CN101921310B - 登革病毒特异性hla-a2限制性表位肽及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及登革病毒特异性HLA-A2限制性表位肽及应用。本发明表位肽是DENV-1非结构蛋白来源的、HLA-A2限制性的CTL表位，可诱导高水平的具有杀伤作用的CTL反应。

Description

登革病毒特异性HLA-A2限制性表位肽及应用

技术领域

本发明属于生物技术和医药领域；更具体地，本发明涉及登革病毒特异性HLA-A2限制性表位肽及应用。

背景技术

登革病毒(Dengue virus，DENV)为单股正链RNA病毒，属黄病毒科、黄病毒属，包括四个血清型(DENV-1，2，3，4)。DENV基因组约为11kb，编码产生3个结构蛋白(衣壳蛋白C、膜蛋白M和包膜蛋白E)和7个非结构蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5)。DENV感染引起轻度的登革热(Dengue fever，DF)或严重的登革出血热/登革休克综合症(Denguehemorrhagic fever/dengue shock syndrome，DHF/DSS)，其中DHF/DSS病例具有极高的病死率。据WHO估计全球每年约有5000万-1亿DENV感染者，其中包括约25万-50万的DHF/DSS病例。目前，在100多个国家中出现过DF患者，而超过60个国家报道过DHF病例。从1978年中国广东和海南等地区首次出现DF以来，中国的台湾，广西，福建，云南，浙江和上海等地区均出现过规模不等的DF的流行。最近十几年，中国流行的DENV血清型主要是DENV-1型。

研究表明DENV感染所诱导的特异性CD8⁺T细胞(Cytotoxic Tlymphocyte，细胞毒性T细胞，CTL)通过释放穿孔素、颗粒酶或表达凋亡配体(FasL)而杀伤DENV感染细胞、清除DENV。CTL表位是刺激机体产生特异性CTL的核心元件(与MHC-I类分子结合的多肽，长度约为8-10个氨基酸)，其能诱导表位特异性的CTL而不出现无关的免疫反应。因此，基于CTL表位研发的CTL表位肽疫苗同传统疫苗相比，具有明显优势：1.安全、无毒、稳定：原因是此类疫苗不包含病原生物的无关组分，只能激发特异性CTL免疫反应，因此彻底摆脱了潜在的副作用；2.易于将来源于病原体的多个CTL表位进行组合，研发针对一种病原体或者针对多种病原体的多价CTL表位肽疫苗；3.易于人工合成，摆脱了体外培养的限制，大大缩短了研制周期。由于上述优势，CTL表位肽疫苗已成为防治DENV感染研究的一个新方向，而鉴定DENV特异性CTL表位则是研发此类疫苗的关键。

HLA-A2是一种在中国人群中具有较高分布的MHC-I类分子，阳性率在40％-60％之间，占MHC-I类分子中各个等位基因的首位，是CTL表位肽疫苗研发中首选的MHC分子。

由于目前尚缺乏预防DENV感染的方法，因此迫切需要开发新的可用于防治DENV感染的疫苗，尤其是安全性和特异性高的CTL表位肽疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供具有较高免疫原性的DENV-1特异性HLA-A2限制性表位肽。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，所述的多肽是选自如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽。

在一个优选例中，所述的多肽来源于登革病毒。

在另一优选例中，所述的多肽来源于登革病毒血清型1(DENV-1)。

在另一优选例中，所述的多肽是登革病毒非结构蛋白来源的。

另一方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的多肽。

另一方面，提供一种载体，所述载体含有所述的多核苷酸。

另一方面，提供一种遗传工程化的细胞，所述细胞含有所述的载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

另一方面，提供一种制备所述的多肽的方法，所述方法包括：

(i)在适合表达的条件下，培养所述的细胞；和

(ii)分离出所述的多肽。

另一方面，提供所述的多肽的用途，用于制备诱导发生细胞毒性T细胞(CTL)反应的药物组合物。

在一个优选例中，所述的多肽用于制备诱导产生肽特异性的细胞毒性T细胞(CTL)的药物组合物。

在另一优选例中，所述的细胞毒性T细胞是HLA-A2限制性的细胞毒性T细胞。

另一方面，提供所述的多肽的用途，用于制备预防或治疗登革病毒(DENV)感染的药物组合物。

另一方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物含有：

有效量的所述的一种或多种多肽；和

药学上可接受的载体。

在一个优选例中，所述的药物组合物是疫苗。

另一方面，提供一种药盒，所述的药盒中含有：一种或多种所述的多肽；或所述的药物组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、各种肽与HLA-A2分子的亲和力，采用流式细胞仪检测用各种肽处理的细胞的荧光强度。

图2、体外从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导产生成熟的树突状细胞(DC)的显微镜照片。其中，左图显示为未成熟DC，其表现为贴壁、长分枝状细胞；右图显示为成熟DC，其表现为悬浮、细胞边缘有细小突起。

图3、HLA-A2限制性表位肽诱导的CTL中IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的百分比。其中，“^*”表示肽刺激组和无肽刺激组比较有显著性差异。

图4、CTL表位肽体外诱导的特异性CTL(ELISPOT检测分泌IFN-γ的细胞)。其中，A为无肽刺激；B为同样的多肽刺激。

图5、HLA-A2限制性CTL表位肽体外诱导的特异性CTL(ELISPOT检测分泌IFN-γ的细胞)。“^*”表示肽刺激组和无肽刺激组比较有显著性差异。

图6、HLA-A2限制性CTL表位肽诱导的CTL对负载表位肽T2细胞的杀伤作用。

图7、各肽的质谱图。

A、肽NS4a_140的质谱图；

B、肽NS2a_144的质谱图；

C、肽NS5_134的质谱图；

D、肽NS4b_40的质谱图。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，首次揭示一组具有较高免疫原性的DENV-1特异性HLA-A2限制性表位肽。所述表位肽是DENV-1非结构蛋白来源的、HLA-A2限制性的CTL表位肽，可诱导高水平的具有杀伤作用的CTL反应。

本发明人首先通过对DENV-1的非结构蛋白采用Rankpep，SYFPEITHI等T细胞表位预测软件预测，选择合成了多条有可能与HLA-A2.1分子结合并诱导机体产生CTL效应的抗原肽，通过MHC-肽复合物稳定性实验，筛选出与HLA-A2.1具有强亲和力的表位肽NS4a_140、肽NS2a_144、肽NS5_134和肽NS4b_40，并对其免疫原性进行评估，发现它们不仅可以在HLA-A2阳性健康人外周血单个核细胞(PBMC)中诱导出肽特异性的HLA-A2限制性的CTL，并且这些CTL可以杀伤提呈同样表位肽的T2细胞。

MHC-肽复合物稳定性实验显示上述这些表位肽受HLA-A2限制，ICS、ELISPOT和CTL杀伤实验证实这些表位肽具有较好免疫原性且其诱导的CTL可以杀伤负载多肽的T2细胞。

如本文所用，所述的“HLA-A2限制性的CTL表位肽”是指具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽(如表1)或其衍生肽，其是登革病毒特异性的，具有诱导发生细胞毒性T细胞(CTL)反应的功能。所述的“HLA-A2限制性的CTL表位肽”在文中也简称为“本发明的表位肽”或“所述的表位肽”。本文所述的“CTL表位肽”是指含有CTL表位的氨基酸序列的蛋白；该蛋白或含有该蛋白的组合物可引发哺乳动物免疫应答。本发明中，术语“多肽”、“蛋白”可互换使用。

表1

	起始位置	序列(SEQ ID NO：)
			NS4a_140	NS4a(140-148)	ALLFMILTV(SEQ ID NO：1)
NS2a_144	NS2a(144-152)	QLWATLLSL(SEQ ID NO：2)
			NS5_134	NS5(134-142)	LLMRTTWAL(SEQ ID NO：3)
NS4b_40	NS4b(40-48)	TLYAVATTI(SEQ ID NO：4)

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。例如，活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸和多肽如果与天然状态一起存在的其他物质分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重组或合成的疫苗诱导哺乳动物体内的特异性体液和/或细胞免疫应答的能力。

如本文所用，“免疫应答”包括细胞性和/或体液性免疫应答，它们足以抑制或防止病毒感染；或防止或抑制由登革病毒所导致的疾病。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂或稀释剂。

如本文所用，“有效量”或“免疫有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

本发明的表位肽及其编码基因

本发明的表位肽可以是重组多肽、合成多肽。本发明的表位肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母和哺乳动物细胞)中产生。

本发明还包括所述表位肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片断”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的表位肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的表位肽片断、衍生物和类似物可以是：(1)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(3)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(4)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化的多肽序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片断的形成的融合蛋白)。这些片断、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明的表位肽的用途是：直接作为药物预防或治疗病原体(登革病毒)感染相关疾病；或制备诱导发生细胞毒性T细胞(CTL)反应的药物组合物。

编码本发明的表位肽的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是单链的或是双链的。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码本发明的表位肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明表位肽有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物。

本发明所述的多核苷酸通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。所述的重组法通常是将所述多核苷酸克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外还可以通过人工合成的方法来合成有关序列。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明表位肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

载体及宿主细胞

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及本发明的载体或表位肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术生产本发明所述表位肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984，224：1431)，可利用本发明的多核苷酸序列来表达或生产重组的本发明的表位肽。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码表位肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；和

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，编码所述表位肽的多核苷酸可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含所述多核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的编码所述的表位肽的多核苷酸以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，酵母等。针对不同的宿主细胞，还可对所述的多核苷酸序列进行密码子优化，以获得改进的表达效果，密码子优化技术是本领域人员熟知的。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，以表达所述的表位肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。

所述的表位肽可在细胞内表达、或分泌到细胞外。可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

组合物

本发明还提供了包含本发明的表位肽的组合物，特别是药物组合物，所述的组合物也包括疫苗。该组合物可用于诱导发生细胞毒性T细胞(CTL)反应，也即诱导产生肽特异性的细胞毒性T细胞(CTL)。该组合物可用于预防或治疗登革病毒感染相关疾病，所述疾病包括(但不限于)：登革热、登革出血热/登革休克综合症。

包含本发明的表位肽的组合物可以包含按表位肽的实际用途所选用的缓冲剂；还可包含适用于预定用途的其它物质。本领域技术人员都善于选择合适的缓冲剂，本领域已知有多种缓冲剂适用于预定用途。在有些实例中，该组合物可含有药学上可接受的赋形剂，本领域已知有多种而无需在此详细讨论。药学上可接受的各种赋形剂在多种出版物已有详述，包括如“Remington’sPharmaceutical Sciences”(《雷明顿药物科学》，第19版(1995)Mack PublishingCo.)。

可将本发明的组合物制备成各种剂型，如注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾、透皮药物等。适用于口服或局部使用的药用级别的有机或无机载体和/或稀释剂，可用于配制包含治疗活性化合物的各种组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油和脂肪。还可用稳定剂、润湿剂和乳化剂、改变渗透压的盐类或维持合适pH值的各种缓冲剂和皮肤渗透增强剂等作为辅助性材料。

当用作疫苗时，所述的疫苗可采用各种方法进行配制。通常，按本领域熟知的各种方法，用合适的药用载体和/或运载体(vehicle)配制本发明的疫苗或药物。合适的载体是无菌盐水。为此也可使用其它水性和非水性等渗无菌注射液以及水性和非水性无菌悬浮液(已知都是本领域技术人员所熟知的药学上可接受的载体)。

另外，本发明的疫苗的配制还可含有其它成分，包括如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。这些成分是疫苗领域技术人员所熟知的。佐剂类包括(但不限制于)铝盐佐剂；皂苷佐剂；Ribi佐剂(Ribi ImmunoChem Research In.，Hamilton，MT)；Montanide ISA佐剂(Seppic，Paris，France)；Hunter’s TiterMax佐剂(CytRx Corp.，Norcross，GA)；Gerbu佐剂(Gerbu Biotechnik GmbH，Gaiberg，Germany)等。另外，在制剂中也可包含调节免疫应答的其它成分(IL-12、CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)等)。

当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的表位肽施用于对象。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。采用疫苗组合物的形式时，还可包括药学上可接受的载体。此外，这种组合物还可包括佐剂、矫味剂或稳定剂等。

给予本发明组合物的常规和药学上可接受的途径包括：鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要可以组合给药途径，或按抗原肽或疾病情况进行调节。疫苗可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

应以“有效量”给予本发明的表位肽，即表位肽的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗登革病毒感染或因感染导致的并发症。

在各疫苗剂份中所选用的表位肽的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，给予约0.01μg-10mg表位肽/kg体重，优选0.1μg-1mg表位肽/kg体重，更优选1μg-1mg表位肽/kg体重。可用包括观察对象中表位肽特异性CTL的水平和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量，可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血液中的表位肽特异性CTL的水平后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的表位肽的免疫应答。

药盒

本发明还提供了一种防治登革病毒感染或因感染导致的并发症的药盒，其中含有本发明的表位肽或含有该表位肽的组合物。此外，为了方便给药，所述的药盒中还可含有注射用的针，和/或药学上可接受的载体，和/或使用说明书。

本发明的主要优点在于：

本发明表位肽是DENV-1非结构蛋白来源的、HLA-A2限制性的CTL表位，可诱导高水平的具有杀伤作用的CTL反应，其不仅对DENV发病机制的研究，而且对DENV表位疫苗以及DENV感染诊断试剂的研发均具有重要的意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、MHC-肽复合物稳定性实验

首先对DENV-1非结构蛋白采用Rankpep，SYFPEITHI等T细胞表位预测软件预测，用常规的肽人工合成法，合成了多条有可能与HLA-A2.1分子结合并诱导机体产生CTL的抗原肽，见表2。

接着，应用MHC-肽复合物稳定性试验筛选与HLA-A2.1分子高亲和力的表位肽。T2细胞是用于测定表位与HLA-A2.1分子结合的细胞，是一种抗原加工相关转运体(TAP)缺陷的HLA-A2.1型细胞株，其细胞表面只表达未结合表位的HLA-A2.1分子，因而可利用其与肽的结合程度来测定HLA-A2.1分子与肽的亲和力。

方法如下：

培养T2细胞(购自ATCC)，用无血清RPMI 1640培养液洗涤细胞3次，调细胞浓度为6×10⁵个/ml，铺于24孔板，1ml/孔。分为实验孔【每孔加50μg肽、3μg的β2M(β2微球蛋白，购自Sigma)】、空白对照孔(未加肽刺激、未加β2M)和背景对照孔(未加肽刺激、只加β2M)，首先将细胞在37℃，5％CO₂孵箱中孵育1h，然后在26℃孵育18h，最后在37℃孵育3h。用PBS洗涤细胞3次，加入FITC标记的抗HLA-A2的单克隆抗体(BD pharmingen)(空白对照孔不加)，4℃避光孵育30min，PBS洗涤2次后，用500μl的含0.5％多聚甲醛的PBS悬浮细胞，用流式细胞仪检测细胞的平均荧光强度(空白对照孔的T2细胞用于调电压)。

结果判定：外源性肽与T2细胞表面HLA-A2.1分子的结合可使其表面的MHC-I类分子的量增加，两者结合越牢固，可检测到的MHC-I类分子的量越多。以平均荧光强度为检测指标，以荧光系数(FI)作为衡量指标，肽的FI＞1被认为是高亲和力的表位。

如表1和图1所示，肽NS4a_140、肽NS2a_144、肽NS5_134和肽NS4b_40与HLA-A2.1分子具有高亲和力，这些肽为HLA-A2限制性表位。这些肽的质谱鉴定见图7。

表2.T2细胞HLA-A2分子对DENV-1候选表位肽的结合力

	起始位置	序列(SEQ ID NO：)	SYFPEITHI预测得分/RANKpep(OPT)	FI
					NS4a_56	NS4a(56-64)	MLLALIAVL(SEQ ID NO：5)	29             81.40％	0.31
C_46	C(46-54)	LVMAFIAFL(SEQ ID NO：6)	24             71.32％	0.53
					NS4a_140	NS4a(140-148)	ALLFMILTV	30             79.84％	3.84

		(SEQ ID NO：1)
					NS2a_144	NS2a(144-152)	QLWATLLSL(SEQ ID NO：2)	28       70.54％	1.12
NS5_762	NS5(762-770)	LLATSIFKL(SEQ ID NO：7)	30       76.74％	0.83
					NS2a_169	NS2a(169-177)	AMILSIVSL(SEQ ID NO：8)	30       70.54％	0.1
NS5_134	NS5(134-142)	LLMRTTWAL(SEQ ID NO：3)	26       65.89％	1.6
					NS4b_40	NS4b(40-48)	TLYAVATTI(SEQ ID NO：4)	21       77.52％	2.25

其中，OPT：肽同HLA-A2分子结合力得分占最佳表位肽同HLA-A2分子结合力得分的百分比。

实施例2、成熟树突状细胞(DC)的诱导，以及负载肽的DC的制备

成熟树突状细胞诱导如下：

抽取HLA-A2阳性健康者的外周静脉血，用无菌PBS缓冲液1∶1稀释，将其轻轻覆盖在Ficoll-Paque密度梯度分离液上，室温2000rpm离心25min，轻轻吸取中间白膜层(PBMC)，用10％FCS的RPMI 1640液洗涤2次，将PBMC在6孔板中贴壁培养3h，弃培养液及未贴壁细胞，每孔加2ml含10％FCS、20μg/ml GM-CSF(Peprotech Inc)、20μg/ml的IL-4(Peprotech Inc)的RPMI1640培养液，于37℃、5％CO₂孵箱中，每3天半量换液(补充等量的细胞因子)，培养至第7天加TNF-α(10μg/ml，Peprotech Inc)诱导成熟，48h后收集细胞，用相差显微镜观察树突状细胞诱导成熟中细胞形态学变化。

结果如图2所示，未成熟DC为贴壁、长分枝状细胞，而成熟DC为悬浮、细胞边缘有突起。

负载肽的DC的制备如下：

将各肽加入前述制备的成熟的DC中(100μg/1×10⁵DC)，37℃、5％CO₂孵箱中培养12h。

实施例3、PBMC的分离及体外肽特异性CTL的诱导

抽取HLA-A2阳性健康者的外周静脉血，用无菌PBS缓冲液1∶1稀释，将其轻轻覆盖在Ficoll-Paque密度梯度分离液上，室温2000rpm离心25min，轻轻吸取中间白膜层(PBMC)，用10％FCS的RPMI 1640液洗涤2次。将PBMC悬浮于10％人AB血清的RPMI 1640培养液(2×10⁶个/ml)中，将细胞悬液加到6孔板中(每孔2ml)，然后将前述制备的负载肽的DC(1×10⁵个/ml)加入孔中共同孵育，每孔加IL-2(10ng/ml，Peprotech Inc)。隔7天用负载肽的DC(1×10⁵个/ml)再刺激1次。第二次刺激后7天，收集细胞(为效应细胞)。

实施例4、细胞内细胞因子染色法(ICS)检测肽特异性CD8⁺IFN-γ⁺T细胞

用负载相同表位肽的DC刺激前述获得的效应细胞，用未负载表位肽的DC刺激前述获得的效应细胞。加入BFA(BrefeldinA，布雷菲德菌素A，购自EnzoBiochem公司，终浓度为10μg/ml)，37℃、5％CO₂孵箱中培养6h。收集细胞，PBS洗涤2次。管中加入APC标记的抗人CD3单克隆抗体(eBioscience，美国)、FITC标记的抗人CD8单克隆抗体(eBioscience)，4℃避光孵育30min。PBS洗涤2次，管中加入固定剂室温10min。PBS洗涤1次，管中加入破膜剂，加入PE标记的抗人IFN-γ单克隆抗体(eBioscience)，4℃避光孵育30min。PBS洗涤2次，用500μl含0.5％多聚甲醛的PBS悬浮细胞。流式细胞仪检测肽特异性CD8⁺IFN-γ⁺T细胞的水平。

结果如图3所示，DENV-1特异性HLA-A2限制性表位肽NS4a_140，肽NS2a_144，肽NS5_134和肽NS4b_40可在体外诱导高水平的CTL反应(在同样肽刺激后，CD8⁺T细胞中有高水平的IFN-γ⁺CD8⁺T细胞)。

实施例5、酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测肽特异性分泌IFN-γ的细胞

采用人IFN-γELISPOT试剂盒(预包被的PVDF膜96孔板，荷兰U-CyTech公司)，参照说明书进行。过程如下：

将96孔板平衡至室温，每孔加入200μl的RPMI 1640培养液，室温下孵育20min。吸出培养液，每孔加入前述肽刺激的2×10⁴PBMC(效应细胞)(悬浮于100μl RPMI 1640培养液)。设置阴性对照孔(加PBMC而不加多表位肽)，表位肽刺激孔(加PBMC同时加入表位肽使其终浓度为10μg/ml)，每个处理因素均设置两孔。将板放于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。吹散每孔中的细胞，吸除液体，洗涤4次(每孔加入100μl洗脱液，洗涤30s，最后将板倒置到吸水纸上拍打以吸干残留的液体)。每孔加入100μl新鲜稀释好的生物素化抗IFN-γ的检测抗体，于37℃培养1h。吸除孔中液体，洗涤4次(同上)。每孔加入100μl新鲜稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的链酶亲和素，于37℃培养1h(避光)。吸除孔中液体，洗涤4次(同上)。每孔加入100μl现配的ACE显色液，于37℃培养10-30min(避光)。移除每孔中ACE，用去离子水冲洗，将板倒置到吸水纸上拍干。从板底部移除塑料排水管，擦干净板的底部。室温放置1-2d使板充分干燥。用ELISPOT斑点分析仪对每孔斑点计数。计数时只计数边缘颜色浅中心颜色深的斑点。一个斑点代表一个斑点形成细胞(Spots Forming Cells，SFC)。斑点数表示为SFCs/1×10⁴PBMC。减去阴性对照孔斑点数后，表位肽刺激孔斑点数≥1SFCs/1×10⁴PBMC时，结果判读为阳性。

结果如图4、图5所示，DENV-1特异性HLA-A2限制性表位肽NS4a_140、肽NS2a_144、肽NS5_134和肽NS4b_40可在体外诱导高水平的CTL反应。

实施例6、CTL杀伤实验

用负载相同表位肽的T2细胞【制备方法如实施例1，用各肽刺激即可(每孔加50μg肽、3μg的β2M)】做靶细胞，用LDH细胞毒检测试剂盒(Cayman公司，德国)检测肽特异性CTL杀伤靶细胞的活性，设RPMI 1640液孔(加无血清RPMI 1640液)，体积校正孔(加无血清RPMI 1640液)，实验孔(效/靶比分为：10∶1，5∶1，2∶1，靶细胞为1×10³)，靶细胞自发释放孔(1×10³靶细胞)，靶细胞最大释放孔(1×10³靶细胞)，效应细胞孔(效应细胞为1×10⁴或5×10³或2×10³)，每孔总体积为100μl。实验过程如下：

按上述将细胞或培养液加入96孔板中，37℃、5％CO₂孵箱中培养48h，结束前6h，体积校正孔和靶细胞最大释放孔加入0.8％的Tripton-100。培养结束后，吹打每孔1min，采用培养板水平离心机400g离心10min，吸取每孔上清50μl，转移到新的96孔板(每孔加入50μl新配置的检测试剂)，室温反应1h。测定每孔490nm的吸光度值(OD值)。计算每个效/靶比时杀伤百分比。

如图6所示，DENV-1特异性HLA-A2限制性表位肽NS4a_140、NS2a_144、NS5_134和NS4b_40体外诱导的CTL具有高水平的杀伤活性。

实施例7、药物组合物

配制药物组合物如下：人工合成上述表位肽，将表位肽同弗氏佐剂乳化，即作为候选疫苗。

将疫苗免疫HLA-A2转基因小鼠，采用ICS、ELISPOT、CTL杀伤实验等方法检测小鼠脾细胞中表位肽特异性CTL的水平以及表位肽特异性CTL对靶细胞的杀伤活性。结果发现，上述各表位肽具有良好的免疫原性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>温州医学院

<120>登革病毒特异性HLA-A2限制性表位肽及应用

<130>092548

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>登革病毒

<400>1

Ala Leu Leu Phe Met Ile Leu Thr Val

1               5

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>登革病毒

<400>2

Gln Leu Trp Ala Thr Leu Leu Ser Leu

1               5

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>登革病毒

<400>3

Leu Leu Met Arg Thr Thr Trp Ala Leu

1               5

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>登革病毒

<400>4

Thr Leu Tyr Ala Val Ala Thr Thr Ile

1               5

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>登革病毒

<400>5

Met Leu Leu Ala Leu Ile Ala Val Leu

1               5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>登革病毒

<400>6

Leu Val Met Ala Phe Ile Ala Phe Leu

1               5

<210>7

<211>9

<212>PRT

<213>登革病毒

<400>7

Leu Leu Ala Thr Ser Ile Phe Lys Leu

1               5

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>登革病毒

<400>8

Ala Met Ile Leu Ser Ile Val Ser Leu

1               5

Claims (7)

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述的多肽是如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的多肽。

3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种遗传工程化的细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求3所述的载体或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

5.权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于制备诱导发生细胞毒性T细胞反应的药物组合物；所述的细胞毒性T细胞是HLA-A2限制性的细胞毒性T细胞。

6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：

有效量的权利要求1所述的多肽；和

药学上可接受的载体。

7.一种药盒，其特征在于，所述的药盒中含有：权利要求1所述的多肽；或权利要求6所述的药物组合物。

Images