TW202128730A - 寡胜肽,其檢測套組,其醫藥組合物與醫藥組合物的用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種寡胜肽。所述寡胜肽包含與SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4之全長胺基酸序列中至少一者具有至少50%之一致性的胺基酸序列。本發明更關於一種包含前述寡胜肽的檢測套組和一種包含前述寡胜肽的醫藥組合物。藉此,本發明在相關技術領域中具有應用的潛力。
Description
本發明是關於一種寡胜肽、一種醫藥檢測套組與一種醫藥組合物。更具體地說,本發明是關於一種對膠原蛋白XII具有專一性之寡胜肽、其檢測套組及其醫藥組合物。
由於關節軟骨缺乏自我修復的能力,尤其是對於60歲以上的人們而言,骨關節炎 (OA)的發病率正持續增加。使用消炎藥物進行治療、於關節腔中注射潤滑性補充劑以及微骨折手術、馬賽克鑲嵌手術等外科手術方法為現行之骨關節炎治療方法,但其只能緩解症狀,且目前沒有用於骨關節炎的疾病緩解性藥物。使用自體軟骨細胞移植之基於細胞的療法僅可有效治療局部性的關節軟骨缺損。尤其是對於大病灶而言,移植幹細胞或祖細胞已成為治療骨關節炎和骨軟骨缺損中軟骨細胞的替代品。
具有自我更新和多能分化能力的間質幹細胞 (MSC)不僅可用於修復間葉組織,還可應用於軟骨和骨骼的組織工程中。於關節內注射間質幹細胞的長期安全性已由41名膝部骨關節炎患者中得到證實。再者,間質幹細胞移植以治療骨關節炎的臨床療效和安全性已通過11項合格試驗與582名膝部骨關節炎患者的薈萃分析而證明。
一項為期兩年之關於在關節中注射間質幹細胞以治療膝部骨關節炎療效的隨訪研究表明對低劑量和中劑量治療之臨床與結構結果的耐用性存在潛在的擔憂,這說明進一步研究的必要性。以透明質酸 (HA)作為載體之間質幹細胞用於關節腔內注射以治療前交叉韌帶 (ACL)橫斷所誘導的骨關節炎相較於單獨注射透明質酸表現出優異的效果。前項研究和其他研究表明,間質幹細胞與滑膜、半月板及韌帶組織的非特異性結合,突顯了開發增強向受損關節軟骨局部遞送細胞之方法的重要性。然而,甚少有研究著重於前述之問題。磁性標記的間質幹細胞已應用於修復關節軟骨。儘管使用磁性顆粒標記的間質幹細胞在軟骨分化過程中沒有表現出惡化情形,但仍存在組織對鐵質吸收的擔憂。
在當前的研究中,我們透過使用人體之骨關節炎樣本對噬菌體展示胜肽庫進行生物淘選來鑑定靶向骨關節的胜肽。靶向骨關節炎的胜肽將診斷劑、潤滑補助品和間質幹細胞遞送至關節表面中的應用更進一步以酶誘導的大鼠骨關節炎模型和前交叉韌帶橫斷的豬骨關節炎模型來進行研究。
根據本發明之一態樣是一種寡胜肽,包含一胺基酸序列,所述胺基酸序列與SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4之全長胺基酸序列中至少一者具有至少50%之一致性。
根據本發明之另一態樣是一種檢測套組,包含前述態樣之寡胜肽。
根據本發明之又一態樣是一種醫藥組合物,包含前述態樣之寡胜肽以及一治療分子或一幹細胞,所述治療分子或幹細胞與寡胜肽結合。
根據本發明之再一態樣是一種前述態樣之醫藥組合物用以製備一治療骨關節炎之藥物的用途。
以下將藉由下述之特定實施方式而更詳細討論本發明,以幫助本領域技術人員在無需過度解釋和過度實驗下完全利用和實踐本發明。然而,這些實際細節是用於描述如何實現本發明的材料和方法,並且不是必需的。
一、結果
<鑑定靶向骨關節炎的胜肽>
使用噬菌體展示胜肽庫,我們從接受全膝關節置換之患者的膝關節所切除的軟骨下骨來探測骨關節炎關節軟骨。骨關節炎軟骨標本將被均質化以獲取組織裂解物或切成大小為5 mm×5 mm的正方形組織塊。透過五輪與組織裂解物和組織碎片結合的噬菌體展示胜肽 (生物淘選)篩選,噬菌體的結合效價分別顯著提高至388倍與864倍。從第五輪生物淘選中收集的噬菌體殖株進一步進行ELISA篩選,而和組織裂解物或片段具有高親和力的殖株將被選擇、定序和比對。最後,我們確定了五組具有獨特保留性模體的靶向噬菌體。噬菌體殖株的結合能力透過對人類軟骨細胞株hPi-GL10進行免疫細胞螢光染色而獲得驗證。所有以M13-PE (與螢光染料偶聯的抗體)標記之已鑑定的噬菌體殖株皆以劑量依賴性方式與hPi-GL結合。值得注意的是,C5-24和C5-91胜肽在hPi-GL中表現出特異性和顯著的結合情況。為了查找特異性結合於骨關節炎軟骨但非與滑膜和半月板等其他軟組織有特異性結合的噬菌體殖株,人體骨關節炎的組織切片進一步使用以山葵過氧化酶 (HRP)標記的噬菌體殖株進行免疫染色,然後對沉澱的3,3-二氨基聯苯胺 (DAB)強度 (-至+++)進行半定量。具體而言,C5-24胜肽 (如SEQ ID NO. 1之胺基酸序列所示)和C5-91胜肽 (如SEQ ID NO. 2之胺基酸序列所示)對軟骨呈現優異的結合活性,但是對半月板和滑膜並沒有結合活性。再者,C5-24胜肽表現出靶向骨關節炎軟骨的胞區質區域的最佳特異性,進而被選擇使用於後續的研究中。
<靶向骨關節炎的活體成像>
為了證明C5-24胜肽對於骨關節炎的靶向活性,以羅丹明標記的C5-24胜肽和加擾胜肽分別注入大鼠骨關節炎模型的關節中並以雙-12光子顯微鏡觀察螢光和二次諧波產生 (SHG)信號。加擾胜肽包含與原始胜肽相同的所有胺基酸,但以新的順序隨機排列。表面渲染的3D重建影像和軟骨的橫向複合影像顯示,稀疏的紅點隨機出現於C5-24胜肽注射的對照軟骨、加擾胜肽注射的對照軟骨和加擾胜肽注射的骨關節炎軟骨中。相反地,在注射C5-24胜肽的骨關節炎軟骨中觀察到諸多的紅點。當以SHG探查第II型膠原蛋白時,紅點係位於無信號SHG的區域 (第1a圖),即對應骨關節炎軟骨的胞區質區域。從z軸平面可以確定C5-24胜肽在骨關節炎軟骨中的深度至少達到50 μm (第1a圖)。此外,所有切片中的總螢光胜肽結合面積 (第1b圖)和結合強度 (第1c圖)進一步被計算,其顯示C5-24胜肽靶向骨關節炎和對照軟骨的顯著差異。前列數據證明了C5-24胜肽靶向骨關節炎軟骨的胞區質區域具有卓越的識別能力和特異性。
<於早期骨關節炎診斷中的應用>
為了證明骨關節炎靶向胜肽在骨關節炎早期診斷中遞送診斷試劑的適用性,C5-24和加擾胜肽將與超順磁性氧化鐵 (SPIO)偶聯 (第2a圖)。傅立葉轉換紅外線光譜 (FTIR)顯示N-H波段/C-O拉伸比增加,表明SPIO已成功裝載於C5-24和加擾胜肽 (第2b圖),所述胜肽係透過關節內注射至以酶切方式建立之大鼠骨關節炎模型的關節中。注射未與胜肽偶聯之SPIO的骨關節炎膝關節的磁共振成像 (MRI)與偽對照組的膝關節相比並無差異,這揭示了在不嚴重剝蝕軟骨的情形下,MRI對骨關節炎早期診斷的挑戰。同樣地,不與骨關節炎軟骨結合的加擾胜肽偶聯SPIO及MRI信號的降低亦無法將早期骨關節炎和偽對照組加以區分。相反地,C5-24胜肽偶聯SPIO與骨關節炎軟骨結合會導致骨關節炎軟骨的MRI信號降低,但此情形卻未見於健康軟骨中 (第2c圖)。為了進一步接近臨床狀態,C5-24胜肽偶聯SPIO用於早期骨關節炎診斷的可行性進一步在前交叉韌帶橫斷之蘭嶼小型豬所建立的大型動物骨關節炎模型獲得證實。在前交叉韌帶橫切2個月後,無論偽對照組是否接受C5-24胜肽偶聯SPIO或不接受C5-24胜肽偶聯SPIO處理,或骨關節炎膝關節不接受C5-24胜肽偶聯SPIO處理,在T1-和T2-加權MR影像中均無差異 (第2d圖),表明使用MRI進行早期骨關節炎診斷的困難。然而,接受C5-24胜肽偶聯SPIO的骨關節炎膝關節在其T1-和T2-加權MR影像中顯示增強信號的減少,證明C5-24胜肽偶聯SPIO對早期骨關節炎診斷的敏感性。綜上所述,前列數據表明當與C5-24胜肽偶聯時,影像顯影劑,如SPIO,可與MR成像系統結合並用於早期骨關節炎診斷。
<於關節潤滑中的應用>
為了研究C5-24胜肽將透明質酸運送到骨關節炎軟骨中用以潤滑的潛力,C5-24胜肽或加擾胜肽將與透明質酸偶聯,並分別簡稱為C5-24-HA和加擾-HA (第3a圖)。通過1
H質子-NMR (核磁共振)測得HA-MA的甲基丙烯酸酯含量約為28.1%,其被用以作為後續和C5-24胜肽 (第3b圖)和加擾胜肽結合的中間產物。流變潤滑性能,包括靜摩擦係數 (μs
)和動摩擦係數 (μk
),是改良先前技術中的旋轉測試方法而進行評估,並於未經修飾的HA、加擾-HA或C5-24-HA處理的成對的人類骨關節炎軟骨圓盤 (從13個個體中收集)之間進行比較。未修飾的HA、加擾-HA和C5-24-HA在1.2秒鬆弛的情況下的總摩擦係數分別為:μs
為0.065、0.073和0.044,μk
為0.045、0.052和0.034,且與未修飾的HA相比,C5-24-HA分別降低了32.3%和24.4%;在120秒鬆弛的情況下,μs
分別為0.072、0.075和0.043,μk
分別為0.045、0.052和0.033,且與未修飾的HA相比,C5-24-HA分別降低了40.3%和26.7%;在120秒鬆弛的情況下,μs
分別為0.077、0.079和0.044,μk
分別為0.048、0.055和0.034,且與未修飾的HA相比,C5-24-HA降低了42.9%和29.2%;而在1200秒鬆弛的情況下,μs
分別為0.094、0.102和0.066,μk
分別為0.060、0.067和0.042,且與未修飾的HA相比,C5-24-HA分別降低了29.8%和30% (第3c圖)。簡而言之,在所有鬆弛階段中,C5-24-HA相較於未修飾的HA和加擾-HA具有統計上顯著優越的靜摩擦和動摩擦特性,說明其潤滑效果卓越。而且,在流變預處理階段和扭矩測量中,C5-24-HA的潤滑性能優於未修飾的HA和加擾-HA。代表性的個人患者資料被放置在補充資料中,在預處理階段的3600秒鬆弛時間內的軟骨盤高度逐漸喪失亦顯示的相同情況,但在接下來的四個鬆弛期中恢復到一致的軟骨盤高度,這減少了影響摩擦測量的因素。前列數據共同表明,C5-24胜肽在開發新穎且有效的骨關節炎關節潤滑劑中的適用性。
<於骨關節炎再生醫學中的應用>
C5-24-HA可通過與CD44 (HA的受體)結合並應用於間質幹細胞再生醫學,CD44在間質幹細胞表面廣泛地表達,並將間質幹細胞遞送至骨關節炎軟骨表面。再者,如先前研究所證實,HA的軟骨形成活性很可能會誘導間質幹細胞形成軟骨。為了證明這一點,大鼠間質幹細胞被施以SPIO以供隨後的追蹤並與螢光偶聯的C5-24-HA或加擾-HA一起孵育 (第4a圖)。螢光顯微鏡觀察表明,間質幹細胞被綠色螢光緊密包圍 (第4b圖)。再者,在與C5-24-HA或加擾-HA一起孵育後,間質幹細胞將立即被注射進大鼠骨關節炎模型的關節中,並在移植後8週對關節進行組織學檢查。當骨關節炎組和偽對照組相比,組織形態計量學分析結果顯示骨關節炎成功被誘導 (第4c、4d圖)。再者,接受由C5-24-HA遞送之間質幹細胞的膝關節具有明顯的軟骨再生與明顯的番紅O染色 (第4c圖),而接受加擾-HA遞送之間質幹細胞的膝關節仍表現出嚴重的骨關節炎,且軟骨表面上出現多個裂縫,其番紅O染色亦消失。以修改後的Mankin評分對骨關節炎程度進行量化的結果也表明,前者的骨關節炎改善優於後者 (第4d圖)。為了追蹤移植到骨關節炎關節中之施以SPIO的間質幹細胞,在移植後3天對大鼠進行MRI掃描 (第5a圖)和進行普魯士藍染色 (第5b圖),結果顯示在C5-24-HA輔助的組別中,間質幹細胞在骨關節炎軟骨中具有特異性歸巢特性,但不在擾亂的HA輔助組別中出現。前列數據表明C5-24-HA在增強間質幹細胞再生醫學中的適用性。
<結合蛋白的鑑定>
為了鑑定人類骨關節炎軟骨組織中與C5-24胜肽結合的推定目標蛋白,我們使用與化學交聯劑3,3'-DithiobisSulfosuccinimidylpropionate (DTSSP)結合之生物素改質的C5-24胜肽,並接著以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺鈉凝膠電泳 (SDS-PAGE)和液相色譜-串聯質譜 (LC-MS/MS)識別結合的目標 (第6a圖)。銀染顯示了幾個清晰的條帶,例如共免疫沉澱蛋白COIP-1、COIP-3和COIP-5 (第6b圖),它們分別被收集、以胰蛋白酶降解並以LC-MS/MS進行分析。前述片段是以演算法透過MASCOT和TurboSequest搜索引擎檢索Swiss Protein Database而鑑定。我們發現了幾個候選蛋白,包括具有概率得分的膠原蛋白alpha-1 (XII)和膠原蛋白alpha-3 (VI)片段,表明該肽屬於某種蛋白質的可能性分別高達850和372,並高於大多數其他所鑑定出的胜肽。為了進一步確認這些蛋白質片段為C5-24胜肽的目標蛋白,我們使用ELISA檢測目標蛋白和生物素改質的C5-24胜肽之間的相互結合活性。首先,我們使用特定濃度的膠原蛋白對ELISA盤進行預塗佈處理,以鑑定胜肽結合的最佳膠原蛋白濃度 (第6c圖),接著使用3.3 μg/mL的膠原蛋白alpha-1 (XII)來檢查胜肽的結合 (第6d圖)。我們發現生物素改質的C5-24胜肽會與膠原蛋白alpha-1 (XII)和膠原蛋白alpha-3 (VI)片段結合,但生物素改質的加擾胜肽並不會。然而,相互性的劑量依賴性結合僅在膠原蛋白alpha-1 (XII)和生物素改質的C5-24胜肽之間觀察得到 (第6c、6d圖)。此外,生物素改質的C5-24胜肽和生物素改質的加擾胜肽與和牛血清白蛋白 (BSA)的結合並無差異。綜上所述,前列數據表明膠原alpha-1 (XII)是C5-24胜肽的目標蛋白。
為了預測蛋白質-胜肽複合物的結構,藉由搜尋序列2的相似性,同源性建模和靶向人類膠原蛋白XII的幾種可靠的結構模型輔助了蛋白質-胜肽的對接。這些結構模型隨後將應用於計算最有潛力並可於本研究中被選用而供進一步實驗之C5-24和C5-91胜肽鏈的可能分子對接構型。蛋白質-胜肽對接模型主要是基於在與目標蛋白的胜肽鏈結合後,符合最低吉布斯自由能和化學熱力學的演算法。我們的數據表明C5-24和C5-91胜肽鏈分別以構型125和構型68靶向膠原蛋白XII中區域L1385-S2285的袋點,並分別以構型34和構型42靶向C端之S2506-P2724,具有最高構型頻率的C5-24和C5-91具有相同的對接位點 (第6e圖)。再者,這些預測構型共享重要的保留性結合模體,WXPXW,其可能主導胜肽鏈與膠原蛋白XII之間的主要對接親和力。此外,人類、豬、兔、大鼠和小鼠的膠原蛋白XII的序列同源性達到90.3%的相似性和83.7%的一致性,且親緣關係分析結果表明膠原蛋白XII在所述五物種之間具有高度的遺傳相關性。C5-24胜肽在囓齒動物、兔和豬骨關節炎模型中的檢查非常可靠。再者,根據表一中的保留性結構域,相同組別的胜肽序列共享重要且相同的模體,例如第1組和第3組中分別共享FVEW和DTH。
表一 | |||
噬菌體殖株 | 胺基酸序列 | 頻率 | |
1 | C5-3, C5-50, C5-84, C5-87 | G D Y V I D W N F I E W | 4/24 |
C5-37 | T V G S F F V E W M M H | 1/24 | |
C5-66 | D I G G W F V E W S L A | 1/24 | |
2 | C5-22, C5-83, C5-92 | D W G Y F S W A Y D S A | 3/24 |
C5-43 | D W Y T V S W L T D S N | 1/24 | |
3 | C5-42, C5-91 | D A Y W H P V W V H D P | 2/24 |
C5-24 | D L Q Y W Y P I W D T H | 1/24 | |
C5-12 | H V Y Q K P S Y W W Y P | 1/24 | |
C5-21 | T W H F V D F S A D T H | 1/24 | |
4 | E5-8, E5-48 | D Y F T L D F T F D S W | 2/24 |
C5-46 | N Q V Y F H Y F D L D F | 1/24 | |
5 | E4-14, E5-24 | S P W W L W K A H N E A | 2/24 |
6 | C5-38 | E V F N H Y I Q Y S T E | 1/24 |
E4-1 | L P G M E L F W N V A N | 1/24 | |
E4-4 | D T F V F G S S K W R A | 1/24 | |
E4-15 | S N N M R A P V N E I Y | 1/24 |
最後,我們證明了膠原蛋白XII在骨關節炎關節軟骨中的專有表達。膠原蛋白XII的表達僅在大鼠骨關節炎軟骨中觀察得到,但未在正常關節軟骨中觀察而得。另外,膠原蛋白XII的表達僅在人類骨關節炎軟骨中觀察得到,而在人類非患有骨關節炎的軟骨中則未觀察到。膠原蛋白XII主要表達在成簇軟骨細胞的胞區質區域中,其與C5-24胜肽結合的區域一致 (第1a圖)。這些數據更獲得161例骨關節炎患者和29例非骨關節炎患者之隊列研究結果的支持。初步分析顯示,與非骨關節炎軟骨相比,骨關節炎髖關節和骨關節炎膝關節軟骨聯合中的COL12A1 mRNA水平顯著增加。
<在疾病緩解性骨關節炎藥物 (DMOADs)中的應用>
目前尚未有藥物被批准為疾病緩解性骨關節炎藥物。因此,骨關節炎可能是一種嚴重的疾病,未滿足治療上的醫療需求改變其基本的病理生理學,並轉化為長期的、與臨床相關的進展。目前,有幾種藥物處於第II期、第III期或臨床前階段,包含靶向軟骨再生的纖維母細胞生長因子-18 (Sprifermin)與促進核心結合因子beta (CBFβ)解離和核內化並刺激級聯軟骨形成的Kartogenin。所有發展中的疾病緩解性骨關節炎藥物均可透過本研究中開發的骨關節炎靶向胜肽的協助而促進其遞送至骨關節炎組織。此外,與全身性藥物治療相反,多數藥物著重在關節內給藥的途徑,以提高藥物的局部生物利用度並避開常規障礙,並可透過降低脫靶效應而使全身毒性最小化並提高安全性。然而,重要的是要了解局部關節內給藥所產生的明顯安慰劑作用,並使療效的評估更具挑戰性。將治療劑遞送到骨關節炎部位之技術精度提高,例如本研究中所發現的胜肽,將可能使骨關節炎有效療法成功的開發。未來應致力於透過裝備有骨關節炎靶向胜肽的複雜載體來提供緩解疾病的藥物,以增強疾病緩解性骨關節炎藥物的發展。
我們已經確定了幾種噬菌體編碼的胜肽模體 (WXPXW和DTH),這些模體選擇性地靶向骨關節炎關節,而未對其他的關節軟組織,包含滑膜組織、半月板和韌帶,進行任何有效的靶向。再者,我們鑑定了C5-24和C5-91胜肽與骨關節炎關節中軟骨細胞的胞區質區域之特異性結合。C5-24已成功地與SPIO和HA結合,並分別供予骨關節炎診斷和潤滑的目的。儘管尚未確認C5-91胜肽可將診斷劑或潤滑劑遞送至骨關節炎關節的關節表面,然C5-91胜肽具有與C5-24胜肽相同的大小和共享相同的模體,因此被認為具有相同的功能。
儘管膠原蛋白II是透明軟骨的基礎,且佔關節軟骨中所有蛋白質的85-90%,但老化或骨關節炎將使膠原蛋白損傷,且所述損傷會由關節表面的軟骨細胞 (胞區質區域)開始,並隨著進展中的退化而延伸到整個軟骨。有鑑於膠原蛋白II未在骨關節炎中具有特異性的表達,靶向膠原蛋白II的胜肽可能不適用於骨關節炎的診斷、治療、潤滑和再生醫學之應用。反之,如同本研究的揭示,實驗與電腦模擬證明共享結合模體WXPXW的骨關節炎靶向胜肽係選擇性地歸巢至胞區質區域並與僅在骨關節炎軟骨中表達的膠原蛋白XII結合。以抗體進行的免疫螢光研究說明膠原蛋白XII是位於胚胎組織中含有膠原蛋白I的密集結締組織結構中,例如肌腱、韌帶、軟骨膜和骨膜 (膠原蛋白XII亦表達在角膜、椎間盤和氣管的組織中),表明其在關節的退化和再生中出現。膠原蛋白XII在骨關節炎再生中的作用仍需進一步的研究來闡明。總結上述,我們開發了針對膠原蛋白XII的新穎遞送平台,用於改良骨關節炎的潤滑、診斷、治療和再生醫學。
雖然與膠原蛋白XII結合的胜肽已被開發於骨關節炎的診斷、潤滑劑和再生醫學,它們亦可能適用於其他疾病,例如在嚴重的乾眼症中可能發生的角膜潰瘍和穿孔,或與包含透明軟骨的其他組織,例如椎間盤和氣管軟骨,相關的傷害或退化性疾病。例如,在角膜的鮑曼氏層中表達的膠原蛋白XII會於角膜潰瘍和疤痕形成過程中過度表達,因此,功能化的膠原蛋白XII靶向胜肽可幫助輸送潤滑劑、抗炎藥和幹細胞,以治療角膜潰瘍。總結上述,我們開發了針對膠原蛋白XII的新穎遞送平台,以改良骨關節炎的潤滑、診斷、治療和再生醫學。所述平台還可用於治療其他疾病,例如眼潰瘍和其他包含透明軟骨的組織的疾病。
<材料與方法>
本申請的上述實施例是基於以下方法和材料來執行的,其細節描述如下。
<製備用於生物淘選和ELISA篩選的軟骨標本>
為了避免患者間個體差異的干擾,我們在同一噬菌體展示實驗中使用來自於同一骨關節炎患者的手術關節軟骨標本以供噬菌體展示實驗中進行五輪的生物淘選。下述處理將進行以確保用於五輪生物淘選的軟骨之粒度組成一致。將重量為3.2 g的人類手術骨關節炎標本加入兩倍磷酸緩衝生理食鹽水 (PBS)中並均質化。軟骨均質液以800×g和4°C的條件離心10分鐘,並收集沉澱物作為「大顆粒軟骨樣品 (C1)」。上清液將添加至新的離心管中,接著以1,500×g和4°C的條件離心10分鐘,並收集沉澱物作為「帶有中等顆粒 (C2)的軟骨樣品」。接著將上清液以2,000×g和4°C的條件再次離心10分鐘後,收集沉澱物作為「小顆粒軟骨樣品 (C3)」。此時的上清液將分別被收集並作為「軟骨組織裂解物」而進行另外五輪的生物淘選,此與在「軟骨組織碎片」上進行的生物淘選並不相同。在「軟骨組織裂解物」的生物淘選上,分別將C1、C2和C3稱重並等分為五等份。五輪的生物淘選的每一輪係使用C1、C2和C3等份的混合物進行。
在「軟骨組織碎片」的生物淘選上,軟骨樣本同樣被切成正方形碎片 (尺寸為5×5 mm),並以每孔一個碎片的數量用指甲油黏附在96孔的ELISA盤上,以進行軟骨細胞的結合篩選。
<對骨關節炎軟骨組織裂解物與碎片的噬菌體殖株生物淘選>
在「軟骨組織裂解物」的生物淘選方面,組織裂解物的上清液係以塗覆液 [0.1 M NaHCO3
, pH 8.6]稀釋十倍,接著新鮮塗佈於用於生物淘選的10公分培養皿 (和進行篩選的96孔ELISA盤)上,並在使用前於4°C靜置24小時。將組織裂解物塗覆的平板以包含1% BSA的PBS於4°C條件下封閉處理過夜,然後加入10 pfu的Ph.D.-12TM噬菌體 (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA)展示胜肽庫並在4°C孵育1小時。在洗滌後,將結合的噬菌體用1 ml之ER2738的對數相培養物在37°C下以100 rpm搖動20分鐘而洗脫。所述洗脫的噬菌體庫將在ER2738中隔夜培養並擴增與滴定。回收的噬菌體將輸入至下一輪的淘選,並從第五輪生物淘選中隨機選擇共130個噬菌體殖株進行培養以進行ELISA篩選。
在「軟骨組織碎片」的每一輪生物淘選中,軟骨樣品以包含1%之胎牛血清白蛋白 (BSA)的PBS於4°C條件下封閉處理1小時。加入最初包含10個空斑形成單位 (pfu)的Ph.D.-12TM (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA)噬菌體展示胜肽庫,並在4°C下孵育1小時。在洗滌後,將結合的噬菌體用1 ml之大腸桿菌ER2738的對數相培養物 (New England BioLabs)在37°C下以100 rpm搖動30分鐘而洗脫。所述洗脫的噬菌體庫將在ER2738中隔夜培養並擴增與滴定。回收的噬菌體將輸入至下一輪的淘選,並從第五輪生物淘選中隨機選擇共95個噬菌體殖株進行培養以進行ELISA篩選。
<鑑定靶向骨關節炎軟骨的胺基酸序列模體>
所選擇之噬菌體殖株與軟骨組織裂解物和與軟骨組織碎片的結合活性係透過ELISA進行檢測。具有最高結合親和力的噬菌體殖株 (軟骨組織裂解物的A490值>0.15,且軟骨組織碎片的A490值>2.0)將被選用並進行定序。透過胺基酸序列的比對,我們鑑定了五個具有不同保留性模體的組別 (如表一所示)。
<hPi-GL軟骨細胞株以免疫螢光標記驗證靶向骨關節炎軟骨的胜肽>
為了檢測前列之噬菌體殖株,於室溫下使用包含4%之多聚甲醛的PBS溶液固定培養於載玻片上的hPi-GL細胞15分鐘,接著用PBS洗滌,並在室溫下使用0.1%之Triton X-100透化30分鐘,以阻斷與1%之BSA/PBST的非特異性結合。載玻片上培養的hPi-GL細胞將分別與4×108
pfu、8×108
pfu和109
pfu之選擇的噬菌體殖株在4°C下孵育1小時。在洗去未結合的噬菌體後,將細胞與作為一級抗體的抗M13小鼠單殖株抗體 (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA)和作為二級抗體的R-藻紅蛋白-AffiniPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG (Jackson ImmunoResearch Inc.)分別在室溫下孵育1小時。接著,用PBST洗滌,並在室溫下用Hoechst 33258 (1 μg/ml; Sigma-Aldrich)複染10分鐘。細胞與噬菌體結合和定位將以共軛焦顯微鏡 (Zeiss LSM 700)進行螢光分析。
<選擇靶向骨關節炎軟骨而非滑膜和半月板的胜肽>
人類骨關節炎軟骨標本將用以檢驗與關節組織結合的靶向噬菌體的定位。石蠟包埋切片的人類骨關節炎組織、滑膜和半月板是取自於經過中國醫藥大學暨附設醫院研究倫理委員會核准之臨床試驗計劃 (IRB編號為CMUH108-REC1-046與T-CMU-23728)的人類骨關節炎手術治療標本。前述試驗已取得書面的知情同意書,並對所有人體組織樣本進行了匿名編碼。所有切片皆以標準方法進行乾燥、脫蠟與復水,接著與C5-87、C5-66、C5-83、C5-91、C5-24、E5-8和C5-46噬菌體殖株或對照噬菌體 (5×108
pfu/μl)一起孵育。在洗滌後,將切片於室溫下以抗M13小鼠單殖株抗體 (GE Healthcare)處理1小時。在經過數個洗滌步驟後使用無生物素之超靈敏聚合物-HRP檢測系統 (Biogenex, Fremont, CA, USA)檢測其免疫反應性。所述載玻片將以蘇木精進行微複染,並用Aquatex (Merck, Darmstadt, Germany)安裝,而後用光學顯微鏡檢驗。選擇在噬菌體殖株上顯示與軟骨細胞但未與滑膜或半月板具有顯著結合的胜肽序列,並對其進行合成以用於後續的研究。
<大鼠骨關節炎模型的建立>
大鼠骨關節炎模型將以先前所述但稍作修改的方式建立。簡而言之,本研究使用體重約300克的雄性SD大鼠。所有動物實驗均獲得中國醫藥大學實驗動物照護及使用委員會的批准。大鼠於標準實驗室的條件下 (溫度為24°C,明暗循環為12小時)飼養,並餵食標準餐食和飲用自來水。大鼠在每次注射前係以流速70 ml/min的2.5%異氟烷 (Abott, USA)麻醉。透過在每組大鼠的右膝中注射作為激活劑的0.2 ml之4%木瓜蛋白酶溶液 (Sigma-Aldrich, USA)與0.1 ml之0.03 M半胱氨酸 (Sigma-Aldrich, USA),以誘導大鼠關節發生骨關節炎。而每組大鼠的左膝則注射相同劑量的食鹽水。前述之注射分別在第四天和第七天重複進行,並在最後一次木瓜蛋白酶注射後兩週,取大鼠膝蓋進行組織學分析以確認骨關節炎的形成。在以下實驗將進一步以建立的大鼠骨關節炎模型進行關節內注射。
<製備羅丹明標記的C5-24胜肽及雙光子顯微鏡觀察>
為了證明C5-24胜肽的骨關節炎特異性靶向活性,不能結合骨關節炎軟骨的DYLWQYPDITWH胜肽將作為加擾胜肽。羅丹明標記的C5-24胜肽和加擾胜肽分別注射至無骨關節炎 (對照組)或以酶誘導的骨關節炎大鼠關節中。C5-24胜肽和加擾胜肽是以化學方式相應地合成 (ABI, USA),並透過點擊反應在HEPES緩衝溶液 (pH 8.0)中以生物素-PEG2-碘乙醯基橋連接分子修飾,再進一步與親和素標記的羅丹明 (JacksonImmuno, USA)連接,並在ddH2
O中以截留分子量4K進行透析,以除去未標記的羅丹明,然後凍乾並保存在-20°C條件下。於40 μl PBS中的1 μg羅丹明標記胜肽的等分試樣將以30G針頭進行關節內注射。
大鼠的膝蓋在注射後1天將被移除並徹底清洗其股骨和脛骨組織,而後將其浸入PBS中並精密地安裝在3.5公分的培養皿上以供雙光子顯微鏡之觀察。顯微鏡系統使用中心波長為810 nm、脈衝重複頻率為76 MHz的近紅外飛秒雷射 (Mira 900, Coherent, USA)來運作,且於脈衝寬度為200 fs下進行成像。雷射功率係控制在足以產生SHG和TPEF之20 mW,並可防止連續照明過程中所致的光損傷。因此,來自膠原蛋白纖維的SHG波長為405 nm,而來自膠原蛋白、彈性蛋白、FAD和NADH的TPEF波長則大約為450至650 nm。所有影像通過雷射掃描儀 (Fluoview 300, Olympus, Japan)、用於雷射聚焦和收集光子的一雙二物鏡 (UPlanSApo 20×/0.75, Olympus, Japan)以及兩個分別用於偵測SHG和TPEF的光電倍增管 (R3896, Hamamatsu, Japan)而獲得。SHG和TPEF透過帶通濾鏡 (FF01-405/10, Semrock, USA)和彩色玻璃 (BG39, Schott, Germany)的組合而從強激發之雷射背景中濾除。接著,以二向分光鏡 (FF435-Di01, Semrock, USA)分開並回溯檢測。在此需注意的是,我們使用立方偏振分束器 (GT10-B, Thorlabs, USA)結合半波長試板 (AHWP05M-980, Thorlabs, USA)與四分之一波長試板 (AQWP05M-980, Thorlabs, USA)來分別示例LP和CP成像。只有聚焦物鏡後的線偏振消光比大於50:1且圓偏振的橢圓度 (Imax/Imin)小於1.1才能用於後續的雙光子成像。所獲得的影像主要使用ImageJ/FiJi軟體 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)進行處理和分析。通過二次諧波生成影像重建的膠原蛋白II的結構 (第1a圖)呈現嵌合軟骨細胞 (黑色區域)周圍的多孔膠原蛋白纖維互連結構 (綠色)。
<製備C5-24胜肽偶聯超順磁性氧化鐵(SPIO)及紅外光譜>
C5-24胜肽和加擾胜肽是以化學方式合成,同時,直徑50 nm之氨基矽烷改性的SPIO顆粒 (Chemicell GmBH, Germany)將先與琥珀醯亞胺基-[(N-馬來醯亞胺基丙醯胺基)-四甘醇]酯 (Thermo Fisher Scientific)交聯並於pH 8.5的碳酸氫鈉緩衝溶液中形成醯胺鍵,接著在pH 7.2的條件下與胜肽中半胱氨酸上的巰基相互作用而形成穩定的硫醚鍵,並在截流分子量為10K的ddH2
O中進行透析以除去游離形式的胜肽、橋連接分子、鹽類和離去基團,並在減壓狀態下進一步濃縮,於PBS中再懸浮,並保存於4°C的環境中以供實驗,且時間不得超過2週。為了分析胜肽在SPIO上的安裝,部分製備而得的SPIO將被凍乾,並以1:100 wt./wt.的溴化鉀 (KBr)徹底研磨,接著以200 pound/inch2
的壓力壓縮而形成薄片以供紅外光譜分析 (Perkin Elmer, USA)。紅外光譜將以400-4000 1/cm的頻率掃描,並分別記錄透射模式下紅外光譜的特徵組和指紋區域分子組。
<大鼠骨關節炎的磁共振成像 (MRI)分析>
如結果所示,大鼠將在指定的時間點執行吸入性麻醉並進行MRI掃描。MRI掃描是使用台灣中央研究院生物醫學研究所的4.7T MR掃描系統 (Bruker BioSpin, Germany)。T1加權和T2加權的矢狀截面將使用以下設定呈現:快速自旋回波序列,重複時間為2000 ms,回波時間為72 ms;切片厚度為1 mm;層間間隙為1 mm;256矩陣;TE為60;TR為2000;視場為60 mm;平均數為2。使用體積60 mm的諧振器和直徑2 cm的表面接收線圈來最大化影像分辨率和質量。MRI的斷層掃描儀DICOMs以Osirix MD (Osirix Ltd., USA)進行分析。
<小型豬骨關節炎模型、關節內注射C5-24胜肽偶聯SPIO及3T-MRI分析>
關於利用前交叉韌帶 (ACL)橫斷術建立骨關節炎的方面,台灣蘭嶼小型豬 (9個月大,體重約50-60 kg)將透過肌內 (i.m.)注射賜靜寧 (20 mg/kg)和硫酸阿托品 (0.02 mg/kg)而麻醉,接著在15分鐘後肌內注射舒泰®
50 (4 mg/kg, Virbac Animal Health, France)。為了獲得膝關節更均質的組別,本研究僅包含雌豬。在手術過程中係繼續使用含有氧氣 (流速為1.5 L/min)、一氧化二氮 (流速為1 L/min)和1%異氟烷的氣體來麻醉動物。動物的右後肢將被清洗並無菌地覆蓋。在靜脈注射頭孢唑啉 (2 g)後,於髕骨至脛骨粗隆處切開約7公分的皮膚切口。然後將膝關節由內側向髕骨韌帶打開而使髕骨部分脫位。接著將前交叉韌帶用夾子固定,並用手術刀在遠端進行切割。為避免該橫切後之前交叉韌帶的自發性癒合,另使用電關節固定器進行近端切除。在成功地使用無菌之0.9%食鹽水溶液潤洗後,以1-0VICRYL®
縫線 (Ethicon, USA)將皮膚切口分層縫合。在此之後,迷你豬能夠正常行走和活動。MRI掃描是使用台灣NARLabs儀器技術研究中心的3T MR掃描系統 (Achieva x 3.0, Philips, Germany)在指定的時間點進行。T1加權和T2加權的矢狀截面將使用以下設定呈現:快速自旋回波序列,重複時間為2000 ms,回波時間為72 ms;切片厚度為3 mm; 512矩陣;TE為200;TR為3500;視場為60 mm;平均數為2。使用體積60 mm的諧振器和直徑2 cm的表面接收線圈來最大化影像分辨率和質量。MRI斷層掃描儀的DICOMs以Osirix MD (Osirix Ltd., USA)進行分析。
<製備與C5-24胜肽和加擾胜肽偶聯的透明質酸 (HA)>
胜肽偶聯的HA是以前述方式合成,但稍作修改。簡而言之,首先MeHA係通過甲基丙烯酸酐 (94%, M.W. 154.17; Sigma)與1% (wt/vol)之HA (透明質酸鈉粉末,分子量≈110-150 kDa, Kikkoman, Japan)在pH值為8的去離子水中反應合成,並通過透析 (截留分子量為6-8 kDa)進行純化後凍乾。中間體MeHA的大分子單體的甲基丙烯酸酯化效率是以1
H NMR進行估算。C5-24胜肽和加擾胜肽皆在C端帶有半胱氨酸殘基,使巰基可以Michael-Addition反應與MeHA反應。將MeHA大分子單體和胜肽溶解在三乙醇胺緩衝食鹽水 (TEOA buffer, 0.2 M TEOA, 0.3 M total osmolarity, pH 8.0)中,並在37°C下保持過夜以進行胜肽偶聯。胜肽偶聯的HA在截止分子量為12K的ddH2
O中進行透析,以除去游離形式的胜肽、TEOA、鹽類和MA後進一步凍乾並在室溫下保存。將偶聯HA的胜肽在0.1M的酸中裂解,並進行1
H NMR以估算胜肽的偶聯效率。
<潤滑劑性能分析>
製備從股骨收集的人類關節軟骨樣品用於潤滑之測試是將先前出版物的內容稍作修改。在中國醫藥大學暨附設醫院研究倫理委員會的嚴格監督下,從接受全膝關節置換術的患者中切取人類骨關節炎軟骨樣品 (IRB編號為CMUH108-REC1-046與T-CMU-23728),並小心避免在解剖過程中損壞關節表面。單一患者的骨關節炎軟骨表層將保持完整,並打孔切割而分別獲得直徑為8.0 mm和6.0 mm的圓盤,且在流變儀中進行摩擦測量時僅切割軟骨的深層,以獲得一個黏貼到經特別設計的測試模組的金屬反面上。軟骨是新鮮使用且無凍結或添加蛋白酶抑制劑,以免改變其表面潤滑性能。將樣品在PBS中劇烈洗滌過夜,以耗盡所有殘留於軟骨表面的潤滑液,並將其分成至少3組。如結果所示,將軟骨圓盤在1 ml的原始HA或胜肽修飾的HA (PBS中的1%HA)中預孵育2小時,以使未修飾的HA或胜肽修飾的HA與軟骨圓盤結合,接著將其浸入測試模組中的10 ml PBS並安裝在流變儀 (HR-1, TA Instrument Ltd., USA)上以供摩擦測試。
根據製造商的說明,流變儀係依據使用標準方法而將初始值設置為零,接著我們在將樣品加載到流變儀後使用電子卡尺計算軟骨樣品的初始高度。樣品將以平行板構型而透過氰基丙烯酸酯膠黏附至頂部和底部的流變儀固定裝置。軟骨和金屬固定裝置表面僅黏有一層薄薄的膠水。6.0 mm之樣品表面將定位於8.0 mm表面的頂部。頂部樣品將被降低並壓在底部樣品上,直到達到~0.01 N的載荷值,以避免樣品表面之間接觸不夠、載荷值的波動與最小化高度測量的誤差。流變儀自動感應的對應記錄高度係用於應變量的計算。儀器將進行設定以記錄總軟骨厚度並計算≈14%壓縮時的高度。人類骨關節炎軟骨樣品的總厚度在≈2.5-3.5 mm的範圍內,其在覆有保護蓋的HA/PBS溶液 (10 mL)水浴中進行測試以防止乾燥。每個樣品的正確對齊和表面不規則性皆被檢查,並以具有平坦表面的樣品進行實驗。樣品將浸入測試潤滑劑中並壓縮至其原始總高度的86%,且透過在每個方向上以0.3 mm/s的有效滑動速度旋轉兩圈而進行預處理,所述之速度定義為角速度乘以環狀的有效半徑Reff
= 2/3[(Ro3
-Ri3
)/(Ro2
-Ri2
)]。所述之預處理重複進行兩次以上,隨後進行3600秒的應力鬆弛期以使壓縮軟骨中的液體加壓完全消退。對每個實驗組的平衡法向應力數據進行記錄與測量。潤滑測試分14個階段進行。前兩個階段可以忽略不計,並用以作為清理或預剪切階段。進行階段3、6、9和12以分析不同放鬆時間的影響。允許樣品在測試之間放鬆1200、120、12和1.2秒。在階段4-5、7-8、10-11和13-14期間中記錄潤滑數據;每個階段都以不同的旋轉方向和恆定的剪切速率進行。在每次測試過程中皆測量扭矩 (τ)和軸向力 (N),並根據以下公式確定動摩擦係數μk
的瞬時測量值:μk
=τ/(Reff
×N)。將瞬時μk
值在每個方向的第二次旋轉中取平均,以產生用於比對的平均μk
。靜摩擦係數在測試啟動期間尋得最大扭矩值下被計算為瞬時μs
=τmax/(Reff
×N)。經實驗後,由於軟骨表面接受約14%的壓縮所致的中央凹痕將被驗證。
<大鼠間質幹細胞的分離和以SPIO標記,並透過C5-24胜肽偶聯的HA傳遞>
大鼠間質幹細胞將如前述之方式進行分離與擴增。簡而言之,從兩隻8至10周大的Sprague-Dawley雌性大鼠 (BioLASCO Taiwan Co Ltd, Taipei, Taiwan)收集之股骨的軟組織將被無菌分離。骨髓中的單核細胞將以密度梯度離心法分離並懸浮於完全培養基 (CCM:包含16.6%之胎牛血清、100 U/mL的青黴素、100 μg/ mL的鏈黴素和2 mM的L-谷氨醯胺的α-MEM)之中,接著以1×105
/cm2
的密度植入培養皿。在24小時後以洗滌和更換培養基的方式除去非貼壁細胞。當細胞達到亞融合時,收集細胞 (第0代)進一步進行繼代培養。接著,將細胞以100個細胞/cm2
的密度種植於CCM並於其中生長,並每週更換培養基兩次。在這項研究中使用的間質幹細胞為第3-4代。
在以超順磁性氧化鐵納米顆粒 (SPIO)標記的間質幹細胞的方面,將50 μg/mL的SPIO (Chemicell GmbH, Gemany)與0.75 μg/mL的聚-L-賴氨酸 (Sigma Aldrich, USA)於培養基中預混合,並在室溫下放置1小時。為了使SPIO奈米顆粒被內吞,間質幹細胞將以每孔4×104
個細胞的密度種植在6孔盤中並生長24小時後,以PBS徹底洗滌。接著,將間質幹細胞收集到微量管中,以1×106
個細胞/200 μl的濃度於37°C的條件下與無血清培養基中2%的C5-24胜肽偶聯HA一起孵育30分鐘。在關節腔內注射方面,HA封裝的間質幹細胞的體積將被減小至25 μl中包含1×106
個細胞,並精密地注射到骨關節炎大鼠的膝關節滑液囊中。
<組織學、免疫細胞螢光與免疫組織化學分析及共軛焦顯微鏡觀察>
在HA封裝的間質幹細胞移植的組織學分析方面,如結果所示,大鼠將在移植後的時間點被犧牲並切除整個膝關節,膝關節以包含4%之多聚甲醛 (PFA)的PBS固定,接著在0.5 M的EDTA中脫鈣2週後包埋於石蠟中,並沿矢狀方向連續切片為5 μm之厚度。以標準方法製備之股骨中部的連續切片將進行H&E染色、普魯士藍染色和番紅O染色,並以位相差顯微鏡 (Carl Zeiss)觀察。在H&E染色方面,將脫石蠟的玻片進行連續復水處理後,以Lillie Mayer蘇木精 (Sigma Aldrich, USA)染色10分鐘,再以伊紅Y (Sigma Aldrich, USA)染色30秒,最後進行一系列的脫水、清潔和固定。普魯士藍染色的載玻片製備類似於H&E染色,其係將復水的載玻片以含有5%之亞鐵氰化鉀的10% HCl溶液 (Sigma Aldrich, USA)染色20分鐘,再用Fast Red進行反染,最後脫水定型、清洗並用樹脂固定凝膠和蓋玻片。在番紅O染色方面,復水的玻片先以0.05%的Fast Green溶液染色3分鐘,然後再以0.1%的番紅O染色溶液染色5分鐘,最後清洗並用樹脂凝膠固定。
關於HA封裝的間質幹細胞之共軛焦顯微鏡觀察,HA將被甲基丙烯酸酯化並與以PBS製備的2% Alexa-488螢光染料偶聯。間質幹細胞被收集至微量管中並根據製造商的說明而以Dil3螢光染料標記 (Invitrogen, USA),並在37°C的HA溶液中孵育30分鐘。隨後,將其滴於載玻片上並立即以共軛焦顯微鏡 (Leica)觀察,然後用ImageJ Fiji (NIH)重建3D影像。
<以親和吸附、液相層析串聯質譜儀 (LC-MS/MS)和ELISA鑑定C5-24胜肽的目標蛋白>
為了鑑定C5-24胜肽鏈的結合目標,人類骨關節炎軟骨樣品將被均質化以供親和吸附。首先將PBS中之1 mg/ml生物素改質的C5-24胜肽添加至軟骨均質液中,並在4°C下孵育1小時。在洗滌後,加入DTSSP溶液至最終濃度為2 mM,以使胜肽-目標蛋白交聯。所述之反應混合物將於室溫下旋轉孵育30分鐘。所述反應係以1M Tris鹼終止。在用第一種裂解緩衝溶液 (1 M NaCl in 100 mM Tris acetate, pH 8.0)於4°C裂解軟骨細胞24小時後離心裂解物,接著用第二種裂解緩衝溶液 (4 M guanidine HCl, 65 mM DTT, 10 mM EDTA in 50 mM sodium acetate, pH 5.8)於4°C再反應24小時。在離心後,將胍提取物與100%的乙醇 (體積比為5:1)於-20°C下混合16小時,以確保除去殘留的鹽酸胍。接著以16,000×g和4°C的條件下離心45分鐘,以使目標蛋白分層沉澱,而後以90%的乙醇洗滌沉澱物後乾燥,再以包含100 μg/ml之胃蛋白酶的100 mM乙酸復溶。將MyOne鏈黴親和素C1 Dynabeads (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)加入蛋白質裂解物中並徹底混合1小時。免疫磁分離法可提取胜肽-蛋白質複合物。最後,以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳 (SDS-PAGE) (Bio-Rad)分離純化的蛋白質,並用SilverQuest銀染試劑盒 (Invitrogen)進行銀染。
將染色的蛋白條帶切成小塊,並用含有50%之ACN的10 mM碳酸氫銨 (ABC, Sigma, St Louis, MO)洗滌5分鐘並重複三次。凝膠碎片以100%的CAN脫水,並以含有1 ng/μl之胰蛋白酶 (Promega, Madison, WI)的25mM ABC溶液 (pH 8.2)復水,而後於37°C下孵育過夜。在降解後,胰蛋白酶胜肽將以含有1%之FA的50% ACN溶液而從凝膠中提取,並使用離心濃縮機進行乾燥。胜肽片段將以LC-MS/MS鑑定。LC-MS/MS是使用離子阱質譜儀 (HCTultra PTM discovery, Bruker, Billerica, MA)線上連接Ultimate 3000 nanoLC系統 (Dionex, Sunnyvale, CA)而運行。樣品被注入吸附管柱 (C18, 5 μm, 1mm × 5 mm, Dionex, Sunnyvale, CA)中並以流速300 nl/min通過逆相管柱 (Atlantis C18, 3 μm, 75 μm × 150 mm, Waters, Milford, MA)而在線分離。胜肽在6分鐘內以H2
O/ACN梯度2%至40%而溶劑B (100% ACN, 0.1% FA)洗脫,並在24分鐘內以40%至70%而從的溶劑B洗脫。MS和MS/MS的掃描範圍分別為400-1600 m/z和100-2500 m/z。經ELISA驗證後,使用MASCOT (Matrix Science, London, UK)和TurboSequest搜索引擎 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)檢索Swiss Protein Database來鑑定蛋白質候選物。
首先,ELISA盤將在室溫下以塗覆液 (0.5M NaHCO3
)中的膠原蛋白alpha-3 (VI)和膠原蛋白alpha-1 (XII)塗覆2小時,並於4°C的條件下用5%的牛奶/TBST封閉過夜。生物素改質的胜肽將被加入ELISA盤中,並於室溫下孵育1小時。而後用PBS洗滌並用偶聯有HRP的小鼠抗M13抗體 (GE Healthcare Biosciences)探測生物素改質的胜肽。生物素改質的胜肽與公知的膠原蛋白alpha-3 (VI)或膠原蛋白alpha-1 (XII)的結合係透過與HRP偶聯的鏈黴親和素 (Thermo Pierce Biotechnology Scientific)而檢測。所述孔盤將以PBS洗滌,然後與過氧化酶基質鄰苯二胺二鹽酸鹽 (OPD; Sigma)一起孵育。所述反應以3 N的HCl終止,並用酵素免疫分析測讀儀測量於490 nm的吸光度。
<C5-24胜肽對接目標的同源性建模>
依照開發人員的指示而利用Dassault Systems (BIOVIA, Discovery Studio Modeling Environment, Release 2019, San Diego, USA)進行分子建模,以進一步確認所選擇之噬菌體殖株在軟骨組織的結合目標。簡而言之,從Uniprot數據庫檢索到的人類、小鼠和豬的ColXII標準序列代碼分別為Q99715、Q60847和F1RQI0。基於來自BLAST結果的模板 (PDB code: 1FNF, 2B2X, 2UUR),使用MODELER建立了三個人類ColXII同源性模型的不同部分。第一個人類ColXII模型的長度是從L1385到S2285,與模板1FNF具有30%的一致性,這說明了纖連蛋白的結構,且由於高度保守的結構拓撲而可用於建模。第二個和第三個人類ColXII模型分別是K2321至L2513和S2506至P2724,分別與模板2B2X和2UUR具有31%和36%的序列一致性。所有同源性模型先通過PDF總能量、DOPE (離散優化蛋白質能量)、得分驗證及Ramachandran圖像檢查,並優化結構以獲得合理的主鏈和側鏈構型。由於IHC中最有希望的結果,最有代表性的蛋白質模板將用於預測C5-24和C5-91胜肽鏈的結合位點和構型。隨後,使用ZDOCK進行蛋白質-胜肽對接以搜索潛在的結合區。Z_Dock得分和E_R_Dock得分係用於驗證胜肽和目標蛋白模板之間的對接能力和正確性。
<統計分析>
前列數據表示為平均值±SD,通過學生t檢驗或單因子獨立變異數分析 (ANOVA)進行統計比對,p值<0.05被認為是顯著的。所有計算均使用獲得中國醫藥大學許可的統計分析系統 (SAS)進行。所示的所有體內數據皆代表進行至少3次獨立實驗。
雖然本發明已參考某些實施例而進行相當詳細地描述,但是其他實施例也是可能的。因此,所附申請專利範圍的精神和範圍不應受限於本文包含之實施例的描述。
無
第1圖呈現活體內成像證明C5-24胜肽與骨關節炎軟骨的結合能力的結果;
第2圖呈現C5-24胜肽在早期骨關節炎診斷中的應用結果;
第3圖呈現C5-24胜肽在關節潤滑中的應用結果;
第4圖呈現C5-24胜肽在骨關節炎再生醫學中的應用結果;
第5圖呈現用於追蹤間質幹細胞之MRI分析和普魯士藍染色的結果;以及
第6圖呈現C5-24胜肽之結合蛋白的鑑定結果。
Claims (19)
- 一種寡胜肽,包含: 一胺基酸序列,其與SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4之全長胺基酸序列中至少一者具有至少50%之一致性。
- 如請求項1所述之寡胜肽,其中該胺基酸序列與SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4之全長胺基酸序列中至少一者具有至少70%之一致性。
- 如請求項2所述之寡胜肽,其中該胺基酸序列與SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4之全長胺基酸序列中至少一者具有至少80%之一致性。
- 如請求項3所述之寡胜肽,其中該胺基酸序列與SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4之全長胺基酸序列中至少一者具有至少90%之一致性。
- 如請求項4所述之寡胜肽,其中該胺基酸序列與SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4之全長胺基酸序列中至少一者具有至少95%之一致性。
- 如請求項5所述之寡胜肽,其中該胺基酸序列與SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4之全長胺基酸序列中至少一者相同。
- 如請求項6所述之寡胜肽,其中該胺基酸序列與SEQ ID NO. 1之全長胺基酸序列相同。
- 如請求項1所述之寡胜肽,其中該胺基酸序列包含一結合模體,該結合模體具有如式(i)所示之一序列: WX1 PX2 W (i), 其中W為色胺酸,P為脯胺酸,X1 和X2 分別為一胺基酸,並且X1 和X2 彼此相同或彼此不同。
- 如請求項1所述之寡胜肽,其中該胺基酸序列包含一結合模體,該結合模體具有如式(ii)所示之一序列: DTH (ii), 其中D為天冬胺酸,T為蘇胺酸,H為組胺酸。
- 如請求項1所述之寡胜肽,其中該寡胜肽的長度介於5個胺基酸殘基至12個胺基酸殘基之間。
- 如請求項1所述之寡胜肽,其中該寡胜肽的一結合標的為膠原蛋白XII。
- 如請求項11所述之寡胜肽,其中該寡胜肽對罹患骨關節炎之一軟骨組織具有結合專一性。
- 一種檢測套組,包含: 如請求項1至請求項12任一項所述之寡胜肽。
- 如請求項13所述之檢測套組,其中該寡胜肽係與一超順磁性氧化鐵(SPIO)或一影像顯影劑結合。
- 一種醫藥組合物,包含: 如請求項1至請求項12任一項所述之寡胜肽;以及 一治療分子或一幹細胞,其與該寡胜肽結合。
- 如請求項15所述之醫藥組合物,其中該治療分子為一骨關節炎治療藥物、一椎間疾病治療藥物、一眼疾治療藥物、一透明質酸、一軟骨生長因子或其組合。
- 如請求項15所述之醫藥組合物,其中該幹細胞為間質幹細胞。
- 如請求項15所述之醫藥組合物,其中該寡胜肽係與一超順磁性氧化鐵(SPIO)或一影像顯影劑結合。
- 一種如請求項15所述之醫藥組合物的用途,其係用以製備一治療骨關節炎之藥物。
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