CN110431147A - 新化合物(免疫刺激肽-细胞内感染) - Google Patents

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Abstract

本发明提供了当施用于动物或人类患者或细胞时能够激活GnRH受体的免疫刺激肽(immunorhelins)。这些免疫刺激肽可用于治疗细胞内细菌、真菌和原生动物感染。

Description

新化合物(免疫刺激肽-细胞内感染)
技术领域
本发明提供了一组能够刺激免疫系统的新型肽，称为immunorhelins。本发明还提供了能够刺激白细胞上的GnRH受体的新型肽。本发明涉及新型化合物本身以及化合物在医药中的用途，特别是在治疗细胞内感染中的用途。Immunorhelins也可用作疫苗接种中的免疫调节佐剂。新型GnRH受体刺激immunorhelins最大化免疫系统的调节作用，同时最小化治疗上不需要的内分泌作用。本发明还提供了制备本发明的immunorhelins的方法，其在医药用途中具有改善的性质。
背景技术
细胞内细菌、真菌和原生动物感染通常不会在健康个体中被诊断出来，因为它们似乎无症状，或者因为症状很轻微以至于受感染的个体往往不会寻求医疗帮助。因此，细胞内感染可能持续潜伏或可能发展为疾病状态。妨碍正常T细胞功能的病症通常导致疾病从潜伏感染进一步发展，并且诸如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(Mtb)的细胞内感染是HIV感染已经发展为AIDS的情况下常见的患者死亡原因。因此，本领域还迫切需要治疗细胞内感染的方法和手段。
细胞内病原体(例如Mtb)具有隐藏在单核细胞和巨噬细胞的细胞内结构的能力，从而引起持续感染。尽管在肺中CD4+T辅助细胞可识别Mtb并且产生适当的反应，但该系统不能产生灭菌免疫力(MacMicking 2012)。为了逃避宿主的免疫识别，Mtb开发了一系列机制，抑制在CD4+T辅助细胞的MHC II类口袋中呈递的Mtb肽的识别。已经证明Toll样受体2被Mtb抑制，而这又抑制了IFN-γ诱导的MHC II类表达(Noss 2001)。此外，数据表明Mtb具有抑制吞噬体加工和成熟的能力，可能是通过恒定链相关机制(Ramachandra 2001)。因此，由于Mtb产生的免疫逃逸因子，源自Mtb的MHC II类肽的正常抗原加工、加载和呈递受损。
设计内吞体溶酶体途径以摄取病原体，将它们加工成12-15aa的长肽，在通过HLA-DM去除恒定链肽CLIP后加载到MHC II类口袋中的肽。在抗原加载之后，将MHC II类肽复合物转运至细胞表面，以呈递CD4+T辅助细胞的特异性T细胞受体(Roche 2015)。最近据报道，Mtb表达的蛋白EsxH直接抑制内吞体分选转运复合体(ESCRT)机制(Portal-Celhay 2016)。EsxH抑制抗原呈递单核细胞和巨噬细胞激活CD4+T辅助细胞的能力。由于完整的ESCRT机制似乎是抗原加工、呈递和T细胞激活所必需的，因此EsxH是通过干预MHC II类途径解释Mtb诱导的免疫逃逸的关联。
MHC II类呈递的重要性也已在原发性免疫缺陷(PID)患者中得到证实。在IFN-γ回路(包括IFNGR和IL-12)中存在缺陷的PID患者具有增加的TBC的获得和非典型分枝杆菌感染。由于MHC II类表达取决于IFN-γ表达并受其调节，因此IFN-γ回路中的表达缺陷将导致额外降低的MHC II类表达和CD4+T辅助细胞的活性差。
原生动物如弓形虫(Toxoplasma gondii)作为绝对细胞内寄生虫，已经开发出一种通过细胞内隐藏来避免免疫识别的机制。该机制涉及干扰MHC II类表达，因此减少了针对特异性CD4+T辅助细胞呈递的弓形虫的量。详细的机制取决于弓形虫表达的可溶性蛋白，即抑制IFN-γ诱导的MHC II类表达(Leroux 2015)。
此外，已经证明不同的真菌感染取决于MHC II类表达。新型隐球菌(Cryptococosneoformans)可能会导致包括艾滋病在内的免疫缺陷患者的危及生命的脑部感染。在新型隐球菌的小鼠模型中的工作已经证明，以IFN-γ依赖性方式激活小胶质细胞及其对MHC II类的上调对于存活是至关重要的(Zhou 2007)。
因此，为了克服由Mtb和其他细胞内细菌、诸如弓形虫的原生动物或以隐球菌(Cryptococus)为例的真菌诱导的免疫逃逸机制，在单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞或其他感染细胞的细胞表面的MHC II类和MHC I类表达可能的增加有益于免疫识别和消除病原体。
发明内容
发明简介
GnRH I(也称为促性腺激素释放激素或LHRH)是具有pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2结构的十肽。它作为92个氨基酸的前肽产生，其在翻译后被修饰以形成最终的肽，其在氨基末端具有焦谷氨酸并且在羧基末端具有羧酰胺。人们早就知道它负责从脑垂体前叶释放FSH和LH，并且通常以脉冲方式从下丘脑释放。GnRH I的超生理水平诱导FSH和LH分泌的立即增加，随后很快抑制FSH和LH分泌。这是因为高水平的GnRH I对垂体前叶的I型GnRH受体具有抑制作用。因此，在高的非生理水平下连续施用GnRH I诱导药理学去势(Fink 1998)。已经合成了大量GnRH I激动剂和拮抗剂用于例如激素敏感性癌症的治疗领域。最初，治疗上使用GnRH I的盐(例如盐酸戈那瑞林和促性激素释放素二乙酸四水合物)。进一步的药物发现和开发导致临床使用多种药物，包括布舍瑞林(buserelin)、曲普瑞林(triptorelin)、纳法瑞林(nafarelin)、组氨瑞林(histrelin)和亮丙瑞林(leuprorelin)，其中每一种药物都具有对促性激素释放素的改善，例如延长的半衰期和I型GnRH受体的超激动作用。
据报道，GnRH I不仅具有激素作用，还可能刺激免疫系统(Jacobson and Ansari2004)。McClean和McCluggage(McClean and McCluggage 2003)观察了术前用I型GnRH受体激动剂治疗后子宫平滑肌瘤中小的成熟淋巴细胞的大量浸润(infiltration)。Bardsley等人(Bardsley 1998)做了相同的观察，表明GnRH I对免疫细胞的迁移具有刺激作用。在以往的分析中报告了来自HIV感染女性的子宫切除标本中慢性浆细胞子宫内膜炎的报告(Kerr-Layton 1998)，以及HIV感染男性中升高的FSH和LH(高促性腺激素)水平(Arver 1999 andBrockmeyer 2000)。通过向表现出AIDS样淋巴细胞谱的易患糖尿病的BB大鼠施用GnRH I，CD4 T淋巴细胞数量增加(Jacobson 1999)。
WO2009/145690A1教导我们GnRH激活和上调T细胞上的MHC I类，其观点为HIV感染的CD4T细胞由于HIV编码的蛋白Nef而下调MHC I类，从而避免识别(Lubben et al.,2007)。
在人类中，存在两种GnRH肽变体，即GnRH I和GnRH II，其由不同的基因编码。GnRHII的结构是pyroGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH2(下划线处与GnRH I不同)。GnRH II是一种非下丘脑形式，主要在脑外产生，有人提出其涉及GnRH系统的非内分泌方面(White 1998)。令人惊讶的是，我们发现GnRH II刺激对T细胞上MHC I类表达作用，证明GnRH II直接激活这些细胞(图1)。
与其他哺乳动物不同，仅描述了一种常规人GnRH受体，即I型GnRH受体。II型GnRH受体同源物存在于人的染色体1q12基因上，但含有移码和终止密码子，并且被认为不能在功能上表达(Morgan 2003)。令人惊讶的是，我们的研究结果表明，II型GnRH受体确实在T细胞上表达，因为它们通过增加的MHC I类表达对GnRH刺激作出反应(图1)。通过qPCR分析证实了这些功能性发现，其中我们可以证明II型GnRH受体mRNA的表达。此外，II型GnRH受体的相对表达水平高于I型GnRH受体在初始和记忆T细胞上的表达水平(图4)。因此，我们已经确定II型GnRH受体的表达是在T细胞上表达的主要受体，对GnRH刺激具有功能性反应。
我们还发现GnRH I类似物可以激活导致MHC I类表达的T细胞。在最近使用GnRH I类似物布舍瑞林(Buserelin)治疗HIV的临床试验中，向HIV感染的男性提供了性激素替代物，以最小化GnRH I的内分泌作用。这些作用是由与垂体I型GnRH受体结合的GnRH I介导的，导致睾酮生成的减少，并随后出现阳痿。当使用高去势水平的GnRH类似物时，除了GnRHI的内分泌作用外，GnRH I很可能通过与T细胞上的II型GnRH受体结合而交叉信号并刺激免疫系统。有趣的是，GnRH I与乳腺癌细胞中表达的受体结合显示出低结合亲和力(Kd，1.6-3.0×10(-6)M)，而GnRH I的中心垂体结合显示出高1000倍的亲和力(Kd，4.8×10(-9)M)(Eidne 1987)。
GnRH I和GnRH II肽的结合亲和力差异可能反映了GnRH I特异性结合垂体细胞的I型GnRH受体的表达，而外周细胞可能具有II型GnRH受体的主要表达，并因此具有较低的亲和力和GnRH I结合的“脱靶”效应。因此，我们意外地发现II型GnRH受体是T细胞上的主要受体是新的并且可以解释GnRH I和GnRH II的受体生理学。因此，通过在治疗HIV中使用GnRHII样肽，应当最小化内分泌作用并分离和增强免疫刺激作用。
发明详述
基于这些发现，本发明人制备了GnRH II样肽，称为immunorhelins，以优化免疫刺激作用并最小化对激素系统的影响。这些immunorhelins可用于刺激MHC I类，MHC I类能够导致免疫应答和清除致病因子，例如细胞内感染和治疗或联合治疗HIV或癌症。因此，公开了几种GnRH II样肽，其具有与II型GnRH受体的有效结合，但优选与I型GnRH受体的结合较弱，导致相当或更强的MHC I类反应，但较弱的对激素刺激或抑制的“脱靶”作用。在本发明的GnRH II样肽也结合并激活I型GnRH受体从而刺激内分泌信号传导的情况下，本发明的化合物因此可以与一种或多种天然、半合成或合成的性激素一起施用，以对抗GnRH II样肽的内分泌作用(例如，睾酮或雌激素，这取决于患者的激素状态)。在成年男性中，天然、半合成或合成的性激素是睾酮或具有相应激素作用的药剂。在成年女性中，天然、半合成或合成的性激素是雌二醇(oestradiol)或具有相应激素作用的药剂，尤其是与孕激素组合。添加后者以避免女性子宫内膜癌的发生并避免阴道出血。然而，子宫切除的女性不会从孕激素的添加中受益。
病毒肽出现在胞质溶胶中，并靶向蛋白体，然后加工和转运(TAP1和TAP2)进入内质网，在内质网中将消化的HIV肽加入到MHC I类肽中，然后转运到细胞表面进行呈递。
与WO2009/145690A1和现有技术的教导相反，细胞内细菌是核内体溶酶体途径的常驻细菌(resident)，在正常细胞例如T细胞中MHC I类通常无法进行该途径。然而，在本发明中，我们首次证明GnRH可以上调抗原呈递细胞(APC)例如CD14+单核细胞上的MHC I类(图2)。APC具有独特的交叉呈递能力，即它们可以将来自核内体溶酶体途径的抗原呈递到MHCI类口袋中，用于激活CD8+T细胞。这一发现令人惊讶，并且表明细胞内细菌例如结核分枝杆菌(M Tuberculosis)存在并隐藏在APC的核内体溶酶体途径中。因此，用GnRH治疗结核分枝杆菌感染的个体将激活并刺激APC，以通过交叉呈递途径启动MHC I类上调，使得CD8+T细胞识别结核分枝杆菌肽并消除感染的APC。
本发明还提供了通过使用一种或多种GnRH类似物治疗细菌、原生动物和真菌感染等细胞内感染的方法。待治疗的细胞内细菌包括结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、引起非典型疾病的分枝杆菌(Mycobacteria causing atypicaldisease)、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌(Mycobacterium avium and M.intracellulare，也称为如鸟-胞内分枝杆菌复合体，Mycobacterium avium-intracellulare complex，或MAC)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、海鱼分枝杆菌(M.marinum)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、戈登分枝杆菌(M.gordinae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、生殖支原体(M.genitalium)、人支原体(M.hominis)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、微小脲原体(U.parvum)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。细胞内原生动物包括弓形虫(Toxoplasma gondii)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P vivax)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、利什曼虫(Leishmania)。细胞内真菌包括荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和脑炎原虫(Encephalitozoon cuniculi)。
本发明提供了人GnRH II的基于肽的类似物。
认为本发明化合物诱导改善的MHC II和/或MHC I抗原呈递，这使得它们可用于治疗细胞内细菌、真菌和原生动物感染。本发明进一步提供一种治疗细胞内感染的方法，其包括施用非生理量的GnRH或GnRH类似物，并且优选还施用性激素。
因此，在本发明的一个方面，提供了式(I)的肽：
或其药学上可接受的盐，并且其中
R5＝甲基(Me)、乙基(Et)、CH2CF3、异丙基(iPr)、正丙基(nPr)、正丁基(nBu)、异丁基(iBu)、仲丁基(sBu)、叔丁基(tBu)、环丙基CH2CONH2或NHCONH2，
关于本发明化合物的式I也可表示为：pGlu-His-Trp-Ser-AA1-AA2-AA3-AA4-Pro-X，
其中：
AA1选自His和Tyr
AA2选自D-Ser(OtBu)、D-Trp、D-Nal、D-Bhi和D-Leu
AA3选自Leu和Trp
AA4选自Arg和Tyr
X选自-NHMe、-NHEt、-NHCH2CF3、-NHiPr、-NHnPr、-NHnBu、-NHiBu、-NHsBu、-NHtBu、-NH环丙基、-NH-NH-CONH2和-NHCH2CONH2。
本发明不包括以下式(I)的化合物：
放弃的式(1)的化合物表示为：
pGlu-His-Trp-Ser-AA1-AA2-AA3-AA4-Pro-X，其中AA1为His，AA3为Trp，AA4为Tyr，AA2选自D-Leu、D-tBu-Ser和D-Trp，并且X为-NHEt或NH-NH-CONH2。
从本发明中排除的化合物P1-P15也可表示如下：
P1.pGlu-His-Trp-Ser-His-d-Ser(tBu)-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH2
P2.pGlu-His-Trp-Ser-His-d-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
P3.pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-d-Trp-Trp-Arg-Pro-Gly-NH2
P4.pGlu-His-Trp-Ser-His-d-Trp-Trp-Arg-Pro-Gly-NH2
P5.pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-d-Trp-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH2
P6.pGlu-His-Trp-Ser-His-d-Trp-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH2
P7.pGlu-His-Trp-Ser-His-d-Trp-Trp-Tyr-Pro-NHEt
P8.pGlu-His-Trp-Ser-His-d-Nal-Trp-Tyr-Pro-NHEt
P9.pGlu-His-Trp-Ser-His-d-Leu-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH2
P10.pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-d-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
P11.pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-d-Nal-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
P12.pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-d-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt
P13.pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-d-Bhi-Leu-Arg-Pro-NHEt
P14.pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-d-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt
P15.pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-d-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHNHCONH2
本发明化合物的令人关注的选择是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，并且其中：
其中R1、R3和R4中的至少一个选自II型，并且R1、R3和R4中未选自II型的那些选自I型，
其中
其中R5＝Me、Et、CH2CF3、iPr、nPr、nBu、iBu、sBu、tBu、环丙基或CH2CONH2
这种化合物的选择也可表示为：pGlu-His-Trp-Ser-AA1-AA2-AA3-AA4-Pro-X，
其中AA1、AA2、AA3、AA4和X如上所定义，并且其中AA1、AA3和AA4中的至少一个选自His、Trp和Tyr；剩余的AA1、AA3和AA4选自Tyr、Leu、Arg，并排除如上所述的化合物P1-P15和权利要求1中放弃的那些化合物。
在一个实施方案中，R1、R3和R4中的两个或三个选自根据上表的II型，并且剩余的R1、R3和R4选自I型。
在一个实施方案中，R1、R3和R4中的一个选自根据上表的I型，R1、R3和R4中的两个选自根据上表的II型。
并且排除如上所述的化合物P1-P21。
根据本发明的具体化合物包括：
特别引起人兴趣的是主要具有下述性质的作为GnRH II类似物的化合物：i)对GnRH II受体的刺激作用或ii)对II型GnRH受体的亲和力。因此，不结合或激活导致不希望的治疗反应的I型GnRH受体的化合物是优选的。认为可将结合或激活I型GnRH受体从而刺激内分泌信号传导的GnRH II类似物与性激素一起施用以对抗内分泌作用。
本发明还提供了治疗细胞内感染(例如细胞内细菌、原生动物和真菌的感染)的方法。
考虑到本发明化合物诱导改善的MHC II和MHC I抗原呈递，这使得它们可用于治疗细胞内细菌、真菌和原生动物感染。本发明进一步提供一种治疗细胞内感染的方法，其包括施用非生理量的GnRH或GnRH类似物。
如果本发明的GnRH类似物与I型GnRH受体相互作用
GnRH类似物是本领域已知的。GnRH类似物是当施用至包括人的动物时模拟GnRH对垂体前叶受体的作用的试剂。然而，以单剂低生理剂量的方式或以具有时间间隔的多个单剂低生理剂量方式施用GnRH类似物确实刺激垂体前叶的受体并因此起到受体激动剂，在初始刺激垂体前叶受体后，每时间单位以高的非生理剂量连续施用GnRH类似物将抑制FSH和LH的分泌，并因此起到受体拮抗剂的作用。
FSH和LH分泌的抑制诱导药理学去势。在这种情况下，GnRH或GnRH类似物的非生理剂量分别为导致GnRH或GnRH类似物的非生理性血浆水平的剂量，其可能导致去势血浆水平。在这种情况下，GnRH或GnRH类似物的非生理性血浆水平为不包括正常的GnRH水平范围的水平，或者在GnRH类似物的情况下，非生理性血浆水平为从生理效应方面不包括在健康人中的GnRH的正常生理效应范围的水平。
更具体地，相对于GnRH的正常生理血浆水平，GnRH的非生理性血浆水平是增加的水平，特别是在延长的时间段(例如超过一周或超过一个月)内增加的水平。此外，更具体地，GnRH类似物的非生理性血浆水平是增加的GnRH类似物的血浆水平，其从生理效应方面不包括在健康人中的GnRH的正常生理效应范围，特别是在延长的时间段内，例如超过一周或超过一个月。本发明包括本发明的GnRH或GnRH类似物(包括其药学上可接受的盐)的任何有用的给药形式，特别是静脉内、肌肉内、皮下、舌下和鼻内给药。特别优选的是储库式和缓释或持续释放组合物。
如果本发明的化合物与I型GnRH受体相互作用并可能获得不期望的效果，则这种化合物可以与一种或多种天然、半合成或合成的性激素联合施用以对抗GnRH II样肽(例如睾酮或雌激素，这取决于患者的激素状态)的内分泌作用。在成年男性中，天然、半合成或合成的性激素是睾酮或具有相应激素作用的药剂。在成年女性中，天然、半合成或合成的性激素是雌二醇或具有相应激素作用的药剂，尤其是与孕激素组合。添加后者是为了避免女性子宫内膜癌的发生并避免阴道出血。然而，子宫切除的女性不会从孕激素的添加中受益。
一种或多种天然、半合成或合成性激素的联合给药可以通过以下方式进行：i)同时给药，ii)GnRH类似物可以早于性激素给药，或iii)GnRH类似物可以晚于性激素给药。此外，取决于所使用的给药形式，GnRH类似物和/或激素可以施用超过一次，例如在通过鼻喷雾施用性激素的情况下，通常在一周或多周内一天施用一次或多次。
例如，联合给药可以延长例如超过一个周期或被不给药时间间隔的多个周期，或者可以连续给药。优选的给药期为1-2周，尤其是10-14天。如果本发明化合物通过激活GnRHI具有内分泌作用，则优选所述化合物的给药基本上与一种或多种天然、半合成或合成性激素的给药期重叠，例如重叠超过50％，优选超过85％，甚至更优选超过90％或95％。联合用药可以保护人免受严重的内分泌副作用，例如性欲减退、潮热、汗液增多和心率增加。在成年男性中，施用的用于对抗本发明化合物的内分泌作用的天然、半合成或合成性激素是睾酮或具有相应激素作用的药剂，尤其是模仿睾酮的激素作用的合成或半合成药剂。优选的药剂包括甲基睾酮和康力龙。在成年女性中，施用的用于对抗本发明化合物的内分泌作用的天然、半合成或合成性激素是雌激素，例如雌二醇或雌二醇的半合成酯或另一种合成或半合成雌激素类似物。优选的雌激素类似物包括缀合的雌激素、炔雌醇和美雌醇，以及非甾体雌激素如双烯雌酚和己烯雌酚。在女性中，雌激素或雌激素类似物给药在一方面优选与孕激素，尤其是黄体酮、黄体酮衍生物或类似物(例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸炔诺酮(noethisterone acetate)、醋酸甲地孕酮、美屈孕酮(medrogestone)和炔诺孕酮(norgestrel))的给药联合。联合给药优选重叠超过50％，优选超过85％，更优选超过90％或95％。优选孕激素与雌激素(雌二醇或雌三醇的半合成酯或合成或半合成雌激素类似物)在一至三个月期间连续给药或在一至三个月期间以约10-14天的时间间隔给药。
如果需要，天然、半合成或合成的性激素与本发明的I型GnRH受体激活化合物联合给药，并且可选地与药学上可接受的载体联合给药。
一般化学方法
技术人员将认识到，本发明化合物可以以已知方式以多种方式制备。以下路线仅说明可用于合成式(I)的化合物的一些方法。
通常，制备本发明化合物的合成方法可分为两种方法：液相合成和固相合成。液相肽合成涉及在溶液相中一起反应的试剂。该方法的缺点包括难以分离和纯化产物。固相肽合成更常见并且具有许多优点，优点包括方便的分离和纯化以及适于自动化(Bodanszkyet al,In Peptide Synthesis,John Wiley&Sons,1976)。已经开发了许多肽合成树脂以允许合成各种肽。这些包括氯甲基聚苯乙烯树脂和2-氯代三苯甲基聚苯乙烯树脂(2-chlorotitryl polystyrene resins)。公开合成短肽的方法的专利的实例包括US 5,602,231、EP 0518655和US 6,879,289。
当用C-末端仲酰胺，例如布舍瑞林(buserelin)中的C-末端仲酰胺，制备本发明化合物时，制备化合物的一种方法如下，并在以下的方案I中描述。肽可以组装在固体载体上，通常使用2-氯代三苯甲基聚苯乙烯树脂，但是对于本领域技术人员来说其他固体载体也是显而易见的。加载第一个氨基酸，然后脱保护以暴露反应性胺基，然后将其用于偶联到下一个氨基酸上。这又可以去保护和偶联。在多轮延伸后，获得所需的肽序列。然后通过TFA或类似试剂的作用将肽从树脂上切下。注意，当在最终化合物中需要叔丁基侧链时，重要的是保持足够低的反应时间，使得它不会完全裂解。一些叔丁基将裂解，但这可以在纯化中去除。最后，通过将C末端去保护的肽与选择的伯胺偶联来制备仲酰胺。尽管本领域技术人员将能够确定可以组合使用以实现酰胺键形成的其他活化剂和碱，偶联反应通常使用HBTU和DIPEA。
方案I
当用C-末端伯酰胺，例如曲普瑞林中的C-末端伯酰胺，制备本发明化合物时，制备化合物的一种方法如下，并在以下的方案II中描述。肽可以组装在固体载体上，通常使用Ramage树脂，但是对于本领域技术人员来说其他固体载体也是显而易见的。加载第一个氨基酸，然后脱保护以暴露反应性胺基，然后将其用于偶联到下一个氨基酸上。这又可以去保护和耦合。在多轮延伸后，获得所需的肽序列。然后通过TFA或类似试剂的作用将肽从树脂上切下。尽管本领域技术人员将能够确定可以组合使用以实现酰胺键形成的其他活化剂和碱，偶联反应通常使用HBTU和DIPEA。
方案II
式(I)的化合物可以通过组合上述方法以及本领域技术人员已知的其他方法制备。
本发明化合物的一般用途
本文所述的化合物可用于医学、医学研究或用于此类用途的组合物的制备中。此外，本发明还涉及如本文所述的化合物P1-P21，其用于医学、医学研究或用于此类用途的组合物的制备。因此，当在下文中术语“本发明化合物”与医学用途或药物组合物一起使用时，该术语还旨在包括化合物P1-P21，条件是这些化合物还不为这种用途所知。
此外，认为该化合物显示出用于治疗细胞内感染和相关疾病的改善的性质，包括与II型GnRH受体相比降低的与I型GnRH受体的结合。
当这些感染单独发生或与病毒剂或病毒性疾病相关或与原发性或继发性免疫缺陷的其他原因相关时，认为本发明化合物可用于治疗细胞内细菌、真菌和原生动物感染，例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、引起非典型疾病的分枝杆菌(Mycobacteria causing atypical disease)、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌(Mycobacterium avium and M.intracellulare，也称为如鸟-胞内分枝杆菌复合体，Mycobacterium avium-intracellulare complex，或MAC)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、海鱼分枝杆菌(M.marinum)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、戈登分枝杆菌(M.gordinae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、生殖支原体(M.genitalium)、人支原体(M.hominis)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、微小脲原体(U.parvum)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，以及治疗细胞内原生动物感染，例如弓形虫(Toxoplasma gondii)、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、隐孢子虫(Cryptosporidium)和利什曼原虫(Leishmania)，以及细胞内真菌感染，例如荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和脑炎原虫(Encephalitozoon cuniculi)。原发性免疫缺陷的原因包括遗传性遗传缺陷和体细胞突变，而继发性免疫缺陷可能由例如上述病毒感染引起，或由遗传性或非遗传性疾病如糖尿病或营养不良引起，或由诸如免疫抑制剂的药剂、药物滥用或其他环境因素引起。
此外，本文公开的本发明化合物可用于病毒性疾病、病症和症状的联合治疗，例如治疗感染病毒的患者或患有病毒性疾病的患者，病毒性疾病例如HIV、腺病毒、甲病毒、虫媒病毒、博尔纳病、布尼亚病毒、杯状病毒、尖锐湿疣、冠状病毒、柯萨奇病毒、巨细胞病毒、登革热病毒、羊传染性脓疱、爱泼斯坦-巴尔病毒、传染性红斑、汉坦病毒、病毒性出血热、病毒性肝炎、单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、传染性单核细胞增多症、流感、拉沙热病毒、麻疹、流行性腮腺炎、接触传染性软疣、副粘病毒、白蛉热、多瘤病毒、裂谷热、风疹、慢病病毒、天花、亚急性硬化性全脑炎、肿瘤病毒感染、西尼罗河病毒、黄热病病毒、狂犬病病毒和呼吸道合胞体病毒。
此外，认为化合物适用于癌症的治疗或联合治疗。尤其是肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱、骨癌、脑/中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、巨大淋巴结增生症、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌和下咽癌、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性粒单核细胞白血病、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺类癌、淋巴瘤、恶性间皮细胞瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔癌和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、基底细胞和鳞状细胞皮肤癌、黑色素瘤、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
因此，本发明化合物的有利性质可包括以下中的一种或多种：
-与I型GnRH受体相比，改善的与II型GnRH受体的结合
-改善的MHC I类刺激
-改善的MHC II类刺激
-改善的免疫调节
-改善的抗原呈递细胞的激活
-改善的T细胞应答
-改善的抗病毒活性
-改善的抗癌活性
-改善的MHC II抗原呈递
-改善的MHC I抗原呈递
包含本发明化合物的药物组合物
本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的化合物和一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体。本章主要涉及新型GnRH类似物的配方。在新化合物对I型GnRH受体具有作用且该作用是不希望的并导致去势或类似效果的情况下，含有性激素的组合物是本领域已知的并且可以共同给药。
本发明化合物或其制剂可以通过任何常规途径给药，例如但不限于，可以肠胃外、口服、局部或通过粘膜(包括口腔、舌下、透皮、阴道、直肠、鼻、眼等)、通过医疗设备(例如支架)、通过吸入给药。在一段时间内治疗可以由单次施用或多次施用组成。
治疗可以是每天一次、每天两次、每天三次、每天四次等，取决于待治疗的具体疾病和待治疗患者的体重和年龄。治疗也可以通过连续给药，例如，通过滴注静脉内给药。
虽然本发明化合物可以像这样给药，但优选将其与一种或多种可接受的载体一起作为药物制剂提供。在与本发明化合物相容并且对其接受者无害的意义上，载体必须是“可接受的”。合适的载体的实例在下面更详细地描述。
制剂可以方便地以合适的包括单位剂型在内剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。这些方法包括使活性成分(本发明化合物)与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，制剂通过将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀且紧密地结合在一起来制备，然后，如果需要，使产品成形。
本发明化合物通常通过任何常规给药途径给药，通常通过口服或任何肠胃外途径，以包含活性成分的药物制剂的形式给药，任选地以无毒有机酸或无机酸或碱、加成盐的形式，并以药学上可接受的剂型给药。取决于病症和待治疗的患者，以及给药途径，组合物可以不同的剂量和/或频率给药。
药物组合物在制造和储存条件下必须是稳定的；因此，如果必要的话，应该防止微生物如细菌和真菌的污染作用。在液体制剂如溶液、分散液，乳液和悬浮液的情况下，载体可以为含有例如以下物质的溶剂或分散介质：水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、植物油、及其合适的混合物。
例如，本发明化合物可以以片剂、胶囊、薄膜、胚珠(ovule)、酏剂、溶液、乳液或悬浮液的形式口服、含服或舌下给药，其可含有调味剂或着色剂。
适合于口服给药的本发明制剂可以作为离散单元存在，例如胶囊，扁囊剂或片剂，每个含有预定量的活性成分；作为多个单元存在，例如片剂或胶囊形式；作为粉末或颗粒存在；作为水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液存在；或者作为水包油液体乳液或油包水液体乳液存在。活性成分也可以以大丸剂、药糖剂或糊剂形式存在。
适于口服给药的本发明化合物的溶液或悬浮液还可含有一种或多种溶剂，包括水、醇、多元醇等，以及一种或多种赋形剂，如pH调节剂、稳定剂、表面活性剂、增溶剂、分散剂、防腐剂、香料等。具体实例包括例如N,N-二甲基乙酰胺、分散剂，例如聚山梨醇酯80、表面活性剂和增溶剂，例如，聚乙二醇、Phosal 50 PG(由磷脂酰胆碱、大豆脂肪酸、乙醇、甘油单酯/甘油二酯、丙二醇和抗坏血酸棕榈酸酯组成)。根据本发明的制剂还可以为乳液形式，其中根据式(I)的化合物可以存在于乳液中，例如水包油乳液或油包水乳液。油可以为天然或合成油或任何类似油的物质，例如大豆油或红花油或其组合。
片剂可含有赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖(例如乳糖一水合物或无水乳糖)、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸、丁基化羟基甲苯(E321)、交联聚维酮、羟丙甲纤维素、崩解剂，例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐、和造粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、聚乙二醇8000、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。此外，可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。
片剂可以通过压制或模塑制得，任选地含有一种或多种辅助成分。压制片剂可以通过在合适的机器中压制自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性成分，任选地与粘合剂(例如聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羟基乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模塑用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物来制备。片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且可以配制成使其中的活性成分缓慢或受控释放，例如使用不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放曲线。
类似类型的固体组合物也可用作明胶胶囊中的填充剂。就此而言，优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖或高分子量聚乙二醇。对于含水悬浮液和/或酏剂，本发明化合物可与各种甜味剂或调味剂、着色剂或染料、乳化剂和/或悬浮剂以及稀释剂(例如水、乙醇、丙二醇和甘油)、以及它们的组合混合。
适于在口腔中局部给药的制剂包括：含有调味基质(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)的活性成分的锭剂；润喉糖(pastille)，其包括在惰性基质(例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性成分；和漱口水，其包含在适合的液体载体中的活性成分。
适于局部给药的药物组合物可以配制成膏剂、霜剂、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、糊剂、凝胶、浸渍敷料剂、喷雾剂、气雾剂或油剂、透皮装置、扑粉(dusting powder)等。这些组合物可通过含有活性剂的常规方法制备。因此，它们还可以包含相容的常规载体和添加剂，例如防腐剂、有助于药物渗透的溶剂，霜剂或膏剂中的润肤剂和用于洗剂的乙醇或油醇。这些载体可以占组合物的约1％至约98％。更常见的是，它们将占组合物的约80％。仅作为说明，通过将足量的含有约5-10％重量的化合物的亲水性材料和水以足够的量混合，来制备霜剂或膏剂，以产生具有所需稠度的霜剂或膏剂。
适于透皮给药的药物组合物可以预先设定为离散的贴剂，其旨在与受体的表皮保持长时间的紧密接触。例如，可通过离子电渗从贴剂递送活性剂。
对于施用于外部组织(例如口腔和皮肤)，组合物优选作为局部霜剂或膏剂施用。当配制成膏剂时，活性剂可与石蜡或水混溶性软膏基质一起使用。
或者，可以将活性剂配制成具有水包油乳膏基质或油包水基质的霜剂。
对于肠胃外给药，使用活性成分和无菌载体制备流体单位剂型，例如但不限于水、醇、多元醇、甘油和植物油，优选水。取决于使用的载体和浓度，活性成分可以是胶状的、悬浮的或溶解在载体中。在制备溶液时，可将活性成分溶解在注射用水中并过滤灭菌，然后装入合适的小瓶或安瓿中并密封。
有利地，诸如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂的试剂可以溶解在载体中。为了增强稳定性，可以在填充到小瓶中之后冷冻组合物并在真空下去除水。然后将干燥的冻干粉末密封在小瓶中，并且可以提供附带的注射用水小瓶，以在使用前重新配制液体。
适用于注射用途的本发明药物组合物包括无菌水溶液或分散液。此外，组合物可以是无菌粉末的形式，用于临时制备这种无菌可注射溶液或分散体。在所有情况下，最终的可注射形式必须是无菌的并且必须是有效的流体以便于注射。
胃肠外悬浮液以与溶液基本相同的方式制备，不同之处在于活性成分悬浮在载体中而不是溶解，并且不能通过过滤完成灭菌。活性成分可以在悬浮于无菌载体中之前通过暴露于环氧乙烷来灭菌。有利地，组合物中包含表面活性剂或润湿剂以促进活性成分的均匀分布。
应当理解，除了上面特别提到的成分之外，本发明的制剂可以包括本领域中常规的与所讨论的制剂类型有关的其他试剂，例如适合口服给药的制剂可包括调味剂。本领域技术人员将知道如何选择合适的制剂以及如何制备它(参见例如Remington’sPharmaceutical Sciences 18 Ed.或更新版本)。本领域技术人员还将知道如何选择合适的给药途径和剂量。
本领域技术人员将认识到，本发明化合物的单个剂量的最佳量和间隔将取决于所治疗病症的性质和程度、给药的形式、途径和部位、以及所治疗的特定个体的年龄和状况。并且医生将最终确定要使用的适当剂量。该剂量可以适当地重复进行。如果产生副作用，则可以根据正常的临床实践改变或减少剂量的量和/或频率。
药物组合物也可以是两部分组合物，其中一部分含有GnRH类似物，另一部分含有性激素。这两个部分可以组合，例如以双层片剂形式组合，或者它们可以例如以胶囊中的丸粒的形式存在。含有GnRH类似物的已知组合物和含有性激素的已知组合物也可用于本发明的方法中。
除非上下文另有要求，否则本文提及的所有％值均为％w/w。
序列表
根据WlPO标准ST.25制备序列表。在序列表中，化合物1-63和P1-P21的非天然氨基酸以下列方式表示为相应的天然氨基酸：
在序列表中，第1-63条对应于化合物1-63，第64-78条对应于化合物P1-P15。第79和80条对应于野生型GnRH I和GnRH II。第81-84条对应于引物。第85-89条对应于化合物64-68。第90-95条对应于化合物P16-P21。然而，不要求保护序列表中所列的序列SEQ IDNo:1-78和85-89，即没有上述非天然氨基酸的序列，将其包括在内仅为符合EPC R.30(1)的要求。
重复序列表中的独立文本
为符合WIPO标准ST.25第36段的规定，现在在说明书的主要部分重复序列表中数字标识符<223>下的独立文本：
定义
本文使用的“一种”和“一个”是指一(种)或多于一个(种)(即至少一个(种))语法对象。举例来说，“类似物”表示一种类似物或多于一种类似物。
如本文所用，术语“immunorhelins”和“本发明化合物”可互换使用，并且是指式(I)的化合物。
本发明化合物的药学上可接受的盐包括由药学上可接受的无机或有机酸或碱形成的常规盐以及季铵的酸加成盐。合适的酸盐的更具体实例包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、甲酸、乳酸、马来酸(maleic)、酒石酸、柠檬酸、棕榈酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、硬脂酸(steroic)、单宁酸(tannic)等。其它酸(例如草酸)虽然本身不是药学上可接受的，但可用于制备可用作获得本发明化合物及其药学上可接受的盐的中间体的盐。合适的碱性盐的更具体实例包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲葡糖胺和普鲁卡因盐。
附图说明
图1：用浓度增加的GnRH II刺激T细胞后的MHC I类的表达。来自健康供体的PBMC用GnRH II和IL-2刺激72小时。数据点代表用流式细胞术测量的CD4+T细胞(蓝色三角形)或CD8+T细胞(黑色方块)上MCH I类表达的平均荧光强度。
图2：用浓度增加的GnRH I类似物(红色)和GnRH II(黑色)刺激T细胞后的MHC I类的表达。来自健康供体的PBMC用GnRH I类似物或用GnRH II和IL-2刺激72小时。数据点代表用流式细胞术测量的CD4+T细胞(A)或CD8+T细胞(B)上MCH I类表达的平均荧光强度。
图3：用浓度增加的GnRH I类似物(红色)和GnRH II(黑色)刺激CD4+CD14+单核细胞后的MHC I类的表达。来自健康供体的CD14+单核细胞PBMC用GnRH I类似物或用GnRH II和IL-2刺激72小时。数据点代表用流式细胞术测量的CD4+CD14+单核细胞上MCH I类表达的平均荧光强度。
图4：用定量实时PCR分析的人T细胞中的GnRH受体表达。条形代表GnRHR I或GnRHRII mRNA的比例，其被归一化为分选的原初T细胞(白色条)或记忆T细胞(灰色条)中RNA聚合酶II表达。使用MCF-7乳腺癌细胞系(黑色条)作为阳性对照。
图5：预期数据：在存在或不存在睾酮的情况下，本发明化合物抑制感染的小鼠肺中的分枝杆菌数。通过在细菌平板上培养来自感染小鼠的肺组织细胞溶解物并计数菌落来评估菌落形成单位(CFU)。
具体实施方式
试验
一般生物学方法
可以使用下述一种或多种方法测试本发明化合物对GnRH受体的优先作用：
I.GnRH受体在T细胞上的表达
用荧光表面标记物抗体CD45RA、CD45RO和CD4标记人原初T细胞和记忆T细胞，并用流式细胞术分选。用Rnaeasy试剂盒(Qiagen)提取总RNA，并用iScript select cDNA合成试剂盒(Biorad)逆转录。用SYBR Green(Applied Bi-osystem)扩增模板cDNA，并在CFX96 PCR(Biorad)上运行。将I型GnRH受体和II型GnRH受体mRNA的比例归一化为分选的原初T细胞或记忆T细胞中的RNA聚合酶II表达。MCF-7乳腺癌细胞系用作阳性对照。
引物序列：
I型GnRH受体
正向5'-tgc ctc ttc atc atc cct ct-3'
反向5'-gca aat gca acc gtc att tt-3'
II型GnRH受体
正向5'-act gtt caa tgg ctg gct gt-3'
反向5'-gcc ccc aga agt ttc ctt ac-3'
I.GnRH I对GnRH II试验
在制作的用于表达I型或II型GnRH受体的细胞上通过转染测试化合物。将细胞暴露于标记的GnRH化合物，洗涤，然后通过测量细胞上的标记进行评估。直接测量(放射性同位素标记或荧光标记)或间接测量(生物素标记的肽)标记。
在分别表达I型GnRH和II型GnRH受体的细胞系中测量由GnRH化合物诱导的信号传导。使用竞争测定法研究GnRH化合物对I型G nRH和II型GnRH受体的各自亲和力。使用Fluo-4-Direct标记的细胞通过流式细胞仪或通过活细胞成像显微镜测量钙通量，以评估它们建立ED50值的效力。还使用针对p-ERK或p-JNK的抗体通过免疫印迹研究信号传导。
为了评估细胞激活对LH和FSH产生的影响并将其与免疫相关功能的刺激进行比较，研究了化合物对表达II型GnRH或I型GnRH受体的垂体细胞和免疫细胞的作用。
II.细胞特异性表面标志物和MHC II类和MHC I类的表达
通过Ficoll-Hypaque密度离心纯化来自健康供体的人外周血单核细胞(PBMC)。将细胞在补充有10％胎牛血清、100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基(Invitrogen)中在37℃、5％CO2的条件下培养24-72小时。用根据本发明的化合物刺激细胞，并使用流式细胞术分析细胞特异性表面标记物和MHC II类(来自BD Pharmingen的单克隆抗体)的表达。
为了在体外测定中测试一组本发明的化合物的免疫调节性质并评估它们在单核细胞上诱导MHC II类表达的能力。首先，当在共培养物中使用已知的GnRH类似物来刺激单核细胞时。可以看到相对于背景、MFI表示的MHC类表达的小幅增加。相反，当使用本发明的化合物时，我们可以检测到MHC II类的细胞表面表达的更大表达。如果这是观察结果，我们可能已经鉴定出一种对MHC II类表达具有影响的化合物，其允许从核内体和溶酶体途径增加MHC II类和I类肽的转化(turnover)和呈递。该发现将增强源自细胞内病原体的肽的呈递，并促进CD4+辅助T细胞以及CD8+T细胞激活，扩增和诱导灭菌免疫。
材料
除非另有说明，否则以下实施例中使用的所有试剂均来自商业来源。
本发明化合物对细胞内细菌的理论实例
材料与方法
通过吸入含有细菌的气溶胶使雄性小鼠感染结核分枝杆菌。感染剂量为每只小鼠100-1000个细菌。感染细菌后，通过适当的途径以合适的剂量施用GnRHII或GnRHI相关化合物(单独或与睾酮一起)或载体1-2周。将小鼠处死并取出肺，均质化并铺在含有支持结核分枝杆菌生长的培养基的细菌培养皿上。孵育3-4周后，在37℃的加热箱中，通过计数平板上的细菌菌落来量化小鼠肺中的细菌量。
预期的结果
该实验的预期的结果是：与用对照载体处理的小鼠对比，GnRH化合物处理的小鼠的肺中的结核分枝杆菌细菌的量减少。我们还预期GnRHII相关化合物在这方面优于GnRHI相关化合物。我们预期睾酮的共同给药不会对GnRH化合物的作用程度产生任何影响。
去势效果的测量及其补偿
由本发明化合物诱导的去势及其任何补偿可通过测量相关性激素的循环水平来确定。如何进行这种测量是本领域技术人员已知的。
一般合成方法
方法A
按上图所示，使用标准Fmoc(芴甲氧羰基)固相合成制备肽。使用受保护的氨基酸(如果需要，使用Fmoc和tBu或Trt)，并在2-氯三苯甲基聚苯乙烯树脂上进行合成。反应以A、B、C的顺序进行，然后进行B和C的多次重复以构建所需的肽。当最后的氨基酸(焦谷氨酸-注意，反应C用于这样做，尽管氨基酸不是Fmoc保护的)已加入，最后的两个反应，即反应D和E，按此顺序进行以产生本发明化合物。
反应A：将树脂悬浮在二氯甲烷中(与树脂相比为10-20体积当量)并在室温下搅拌。在二异丙基乙胺(6当量)存在下，将Fmoc保护的氨基酸(2当量)加入到1当量的树脂中。将反应在室温下搅拌0.5-1小时。通过过滤收集树脂，用DMF洗涤6次，然后直接用于下一步骤。
反应B：在室温下通过在二甲基甲酰胺(与树脂相比5-10体积当量)中处理哌啶(20％)去除Fmoc保护基团。将反应物搅拌最多1小时，通过过滤收集树脂，然后用DMF洗涤树脂6次，并直接用于下一步骤。
反应C：将Fmoc保护的氨基酸(4当量)溶解在DMF中并加入DI-PEA(2当量)。在室温下搅拌1分钟后，将这些加入到反应B中的树脂负载的氨基酸(1当量)中，并加入HBTU(1当量)处理。将反应物搅拌最多1小时，然后通过过滤收集树脂，用DMF洗涤6次，并直接用于下一步骤。下一步为反应B或反应D，取决于靶序列。
反应D：通过用含有3-5％三氟乙酸的二氯甲烷进行处理，将保护的肽从树脂上裂解下来。通过过滤除去树脂，通过用冰冷的乙醚沉淀产生肽，并通过离心收集。将固体在另外的乙醚中洗涤，然后在用于下一步骤前在真空下干燥。
反应E：通过将来自反应D(1当量)的肽溶解在DMF中形成C-末端酰胺，加入单烷基胺(20-50当量)和HBTU(2-3当量)并在室温下搅拌反应物最多3小时。用水稀释反应，然后如下详述纯化粗肽。
方法B
按上图所示，使用标准Fmoc固相合成制备肽。使用受保护的氨基酸(如果需要，使用Fmoc和tBu或Trt)，并在Ramage树脂上进行合成。反应以A、B、C的顺序进行，然后进行B和C的多次重复以构建所需的肽。当最终的氨基酸(焦谷氨酸-注意，反应C用于这样做，尽管氨基酸不是Fmoc保护的)已经加入，最后的两个反应，即反应D和E，以此顺序进行以产生本发明化合物。
反应F：将Fmoc Ramage树脂悬浮在含有20％哌啶的DMF(与树脂相比为5-10体积当量)中。在室温下搅拌反应最多1小时，通过过滤收集树脂，用DMF洗涤6次，直接用于下一步反应。
反应G：将Fmoc保护的氨基酸(5当量)溶解在DMF中并加入DI-PEA(2当量)。在室温下搅拌1分钟后，将这些加入到反应F中的树脂负载的氨基酸(1当量)中，并加入HBTU(1当量)处理。将反应物搅拌最多1小时，然后通过过滤收集树脂，用DMF洗涤6次，并直接用于下一步骤。
反应H：在室温下通过用含有哌啶(20％)的二甲基甲酰胺(与树脂相比为5-10体积当量)进行处理去除Fmoc保护基团。将反应物搅拌最多1小时，通过过滤收集树脂，然后用DMF洗涤树脂6次，并直接用于下一步骤。
反应I：将Fmoc保护的氨基酸(4当量)溶解在DMF中并加入DI-PEA(2当量)。在室温下搅拌1分钟后，将这些加入到反应H中的树脂负载的氨基酸(1当量)中，加入HBTU(1当量)处理。将反应物搅拌最多1小时，然后通过过滤收集树脂，用DMF洗涤6次，并直接用于下一步骤。下一步为反应H或反应J，取决于靶序列。
反应J：通过用含有2.5％水、2.5％三异丙基硅烷和5％二氯甲烷的90％三氟乙酸处理，将肽从树脂上裂解下来。通过过滤除去树脂，通过用冰冷的乙醚沉淀产生肽，并通过离心收集。然后按如下详述纯化粗肽。
纯化
将粗肽分别溶解在乙腈/H2O(1:1，v/v)中，并通过制备型HPLC用C18柱使用水(0.1％TFA)-乙腈(0.1％TFA)梯度洗脱纯化。通过分析型HPLC确认肽的最终纯度。将肽在-20℃下储存前冻干。
化合物分析-鉴定和纯度
分析方法A.
为了分析，将化合物溶解在甲醇:水(9:1，0.1mg/ml)中，并将150μl的部分置于HPLC微量瓶中，并以14000rpm离心3分钟。然后通过具有二极管阵列(HPLC-DAD)和质谱(HPLC-MS)检测的高效液相色谱检查样品。使用Agilent 1100HPLC系统进行HPLC-DAD-MS，该系统包括四元液相泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器，其耦合至Waters ZQ单四极杆质谱仪。所有化合物使用相同的反相Waters Xselect CSH C18,2.1mm×50mm，3.5μm粒径柱，并配有Waters VanGuard CSH C18,2.1mm×5mm、3.5μm粒径保护柱和WatersAcquity、0.2μm在线柱式过滤器。该柱以1ml/分钟的流速使用，保持在60℃的温度。使用的溶剂为含有0.17％甲酸的95％乙腈、5％水(溶剂B)和含有10mM甲酸铵、0.2％甲酸的水溶液(溶剂A)，具有如下梯度：从0-0.2分钟为5％溶剂B，0.2-9.3分钟为5-50％溶剂B，9.3-9.5分钟为50-95％溶剂B，9.5至11分钟为95％溶剂B，11至11.05分钟为95-5％溶剂B，以及11.05-11.5分钟用5％溶剂B再平衡。氮气用作辅助气体和保护气体。源电压设定为3400V，锥电压设定为31V，气体流速为50L/小时，干燥气体流速为550L/小时，干燥气体温度为350℃。
化合物分析-溶液中的溶解度和稳定性
分析方法B.
对于溶解度和稳定性分析，将化合物溶解(0.2mg/ml)在磷酸盐缓冲溶液(PBS，10mm，pH7.4)中并在室温下振荡20分钟。取T＝0小时样品(80μl)并以14000rpm离心3分钟，然后按如上所述通过分析方法A分析。将大量样品置于37℃的Techne Roller-Blot HB-3DRolling Hybridiser中，并且仅在T＝4、24和96小时的时间点取样(80μl)时去除。将样品以14000rpm离心3分钟，然后按如上所述通过HPLC-DAD-MS分析。在每个时间点记录280nm下的UV曲线下面积。
实施例
实施例1-化合物合成
根据一般合成方法中所述的方法制备本发明的化合物。
实施例2-溶解度分析
按一般方法中所述测试本发明化合物的溶解度。然后根据1-5的等级对溶解度进行分级，其中1是最可溶的，5是最不可溶的。
实施例3-稳定性分析
按一般方法中所述测试本发明化合物在水性介质(PBS pH7.4)中的稳定性。然后根据等级对稳定性进行分级，其中t1/2>96分钟显示为+，并且小于此值的稳定性显示为-。
实施例4-GnRH R刺激
使用CHO-K1细胞(Genscript)通过钙测定评估本发明化合物刺激GnRHR的能力，详情参见一般方法。然后将活性记录为1μM下的刺激百分比。
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本申请中提及的所有参考文献，包括专利和专利申请，都通过引用以最大可能的方式并入本文。
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<223> MGnRH II的人造类似物
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<212> PRT
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<223> MGnRH II的人造类似物
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<212> DNA
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<223> I型GnRH受体反向引物
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<212> DNA
<213> 智人
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<223> II型GnRH受体正向引物
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<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> II型GnRH受体反向引物
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<223> MGnRH II的人造类似物
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Glu His Trp Ser His Trp Trp Tyr Pro
1 5

Claims (21)

1.式(I)的化合物
或其药学上可接受的盐，并且其中
其中
其中
其中
其中R5＝甲基、乙基、CH2CF3、异丙基、正丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丙基CH2CONH2或NHCONH2，
并且条件是本发明不包括以下化合物：
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R1、R3和R4中的至少一个选自下表中的II型，并且R1、R3和R4中未选自II型的那些选自下表中的I型：
3.根据权利要求2所述的化合物，其中R1、R3和R4中的至少两个或三个选自下表中的II型：
4.根据权利要求2所述的化合物，其中R1、R3和R4中的一个选自下表中的I型，R1、R3和R4中的两个选自下表中的II型：
5.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中R5＝乙基或CH2CONH2。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中R5＝甲基、异丙基、正丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中式(I)的化合物选自：
8.药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的化合物在医药中的用途。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的化合物在治疗细胞内细菌感染、细胞内真菌感染或细胞内原生动物感染中的用途。
11.选自如权利要求1所定义的P1-P21的化合物在治疗细胞内细菌感染、细胞内真菌感染或细胞内原生动物感染中的用途。
12.根据权利要求10或11中所述的化合物在治疗细胞内感染的用途，所述细胞内感染选自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、引起非典型疾病的分枝杆菌(Mycobacteria causing atypicaldisease)、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌(Mycobacteriumavium and M.intracellulare，也称为如鸟-胞内分枝杆菌复合体，Mycobacterium avium-intracellulare complex，或MAC)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、海鱼分枝杆菌(M.marinum)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、戈登分枝杆菌(M.gordinae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、生殖支原体(M.genitalium)、人支原体(M.hominis)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、微小脲原体(U.parvum)、肺炎衣原体(Chlamydophilapneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P vivax)、克氏锥虫(Trypanosomacruzi)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、利什曼虫(Leishmania)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和脑炎原虫(Encephalitozoon cuniculi)。
13.一种治疗或预防由细胞内细菌感染、细胞内真菌感染或细胞内原生动物感染引起的疾病的方法，其包括向有此需要的人或动物个体施用治疗有效量的权利要求1-7中任一项所述的化合物。
14.一种治疗或预防由细胞内细菌感染、细胞内真菌感染或细胞内原生动物感染引起的疾病的方法，其包括向有此需要的人或动物个体施用治疗有效量的选自权利要求1中所定义的P1-P21的化合物。
15.一种治疗或预防由细胞内细菌感染、细胞内真菌感染或细胞内原生动物感染引起的疾病的方法，其包括向有此需要的人或动物个体施用治疗有效量的权利要求1-7中任一项所述的化合物以及天然性激素、半合成性激素或合成性激素。
16.一种治疗或预防由细胞内细菌感染、细胞内真菌感染或细胞内原生动物感染引起的疾病的方法，其包括向有此需要的人或动物个体施用治疗有效量的选自如权利要求1所定义的P1-P21的化合物以及天然性激素、半合成性激素或合成性激素。
17.一种治疗或预防由细胞内细菌或原生动物感染引起的疾病的方法，其包括向有此需要的男人或雄性动物个体施用治疗有效量的权利要求1-7中任一项所述的化合物以及天然雌激素、半合成雌激素或合成雌激素，并任选地进一步施用天然孕激素、半合成孕激素或合成孕激素。
18.一种治疗或预防由细胞内细菌感染、细胞内真菌感染或细胞内原生动物感染引起的疾病的方法，其包括向有此需要的人或动物个体施用治疗有效量的选自权利要求1中定义的P1-P21的化合物以及天然雌激素、半合成雌激素或合成雌激素，并任选地进一步施用天然孕激素、半合成孕激素或合成孕激素。
19.一种治疗或预防由细胞内细菌感染、细胞内真菌感染或细胞内原生动物感染引起的疾病的方法，其包括向有此需要的男人或雄性动物个体施用治疗有效量的权利要求1-7中任一项所述的化合物以及天然睾酮、半合成睾酮或合成睾酮。
20.一种治疗或预防由细胞内细菌感染、细胞内真菌感染或细胞内原生动物感染引起的疾病的方法，其包括向有此需要的人或动物个体施用治疗有效量的选自如权利要求1所定义的P1-P21的化合物以及天然睾酮、半合成睾酮或合成睾酮。
21.根据权利要求13-20中任一项所述的方法，其中所述细胞内感染选自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、引起非典型疾病的分枝杆菌(Mycobacteria causingatypicaldisease)、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌(Mycobacterium avium andM.intracellulare，也称为如鸟-胞内分枝杆菌复合体，Mycobacterium avium-intracellulare complex，或MAC)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、海鱼分枝杆菌(M.marinum)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、戈登分枝杆菌(M.gordinae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、生殖支原体(M.genitalium)、人支原体(M.hominis)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、微小脲原体(U.parvum)、肺炎衣原体(Chlamydophilapneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P vivax)、克氏锥虫(Trypanosomacruzi)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、利什曼虫(Leishmania)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和脑炎原虫(Encephalitozoon cuniculi)。
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