CN110325206A

CN110325206A - 用于管理病毒感染的多肽

Info

Publication number: CN110325206A
Application number: CN201780086265.XA
Authority: CN
Inventors: S·乔治; J·雅各布; D·霍尔特豪森; S·H·李; J·沙尔图尼
Original assignee: AMORY UNIV; Rajiv Gandhi Centre for Biotechnology
Current assignee: AMORY UNIV; Emory University; Rajiv Gandhi Centre for Biotechnology
Priority date: 2016-12-13
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2019-10-11
Also published as: US10898544B2; MX2019006943A; CA3046927A1; EP3554533B1; EP3909598A1; JP2020513418A; US20190307840A1; US11666630B2; EP3554533A1; EP3554533A4; AU2017377993A1; US20210138029A1; WO2018111580A1

Abstract

本文提供抗病毒多肽及使用方法。具体来说，这些多肽可包含Yodha氨基酸序列、其变体、衍生物或截短形式。在某些实施方案中，本发明涉及本文中公开的肽和组合物用于治疗或预防病毒感染的用途。

Description

用于管理病毒感染的多肽

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年12月13日提交的美国临时申请No.62/433,490和2017年3月2日提交的美国临时申请No.62/466,066的权益。这些申请各自的全文内容以引用的方式并入本文中用于所有目的。

关于联邦基金资助研究的声明

本发明在国立卫生研究院授予的R01AI100110、U19AI083019和R56AI110516下由政府支持来进行。政府具有本发明中的某些权利。

以引用的方式并入以办公室电子档案系统(EFS-WEB)的TEXT文件形式递交的材料

以text格式代替纸印本提供与本申请相关的序列表，并以引用的方式并入说明书中。含有序列表的text文件的名称为17057PCT_ST25.txt。text文件为23KB，创建于2017年12月1日并通过EFS-Web电子递交。

发明背景

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是属于黄病毒科的一种蚊媒病毒并且与西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)、登革热病毒(Dengue virus，DENV)和日本脑炎病毒(JapaneseEncephalitis virus，JEV)密切相关(Gould等人，Lancet 371,500-509,(2008))。与DENV类似，ZIKV通过受感染的伊蚊属蚊虫叮咬来传播(Dick等人，Trans R Soc Trop Med Hyg46,509-520(1952)；Shan等人，Cell Host&Microbe 19,891-900,(2016))。然而，与其它黄病毒不同，ZIKV可由受感染母体垂直传播给子宫中正在发育的胎儿，导致先天性寨卡病毒综合征。先天性寨卡病毒综合征的特征为自然流产、胎儿大脑异常和小头畸形(Adams Waldorf等人，Nat Med 22,1256-1259,(2016)；Tabata等人，Cell Host Microbe 20,155-166,(2016)；Besnard等人，French Polynesia,Euro Surveill 19(2014)；Mysorekar等人，NEngl J Med 375,481-484,(2016)；Schuler-Faccini等人，MMWR Morb Mortal Wkly Rep65,59-62,(2016))。在成人中，ZIKV也与格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)有关，这是一种免疫系统侵袭神经系统的病症。近来已证实ZIKV的巴西毒株(Brazilianstrain)在实验的小鼠模型中导致出生缺陷(Lazear等人，Cell Host Microbe 19,720-730,(2016))。采用这种小鼠模型，已研发出一种在易感小鼠体内针对ZIKV激发提供完全防护的疫苗(Stettler等人，Science 353,823-826,(2016))。然而，考虑到疫苗可能促进抗体依赖性增强作用，这增加了感染易感性，与在DENV感染中观察到的类似(Dejnirattisai等人，Nat Immunol 17,1102-1108,(2016))。对抗ZIKV感染的潜在策略将是研发用于治疗或预防感染的抗病毒治疗。

登革热病毒(DENV)是感染人类最普遍的虫媒病毒病原体。这些蚊虫传播的病毒在大部分热带和亚热带国家极为普遍，使近一半的世界人口生活在DENV感染的风险下并且导致每年估计百万例感染(Mackenzie等人，Nat Med 10,S98-109,(2004))。DENV感染可导致多种症状，从亚临床型到自限性的类似流感的疾病登革热(DF)，再到具有血管渗透性增加导致血浆泄漏的特征的更严重并且威胁生命的登革出血热和休克综合征(DHF/DSS)、严重血小板减少症以及导致循环衰竭的低血压(Gubler,Novartis Found Symp277,3-16,(2006))。自上世纪中叶以来，DENV盛行率、感染率和疾病的严重度呈指数增加(Guzman等人，Nat Rev Microbiol 8,S7-S16,(2010))。尽管数十年来关注、需求并且为之努力，但仍无可用的登革热疫苗且疫苗候选物在临床前的发展和临床试验中继续遭遇障碍和安全问题。

流感是一个公共健康问题，因为其导致经济负担、发病率以及甚至死亡率。流感感染可导致各种疾病状态，从亚临床感染到轻度的上呼吸道感染和气管支气管炎、再到严重的偶尔会引起致命的病毒性肺炎。这种广泛范围严重性的原因由宿主的感染部位和免疫状态得以解释。就免疫学的观点而言，流感的最重要特征在于表面糖蛋白、血凝素和神经氨酸酶的快速不可预测的改变，称为抗原转变和漂移。这些改变最终导致出现新的流感毒株，其使得病毒可逃离免疫系统并且是几乎每年的流行病的原因(Laver等人，Nature 283,454-457(1980)；Laver等人，Philosophical Trans.Royal Soc.B,288(1029),313-326,(1980))。针对流感病毒的免疫受到病毒的这种明显抗原变异以及感染对呼吸道粘膜的束缚的限制。流感疫苗目前可用且许可是基于全灭活病毒或基于病毒表面糖蛋白。这些流感疫苗无法诱发完全、长期并且跨毒株的免疫力。

因此，需要改良的组合物和方法来防御病毒病原体。本文所述的组合物和方法解决这些和其它需要。

发明领域

根据如本文中具体呈现和广泛描述的公开材料、化合物、组合物、试剂盒和方法的目的，公开的主题涉及化合物、组合物、制备所述化合物和/或组合物的方法以及使用所述化合物和/或组合物的方法。

更具体来说，本文中公开具有抗病毒活性的分离肽以及包含多肽、其变体、衍生物的组合物。在一些实施方案中，多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与本文中公开的诸如选自SEQ ID NO:1-58和SEQ ID NO:59-77的氨基酸序列具有至少60％的相同性，例如选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:65的肽。例如，组合物可包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少60％序列相同性的氨基酸序列的多肽或由所述多肽组成。在其它实例中，组合物可包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:36或与SEQ ID NO:36具有至少60％序列相同性的氨基酸序列的多肽或由所述多肽组成。又在其它实例中，组合物可包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:56或与SEQID NO:56具有至少80％序列相同性的氨基酸序列的多肽或由所述多肽组成。在其它实例中，组合物可包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:57或与SEQ ID NO:57具有至少80％序列相同性的氨基酸序列的多肽或由所述多肽组成。又在其它实例中，组合物可包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:58或与SEQ ID NO:58具有至少60％序列相同性的氨基酸序列的多肽或由所述多肽组成。又在其它实例中，组合物可包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:65或与SEQ IDNO:65具有至少60％序列相同性的氨基酸序列的多肽或由所述多肽组成。在一些实施方案中，组合物中的多肽可包括至少一种修饰，诸如酰胺化或乙酰化。

在一些实施方案中，多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与本文中公开的例如选自SEQ ID NO:1-58或59-77或具有LFFX¹GTIX²LX³LC(SEQ ID NO:78)的氨基酸序列具有至少60％的相同性或由其组成；其中X¹为任何氨基酸；X²为任何氨基酸或S或N；且X³为任何氨基酸，在某些实施方案中，X¹为L、A、任何氨基酸或非L的任何氨基酸；且X³为S、A、任何氨基酸或非S的任何氨基酸。在某些实施方案中，多肽不大于18、20、22、25、27、30、35或40个氨基酸。

在一些实施方案中，多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与本文中公开的例如选自SEQ ID NO:1-58或59-77或具有LFFX¹GTIX²LX³LCX⁴DD(SEQ ID NO:79)的氨基酸序列具有至少60％的相同性或由其组成；其中X¹为任何氨基酸；X²为任何氨基酸、X³为任何氨基酸且X⁴为任何氨基酸。在某些实施方案中，X¹为L、A、任何氨基酸或非L的任何氨基酸；X²为S或N；且X³为S、A、任何氨基酸或非S的任何氨基酸；且X⁴为Q、E、A或任何氨基酸。在某些实施方案中，多肽不大于18、20、22、25、27、30、35或40个氨基酸。

在一些实施方案中，多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与本文中公开的例如选自SEQ ID NO:1-58或59-77或具有LFFX¹GTIX²LX³LCX⁴DDQERC(SEQ ID NO:80)的氨基酸序列具有至少60％的相同性或由其组成；其中X¹为任何氨基酸；X²为任何氨基酸、X³为任何氨基酸且X⁴为任何氨基酸。在某些实施方案中，X¹为L、A、任何氨基酸或非L的任何氨基酸；X²为S或N；且X³为S、A、任何氨基酸或非S的任何氨基酸；且X⁴为Q、E、A或任何氨基酸。在某些实施方案中，多肽不大于18、20、22、25、27、30、35或40个氨基酸。

在一些实施方案中，本发明涉及组合物，其包含：包含与本文中公开的氨基酸序列具有至少60％相同性的氨基酸序列的多肽或其衍生物或前药以及药学上可接受的载剂。

在某些实施方案中，本发明涉及包含编码本文中公开的肽的核酸的重组载体。在某些实施方案中，本发明涉及表达系统，其包含：包含编码本文中公开的肽的核酸的重组载体。在某些实施方案中，本发明涉及细胞，其包含：包含编码本文中公开的肽的核酸的重组载体。在某些实施方案中，本发明涉及一种载体，其包含编码本文中公开的肽的核酸和异源核酸序列。在某些实施方案中，本发明涉及一种载体，其包含与异源启动子序列可操作组合的编码本文中公开的肽的核酸。

在某些实施方案中，本发明涉及一种编码本文中公开的多肽的核酸，其中核苷酸序列变为含有至少一个相对于天然存在的序列而言非天然存在的取代和/或修饰，例如，相对于天然序列改变一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，本发明涉及一种编码本文中公开的多肽的核酸，其进一步包含标记。在某些实施方案中，核酸包含与异源启动子可操作组合的编码本文中公开的肽的序列。

在某些实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含本文中公开的肽和药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，药物组合物呈胶囊、药片、药丸、粉末、颗粒或凝胶的形式。在某些实施方案中，药物组合物呈无菌pH缓冲的水性盐溶液的形式，或呈配置成用于喷射液体的容器的形式，或呈具有装药(propellant)的密封容器的形式。在某些实施方案中，本发明涵盖制备本文中公开的用于治疗或预防病毒感染的药物。在某些实施方案中，药物组合物呈肠溶衣包裹的固体形式。在某些实施方案中，药物组合物中的药学上可接受的赋形剂为增溶剂。

组合物可进一步包括药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，组合物可为疫苗形式。疫苗可进一步包括药学上可接受的佐剂。

本文中还公开使用组合物的方法。组合物可用于预防或治疗病毒感染，诸如流感、HIV、寨卡或登革热感染。本文中公开的方法可包括给向受试者施用包含如本文所述的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述方法可进一步包括给受试者施用至少一种其它抗病毒化合物。

在某些实施方案中，本发明涉及预防或治疗有需要的受试者中病毒感染的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的本文中公开的多肽、其衍生物或前药。在某些实施方案中，病毒感染为寨卡病毒。在某些实施方案中，病毒感染为登革热病毒。在某些实施方案中，病毒感染为流感病毒。在某些实施方案中，病毒感染为人类免疫缺陷病毒(HIV)、慢病毒或逆转录病毒。

在某些实施方案中，多肽与以下组合施用：核苷逆转录酶抑配制物、非核苷逆转录酶抑配制物、蛋白酶抑配制物、融合或细胞进入抑配制物、整合酶抑配制物、CYP3A抑配制物或其组合。

在某些实施方案中，所述组合选自：阿巴卡韦(abacavir)和拉米夫定(lamivudine)的组合；阿巴卡韦、度鲁特韦(dolutegravir)和拉米夫定的组合；阿巴卡韦、拉米夫定和齐多夫定(zidovudine)的组合；阿扎那韦(atazanavir)和可比司他(cobicistat)的组合；地瑞那韦(darunavir)和可比司他的组合；度鲁特韦和利匹韦林(rilpivirine)的组合；依法韦仑(efavirenz)、恩曲他滨(emtricitabine)和富马酸替诺福韦酯(tenofovir disoproxil fumarate)的组合；埃替格韦(elvitegravir)、可比司他、恩曲他滨和富马酸替诺福韦艾拉酚胺(tenofovir alafenamide fumarate)的组合；埃替格韦、可比司他、恩曲他滨和富马酸替诺福韦酯的组合；恩曲他滨、利匹韦林和替诺福韦艾拉酚胺(tenofovir alafenamide)的组合；恩曲他滨、利匹韦林和富马酸替诺福韦酯的组合；恩曲他滨和替诺福韦艾拉酚胺的组合；恩曲他滨和富马酸替诺福韦酯的组合；拉米夫定和齐多夫定的组合；以及洛匹那韦(lopinavir)和利托那韦(ritonavir)的组合。

在某些实施方案中，本发明涉及生产包含本文中公开的肽、变体和衍生物以及其组合物的药物用于治疗或预防病毒感染。

其它优势将在下文的具体实施方式中部分描述，并且部分地由具体实施方式显而易见，或可通过实践下文所述各方面习得。下文所述的优势将通过在随附权利要求书中特定指出的要素和组合来实现和获得。应了解，前文的一般性描述和下文的详细描述只是示范性和解释性的，而并非限制。

说明书附图

图1A.筛选和识别针对寨卡病毒的蛙肽的数据。将宿主防御肽与ZIKV温育两小时，并在感染后72小时使用ZIKV的斑点形成分析(FFA)来测试病毒的生存力。使用OVA肽作为阴性对照(设定为100％的FFU/孔)。T测试，双尾p值p＝0.0077(**)。

图1B.使用溶血测试每种肽的细胞毒性。简单来说，通过浓度渐增的每种肽以及RBC溶解来处理2x10⁷个人红细胞。

图1C.显示Yodha肽(Brevenin总科)的氨基酸序列，由Hopps&Woods氨基酸亲水性标度来表示。

图1D.显示通过FFA对Yodha肽在ZIKV感染中的IC₅₀测量值。数据为来自至少三次独立实验的平均值±SEM。

图1E.使用高达200μM的更高浓度针对人类RBC测试Yodha肽和OVA肽的细胞毒性。通过浓度渐增的每种肽和RBC溶解来处理人红细胞。

图1F.检查Yodha肽诱发的ZIKV抑制作用随时间(5分钟至2小时)变化的动力学(肽浓度为20μM)。使用OVA肽作为阳性对照(设定为100％的FFU/孔)。值表示平均值±S.E.M。*P<0.05且**P<0.01；通过双因素方差分析(Two-way ANOVA)。

图2A.显示表明Yodha肽抑制ZIKV的所有4种毒株的数据。使寨卡病毒毒株PRVABC59、MR-766、DakAr 41524和P6-740暴露于50μM的Yodha或对照OVA肽。值表示平均值±S.E.M。****p<0.0001；通过双因素方差分析。

图2B.显示100μM的数据。

图3A.显示用Yodha肽处理减少ZIKV体外复制，作为实验设计的示意图。将Vero细胞单层首先用ZIKV感染且随后在感染后1h、24h、48h和72h用Yodha肽或对照OVA肽(40μM)处理。在感染后3、24、48和72小时收集培养物上清液并分析ZIKV。

图3B.显示用Yodha肽处理导致上清液中的ZIKV滴度显著减小。误差条指示通过双因素方差分析来评估四个技术复本统计显著性的SEM。

图4A.说明显示Yodha肽抑制ZIKV进入细胞的实验设置的示意图。

图4B.显示将ZIKV用200μM的Yodha肽或对照OVA肽处理30min且随后用于以0.5的MOI感染Vero细胞，并通过定量RT-PCR(qRT-PCR)确定ZIKV RNA的表达。细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)充当内部对照物。T测试双尾(**)p＝0.0028。

图4C.显示将模拟感染和ZIKV感染的Vero细胞进行荧光染色，ZIKV包膜(绿色)、α-微管蛋白(红色)和DAPI(蓝色)。

图4D.显示ZIKV暴露于对照ova肽或Yodha肽。

图4E.显示来自图4D的样本随后用于感染Vero单层。ZIKV包膜在对照物的细胞质中可见，但在经Yodha肽处理的Vero细胞中不可见。

图5A.透射电子显微镜的显微图显示Yodha肽破坏ZIKV。经OVA肽(对照物)或Yodha肽处理的ZIKV的TEM显微图。将ZIKV以200μM的肽只温育10分钟、用多聚甲醛固定且随后处理用于电子显微镜。Yodha肽处理导致形态损失和病毒颗粒聚集。

图5B.来自(5A)的经对照物或Yodha肽处理的ZIKV的放大图像。数据代表进行的三次实验。

图6A.列举Yodha肽(SEQ ID NO:1-24)的丙氨酸-扫描突变体。

图6B.显示与设定为0的Yodha肽相比，丙氨酸-扫描突变体肽的杀病毒活性的变化。T测试双尾p值(*)p＝0.021，(ns)非显著性p＝0.1553。

图6C.显示每个丙氨酸扫描突变体使用人红细胞测试细胞毒性。

图6D.显示：显示L和D氨基酸都对寨卡有效的数据。

图7A.显示Yodha肽的天然存在的变体抑制ZIKV——Yodha肽的天然变体的列表(SEQ ID NO:1、25-55)。

图7B.显示细胞毒性测试，其显示Yodha肽变体对人类RBC无毒。

图7C.显示测试Yodha肽的这些天然存在的变体中的每一种中和ZIKV的能力。除一种以外，所有变体均抑制ZIKV。

图7D.显示测试的截短和突变的Yodha肽(SEQ ID NO:56-58)。

图7E.显示突变肽抑制ZIKV的能力。

图7F.显示没有毒性。

图8A.显示Yodha肽中和DENV血清型1、2、3和4，以50μM的Yodha肽温育，并确定病毒斑点形成单位的％。

图8B.显示以160μM的Yodha肽温育的结果。较低剂量的Yodha肽对DENV 1、2和4有效。中和DENV 3需要较高剂量的Yodha肽。

图8C.通过FFA测量Yodha在DENV感染中的IC₅₀。

图8D.截短的Yodha变体12针对DENV3感染的剂量递增表明截短形式比全长Yodha肽更有效。使用OVA肽作为阴性对照且设定为100％病毒FFU/孔。

图9A.显示Yodha肽中和H1N1和H3N2人流感病毒。将Yodha肽与H1N1和H3N2病毒在37℃温育1小时，且然后将病毒涂布(plated)在MDCK细胞单层上。次日，使用斑点形成分析来观察病毒。

图9B.显示Yodha肽(47)针对流感病毒的多种亚型有效。

图9C.显示的数据表明Yodha肽与H2、H5、H7和H9禽流感血凝素结合。

图10A.显示40uM的Yodha肽(47)有效抑制进化枝A HIV。使进化枝A、B和C HIV病毒暴露于分级剂量(5um-160uM)的Yodha肽或对照OVA肽。

图10B.显示40uM的Yodha肽(47)有效抑制进化枝B HIV。

图10C.显示40uM的Yodha肽(47)有效抑制进化枝C HIV。

图11A.显示感染3天后血清中的病毒血症，表明施用Yodha肽减轻小鼠体内的ZIKV病毒血症和病毒载量。对4-5周大的小鼠群(cohort)经腹腔内给与2mg抗-Ifnar1mAb，且次日以10⁵FFU的PRVABC ZIKV感染。通过实时PCR监控病毒血症和病毒载量。

图11B.显示第6天眼睛中的病毒载量。

图11C.显示第6天脾中的病毒载量。

图12.显示的数据表明Yodha肽的截短变体中和H3N2流感。

具体实施方案

参考公开主题特定方面的以下详细描述以及其中包括的实施例和附图，可更易于理解本文所述的材料、化合物、组合物、试剂盒和方法。在公开和描述本发明的材料、化合物、组合物、试剂盒和方法之前，应了解下文所述各方面不限于特定的合成方法或特定的试剂，因此当然可变化。还应了解，本文所用的技术只用于描述具体方面的目的，且并非意在限制。

在本说明书中，还参考各种公布。这些公布的公开内容全文以引用的方式并入本申请中，以便更全面地描述所公开的主题所属的技术领域。公开的参考文献关于其中所包含的在参考文献所依赖的语句中论述的材料也个别地且特定地以引用的方式并入本文中。

定义

在本说明书以及下文的权利要求书中，将参考定义为具有以下含义的若干术语：

应注意，如本文所用以及在随附的权利要求书中，除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“一(a/an)”和“所述”包括多个所指对象。

关于具有氨基酸序列的肽的术语“包含”指的是可含有其它N-末端(胺末端)或C-末端(羧酸末端)氨基酸的肽，即该术语意在于较大的肽内包括氨基酸序列。

关于具有氨基酸序列的肽的术语“由……组成”指的是序列中具有确切数量的氨基酸且不大于或具有不大于权利要求书中明确列举的氨基酸范围的肽。

“任选的”或“任选地”意思是后续描述的事件或情形可发生或可不发生，且此描述包括所述事件或情形发生的情况以及不发生的情况。例如，短语“任选的佐剂”意思是可包括佐剂或可不包括佐剂。

术语“药学上可接受的”指的是在合理医学判断的范畴内适用于接触人类和动物组织而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益风险比相应的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

术语“载剂”意思是在与化合物或组合物组合时有助于或帮助所述化合物或组合物的制备、储存、施用、传递、有效性、选择性或任何其它特征以供其预期用途或目的的化合物、组合物、物质或结构。例如，可选择载剂以使活性成分的任何降解最小化且使对受试者的任何不利副作用最小化。

术语“酰胺化”指的是将羧酸转化为酰胺，例如在多肽的C-末端。

术语“乙酰化”指的是以乙酰基取代胺基，例如在多肽的N-末端。

术语“变体”指的是具有氨基酸插入、删除、保守性或非保守性取代的氨基酸序列或与所列举的序列具有60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性或相同性的肽。

变体包括等位基因变体。术语“等位基因变体”指的是含有导致肽的氨基酸序列发生改变且存在于天然群体(例如，蛙类物种或品种)中的多态现象的多肽。这种天然等位基因变化通常可导致多肽发生1-5％的变化。等位基因变体可通过对大量不同物种中的感兴趣的肽序列进行测序来识别，这可以容易地通过使用杂交探针识别所述物种中的相同遗传基因座来进行。作为天然等位基因变化的结果并且不改变感兴趣的肽的功能活性的任何以及所有所述得到的氨基酸多态现象或变化预期都在本发明的范畴内。

如本文所用的术语“疫苗”指的是在激发后(upon challenge)对个体提供免疫力的组合物。

术语“抗病毒”和“杀病毒”可互换使用并且指的是能够抑制和/或杀死病毒颗粒和/或预防病毒颗粒引起的感染的物质。

术语“抑制”指的是活性、反应、病况、疾病或其它生物学参数减小。这可包括(但不限于)活性、反应、病况或疾病完全消除。这也可包括例如活性、反应、病况或疾病与天然或对照水平相比减少10％。因此，减少可为与天然或对照水平相比减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或在此之间的任意减少量。

“减少(reduce)”或此词语的其他形式如“reducing”或“reduction”意思是降低某一事件或特征(例如，病毒感染)。应了解，这通常与某种标准或预期值有关，换句话说是相对的，但并非总是需要参考标准值或相对值。例如，“减少病毒感染”意思是相对于标准值或对照值减少病毒的感染率。

如本文中所用，术语“预防”包括预防复发、传播或发作。并不意味着本发明局限于完全预防。在一些实施方案中，延迟发作或减轻疾病的严重程度。

如本文中所用，术语“治疗”并不局限于治愈受试者(例如，患者)和根治疾病的情形。相反，本发明的实施方案也涵盖仅减轻症状和/或延迟疾病发展的治疗。

如本文中所用，在用于描述与另一治疗一起施用时，术语“与……组合”意思是所述物质在另一治疗之前、与其一起或在其之后施用，或其组合形式。

如本文中所用，术语“无菌的”指的是使某物经历有效杀死或消除可传染剂(诸如，真菌、细菌、病毒、朊病毒和孢子形式等)的过程。杀菌可通过施加热、化学品、辐射、高压或过滤来实现。一种方法涉及通过蒸馏制备并储存在密封容器中的水，其中引入合适的添加剂来接近等渗。

术语“多核苷酸”指的是包含两个或多个、优选多于三个且通常多于十个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。确切的大小将取决于多种因素，这又取决于寡核苷酸最终的功能或用途。多核苷酸可通过任意方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。术语“寡核苷酸”通常指的是长度通常小于30个核苷酸的短长度的单链多核苷酸链，尽管它也可与术语“多核苷酸”互换使用。

术语“核酸”指的是如上文所述的核苷酸的聚合物或多核苷酸。该术语用于表示单个分子或许多分子。核酸可为单链或双链的，且可包括编码区和各种调控元件区。

“异源”核酸序列或肽序列指的是并非天然存在的核酸序列或肽序列，例如因为全序列含有来自其它植物、细菌、病毒、其它生物体的区段或存在于同一生物体中但通过并非在同一生物体中天然存在的方式或并非以任何天然状态连接在一起的两个序列的连接体。

关于核酸分子使用的术语“重组”指的是由通过分子生物技术连接在一起的核酸区段组成的核酸分子，其限制条件为整个核酸序列并非天然存在，即在总序列中具有至少一个突变以便整个序列并非天然存在，即使分开的区段可天然存在。所述区段可连接成改变的排列，以使得整个核酸序列从始至终并不天然存在。关于蛋白或多肽使用的术语“重组”指的是使用重组核酸分子表达的蛋白分子。

术语“蛋白”、“肽”和“多肽”可互换地用来指包含通过肽键连接的氨基酸的化合物并且可互换使用。氨基酸可天然或非天然存在。“嵌合蛋白”或“融合蛋白”是其中蛋白的不同部分源自不同来源以使得整个分子并非天然存在的分子。嵌合蛋白可含有来自相同物种或不同物种的氨基酸序列，只要它们不以与天然状态存在的相同方式排列在一起即可。嵌合蛋白的实例包括本文中公开的含有连接至C-末端或N-末端的一个、两个或多个氨基酸的序列，其与任何天然存在的蛋白不同，诸如在增加含有胺侧链基团的氨基酸(例如赖氨酸)、含有羧酸侧链基团的氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)、多组氨酸标签(例如通常为四个或四个以上组氨酸的氨基酸)的情况下。涵盖的嵌合蛋白包括具有自剪切肽的那些嵌合蛋白，诸如P2A-GSG。参见Wang.Scientific Reports 5,文章编号：16273(2015)。

如本文中所用，术语“衍生物”指的是充分保留所识别类似物的功能属性的结构类似肽。衍生物可在结构上类似，因为其缺少一个或多个原子，例如以氢置换氨基、羟基或硫醇基，以不同水合/氧化状态的盐取代，或因为分子中的一个或多个原子发生改变，诸如(但不限于)以硫原子置换氧原子或以羟基置换氨基。衍生物可为前药，包含脂质、聚乙二醇、糖、多糖。衍生物可为由连接基团连接在一起的两种或多种肽。预期连接基团为生物可降解的。衍生物可通过在合成或有机化学教科书中提供的任意种合成方法或适当的改变形式来制备，诸如在以引用方式并入本文中的March's Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,Wiley,第6版(2007)Michael B.Smith或DominoReactions in Organic Synthesis,Wiley(2006)Lutz F.Tietze中提供的那些方法。

在某些实施方案中，本文公开的肽具有至少一种非天然存在的分子修饰，诸如连接聚乙二醇、连接嵌合肽、连接包含芳香族基团的荧光染料、荧光肽、能够结合诸如¹⁸F的放射性核素的螯合剂、N-末端乙酰基、丙酰基、肉豆蔻酰基和棕榈酰基或N-末端甲基化或C-末端烷基酯。在某些实施方案中，本发明涵盖本文中公开的使用市售的生物素化试剂标记的肽。生物素化的肽可用于链霉亲和素亲和结合、纯化和检测。在某些实施方案中，本发明涵盖本文公开的含有天然存在的单糖的叠氮化物衍生物的肽，诸如N-叠氮乙酰基葡萄糖胺、N-叠氮乙酰基甘露糖胺和N-叠氮乙酰基半乳糖胺。

在某些实施方案中，本发明涵盖本文公开的肽的衍生物，其中一个或多个氨基酸经化学基团取代来改良药代动力学特性，诸如溶解度和血清半衰期，任选地通过接头连接。在某些实施方案中，这种衍生物可为前药，其中取代基或接头是生物可降解的，或取代基或接头不是生物可降解的。在某些实施方案中，涵盖的取代基包括糖、多糖、乙酰基、脂肪酸、脂质和/或聚乙二醇。取代基可通过任选地通过接头连接在肽的C-末端或N-末端上形成酰胺键来共价键结。在某些实施方案中，预期取代基可通过肽中的氨基酸共价键结，例如通过胺侧链基团(诸如赖氨酸)，或通过在包含本文所公开序列的肽中的含有羧酸侧链基团的氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)来共价键结。在某些实施方案中，预期取代基可通过本文公开的序列中的半胱氨酸任选地通过接头连接来共价键结。在某些实施方案中，取代基通过与半胱氨酸氨基酸侧基形成二硫键的接头来连接。

术语“取代”指的是其中至少一个氢原子经取代基置换的分子。经取代时，一个或多个基团为“取代基”。分子可经多次取代。在氧取代基(“＝O”)的情况下，置换两个氢原子。在本发明上下文中，取代基的实例可包括卤素、羟基、烷基、烷氧基、硝基、氰基、氧、碳环基(carbocyclyl)、碳环烷基(carbocycloalkyl)、杂碳环基(heterocarbocyclyl)、杂碳环烷基(heterocarbocycloalkyl)、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、-NRaRb、-NRaC(＝O)Rb、-NRaC(＝O)NRaNRb、-NRaC(＝O)ORb、-NRaSO₂Rb、-C(＝O)Ra、-C(＝O)ORa、-C(＝O)NRaRb、-OC(＝O)NRaRb、-ORa、-SRa、-SORa、-S(＝O)₂Ra、-OS(＝O)₂Ra和-S(＝O)₂ORa。Ra和Rb在本发明上下文中可相同或不同且独立地为氢、卤素、羟基、烷基、烷氧基、烷基、氨基、烷氨基、二烷氨基、碳环基、碳环烷基、杂碳环基、杂碳环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基。任选地，取代基可进一步经取代。

如本文中所用，“脂质”基团指的是在水中高度不溶的天然或非天然存在的疏水基团。如本文中所用，当脂质上的连接点被氢置换且得到的化合物在水中具有小于0.63x10^-4％(在25℃下)的溶解度(此为辛烷在水中按重量计的溶解度百分比)时，认为脂质基团高度不溶于水。参见Solvent Recovery Handbook,第2版,Smallwood,2002，BlackwellScience，第195页。天然存在的脂质的实例包括在脂肪酸、甘油脂质、胆固醇、类固醇、聚酮化合物和衍生物中发现的饱和或不饱和烃链。非天然存在的脂质包括天然存在的脂质的衍生物、丙烯酸聚合物、芳香族和烷基化化合物及其衍生物。

术语“前药”指的是体内转化为生物活性形式的物质。前药常适用，因为在某些情形下它们比母体化合物更易于施用。前药也可优于母体药物改善在药物组合物中的溶解度。前药可通过各种机制转化为母体药物，包括酶促过程和代谢水解。典型的前药为药学上可接受的酯。前药包括其中羟基、氨基或巯基(硫醇基)与在向受试者施用活性化合物的前药时裂解分别形成游离羟基、游离氨基或游离巯基的任何基团键结的化合物。前药的实例包括(但不限于)活性化合物中的醇官能团的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物或活性化合物中的胺官能团的乙酰胺、甲酰胺和苯甲酰胺衍生物等。

例如，如果公开的肽或所述肽的药学上可接受的形式含有羧酸官能团，则前药可包含通过以诸如以下基团置换酸基的氢原子所形成的药学上可接受的酯：(C₁-C₈)烷基、(C₂-C₁₂)烷酰氧基甲基、具有4至9个碳原子的1-(烷酰氧基)乙基、具有5至10个碳原子的1-甲基-1-(烷酰氧基)-乙基、具有3至6个碳原子的烷氧基羰氧基甲基、具有4至7个碳原子的1-(烷氧基羰氧基)乙基、具有5至8个碳原子的1-甲基-1-(烷氧基羰氧基)乙基、具有3至9个碳原子的N-(烷氧羰基)氨基甲基、具有4至10个碳原子的1-(N-(烷氧羰基)氨基)乙基、3-酞基、4-巴豆酸内酯基、γ-丁内酯-4-基、二-N,N-(C₁-C₂)烷氨基(C₂-C₃)烷基(诸如β-二甲氨基乙基)、氨基甲酰基-(C₁-C₂)烷基、N,N-二(C₁-C₂)烷基氨基甲酰基-(C₁-C₂)烷基和哌啶基-、吡咯烷基-或吗啉基(C₂-C₃)烷基。

如果公开的肽或所述肽的药学上可接受的形式含有醇官能团，则可通过以诸如以下基团置换醇基的氢原子来形成前药：(C₁-C₆)烷酰氧基甲基、1-((C₁-C₆)烷酰氧基)乙基、1-甲基-1((C₁-C₆)烷酰氧基)乙基、(C₁-C₆)烷氧基羰氧基甲基、-N-(C₁-C₆)烷氧羰基氨基甲基、琥珀酰基、(C₁-C₆)烷酰基、α-氨基(C₁-C₄)烷酰基、芳基酰基和α-氨基酰基或α-氨基酰基-α-氨基酰基，其中每个α-氨基酰基独立地选自天然存在的L-氨基酸P(O)(OH)₂、-P(O)(O(C₁-C₆)烷基)₂和糖基(由去除半缩醛形式碳水化合物的羟基所产生的基团)。

如果公开的肽或所述肽的药学上可接受的形式合并有胺官能团，可通过以诸如以下基团置换胺基中的氢原子来形成前药：R-羰基、RO-羰基、NRR'-羰基，其中R和R'各自独立地为(C₁-C₁₀)烷基、(C₃-C₇)环烷基、苯甲基、天然α-氨基酰基、-C(OH)C(O)OY₁(其中Y¹为H、(C₁-C₆)烷基或苯甲基)、-C(OY₂)Y₃(其中Y₂为(C₁-C₄)烷基且Y₃为(C₁-C₆)烷基、羧基(C₁-C₆)烷基、氨基(C₁-C₄)烷基或单-正二-N,N-(C₁-C₆)烷氨基烷基)、-C(Y₄)Y₅(其中Y₄为H或甲基且Y₅为单-N-或二-N,N-(C₁-C₆)烷氨基)、吗啉基、哌啶-1-基或吡咯烷-1-基。

如本文中所用，“药学上可接受的酯”包括(但不限于)酸性基团的烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基和环烷基酯，所述酸性基团包括(但不限于)羧酸、磷酸、次膦酸、磺酸、亚磺酸和硼酸。

如本文中所用，“药学上可接受的烯醇醚”包括(但不限于)式-C＝C(OR)的衍生物，其中R可选自烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基和环烷基。药学上可接受的烯醇酯包括(但不限于)式-C＝C(OC(O)R)的衍生物，其中R可选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基和环烷基。

“连接基团”指的是可用于与分子部分桥接在一起的任意种类的分子排列。式的实例可为-R_m-，其中R在每次出现时个别地且独立地选自：-CR_mR_m-、-CHR_m-、-CH-、-C-、-CH₂-、-C(OH)R_m、-C(OH)(OH)-、-C(OH)H、-C(Hal)R_m-、-C(Hal)(Hal)-、-C(Hal)H-、-C(N₃)R_m-、-C(CN)R_m-、-C(CN)(CN)-、-C(CN)H-、-C(N₃)(N₃)-、-C(N₃)H-、-O-、-S-、-N-、-NH-、-NR_m-、-(C＝O)-、-(C＝NH)-、-(C＝S)-、-(C＝CH₂)-，其可在R基团之间个别地且独立地含有单键、双键或三键。如果R具有R_m支链，则其可由诸如-CH₃、-H、-CH＝CH₂、-CCH、-OH、-SH、-NH₂、-N₃、-CN或-Hal基团封端，或两个支链R可形成环状结构。预期在某些情形下，R的总数或“m”可小于100，或50，或25，或10。连接基团的实例包括桥接烷基和烷氧基烷基。连接基团可经一个或多个取代基取代。

如本文中所用，关于取代基或接头的术语“生物可降解”指的是在施用于受试者(例如，人类)时将通过生物机制分解的肽衍生物中的分子排列，以便形成代谢物且分子排列不会长时间保留，例如分子排列在数小时或数天后将被身体分解。在某些实施方案中，本发明预期生物可降解的接头或取代基在一周或一个月后将不存在。

施用所预期的“受试者”包括(但不限于)人类(例如，任何年龄群的男性或女性，例如儿科受试者(例如，婴儿、幼儿、青少年)或成人受试者(例如，年轻人、中年人或老年人))和/或其它灵长类动物(例如，食蟹猴、猕猴)；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，诸如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫和/或狗；和/或鸟类，包括商业相关的鸟类，诸如鸡、鸭、鹅、鹌鹑和/或火鸡。

术语“可操作组合”、“以可操作顺序”和“可操作连接”指的是核酸序列的连接方式使得核酸分子能够引导给定基因的转录和/或使得可产生想要的蛋白分子的合成。此术语还指的是氨基酸序列的连接方式使得可产生功能性蛋白。

在某些实施方案中，术语“序列相同性百分比”通过将两个最佳对准的序列在比较窗口上进行对比，确定在两个序列中出现相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)的位置数量以产生匹配位置数量、将匹配位置数量除以比较窗口中的位置总数(即，窗口大小)并用结果乘以100得到序列相同性的百分比来计算。

在某些实施方案中，序列“相同性”指的是使用相同位置的数量除以最短序列或排除悬垂部分的等同位置数量(其中内部缺口算作等同位置)中的较大值所计算的两个比对序列之间的序列比对中的精确匹配氨基酸的数量(表示为百分比)。例如，多肽GGGGGG与GGGGT具有4/5或80％的序列相同性。例如，多肽GGGPPP与GGGAPPP具有6/7或85％的序列相同性。在某些实施方案中，对本文中表达的序列相同性的任何引用可取代序列相似性。“相似性”百分比用来定量两个对准序列之间的相似性。这种方法与确定相同性相同，区别在于某些氨基酸并非必需相同来实现匹配。根据以下氨基酸群组，如果氨基酸在具有类似特性的一个群组中，则将其分类为匹配：芳香族-F Y W；疏水性-A V I L；带正电：R K H；带负电-D E；极性-S T N Q。氨基酸基团也考虑保守取代。

术语“编码……的核酸序列”指的是包含基因编码区的核酸序列，或换句话说，编码基因产物的核酸序列。编码区可以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸、多核苷酸或核酸可为单链(即，有义链)或双链。合适的控制元件，诸如增强子/启动子、剪接点、多腺苷酸化信号等可位于接近基因的编码区处(如果需要)以允许适当开始转录和/或正确加工初级RNA转录物。或者，本发明的表达载体中使用的编码区可含有内源性增强子/启动子、剪接点、间插序列、多腺苷酸化信号等或内源性和外源性对照元件的组合。

真核细胞中的转录控制信号包含“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由特定与转录中所涉及的细胞蛋白相互作用的DNA序列短阵列组成(Maniatis等人，Science236:1237,1987)。启动子和增强子元件已由各种真核来源分离得到，包括酵母、昆虫、哺乳动物和植物细胞中的基因。启动子和增强子元件也已由病毒分离得到，且在原核细胞中也发现了类似控制元件，诸如启动子。特定启动子和增强子的选择取决于用于表达感兴趣的蛋白的细胞类型。一些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而其它启动子和增强子在有限的细胞类型子集中实现功能(评论参见Voss等人，Trends Biochem.Sci.,11:287,1986；以及Maniatis等人，上文1987)。

如本文中所用的术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”指的是位于DNA聚合物的蛋白编码区的5'末端(即，在蛋白编码区之前)的DNA序列。自然界已知的大多数启动子的位置在转录区之前。启动子充当开关，活化基因表达。如果基因活化，则称为被转录或参与转录。转录涉及由基因合成mRNA。因此，启动子充当转录调节元件，并且也为开始将基因转录成mRNA提供位点。

相反，“可调节”或“可诱导”启动子为存在刺激(例如，热休克、化学品、光等)的情况下能够引导可操作连接的核酸序列进行一定水平的转录的启动子，所述转录水平与可操作连接的核酸序列在不存在刺激时的转录水平不同。

增强子和/或启动子可为“内源性”或“外源性”或“异源”的。“内源性”增强子或启动子为与基因组中的给定基因天然连接的增强子或启动子。“外源性”或“异源”增强子或启动子为通过遗传操作(即，分子生物技术)与基因并置以便由连接的增强子或启动子引导基因转录的增强子或启动子。例如，与第一基因可操作组合的内源性启动子可经分离、去除并与第二基因可操作组合放置，由此使其成为与第二基因可操作组合的“异源启动子”。涵盖多种所述组合，例如第一和第二基因可来自相同物种或来自不同物种。

现将详细参考所公开材料、化合物、组合物、物品和方法的具体方面，其实例在随附的实施例和附图中进行说明。

多肽

在某些实施方案中，本发明涉及本文中公开的多肽及其变体，诸如包含SEQ IDNO:1-77或由SEQ ID NO:1-77组成的任何肽。在某些实施方案中，肽包含氨基酸序列LFFX¹GTIX²LX³LC(SEQ ID NO:78)；其中X¹为任何氨基酸；X²为S或N；且X³为任何氨基酸，在某些实施方案中，X¹为L、A、任何氨基酸或非L的任何氨基酸；且X³为S、A、任何氨基酸或非S的任何氨基酸。

在某些实施方案中，多肽由氨基酸序列SMLLLFFLGTISLSLCQDDQERC(SEQ ID NO:1)组成。在某些实施方案中，多肽由氨基酸序列SMLLLFFLGTISLSLCQ(SEQ ID NO:56)或PMLLLFFLGTISLSLCQ(SEQ ID NO:57)组成。在某些实施方案中，多肽由氨基酸序列LLFFLGTISLSLCQDDQERC(SEQ ID NO:65)组成。在某些实施方案中，多肽具有一个或两个氨基酸取代。

在某些实施方案中，多肽包含氨基酸序列LFFX¹GTIX²LX³LC(SEQ ID NO:78)；其中X¹为任何氨基酸；X²为任何氨基酸或S或N；且X³为任何氨基酸。在某些实施方案中，X¹为A或非L的任何其它氨基酸。在某些实施方案中，X³为A或非S的任何其它氨基酸。

在一些实施方案中，多肽包含的氨基酸序列包含与本文中公开的例如选自SEQ IDNO:1-58或59-77或具有LFFX¹GTIX²LX³LC(SEQ ID NO:78)的氨基酸序列具有至少60％相同性的氨基酸序列；其中X¹为任何氨基酸；X²为任何氨基酸或S或N；且X³为任何氨基酸，在某些实施方案中，X¹为L、A、任何氨基酸或非L的任何氨基酸；且X³为S、A、任何氨基酸或非S的任何氨基酸。在某些实施方案中，多肽不大于18、20、22、25、27、30、35或40个氨基酸。

在一些实施方案中，多肽包含与本文中公开的例如选自SEQ ID NO:1-58或59-77或具有LFFX¹GTIX²LX³LCX⁴DD(SEQ ID NO:79)的氨基酸序列具有至少60％相同性的氨基酸序列；其中X¹为任何氨基酸；X²为任何氨基酸，X³为任何氨基酸且X⁴为任何氨基酸。在某些实施方案中，X¹为L、A、任何氨基酸或非L的任何氨基酸；X²为S或N；且X³为S、A、任何氨基酸或非S的任何氨基酸；且X⁴为Q、E、A或任何氨基酸。在某些实施方案中，多肽不大于18、20、22、25、27、30、35或40个氨基酸。

在一些实施方案中，多肽包含本文中公开的例如选自SEQ ID NO:1-58或59-77或具有LFFX¹GTIX²LX³LCX⁴DDQERC(SEQ ID NO:80)的氨基酸序列具有至少60％相同性的氨基酸序列；其中X¹为任何氨基酸；X²为任何氨基酸，X³为任何氨基酸且X⁴为任何氨基酸。在某些实施方案中，X¹为L、A、任何氨基酸或非L的任何氨基酸；X²为S或N；且X³为S、A、任何氨基酸或非S的任何氨基酸；且X⁴为Q、E、A或任何氨基酸。在某些实施方案中，多肽不大于18、20、22、25、27、30、35或40个氨基酸。

宿主防御肽构成先天免疫系统的古老分支。它们包含多种在所有活的单细胞和多细胞生物体中充当第一道防线的天然产生的肽。它们通过直接将病原体杀死、通过物理破坏外膜或通过阻断内部功能来中和病原体(Zhang等人，Curr Biol 26,R14-R19(2016))。先前已分离出来自在印度西南部的西高止山脉(Western Ghats)发现的林蛙Hydrophylaxbahuvistara和Hylarana aurantiaca的皮肤的宿主防御肽(Vineeth Kumar等人，ActaBiol Hung 67,121-124,(2016))。

本文中公开一种由Hylarana aurantiaca分离的宿主防御肽，已发现其具有抗病毒活性。此肽称为Yodha肽并已制备变体而且也在本文中公开。因此，本文中公开Yodha肽的活性片段和变体，称为多肽。术语“多肽”打算涵盖通过对公开的Yodha肽序列进行删除、添加、突变、取代、截短、逆转或重排所产生的变体，只要多肽能够产生如本文所述的抗病毒反应即可。

公开的肽包含通过肽键偶合的氨基酸。每种氨基酸可为天然或非天然氨基酸。术语“非天然氨基酸”指的是作为天然氨基酸同系物的有机化合物，其具有与天然氨基酸类似的结构，以便其模拟天然氨基酸的结构和反应性。非天然氨基酸可为经过修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物，其并非20种常见的天然存在的氨基酸之一或稀有的天然氨基酸硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸。非天然氨基酸也可以是天然氨基酸的D-异构体。合适氨基酸的实例包括(但不限于)丙氨酸、别异亮氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、萘丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、衍生物或其组合。这些及其它氨基酸连同其在本文中所用的缩写一起列举在表1中。

表1.氨基酸缩写

*单字母缩写：当在本文中以大写字母显示时，表示L-氨基酸形式，当在本文中以小写字母显示时，表示D-氨基酸形式

还公开所公开的多肽的变体。变体为本领域技术人员所充分理解且可包含氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰通常分为三类中的一种或多种：取代、插入或删除变体。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及序列内插入单个或多个氨基酸残基。插入通常会是比氨基或羧基末端融合的那些小的插入，例如在1至3个残基的等级上。删除的特征为从肽序列中去除一个或多个氨基酸残基。通常在肽中的任一个位点删除不超过1至3个残基。氨基酸取代通常为单个残基，在一次可发生在多个不同位置；插入通常将在约1至3个氨基酸残基的等级上；且删除将在约1至3个残基的范围内。优选地在相邻对中进行删除或插入，即删除2个残基或插入2个残基。取代、删除、插入或其任意组合可进行组合或实现最终的构筑体。取代变体为其中去除至少一个残基且在其位置处插入一个不同残基的变体。所述取代通常根据下表2来进行且称为保守性取代。

表2.氨基酸取代

通过选择与表2中的取代相比较不保守的取代来实现功能的实质性改变，即选择对维持(a)取代区域中的肽主链的结构，例如呈片状或螺旋构型，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性或(c)侧链的体积的作用变化更显著的残基。一般而言预期对蛋白特性产生最大改变的取代将为以下取代，其中(a)亲水性残基(例如，丝氨酰基或苏氨酰基)取代疏水性残基(例如，亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基)(或被所述疏水性残基取代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其它残基(或被任何其它残基取代)；(c)具有正电性侧链的残基(例如，赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)取代负电性残基(例如，谷氨酰基或天冬氨酰基)(或被所述负电性残基取代)；或(d)具有庞大侧链的残基(例如，苯丙氨酸)取代不具有侧链的残基(例如，甘氨酸)(或被所述不具有侧链的残基取代)，在此情形下，(e)通过增加硫酸化和/或糖基化的位点数量。

例如，用生物学上和/或化学上类似的一个氨基酸残基置换另一个氨基酸残基被本领域技术人员称为保守性取代。例如，保守性取代将为用一个疏水性残基置换另一个疏水性残基，或用一个极性残基置换另一个极性残基。取代包括诸如以下的组合：Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；以及Phe、Tyr。每个明确公开序列的所述保守性取代变化形式均包括在本文提供的肽中。

在一些实施方案中，公开与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:65具有至少约60％、70％、80％或90％序列相同性的多肽。例如，公开的多肽可具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸取代(保守性取代或非保守性取代)或1至3个氨基酸残基的删除或插入。

如本文所公开，公开的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1可具有至少60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性(例如，序列可含有添加、删除和/或取代)。在一些实施方案中，多肽序列可包含氨基酸序列SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ IDNO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18；SEQ IDNO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ IDNO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30；SEQ IDNO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36；SEQ IDNO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:40；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:42；SEQ IDNO:43；SEQ ID NO:44；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:48；SEQ IDNO:49；SEQ ID NO:50；SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:52；SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:54；SEQ IDNO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58；或其具有至少约60％、70％、80％或90％序列相同性的保守性变体(即，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸取代)。

如本文所公开，公开的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1可具有至少60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性(例如，序列可含有添加、删除和/或取代)。在一些实施方案中，多肽序列可包含氨基酸序列SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:62；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64；SEQ ID NO:65；SEQ ID NO:66；SEQ ID NO:67；SEQ ID NO:68；SEQ IDNO:69；SEQ ID NO:70；SEQ ID NO:71；SEQ ID NO:72；SEQ ID NO:73；SEQ ID NO:74；SEQ IDNO:75；SEQ ID NO:76；SEQ ID NO:77；或其具有至少约60％、70％、80％或90％序列相同性的保守性变体(即，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸取代)。

在某些实施方案中，公开的多肽可包含具有对应于本文所公开的任何多肽(例如，SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:65)的残基18-23或这些残基的至少1、2、3、4或5个的氨基酸取代的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，公开的多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50；SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:52；或其具有至少约60％、70％、80％或90％序列相同性的保守性变体(即，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸取代)。

在某些实施方案中，公开的多肽可包含具有对应于本文所公开的任何多肽(例如，SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:65)的残基1-5或这些残基的至少1、2、3或4个的氨基酸取代的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，公开的多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36；SEQID NO:38；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:44；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:53；SEQID NO:54；SEQ ID NO:55；或其具有至少约60％、70％、80％或90％序列相同性的保守性变体(即，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸取代)。

在具体实施方案中，公开的多肽可包含在本文中公开的任何多肽(例如，SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58)的残基1处具有氨基酸取代的氨基酸序列。例如，当多肽的序列不同于以上序列时，可使用脯氨酸来置换残基1处的丝氨酸。在一些实施方案中，公开的多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58；或其具有至少约60％、70％、80％或90％序列相同性的保守性变体(即，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸取代)。

在某些实施方案中，公开的多肽可包含具有对应于本文中公开的任何多肽(例如，SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；或SEQ ID NO:58)的残基6-17或这些残基的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个的氨基酸取代的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，公开的多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43；SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:47；或其具有至少约60％、70％、80％或90％序列相同性的保守性变体(即，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸取代)。

在某些实施方案中，当多肽的序列不同于以上序列时，多肽可包括删除一个多氨基酸区。删除可在外部，诸如在氨基和/或羧基末端删除1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，尤其为删除1、2、3、4或5个氨基酸，尤其为删除1、2或3个氨基酸。删除可在内部，诸如在SEQID NO:1的残基2-22处删除1、2、3、4、5或6个氨基酸，尤其为删除1、2、3、4或5个氨基酸。

在具体实施方案中，多肽可包含具有对应于本文中公开的任何多肽(例如，SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:36)的残基18-23或这些残基的氨基酸删除的至少1、2、3、4或5个的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，公开的多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO:56；SEQ IDNO:57；或其具有至少约60％、70％、80％或90％序列相同性的保守性变体(即，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸取代)。在一些实施方案中，多肽可包含至少SEQID NO:1的残基2至17或其具有至少约60％、70％、80％或90％序列相同性的保守性变体(即，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸取代)。在一些实施方案中，多肽包含至少SEQ ID NO:36的残基1至17或其具有至少约60％、70％、80％或90％序列相同性的保守性变体(即，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氨基酸取代)。

在某些实施方案中，当多肽的序列不同于以上序列时，多肽可在氨基和/或羧基末端超出以上序列1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，尤其为1、2、3、4或5个氨基酸，尤其为1、2或3个氨基酸。

如本文所公开，多肽可含有取代所提供序列的氨基酸。这些取代可类似于所公开序列中存在的氨基酸(即，保守性改变)(例如，酸性氨基酸取代另一酸性氨基酸、碱性氨基酸取代碱性氨基酸、大的疏水性氨基酸取代大的疏水性氨基酸等)。取代也可包含氨基酸类似物和模拟物。在一个特定实施方案中，取代预期促进螺旋性或螺旋形成。

多肽可在C-末端和/或N-末端具有封端、保护和/或稳定部分。所述部分在本领域中是熟知的且包括(不限于)酰胺化和乙酰化。多肽也可在任何氨基酸处脂化或糖基化(即，糖肽)。具体来说，这些多肽可聚乙二醇化以改善成药性。

公开的多肽还可包含至少一个D-氨基酸代替天然的L-氨基酸。在一些实施方案中，公开的多肽可只包含D-氨基酸。在一个特定实施方案中，公开的多肽包含间隔开约1、2、3和/或4个(例如，3个)连续L-氨基酸的D-氨基酸。

多肽可含有标准氨基酸(诸如(不限于)氟化残基)或非标准氨基酸(例如，β-氨基酸)的至少一种衍生物。在又一个实施方案中，肽也可以头尾循环或涉及几个残基局部循环。重组载体和表达系统

在某些实施方案中，本发明涉及包含编码本文中公开的肽的核酸的重组载体。在某些实施方案中，本发明涉及包含含有编码本文中公开的肽的核酸的重组载体的表达系统。在某些实施方案中，本发明涉及包含含有编码本文中公开的肽的核酸的重组载体的细胞。

关于核酸分子的术语“重组”指的是由通过分子生物技术连接在一起的核酸区段组成的核酸分子。关于蛋白或多肽的术语“重组”指的是使用重组核酸分子表达的蛋白分子。

术语“载体”或“表达载体”指的是含有想要的编码序列和对于在特定宿主生物体或表达系统(例如，细胞或无细胞)中表达可操作连接的编码序列所必需的适当核酸序列的重组核酸。在原核细胞中表达所必需的核酸序列通常包括启动子、操纵基因(任选的)和核糖体结合位点，常连同其它序列一起。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和多腺苷酸化信号。

蛋白“表达系统”指的是体内和体外(无细胞)系统。用于重组蛋白表达的系统通常利用经含有模板的DNA表达载体转染的细胞。将细胞在使其可翻译想要的蛋白的条件下进行培养。提取经过表达的蛋白用于后续纯化。熟知使用原核和真核细胞的体内蛋白表达系统。还使用变性剂和蛋白重折叠程序恢复一些蛋白。体外(无细胞)蛋白表达系统通常使用全细胞的翻译兼容提取物或含有足以用于转录、翻译和任选的翻译后修饰的组分的组合物，所述组分诸如RNA聚合酶、调节蛋白因子、转录因子、核糖体、tRNA辅助因子、氨基酸和核苷酸。在表达载体存在下，这些提取物和组分可合成感兴趣的蛋白。无细胞系统通常不含蛋白酶且使得可由经修饰的氨基酸来标记蛋白。一些无细胞系统合并编码组分以供翻译为表达载体。参见例如，Shimizu等人，Cell-free translation reconstituted with purifiedcomponents,2001,Nat.Biotechnol.,19,751-755和Asahara&Chong,Nucleic AcidsResearch,2010,38(13):e141，两者都以全文引用的方式并入本文中。

“可选择标记”为引入重组载体中来编码多肽从而赋予适合人工选择或识别的特征的核酸(报告基因)，例如，β-内酰胺酶赋予抗生素抗性，使得表达β-内酰胺酶的生物体在生长介质中存在抗生素的情况下可存活。另一种实例为胸苷激酶，其使得宿主对更昔洛韦(ganciclovir)选择敏感。可筛选标记可以允许基于是否存在预期的颜色来辨别需要和不需要的细胞。例如，lac-z-基因产生β-半乳糖苷酶，在X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的存在下赋予蓝色。如果重组插入使lac-z-基因失活，则得到的集落是无色的。可存在一个或多个可选标记，例如，可与表达生物体无法合成其生长所需的特定化合物(营养缺陷型)互补的酶以及能够将化合物转化为对其生长有毒的另一种化合物的酶。URA3，一种乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶，是尿嘧啶生物合成所必需的并且可补充对于尿嘧啶而言为营养缺陷型的ura3突变体。URA3也将5-氟乳清酸转化为毒性化合物5-氟尿嘧啶。

其它预期的可选标记包括赋予抗菌抗性或表达荧光蛋白的任何基因。实例包括(但不限于)以下基因：amp^r、cam^r、tet^r、杀稻瘟菌素^r、neo^r、hyg^r、abx^r、新霉素磷酸转移酶II型基因(nptII)、p-葡萄糖醛酸酶(gus)、绿色荧光蛋白(gfp)、egfp、yfp、mCherry、p-半乳糖苷酶(lacZ)、lacZa、lacZAM15、氯霉素乙酰转移酶(cat)、碱性磷酸酶(phoA)、细菌荧光素酶(luxAB)、双丙氨膦抗性基因(bar)、磷酸甘露糖异构酶(pmi)、木糖异构酶(xylA)、阿糖醇脱氢酶(atlD)、UDP-葡萄糖:半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶I(galT)、邻氨基苯甲酸盐合成酶的反馈抑制不敏感α亚基(OASA1D)、2-脱氧葡萄糖(2-DOGR)、苯甲基腺嘌呤-N-3-葡糖苷酸、大肠杆菌苏氨酸脱氨酶、谷氨酸1-半醛氨基转移酶(GSA-AT)、D-氨基酸氧化酶(DAAO)、耐盐基因(rstB)、铁氧还蛋白样蛋白(pflp)、海藻糖-6-P合酶基因(AtTPS1)、赖氨酸消旋酶(lyr)、二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、色氨酸合酶β1(AtTSB1)、脱卤素酶(dhlA)、甘露糖-6-磷酸还原酶基因(M6PR)、潮霉素磷酸转移酶(HPT)和D-丝氨酸解氨酶(dsdA)。

“标记”指的是直接或间接与另一分子(诸如抗体或蛋白)结合以便于检测所述分子的可检测的化合物或组合物。标记的具体非限制性实例包括荧光标签、酶连接和放射性同位素。在一个实例中，“标记受体”指的是在受体中合并异源多肽。标记包括合并放射性标记的氨基酸或使生物素基部分与多肽共价连接，其可由经过标记的亲和素来检测(例如，含有荧光标记的链霉亲和素或可由光学或比色方法检测的酶促活性)。在本领域中已知并且可使用各种标记多肽和糖蛋白的方法。多肽标记的实例包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核苷酸(诸如³⁵S或¹³¹I)荧光标记(诸如，异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明(rhodamine)、镧系磷光剂)、酶标记(诸如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基、由次级报告基因识别的预先确定的多肽表位(诸如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)或磁化剂(诸如钆螯合物)。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂连接以减小潜在的空间位阻。

在某些实施方案中，本发明涉及包含本文中公开的序列或其变体或融合的重组多肽，其中氨基酸序列的氨基末端或碳末端任选地连接至异源氨基酸序列、标记或报告分子。

在某些实施方案中，本发明涉及包含编码本文中公开的多肽或其嵌合蛋白的核酸的重组载体。

在某些实施方案中，重组载体任选地包含哺乳动物、人类、昆虫、病毒、细菌、细菌质粒、酵母相关的复制起点或基因，诸如基因或逆转录病毒基因或慢病毒LTR、TAR、RRE、PE、SLIP、CRS和INS核苷酸区段或选自tat、rev、nef、vif、vpr、vpu和vpx的基因或选自gag、pol和env的结构基因。

在某些实施方案中，重组载体任选地包含基因载体元件(核酸)，诸如可选标记区、lac操纵子、CMV启动子、杂交鸡B-肌动蛋白/CMV增强子(CAG)启动子、tac启动子、T7RNA聚合酶启动子、SP6RNA聚合酶启动子、SV40启动子、内部核糖体进入位点(IRES)序列、顺式作用土拨鼠调节后调节元件(WPRE)、支架附着区(SAR)、末端反向重复序列(ITR)、FLAG标签编码区、c-myc标签编码区、金属亲和标签编码区、链霉亲和素结合肽标签编码区、polyHis标签编码区、HA标签编码区、MBP标签编码区、GST标签编码区、聚腺苷酸化编码区、SV40多腺苷酸化信号、SV40复制起点、Col E1复制起点、f1起点、pBR322起点或pUC起点、TEV蛋白酶识别位点、loxP位点、Cre重组酶编码区或诸如在小于50或60个核苷酸的连续区段内具有5、6或7个或多个限制位点或在小于20或30个核苷酸的连续区段内具有3或4个或多个限制位点的多克隆位点。疫苗组合物

还公开在药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂中含有任何公开的多肽的疫苗组合物。尽管不要求，疫苗组合物任选地含有一种或多种免疫刺激剂。免疫刺激剂指的是增强或加强对外源性抗原的免疫反应(抗体或细胞介导)的基本上任何物质。一种优选类型的免疫刺激剂为佐剂。疫苗可任选地含有药学上可接受的佐剂。

许多佐剂含有设计成保护多肽防止快速分解代谢的物质(诸如氢氧化铝或矿物油)和免疫反应刺激物(诸如脂质A、源自百日咳杆菌(Bortadella pertussis)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的蛋白)。佐剂可为可代谢油与乳化剂的亚微米水包油乳液。例如，佐剂可包含MF59^TM，其为角鲨烯、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(Tween^TM80)和山梨醇酐三油酸酯的亚微米水包油乳液。佐剂也可以是TLR4激动剂MPL(3-O-去乙酰基-4′-单磷酰脂质A)和铝盐(例如，AS04(GlaxoSmithKline,Philadelphia,Pa.))的组合。某些佐剂是市售的，例如，弗氏不完全佐剂(Freund’s Incomplete Adjuvant)和完全佐剂(Complete Adjuvant)(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)；默克佐剂65(MerckAdjuvant65)(Merck and Company,Rahway,N.J.)；AS01、AS02、AS03和AS04(GlaxoSmithKline,Philadelphia,Pa.)；铝盐，诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙盐、铁盐或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生化的多糖；聚磷腈；生物可降解的微球体；单磷酰脂质A和quil A。细胞因子(诸如GM-CSF)、白介素-2、-7、-12以及其它类似的生长因子也可用作佐剂。

佐剂组合物可为诱发抗炎性免疫反应(抗体或细胞介导)的组合物。因此，高水平的抗炎性细胞因子(抗炎性细胞因子)可包括(但不限于)白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素10(IL-10)和转化生长因子β(TGFβ)。抗炎性反应任选地将由CD4+T辅助细胞介导。细菌鞭毛蛋白已展示具有佐剂活性(McSorley等人，J.Immunol.169:3914-19,2002)。还公开编码可用于佐剂组合物中的鞭毛蛋白的多肽序列。任选地，佐剂增加脂多糖(LPS)反应性。说明性的佐剂包括(但不限于)单磷酰脂质A(MPL)、氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸盐(AGP)，包括(但不限于)RC-512、RC-522、RC-527、RC-529、RC-544和RC-560(Corixa,Hamilton,Mont.)。

另外，佐剂组合物可为诱发主要为Th1型免疫反应的佐剂组合物。高水平的Th1型细胞因子(例如，IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)倾向有利于对所施用的抗原诱发细胞介导的免疫反应。相反，高水平的Th2型细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)倾向有利于诱发体液免疫反应。在应用如本文提供的疫苗之后，受试者将支持包括Th1型和Th2型反应的免疫反应。任选地，Th1型细胞因子的水平将增加至大于Th2型细胞因子水平的程度。这些细胞因子的水平可易于使用标准分析来评估。主要引发Th1型反应的某些佐剂包括例如单磷酰脂质A(优选为3-去-O-酰化单磷酰脂质A)以及可购自Corixa Corporation(Seattle,Wash.)的铝盐佐剂的组合。含有CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未经甲基化)也主要诱发Th1反应。另一种佐剂包含皂素，诸如Quil A或其衍生物，包括QS21和QS7(AquilaBiopharmaceuticals Inc.,Framingham,Mass.)；七叶树皂苷(Escin)；洋地黄皂苷(Digitonin)；或丝石竹(Gypsophila)或藜麦(Chenopodium quinoa)皂素。

用于公开的疫苗组合物中的其它说明性佐剂包括Montamide ISA 720(Seppic,France)、SAF(Chiron,Calif.,United States)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列的佐剂(例如，SBAS-2或SBAS-4，可购自GlaxoSmithKline,Philadelphia,Pa.)、Detox(Enhanzyn^TM)(Corixa,Hamilton,Mont.)、RC-529(Corixa,Hamilton,Mont.)以及其它氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸盐(AGP)。

药物组合物

公开的多肽在治疗上可与药学上可接受的载剂组合使用。如本领域技术人员所熟知，载剂将自然选择以便最小化活性成分的任何降解作用以及最小化在受试者中的任何不良副作用。

公开的多肽可呈溶液、悬浮液，合并至微米颗粒、脂质体或细胞中或形成为药片、凝胶或栓剂。合适的载剂及其配制物在Remington:The Science and Practice ofPharmacy(第22版)编者Loyd V.Allen,Jr.等人,Pharmaceutical Press,2012中描述。通常在配制物中使用适当量的药学上可接受的盐来使配制物等渗。药学上可接受的载剂的实例包括(但不限于)盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)和葡萄糖溶液。溶液的pH优选为约5至约8，且更优选为约7至约7.5。其它载剂包括缓释配制物，诸如含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，所述基质为成形制品的形式，例如薄膜、脂质体或微粒。本领域技术人员将显而易见，例如视施用途径和所施用组合物的浓度而定，某些载剂可更为优选。

本领域技术人员已知医药载剂。这些最常用的是用于向人类施用疫苗的标准载剂，包括溶液，诸如无菌水、盐水和生理学pH的缓冲溶液。药物组合物中除疫苗以外可包括载剂、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可包括一种或多种活性成分，诸如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。公开的多肽优选配制成通过鼻内、肌肉内、皮下、经皮或舌下施用来传递。

用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)以及可注射的有机酯，诸如油酸乙酯。水性载剂包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲媒介物。肠胃外运载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringer’s dextrose)、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内运载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如，基于林格氏葡萄糖的那些补充剂)等。也可存在防腐剂和其它添加剂，诸如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

对于口服形式来说，公开的多肽可与合适的添加剂(诸如，赋形剂、稳定剂或惰性稀释剂)混合并通过常用方法制成合适的施用形式，诸如药片、包衣药片、硬胶囊、水性溶液、醇溶液或油性溶液。合适的惰性载剂的实例为阿拉伯胶、氧化镁、碳酸镁、磷酸钾、乳糖、葡萄糖或淀粉，特别是玉米淀粉。在此情形下，可按干颗粒和湿颗粒的形式进行制备。合适的油性赋形剂或溶剂为植物油或动物油，诸如葵花油或鱼肝油。用于水性溶液或醇溶液的合适溶剂为水、乙醇、糖溶液或其混合物。聚乙二醇和聚丙二醇也适合用作其它施用形式的进一步助剂。作为速释药片，这些组合物可含有微晶纤维素、磷酸二钙、淀粉、硬脂酸镁和乳糖和/或本领域中已知的其它赋形剂、粘合剂、增量剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂。

在通过鼻用气雾剂或吸入来施用时，公开的多肽可根据医药配制物领域中熟知的技术来制备，并且可采用苄醇或其它合适的防腐剂、用于增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或本领域中已知的其它增溶剂或分散剂而制备成盐水溶液。用于以气雾剂或喷雾形式施用的合适医药配制物例如为本发明的化合物或其生理学耐受盐在药学上可接受的溶剂(诸如，乙醇或水或所述溶剂的混合物)中的溶液、悬浮液或乳液。如果需要，配制物可另外含有其它医药助剂，诸如表面活性剂、乳化剂和稳定剂以及推进剂。

对于皮下或静脉内施用而言，公开的多肽如果需要常规的物质，诸如增溶剂、乳化剂或其它助剂，则使其成为溶液、悬浮液或乳液。公开的多肽也可冻干且获得的冻干产物例如用于生产注射或灌注制剂。合适的溶剂是例如水、生理盐水溶液或醇，例如乙醇、丙醇、甘油、糖溶液，诸如葡萄糖或甘露糖醇溶液或所提及各种溶剂的混合物。可注射溶液或悬浮液可根据已知技术，使用合适的无毒、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(诸如甘露糖醇、1,3-丁二醇、水、林格氏溶液或等渗氯化钠溶液)或合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂(诸如无菌、无味的固定油，包括合成单甘油酯或甘油二酯)和脂肪酸(包括油酸)来配制。

在以栓剂形式直肠施用时，可通过将多肽与合适的非刺激性赋形剂(诸如，可可脂、合成甘油酯或聚乙二醇)混合来制备配制物，其在常温下为固体，但在直肠腔中液化和/或溶解以释放药物。

如果使用公开多肽的肠胃外施用，则其通常通过注射来表征。注射物可制备成常规形式，液体溶液或悬浮液、适合在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式或乳液形式。

在某些实施方案中，预期包含公开的多肽的组合物可为缓释配制物。典型的缓释配制物使用肠溶衣。通常对口服药物施加屏障来控制在吸收所述口服药物的消化系统中的位置。肠溶衣防止药物在到达小肠前被释放。肠溶衣可含有多糖聚合物，所述多糖诸如麦芽糖糊精、黄原胶、硬葡聚糖、淀粉、海藻酸盐、普鲁兰多糖(pullulan)、透明质酸、几丁质、壳聚糖等；其它天然聚合物，诸如蛋白(白蛋白、明胶等)、聚-L-赖氨酸；聚(丙烯酸)钠；聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)(例如，聚(羟乙基甲基丙烯酸酯))；羧基聚亚甲基(例如，Carbopol^TM)；卡波姆(carbomer)；聚乙烯吡咯烷酮；胶类，诸如瓜尔胶、阿拉伯胶、刺梧桐胶、印度树胶、刺槐豆胶、罗望子胶、结冷胶、黄蓍胶、琼脂、果胶、谷蛋白等；聚(乙烯醇)；乙烯乙烯醇；聚乙二醇(PEG)；以及纤维素醚，诸如羟甲基纤维素(HMC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)、羧乙基纤维素(CEC)、乙基羟乙基纤维素(EHEC)、羧甲基羟乙基纤维素(CMHEC)、羟丙基甲基-纤维素(HPMC)、羟丙基乙基纤维素(HPEC)和羧甲基纤维素钠(Na-CMC)；以及任何上述聚合物的共聚物和/或(简单)混合物。某些上述聚合物可通过标准技术进一步交联。

聚合物的选择将由本发明的组合物中采用的活性成分/药物的性质以及所需的释放速率来决定。具体来说，例如在HPMC的情形下，技术人员应了解较高的分子量一般将提供较缓慢的从组合物释放药物的速率。此外，在HPMC的情形下，甲氧基和羟基丙氧基的不同取代程度将导致从组合物释放药物的速率发生变化。就此而言以及如上文所述，有利的是以包衣的形式提供本发明的组合物，其中通过掺合例如具有不同分子量的两种或两种以上聚合物来提供聚合物载剂，从而产生特定要求或需要的释放曲线。

聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物聚(乳酸-共-乙醇酸)的微球可用于形成缓释蛋白传递系统。公开的多肽可通过多种方法包埋在聚(乳酸-共-乙醇酸)微球仓(depot)中，包括以水性蛋白和有机溶剂性聚合物形成油包水乳液(乳液方法)、以固体蛋白分散在溶剂基聚合物溶液中形成油包固体悬浮液(悬浮液方法)或通过将蛋白溶解在溶剂基聚合物溶液中(溶解方法)。可将聚(乙二醇)连接至蛋白(聚乙二醇化)来增加循环治疗性蛋白的体内半衰期并减小免疫反应的机率。

脂质体悬浮液(包括靶向病毒抗原的脂质体)也可通过常规方法来制备以产生药学上可接受的载剂。根据本发明，这可适用于传递游离核苷、酰基核苷或磷酸酯前药形式的核苷化合物。

想要的组合物的确切量将根据受试者而变化，取决于受试者的物种、年龄、体重和一般状况、所治疗过敏性病症的严重程度、使用的特定核酸或载体、其施用模式等。因此，不可能规定每种组合物的确切量。然而，本领域一般技术人员可仅使用常规实验根据本文中的教导来确定适当的量。例如，施用组合物的有效剂量和时间安排可凭经验确定，并且做出所述决定在本领域的技术范围内。施用组合物的剂量范围为足够大产生使病症症状受到影响的想要的作用的那些剂量范围。剂量不应大到导致不利副作用，诸如不需要的交叉反应、过敏反应等。剂量通常将随患者的年龄、病况、性别和疾病程度、施用途径或方案中是否包括其它药物而变化，并且可由本领域技术人员来确定。在任何禁忌症的情形下，可由个别医生来调整剂量。剂量可变化，并且可按每天施用一次或多次持续一天或数天来施用。指导规则可见于关于给定种类医药产品的适当剂量的文献中。视上述因素而定，单独使用的公开疫苗的典型剂量可在每次疫苗接种约1μg/kg至高达100mg/kg体重或更高的范围内，诸如10μg/kg至50mg/kg、或50μg/kg至10mg/kg。

用于局部施用的配制物可包括油膏、洗液、乳霜、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾、液体或粉末。常规的医药载剂、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可为必需或有利的。

一些公开的多肽可潜在地以药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐形式来施用，所述酸加成盐或碱加成盐通过与诸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸的无机酸和诸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、顺丁烯二酸和反丁烯二酸的有机酸反应而形成，或通过与诸如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾的无机碱和诸如单烷基胺、二烷基胺、三烷基胺和芳基胺以及经取代乙醇胺的有机碱反应而形成。

本发明的医药配制物优选为单位剂型，且可适当地封装在例如盒子、气泡、小瓶、瓶子、药囊、安瓿或任何其它合适的单剂量或多剂量固定器(holder)或容器(可适当标记)中；任选地具有一个或多个含有产品信息和/或使用说明的说明书。通常，所述单位剂量将含有1mg与1000mg之间、且通常为5mg与500mg之间的本发明的至少一种化合物，例如每单位剂量含有约10、25、50、100、200、300或400mg。

公开的多肽也可用于补充现有的人类疫苗来改善交叉保护。因此，公开的组合物可进一步包括(或与以下各物组合施用)：全灭活病毒、分裂病毒疫苗、活减毒登革热病毒疫苗、活减毒ZIKV病毒疫苗或另一种病毒样颗粒(VLP)疫苗以及DNA疫苗。

公开的组合物可进一步包括(或与以下各物组合施用)：抗病毒剂、抗生素、类固醇、镇痛剂、抗炎性剂、抗组胺剂或其任何组合中的一类或多类。

在具体的实施方案中，公开的多肽可与抗病毒剂一起施用(组合在同一组合物中、组合但在单独的组合物中或相继施用)。可按所述组合使用的合适抗病毒剂的实例包括(但不限于)乙酰吗喃(Acemannan)；阿昔洛韦(Acyclovir)；阿昔洛韦钠；阿德福韦(Adefovir)；阿洛夫定(Alovudine)；阿韦舒托(Alvircept Sudotox)；盐酸金刚烷胺；阿拉诺丁(Aranotin)；阿立酮(Arildone)；甲磺酸阿替韦啶(Atevirdine Mesylate)；阿夫立定(Avridine)；西多福韦(Cidofovir)；西潘茶碱(Cipamfylline)；盐酸阿糖胞苷(CytarabineHydrochloride)；甲磺酸地拉韦啶(Delavirdine Mesylate)；地昔洛韦(Desciclovir)；地达诺新(Didanosine)；二恶沙利(Disoxaril)；依度尿苷(Edoxudine)；恩韦拉登(Enviradene)；恩韦肟(Enviroxime)；泛昔洛韦(Famciclovir)；盐酸法莫丁(FamotineHydrochloride)；非西他滨(Fiacitabine)；非阿尿苷(Fialuridine)；磷利酯(Fosarilate)；膦甲酸钠(Foscarnet Sodium)；膦乙醇钠(Fosfonet Sodium)；更昔洛韦(Ganciclovir)；更昔洛韦钠；碘苷(Idoxuridine)；凯托沙(Kethoxal)；拉米夫定；洛布卡韦(Lobucavir)；盐酸美莫丁(Memotine Hydrochloride)；美替沙腙(Methisazone)；奈韦拉平(Nevirapine)；喷昔洛韦(Penciclovir)；吡罗达韦(Pirodavir)；利巴韦林(Ribavirin)；盐酸金刚乙胺(Rimantadine Hydrochloride)；甲磺酸沙奎那韦(Saquinavir Mesylate)；盐酸索金刚胺(Somantadine Hydrochloride)；索利夫定(Sorivudine)；维司托隆(Statolon)；司他夫定(Stavudine)；盐酸替洛隆(Tilorone Hydrochloride)；曲氟尿苷(Trifluridine)；盐酸伐昔洛韦(Valacyclovir Hydrochloride)；氟达拉滨(Vidarabine)；磷酸氟达拉滨(Vidarabine Phosphate)；磷酸氟达拉滨钠；韦罗肟(Viroxime)；扎西他滨(Zalcitabine)；齐多夫定；净韦肟(Zinviroxime)。

施用肽的方法包括(但不限于)肠胃外施用(例如，皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外和粘膜(例如，鼻内和口服途径)。在具体的实施方案中，肽或嵌合蛋白通过肌肉内、静脉内或皮下施用。组合物可通过任何便利的途径来施用，例如通过灌注或弹丸式注射，通过上皮或皮肤粘膜被覆(例如，口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收，以及可与其它生物活性剂一起施用。

施用可为全身的或局部的。另外，也可采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及具有雾化剂的配制物。参见例如，美国专利No.6,019,968；5,985,20；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；以及PCT公布No.WO 92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；和WO 99/66903。在具体的实施方案中，想要的可以是向需要治疗的区域局部施用药物组合物；这可通过(例如且不限于)局部灌注、注射或通过植入物来实现，所述植入物为多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜(诸如硅橡胶膜)或纤维。

在某些实施方案中，雾化剂或推进剂为氢氟烷烃、1,1,1,2-四氟乙烷、1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷、丙烷、正丁烷、异丁烯、二氧化碳、空气、氮气、氧化亚氮、二甲醚、反-1,3,3,3-四氟丙-1-烯或其组合。

配制物中将采用的确切剂量也将取决于施用途径和病况的严重性，并且应根据医师的判断和每位患者的情况来决定。有效剂量可由源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线来推测。对于肽和融合蛋白而言，施用于患者的剂量通常为0.0001mg/kg患者体重至100mg/kg患者体重。施用于患者的剂量优选以患者体重计在0.0001mg/kg与20mg/kg之间、在0.0001mg/kg与10mg/kg之间、在0.0001mg/kg与5mg/kg之间、在0.0001与2mg/kg之间、在0.0001与1mg/kg之间、在0.0001mg/kg与0.75mg/kg之间、在0.0001mg/kg与0.5mg/kg之间、在0.0001mg/kg至0.25mg/kg之间、在0.0001至0.15mg/kg之间、在0.0001至0.10mg/kg之间、在0.001至0.5mg/kg之间、在0.01至0.25mg/kg之间或在0.01至0.10mg/kg之间。此外，可通过诸如脂化的修饰增强融合蛋白的吸收和组织渗透来减少施用蛋白的剂量和频率。

组合物包括适用于制造药物组合物(例如，不纯的或未经消毒的组合物)的原料药物组合物以及可用于制备单位剂型的药物组合物(即，适合施用于受试者或患者的组合物)。这样的组合物包含预防或治疗有效量的本文中公开的预防剂和/或治疗剂或那些物质的组合以及药学上可接受的载剂。在某些实施方案中，药物组合物含有药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂为增溶剂，诸如脂质、胆固醇、脂肪酸、脂肪酸烷基酯、亚油酸、油酸、花生四烯酸、糖、多糖、环糊精、2-羟丙基(环糊精)或其组合。

在具体的实施方案中，术语“药学上可接受”意思是联邦或国家政府的管理机构批准或列举在美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其它通常公认的药典中用于动物，或更具体来说用于人类。术语“载剂”指的是与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全和不完全)、赋形剂或运载体。所述药物载剂可为无菌液体，诸如水和油类，包括来源于石油、动物、植物或合成来源的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物通过静脉内施用时，水为优选的载剂。也可采用盐水溶液以及水性葡萄糖和甘油溶液作为液体载剂，尤其对于可注射溶液而言。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物也可含有微量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采用溶液、悬浮液、乳液、药片、药丸、胶囊、粉末、缓释配制物等形式。

一种实施方案提供一种药包或试剂盒，其包含一个或多个填充有本文中公开的肽的容器。另外，在药包或试剂盒中也可包括一种或多种其它适用于治疗疾病的预防剂或治疗剂。一种实施方案提供一种药包或试剂盒，其包括一个或多个填充有药物组合物的一种或多种成分的容器。所述容器可任选地结合有由控制药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构开具的形式的标签，所述标签反映出获得了制造、使用或销售用于人类施用的机构的批准。

在某些实施方案中，本发明涵盖包含本文中公开的蛋白和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在某些实施方案中，本发明涵盖生产包含本文中公开的蛋白的药物以及用于本文中公开的方法的用途。

在某些实施方案中，本发明涉及包含本文中公开的蛋白和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在某些实施方案中，组合物为药丸或胶囊形式，或组合物为水性缓冲液，例如其pH在6和8之间。在某些实施方案中，药学上可接受的赋形剂选自填充剂、助流剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂和糖。

适合肠胃外注射的组合物可包含生理学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液以及用于复溶成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性载剂、稀释剂、溶剂或运载体的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、其合适的混合物、植物油(诸如，橄榄油、芝麻油和viscoleo)和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯。对微生物作用的预防可通过添加任意各种抗菌剂和抗真菌剂来控制，所述抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。也可能需要包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。可通过使用延迟吸收的物质(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。

用于口服的固体剂型包括胶囊、药片、药丸、粉末和颗粒。在所述固体剂型中，蛋白可与至少一种惰性的常用赋形剂(或载剂)，诸如柠檬酸钠或磷酸二钙或以下各物混合：(a)填充剂或增量剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸，(b)粘合剂，例如，羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，(c)保湿剂，例如，甘油，(d)崩解剂，例如，琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠，(e)溶液延迟剂，例如，石蜡，(f)吸收加速剂，例如，季铵化合物，(g)湿润剂，例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，(h)吸附剂，例如，高岭土和膨润土，以及(i)润滑剂，例如，滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠或其混合物。在胶囊、药片和药丸的情形下，剂型还可包含缓冲剂。

用于口服的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除蛋白以外，液体剂型可含有本领域中常用的惰性稀释剂，诸如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油或芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇酐脂肪酸酯或这些物质的混合物等。

在某些实施方案中，涵盖生产方法，其中两种组分(本文中公开的蛋白和药物载剂)已经以适合一起复水的组合的干燥形式提供。在其它实施方案中，预期将本文中公开的蛋白与药物载剂混合来提供药物组合物。

可能通过一步法，简单地向容器中的组合物中添加合适的药学上可接受的稀释剂来提供药物组合物。在某些实施方案中，容器优选为用于施用与稀释剂接触后的复水药物组合物的注射器。在某些实施方案中，可将经过涂层的蛋白填充至注射器中，且随后可用塞子封闭注射器。以实现想要的最终浓度的量使用稀释剂。药物组合物可含有其它适用组分，诸如离子、缓冲剂、赋形剂、稳定剂等。

“干燥”药物组合物通常只具有残余量的水分，其可大致对应于相当市售产品的水分含量，例如作为干燥产品具有约12％的水分。根据本发明的干燥药物组合物通常具有优选低于10％水分、更优选低于5％水分、尤其低于1％水分的残余水分含量。药物组合物也可具有更低的水分含量，例如0.1％或甚至更低。在某些实施方案中，提供干燥的药物组合物以防止降解以及使其具备储存稳定性。

容器可为适合容纳(和储存)药物组合物的任何容器，诸如注射器、小瓶、管子等。随后可优选地通过注射器的专用针头或通过合适的导管来施用药物组合物。典型的稀释剂包含注射用水和NaCl(优选为50至150mM，尤其为110mM)、CaCl₂(优选为10至80mM，尤其为40mM)、乙酸钠(优选为0至50mM，尤其为20mM)和甘露糖醇(优选为高达10％w/w，尤其为2％w/w)。稀释剂优选地也可包括缓冲剂或缓冲剂系统来缓冲复原无水组合物的pH，优选在6.2至7.5的pH下，尤其在6.9至7.1的pH下。

在某些实施方案中，由单独的容器来提供稀释剂。此容器可优选为注射器。注射器中的稀释剂随后可易于施加到用于使干燥组合物复原的容器中。如果所述容器也是注射器，那么两个注射器可在一个包中一起完成。因此，优选的是在注射器中提供干燥组合物，这由具有用于使所述干燥且稳定的组合物复原的药学上可接受的稀释剂的稀释剂注射器来完成。

在某些实施方案中，本发明涵盖一种试剂盒，所述试剂盒包含本文中公开的药物组合物和具有合适稀释剂的容器。试剂盒的其它组分可为使用说明书、施用方式(诸如注射器、导管、刷子等(如果组合物未以施用方式提供))或供医学(手术)实践使用所必需的其它组分(诸如，替代针头或导管、额外的小瓶或其它伤口覆盖用品)。在某些实施方案中，试剂盒包含容纳无水且稳定的止血组合物的注射器和含有稀释剂的注射器(或提供用来从另一稀释剂容器中吸取稀释剂)。

制备方法

本文中公开的多肽可根据已知方法通过各种方式来制备。在一些实施方案中，可通过免疫亲和纯化从适当来源(例如，细菌或动物培养的细胞或组织，任选地经过转化)来纯化多肽。例如，SEQ ID NO:1可来源于在印度西南部的西高止山脉发现的蛙类，包括Hydrophylax bahuvistara和Hylarana aurantiaca。核酸分子编码多肽的可用性使得可使用本领域中已知的体外表达方法和无细胞表达系统来生产蛋白。体外转录和翻译系统例如可购自Promega^TMBiotech(Madison,Wis.)或(Gaithersburg,Md.)。

通过在合适的原核或真核系统中表达可产生更大量的多肽。例如，可将编码多肽的部分或全部DNA分子插入适于在细菌细胞(诸如，大肠杆菌)中表达的质粒载体中。所述载体包含在以允许在宿主细胞中表达DNA的方式定位的宿主细胞中表达DNA所必需的调节元件。表达所需要的所述调节元件包括启动子序列、转录起始序列和任选存在的增强子序列。

在重组原核或真核系统中通过基因表达产生的多肽可根据本领域中已知的方法来纯化。可使用市售的表达/分泌系统，由此表达重组蛋白且随后由宿主细胞分泌，并且易于从周围介质中纯化。如果不使用表达/分泌载体，一种替代方法涉及通过亲和分离来纯化重组蛋白，诸如通过与特异性结合重组蛋白或镍柱的抗体进行免疫相互作用来分离在其N末端或C末端以6-8个组氨酸残基标记的重组蛋白。替代性的标签可包含FLAG表位或血凝素表位。所述方法是技术人员所常用的。

多肽也可以化学合成。例如，可使用固相方法来合成肽。Steward,J.M.和Young,J.D.,Solid Phase Peptide Synthesis,第2版,Pierce Chemical Company,Rockford,Ill.,(1984)，使用Applied Biosystem合成仪。

类似地，可合成多个片段，随后连接在一起形成更大的片段。这些合成的肽片段也可以通过在特定位置进行氨基酸取代来制备，从而体外和体内测试抗病毒活性。对于固相肽合成而言，多种技术的总和可见于J.M.Stewart和J.D.Young,Solid Phase PeptideSynthesis,W.H.Freeman Co.(San Francisco),1963和J.Meienhofer,Hormonal Proteinsand Peptides,第2卷，第46页，Academic Press(New York),1973中。关于经典的溶液合成，参见G.Schroder和K.Lupke,The Peptides,第1卷，Academic Press(New York)。一般来说，这些方法包括向生长的肽链中相继添加一个或多个氨基酸或经过适当保护的氨基酸。第一个氨基酸的氨基或羧基通常由合适的保护基保护。经过保护或衍生的氨基酸随后连接至惰性的固体支撑物或通过在具有经过适当保护的互补基团(氨基或羧基)的序列中加入下一个氨基酸并且在适合形成酰胺键的条件下在溶液中使用。随后从这个新加入的氨基酸残基中去除保护基并加入下一个氨基酸(经过适当保护)，等等。在按适当顺序连接所有需要的氨基酸之后，相继或同时去除任何剩下的保护基(和任何固体支撑物)以提供最终的多肽。通过简单修改此通用程序，可能一次性向生长的链中加入一个以上氨基酸，例如通过(在不使手性中心外消旋的条件下)使经过保护的三肽与经过适当保护的二肽偶合以在去保护后形成五肽。

一种合适的制备多肽的方法涉及固相肽合成，其中以酸或碱敏感性基团来保护氨基酸的α-N-末端。所述保护基应具有在肽键形成的条件下稳定、同时可易于去除而不破坏生长的肽链或使其中所含的任何手性中心外消旋的特性。合适的保护基为9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)、联苯异丙氧羰基、叔戊氧羰基、异冰片氧羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧羰基、邻硝基苯基亚氧硫基、2-氰基-叔丁氧羰基等。其它侧链保护基为：对于如赖氨酸和精氨酸的侧链氨基而言，2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(pmc)、硝基、对甲苯磺酰基、4-甲氧基苯-磺酰基、Cbz、Boc和金刚烷氧羰基；对于酪氨酸而言，苯甲基、邻溴苄氧羰基、2,6-二氯苄基、异丙基、叔丁基(t-Bu)、环己基、环戊基和乙酰基(Ac)；对于丝氨酸而言，叔丁基、苄基和四氢吡喃基；对于组氨酸而言，三苯甲基、苄基、Cbz、对甲苯磺酰基和2,4-二硝基苯基；对于色氨酸而言，甲酰基；对于天冬氨酸和谷氨酸而言，苄基和叔丁基；以及对于半胱氨酸而言，三苯基甲基(三苯甲基)。

在固相肽合成方法中，α-C-末端氨基酸连接至合适的固体支撑物或树脂。适用于上述合成的合适固体支撑物为对逐步缩合-去保护反应的试剂和反应条件而言为惰性的以及在使用的介质中不溶的那些材料。用于合成α-C-末端羧基肽的固体支撑物为4-羟基甲基苯氧基甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)。用于α-C-末端酰胺肽的固体支撑物为由Applied Biosystems(Foster City,Calif.)可获得的4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酰胺基乙基树脂。在诸如二氯甲烷或DMF的溶剂中，在10℃与50℃之间的温度下，在具有或不具有4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲氨基)六氟磷酸鏻(BOP)或双(2-酮基-3-恶唑烷基)氯化膦(BOPCl)的情况下介导偶合约1至约24小时，通过N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳化二亚胺(DIC)或O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)使α-C-末端氨基酸与树脂偶合。当固体支撑物为4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基-乙酰胺基乙基树脂时，以二级胺(优选为哌啶)使Fmoc基团裂解，然后与如上文所述的α-C-末端氨基酸偶合。

一种与去保护的4(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基-乙酰胺基乙基树脂偶合的方法为在DMF中的O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU，1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT，1当量)。如本领域中所熟知，连续保护氨基酸的偶合可在自动多肽合成器中进行。

在一个实施方案中，用Fmoc来保护生长肽链的氨基酸中的α-N-末端。通过用二级胺(优选为哌啶)处理来实现从生长肽的α-N-末端侧去除Fmoc保护基。随后将每个经过保护的氨基酸以约3倍摩尔过量引入，并且优选在DMF中进行偶合。偶合剂通常为O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU，1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT，1当量)。在固相合成结束时，以连续或单一操作将多肽从树脂中去除并去保护。

可在单一操作中，通过用包含苯甲硫醚、水、乙二硫醇和三氟乙酸的裂解试剂处理树脂结合的多肽来实现多肽的去除和去保护。在多肽的α-C-末端为烷基酰胺的情况下，通过用烷基胺进行氨解来使树脂裂解。或者，可通过例如用甲醇转酯化接着进行氨解，或通过直接转酰胺化来去除肽。经过保护的肽可在此时进行纯化或直接用于下一步骤。侧链保护基的去除使用上文所述的裂解混合物来完成。完全去保护的肽可通过采用任何或所有以下类型的一系列色谱步骤来纯化：在弱碱性树脂(乙酸酯形式)上的离子交换；在未经衍生的聚苯乙烯-二乙烯基苯(例如，Amberlite XAD)上的疏水性吸附色谱；硅胶吸附色谱；在羧甲基纤维素上的离子交换色谱；例如在Sephadex G-25、LH-20上的分配色谱或逆流分配；高效液相色谱(HPLC)，尤其是在辛基-或十八烷基甲硅烷基-硅胶键合相柱填充物上的逆相HPLC。

由上述方法制备的多肽可根据标准程序来分析和验证。例如，所述多肽可根据已知方法进行氨基酸序列分析。

多肽的活性可通过任何方法来测量，诸如测量多肽阻碍例如登革热病毒或寨卡病毒感染细胞的能力。

使用方法

本发明还涵盖使用本文中公开的多肽的方法。本文中提供的多肽和组合物可用于治疗病毒感染性疾病。病毒是通常可在生物体的活细胞中复制的感染剂。病毒颗粒(病毒体)通常由核酸、蛋白外壳以及某些情况下围绕蛋白外壳的脂质包膜组成。病毒的形状从简单的螺旋形和二十面体形式到更复杂的结构。病毒编码的蛋白亚单元将自组装形成衣壳，通常需要存在病毒基因组。复杂的病毒可编码有助于构筑其衣壳的蛋白。与核酸相关的蛋白称为核蛋白，且病毒衣壳蛋白与病毒核酸的结合称为核衣壳。

在一些实施方案中，本发明涉及治疗受包膜RNA病毒感染的受试者的方法。包膜RNA病毒的实例包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、肝炎病毒、寨卡病毒和登革热病毒。

在某些实施方案中，本发明涉及治疗经诊断患有寨卡病毒(ZIKV)感染的受试者的方法。在某些实施方案中，本发明涉及预防受试者ZIKV感染的方法。寨卡病毒(ZIKV)是在1947年由乌干达的寨卡森林中的发热哨兵恒河猴首次分离的黄病毒科(黄病毒属)中的一种新兴的虫媒传播的人类病原体。尽管主要是由埃及伊蚊(Aedes aegypti mosquito)传播的，但目前的报道强烈表明病毒通过围产期、性以及通过输血来传播。ZIKV感染通常具有自限性，80％的感染个体无临床症状。生病患者的症状通常是轻度的且不危及生命。症状包括发烧、斑状丘疹、关节痛和/或结膜炎、肌肉痛、头痛和眶后痛。最近，格林-巴利综合征(GBS)(非脊灰病毒相关急性弛缓性麻痹的最常见病因)以及原发性小头畸形病例的发生率高于正常值与法属玻利尼西亚和巴西爆发ZIKV有关。GBS是一种严重的疾病，据信是由对某些病毒或细菌感染的抗原暴露的免疫介导反应引起的。粗略20％的患者留下严重残疾，且大约5％的患者死亡。还有受到极大关注的是ZIKV感染与在2015年巴西报道的小头畸形病例发生率增加20倍显著相关。症状中最常见的是痫性发作、智力迟钝、发育迟缓、脑瘫、听力或视力丧失。

ZIKV的感染机制尚未充分研究，但病毒的复制循环与诸如DFV的其它黄病毒类似。由来自受ZIKV感染的蚊子的唾液接种的人类皮肤导致感染表皮角化细胞、皮肤成纤维细胞和郎格罕细胞(Langerhans cell)。ZIKV通过淋巴结和血流在整个人类宿主中继续传播。通过由病毒非结构蛋白、病毒RNA和宿主蛋白组成的膜结合病毒复制复合物在内质网中的细胞内隔室中发生ZIKV基因组复制，其特点大部分是未知的。ZIKV的基因组是长度约为10.7kb的单链(+)-RNA分子，具有两个非编码侧翼区(NCR)，称为5’-NCR和3’-NCR。ZIKV RNA基因组含有编码3,419个氨基酸的多肽的单一开放阅读框(ORF)，其裂解为三个结构蛋白(C、prM和E)和七个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。复合物首先将基因组正链RNA转录到互补的负链RNA中间物中，导致形成双链RNA。此双链中的负链充当多轮正链RNA合成的模板。病毒RNA合成在整个非对称复制循环中发生，其中合成比负链RNA多十倍的正链。

在某些实施方案中，本发明涉及治疗经诊断患有登革热感染的受试者的方法。在某些实施方案中，受试者经诊断患有血清型1、2、3或4的登革热。

在某些实施方案中，本发明涉及治疗经诊断患有流感感染的受试者的方法。在某些实施方案中，受试者经诊断患有流感A病毒、流感B病毒、流感C病毒、禽流感或SARS，包括亚型H1N1、H3N2、H7N9、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H5N1、H5N1、H5N1Duck/MN/1525/81、H5N2、H7N1、H7N7和H9N2)。

在某些实施方案中，本发明涉及治疗经诊断患有HIV的受试者的方法。HIV是一种导致获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的慢病毒(逆转录病毒科的成员)。慢病毒以单链、正义、包膜的RNA病毒形式传播。在进入靶细胞后，病毒RNA基因组由病毒编码的逆转录酶转化为双链DNA。此病毒DNA随后由病毒编码的整合酶连同宿主细胞辅助因子一起整合为细胞DNA。存在两类HIV。HIV-1有时称为LAV或HTLV-III。

HIV通常由抗病毒剂组合来治疗，例如两种核苷类似物逆转录抑制剂和一种非核苷类似物逆转录抑制剂或蛋白酶抑制剂。三种药物的组合通常称为三重混合物。在某些实施例实施方案中，本发明涉及通过与两种核苷类似物逆转录抑制剂和一种非核苷类似物逆转录抑制剂或蛋白酶抑制剂组合施用本文中公开的药物组合物来治疗经诊断患有HIV的受试者。非核苷类似物逆转录抑制剂或蛋白酶抑制剂的实例包括恩曲他滨、替诺福韦、依法韦仑、雷特格韦(raltegravir)、利托那韦和地瑞那韦。

在某些实施方案中，本发明涉及治疗经诊断患有丙型肝炎(HCV)或乙型肝炎(HBV)的受试者的方法。丙型肝炎病毒是一种单链的正义RNA病毒。它是黄病毒科中唯一已知的丙型肝炎病毒属的成员。丙型肝炎病毒有六种主要的基因型，由数字来表示。丙型肝炎病毒颗粒由遗传物质(RNA)的核、周围包有二十面体保护壳且进一步包在脂质包膜中来组成。在脂质包膜中嵌埋两种病毒包膜糖蛋白E1和E2。基因组由经过翻译用以产生单一蛋白的单一开放阅读框组成。这种大的前蛋白后期由细胞和病毒蛋白酶切割成允许在宿主细胞内进行病毒复制的较小蛋白，或组装成成熟的病毒颗粒，例如E1、E2、NS2、NS3、NS4、NS4A、NS4B、NS5、NS5A和NS5B。

乙型肝炎病毒是一种嗜肝性DNA病毒。病毒颗粒(病毒体)由外部脂质包膜和包含蛋白的二十面体核衣壳芯组成。HBV的基因组由环形DNA组成，但DNA并非完全双链。链的一端连接至病毒DNA聚合酶。病毒通过逆转录以RNA中间形式复制。复制通常在肝脏中进行，其在此导致炎症(肝炎)。病毒传播到在受感染人体中发现病毒特异性蛋白及其相应抗体的血液中。使用针对这些蛋白和抗体的血液测试来诊断感染。

本文中公开的方法可包括向带有诸如HIV、流感、登革热或ZIKV的包膜病毒的受试者施用公开的多肽。公开的多肽可通过多种方式施用。例如，可通过肌肉内、鼻内或皮肤中的微针来施用公开的多肽。组合物可通过口服、静脉内、皮下、经皮(例如，通过微针)、腹腔内、眼睛、阴道、直肠、舌下或通过吸入来施用。

多肽通常将以“有效量”施用，“有效量”意思是在适当施用时足以对所施用的受试者实现所需的治疗或预防作用的任何量的多肽。通常视将要预防或治疗的病况以及施用途径而定，所述有效量通常将为每天每公斤患者体重0.01至1000mg之间、更经常在0.1与500mg之间，诸如1与250mg之间，例如，每天每公斤患者体重约5、10、20、50、100、150、200或250mg，其可作为单次每日剂量施用，分成一次或多次每日剂量。施用量、施用途径以及进一步的治疗方案可由治疗临床医生视诸如患者年龄、性别和一般状况以及将要治疗的疾病/症状的性质和严重程度等因素来确定。参考美国专利No.6,372,778、美国专利No.6,369,086、美国专利No.6,369,087和美国专利No.6,372,733以及上文提到的其它参考文献，以及标准手册，诸如最新版的Remington’s Pharmaceutical Sciences。

在某些实施方案中，本文中公开的药物组合物与第二抗病毒剂组合施用。在某些实施方案中，第二抗病毒剂为奥司他韦(oseltamivir)、扎那米韦(zanamivir)和/或帕拉米韦(peramivir)。在某些实施方案中，抗病毒剂为阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺(amantadine)、安普那韦(amprenavir)、安普利近(ampligen)、阿比朵尔(arbidol)、阿扎那韦、立普妥(atripla)、波西普韦(boceprevir)、西多福韦、可比韦(combivir)、康普莱(complera)、地瑞那韦、地拉韦啶、地达诺新、二十二烷醇、度鲁特韦、依度尿苷、依法韦仑、恩曲他滨、恩夫韦地(enfuvirtide)、恩替卡韦(entecavir)、泛昔洛韦、福米韦生(fomivirsen)、膦沙那韦(fosamprenavir)、膦甲酸、膦乙醇、更昔洛韦、伊巴他滨(ibacitabine)、伊姆诺韦(imunovir)、碘苷、咪喹莫特(imiquimod)、茚地那韦(indinavir)、肌苷、III型干扰素、II型干扰素、I型干扰素、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺(loviride)、马拉韦罗(maraviroc)、吗啉胍(moroxydine)、美替沙腙、奈非那韦(nelfinavir)、奈韦拉平、奈沙韦(nexavir)、奥司他韦、聚乙二醇干扰素α-2a、喷昔洛韦、帕拉米韦、普可那利(pleconaril)、足叶草毒素(podophyllotoxin)、雷特格韦、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、培拉米定(pyramidine)、沙奎那韦、司他夫定、stribild、替诺福韦、替诺福韦酯、富马酸替诺福韦艾拉酚胺、替拉那韦(tipranavir)、曲氟尿苷、trizivir、曲金刚胺(tromantadine)、特鲁瓦达(truvada)、伐昔洛韦(valaciclovir)、缬更昔洛韦(valganciclovir)、维立韦罗(vicriviroc)、氟达拉滨、韦拉米定(viramidine)、扎西他滨、扎那米韦、齐多夫定及其组合。

已描述本发明的多个实施方案。尽管如此，仍应了解在不偏离本发明的精神和范畴下可进行各种修改。因此，其它实施方案在以下权利要求书的范畴内。

实施例

列举以下实例来为本领域一般技术人员提供关于如何制备和评估本文中要求的化合物、组合物、物品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且打算只是例示本发明而并非打算限制发明人所认为的其发明的范畴。已致力于关于数值(例如，量、温度等)的准确性，但应考虑到一些误差和偏差。除非另外说明，份为重量份，温度以℃计或在周围温度下，且压力为大气压或接近大气压。

细胞和病毒：在补充有10％FBS(FBS；Atlanta Biologicals)、1％Pen/Strep和1％HEPES的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM；Lonza)中培养Vero细胞。使用ZIKV毒株PRVABC59、MR-766、DakAr和P6-740。在生物安全水平2+(BSL2+)下进行ZIKV感染实验。

肽：最初通过刺激物驱动的分泌作用从印度南部西高止山脉地区的蛙类分离出肽并且如Reshmy等人,J Pept Sci 17,342-347,(2011)所述进行表征。在Genemed SynthesisInc.(San Francisco,CA)、Neo Scientific和艾莫利大学的Dr.Brian Evavold实验室合成肽。使用OVA257-264肽(Invivogen)作为对照物。

斑点形成试验：将肽与ZIKV(100FFU/孔)在37℃温育2小时。使用此温育的混合物在37℃感染Vero细胞1.5小时。将细胞和接种物用2％的甲基纤维素溶液(OptiMEM；Gibco)覆盖并在37℃温育72小时。将细胞用PBS洗涤且用1:1的甲醇/丙酮混合物固定30min。在室温将细胞以5％牛奶/PSB阻断20min且在37℃与一抗(抗黄病毒小鼠4G216抗体)温育2小时。然后在37℃将细胞与二抗(HRP结合的山羊抗小鼠IgG，Cell Signaling)温育1小时。用辣根过氧化物酶底物(KPL)使细胞显色。在CTL-ImmunoSpot S6Micro分析仪上读板。

溶血毒性分析：将单供体人红细胞(Innovative Research)在PBS(pH 7.4)中洗涤，500x g离心3次，持续5min。在V形底96孔板中制备经过连续稀释的蛙肽或OVA对照肽并在37℃与每孔2x10⁷个经过洗涤的hRBC混合1小时。使用PBS溶液作为阴性对照(0％溶解)且使用PBS中0.1％的Triton X-100作为100％溶解。将板在4℃以300x g离心5分钟使完整RBC沉淀，并通过450nm的吸光度测量每个孔的上清液。

免疫荧光：使Vero细胞生长并在玻璃盖玻片上以1的MOI用ZIKV(PRVABC59)感染30分钟，且固定前用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次。随后将细胞用4％的多聚甲醛溶液固定10分钟并在室温下在0.2％的Triton X-100中渗透12分钟。将细胞在无血清的蛋白阻断溶液(Dako)中阻断1小时且用一抗(小鼠4G2单克隆抗体和兔抗-α微管蛋白多克隆抗体，Millipore)和二抗(驴抗小鼠Alexa-488和Alexa-594，Thermo Fisher)染色。洗涤之后，将样本安装到具有DAPI的ProLong^TMGold(Thermo Fisher)上。使用FV10-ASW2.1软件，由Olympus Fluoview FV1000显微镜获取图像。

qRT-PCR：使用RNeasy Plus微型试剂盒(Qiagen)从模拟感染或经ZIKV感染的Vero中提取总RNA(每种样本2x10⁵个细胞)。对于qRT-PCR而言，使用随机六聚物，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)将总RNA转化为互补的DNA。为定量病毒RNA，根据制造商说明，使用TaqMan Gene Expression Master Mix(AppliedBiosystems)进行qRT-PCR。用于RT-PCR的引物先前已由Quicke等人描述。针对细胞GAPDH且相对于模拟感染对照物将25病毒RNA标准化。

用于EM的ZIKV阴性染色：在阴性染色之前，用4％的缓冲多聚甲醛固定ZIKV样本。随后将5μL的寨卡样本沉积到已由辉光放电处理20秒钟的400目镀碳铜格栅上，且为样本留有5分钟以供沉降到加盖玻璃盘中。随后将具有样本的格栅通过使样本侧接触2滴双蒸水快速洗涤，用滤纸进行毛细作用且然后用1％的磷钨酸(PTA)染色15秒钟，然后用滤纸去除PTA。使寨卡病毒在装配有Gatan US1000CCD相机(Gatan,Pleasanton,CA)的JEOL JEM-1400透射电子显微镜(JEOL Ltd.,Tokyo,Japan)上成像。

Yodha肽和变体对于寨卡病毒而言是杀病毒的

筛选蛙皮肤肽来识别针对ZIKV感染具有潜在杀病毒活性的肽。将各种肽与ZIKV(PRVABC59毒株)温育2小时，且然后通过斑点形成分析来测试病毒生存力。在76种肽的库中，12种肽使ZIKV的感染性减小(图1A)。宿主防御肽的主要缺陷在于其对哺乳动物细胞可能有毒。为识别12种肽中的无毒候选物，测量每种肽针对人红细胞的毒性。12种肽中，只有一种肽即使在高浓度时仍显示无细胞毒性(图1B)。这种肽命名为Yodha，在梵文中意思是“勇士”。Yodha肽含有23个氨基酸，且以SMLLLFFLGTISLSLCQDDQERC(SEQ ID NO:1)提供并且属于Brevenin超家族。使用Hopp和Woods曲线图(Hopp等人，P Natl Acad Sci-Biol 78,3824-3828,(1981))来分析这种肽，并且有趣的是，具有疏水性侧链的氨基酸占据了Yodha肽中几乎一半的N末端区域(图1C)。Yodha肽的C末端含有3个带负电的氨基酸((Asp(D)和Glu(E))。

为确定半最大抑制浓度(IC₅₀)，针对ZIKV对Yodha肽进行剂量递增分析(2.5μM至160μM)且观察到在10μM、20μM、40μM、80μM和160μM时分别减少35％、50％、65％、80％和90％。Yodha肽的IC₅₀为20μM(图1D)。为确定可使用而无毒性的Yodha的最大浓度，在31.25μM至2000μM范围内的肽浓度下进行人红细胞(RBC)细胞毒性测试。Yodha即使在1000μM时仍无毒，而只在2000μM时显示毒性(图1E)。还确定在暴露于ZIKV后由此肽减少的病毒动力学。使ZIKV暴露于Yodha肽5min、15min、30min、1小时和2小时。病毒滴度(以斑点形成单位FFU来测量)在测试的所有时间点均显著减小，且强烈表明Yodha肽的最大活性出现在用ZIKV温育的前五分钟内(图1F)。

基于序列同源性，可将ZIKV分为四种不同的谱系(Petersen等人，N Engl J Med375,294-295,(2016)；Hamel等人，Microbes Infect 18,441-449,(2016))。第一种ZIKV，MR-766是1947年在乌干达由哨兵恒河猴分离的。1966年，在马来西亚由大量埃及伊蚊(Aedesaegypti)分离出第一种非非洲毒株P6-740。非洲毒株DaKar41524是1984年在塞内加尔由非洲伊蚊(Aedes africanus)池(pool)分离的。2015年，在波多黎各由受感染的人类患者分离出现代毒株PRVABC59。与在美国传播的流行性毒株密切相关的这种毒株与子宫内ZIKV感染相关。图1A-1F中的所有实验都使用ZIKV的PRVABC59(波多黎各2015)毒株。

接下来，确定Yodha肽抑制ZIKV的不同毒株MR-766(乌干达，1947)、DakAr41524(塞内加尔，1984)、P6-740(马来西亚，1966)和PRVABC59(波多黎各，2015)的程度。Yodha肽抑制所有ZIKV毒株(图2A和2B)。总而言之，数据表明Yodha肽可能靶向ZIKV共有的共同区域。

还确定Yodha肽在已受ZIKV感染的细胞中是否可减少感染性病毒的产生。简单来说，Vero细胞受感染，使得病毒可附着和进入，并且随后在感染后1、14、48和72小时将Yodha肽加入培养基中。在ZIKV感染后3、24、48和72小时收集培养物上清液以通过FFU分析来定量ZIKV(图3A)。在感染后3小时，在经OVA-或Yodha肽处理的细胞中均未检测到ZIKV。观察到在感染后48和72小时，ZIKV产量减少60-70％(图3B)。总而言之，数据表明Yodha肽可显著减小病毒滴度并限制ZIKV的体外传播。

接下来，确定所观察到的Yodha肽诱导的病毒滴度降低是否是由于阻断病毒进入。合理的是，如果肽直接杀死或破坏ZIKV的包膜结构，则这将防止病毒进入。为对此进行测试，通过使ZIKV在4℃下结合细胞1小时，接着将细胞转移到37℃以允许病毒进入来进行测量病毒进入的实验(图4A)。已证实，在25min内通过早期核内体转运发生DENV2进入(Ang等人，Virol J 7,24,(2010))。使ZIKV暴露于Yodha肽且随后使病毒感染Vero细胞30min。通过定量性实时PCR(qRT-PCR)(图4B)测量Vero细胞中的病毒RNA(图3A)。在只有病毒的样本和经对照OVA肽温育的ZIKV对照样本中检测到相当量的ZIKV RNA。证实与只有OVA和病毒的对照物相比，经Yodha肽预先温育的感染ZIKV的细胞中只表达20％的ZIKV RNA，表明暴露于Yodha肽显著减小了ZIKV进入宿主细胞的能力。接下来，通过使用针对泛黄病毒E蛋白的抗体的免疫荧光来观察ZIKV是否进入(图4C)。如由qRT-PCR结果所预期，观察到ZIKV包膜在经Yodha肽处理的样本中的表达减少(图4E)，而OVA对照物(图4D)未显示此作用。这表明Yodha肽抑制ZIKV且阻止病毒进入细胞。

图4A-4E显示ZIKV暴露于Yodha肽抑制病毒进入，且此作用可能是由于与病毒结合且阻止进入，或者肽可能破坏病毒。为对此进行测试，将ZIKV用Yodha肽或对照肽处理10min且随后通过电子显微镜进行分析。令人惊讶的是，与呈现完整病毒体的经对照肽处理的ZIKV相比，经Yodha肽处理10-min引起对病毒颗粒的破坏(图5A和5B)。如丧失边界清楚的形态、丧失明确界定的层以及形成由破坏的病毒颗粒组成的聚集体可见，经Yodha肽处理的ZIKV展示出显著的结构破坏，这是在防御素诱发的病毒聚集中也观察到的一种特征(Doss等人，Protein D.J Immunol 182,7878-7887,(2009)；Doss等人，J Immunol 188,2759-2768,(2012))。总而言之，这些结果表明由于对寨卡病毒体的物理破坏，经Yodha肽处理的ZIKV丧失其感染性。

为进一步表征Yodha肽，产生了肽的丙氨酸扫描突变体，其去除了侧链但保留肽的构型，使得可评估每个氨基酸在更大结构中的意义(图6A)。测试23种突变肽(SEQ IDNO:2-24)中每一者(a)中和ZIKV的能力(图6B)和(b)对人类RBC的毒性(如果存在任何毒性)(图6C)。有趣的是，只有一种丙氨酸突变体(肽8)显示与母体肽相比在统计学上显著的(p＝0.02)抗病毒活性，而23种突变体中有20种活性减小，且两种突变体展现与Yodha肽相当的活性(图6B)。ALA突变体均无毒性且不导致RBC溶解(图6C)。手性是药理学应用中考虑的一个重要因素，因为镜像的D-对映异构体肽比天然存在的L-对映异构体在体内更稳定。D和L形式的肽以相当的效率中和ZIKV(图6D)，表明这种肽可靶向病毒中由D和L两种形式的肽识别的对称结构。

Hylarana aurantiaca南印度蛙产生几乎肯定不特异性对抗寨卡病毒，但对抗在其小生境中遭遇的其它病原体的Yodha肽。已确定这种肽或其类似物在由世界上其它地区分离的宿主防御肽中如何普遍。研究BLASTp程序并识别尤其在疏水性N-末端展示高水平同源性的31种肽(图7A)。(SEQ ID NO:25-55)确定任何这些这些变体肽可中和ZIKV的程度。

首先确定其毒性，且这些变体肽对人类RBC均不显示毒性(图7B)。除一种以外，所有变体肽对ZIKV都显示杀病毒活性(图7C)；变体25(SEQ ID NO:49)除了6个C末端氨基酸外与Yodha相同，对病毒不展示杀病毒作用。另一方面，变体12(SEQ ID NO:36)(来自高原林蛙(Rana kukunoris)的brevinin-2KK2，PMLLLFFLGTISLSLCQEEERGA)，表明针对ZIKV的作用比Yodha肽增加1.6倍。在N-末端，Yodha肽和变体12(SEQ IDNO:36)除位置1从丝氨酸变为脯氨酸残基以外都相同；这些肽的C末端在位置17(Q)之后不同。由与表达Yodha肽的蛙Hyalarana aurantiaca来自相同地理区域的青铜蛙(I.temporalis)分离的，呈现S1-P改变但在末端少一个谷氨酸氨基酸的变体21(SEQ IDNO:45)(PMLLLFFLGTISLSLCQEERGA)也对ZIKV展示活性。

接下来研究位置1处的S变为P或去除C末端(Q17之后的序列)是否有助于改善活性。还产生一种从Yodha去除C末端DDQERC(SEQ ID NO:81)的截短的短Yodha肽(SEQ ID NO:56)、从变体12去除EEERGA(SEQ ID NO:82)的短12肽(SEQ ID NO:57)以及在全长Yodha中置换S1-P的S1P Yodha(SEQ ID NO:58)(图7D)。测试这些肽针对ZIKV的活性(图7D)。S1P全长Yodha肽比WT Yodha肽对ZIKV显著更有效。从Yodha以及变体12(SEQ ID NO:36)去除C末端显著改善活性。这也表明活性依赖于N末端的疏水区。总而言之，这些结果表明改变N末端位置1处的S-P或去除C末端-DDQERC(SEQ ID NO:81)改善Yodha肽针对寨卡病毒的活性。

表3.Yodha多肽、其突变体和变体。

构成先天免疫系统的古老分支的宿主防御肽为宿主提供保护。两栖动物宿主防御肽Yodha针对寨卡病毒起作用。这种肽及其变体至少出于以下原因可用作抗病毒剂。首先，其可直接作用于病毒并导致病毒溶解。其次，Yodha肽作用于ZIKV的所有谱系。对四种ZIKV毒株各自独立地进行测序且发现P6-1966、MR-1947和Dak-194的氨基酸水平与PR-2015分别相差1.1％、3.2％和3.0％。还有，MR-1947与PR-2015的结构蛋白的区别(4.4％)比非结构蛋白的区别(2.9％)更显著。尽管如此，Yodha肽靶向所有四种不同的谱系，表明其可靶向在所有ZIKV之间保守的基序。第三，Yodha肽对人类RBC无毒；这种肽的IC₅₀为20μM(0.052m g/mL)且在1000μM(2.6mg/ml)下无毒，得到可施用的大范围剂量。第四，Yodha肽至少在暴露于病毒的5分钟之内快速中和病毒，这在治疗中是一种有利的特征。第五，已证实Yodha肽的L-和D-对映异构体形式都针对ZIKV起作用(图2D)而且这是有意义的，因为与天然存在的L形式不同，D形式在体内更稳定，因为对内源性蛋白酶的敏感性更小。

Yodha肽靶向ZIKV的哪个部分尚不清楚。由于其对传播了68年(1947-2015)的ZIKV病毒有效，因此所述肽可能靶向在所有这些病毒之间保守的一些基序。EM研究证实Yodha肽诱使病毒溶解。已知疏水性是将蛋白的跨膜区段整合至脂质双层中的主要驱动力。有趣的是，图7A-7F中所示的Yodha肽以及天然存在的变体肽具有肽的活性可映射的共同的疏水性N末端(图1C)。这表明肽可能通过使用疏水性N-末端整合至病毒脂质双层中使病毒失去稳定。

Yodha肽的天然存在的变体也对ZIKV具有活性。这些肽来自具有跨越全球的天然栖息地——印度、中国、斯里兰卡、缅甸、美国、加拿大、墨西哥、韩国、俄罗斯或欧洲的蛙类。这些两栖动物产生这些肽来对抗ZIKV的可能性极小，相反，这些肽赋予了对抗一些常见两栖动物病原体的生存优势。这些肽可能通过与toll样受体类似的“模式识别”来起作用，且ZIKV碰巧共用这些模式/基序。这些发现证实，Yodha肽可用作ZIKV病毒的抗病毒化合物。这种肽对ZIKV的直接杀病毒活性以及其对人类RBC的低毒性使其成为对抗ZIKV的候选物。

Yodha肽有效减小小鼠体内的病毒滴度

施用Yodha肽减轻ZIKV病毒血症和小鼠体内的病毒载量。对4-5周大的小鼠群体经腹腔内给与2mg抗-Ifnar1mAb，且次日用10⁵FFU的PRVABC ZIKV感染。通过实时PCR监控血清和组织中的病毒血症和病毒载量。参见图11A-C。

Yodha肽对于登革热病毒而言具有杀病毒性

登革热是在世界范围内导致约4亿病例的一种蚊媒疾病。估计128个国家的39亿人群存在屈服于登革热的风险。这是由属于与寨卡病毒同一科的黄病毒科的登革热病毒引起的。登革热病毒具有四种血清型，DENV 1-4。暴露于一种血清型增强对其它血清型的感染性，因为针对一种血清型制得的抗体与另一血清型交叉反应且结合并促使感染增加。目前针对登革热病毒无可用的疫苗或抗病毒药物。发现Yodha肽对登革热病毒的所有四种血清型都具有杀病毒性。有趣的是，DENV 1、2和4在50μM的肽浓度下易于中和(图8A)，且DENV 4有效需要更高剂量(160μM)的Yodha肽(图8B)。截短Yodha变体12针对DENV3感染的剂量递增表明截短形式比全长Yodha肽更有效(图8D)。

Yodha肽对于人类流感病毒具有杀病毒性

进行实验表明Yodha肽对流感病毒的所有亚型有效。Yodha肽对H1、H3、N1、N2流感病毒有效。图9A显示数据表明Yodha肽对H1N1、H3N2、H1N2、H3N1和H3N2病毒具有杀病毒性。Yodha肽也结合H2、H5、H7和H9禽流感血凝素。用生物素化的Yodha肽温育来自三种H3病毒以及禽流感病毒H2、H5、H7和H9的重组血凝素。使用抗流感抗血清的蛋白质印记法用来检测病毒HA和链霉亲和素PE，从而检测生物素化的Yodha肽。Yodha肽与来自所测试流感病毒的HA结合，表明其对流感病毒具有广泛的活性。

Yodha肽的截短变体

产生Yodha肽的巢式截短变体。用H3N2流感病毒(A/Aichi/2/68)温育这些变体且随后相对于对照肽通过基于细胞的中和能力分析进行测试。参见图12。此数据表明8/19(42％)所测试的截短中和50％或50％以上所加入的H3N2。

序列	代码
			SMLLLFFLGTISLSLCQDDQER	SY-1	SEQ ID NO:59
SMLLLFFLGTISLSLCQDDQE	SY-2	SEQ ID NO:60
			SMLLLFFLGTISLSLCQDDQ	SY-3	SEQ ID NO:61
SMLLLFFLGTISLSLCQDD	SY-4	SEQ ID NO:62
			MLLLFFLGTISLSLCQDDQERC	NSY-1	SEQ ID NO:63
LLLFFLGTISLSLCQDDQERC	NSY-2	SEQ ID NO:64
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			LCQDDQERC	NSY-13	SEQ ID NO:75
CQDDQERC	NSY-14	SEQ ID NO:76
			QDDQERC	NSY-15	SEQ ID NO:77

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有如本发明内容所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。本文引用的公布及其引用的材料特定以引用的方式并入。

本领域技术人员将意识到，或使用不超出常规实验能够确定本文所述的公开内容的具体实施方案的多种等效物。下文的权利要求书预期涵盖所述等效物。

序列表

<110> Emory University

Jacob, Joshy

Holthausen, David

Lee, Song Hee

George, Sanil

<120> 用于管理病毒感染的多肽

<130> 17057 PCT

<150> US 62/433,490

<151> 2016-12-13

<150> US 62/466,066

<151> 2017-03-02

<160> 82

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 1

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 2

Ala Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 3

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 3

Ser Ala Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 4

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 4

Ser Met Ala Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 5

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 5

Ser Met Leu Ala Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 6

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 6

Ser Met Leu Leu Ala Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 7

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 7

Ser Met Leu Leu Leu Ala Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 8

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 8

Ser Met Leu Leu Leu Phe Ala Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 9

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 9

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Ala Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 10

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 10

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Ala Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 11

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 11

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Ala Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 12

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 12

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ala Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 13

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 13

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ala Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 14

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 14

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Ala Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 15

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 15

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ala Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 16

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 16

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Ala Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 17

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 17

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Ala

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 18

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 18

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Ala Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 19

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 19

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Ala Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 20

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 20

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Ala Gln Glu Arg Cys

20

<210> 21

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 21

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Ala Glu Arg Cys

20

<210> 22

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 22

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Ala Arg Cys

20

<210> 23

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 23

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Ala Cys

20

<210> 24

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 24

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Ala

20

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<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 25

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Glu Arg Gly Ala

20

<210> 26

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 26

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Glu Gly Ala

20

<210> 27

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 27

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Glu Glu Glu Arg Gly Ala

20

<210> 28

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 28

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Glu Gln Glu Arg Asn Ala

20

<210> 29

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 29

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Glu Gln Glu Arg Asp Ser Asp

20

<210> 30

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 30

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Glu Gln Glu Arg Asp Ala Asp

20

<210> 31

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 31

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Glu Glu Arg Gly Ala

20

<210> 32

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 32

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Glu Glu Glu Arg Asn Ala

20

<210> 33

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 33

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Glu Glu Arg Asp Ala

20

<210> 34

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 34

Ser Leu Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Glu Thr Asn Ala

20

<210> 35

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 35

Ser Leu Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Asn Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Glu Met Pro Lys

20

<210> 36

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 36

Pro Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Glu Glu Glu Arg Gly Ala

20

<210> 37

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 37

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Asn Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Glu Glu Arg Asp Ala

20

<210> 38

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 38

Ser Leu Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Glu Glu Glu Arg Asn Ala

20

<210> 39

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 39

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Met Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Glu Arg Gly Ala

20

<210> 40

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 40

Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys Glu

1 5 10 15

Gln Glu Arg Asn Ala

20

<210> 41

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 41

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Asn Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Glu Gln Glu Arg Asp Ala

20

<210> 42

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 42

Pro Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Glu Gln Glu Arg Asn Ala

20

<210> 43

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 43

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Asn Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Glu Gln Glu Arg Asn Ala

20

<210> 44

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 44

Ser Leu Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Arg Glu Ala Asp

20

<210> 45

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 45

Pro Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Glu Glu Arg Gly Ala

20

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<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 46

Ser Leu Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Asn Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Glu Thr Asn Ala

20

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<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 47

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Asn Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Glu Glu Glu Arg Asp Ala

20

<210> 48

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 48

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Glu Glu Glu Arg

20

<210> 49

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 49

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Glu Glu Glu Arg Asp Ala

20

<210> 50

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 50

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Glu Glu Glu Arg Ser Ala

20

<210> 51

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 51

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Glu Glu Glu Arg Asn Ala

20

<210> 52

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 52

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Glu Glu Glu Arg Gly Ala

20

<210> 53

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 53

Ser Met Leu Leu Phe Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Glu Glu Glu Arg Gly Ala

20

<210> 54

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 54

Ser Leu Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Glu Glu Glu Arg Asn Ala

20

<210> 55

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 55

Ser Met Leu Leu Ile Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Glu Gln Glu Arg Asp Ala

20

<210> 56

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 56

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln

<210> 57

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 57

Pro Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln

<210> 58

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 58

Pro Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 59

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 59

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu Arg

20

<210> 60

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 60

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln Glu

20

<210> 61

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 61

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp Gln

20

<210> 62

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 62

Ser Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys

1 5 10 15

Gln Asp Asp

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<211> 22

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 63

Met Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys Gln

1 5 10 15

Asp Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 64

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 64

Leu Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys Gln Asp

1 5 10 15

Asp Gln Glu Arg Cys

20

<210> 65

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 65

Leu Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys Gln Asp Asp

1 5 10 15

Gln Glu Arg Cys

20

<210> 66

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 66

Leu Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys Gln Asp Asp Gln

1 5 10 15

Glu Arg Cys

<210> 67

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 67

Phe Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys Gln Asp Asp Gln Glu

1 5 10 15

Arg Cys

<210> 68

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 68

Phe Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys Gln Asp Asp Gln Glu Arg

1 5 10 15

Cys

<210> 69

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 69

Leu Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

1 5 10 15

<210> 70

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 70

Gly Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

1 5 10 15

<210> 71

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 71

Thr Ile Ser Leu Ser Leu Cys Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

1 5 10

<210> 72

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 72

Ile Ser Leu Ser Leu Cys Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

1 5 10

<210> 73

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 73

Leu Ser Leu Cys Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

1 5 10

<210> 74

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 74

Ser Leu Cys Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

1 5 10

<210> 75

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 75

Leu Cys Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

1 5

<210> 76

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 76

Cys Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

1 5

<210> 77

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 77

Gln Asp Asp Gln Glu Arg Cys

1 5

<210> 78

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<220>

<221> X

<222> (1)..(12)

<223> X为任何氨基酸

<400> 78

Leu Phe Phe Xaa Gly Thr Ile Xaa Leu Xaa Leu Cys

1 5 10

<210> 79

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<220>

<221> X

<222> (1)..(15)

<223> X为任何氨基酸

<400> 79

Leu Phe Phe Xaa Gly Thr Ile Xaa Leu Xaa Leu Cys Xaa Asp Asp

1 5 10 15

<210> 80

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<220>

<221> X

<222> (1)..(19)

<223> X为任何氨基酸

<400> 80

Leu Phe Phe Xaa Gly Thr Ile Xaa Leu Xaa Leu Cys Xaa Asp Asp Gln

1 5 10 15

Glu Arg Cys

<210> 81

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 81

Asp Asp Gln Glu Arg Cys

1 5

<210> 82

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 82

Glu Glu Glu Arg Gly Ala

1 5

Claims

1.一种组合物，其包含：

包含氨基酸序列LFFX¹GTIX²LX³LC(SEQ ID NO:78)的多肽或其变体，其中X¹为任何氨基酸；X²为任何氨基酸；且X³为任何氨基酸，以及

药学上可接受的载剂。

2.如权利要求0所述的组合物，其中所述多肽由氨基酸序列SMLLLFFLGTISLSLCQDDQERC(SEQ ID NO:1)组成。

3.如权利要求0所述的组合物，其中所述多肽由氨基酸序列SMLLLFFLGTISLSLCQ(SEQID NO:56)或PMLLLFFLGTISLSLCQ(SEQ ID NO:57)组成。

4.如权利要求0所述的组合物，其中所述多肽由氨基酸序列LLFFLGTISLSLCQDDQERC(SEQ ID NO:65)组成。

5.如权利要求1所述的组合物，其中所述多肽具有一个或两个氨基酸取代。

6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其进一步包含另一种抗病毒化合物。

7.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述组合物为胶囊、药片、药丸、粉末、颗粒或凝胶的形式。

8.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述组合物为无菌pH缓冲的水性盐溶液的形式。

9.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述多肽具有选自酰胺化和乙酰化的至少一个氨基酸修饰。

10.一种在有需要的受试者中预防或治疗病毒感染的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列包含LFFX¹GTIX²LX³LC(SEQ ID NO:78)；其中X¹为任何氨基酸；X²为任何氨基酸；且X³为任何氨基酸。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述病毒感染为寨卡病毒。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述病毒感染为登革热病毒。

13.如权利要求10所述的方法，其中所述病毒感染为流感病毒。

14.如权利要求10所述的方法，其中所述病毒感染为HIV病毒。

15.一种多肽，其包含的氨基酸序列包含LFFX¹GTIX²LX³LC(SEQ ID NO:78)；其中X¹为任何氨基酸；X²为任何氨基酸；且X³为任何氨基酸。

16.如权利要求15所述的多肽，其中X¹为A。

17.如权利要求15所述的多肽，其中X³为A。

18.一种编码如权利要求15所述的多肽的核酸，其与异源启动子可操作组合。

19.一种包含如权利要求18所述的核酸的载体。

20.一种包含如权利要求19所述的载体的表达系统。