL引起巨噬细胞的清除反应和中膜VSMC的增生形成粥样斑块。以上变化可最终导致动脉内膜脂纹、纤维斑块和/或粥样斑块的形成。

4.单核巨噬细胞的作用

研究表明，AS斑块中含有包括单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞、ox-LDL负载的巨噬细胞(即泡沫细胞)和T淋巴细胞等炎性反应细胞浸润^[8]。单核-巨噬细胞在AS中的作用可以概括为：(1)吞噬作用:病变早期的泡沫细胞多来源于血中的单核细胞,后者进入内皮下转变为巨噬细胞，其表面的特异性受体可与ox-LDL结合，从而摄入大量胆固醇，成为泡沫细胞。(2)参与炎性反应和免疫反应：上述吞噬过程能够通过向细胞外基质释放炎性反应因子而诱发特有的炎性反应。在AS病灶内可见T淋巴细胞的浸润，同时与非破裂的斑块相比，破裂的AS斑块的纤维帽中含有更多的巨噬细胞。(3)参与增殖反应：巨噬细胞被激活后可释放多种细胞因子和生长因子，促进中膜VSMC 的迁移和增生。同时，巨噬细胞表达多种金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶类，使细胞外基质退化，斑块不稳定甚至有破裂的趋势^[9]。

5.VSMC的作用

经过近些年的研究，人们认识到中膜VSMC增殖、游走进入内膜及基质蛋白的合成，是参与AS进展期病变形成的主要环节，并在AS和再狭窄的内膜增厚中起重要作用^[10]。AS斑块和再狭窄的发病和进展包含血管壁细胞间的复杂的交互效应，细胞因子、炎性反应、趋化因子、生长因子从中发挥了重要作用。游走的VSMC经其表面的 LDL受体介导吞噬脂质，形成VSMC源性泡沫细胞，参与病变的形成。同时，这些增生的内膜VSMC还能合成胶原蛋白、弹性蛋白和糖蛋白等，以及巨噬细胞吞噬LDL释放游离脂质，使病变的内膜增厚变硬，促进硬化斑块的形成。对此，人们做出很多努力来抑制上述细胞的蓄积，并在支架术后再狭窄方面取得了很大成功^[11]。

糖尿病与动脉粥样硬化关系密切，表现为糖尿病患者出现动脉粥样硬化的时间早、程度重和预后差，而动脉粥样硬化又是糖尿病患者的主要死亡原因。

临床发现糖尿病患者的冠状动脉血管病理改变的特点主要是病变累及的血管较多、冠状动脉狭窄严重，病变更加弥漫严重，其机制多认为是血糖代谢异常引起动脉粥样硬化，随着更进一步深入的研究，更多的结果表明，糖尿病引起动脉粥样硬化并非单一因素所致，而是通过多种途径以及较为复杂的机制来诱发和促进动脉粥样硬化的发生及发展，例如巨噬细胞极化、巨噬细胞移动抑制因子途径、糖基化终产物途径、清道夫受体上调、胰岛素抵抗、泛素-蛋白酶体系统 (ubiquitin proteasome system，UPS)激活、血小板源性生长因子 (platelet-derived growth factor，PDGF)激活途径等^[12]。

在2型糖尿病患者体内白色脂肪等组织中，存在巨噬细胞极化失衡，表现为M1型巨噬细胞增多。M1型巨噬细胞主要分泌TNF-α、 IL-6、单核细胞趋化蛋白1等，发挥促炎作用，上述细胞因子不仅诱导胰岛素抵抗的发生而且促进动脉粥样硬化^[13]。

巨噬细胞移动抑制因子(macrophagemigration inhibitory factor， MIF)是一种重要的参与免疫和炎症反应的因子。在糖尿病患者中， MIF的表达增加，可能与糖尿病合并动脉粥样硬化有关^[14]。其引起动脉粥样硬化机制如下：(1)MIF使巨噬细胞在炎症部位浸润、活化，加速脂质的吞噬，诱导泡沫细胞的产生。有研究发现，巨噬细胞摄取氧化低密度脂蛋白使MIF上调，相应的MIF可以增加氧化低密度脂蛋白的摄取，促进泡沫细胞形成。(2)MIF可以活化血管内皮细胞及平滑肌细胞，使其分别表达单核细胞趋化蛋白1和细胞间黏附分子1，使单核巨噬细胞趋化迁移增加，从而加速动脉粥样硬化。在各种动脉模型中使用MIF抗体，可以使内皮下巨噬细胞、泡沫细胞、巨噬细胞活化的标志物减弱。

糖尿病患者中，糖基化终产物(advanced glycation end products， AGEs)与可以促进动脉粥样硬化病变的发生及进展。AGEs动脉壁内葡萄糖与蛋白质和脂蛋白的非酶糖基化反应产物，其与相应受体结合后通过如下机制加速动脉粥样硬化：(1)长期高血糖可使AGEs产生增加，AGEs可以修饰蛋白质、核酸和脂质，使活性氧簇产生增加，增强氧化应激，AGEs在通过增加中性粒细胞氧自由基的产生的同时能够增加中性粒细胞NADPH氧化酶活性，促进血管氧化应激，增加糖尿病患者心血管疾病的发生率^[15]。(2)AGEs增加黏附分子表达，髓系与非髓系细胞表面上AGEs受体可以增加血管黏附分子1 的表达，加速糖尿病相关的动脉粥样硬化^[16]。

胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是胰岛素作用的靶组织对外源性或者内源性胰岛素的敏感性以及反应性下降。2型糖尿病常合并有胰岛素抵抗。胰岛素抵抗通过如下机制可以加速糖尿病动脉粥样硬化：(1)胰岛素抵抗加速巨噬细胞凋亡：研究发现，糖尿病患者进展期的动脉粥样硬化斑块核心较非糖尿病患者明显增大^[17]。糖尿病进展期动脉粥样硬化病变处，由于巨噬细胞胰岛素抵抗，内质网应激所诱导的细胞凋亡明显增加，促进斑块核心增大。(2)在胰岛素抵抗和代谢综合征患者中发现CX3CL1/CX3CL1轴活化明显增加，与动脉粥样硬化加速呈正相关。动物模型中发现该轴的活化增加斑块的不稳定性。胰岛素抵抗通过活化CX3CL1/CX3CL1轴诱导血管平滑肌细胞凋亡加速动脉粥样硬化^[18]。巨噬细胞维生素D3受体敲除促进胰岛素抵抗，加速动脉粥样硬化^[19]。

糖尿病患者的内源性氧化应激增强使得巨噬细胞的UPS被过度激活^[20]。UPS的过度激活，促进糖尿病炎症因子(如血管细胞黏附因子1以及细胞间黏附分子1)的表达和分泌，引起血管内皮细胞不可逆性损伤，导致动脉粥样硬化^[21]。

此外，糖尿病患者的AGEs、血管紧张素Ⅱ、内皮素、炎症和高血脂状态增加PDGF途径的活性，而PDGF途径活性的增加具有促进炎症反应的作用。PDGF具有上调结缔组织生长因子表达的作用，促进内皮细胞和成纤维细胞的迁移、黏附和增殖，加剧动脉粥样硬化的发生^[22]。

目前为止，对动脉粥样硬化的药物治疗主要有降血脂药物、抗血小板药物、降血压药物、扩张血管药物、降血糖药物、抗凝血药物、溶血栓药物。我们在研究中惊奇地发现纤溶酶原可以消减动脉管壁的脂质积聚、沉积、降低纤维组织增生，修复动脉粥样硬化对血管壁的损伤，改善动脉粥样硬化导致的组织器官缺血损伤和由于组织器官缺血所致的相关病症。

发明概述

本发明涉及治疗受试者动脉粥样硬化及其相关病症。

一方面，本发明涉及用于治疗受试者动脉粥样硬化及其相关病症的方法，包括给药受试者预防和/或治疗有效量的纤溶酶原，所述受试者患有或怀疑患有动脉粥样硬化及其相关病症。本发明还涉及纤溶酶原用于治疗受试者动脉粥样硬化及其相关病症的用途。本发明还涉及纤溶酶原在制备用于治疗受试者动脉粥样硬化及其相关病症的药物、药物组合物、制品、试剂盒中的用途。进一步地，本发明还涉及用于治疗受试者动脉粥样硬化及其相关病症的纤溶酶原。本发明还涉及用于治疗受试者动脉粥样硬化及其相关病症的包含纤溶酶原的药物、药物组合物、制品、试剂盒。

在一些实施方案中，所述动脉粥样硬化包括主动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化、脑动脉粥样硬化、肝动脉粥样硬化、肾动脉粥样硬化、肠系膜动脉粥样硬化、下肢动脉粥样硬化。在一些实施方案中，所述动脉粥样硬化相关病症包括由于动脉粥样硬化导致组织、器官缺血而引发的相关病症，包括冠状动脉粥样硬化引发的冠心病、心绞痛、心肌梗死、心律失常、心衰；脑动脉粥样硬化引起的脑缺血、脑血栓、脑萎缩、脑出血、脑栓塞；肾动脉粥样硬化引发的肾功能不全、高血压、肾小球纤维化、肾衰、尿毒症；肠系膜动脉粥样硬化引发的饱餐后腹痛、消化不良、便秘、肠壁坏死、便血；下肢动脉粥样硬化引发的间歇性跛行、坏疽。在一些实施方案中，所述动脉粥样硬化选自：冠状动脉粥样硬化、脑动脉粥样硬化和肾动脉粥样硬化。在一些实施方案中，所述动脉粥样硬化为与糖尿病并发的动脉粥样硬化。在一些实施方案中，所述纤溶酶原通过选自如下的一项或多项预防和/或治疗动脉粥样硬化；降低受试者血清总胆固醇水平、降低受试者血清甘油三酯水平、降低受试者血清低密度脂蛋白水平、升高受试者血清高密度脂蛋白水平。在一些实施方案中，所述纤溶酶原通过降低受试者动脉管壁的脂质沉积预防和/或治疗动脉粥样硬化。在一些实施方案中，所述纤溶酶原通过选自如下的一项或多项预防和/或治疗动脉粥样硬化：促进肝脏的脂肪代谢、促进肝脏的脂肪运输和降低受试者肝脏的脂肪沉积。

在又一方面，本发明涉及预防和/或治疗受试者由于动脉粥样硬化所致的组织、器官缺血损伤及其相关病症的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于预防和/或治疗受试者由于动脉粥样硬化所致的组织、器官缺血损伤及其相关病症的用途。本发明还涉及纤溶酶原在制备用于预防和/或治疗受试者由于动脉粥样硬化所致的组织、器官缺血损伤及其相关病症的药物、药物组合物、制品、试剂盒中的用途。进一步地，本发明还涉及用于预防和/或治疗受试者由于动脉粥样硬化所致的组织、器官缺血损伤及其相关病症的纤溶酶原。本发明还涉及用于预防和/或治疗受试者由于动脉粥样硬化所致的组织、器官缺血损伤及其相关病症的包含纤溶酶原的药物、药物组合物、制品、试剂盒。

在一些实施方案中，所述受试者的组织、器官缺血损伤为冠状动脉粥样硬化导致的心肌损伤。在一些实施方案中，所述病症为冠心病、心绞痛、心肌梗死、心律失常或心衰。在一些实施方案中，所述受试者的组织、器官缺血损伤为脑动脉粥样硬化导致的脑缺血损伤。在一些实施方案中，所述病症为脑缺血、脑血栓、脑萎缩、脑出血或脑栓塞。在一些实施方案中，所述病症为肾功能不全、高血压、肾小球纤维化、肾衰或尿毒症。

在又一方面，本发明涉及预防和/或治疗受试者由于动脉粥样硬化所致的动脉血栓及其相关病症的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于预防和/或治疗受试者由于动脉粥样硬化所致的动脉血栓及其相关病症的用途。本发明还涉及纤溶酶原在制备用于预防和/或治疗受试者由于动脉粥样硬化所致的动脉血栓及其相关病症的药物、药物组合物、制品、试剂盒中的用途。进一步地，本发明还涉及用于预防和/或治疗受试者由于动脉粥样硬化所致的动脉血栓及其相关病症的纤溶酶原。本发明还涉及用于预防和/ 或治疗受试者由于动脉粥样硬化所致的动脉血栓及其相关病症的包含纤溶酶原的药物、药物组合物、制品、试剂盒。在一些实施方案中，所述病症包括冠心病、心绞痛、心肌梗死、心律失常、心衰、脑缺血、脑血栓、脑萎缩、脑出血、脑栓塞、脑梗死、肾功能不全、高血压、肾小球纤维化、肾衰、尿毒症、肠坏死、间歇性跛行、坏疽。

在又一方面，本发明涉及预防和/或治疗受试者糖尿病并发的动脉粥样硬化的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于预防和/或治疗受试者糖尿病并发的动脉粥样硬化的用途。本发明还涉及纤溶酶原在制备用于预防和/或治疗受试者糖尿病并发的动脉粥样硬化的药物、药物组合物、制品、试剂盒中的用途。进一步地，本发明还涉及用于预防和/或治疗受试者糖尿病并发的动脉粥样硬化的纤溶酶原。本发明还涉及用于预防和/或治疗受试者糖尿病并发的动脉粥样硬化的包含纤溶酶原的药物、药物组合物、制品、试剂盒。在一些实施方案中，所述动脉粥样硬化选自如下的一项或多项：主动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化、脑动脉粥样硬化、肾动脉粥样硬化、肠系膜动脉粥样硬化、下肢动脉粥样硬化。

在又一方面，本发明涉及预防和/或治疗受试者糖尿病并发的冠状动脉粥样硬化的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于预防和/或治疗受试者糖尿病并发的冠状动脉粥样硬化的用途。本发明还涉及纤溶酶原在制备用于预防和/或治疗受试者糖尿病并发的冠状动脉粥样硬化的药物、药物组合物、制品、试剂盒中的用途。进一步地，本发明还涉及用于预防和/或治疗受试者糖尿病并发的冠状动脉粥样硬化的纤溶酶原。本发明还涉及用于预防和/或治疗受试者糖尿病并发的冠状动脉粥样硬化的包含纤溶酶原的药物、药物组合物、制品、试剂盒。

在又一方面，本发明涉及预防和/或治疗糖尿病受试者的冠心病、心绞痛、心肌梗死、心律失常或心衰的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于预防和/或治疗糖尿病受试者的冠心病、心绞痛、心肌梗死、心律失常或心衰的用途。本发明还涉及纤溶酶原在制备用于预防和/或治疗糖尿病受试者的冠心病、心绞痛、心肌梗死、心律失常或心衰的药物、药物组合物、制品、试剂盒中的用途。进一步地，本发明还涉及用于预防和/或治疗糖尿病受试者的冠心病、心绞痛、心肌梗死、心律失常或心衰的纤溶酶原。本发明还涉及用于预防和/或治疗糖尿病受试者的冠心病、心绞痛、心肌梗死、心律失常或心衰的包含纤溶酶原的药物、药物组合物、制品、试剂盒。

在又一方面，本发明涉及治疗糖尿病或动脉粥样硬化受试者高脂血症的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于治疗糖尿病或动脉粥样硬化受试者高脂血症的用途。本发明还涉及纤溶酶原在制备用于治疗糖尿病或动脉粥样硬化受试者高脂血症的药物、药物组合物、制品、试剂盒中的用途。进一步地，本发明还涉及用于治疗糖尿病或动脉粥样硬化受试者高脂血症的纤溶酶原。本发明还涉及用于治疗糖尿病或动脉粥样硬化受试者高脂血症的包含纤溶酶原的药物、药物组合物、制品、试剂盒。

在一些实施方案中，所述受试者具有如下的一项或多项：血清总胆固醇水平升高、血清甘油三酯水平升高、血清低密度脂蛋白水平升高、血清高密度脂蛋白水平降低。在一些实施方案中，所述高脂血症通过选自如下的一项或多项得到改善；降低受试者血清总胆固醇水平、降低受试者血清甘油三酯水平、降低受试者血清低密度脂蛋白水平、升高受试者血清高密度脂蛋白水平。

在又一方面，本发明涉及预防或消减受试者动脉管壁脂质沉积的方法，其中所述受试者易患动脉粥样硬化或已患动脉粥样硬化，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于预防或消减受试者动脉管壁脂质沉积的用途。本发明还涉及纤溶酶原在制备用于预防或消减受试者动脉管壁脂质沉积的药物、药物组合物、制品、试剂盒中的用途。进一步地，本发明还涉及用于预防或消减受试者动脉管壁脂质沉积的纤溶酶原。本发明还涉及用于预防或消减受试者动脉管壁脂质沉积的包含纤溶酶原的药物、药物组合物、制品、试剂盒。

在一些实施方案中，所述易患动脉粥样硬化的受试者为患有原发性或继发性脂肪代谢紊乱的受试者。在一些实施方案中，述易患动脉粥样硬化的受试者为患有肝脏疾病、肾脏疾病、肥胖症、高脂血症或糖尿病的受试者。

在一些实施方案中，所述纤溶酶原可与受试者需要的一种或多种其它药物或疗法联合施用。在一些实施方案中，所述其它药物包括：降血脂药物、抗血小板药物、降血压药物、扩张血管药物、降血糖药物、抗凝血药物、溶血栓药物，保肝药物，抗心律失常药物，强心药物，利尿药物，抗感染药物、抗病毒药物、免疫调节药物、炎症调节类药物、抗肿瘤药物、激素类药物、甲状腺素。在一些实施方案中，所述药物包括降血脂药物：他汀类；贝特类；烟酸；消胆胺；安妥明；不饱和脂肪酸如益寿宁、血脂平及心脉乐；藻酸双酯钠；抗血小板药物：阿司匹林；潘生丁；氯吡格雷；西洛他；扩张血管药物：肼苯哒嗪；硝酸甘油和消心痛；硝普钠；α硝受体阻断剂如哌唑嗪；α受体阻断剂如酚妥拉明；β拉受体兴奋剂如舒喘灵；卡托普利、依那普利；心痛定、硫氮卓酮；柳丁氨酸、长压定、前列腺素、心钠素；溶血栓药物：尿激酶和链激酶；组织型纤溶酶原激活剂；单链尿激酶型纤溶酶原激活剂；TNK-组织型纤溶酶原激活剂；抗凝血药物：肝素；依诺肝素；那曲肝素；比伐卢定。

在一些实施方案中，所述纤溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤溶酶原活性。在一些实施方案中，所述纤溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代 1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、 1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。

在一些实施方案中，所述纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。在一些实施方案中，所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta- 纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性的变体。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为天然或合成的人纤溶酶原、或其仍然保留纤溶酶原活性的变体或片段。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为来自灵长类动物或啮齿类动物的人纤溶酶原直向同系物或其仍然保留纤溶酶原活性的变体或片段。在一些实施方案中，所述纤溶酶原的氨基酸如序列2、 6、8、10或12所示。在一些实施方案中，所述纤溶酶原是人天然纤溶酶原。

在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者缺乏或缺失纤溶酶原。在一些实施方案中，所述缺乏或缺失是先天的、继发的和/或局部的。

在一些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的载剂和用于前述方法的纤溶酶原。在一些实施方案中，所述试剂盒可以是预防性或治疗性试剂盒，其包含：(i)用于前述方法的纤溶酶原和(ii)用于递送所述纤溶酶原至所述受试者的构件(means)。在一些实施方案中，所述构件为注射器或小瓶。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含标签或使用说明书，该标签或使用说明书指示将所述纤溶酶原投予所述受试者以实施前述任一方法。

在一些实施方案中，所述制品包含：含有标签的容器；和包含(i) 用于前述方法的纤溶酶原或包含纤溶酶原的药物组合物，其中所述标签指示将所述纤溶酶原或组合物投予所述受试者以实施前述任一方法。

在一些实施方案中，所述试剂盒或制品还包含另外的一个或多个构件或容器，该构件或容器中含有其他药物。在一些实施方案中，所述其他药物选自下组：降血脂药物、抗血小板药物、降血压药物、扩张血管药物、降血糖药物、抗凝血药物、溶血栓药物，保肝药物，抗心律失常药物，强心药物，利尿药物，抗感染药物、抗病毒药物、免疫调节药物、炎症调节类药物、抗肿瘤药物、激素类药物、甲状腺素。

在前述方法的一些实施方案中，所述纤溶酶原可通过全身或局部给药，优选通过以下途径施用：静脉内、肌内、皮下给予纤溶酶原来进行治疗。在前述方法的一些实施方案中，所述纤溶酶原与适当的多肽载体或稳定剂组合施用。在前述方法的一些实施方案中，所述纤溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、 0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤体重计算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、 0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方厘米体表面积计算)的剂量施用，优选至少重复一次，优选至少每天施用。

本发明明确涵盖了属于本发明实施方案之间的技术特征的所有组合，并且这些组合后的技术方案在本申请中已经明确公开，就像上述技术方案已经单独且明确公开一样。另外，本发明还明确涵盖各个实施方案及其要素的之间的组合，该组合后的技术方案在本文中明确公开。

发明详述

“动脉粥样硬化”是一种慢性的、渐进性动脉疾病，发病时动脉中沉积的脂肪部分或全部堵塞血流。当原本光滑、坚实的动脉内膜变粗糙、增厚，并被脂肪、纤维蛋白、钙和细胞碎屑堵塞时，便出现动脉粥样硬化。动脉粥样硬化是个渐进的过程。当血液中的脂类浓度大大增加时，便会沿着动脉壁形成脂肪条纹。这些条纹会导致脂肪和胆固醇沉积，这些沉淀依附在原本平滑的动脉内膜上，从而形成小结。这些小结下面继而长出纤维化的瘢痕组织，导致钙沉积。沉积的钙逐渐演变为无法除去的白垩状坚硬薄膜(称为动脉粥样斑)。动脉内部的这层永久薄膜会阻碍动脉的正常扩张和收缩，从而减缓了动脉内的血流速度，从而很容易形成血块，妨碍或阻止血液流经动脉。

仅就动脉粥样硬化症而言，人们感觉不到任何症状。仅当与体内的某个重要器官相连的动脉被堵塞后，才会发现此病。因该器官中的动脉受阻而引起的症状较为明显。例如，如果心脏供血动脉部分受阻，人们就可能感到心绞痛；但是如果完全被阻塞，就可能导致心脏病(由受阻动脉供血的心脏组织死亡)。如果动脉粥样硬化影响到脑部动脉，人们会感觉眩晕、视线模糊和晕厥，甚至可能导致中风(由受阻动脉供血的脑组织死亡，从而引起神经损伤，如受死亡脑组织控制的肢体出现瘫痪)。通向肾部的动脉受阻还可能导致肾衰竭。通向眼部的血管受阻可能导致失明。四肢动脉阻塞可能导致各肢体的病变。

纤溶酶是纤溶酶原激活系统(PA系统)的关键组分。它是一种广谱的蛋白酶，能够水解细胞外基质(ECM)的几个组分，包括纤维蛋白、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖^[23]。此外，纤溶酶能将一些金属蛋白酶前体(pro-MMPs)激活形成具有活性的金属蛋白酶(MMPs)。因此纤溶酶被认为是胞外蛋白水解作用的一个重要的上游调节物^[24,25]。纤溶酶是由纤溶酶原通过两种生理性的PAs：组织型纤溶酶原激活剂(tPA)或尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)蛋白水解形成的。由于纤溶酶原在血浆和其他体液中相对水平较高，传统上认为PA系统的调节主要通过PAs的合成和活性水平实现。PA 系统组分的合成受不同因素严格调节，如激素、生长因子和细胞因子。此外，还存在纤溶酶和PAs的特定生理抑制剂。纤溶酶的主要抑制剂是α2-抗纤溶酶(α纤溶酶(抑制剂。纤溶酶的主)。PAs的活性同时被uPA和tPA的纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)抑制以及主要抑制uPA的溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)调节。某些细胞表面具有直接水解活性的uPA特异性细胞表面受体(uPAR)^[26,27]。

纤溶酶原是一个单链糖蛋白，由791个氨基酸组成，分子量约为 92kDa^[28,29]。纤溶酶原主要在肝脏合成，大量存在于胞外液中。血浆中纤溶酶原含量约为2μM。因此纤溶酶原是组织和体液中蛋白质水解活性的一个巨大的潜在来源^[30,31]。纤溶酶原存在两种分子形式：谷氨酸-纤溶酶原(Glu-plasminogen)和赖氨酸-纤溶酶原 (Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纤溶酶原具有一个氨基末端(N-末端)谷氨酸，因此被称为谷氨酸-纤溶酶原。然而，在纤溶酶存在时，谷氨酸-纤溶酶原在Lys76-Lys77处水解成为赖氨酸-纤溶酶原。与谷氨酸-纤溶酶原相比，赖氨酸-纤溶酶原与纤维蛋白具有更高的亲和力，并可以更高的速率被PAs激活。这两种形式的纤溶酶原的Arg560-Val561肽键可被uPA或tPA切割，导致二硫键连接的双链蛋白酶纤溶酶的形成^[32]。纤溶酶原的氨基末端部分包含五个同源三环，即所谓的kringles，羧基末端部分包含蛋白酶结构域。一些 kringles含有介导纤溶酶原与纤维蛋白及其抑制剂α2-AP特异性相互作用的赖氨酸结合位点。最新发现一个纤溶酶原为38kDa的片段，其中包括kringles1-4，是血管生成的有效抑制剂。这个片段被命名为血管抑素，可通过几个蛋白酶水解纤溶酶原产生。

纤溶酶的主要底物是纤维蛋白，纤维蛋白的溶解是预防病理性血栓形成的关键^[33]。纤溶酶还具有对ECM几个组分的底物特异性，包括层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖和明胶，表明纤溶酶在ECM重建中也起着重要作用^[29,34,35]。间接地，纤溶酶还可以通过转化某些蛋白酶前体为活性蛋白酶来降解ECM的其他组分，包括MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纤溶酶可能是细胞外蛋白水解的一个重要的上游调节器^[36]。此外，纤溶酶具有激活某些潜在形式的生长因子的能力^[37-39]。在体外，纤溶酶还能水解补体系统的组分并释放趋化补体片段。

“纤溶酶”是存在于血液中的一种非常重要的酶，能将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体。

“纤溶酶原”是纤溶酶的酶原形式，根据swiss prot中的序列，按含有信号肽的天然人源纤溶酶原氨基酸序列(序列4)计算由810 个氨基酸组成，分子量约为90kD，主要在肝脏中合成并能够在血液中循环的糖蛋白，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全长的纤溶酶原包含七个结构域：位于C末端的丝氨酸蛋白酶结构域、 N末端的Pan Apple(PAp)结构域以及5个Kringle结构域(Kringle1-5)。参照swiss prot中的序列，其信号肽包括残基Met1-Gly19，PAp包括残基Glu20-Val98，Kringle1包括残基Cys103-Cys181，Kringle2包括残基Glu184-Cys262，Kringle3包括残基Cys275-Cys352，Kringle4包括残基Cys377-Cys454，Kringle5包括残基Cys481-Cys560。根据NCBI 数据，丝氨酸蛋白酶域包括残基Val581-Arg804。

Glu-纤溶酶原是天然全长的纤溶酶原，由791个氨基酸组成(不含有19个氨基酸的信号肽)，编码该序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在体内，还存在一种是从Glu-纤溶酶原的第76-77位氨基酸处水解从而形成的Lys-纤溶酶原，如序列 6所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。Delta-纤溶酶原(酶原a-氨sminogen)是全长纤溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5 结构的片段，仅含有Kringle1和丝氨酸蛋白酶域^[40,41]，有文献报道了 delta-纤溶酶原的氨基酸序列(序列8)^[41]，编码该氨基酸序列的cDNA 序列如序列7。小纤溶酶原(Mini-plasminogen)由Kringle5和丝氨酸蛋白酶域组成，有文献报道其包括残基Val443-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)^[42]，其氨基酸序列如序列10所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纤溶酶原(Micro-plasminogen)仅含有丝氨酸蛋白酶结构域，有文献报道其氨基酸序列包括残基Ala543-Asn791(以不含有信号肽的 Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)^[43]，也有专利文献 CN102154253A报道其序列包括残基Lys531-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)，本专利序列参考专利文献CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

本发明的“纤溶酶”与“纤维蛋白溶酶”、“纤维蛋白溶解酶”可互换使用，含义相同；“纤溶酶原”与“纤维蛋白溶酶原”、“纤维蛋白溶解酶原”可互换使用，含义相同。

在本申请中，所述纤溶酶原“缺乏”的含义为受试者体内纤溶酶原的含量或活性比正常人低，低至足以影响所述受试者的正常生理功能；所述纤溶酶原“缺失”的含义为受试者体内纤溶酶原的含量或活性显著低于正常人，甚至活性或表达极微，只有通过外源提供才能维持正常生理功能。

本领域技术人员可以理解，本发明纤溶酶原的所有技术方案适用于纤溶酶，因此，本发明描述的技术方案涵盖了纤溶酶原和纤溶酶。

在循环过程中，纤溶酶原采用封闭的非活性构象，但当结合至血栓或细胞表面时，在纤溶酶原激活剂(plasminogen activator，PA)的介导下，其转变为呈开放性构象的活性纤溶酶。具有活性的纤溶酶可进一步将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体，进而溶解血栓。其中纤溶酶原的PAp结构域包含维持纤溶酶原处于非活性封闭构象的重要决定簇，而KR结构域则能够与存在于受体和底物上的赖氨酸残基结合。已知多种能够作为纤溶酶原激活剂的酶，包括：组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、激肽释放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。

“纤溶酶原活性片段”溶是指在纤溶酶原蛋白中，能够与底物中的靶序列结合并发挥蛋白水解功能的活性片段。本发明涉及纤溶酶原的技术方案涵盖了用纤溶酶原活性片段代替纤溶酶原的技术方案。本发明所述的纤溶酶原活性片段为包含纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶域的蛋白质，优选，本发明所述的纤溶酶原活性片段包含序列14、与序列14具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列的蛋白质。因此，本发明所述的纤溶酶原包括含有该纤溶酶原活性片段、并且仍然保持该纤溶酶原活性的蛋白。

目前，对于血液中纤溶酶原及其活性测定方法包括：对组织纤溶酶原激活剂活性的检测(t-PAA)、血浆组织纤溶酶原激活剂抗原的检测(t-PAAg)、对血浆组织纤溶酶原活性的检测(plgA)、血浆组织纤溶酶原抗原的检测(plgAg)、血浆组织纤溶酶原激活剂抑制物活性的检测、血浆组织纤溶酶原激活剂抑制物抗原的检测、血浆纤维蛋白溶酶 -抗纤维蛋白溶酶复合物检测(PAP)。其中最常用的检测方法为发色底物法：向受检血浆中加链激酶(SK)和发色底物，受检血浆中的PLG 在SK的作用下，转变成PLM，后者作用于发色底物，随后用分光光度计测定，吸光度增加与纤溶酶原活性成正比。此外也可采用免疫化学法、凝胶电泳、免疫比浊法、放射免疫扩散法等对血液中的纤溶酶原活性进行测定。

“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物种之间的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也称为直向同源物、垂直同源物。其具体指不同物种中由同一祖先基因进化而来的蛋白或基因。本发明的纤溶酶原包括人的天然纤溶酶原，还包括来源于不同物种的、具有纤溶酶原活性的纤溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代变体”是指其中一个给定的氨基酸残基改变但不改变蛋白质或酶的整体构象和功能，这包括但不限于以相似特性(如酸性，碱性，疏水性，等)的氨基酸取代亲本蛋白质中氨基酸序列中的氨基酸。具有类似性质的氨基酸是众所周知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水性的碱性氨基酸并可以互换。同样，异亮氨酸是疏水氨基酸，则可被亮氨酸，蛋氨酸或缬氨酸替换。因此，相似功能的两个蛋白或氨基酸序列的相似性可能会不同。例如，基于MEGALIGN算法的70％至99％的相似度(同一性)。“保守取代变体”还包括通过BLAST或FASTA算法确定具有60％以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能达75％以上更好，最好能达85％以上，甚至达90％以上为最佳，并且与天然或亲本蛋白质或酶相比具有相同或基本相似的性质或功能。

“分离的”纤溶酶原是指从其天然环境分离和/或回收的纤溶酶原蛋白。在一些实施方案中，所述纤溶酶原会纯化(1)至大于90％、大于95％、或大于98％的纯度(按重量计)，如通过Lowry法所确定的，例如超过99％(按重量计)，(2)至足以通过使用旋转杯序列分析仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至同质性，该同质性是通过使用考马斯蓝或银染在还原性或非还原性条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定的。分离的纤溶酶原也包括通过生物工程技术从重组细胞制备，并通过至少一个纯化步骤分离的纤溶酶原。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码的和非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生化的氨基酸，和具有经修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列(具有或没有N端甲硫氨酸残基)的融合物；等等。

关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。然而，为了本发明的目的，氨基酸序列同一性百分数值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。

在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列 A相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：

分数X/Y乘100

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当领会，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。

如本文中使用的，术语“治疗”和“处理”指获得期望的药理和 /或生理效果。所述效果可以是完全或部分预防疾病或其症状，和/或部分或完全治愈疾病和/或其症状，并且包括：(a)预防疾病在受试者体内发生，所述受试者可以具有疾病的素因，但是尚未诊断为具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滞其形成；和(c)减轻疾病和/或其症状，即引起疾病和/或其症状消退。

术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于鼠(大鼠、小鼠)、非人灵长类、人、犬、猫、有蹄动物(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)等。

“治疗有效量”或“有效量”指在对哺乳动物或其它受试者施用以治疗疾病时足以实现对疾病的所述预防和/或治疗的纤溶酶原的量。“治疗有效量”会根据所使用的纤溶酶原、要治疗的受试者的疾病和 /或其症状的严重程度以及年龄、体重等而变化。

本发明纤溶酶原的制备

纤溶酶原可以从自然界分离并纯化用于进一步的治疗用途，也可以通过标准的化学肽合成技术来合成。当通过化学合成多肽时，可以经液相或固相进行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中将序列的C末端氨基酸附接于不溶性支持物，接着序贯添加序列中剩余的氨基酸)是适合纤溶酶原化学合成的方法。各种形式的SPPS，诸如Fmoc和Boc 可用于合成纤溶酶原。用于固相合成的技术描述于Barany和 Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284页于The Peptides:Analysis, Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in PeptideSynthesis,Part A., Merrifield,等J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963)；Stewart等,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill. (1984)；和Ganesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3-10和Camarero JA等2005Protein PeptLett.12:723-8中。简言之，用其上构建有肽链的功能性单元处理小的不溶性多孔珠。在偶联/去保护的重复循环后，将附接的固相游离N末端胺与单个受N保护的氨基酸单元偶联。然后，将此单元去保护，露出可以与别的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之后将其切掉。

可以使用标准重组方法来生产本发明的纤溶酶原。例如，将编码纤溶酶原的核酸插入表达载体中，使其与表达载体中的调控序列可操作连接。表达调控序列包括但不限于启动子(例如天然关联的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件、和转录终止序列。表达调控可以是载体中的真核启动子系统，所述载体能够转化或转染真核宿主细胞(例如COS或CHO细胞)。一旦将载体掺入合适的宿主中，在适合于核苷酸序列的高水平表达及纤溶酶原的收集和纯化的条件下维持宿主。

合适的表达载体通常在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体含有选择标志物(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)以有助于对外源用期望的DNA序列转化的那些细胞进行检测。

大肠杆菌(Escherichia coli)是可以用于克隆主题抗体编码多核苷酸的原核宿主细胞的例子。适合于使用的其它微生物宿主包括杆菌，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和其他肠杆菌科 (enterobacteriaceae)，诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属 (Serratia)、和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以生成表达载体，其通常会含有与宿主细胞相容的表达控制序列 (例如复制起点)。另外，会存在许多公知的启动子，诸如乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统，beta-内酰胺酶启动子系统，或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常会控制表达，任选在操纵基因序列的情况中，并且具有核糖体结合位点序列等，以启动并完成转录和翻译。

其他微生物，诸如酵母也可用于表达。酵母(例如酿酒酵母(S. cerevisiae))和毕赤酵母(Pichia)是合适的酵母宿主细胞的例子，其中合适的载体根据需要具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。诱导型酵母启动于特别包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C、和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。

在微生物外，哺乳动物细胞(例如在体外细胞培养物中培养的哺乳动物细胞)也可以用于表达并生成本发明的抗-Tau抗体(例如编码主题抗-Tau抗体的多核苷酸)。参见Winnacker,From Genes to Clones, VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、和经转化的B细胞或杂交瘤。用于这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列，如复制起点，启动子和增强子(Queen等,Immunol.Rev.89:49 (1986))，以及必需的加工信息位点，诸如核糖体结合位点，RNA剪接位点，多聚腺苷酸化位点，和转录终止子序列。合适的表达控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等衍生的启动子。参见Co等,J.Immunol.148:1149(1992)。

一旦合成(化学或重组方式)，可以依照本领域的标准规程，包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，高效液相层析(HPLC)，凝胶电泳等来纯化本发明所述的纤溶酶原。该纤溶酶原是基本上纯的，例如至少约80％至85％纯的，至少约85％至90％纯的，至少约90％至95％纯的，或98％至99％纯的或更纯的，例如不含污染物，所述污染物如细胞碎片，除主题抗体以外的大分子，等等。

药物配制剂

可以通过将具有所需纯度的纤溶酶原与可选的药用载体，赋形剂，或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A. ed.(1980))混合形成冻干制剂或水溶液制备治疗配制剂。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkoniumchloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。优选冻干的抗-VEGF抗体配制剂在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作为参考。

本发明的配制剂也可含有需治疗的具体病症所需的一种以上的活性化合物，优选活性互补并且相互之间没有副作用的那些。例如，抗高血压的药物，抗心律失常的药物，治疗糖尿病的药物等。

本发明的纤溶酶原可包裹在通过诸如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊中，例如，可置入在胶质药物传送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)中或置入粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol, A.Ed.(1980)。

用于体内给药的本发明的纤溶酶原必需是无菌的。这可以通过在冷冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。

本发明的纤溶酶原可制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括具有一定形状且含有糖蛋白的固体疏水聚合物半通透基质，例如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)；Langer,Chem. Tech.,12:98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3773919,EP 58,481)，L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等， Biopolymers 22:547(1983))，不可降解的乙烯－乙烯乙酸酯 (ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出处同上)，或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子 100天以上，而一些水凝胶释放蛋白的时间却较短。可以根据相关机理来设计使蛋白稳定的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。

给药和剂量

可以通过不同方式，例如通过静脉内，腹膜内，皮下，颅内，鞘内，动脉内(例如经由颈动脉)，肌内来实现本发明药物组合物的施用。

用于胃肠外施用的制备物包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、或固定油。静脉内媒介物包含液体和营养补充物、电解质补充物，等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体，等等。

医务人员会基于各种临床因素确定剂量方案。如医学领域中公知的，任一患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、施用次数和路径、总体健康、和同时施用的其它药物。本发明包含纤溶酶原的药物组合物的剂量范围可以为例如每天约0.0001至2000mg/kg，或约0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg 等等)受试者体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或50mg/kg体重或在1-50mg/kg的范围，或至少1mg/kg。高于或低于此例示性范围的剂量也涵盖在内，特别是考虑到上述的因素。上述范围中的中间剂量也包含在本发明的范围内。受试者可以每天、隔天、每周或根据通过经验分析确定的任何其它日程表施用此类剂量。例示性的剂量日程表包括连续几天1-10mg/kg。在本发明的药物施用过程中需要实时评估治疗效果和安全性。

制品或药盒

本发明的一个实施方案涉及一种制品或药盒，其包含可用于治疗由糖尿病引起的心血管病及其相关病症的本发明纤溶酶原或纤溶酶。所述制品优选包括一个容器，标签或包装插页。适当的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。所述容器含有组合物，所述组合物可有效治疗本发明的疾病或病症并具有无菌入口(例如所述容器可为静脉内溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射针穿透的塞子的)。所述组合物中至少一种活性剂为纤溶酶原/纤溶酶。所述容器上或所附的标签说明所述组合物用于治疗本发明所述由糖尿病引起的心血管病及其相关病症。所述制品可进一步包含含有可药用缓冲液的第二容器，诸如磷酸盐缓冲的盐水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可进一步包含从商业和使用者角度来看所需的其它物质，包括其它缓冲液，稀释剂，过滤物，针和注射器。此外，所述制品包含带有使用说明的包装插页，包括例如指示所述组合物的使用者将纤溶酶原组合物以及治疗伴随的疾病的其它药物给药患者。

附图简述

图1 26周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量检测结果。结果显示，在注射人源纤溶酶源35 天后，给纤溶酶原组小鼠血清中HDL-C的含量显著高于给溶媒PBS 对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明注射纤溶酶原能促进血清HDL-C含量的升高。

图2 24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量检测结果。结果显示，糖尿病模型小鼠连续注射人源纤溶酶源31天后，给纤溶酶原组小鼠血清中的LDL-C含量低于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原能降低血清中LDL-C的含量。

图3 ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原30天后体重的变化。结果显示，给予纤溶酶原30天后小鼠体重无明显改变，说明给药处理对ApoE动脉粥样硬化模型小鼠的体重无明显影响。

图4 ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原30天后血清总胆固醇的检测结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠总胆固醇浓度明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能降低ApoE动脉粥样硬化模型小鼠血清中总胆固醇的含量。

图5 ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原30天后血清甘油三酯检测结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠甘油三酯浓度明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能降低ApoE动脉粥样硬化模型小鼠血清中甘油三酯的含量。

图6 ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原30天后血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的检测结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠LDL-C浓度明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能降低ApoE动脉粥样硬化模型小鼠血清中LDL-C的含量。

图7 ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原30天后心脏脏器系数统计结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠心脏脏器系数明显低于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原能改善ApoE动脉粥样硬化模型小鼠心脏损伤所致的心脏代偿性肥大。

图8 ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原10天后大体主动脉油红O染色图片。结果显示，给纤溶酶原组小鼠主动脉弓、胸主动脉以及腹主动脉脂质斑块(箭头标识)面积明显小于给溶媒PBS对照组，给溶媒PBS对照组脂质占血管面积比为36.0％，给纤溶酶原组为29.6％。说明纤溶酶原能减少ApoE动脉粥样硬化模型小鼠动脉粥样斑块沉积，促进动脉粥样硬化血管壁损伤的修复。

图9 ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予PBS或纤溶酶原20天后大体主动脉油红O染色图片。结果显示，给纤溶酶原组小鼠主动脉弓、胸主动脉以及腹主动脉脂质斑块(箭头标识)面积明显小于给溶媒 PBS对照组。给溶媒PBS对照组脂质占血管面积比为48.1％，给纤溶酶原组为39.4％。说明纤溶酶原能减少ApoE动脉粥样硬化模型小鼠动脉粥样斑块沉积，促进动脉粥样硬化血管损伤的修复。

图10 ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原30天后肝脏油红O染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组， C为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠肝脏脂肪沉积(箭头标识)明显少于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能改善动脉粥样硬化模型小鼠肝脏脂肪沉积。

图11 ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原30天后主动脉窦油红O染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组小鼠主动脉窦脂肪沉积(箭头标识)明显少于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原能改善脂肪在主动脉窦的沉积。

图12 ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原30天后主动脉瓣HE染色代表性图片。A、C为给溶媒PBS对照组，B、D为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组(图12B、12D)小鼠主动脉瓣斑块沉积(箭头标识)明显少于给溶媒PBS对照组(图12A、12C)，且主动脉瓣膜融合程度前者小于后者。说明纤溶酶原能改善动脉粥样硬化模型小鼠主动脉瓣膜损伤。

图13 ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原30天后主动脉油红O染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示给纤溶酶原组主动脉油红O着色面积(箭头标识)明显小于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原能明显减少动脉粥样硬化模型小鼠主动脉脂质的沉积，改善主动脉内壁的损伤。

图14 ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原30天后心脏 IgM免疫染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组小鼠心脏IgM的阳性表达(箭头标识) 明显少于给溶媒PBS对照组，说明纤溶酶原能促进动脉粥样硬化所致心脏损伤的修复。

图15 ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原30天后心脏天狼星红染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组胶原的沉积(箭头标识)明显少于给溶媒 PBS对照组，说明纤溶酶原能减轻ApoE动脉粥样硬化模型小鼠心脏纤维化。

图16 26周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后心室油红O染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组小鼠心室脂质沉积(箭头标识)明显少于给溶媒 PBS对照组。说明纤溶酶原能够减少糖尿病小鼠心室脂质沉积，促进心室损伤的修复。

图17 ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原30天后主动脉窦天狼星红染色代表性图片。A、C为给溶媒PBS对照组，B、D为给纤溶酶原组。结果显示给纤溶酶原组主动脉窦血管内壁胶原蛋白沉积(箭头标识)的面积明显小于给溶媒PBS对照组，说明纤溶酶原能够消减动脉粥硬化模型小鼠主动脉窦纤维化水平。

图18 24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后主动脉HE染色图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示，给溶媒PBS对照组血管管壁有泡沫细胞沉积(箭头标识)，中层弹性膜排列紊乱，管壁凹凸不均；给纤溶酶原组中层弹性膜结构规则，呈波浪形。表明注射纤溶酶原对糖尿病所致的主动脉损伤具有一定的修复作用。

图19 24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后血清中肌钙蛋白含量检测结果。结果显示，给纤溶酶原组心肌肌钙蛋白I的浓度明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异极显著(**表示P<0.01)。说明纤溶酶原能显著促进糖尿病后期小鼠心肌损伤的修复。

图20 3％胆固醇高脂血症模型小鼠给予纤溶酶原10天和20天后血清高密度脂蛋白胆固醇检测结果。结果显示，给予纤溶酶原后给纤溶酶原组小鼠血清HDL-C浓度明显高于给溶媒PBS对照组，且二者在给药10天和20天后高密度脂蛋白浓度均统计差异极显著(**表示 P<0.01)。说明纤溶酶原能有效提高高脂血症模型小鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇的含量，改善高脂血症模型小鼠血脂紊乱。

图21显示3％胆固醇高脂血症模型小鼠给予纤溶酶原20天动脉粥样硬化指数计算结果。计算结果显示，给纤溶酶原组小鼠动脉粥样硬化指数明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著。说明纤溶酶原能降低高脂血症模型小鼠发生动脉粥样硬化的风险。

图22显示3％胆固醇高脂血症模型小鼠给予纤溶酶原20天心脏风险指数计算结果。结果显示，给纤溶酶原组CRI明显小于给溶媒 PBS对照组，且统计差异极其显著。说明纤溶酶原能有效的降低高脂血症模型小鼠发生心脏疾病的风险。

实施例：

实施例1纤溶酶原升高糖尿病小鼠血清中的高密度脂蛋白胆固醇

26周龄db/db雄性小鼠20只随机分组，给纤溶酶原组11只，给溶媒PBS对照组9只。给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原 2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。连续注射35天后摘眼球采全血，4℃，3500r/min离心10分钟，取上清液进行高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测。高密度脂蛋白胆固醇的检测采用试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号A112-1)，并按照该试剂盒所述方法进行。

检测结果显示，db/db鼠连续注射人源纤溶酶源35天后，给纤溶酶原组小鼠血清中HDL-C的含量高于给溶媒PBS对照组(图1)，且统计差异显著。

糖尿病通常伴有心血管动脉粥样硬化^[45,46]，而高密度脂蛋白是一种抗动脉粥样硬化的血浆脂蛋白，是冠心病的保护因子，俗称“血管清道夫”。该检测结果证明纤溶酶原能提高血清HDL-C的水平，从而有助于改善糖尿病小鼠的动脉粥样硬化。

实施例2纤溶酶原降低糖尿病小鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇

24-25周龄db/db雄性小鼠10只随机分组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组各5只，并取3只db/m作为正常对照组。给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，正常对照组小鼠不作任何处理。开始给药定为第0天，连续注射31天后小鼠摘眼球采全血，4℃，3500r/min离心10 分钟，取上清液进行低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)检测。低密度脂蛋白胆固醇的检测采用试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号 A113-1)，并按照该检测试剂盒所述方法进行。

检测结果显示，db/db小鼠连续注射人源纤溶酶源31天后，给纤溶酶原组小鼠血清中的LDL-C含量低于给溶媒PBS对照组(图2)。

低密度脂蛋白是一种运载胆固醇进入外周组织细胞的脂蛋白颗粒，可被氧化成氧化低密度脂蛋白，当低密度脂蛋白，尤其是氧化修饰的低密度脂蛋白(OX-LDL)过量时，它携带的胆固醇便积存在动脉壁上，引发动脉硬化。因此低密度脂蛋白胆固醇被称为“坏的胆固醇”^[52]。该实验结果证明纤溶酶原能降低血清中低密度脂蛋白胆固醇的含量，从而有利于控制动脉粥样硬化。

实施例3纤溶酶原对ApoE动脉粥样硬化小鼠体重的影响

6周龄雄性ApoE小鼠13只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲， TP2031)16周以诱导动脉粥样硬化模型^[47,48]。成模后的小鼠在给药前三天每只取血50μl以检测总胆固醇(T-CHO)含量，并根据T-CHO 含量随机分为两组，给溶媒PBS对照组7只，给纤溶酶原组6只。开始给药定为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原 1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，给药30天，给药期间继续饲喂高脂高胆固醇饲料。于给药的第1、31 天称量小鼠体重。

结果显示，给予纤溶酶原30天后小鼠体重无明显改变(图3)，说明给药处理对ApoE动脉粥样硬化模型小鼠的体重无明显影响。

实施例4纤溶酶原降低ApoE动脉粥样硬化小鼠血脂含量

6周龄雄性ApoE小鼠13只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲， TP2031)16周以诱导动脉粥样硬化模型^[47,48]。成模后的小鼠在给药前三天每只取血50μl以检测总胆固醇(T-CHO)含量，并根据T-CHO 含量随机分为两组，给溶媒PBS对照组7只，给纤溶酶原组6只。开始给药定为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原 1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。给药30天，给药期间继续饲喂高脂高胆固醇饲料。在第30天小鼠禁食 16小时，第31天摘除眼球取血，离心获得上清，用以检测血清总胆固醇(T-CHO)、血清甘油三酯(TG)和血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C) 含量。

1.血清总胆固醇含量

使用检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号A111-1)、并按照该检测试剂盒所述方法检测血清总胆固醇含量。

检测结果显示，给纤溶酶原组小鼠总胆固醇浓度明显低于给溶媒 PBS对照组，且统计差异显著(图4)。说明纤溶酶原能降低ApoE 动脉粥样硬化模型小鼠血清中总胆固醇的含量。

2.血清甘油三酯含量

使用TG检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号A110-1)、并按照该试剂盒的说明采用COD-PAP法检测血清TG含量。检测结果显示，给纤溶酶原组小鼠TG浓度明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(图5)。

3.血清低密度脂蛋白胆固醇含量

使用低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)按照检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号A113-1)、并按照该试剂盒所述方法检测血清低密度脂蛋白含量。

检测结果显示，给纤溶酶原组小鼠LDL-C浓度明显低于给溶媒 PBS对照组，且统计差异显著(图6)。说明纤溶酶原能降低ApoE 动脉粥样硬化模型小鼠血清中LDL-C的含量，改善动脉粥样硬化。

上述结果证明纤溶酶原能显著降低动脉粥样硬化模型小鼠的血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇含量，改善动脉粥样硬化。同时，通过降低血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的含量，降低动脉粥样硬化并发症，例如动脉粥样硬化性心血管疾病的风险。

实施例5纤溶酶原改善ApoE动脉粥样硬化小鼠心脏代偿性肥大

6周龄雄性ApoE小鼠13只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲， TP2031)16周以诱导动脉粥样硬化模型^[47,48]。成模后的小鼠在给药前三天每只取血50μl以检测总胆固醇(T-CHO)含量，并根据T-CHO 含量随机分为两组，给溶媒PBS对照组7只，给纤溶酶原组6只。开始给药定为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原 1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。给药30天，给药期间继续饲喂高脂高胆固醇饲料。于给药的第31天称重后处死小鼠，取心脏称重，并计算心脏系数。心脏系数(％)＝心脏重量/体重×100。

结果显示，给纤溶酶原组小鼠心脏系数明显低于给溶媒PBS对照组(图7)。说明纤溶酶原能减轻ApoE动脉粥样硬化模型小鼠由于心脏损伤所致的心脏代偿性肥大。

实施例6纤溶酶原改善ApoE动脉粥样硬化小鼠主动脉脂质斑块沉积

6周龄雄性ApoE小鼠13只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲， TP2031)16周以诱导动脉粥样硬化模型^[47,48]。成模后的小鼠在给药前三天每只取血50μl以检测总胆固醇(T-CHO)含量，并根据T-CHO 含量随机分为两组，给溶媒PBS对照组7只，给纤溶酶原组6只。开始给药定为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原 1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。给药10天，给药期间继续饲喂高脂高胆固醇饲料，第11天两组小鼠各随机取一只处死，取主动脉于4％多聚甲醛固定24-48小时，剖开后进行油红O大体染色，主动脉在体式显微镜7倍镜下观察拍照。

油红O染色可显示脂质沉积，反映损伤的严重程度^[49]。染色结果(图8)显示，给纤溶酶原组小鼠主动脉弓、胸主动脉以及腹主动脉脂质斑块(箭头标识)面积明显小于给溶媒PBS对照组，给溶媒PBS 对照组脂质占血管面积比为36.0％，给纤溶酶原组为29.6％。实验证明纤溶酶原能减少ApoE动脉粥样硬化模型小鼠动脉粥样斑块沉积，促进动脉粥样硬化的修复。

实施例7纤溶酶原减少ApoE动脉粥样硬化小鼠主动脉脂质斑块沉积

6周龄雄性ApoE小鼠13只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲， TP2031)16周以诱导动脉粥样硬化模型^[47,48]。成模后的小鼠在给药前三天每只取血50μl以检测总胆固醇(T-CHO)含量，并根据T-CHO 含量随机分为两组，给溶媒PBS对照组7只，给纤溶酶原组6只。开始给药定为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。给药20天，给药期间继续饲喂高脂高胆固醇饲料，第21天两组小鼠各随机取一只处死，取主动脉于4％多聚甲醛固定24-48小时，剖开后进行油红O大体染色，主动脉在体式显微镜7倍镜下观察拍照。

主动脉弓、胸主动脉以及腹主动脉脂质斑块(箭头标识)面积明显小于给溶媒PBS对照组，给溶媒PBS对照组脂质占血管面积比为 48.1％，给纤溶酶原组为39.4％(图9)。说明纤溶酶原能减少ApoE 动脉粥样硬化模型小鼠动脉粥样斑块，促进动脉粥样硬化的修复。

实施例8纤溶酶原改善ApoE动脉粥样硬化小鼠肝脏脂质沉积

6周龄雄性ApoE小鼠13只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲， TP2031)16周以诱导动脉粥样硬化模型^[47,48]。成模后的小鼠在给药前三天每只取血50μl以检测总胆固醇(T-CHO)含量，并根据T-CHO 含量随机分为两组，给溶媒PBS对照组7只，给纤溶酶原组6只。开始给药定为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原 1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。给药30天，给药期间继续饲喂高脂高胆固醇饲料。于第31天处死小鼠，取肝脏于4％多聚甲醛固定24-48小时，分别于15％、30％蔗糖中4℃过夜沉底，OCT包埋，冰冻切片厚度8μm，油红O染色15min，75％酒精分化5秒，苏木素染核30秒，甘油明胶封片。切片在400倍光学显微镜下观察。

染色结果显示，给纤溶酶原组(图10B)小鼠肝脏脂肪沉积(箭头标识)明显少于给溶媒PBS对照组(图10A)，且定量分析统计差异显著(图10C)。说明纤溶酶原可改善ApoE动脉粥样硬化小鼠肝脏脂肪沉积。

实施例9纤溶酶原改善ApoE动脉粥样硬化小鼠主动脉窦脂质沉积

6周龄雄性ApoE小鼠13只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲， TP2031)16周以诱导动脉粥样硬化模型^[47,48]。成模后的小鼠在给药前三天每只取血50μl以检测总胆固醇(T-CHO)含量，并根据T-CHO 含量随机分为两组，给溶媒PBS对照组7只，给纤溶酶原组6只。开始给药定为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原 1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。给药30天，并于第31天处死小鼠，取心脏于4％多聚甲醛固定24-48 小时，分别于15％、30％蔗糖中4℃过夜沉底，OCT包埋，冰冻切片厚度8μm，油红O染色15min，75％酒精分化5秒，苏木素染核30 秒，甘油明胶封片。切片在200倍光学显微镜下观察。

结果显示，给纤溶酶原组(图11B)小鼠主动脉窦脂肪沉积(箭头标识)明显少于给溶媒PBS对照组(图11A)。说明纤溶酶原可改善动脉粥样硬化中主动脉窦脂肪沉积。

实施例10纤溶酶原改善ApoE动脉粥样硬化小鼠主动脉窦损伤

6周龄雄性ApoE小鼠13只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲， TP2031)16周以诱导动脉粥样硬化模型^[47,48]。成模后的小鼠在给药前三天每只取血50μl以检测总胆固醇(T-CHO)含量，并根据T-CHO 含量随机分为两组，给溶媒PBS对照组7只，给纤溶酶原组6只。开始给药定为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原 1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。给药30天，给药期间继续饲喂高脂高胆固醇饲料。于第31天处死小鼠，取心脏于4％多聚甲醛固定24-48小时。固定后的组织样本经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。主动脉窦组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水并用苏木素和伊红染色(HE染色)，1％盐酸酒精分化后氨水返蓝并酒精梯度脱水封片，切片分别在在40倍(图12A和12B) 和200倍(图12C和12D)光学显微镜下观察。

染色结果显示，给纤溶酶原组(图12B、12D)小鼠主动脉窦脂质斑块沉积(箭头标识)明显少于给溶媒PBS对照组(图12A、12C)，且主动脉瓣膜融合程度前者小于后者。说明纤溶酶原能改善动脉粥样硬化中主动脉瓣膜损伤。

实施例11纤溶酶原降低ApoE动脉粥样硬化小鼠主动脉脂质沉积

6周龄雄性ApoE小鼠13只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲， TP2031)16周以诱导动脉粥样硬化模型^[47,48]。成模后的小鼠在给药前三天每只取血50μl在以检测总胆固醇(T-CHO)含量，并根据 T-CHO含量随机分为两组，给溶媒PBS对照组7只，给纤溶酶原组 6只。开始给药定为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。给药30天，给药期间继续饲喂高脂高胆固醇饲料。于第31天处死小鼠，取主动脉于4％多聚甲醛固定24-48小时，分别于15％、30％蔗糖中4℃过夜沉底，OCT包埋，冰冻切片厚度8μm，油红O染色15min， 75％酒精分化5秒，苏木素染核30秒，甘油明胶封片。切片在200 倍光学显微镜下观察。

染色结果显示，给纤溶酶原组(图13B)主动脉油红O染色沉积 (箭头标识)面积明显小于给溶媒PBS对照组(图13A)。说明纤溶酶原能够明显降低ApoE动脉粥样硬化模型小鼠主动脉脂质在血管内壁的沉积，改善主动脉的损伤。

实施例12纤溶酶原改善ApoE动脉粥样硬化小鼠心脏损伤

6周龄雄性ApoE小鼠13只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲， TP2031)16周以诱导动脉粥样硬化模型^[47,48]。成模后的小鼠在给药前三天每只取血50μl以检测总胆固醇(T-CHO)含量，并根据T-CHO 含量随机分为两组，给溶媒PBS对照组7只，给纤溶酶原组6只。开始给药定为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原 1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。给药30天，给药期间继续饲喂高脂高胆固醇饲料。于第31天处死小鼠，取心脏于4％多聚甲醛固定24-48小时。固定后的组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS 洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA) 封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加山羊抗鼠IgM(HRP)抗体(Abcam)，室温孵育1小时，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水、二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。IgM抗体在清除凋亡和坏死细胞过程中发挥着重要作用，组织器官损伤局部IgM抗体的水平与损伤程度呈正相关^[50,51]。因此，检测组织器官局部IgM抗体的水平能够反映该组织器官的损伤情况。实验发现，给纤溶酶原组小鼠(图 14B)心脏IgM的阳性表达明显少于给溶媒PBS对照组(图14A)。说明纤溶酶原能够明显改善ApoE小鼠心肌损伤。

实施例13纤溶酶原降低ApoE动脉粥样硬化小鼠心脏纤维化水平

6周龄雄性ApoE小鼠13只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲， TP2031)16周以诱导动脉粥样硬化模型^[47,48]。成模后的小鼠在给药前三天每只取血50μl以检测总胆固醇(T-CHO)含量，并根据T-CHO 含量随机分为两组，给溶媒PBS对照组7只，给纤溶酶原组6只。开始给药定为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原 1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。给药30天，给药期间继续饲喂高脂高胆固醇饲料。于第31天处死小鼠，取材心脏于4％多聚甲醛固定24-48小时。固定后的组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次，以0.1％天狼星红饱和苦味酸染色30分钟后，流水冲洗2min，苏木素染色1分钟，流水冲洗，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，流水冲洗，烘干后中性树胶封片，在200倍光学显微镜下观察。

天狼星红染色可使胶原持久染色，是对病理切片中胶原组织的特殊染色方法，以特异显示胶原组织。

染色结果显示，给纤溶酶原组(图15B)胶原的沉积(箭头标识) 明显少于给溶媒PBS对照组(图15A)，说明纤溶酶原能降低ApoE 动脉粥样硬化模型小鼠心脏组织中胶原的沉积，降低心脏纤维化。

实施例14纤溶酶原降低糖尿病小鼠心室脂质沉积

糖尿病通常伴有心血管动脉粥样硬化^[45,46]。心血管动脉粥样硬化可导致心肌细胞的缺血损伤。油红O染色可显示脂质沉积，反映损伤的严重程度^[49]。

26周龄db/db雄性小鼠9只，随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只。给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，给药35天。于第36天处死小鼠，取心脏于4％多聚甲醛固定24-48小时，分别于15％、30％蔗糖中4℃过夜沉底，OCT包埋，冰冻切片厚度8μm，油红O染色15min，75％酒精分化5秒，苏木素染核30秒，甘油明胶封片。切片在400倍光学显微镜下观察。

结果显示，给纤溶酶原组小鼠(图16B)心室脂质沉积(箭头标识)明显少于给溶媒PBS对照组(图16A)。说明纤溶酶原能够减少糖尿病小鼠心室脂质沉积，促进心室损伤的修复。

实施例15纤溶酶原改善ApoE动脉粥样硬化小鼠主动脉窦纤维化

6周龄雄性ApoE小鼠13只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲， TP2031)16周以诱导动脉粥样硬化模型^[31,32]。成模后的小鼠在给药前三天每只取血50μl以检测总胆固醇(T-CHO)含量，并根据T-CHO 含量随机分为两组，给溶媒PBS对照组7只，给纤溶酶原组6只。开始给药定为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原 1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。给药30天，并于第31天处死小鼠，取心脏于4％多聚甲醛固定24-48 小时，分别于15％、30％蔗糖中4℃过夜沉底，OCT包埋，冰冻切片厚度8μm，以0.1％天狼星红饱和苦味酸染色30分钟后，流水冲洗 2min，苏木素染色1分钟，流水冲洗，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，流水冲洗，烘干后中性树胶封片，在40光学显微镜下观察，图17C、 17D分别为图17A、17B黑框区域放大图片。

结果显示给纤溶酶原组(图17B、17D)胶原蛋白沉积(箭头标识)的面积明显小于给溶媒PBS对照组(图17A、17C)，说明纤溶酶原能够消减动脉粥硬化模型小鼠主动脉窦纤维化水平。

实施例16纤溶酶原对糖尿病小鼠主动脉内壁损伤的保护作用

24-25周龄db/db雄性小鼠10只，实验开始当天记为第0天并称重,根据体重随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各5 只。第1天开始给纤溶酶原或PBS(PBS为磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffer Saline)，本文中为纤溶酶原的溶媒)，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2ml/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组以相同方式给予相同体积的PBS。在第32天处死小鼠并取主动脉在10％中性福尔马林固定液中固定24小时。固定后的组织样本经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水并用苏木素和伊红染色(HE染色)，1％盐酸酒精分化后氨水返蓝并酒精梯度脱水封片，切片在400倍光学显微镜下观察。

HE染色结果显示，给溶媒PBS对照组血管管壁有泡沫细胞沉积 (箭头标识)，中层弹性膜排列紊乱，管壁凹凸不均(图18A)；给纤溶酶原组中层弹性膜结构规则，呈波浪形(图18B)。表明注射纤溶酶原对糖尿病所致的主动脉管内壁的损伤具有一定的修复作用。

实施例17纤溶酶原对糖尿病小鼠心肌损伤的保护作用

糖尿病通常伴有心血管动脉粥样硬化^[45,46]。心血管动脉粥样硬化可导致心肌细胞的缺血损伤。心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,CTNI) 是心肌损伤的重要标志物，其血清浓度能够反映心肌损伤的程度^[44]。本实验通过检测心肌肌钙蛋白I观察纤溶酶原对心肌损伤的修复作用。

24-25周龄db/db雄性小鼠28只，随机分为两组，给溶媒PBS 对照组12只，给纤溶酶原组16只。实验开始当天记为第0天并称重分组，第1天开始给纤溶酶原或PBS，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2ml/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组尾静脉注射给予相同体积的PBS。第32天摘除眼球取血，以3500 r/min离心15-20分钟，并取上清检测进行心肌肌钙蛋白I的浓度测定。结果显示，给纤溶酶原组心肌肌钙蛋白I的浓度明显低于给溶媒PBS 对照组，且统计差异极为显著(图19)。说明纤溶酶原能显著促进糖尿病小鼠心血管动脉粥样硬化所致的心肌损伤的修复。

实施例18纤溶酶原提高3％胆固醇高脂血症模型小鼠血清高密度脂蛋白胆固醇浓度

9周龄雄性C57小鼠16只饲喂3％胆固醇高脂饲料(南通特洛菲)4 周，诱导高脂血症^[52,53]，此模型定为3％胆固醇高脂血症模型。成模后的小鼠继续饲喂3％胆固醇高脂饲料。在给药前三天每只小鼠取血 50μL，检测总胆固醇，并根据总胆固醇浓度和体重随机分为两组，每组各8只。开始给药记为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的 PBS，给药20天。在第10、20天小鼠禁食16小时，第11、21天扎眼眶静脉丛取血50μl，离心获得上清，用以检测血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。本文中高密度脂蛋白胆固醇含量通过检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号A112-1)所述方法检测。

检测结果显示，给纤溶酶原组小鼠血清HDL-C浓度明显高于给溶媒PBS对照组，且二者在给药10、20天后HDL-C浓度均有统计学差异(图20)。说明纤溶酶原能提高高脂血症模型小鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇的含量，改善高脂血症小鼠血脂紊乱。

实施例19纤溶酶原降低3％胆固醇高脂血症模型小鼠动脉粥样硬化形成的风险

9周龄雄性C57小鼠16只饲喂3％胆固醇高脂饲料(南通特洛菲)4 周，诱导高脂血症[52,53]，此模型定为3％胆固醇高脂血症模型。成模后的小鼠继续饲喂3％胆固醇高脂饲料。在给药前三天每只小鼠取血50μl，检测总胆固醇(T-CHO)，并根据总胆固醇浓度和体重随机分为两组，每组各8只。开始给药记为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。在第20天给药后小鼠开始禁食，禁食16小时，第21天扎眼眶静脉丛取血50μL，离心获得上清，总胆固醇含量采用总胆固醇检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号A111-1)进行检测；高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量采用高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号A112-1)进行检测。

动脉粥样硬化指数，是临床上预测动脉粥样硬化的综合指标，认为它在用作对冠心病风险程度的估计方面临床意义比单项的总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白更大[54]。动脉粥样硬化指数＝(T-CHO-HDL-C)/HDL-C。

计算结果显示，给纤溶酶原组小鼠动脉粥样硬化指数明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(图21)。说明纤溶酶原能降低高脂血症模型小鼠发生动脉粥样硬化的风险。

实施例20纤溶酶原降低3％胆固醇高脂血症模型小鼠心脏发病风险

9周龄雄性C57小鼠16只饲喂3％胆固醇高脂饲料(南通特洛菲)4 周，诱导高脂血症[52,53]，此模型定为3％胆固醇高脂血症模型。成模后的小鼠继续饲喂3％胆固醇高脂饲料。在给药前三天每只小鼠取血50μl，检测总胆固醇(T-CHO)，并根据总胆固醇浓度随机分为两组，每组各8只。开始给药记为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。在第20天给药后小鼠开始禁食，禁食16小时，第 21天扎眼眶静脉丛取血50μL，离心获得上清，总胆固醇含量采用总胆固醇检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号A111-1)进行检测；高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量采用高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号A112-1)进行检测。心脏危险指数＝T-CHO/HDL。

心脏危险指数(cardiac risk index，CRI)用以评估血脂紊乱诱发心脏疾病的风险[54]。

结果显示，给纤溶酶原组CRI明显小于给溶媒PBS对照组，且统计差异极其显著(图22)。说明纤溶酶原能有效的降低高脂血症模型小鼠发生心脏疾病的风险。

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序列表

<110> 深圳瑞健生命科学研究院有限公司

<120> 一种治疗动脉粥样硬化及其并发症的方法

<130> PDK03571

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2376

<212> DNA

<213> 不含有信号肽的天然纤溶酶原(Glu-PLG，Glu-纤维蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 1

gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60

cagctgggag caggaagtat agaagaatgt gcagcaaaat gtgaggagga cgaagaattc 120

acctgcaggg cattccaata tcacagtaaa gagcaacaat gtgtgataat ggctgaaaac 180

aggaagtcct ccataatcat taggatgaga gatgtagttt tatttgaaaa gaaagtgtat 240

ctctcagagt gcaagactgg gaatggaaag aactacagag ggacgatgtc caaaacaaaa 300

aatggcatca cctgtcaaaa atggagttcc acttctcccc acagacctag attctcacct 360

gctacacacc cctcagaggg actggaggag aactactgca ggaatccaga caacgatccg 420

caggggccct ggtgctatac tactgatcca gaaaagagat atgactactg cgacattctt 480

gagtgtgaag aggaatgtat gcattgcagt ggagaaaact atgacggcaa aatttccaag 540

accatgtctg gactggaatg ccaggcctgg gactctcaga gcccacacgc tcatggatac 600

attccttcca aatttccaaa caagaacctg aagaagaatt actgtcgtaa ccccgatagg 660

gagctgcggc cttggtgttt caccaccgac cccaacaagc gctgggaact ttgtgacatc 720

ccccgctgca caacacctcc accatcttct ggtcccacct accagtgtct gaagggaaca 780

ggtgaaaact atcgcgggaa tgtggctgtt accgtgtccg ggcacacctg tcagcactgg 840

agtgcacaga cccctcacac acataacagg acaccagaaa acttcccctg caaaaatttg 900

gatgaaaact actgccgcaa tcctgacgga aaaagggccc catggtgcca tacaaccaac 960

agccaagtgc ggtgggagta ctgtaagata ccgtcctgtg actcctcccc agtatccacg 1020

gaacaattgg ctcccacagc accacctgag ctaacccctg tggtccagga ctgctaccat 1080

ggtgatggac agagctaccg aggcacatcc tccaccacca ccacaggaaa gaagtgtcag 1140

tcttggtcat ctatgacacc acaccggcac cagaagaccc cagaaaacta cccaaatgct 1200

ggcctgacaa tgaactactg caggaatcca gatgccgata aaggcccctg gtgttttacc 1260

acagacccca gcgtcaggtg ggagtactgc aacctgaaaa aatgctcagg aacagaagcg 1320

agtgttgtag cacctccgcc tgttgtcctg cttccagatg tagagactcc ttccgaagaa 1380

gactgtatgt ttgggaatgg gaaaggatac cgaggcaaga gggcgaccac tgttactggg 1440

acgccatgcc aggactgggc tgcccaggag ccccatagac acagcatttt cactccagag 1500

acaaatccac gggcgggtct ggaaaaaaat tactgccgta accctgatgg tgatgtaggt 1560

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tgtgcggccc cttcatttga ttgtgggaag cctcaagtgg agccgaagaa atgtcctgga 1680

agggttgtag gggggtgtgt ggcccaccca cattcctggc cctggcaagt cagtcttaga 1740

acaaggtttg gaatgcactt ctgtggaggc accttgatat ccccagagtg ggtgttgact 1800

gctgcccact gcttggagaa gtccccaagg ccttcatcct acaaggtcat cctgggtgca 1860

caccaagaag tgaatctcga accgcatgtt caggaaatag aagtgtctag gctgttcttg 1920

gagcccacac gaaaagatat tgccttgcta aagctaagca gtcctgccgt catcactgac 1980

aaagtaatcc cagcttgtct gccatcccca aattatgtgg tcgctgaccg gaccgaatgt 2040

ttcatcactg gctggggaga aacccaaggt acttttggag ctggccttct caaggaagcc 2100

cagctccctg tgattgagaa taaagtgtgc aatcgctatg agtttctgaa tggaagagtc 2160

caatccaccg aactctgtgc tgggcatttg gccggaggca ctgacagttg ccagggtgac 2220

agtggaggtc ctctggtttg cttcgagaag gacaaataca ttttacaagg agtcacttct 2280

tggggtcttg gctgtgcacg ccccaataag cctggtgtct atgttcgtgt ttcaaggttt 2340

gttacttgga ttgagggagt gatgagaaat aattaa 2376

<210> 2

<211> 791

<212> PRT

<213> 不含有信号肽的天然纤溶酶原(Glu-PLG，Glu-纤维蛋白溶酶原)氨基酸序列

<400> 2

Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser

1 5 10 15

Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala

20 25 30

Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His

35 40 45

Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser

50 55 60

Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met

85 90 95

Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser

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<212> DNA

<213> 含有信号肽的天然纤溶酶原（来源于swiss prot）的核酸序列

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<213> 含有信号肽的天然纤溶酶原（来源于swiss prot）的氨基酸序列

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100 105 110

Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser

115 120 125

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130 135 140

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180 185 190

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<213> delta-plg（delta-纤溶酶原）氨基酸序列

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Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser

1 5 10 15

Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala

20 25 30

Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His

35 40 45

Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser

50 55 60

Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met

85 90 95

Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser

100 105 110

Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu

115 120 125

Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp

130 135 140

Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu

145 150 155 160

Glu Cys Glu Glu Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val

165 170 175

Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His

180 185 190

Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met

195 200 205

His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala

210 215 220

Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile

225 230 235 240

Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile

245 250 255

Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu

260 265 270

Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala

275 280 285

Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe

290 295 300

Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu

305 310 315 320

Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr

325 330 335

Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His

340 345 350

Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu

355 360 365

Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp

370 375 380

Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val

385 390 395 400

Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

405 410

<210> 9

<211> 1104

<212> DNA

<213> Mini-plg（小纤维蛋白溶酶原）核酸序列

<400> 9

gtcaggtggg agtactgcaa cctgaaaaaa tgctcaggaa cagaagcgag tgttgtagca 60

cctccgcctg ttgtcctgct tccagatgta gagactcctt ccgaagaaga ctgtatgttt 120

gggaatggga aaggataccg aggcaagagg gcgaccactg ttactgggac gccatgccag 180

gactgggctg cccaggagcc ccatagacac agcattttca ctccagagac aaatccacgg 240

gcgggtctgg aaaaaaatta ctgccgtaac cctgatggtg atgtaggtgg tccctggtgc 300

tacacgacaa atccaagaaa actttacgac tactgtgatg tccctcagtg tgcggcccct 360

tcatttgatt gtgggaagcc tcaagtggag ccgaagaaat gtcctggaag ggttgtaggg 420

gggtgtgtgg cccacccaca ttcctggccc tggcaagtca gtcttagaac aaggtttgga 480

atgcacttct gtggaggcac cttgatatcc ccagagtggg tgttgactgc tgcccactgc 540

ttggagaagt ccccaaggcc ttcatcctac aaggtcatcc tgggtgcaca ccaagaagtg 600

aatctcgaac cgcatgttca ggaaatagaa gtgtctaggc tgttcttgga gcccacacga 660

aaagatattg ccttgctaaa gctaagcagt cctgccgtca tcactgacaa agtaatccca 720

gcttgtctgc catccccaaa ttatgtggtc gctgaccgga ccgaatgttt catcactggc 780

tggggagaaa cccaaggtac ttttggagct ggccttctca aggaagccca gctccctgtg 840

attgagaata aagtgtgcaa tcgctatgag tttctgaatg gaagagtcca atccaccgaa 900

ctctgtgctg ggcatttggc cggaggcact gacagttgcc agggtgacag tggaggtcct 960

ctggtttgct tcgagaagga caaatacatt ttacaaggag tcacttcttg gggtcttggc 1020

tgtgcacgcc ccaataagcc tggtgtctat gttcgtgttt caaggtttgt tacttggatt 1080

gagggagtga tgagaaataa ttaa 1104

<210> 10

<211> 367

<212> PRT

<213> Mini-plg（小纤维蛋白溶酶原）氨基酸序列

<400> 10

Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala

1 5 10 15

Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr

20 25 30

Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly

35 40 45

Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala

50 55 60

Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg

65 70 75 80

Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly

85 90 95

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys

100 105 110

Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln

115 120 125

Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala

130 135 140

His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly

145 150 155 160

Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr

165 170 175

Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val

180 185 190

Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu

195 200 205

Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala

210 215 220

Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro

225 230 235 240

Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys

245 250 255

Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu

260 265 270

Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg

275 280 285

Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly

290 295 300

His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

305 310 315 320

Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser

325 330 335

Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg

340 345 350

Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

355 360 365

<210> 11

<211> 750

<212> DNA

<213> Micro-plg（微纤维蛋白溶酶原）核酸序列

<400> 11

gccccttcat ttgattgtgg gaagcctcaa gtggagccga agaaatgtcc tggaagggtt 60

gtaggggggt gtgtggccca cccacattcc tggccctggc aagtcagtct tagaacaagg 120

tttggaatgc acttctgtgg aggcaccttg atatccccag agtgggtgtt gactgctgcc 180

cactgcttgg agaagtcccc aaggccttca tcctacaagg tcatcctggg tgcacaccaa 240

gaagtgaatc tcgaaccgca tgttcaggaa atagaagtgt ctaggctgtt cttggagccc 300

acacgaaaag atattgcctt gctaaagcta agcagtcctg ccgtcatcac tgacaaagta 360

atcccagctt gtctgccatc cccaaattat gtggtcgctg accggaccga atgtttcatc 420

actggctggg gagaaaccca aggtactttt ggagctggcc ttctcaagga agcccagctc 480

cctgtgattg agaataaagt gtgcaatcgc tatgagtttc tgaatggaag agtccaatcc 540

accgaactct gtgctgggca tttggccgga ggcactgaca gttgccaggg tgacagtgga 600

ggtcctctgg tttgcttcga gaaggacaaa tacattttac aaggagtcac ttcttggggt 660

cttggctgtg cacgccccaa taagcctggt gtctatgttc gtgtttcaag gtttgttact 720

tggattgagg gagtgatgag aaataattaa 750

<210> 12

<211> 249

<212> PRT

<213> Micro-plg（微纤维蛋白溶酶原）氨基酸序列

<400> 12

Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys

1 5 10 15

Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro

20 25 30

Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly

35 40 45

Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu

50 55 60

Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln

65 70 75 80

Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu

85 90 95

Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser

100 105 110

Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro

115 120 125

Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly

130 135 140

Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu

145 150 155 160

Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly

165 170 175

Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr

180 185 190

Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys

195 200 205

Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala

210 215 220

Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr

225 230 235 240

Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

245

<210> 13

<211> 684

<212> DNA

<213> 丝氨酸蛋白酶（结构）域的核酸序列

<400> 13

gttgtagggg ggtgtgtggc ccacccacat tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 60

aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 120

gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 180

caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 240

cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 300

gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 360

atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 420

ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 480

tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 540

ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 600

ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 660

acttggattg agggagtgat gaga 684

<210> 14

<211> 228

<212> PRT

<213> 丝氨酸蛋白酶（结构）域的氨基酸序列

<400> 14

Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile

20 25 30

Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro

35 40 45

Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn

50 55 60

Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu

65 70 75 80

Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val

85 90 95

Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val

100 105 110

Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln

115 120 125

Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile

130 135 140

Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln

145 150 155 160

Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys

165 170 175

Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr

180 185 190

Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn

195 200 205

Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu

210 215 220

Gly Val Met Arg

225

Claims (10)

1.一种用于治疗受试者动脉粥样硬化及其相关病症的方法，包括给药受试者预防和/或治疗有效量的纤溶酶原，所述受试者患有或怀疑患有动脉粥样硬化及其相关病症。

2.权利要求1的方法，其中所述动脉粥样硬化包括主动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化、脑动脉粥样硬化、肝动脉粥样硬化、肾动脉粥样硬化、肠系膜动脉粥样硬化、下肢动脉粥样硬化、颈动脉粥样硬化。

3.权利要求1的方法，其中所述动脉粥样硬化相关病症包括由于动脉粥样硬化导致组织、器官缺血而引发的相关病症，包括冠状动脉粥样硬化引发的冠心病、心绞痛、心肌梗死、心律失常、心衰；脑动脉粥样硬化引起的脑缺血、脑血栓、脑萎缩、脑出血、脑栓塞；肾动脉粥样硬化引发的肾功能不全、高血压、肾小球纤维化、肾衰、尿毒症；肠系膜动脉粥样硬化引发的饱餐后腹痛、消化不良、便秘、肠壁坏死、便血；下肢动脉粥样硬化引发的间歇性跛行、坏疽。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述动脉粥样硬化选自：冠状动脉粥样硬化、主动脉粥样硬化、脑动脉粥样硬化和肾动脉粥样硬化。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述动脉粥样硬化为与糖尿病并发的动脉粥样硬化。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述纤溶酶原通过选自如下的一项或多项预防和/或治疗动脉粥样硬化；降低受试者血清总胆固醇水平、降低受试者血清甘油三酯水平、降低受试者血清低密度脂蛋白水平、升高受试者血清高密度脂蛋白水平。

7.权利要求1-5任一项的方法，其中所述纤溶酶原通过降低受试者动脉管壁的脂质沉积预防和/或治疗动脉粥样硬化。

8.权利要求1-5任一项的方法，其中所述纤溶酶原通过选自如下的一项或多项预防和/或治疗动脉粥样硬化：促进肝脏的脂肪代谢、促进肝脏的脂肪运输和降低受试者肝脏的脂肪沉积。

9.一种预防和/或治疗受试者由于动脉粥样硬化所致的组织、器官缺血损伤及其相关病症的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

10.权利要求9的方法，其中所述受试者的组织、器官缺血损伤为冠状动脉粥样硬化导致的心肌损伤。