CN104853773A - 用于治疗和诊断急性心肌梗死的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

描述了用于治疗和诊断急性心肌梗死的组合物和方法。本发明还提供了处理个体以预防或抑制急性心肌梗死对心肌组织损伤的方法，包括在AMI之前向个体施用针对BMP-1-3的抗体、针对BMP-1-4的抗体或针对BMP-1-3的抗体和针对BMP-1-4的抗体的组合。

Description

用于治疗和诊断急性心肌梗死的方法和组合物

与相关申请的交叉参考

本申请要求于2012年4月25日提交的美国临时申请号61/638,373和于2012年4月25日提交的美国临时申请号61/638,424的优先权，所述美国临时申请的内容整体引入本文。

发明领域

本发明的领域是心脏病。具体地，本发明提供了用于治疗和诊断急性心肌梗死的方法和组合物，其包含针对一种或多种BMP-1同种型的一种或多种抗体。

发明背景

急性心肌梗死（“AMI”）是发达国家主要的死亡原因，并且占全世界13%的死亡。AMI也被称为“心脏病发作”，是当冠状动脉或血管变得阻塞导致对心肌组织的血液供应丧失时发生的一类心脏病。不再接收到足够血液（灌注不足）的心肌组织快速死亡，并且被弱功能或无功能的纤维瘢痕组织替换，所述纤维瘢痕组织可以扩张，导致增加的功能心肌组织丧失，这依次又可以导致心脏功能失调。在美国每年有超过50万人经历第一次AMI，并且超过20万患有心肌梗死的人在到达医院前死亡。

心脏的细胞成分和非细胞组分中错综复杂的关系，驱动适当的心脏发育、稳态和病理损伤（例如AMI）后的恢复。心肌细胞，成纤维细胞和内皮细胞差异表达并且响应特定的细胞外基质因子，所述细胞外基质因子促进细胞通讯和总体心脏功能。细胞外基质（“ECM”）促进在稳态和发育过程期间的机械、电和化学信号。这些信号调节细胞活动，例如细胞增殖、迁移、粘附和基因表达变化。在多种生理学心脏状态期间，发生不同的细胞和ECM表达变化。参见 Bowers等人，J. 　 Molec. 　 Cell. 　 Cardiol.，48: 474-482（2010）。例如，在心肌梗死期间，心肌细胞经历细胞凋亡，成纤维细胞经历密集增殖，血管密度减少，而 I型胶原、Ⅲ型胶原、IV型胶原、纤连蛋白和骨膜素表达增加导致纤维化增强和心脏功能减弱。这些过程对左心室功能具有不利作用，因此构成使用抗纤维化剂抑制或逆转这种不利影响的治疗基础。参见例如Sun等人，Cardiovasc. 　 Res.，46: 250-256（2000）；Jugdutt，Circulation，108: 1395-1403（2003）；Lopez等人，Am. 　 J. 　 Physiol. 　 Heart. 　 Circ. 　 Physiol.，299: H1-H9（2010）等。

如果在冠状血管阻塞后快速应用，则对AMI的治疗通常是有效的。积极的溶栓疗法包括溶解血栓（血块）的药物或初期血管成形术和支架。慢性、心梗后治疗包括血管紧张素转换酶（“ACE”）抑制剂、β阻滞剂、利尿剂和钙通道拮抗剂，其可以降低主动脉压，从而减少左心室（LV）的心室重构，所述心室重构可以以其它方式扩张梗死面积，导致更多的无功能瘢痕组织。心内直视手术方法包括修复或替换阻塞的冠状血管的冠状动脉搭桥手术，以及使心脏组织的无功能梗死区修复、萎缩或移除的方法。

骨形态发生蛋白-1（“BMP-1”，“BMP1”）最初分离自高度纯化的BMP牛骨提取物，并且最初报告在皮下（异位）骨形成测定中在体内诱导软骨形成（（Wozney等人，Science，242: 1528-1534（1988））。然而，BMP-1（SEQ ID NO:1）不与其他BMP共享显著的氨基酸序列同源性，BMP-1也不显示出其他BMP中发现的特征性信号肽、前结构域、羧基末端（成熟结构域）或半胱氨酸结，所述其他BMP是生长因子的TGFβ超家族成员。TGF-β家族内的BMP-1的错误状态起因于骨生成的原始生物测定中的瑕疵（Wozney等人，（1988）），其中在生物测定中观察到的软骨看起来是污染不溶性骨基质的以前的生长板软骨，其被错误鉴定为新近形成的组织（参见Reddi，Science，271: 463（1996））。如以后显示的，BMP-1在标准的异位骨形成测定中不能诱导软骨或骨形成。参见例如，国际专利公开号WO 2008/011193 A2。

事实上，BMP-1显示与前胶原C蛋白酶相同，所述前胶原C蛋白酶是锌金属蛋白酶，切割前胶原I、II和III的羧基前结构域，以产生主要纤维状胶原I、II和III的成熟单体（Kessler等人，Science，271: 360-362（1996）；Li等人，Proc. 　 Natl. 　 Acad. 　 Sci. 　 USA，93: 5127-5130（1996））；对于细胞外基质（ECM）中的不溶性胶原的适当装配以及如发现与多种器官疾病相关的纤维瘢痕组织形成必需的步骤（Turtle等人，Expert 　 Opin. 　 Ther. 　 Patents，14（8）: 1185-1197（2004））。除其在切割前胶原中的作用之外，BMP-1还切割其他ECM大分子，包括前赖氨酰氧化酶（prolysyl oxidase）（Panchenko等人，J. 　 Biol. 　 Chem.，271: 7113-7119（1996））、前双糖链蛋白聚糖（probiglycan）（Scott等人，J. 　 Biol. 　 Chem.，275: 30504-30511（2000））和前层粘连蛋白-5（Amano等人，J. 　 Biol. 　 Chem.，275: 22728-22735（2000））。BMP-1还使IGF1与其结合蛋白和其他生长因子从其潜在复合物中释放（Muir和Greenspan，J. 　 Biol. 　 Chem.，286（49）: 41905-41911（2011））。BMP-1蛋白质结构域结构包含N末端前结构域，随后为涉及众多蛋白质-蛋白质相互作用的保守蛋白酶结构域（Bork等人，J. 　 Mol. 　 Biol.，231: 539-545（1993））。蛋白酶结构域的C末端是CUB和EGF结构域。最N末端的BMP-1 CUB结构域（“CUB1”）可以切割脊索素（chordin），所述脊索素是保护BMP-2和BMP-4免于活化的BMP拮抗剂（Petropoulou等人，J. 　 Biol. 　 Chem.，280: 22616-22623（2005）），而EGF结构域结合钙离子（Ca²⁺），并且可以对BMP-1同种型的一部分赋予结构刚性（Werner等人J. 　 Mol. 　 Biol.，296: 1065-1078（2000））。

BMP1基因与果蝇（Drosophila）基因tolloid（“TLD”）相关，由于其活化TGF-β样形态发生素（morphogen）的能力，所述tolloid牵涉受decapentaplegic（“DPP”）基因控制的图式形成。BMP-1蛋白目前已知为在图式形成级联期间必需的形态发生控制点之一（Ge和Greenspan，Birth Defect Res.，78: 47-68（2006））。BMP1基因无效的小鼠是围产期致死的，伴随腹侧体壁关闭的失败和持续性肠疝形成，可能是由于缺陷的ECM和背腹图式形成的有限破坏（Suzuki等人，Development，122: 3587-3595（1996））。与pCP活性丧失一致的是，BMP1无效小鼠具有异常胶原纤维。

BMP-1是在广泛范围的物种中发现的金属蛋白酶的小亚组的原型。在哺乳动物中，存在四种BMP-1/TLD相关（或“BMP-1/TLD样”）金属蛋白酶。编码BMP-1的基因还编码第二种更长的蛋白酶，其通过可变剪接的mRNA编码。具有与TLD基本上相同的结构域结构，该蛋白酶指定为哺乳动物Tolloid（“mTLD”）（Takahara等人，J. 　 Biol. 　 Chem.，269: 32572-32578（1994））。此外，还存在两种遗传上不同的哺乳动物BMP-1/TLD相关蛋白酶，指定为哺乳动物Tolloid样1和Tolloid样2（“mTLL1”和“mTLL2”）。BMP-1/TLD样蛋白酶的前结构域必须通过枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶（SPC）蛋白酶解去除（Leighton和Kadler，J. 　 Biol. 　 Chem.，278: 18478-18484（2003）），以实现这些蛋白酶的完全活性。BMP-1/TLD样蛋白酶的前结构域的作用看起来是使BMP-1/TLD样蛋白酶维持在潜伏形式（Marques等人，Cell ， 91: 417-426（1997）；Sieron等人，Biochemistry，39: 3231-3239（2000）；Leighton和Kadler（2003））。

BMP-1/TLD相关金属蛋白酶负责与细胞外基质（ECM）形成相关的许多细胞外蛋白的蛋白酶解成熟。这些包括多种胶原、小的富含亮氨酸的蛋白聚糖、SIBLING蛋白、赖氨酰氧化酶、层粘连蛋白-5和来自蛋白聚糖基底膜蛋白聚糖串珠素（perlecan）的抗血管生成因子（Iozzo，Nat. 　 Rev. 　 Mol. 　 Cell. 　 Biol.，6: 646-656（2005）；Greenspan，Top. 　 Curr. 　 Chem.，247: 149-183（2005）；Ge和Greenspan（2006））。BMP-1还涉及使真正的BMP从ECM中释放，或涉及活化潜伏的TGF-β家族成员例如BMP-4、BMP-11和GDF-8（Wolfman等人，Proc. 　 Natl. 　 Acad. 　 Sci. 　 USA，100: 15842-15846（2003）；Ge等人，Mol. 　 Cell. 　 Biol.，25: 5846-5858（2005））。

最初发现的BMP-1形式指定为“BMP-1-1”（或“BMP1-1”；SEQ ID NO:1），以及由剪接变体RNA转录物编码的其他BMP-1同种型已在转录水平上得到描述，并且指定序贯后缀：BMP-1-2、BMP-1-3、BMP-1-4、BMP-1-5、BMP-1-6和BMP-1-7。参见例如，Kessler等人（1996）；Li等人（1996）；Wozney等人（1988）；Janitz等人，J. 　 Mol. 　 Med.，76: 141-146（1998）；Takahara等人（1994）；Hillman等人，Genome 　 Biol. ， 5 （ 2 ）: R8.1-R8.16（2004）；以及Ge和Greenspan，Birth 　 Defect 　 Res.，78: 47-68（2006）。如预期的，由剪接变体转录物编码的BMP-1同种型共享许多结构域，包括引导肽、前区和蛋白酶（催化）区。以前，仅原始BMP-1，即BMP-1-1，在蛋白质水平上得到确认，而BMP-1-2和其他BMP-1同种型的序列由剪接变体转录物的核苷酸序列推导得出，但在蛋白质水平上未得到描述。最近，许多BMP-1同种型已在蛋白质水平上确定为在具有多种疾病（例如慢性肾病和急性胰腺炎）的患者的血液以及健康人个体的血液（其仅含有BMP-1-3）中循环。参见例如国际专利公开号WO 2008/011193 A2；Grgurevic等人，J. 　 Am. 　 Soc. 　 Nephrol.，21: 681-692（2011）。此外，BMP-1在导致多种疾病中的纤维化和瘢痕组织的前胶原加工中的作用，以及在多种疾病的患者中包含个别BMP-1同种型的血液概况的发现，已使得BMP-1成为有吸引力的开发新疗法的靶。参见例如，WO 2008/011193 A2，Turtle等人（2004）和Grgurevic等人（2011）。

尽管多种药物和操作的可用性，但每年仍有数十万人死于急性心肌梗死。明确的是，仍存在用于治疗和预防急性心肌梗死的新组合物和方法的需要。

发明概述

本发明提供了基于以下发现用于急性心肌梗死（AMI，心脏病发作）诊断和治疗的新方法和组合物：人心脏组织含有BMP-1-4；发现BMP-1-4在具有持续AMI的人对象的血液中循环，但在健康个体中未发现；并且BMP-1-3和BMP-1-4是用于治疗AMI的治疗靶。因此，目前能够通过检测来自人患者的血液样品中的BMP-1-4存在来诊断AMI。此外，如本文所示，施用针对BMP-1-3的抗体和/或针对BMP-1-4的抗体有效减少心肌组织损伤程度，并且甚至有效促进具有持续AMI的个体的心脏梗死区中的功能心肌组织再生。

在本文描述的方法和组合物中，BMP-1-3蛋白质是具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的BMP-1同种型，并且BMP-1-4蛋白质是具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的BMP-1同种型。

在本发明的一个实施方案中，提供了用于治疗人对象中的急性心肌梗死（AMI）的方法，其包括给对象施用针对BMP-1-3的抗体、或针对BMP-1-4的抗体、或针对BMP-1-3的抗体和针对BMP-1-4的抗体的组合。优选地，抗体是中和抗体。

本发明还提供了治疗个体以预防或抑制由于急性心肌梗死对心肌组织的损伤的方法，其包括在AMI之前给个体施用针对BMP-1-3的抗体、或针对BMP-1-4的抗体、或针对BMP-1-3的抗体和针对BMP-1-4的抗体的组合。

在另一个实施方案中，本发明提供了诊断人个体中的急性心肌梗死的方法，其包括在个体的血液样品中检测具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的BMP-1-4的存在，或检测BMP-1-4氨基酸序列的表位或可检测片段（例如胰蛋白酶片段）。

本发明用于急性心肌梗死的诊断方法有利地使用能够结合BMP-1-4的检测物结合分子进行，BMP-1-4在得自个体的血液样品中的存在指示个体具有持续性急性心肌梗死。合适的BMP-1-4检测物结合分子包括结合BMP-1-4的抗体分子（包括多克隆抗体和单克隆抗体、基因工程抗体分子和抗体的结合片段，例如Fab片段、F（ab'）₂片段等等）和结合BMP-1-4的适体（对于特定蛋白质具有特异性结合亲和力的核酸分子）。针对BMP-1-4的抗体或其他BMP-1-4检测物结合分子还可以与提供可检测信号的可检测标记分子结合（共价或非共价地），所述可检测信号允许鉴定通过抗BMP-1-4抗体（或其他BMP-1-4检测物结合分子）和靶BMP-1-4形成的复合物用于诊断AMI。

本发明的进一步实施方案是就急性心肌梗死诊断和治疗个体的方法，其包括：

（a）检测来自个体的血液样品中BMP-1-4的存在，其中样品中BMP-1-4的存在指示个体具有持续性急性心肌梗死；

和

（b）给步骤（a）中检测为具有持续性急性心肌梗死的个体施用针对BMP-1-3的抗体、针对BMP-1-4的抗体、或针对BMP-1-3的抗体和针对BMP-1-4的抗体的组合。

附图简述

图1显示了由BMP-1基因同种型（可变剪接产物）编码的全长（未加工的）BMP-1-1、BMP-1-3、BMP-1-4蛋白质的结构域图解，其中指示了共同和同种型特异性结构域。结构域未按比例绘出。每个同种型的编码序列内的相应剪接点的位置通过相应蛋白质结构域之间的缺口和桥指示。"引导区" = 信号肽序列。"前结构域" = N末端前肽结构域，其看起来使BMP-1金属蛋白酶维持潜伏形式，并且必须被切割以提供完全活跃的蛋白酶活性。"蛋白酶" = 共同的虾红素样催化结构域。"CUB" = BMP-1同种型的CUB结构域，其中每个CUB结构域通过数字依次区分。"EGF" = 钙结合的表皮生长因子（EGF）样结构域，其中每个EGF结构域通过数字依次区分。"ISD" = 同种型特异性结构域，其为对于每个BMP-1同种型特异性的C末端肽结构域。BMP-1-1同种型蛋白质的ISD是具有SEQ ID NO:1的氨基酸残基703-730的肽。BMP-1-3同种型蛋白质的ISD是具有SEQ ID NO:2的氨基酸残基977-986的肽。BMP-1-4同种型蛋白质的ISD是具有SEQ ID NO:3的氨基酸残基245-302的肽。

图2显示了在具有结扎诱导的急性心肌梗死（AMI）大鼠血液中的心肌带肌酸激酶蛋白质（creatine kinase myocardial band protein）（“CK-MB”）水平（单位/升，"U/L"）与诱导AMI的左冠状动脉手术结扎后的时间（“天”）相比较的图。实心菱形 = 用针对BMP-1-3的单克隆抗体（“BMP1-3 mAb”）处理的具有结扎诱导的AMI的大鼠血液中的CK-MB水平。空心正方形 = 未用BMP1-3 mAb疗法处理的具有结扎诱导的AMI的对照大鼠血液中的CK-MB水平（对照）。星号指示与对照大鼠中的那种相比较，用抗体处理的大鼠中的CK-MB水平中的统计学差异（*p<0.05）。关于细节参见实施例4。

图3显示了在具有结扎诱导的急性心肌梗死（AMI）大鼠血液中的心肌带肌酸激酶蛋白质（“CK-MB”）水平（单位/升，"U/L"）与诱导AMI的左冠状动脉手术结扎后的时间（“天”）相比较的图。实心菱形 = 用针对BMP-1-4的多克隆抗体（“BMP1-4 Ab”）处理的具有结扎诱导的AMI的大鼠血液中的CK-MB水平。空心正方形 = 未用BMP1-4 Ab疗法处理的具有结扎诱导的AMI的对照大鼠血液中的CK-MB水平（对照）。星号指示与对照大鼠中的那种相比较，用抗体处理的大鼠中的CK-MB水平中的统计学差异（*p<0.05）。关于细节参见实施例5。

图4显示了在具有结扎诱导的急性心肌梗死（AMI）大鼠血液中的肌钙蛋白t蛋白质水平（μg/L）与诱导AMI的左冠状动脉手术结扎后的时间（天）相比较的图。实心菱形 = 用针对BMP-1-3的单克隆抗体和针对BMP-1-4的单克隆抗体的组合（"BMP1-3 mAb + BMP1-4 mAb"）处理的具有结扎诱导的AMI的大鼠血液中的肌钙蛋白t水平。空心正方形 = 未用抗体处理的具有结扎诱导的AMI的对照大鼠血液中的肌钙蛋白t水平（对照）。星号指示与对照大鼠中的那种相比较，用抗体处理的大鼠中的肌钙蛋白t水平中的统计学差异（*p<0.05）。关于细节参见实施例6。

图5显示了对于用BMP-1-3 mAb处理的大鼠（“BMP1-3 mAb”）和未用抗体处理的具有AMI的对照大鼠（“对照”），在手术前（术前）、在诱导AMI的结扎手术后一周时（“1周”）、以及在诱导AMI的手术后一个月时（“1个月”），大鼠心脏的重构PET扫描图像。箭头指示对于用BMP1-3 mAb处理的大鼠，在手术后一周和一个月时的缺陷区域。在用BMP-1-3 mAb处理的动物中，在一个月后明确指示心脏的原始梗死区中的功能心肌组织的恢复，而在未经处理的对照动物的心脏中，在一个月后功能组织的丧失仍是显而易见的。关于细节参见实施例8。

图6显示了在冠状动脉结扎后使用或不使用BMP-1-3单克隆抗体疗法，来自大鼠中的心肌的组织学分析的显微照片。图6A 显示了在不存在抗体疗法的情况下，在诱导急性心肌梗死（AMI）的左冠状动脉结扎后一周时，来自大鼠心脏的梗死区的心脏切片（放大率4X）。图6A中的矩形在图6B放大。图6B显示了图6A中的矩形区域的组织的天狼猩红染色（以20X放大率），指示早期胶原沉积。参见图6B中的箭头。图6C显示了用苏木精和伊红染色的，来自具有AMI的未经处理的大鼠的心肌组织切片，揭示了在一个月后由损伤的心肌纤维围绕的残留纤维化瘢痕组织。参见图6C中的箭头。图6D显示了来自大鼠的心脏梗死区的心脏切片，所述大鼠在诱导AMI的左冠状动脉结扎之前用BMP-1-3 mAb（15 µg/kg）进行处理，并且随后在手术后的第一周期间每一天用BMP-1-3 mAb进行处理。在AMI后的纤维化区域明显小于在对照大鼠中观察到的那种。参见图6D中的箭头。图6E 显示了通过图6D中的箭头指示的区域的更高倍放大，揭示了新的再生肌纤维斑点。参见图6E中的箭头。图6F显示了通过图6D中的箭头指示的区域的更详细视图，揭示了新近形成的肌纤维以及纤维组织周围的细胞，其与对照大鼠中观察到的那种相比更不致密。关于细节参见实施例9。

发明详述

本文描述的本发明基于以下发现，BMP-1-3和BMP-1-4蛋白质均存在于具有持续性急性心肌梗死（“AMI”，“心脏病发作”）的成人个体的血液中，并且这两种BMP-1同种型也是用于治疗AMI的治疗靶。

为了使本发明可以被完全理解，定义了下述术语。

本文描述的全长（未加工的）BMP-1-1蛋白质的氨基酸序列具有下述氨基酸序列：

。

本文描述的全长（未加工的）BMP-1-3蛋白质的氨基酸序列具有下述氨基酸序列：

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本文描述的全长（未加工的）BMP-1-4蛋白质的氨基酸序列具有下述氨基酸序列：

。

除非另有说明，否则当术语“约”和“大约”与量、数字或值组合使用时，则该组合描述了单独的所述量、数字或值以及加上或减去该量、数字或值10%的量、数字或值。作为非限制性例子，短语“约40%”和“大约40%”公开了“40%”以及“从36%到44%，包括端值”。

如本文使用和理解的，“抗体”或“抗体分子”指的是特异性结合成员，其为无论是天然产生的，还是合成或半合成产生的蛋白质分子或其一部分，具有抗原结合结构域，并且结合特定靶分子（抗原），所述抗原结合结构域包含免疫球蛋白轻链可变区或结构域（V_L）或其一部分、免疫球蛋白重链可变区或结构域（V_H）或其一部分或其组合。术语“抗体”还涵盖具有抗原结合结构域的任何多肽或蛋白质分子，所述抗原结合结构域与免疫球蛋白的抗原结合结构域相同或同源。抗体可以是“多克隆”的，即，抗原结合分子的群体在多种不同的细胞中产生，并且因而与抗原上的不同位点结合，或是“单克隆”的，即，由单个细胞系产生的相同抗原结合分子的群体，其与抗原上的仅一个位点（即抗原的相同表位）结合。如本文使用和理解的，抗体分子的例子包括众所周知种类的免疫球蛋白（例如，IgG、IgM、IgA、IgE、IgD）种类及其同种型中的任一种；包含抗原结合结构域的免疫球蛋白片段，例如Fab或F（ab'）₂分子；单链抗体（scFv）分子；双重scFv分子；单结构域抗体（dAb）分子，其具有仅包含单个重链可变结构域的三个CDR的功能抗原结合结构域，其可以以1:1的比例与抗原结合而无需相应的轻链可变结构域（参见例如Ward等人，Nature，341: 544-546（1989）；国际公开号WO 90/05144；Hamers-Casterman等人，Nature，363: 446-448（1993），Muyldermans等人，Protein 　 Eng.，7: 1129-1135（1994））；FD分子（由与抗体重链恒定结构域CH1、CH2、CH3以及任选的CH4区连接的抗体VH区组成）；双体分子；以及包含此类分子的融合蛋白。双体通过两个双体单体的结合组成，其形成含有两个完整的抗原结合结构域的二聚体，其中每个结合结构域本身由来自两个单体各自的区域的分子间结合形成（参见例如Holliger等人，Proc. 　 Natl. 　 Acad. 　 Sci. 　 USA，90: 6444-6448（1993））。本文描述的组合物和方法中有用的针对BMP-1-3或BMP-1-4的抗体也可以是双特异性抗体，其包含特异性结合BMP-1-3的分子的抗原结合结构域和特异性结合BMP-1-4的分子的另一个抗原结合结构域。可以用于本文描述的组合物和方法中的针对BMP-1-3或BMP-1-4的抗体分子也可以是双重可变结构域（DVD）结合蛋白（参见例如，国际专利公开号WO 2007/024715），其包含特异性结合BMP-1-3的抗原结合结构域，或特异性结合BMP-1-4的抗原结合结构域，或者包含特异性结合BMP-1-3的分子的抗原结合结构域和特异性结合BMP-1-4的分子的另一个抗原结合结构域。上述的所有分子均为在本文描述的方法中有用的结合蛋白，因为它们包含关于BMP-1-3的功能结合结构域和/或关于BMP-1-4的功能结合结构域。与BMP-1-3或BMP-1-4结合的抗体可替代地在本文中分别被称为“BMP-1-3抗体”或“BMP-1-4抗体”，并且还分别被称为“抗BMP-1-3抗体”和“抗BMP-1-4抗体”。

“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体分子和抗体片段的抗体（例如，特异性结合特定BMP-1同种型例如BMP-1-3或BMP-1-4的分离的抗体，基本上不含特异性结合除特定BMP-1同种型外的抗原的抗体分子）。然而，特异性结合特定BMP-1-3的“分离的抗体”可以与其他抗原例如来自其他物种的BMP-1-3具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学制品。

术语“单克隆抗体”或“mAb”指的是得自基本上同质的抗体分子群体的抗体，即群体包含的个别抗体分子是相同的，除了可以以少量存在的天然存在的突变以外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与通常包括针对抗原的不同抗原决定簇（表位）的不同抗体分子的多克隆抗体制剂形成对比，每个mAb分子针对抗原的单一表位。修饰词“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法的抗体产生。

术语“人抗体”包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体可以包括例如在CDR且特别是CDR-H3中，不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，通过体外的随机或位点特异性诱变或者通过体内的体细胞突变而引入的突变）。然而，术语“人抗体”不包括其中衍生自另一个哺乳动物物种种系例如小鼠的CDR序列已移植到人构架序列上的抗体。

术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体，从重组的组合人抗体文库中分离的抗体（Hoogenboom，Trends 　 Biotechnol.，15: 62-70（1997）；Azzazy和Highsmith，Clin. 　 Biochem.，35: 425-445（2002）；Gavilondo和Larrick，BioTechniques，29: 128-145（2000）；Hoogenboom和Chames，Immunol. 　 Today，21: 371-378（2000）），从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物（例如小鼠）中分离的抗体（参见例如Taylor等人，Nucl. 　 Acids 　 Res.，20: 6287-6295（1992）；Kellermann和Green，Curr. 　 Opin. 　 Biotechnol. ，13: 593-597（2002）；Little等人，Immunol. 　 Today，21: 364-370（2000））；或者通过任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体，所述任何其他方法涉及人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的剪接。此类重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在某些实施方案中，然而，对此类重组人抗体实施体外诱变（或者，当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变），并且因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其虽然衍生自并涉及人种系VH和VL序列，但可能并非天然存在于体内人抗体种系储库内。

术语“嵌合抗体”指的是包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列以及来自另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重链和轻链可变区的抗体。

术语“CDR”指的是在抗体可变区内的互补决定区。在每个抗体可变区中存在三个CDR，并且指定为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”，其中通过如本文采用的常规约定，“CDR1”指的是在抗体可变区内的三个CDR中最N末端近端的，并且“CDR3”指的是在抗体可变区内的三个CDR中最C末端近端的。在抗体重链可变区（VH）内的CDR指定为“CDR-H1”、“CDR-H2”和“CDR-H3”，而抗体轻链可变区（VL）内的CDR指定为“CDR L1”、“CDR-L2”和“CDR-L3”。

如本文使用的术语“CDR组”指的是在单个可变区中存在的一组三个CDR，其能够结合抗原分子的特定表位。这些CDR的确切边界已根据不同的编号系统不同限定。由Kabat描述的系统（Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health，Bethesda，Maryland（1987）和（1991））；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242（1991））是最广泛使用的编号系统。Kabat编号系统提供了用于可变区内的残基的残基编号系统，并且提供了限定三个CDR的精确残基边界。后来设计了其他编号系统，但Kabat编号系统仍是用于指定抗体可变区内的残基位置，以及用于鉴定抗体可变区内的每个CDR的氨基酸序列的最广泛使用的编号系统。

在过去二十年间，可变重链和轻链区的氨基酸序列的广泛公共数据库的增长和分析，已导致对可变区序列内的框架区（FR）和CDR序列之间的典型边界的理解，并且使得本领域技术人员能够根据Kabat编号、Chothia编号或其他系统精确地确定CDR。参见例如，Martin，"Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," 第31章，于 Antibody Engineering,（Kontermann和Dübel，编辑）（Springer-Verlag，Berlin，2001），特别是第432-433页。下文提供了确定在可变重链（VH）和可变轻链（VL）区的氨基酸序列内的Kabat CDR的氨基酸序列的有用方法：

为了鉴定CDR-L1氨基酸序列：

从VL区的氨基端大约24个氨基酸开始；

在CDR-L1序列前的残基始终为半胱氨酸（C）；

在CDR-L1序列后的残基始终为色氨酸（W）残基，通常为Trp-Tyr-Gln（W-Y-Q），也可以是Trp-Leu-Gln（W-L-Q）、Trp-Phe-Gln（W-F-Q）和Trp-Tyr-Leu（W-Y-L）；

长度通常为10-17个氨基酸残基。

为了鉴定CDR-L2氨基酸序列：

始终在CDR-L1的末端后16个残基开始；

在CDR-L2序列前的残基一般为Ile-Tyr（I-Y），也可以是Val-Tyr（V-Y）、Ile-Lys（I-K）和Ile-Phe（I-F）；

长度始终为7个氨基酸残基。

为了鉴定CDR-L3氨基酸序列：

始终在CDR-L2的末端后33个残基开始；

在CDR-L3氨基酸序列前的残基始终为半胱氨酸（C）；

在CDR-L3序列后的残基始终为Phe-Gly-X-Gly（F-G-X-G）（SEQ ID NO:4），其中X 为任意氨基酸；

长度通常为7-11个氨基酸残基。

为了鉴定CDR-H1氨基酸序列：

从VH区的氨基末端大约31个氨基酸残基开始并且始终半胱氨酸（C）后的9个残基开始；

在CDR-H1序列前的残基始终为Cys-X-X-X-X-X-X-X-X（SEQ ID NO:5），其中X 为任意氨基酸；

在CDR-H1序列后的残基始终为Trp（W），通常为Trp-Val（W-V），也可以是Trp-Ile（W-I）和Trp-Ala（W-A）；

长度通常为5-7个氨基酸残基。

为了鉴定CDR-H2氨基酸序列：

始终在CDR-H1的末端后15个氨基酸开始；

在CDR-H2序列前的残基通常为Leu-Glu-Trp-Ile-Gly（L-E-W-I-G）（SEQ ID NO:6），但也存在其他变化；

在CDR-H2序列后的残基通常为Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala（K/R-L/I/V/F/T/A-T/S/I/A）；

长度通常为16-19个氨基酸残基。

为了鉴定CDR-H3氨基酸序列：

始终在CDR-H2的末端后33个氨基酸开始并且始终在半胱氨酸（C）后3个残基开始，；

在CDR-H3序列前的残基始终为 Cys-X-X（C-X-X），其中X 为任意氨基酸，通常为Cys-Ala-Arg（C-A-R）；

在CDR-H3序列后的残基始终为Trp-Gly-X-Gly（W-G-X-G）（SEQ ID NO:7），其中X 为任意氨基酸；

长度通常为3-25个氨基酸残基。

术语“CDR移植抗体”指的是这样的抗体分子，其包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列，但其中VH和/或VL区中的一个或多个CDR区的序列替换为另一个物种的CDR序列，例如具有人重链和轻链可变区的抗体，其中一个或多个人CDR（例如，CDR3）已替换为鼠CDR序列。将一个物种的抗体的CDR移植到另一个物种的抗体的可变结构域内的方法是本领域众所周知的。参见例如，Jones等人，Nature，321: 522-525（1986）；Riechmann等人，Nature，332: 323-327（1988）；Verhoeyen等人，Science，239: 1534-1536（1988）；和Queen等人，Proc. 　 Natl. 　 Acad. 　 Sci. 　 USA，86: 10029-10033（1989）。

“循环”和“循环的”描述了通过个体的脉管系统行进或以其他方式转运的任何事物。

术语“病症”和“疾病”是同义词，并且指的是任何病理状况，与原因或病原剂无关。组织中的“缺陷”指的是异常或缺陷组织生长的部位。“疾病”或“病症”的特征可在于一种或多种组织中的一种或多种“缺陷”。本发明的目的疾病（或病症）是急性心肌梗死（“AMI”，“心脏病发作”）。

如本文使用的，术语“疗法”和“治疗”指的是减轻疾病或病症的一种或多种症状或表现的任何方案，其抑制疾病或病症的进程，停滞疾病或病症的进展或者逆转疾病或病症的进展（引起消退），或预防疾病或病症的发作。术语“疗法”包括预防（防止）疾病的一种或多种症状或表现，包括改善或抑制症状或表现的程度，在不存在治疗的情况下，所述症状或表现将以其他方式表征疾病。

“治疗有效量”是这样的化合物（例如针对BMP-1-3的抗体、针对BMP-1-4的抗体或其组合）量，其完全或部分抑制疾病的进展；至少部分减轻疾病的一种或多种症状；或增强或促进用于治疗疾病的另一种化合物的治疗效应或在其他方面有利的效应。治疗有效量也可以是预防有效的量。治疗有效的量将取决于患者的尺寸和性别、待治疗的疾病、疾病的严重性和寻求的结果。对于给定人个体，治疗有效量可以通过本领域技术人员已知的方法进行确定。

当用于描述本文公开的多种蛋白质或多肽时，术语“分离的”意指蛋白质或多肽已得到鉴定，并且与其天然环境的组分分离和/或回收。它的天然环境的污染物组分是通常干扰该多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质种类。分离的蛋白质或多肽包括在经改造为表达其的重组细胞内原位的蛋白质或多肽，因为该蛋白质或多肽的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的蛋白质或多肽将通过至少一个纯化步骤进行制备。

本文描述为“包含”一个或多个指定的元件或步骤的组合物或方法是开放式的，意指该指定的元件或步骤是必需的，但其他元件或步骤可以加入该组合物或方法的范围内。为了避免冗长，还应理解本文描述为“包含”（或“其包含”）一个或多个指定的元件或步骤的任何组合物或方法还描述了相应的更受限制的 “基本上由相同的指定的元件或步骤组成”（或“其基本上由相同的指定的元件或步骤组成”）的组合物或方法，意指该组合物或方法包括指定的必需元件或步骤，并且还可以包括实质上不影响该组合物或方法的基本和新型特征的另外元件或步骤。还应理解本文描述为“包含”一个或多个指定的元件或步骤或者“基本上由一个或多个指定的元件或步骤组成”的任何组合物或方法还描述了相应的更受限制并封闭式的“由指定的元件或步骤组成”（或“其由一个或多个指定的元件或步骤组成”）的组合物或方法，以排除任何其他未指定的元件或步骤。在本文公开的任何组合物或方法中，任何指定的必需元件或步骤的已知或公开等价物可以取代该元件或步骤。

除非另有说明，否则其他术语的含义与本领域技术人员理解和使用的相同，所述领域包括医学、免疫学、生物化学、分子生物学和组织再生领域。

本发明基于以下发现：BMP-1-4存在于具有持续性急性心肌梗死（AMI）的人个体的血液中，但不存在于健康个体的血液中。存在于健康个体的血液循环中的BMP-1-3同种型蛋白质，还存在于具有持续性AMI的个体的血液中。因此，BMP-1-4可用作新的AMI的血液生物学标记（生物标记）。

如先前显示的，通过分析血液中对于特定BMP-1同种型独特的一种或多种肽（例如，胰蛋白酶肽）的存在，可以检测血液样品中的BMP-1同种型蛋白质。参见例如，WO 2008/011193；Grgurevic等人（2011）。如下文实施例1中所示，这类肽分析首次证实在人中在蛋白质水平上BMP-1-4同种型蛋白质的存在。此外，BMP-1-4蛋白质在具有持续性急性心肌梗死的患者的血液中，而不是健康志愿者的血液中检测到。使用针对BMP-1-4和BMP1-3的抗体，BMP-1-4和BMP1-3定位于发育中的人胚胎的心脏以及具有持续性AMI的人个体的心脏切片中（数据未显示）。因此，BMP-1-4通常在正常心脏组织中表达，但出现在具有持续性AMI的个体的血液中。BMP-1-4在具有持续性AMI的人个体的血液中的出现还与血浆肌钙蛋白t（“Tn-T”）的出现和心肌带肌酸激酶（CK-MB）水平上升关联。因此，BMP-1-4可用作AMI的血液生物标记。

本文描述的BMP-1-4出现在具有持续性AMI的个体的血液中并且BMP-1-4定位于健康心脏组织中的发现，以及指示BMP-1-1和BMP-1-3促进其他器官中的纤维化和瘢痕组织的先前发现（参见例如，Turtle等人（2004），WO 2008/011193，Grgurevic等人（2011）），导致本发明人研究BMP-1-3和BMP-1-4中的任一或两者是否能够用作治疗AMI的治疗靶。使用在下文实施例中所述的AMI标准大鼠模型的研究结果明确显示，BMP-1-3和BMP-1-4均为用于治疗AMI的治疗靶。例如，与具有AMI的未经处理的对照大鼠中的那种相比较，对具有AMI的大鼠施用针对BMP-1-3的单克隆抗体（“BMP-1-3 mAb”）导致显著更低的生物标记CK-MB血浆水平上升。参见实施例4和图2。与具有AMI的未经处理的对照大鼠中的那种相比较，对具有AMI的大鼠施用针对BMP-1-4的抗体还导致显著更低的CK-MB血浆水平上升。参见实施例5和图3。与未经处理的对照大鼠中相比较，对具有AMI的大鼠施用BMP-1-3 mAb和BMP-1-4 mAb的组合还导致显著更低水平的肌钙蛋白t（“Tn-T”）血浆水平。参见实施例6和图4。

此外，对具有AMI的大鼠施用BMP-1-3 mAb的治疗效果还通过心脏尺寸和功能的超声心动图评价指示，与未经处理的对照大鼠中的那些相比较，所述超声心动图评价揭示显著更高的舒张期（IVSd）和收缩期（IVSs）室间隔尺寸、显著更低的左心室收缩期内径（LVIDs）、显著更低的左心室收缩期后壁厚度（LVPWs）、显著更高的射血分数（EF）和显著更高的缩短分数（ES）。事实上，抗体处理的大鼠的心脏尺寸和功能类似于无AMI的假手术大鼠的那些。参见实施例7和表1。

还显示用BMP-1-3 mAb治疗促进在AMI后在心脏梗死区中更高质量的瘢痕组织和功能心肌组织。如实施例8中所述，使用正电子发射断层扫描术（PET），通过经过一个月过程监控心脏梗死区，极大地显示了抗体治疗的这种疗效。如图5中所示，在AMI的手术诱导前（“术前”）、在手术后一周时（“1周”）和在手术后一个月时（“1个月”），具有AMI的大鼠的心脏进行PET扫描。用BMP-1-3 mAb处理的大鼠心脏和未经处理的对照大鼠的PET扫描图像明确显示：在手术后一周时，在梗死区中的无功能组织，尽管未经处理的对照大鼠的梗死区看起来比处理大鼠的那种更显著。参见图5中在“1周”时的心脏图像。然而，在AMI的手术诱导后一个月，PET扫描图像揭示在处理和未经处理的动物的原始心脏梗死区中生成的组织质量的巨大差异。特别地，接受BMP-1-3 mAb治疗的大鼠心脏的PET扫描图像显示在梗死区中的功能心肌组织的大量恢复，而在未经处理的对照大鼠的梗死区中的无功能组织明确保留，并且甚至比在一周时更显著。参见图5中在“1月”时的心脏图像。结果显示，与未经处理的对照大鼠的心脏中生成的修复组织相比较，接受抗体疗法的大鼠心脏中的修复组织明确具有更高质量和更多功能。

如下文实施例9中所述，来自具有AMI的未经处理的对照大鼠的心脏和来自用BMP-1-3 mAb处理的具有AMI的大鼠的心肌组织的组织学分析，还显示用BMP-1-3抗体处理的有利效应。特别地，在诱导AMI的左冠状动脉手术结扎后一周时，来自未经处理的对照大鼠的心肌组织的天狼猩红染色揭示早期胶原沉积（参见图6B）。在手术后一个月时，来自未经处理的对照大鼠的心肌组织的天狼猩红染色揭示由损坏的心肌纤维明确围绕的残留纤维化瘢痕组织（参见图6C）。相比之下，与未经处理的对照大鼠的那种相比较，在AMI后一周时的纤维化面积在用BMP-1-3 mAb处理的大鼠的心肌组织中明显更小（参见图6D）。图6D所示的组织的更高倍放大揭示新近形成的肌纤维斑点（参见图6E）和周围的细胞以及比未经处理的对照大鼠中观察到的那种明显更不致密的纤维组织（参见图6F）。

本领域已知的多种方法中的任一种可以用于产生多克隆或单克隆抗体分子，其特异性结合特定目的BMP-1同种型（例如BMP-1-3或BMP-1-4），或包含特定BMP-1同种型的至少一种表位（即，特异性抗原结合位点）的特定目的BMP-1同种型的一部分。

多克隆抗体可以使用本领域已知的标准方法来生产，其中在通过动物引起免疫应答的条件下，将抗原（例如，BMP-1-3、BMP-1-4或者包含BMP-1-3或BMP-1-4的表位的肽）施用于动物，导致产生针对该抗原的抗体。通常，此类多克隆抗体在动物的血液中产生，并且可以在血液的血清部分（抗血清）中分离。进一步纯化可以提供增强纯度的多克隆抗体制剂或从抗血清中分离特定种类的抗体。

用于本文描述的组合物和方法中的优选抗体分子是针对BMP-1-3和BMP-1-4的单克隆抗体（mAb）。单克隆抗体可以使用本领域可获得的标准杂交瘤技术进行制备。这种技术在本领域的标准实验室手册中描述。参见例如，Harlowe等人，Antibodies: A Laboratory Manual ，第二版（Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988）；Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas（Elsevier，New York，1981）；通过引用并入本文。使用本领域可获得的多种其他方法中的任一种，可以生成针对BMP-1-3和BMP-1-4的抗体。例如，使用选择性淋巴细胞抗体法（SLAM），可以由单一的分离淋巴细胞生成针对BMP-1-3和BMP-1-4的抗体。参见例如，美国专利号5,627,052；国际公开号WO 92/02551；Babcook等人，Proc. 　 Natl. 　 Acad. 　 Sci. 　 USA，93: 7843-7848（1996）；通过引用并入本文。还可以使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或一部分的转基因动物，制备针对BMP-1-3和BMP-1-4的抗体，当该转基因动物用BMP-1-3或BMP-1-4蛋白质或其肽片段免疫接种时，所述人免疫球蛋白基因座将产生人抗体。参见例如，Green等人，Nature 　 Genetics，7:13-21（1994）；美国专利号5,916,771；国际专利公开号WO 91/10741；通过引用并入本文。用于产生可用于本文描述的组合物和方法中的BMP-1-3和BMP-1-4抗体的其他方法包括但不限于，噬菌体展示法（例如，通过引用并入本文的Brinkmann等人，J. 　 Immunol. 　 Methods，182: 41-50（1995）；Ames等人，J. 　 Immunol. 　 Methods，184: 177-186（1995），Kettleborough等人，Eur. 　 J. 　 Immunol.，24:952-958（1994））），酵母展示法（参见例如，通过引用并入本文的美国专利号6,699,658），和作为RNA-蛋白质融合物的抗体文库表达（参见例如，通过引用并入本文的国际专利公开号WO 98/31700）。

优选地，使用具有R-Y-T-S-T-K-F-Q-D-T-L-H-S-R-K的氨基酸序列（SEQ ID NO:2的氨基酸残基972-986）的肽抗原，产生BMP-1-3 mAb。特别优选的BMP-1-3 mAb称为____，通过杂交瘤细胞系产生，所述杂交瘤细胞系通过ProMab（Richmond，California，美国）订购制备，并且根据布达佩斯条约在2013年4月24日保藏于德国微生物菌种保藏中心（Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Zellkulturen GmbH）（“DSMZ”）（登记号______）。

优选地，使用具有C-G-S-R-N-G-A-S-F-P-S-S-L-E-S-S-T-H-Q-A的氨基酸序列（SEQ ID NO:8）的肽免疫原，产生BMP-1-4 mAb。BMP-1-4 mAb，称为_____，已通过ProMab（Richmond, California, USA）订购生产。

产生单克隆抗体（“mAb”）的啮齿类动物杂交瘤细胞是编码mAb分子的恒定区和可变区的现成DNA来源。尤其有用的是编码BMP-1-3 mAb或BMP-1-4 mAb的个别互补决定区（“CDR”）和框架区（“FR”）的DNA的分离和序列测定。编码啮齿类动物BMP-1-3 mAb或BMP-1-4 mAb的个别CDR、FR和/或其一部分的分离或合成的DNA，可以容易地用于生产结合BMP-1-3或BMP-1-4的多种其他重组抗体分子的标准方法中。此类重组抗体分子包括但不限于，CDR移植抗体分子；嵌合抗体，人源化抗体；亲和成熟的人源化抗体；单链抗体（“scFv”）分子；双重scFv分子；双体分子；结合BMP-1-3或BMP-1-4中的任一或两者的双特异性抗体；以及结合BMP-1-3和BMP-1-4中的任一或两者的双重可变结构域免疫球蛋白结合蛋白。特别优选的重组抗体是人源化抗体，其结合与原始啮齿类动物mAb相同的抗原（BMP-1-3或BMP-1-4），但当注射到人内时，具有很少的免疫原性。参见例如 美国专利号5,693,762；Queen等人（1989）；欧洲专利号0 239 400 B1。

优选地，在用于治疗急性心肌梗死的本发明的方法和组合物中使用的针对BMP-1-3和BMP-1-4的抗体是中和抗体，如通过下述证实的：该抗体在体外抑制BMP-1-3或BMP-1-4介导的前胶原切割的能力（参见例如，Kessler等人（1996）；Li等人（1996）；Garrigue-Antar等人，J. 　 Biol. 　 Chem.，276（28）: 26237-26242（2001）；Hartigan等人，J. 　 Biol. 　 Chem.，278（20）:18045-18049（2003））；该抗体在体外抑制BMP-1-3或BMP-1-4介导的牙本质基质蛋白1（DMP-1）切割的能力（参见例如，Qin等人，J. 　 Biol. 　 Chem.，278（36）: 34700-34708（2003）；Steiglitz等人，J. 　 Biol. 　 Chem.，279（2）: 980-986（2004））；或该抗体在急性心肌梗死的大鼠模型中抑制对心肌组织的损伤程度的能力（参见在 Zornoff等人，Arq. 　 Bras. 　 Cardiol.，93（3）: 403-408（2009）中的大鼠模型综述）。

根据本发明用于治疗个体急性心肌梗死（AMI）的方法包含给个体施用针对BMP-1-3的抗体、针对BMP-1-4的抗体、或针对BMP-1-3的抗体和针对BMP-1-4的抗体的组合的步骤。优选地，用于治疗人个体AMI的抗体分子具有这样的区域和结构域，其为人抗体的那些或基本上是人抗体的那些，以便减少在施用该抗体以治疗AMI的个体中引发免疫应答的可能性。因此，用于治疗AMI的 针对BMP-1-3和BMP-1-4的抗体优选是全人抗体或人源化抗体。更不优选地，该抗体是嵌合抗体。更不优选地，该抗体是缺乏衍生自人抗体的任何结构域或区域的非人抗体。

对于在根据本发明治疗人个体中的急性心肌梗死（AMI）中的使用，使用本领域众所周知的用于制备用于将治疗抗体施用于人个体的药物组合物的技术和成分，制备包含针对BMP-1-3的抗体分子或针对BMP-1-4的抗体分子或两种抗体分子的组合的组合物。包含针对BMP-1-3的抗体或针对BMP-1-4的抗体或两种抗体分子的组合的组合物可以配制用于通过多种施用途径或方式中的任一种施用。包含针对BMP-1-3的抗体或针对BMP-1-4的抗体或两种抗体分子的组合的组合物可以配制用于肠胃外或非肠胃外施用。优选地，用于治疗AMI的包含针对BMP-1-3的抗体或针对BMP-1-4的抗体或两种抗体分子的组合的组合物配制用于肠胃外施用，例如但不限于静脉内、皮下、腹膜内或肌内施用。更优选地，组合物配制用于静脉内施用。此类肠胃外施用优选通过组合物的注射或输注进行。

用于施用于人个体的包含针对BMP-1-3的抗体或针对BMP-1-4的抗体或两种抗体分子的组合的组合物，可以包含与一种或多种药学可接受的组分例如药学可接受的载体（媒介物、缓冲液）、赋形剂或其他成分组合的有效量的任一或两种抗体分子。“药学可接受的”意指组合物中的化合物、组分或成分与人个体的生理学相容，并且还不损害BMP-1-3抗体或BMP-1-4抗体组分的有效活性，或者不损害待施用于人个体的组合物中可能存在的其他组分的所需特性或活性。药学可接受的载体的例子包括但不限于，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等及其组合。在许多情况下，优选包括等渗剂，包括但不限于糖；多元醇例如甘露醇或山梨醇；氯化钠；及其组合。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，以增强该组合物的贮存期限或有效性。赋形剂一般是对组合物提供所需特征的任何化合物或化合物的组合。组合物中的pH值可以根据需要进行调整，例如以促进或维持组分成分的可溶性，维持制剂中的一种或多种成分的稳定性，和/或制止操作中的一些点上潜在可能引入的不希望有的微生物生长。

包含BMP-1-3抗体或BMP-1-4抗体或两种抗体分子的组合的组合物，也可以包括一种或多种其他成分，例如其他药学试剂（例如，抗生素、抗炎化合物、抗病毒剂、抗癌剂）、填料、制剂佐剂及其组合。

根据本发明的组合物可以采取多种形式。这些包括但不限于，液体、半固体和固体剂型，分散体，悬浮液，片剂，丸剂，粉末，脂质体和栓剂。优选形式取决于预期施用途径。优选组合物采取注射剂或可输注溶液的形式，例如类似于施用已批准用于人中的治疗抗体使用的那些的组合物（例如，如用于治疗性TNF -α抗体分子阿达木单抗或英夫利昔单抗）。在优选实施方案中，BMP-1-3抗体或BMP-1-4抗体或两种抗体分子的组合通过静脉内注射或输注施用。在另一个实施方案中，抗体通过肌内或皮下注射施用。

治疗组合物在制造和贮存条件下必须是无菌和稳定的。该组合物可以配制成溶液、微乳液、分散体、脂质体或其他适合于高药物浓度的结构。无菌可注射溶液可以通过下述进行制备：将活性化合物（即针对BMP-1-3的抗体或针对BMP-1-4的抗体或两种抗体分子的组合）以所需量掺入适当溶剂中，任选连同对组合物提供有利特征的成分之一或组合，需要时，随后为过滤灭菌。一般地，分散体通过下述进行制备：将活性成分掺入无菌媒介物中，所述无菌媒介物含有基础分散介质（例如，无菌水、无菌等渗盐水等等），以及任选地可能是足够分散所需的一种或多种其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌冻干粉末的情况下，优选的制备方法包括真空干燥和喷雾干燥，这由其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。溶液的适当流动性可以通过下述得到维持：例如，使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下维持所需粒子大小，以及使用表面活性剂。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂（例如单硬脂酸盐和/或明胶）来实现可注射组合物的延长吸收。

针对BMP-1-3的抗体或针对BMP-1-4的抗体或两种抗体分子的组合可以通过本领域已知的多种方法施用，尽管优选施用途径或方式是肠胃外施用，并且更优选是静脉内施用。如技术人员应当理解的，施用途径或方式将根据所需结果而改变。在某些实施方案，抗体可以与保护化合物免于快速释放的载体一起进行制备，例如控制释放制剂，包括埋植剂、经皮贴剂和微胶囊化递送系统。可以使用生物可降解和生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的多种方法是本领域技术人员已知的。

结合BMP-1-3或BMP-1-4的抗体分子可以用于本领域可获得的多种基于抗体的免疫检测系统和形式中的任一种，用于在体外或体内检测所需抗原。此类系统和形式容易适用于检测或测量多种组合物中的任一种中的BMP-1-3或BMP-1-4，所述组合物包括但不限于，全血、血浆、血清、多种组织提取物和体液。适用于检测BMP-1-3或BMP-1-4的此类系统或形式的例子包括但不限于，免疫印迹（例如，蛋白质印迹、斑点印迹）、酶联免疫吸附测定（“ELISA”）、放射性免疫测定（“RIA”）、免疫沉淀、亲和方法、免疫芯片等等。

根据本发明，提供了用于在人个体中诊断急性心肌梗死（AMI）的方法，其包括测定个体血液中BMP-1-4的存在，其中在血液中检测到BMP-1-4指示该个体具有持续性AMI。在优选实施方案中，BMP-1-4抗体用于检测个体的血液中的BMP-1-4。例如，使用适当的成像系统和连接至适当可检测标记的BMP-1-4抗体，能够在体内检测在外周中循环的BMP-1-4的存在。然而，在用于诊断人个体中的AMI的方法的更优选实施方案中，从人个体中获得血液样品并且在体外测定BMP-1-4的存在。

在典型的免疫测定形式中，使从个体获得的血液样品与BMP-1-4抗体分子接触。随后使用本领域可获得的用于检测抗体-抗原结合复合物的多种检测系统中的任一种，来检测BMP-1-4抗体分子和血液样品中存在的BMP-1-4蛋白质之间的结合复合物形成。

用于检测或测量血液中存在的BMP-1-4量（即，数量）的BMP-1-4抗体可以在溶液中使用，或可替代地，可以固定在多种固体基底的任一种的表面上。BMP-1-4抗体可以固定于其上用于本文描述的方法和组合物中的固体基底包括但不限于，磁性基质颗粒；色谱基质或树脂颗粒（例如，琼脂糖）；塑料测定板（例如微孔测定板）的一个或多个孔的表面；固体基底材料小片，例如塑料、尼龙、木材、纸张或其他固体材料的小片或条，其可以浸入血液样品或测定溶液内或者以其他方式放置与血液样品或测定溶液接触；以及硅芯片（或其他芯片材料）的表面。将BMP-1-4抗体固定至微量滴定板的孔表面或芯片（例如，硅芯片、载玻片等）表面，允许用于检测或测量一个或多个血液样品中的BMP-1-4量的形式的使用，使用在标准高流通量ELISA或生物芯片测定程序中常规使用的半自动化或全自动化装置。此类装置可特别用于就BMP-1-4的存在测定大量极小体积的血液。

BMP-1-4抗体可以通过任何方法固定至固体基底的表面，所述方法保留该抗体在与含有BMP-1-4的血液样品接触时与BMP-1-4结合的能力，以形成结合复合物。例如，抗体可以通过吸附（非共价粘附）或者将抗体直接共价连接至固体表面或接头分子而固定至固体基底，所述接头分子允许使用本领域已知的方法将抗体栓系至固体基底。

检测包含BMP-1-4和BMP-1-4抗体的结合复合物的方法优选采用使用一种或多种信号生成分子（可检测标记）的检测系统，所述信号生成分子将生成易于通过人眼检测，或者容易通过信号检测仪器（例如，分光光度计）检测或测量的信号。可用于检测结合复合物的此类信号包括但不限于，例如如由可以直接或间接连接至BMP-1-4抗体的荧光染料或花青素分子生成的荧光信号；例如如由可以直接或间接连接至BMP-1-4抗体的酶或有色分子（例如，颜料）生成的可见颜色信号；例如如由可以直接或间接连接至BMP-1-4抗体的放射性同位素生成的放射性信号；以及例如如由化学发光或生物发光系统生成的光信号。生物发光系统的例子是萤光素-萤光素酶系统，其中萤光素酶可以直接或者间接连接至抗体，以在萤光素底物的存在下，生成可检测的光信号。

使用本领域可获得的标准试剂和方案，可检测标记可以直接或经由接头分子缀合至BMP-1-4抗体。可替代地，BMP-1-4抗体可以是未标记的，并且在不由第一种BMP-1-4抗体结合的表位处结合BMP-1-4抗体或结合抗原-抗体结合复合物中的BMP-1-4的第二种结合分子（例如，抗体），可以用于生成可检测信号。这种形式通过标准夹心免疫测定例示，其中“捕获抗体”（例如，BMP-1-4抗体）结合目的抗原（例如，BMP-1-4），以形成结合复合物，并且随后提供包含可检测标记的第二抗体（检测抗体），其结合捕获抗体或在不由捕获抗体结合的表位处与结合复合物中的目的抗原结合。应当理解如果第二抗体也是BMP-1-4抗体，则它必须与BMP-1-4上不由捕获抗体结合的表位和在捕获抗体与BMP-1-4之间形成的结合复合物上暴露（可接近）的表位两者结合。夹心免疫测定的其他变化是熟练从业者已知的，并且适用于本文描述的方法中。

在另一种测定形式中，血液样品中的BMP-1-4使用BMP-1-4抗体与之吸附或共价连接的测试条进行检测。此类测试条提供了检测或测量血液样品中的BMP-1-4的方便方法。例如，通过手动或自动将测试条浸入样品内或将血液样品滴在测试条上，可以使含有固定化BMP-1-4抗体的测试条与血液样品接触。优选地，首先将测试条浸入封闭剂例如牛血清白蛋白或其他组合物内，以减少通过潜在干扰分子的非特异性结合。需要时，该测试条可以进一步浸入任何试剂或与任何试剂接触，所述任何试剂是发展或生成可检测或可测量信号所需的，所述可检测或可测量信号指示在该条上包含与固定化BMP-1-4抗体结合的BMP-1-4的结合复合物的存在。该测试条随后目测观察，或通过适当的检测仪器读数，以确定样品中BMP 1-4的存在或量。

本文描述的用于检测来自个体的血液中的BMP-1-4的方法可以采用全血或全血的级分，例如血浆或血清。在任何特定测定形式中是使用全血、血浆或血清还是甚至一些其他血液级分的最终决定完全在本领域普通技术人员的理解和判断内。一般地，血浆是优选的。

使用用于从个体获得血液样品的标准方法和设备，包括但不限于，无菌针头、无菌注射器、无菌部分抽真空的血液样品管用于从人个体获得血液样品，是抽血者和医疗保健提供者众所周知的。

为了准确测量（定量）得自个体的血液样品中（以及，由此在个体的循环中）的BMP-1-4水平（量，浓度），可以使用如本文描述的测定图解表示或用计算机生成标准曲线。例如，本文描述的测定可以对一个或多个血液样品以及一系列溶液进行，所述一系列溶液含有已知浓度的BMP-1-4，或者含有BMP-1-4的一个或多个表位的肽或肽集合（BMP-1-4标准品）。对于每个BMP-1-4标准品获得的信号强度或量级随后用于构建标准曲线，所述标准曲线使信号强度或量级与BMP-1-4的量或浓度关联。随后可以在标准曲线上读出来自BMP-1-4含量未知的样品的信号强度或量级，以确定样品中存在的相应BMP-1-4水平（量，浓度）。优选地，BMP-1-4含量未知的样品中的BMP-1-4水平通过内插法进行确定，即，通过在至少两个BMP-1-4标准点之间生成或绘制的标准曲线区域上读出来自BMP-1-4含量未知的样品的信号量级或强度。较不优选地但任选地，可以通过外推法确定样品中的BMP-1-4量，其中信号的量级或强度落在超过或超出两个或更多个BMP-1-4标准点以外绘制或生成的标准曲线区域上。

本文描述的方法和组合物优选采用BMP-1-4抗体作为优选的BMP-1-4结合配偶体，以检测血液样品中的BMP-1-4的存在或定量血液样品中的BMP-1-4。然而，还应当理解如果该结合配偶体可以类似于用于或适用于该方法和组合物，则此类方法和组合物可以包括除BMP-1-4抗体分子外的BMP-1-4结合配偶体的使用，。

用于检测血液样品中的BMP-1-4所需的材料可以方便地装配成试剂盒，所述试剂盒允许医疗保健提供者确定个体是否具有持续性急性心肌梗死（AMI）。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含BMP-1-4抗体和说明书，所述说明书指示如何使用该试剂盒进行检测血液样品中的BMP-1-4的测定。在另一个实施方案中，试剂盒可以包含结合BMP-1-4抗体的第一抗体（捕获抗体）；第二抗体分子（检测抗体），其中所述第二抗体含有可检测标记，并且与捕获抗体结合或与不由捕获抗体结合的BMP-1-4表位结合；以及指示如何使用该试剂盒进行检测或定量血液样品中的BMP-1-4的测定的说明书。试剂盒中用作捕获抗体的BMP-1-4抗体可以用于溶液中，或可以固定在固体基底上，所述固体基底例如芯片、珠、测试条、微量滴定板孔的表面等等，其能够与血液样品接触。本文描述的试剂盒中的组分捕获抗体和检测抗体可以在多种状况的任一种中进行包装，所述状况例如干燥状态、非水合状态、冻干状态、脱水状态或在生理缓冲溶液中的水合状态。用于水合、洗涤、阻断非特异性结合、或来自检测抗体上的可检测标记的信号生成的溶液也可以包括在本文描述的试剂盒中。试剂盒还可以包括从个人体获得血液样品的一种或多种装置。这种装置包括但不限于无菌钉、无菌针、无菌针和注射器、以及无菌抽真空的血液样品管。

本发明的另外实施方案和特征根据下述非限制性实施例将是显而易见的。

实施例

实施例 1. 使用液相色谱 - 质谱法（“ LC-MS ”），通过肝素琼脂糖凝胶亲和色谱和蛋白质鉴定，从人血浆中鉴定 BMP-1-3 和 BMP-1-4 同种型，而不是真正的成骨 BMP 。

如先前所述进行关于BMP-1-3和BMP-1-4同种型的来自人对象的血液分析。参见Grgurevic等人（2011）；国际公开号WO2008/011193。

血浆收集

血液样品从健康成人志愿者和具有持续性急性心肌梗死（AMI）的患者中收集。将血液样品抽取到含有3.8%柠檬酸钠的注射器内，以形成1:9的抗凝剂与血液比（v/v）。血浆通过离心（15分钟，以3000 x g）获得，并且每份成人血液样品的等分试样用于制备合并的血浆原液。在分析前将等分试样样品贮存于-80℃下。

亲和柱纯化

将合并的人血浆（80 ml）用10 mM磷酸钠缓冲液（pH 7）稀释两倍，并且施加于先前用10 mM磷酸钠缓冲液（pH 7）平衡的5 ml肝素琼脂糖凝胶柱（Amersham Pharmacia Biotech）。用含有1.0 M和2.0 M NaCl的10 mM磷酸钠缓冲液（pH 7）从柱中洗脱结合蛋白质。

硫酸铵沉淀

将饱和硫酸铵（"SAS"）逐滴加入蛋白质洗脱物，在涡旋混合器上混合至35%（w/v）的终浓度。将样品在冰上保持10分钟，并且以12,000 x g离心5分钟。弃去上清液，并且准备团块用于通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的后续分析。

纯化蛋白质的 SDS-PAGE 和蛋白质印迹分析

根据Laemmli的方法（Nature，227: 680-685（1970）），使用10%凝胶在标准SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上运行团块。在电泳后，将一份SDS-PAGE凝胶转移至硝酸纤维素，并且其他直接用考马斯亮蓝（"CBB"）染色。首先使硝酸纤维素膜与对于真正的成骨BMP例如BMP-7（Genera Research Laboratory）或BMP-1同种型特异性的抗体一起温育，并且在4℃下保持过夜。碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠抗体在室温下用作第二抗体共1小时。用5 ml生色底物使膜显色。凝胶的其他部分在标准染色操作下（在45%甲醇中的0.1% CBB，10%乙酸；在室温下30分钟）用考马斯亮蓝（CBB）染色。

将凝胶切割成对应于如通过用CBB染色揭示的每个蛋白质条带的切片。随后加工凝胶切片，以确定何种蛋白质存在于每个切片中，使用通过HPLC和质谱法（"MS"）分析从每个蛋白质条带中释放的胰蛋白酶肽的方法，使用如由Olsen和Mann（Proc. 　 Natl. 　 Acad. 　 Sci. 　 USA，101: 13417-13422（2004））描述并且由Grgurevic等人（J. 　 Nephrol.，20: 311-319（2007））修改的纳升电喷雾LC-MS接口。下文指示了与这个研究具体相关的这种方法步骤的方面。

凝胶内胰蛋白酶消化方案

凝胶中的条带从CBB染色的凝胶中切下，并且用胰蛋白酶消化。简言之，用100 µl乙腈使凝胶小片收缩8分钟。去除液体，并且用100 µl碳酸氢铵使凝胶小片再膨胀12分钟，并且随后在SpeedVac中干燥10分钟。加入二硫苏糖醇（"DTT"，100 µl），并且在57℃下温育45分钟。将凝胶小片用100 μl乙腈在57℃下收缩8分钟，向下旋转并且去除液体。将碘乙酰胺（100 µl）加入每个凝胶小片，并且在室温下在黑暗中无需搅动温育45分钟。加入胰蛋白酶（10 µl）/凝胶小片。随后使凝胶小片离心并且再膨胀10分钟。使样品在热混合器中在37℃下温育过夜。

肽提取方案

从37℃热混合器中取出样品。加入含有乙腈、水和甲酸的溶液（50 µl）。使样品超声处理15分钟。将上清液转移至储备管，并且加入50 µl乙腈。使提取物在SpeedVac中在真空下干燥至完全干燥（约40分钟）。用含有水、甲醇和甲酸的10 µl溶液使肽再溶解。将样品超声处理5分钟，并且贮存于-20℃下直至分析时。

质谱法

如下通过液相色谱-质谱法（LC-MS）分析胰蛋白酶肽。使用纳升电喷雾LC-MS接口（Proxeon Biosystems，Odense，丹麦），使Agilent 1100 nanoflow HPLC系统（Agilent Technologies，Palo Alto，CA）与7-Tesla LTQ-FT质谱仪（Thermo Electron，Bremen，德国）偶联。肽在自制75 µm C₁₈ HPLC柱上分离，并且以阳离子飞行模式进行质谱分析。每个测量循环由下述组成：完全质谱法（MS）扫描，随后为所选离子监控（SIM）扫描，三种最强烈离子的MS/MS和MS/MS/MS扫描。这提供了2 ppm的通常肽质量准确度，以及来自MS/MS和MS/MS/MS碎片离子的另外序列信息。使所得到的谱图心化（centroided），并且使用Mascot搜索引擎（Matrix Science）针对NCBInr数据库进行搜索。用胰蛋白酶特异性、羧基酰氨基甲基化作为固定修饰和氧化甲硫氨酸作为可变修饰完成搜索。5 ppm和0.6 Da的质量公差分别用于MS和MS/MS谱。

结果

对于来自健康人个体的血液，LS-MS和免疫印迹分析揭示十二（12）种胰蛋白酶肽，其与NCBInr数据库相比较。发现两种肽不属于任何已知的真正的成骨BMP，而是属于BMP-1-3前体的剪接同种型3（Swiss-Prot: P13497-2；SEQ ID NO:2），即前胶原C蛋白酶。两种肽的氨基酸序列为：

S-G-L-T-A-D-S-K（SEQ ID NO:2的氨基酸653-660），Mascot得分 = 36；

G-I-F-L-D-T-I-V-P-K（SEQ ID NO:2的氨基酸280-289），Mascot 得分 = 26。

NCBInr数据库中没有其他蛋白质匹配相同组的肽。通过LS-MS或通过免疫印迹在100 kDa和35 kDa的分子量处未检测到真正的成骨BMP蛋白质。与先前发现（WO 2008/011193 A2；Grgurevic等人（2011））一致，结果表明真正的成骨BMPs通常不在健康成人的血液中循环，而BMP-1-3，即前胶原C蛋白酶同种型，是正常人血液的可溶性蛋白质组分。

对于具有持续性急性心肌梗死的人患者的血液，LS-MS和免疫印迹分析揭示BMP-1-3的肽以及与NCBInr数据库相比较的两种胰蛋白酶肽。发现两种肽属于BMP-1-4同种型（SEQ ID NO:3）的氨基酸序列。两种肽的氨基酸序列为：

K-N-C-D-K-F-G-I-V-V-H-E-L-G（SEQ ID NO:3的氨基酸203-216），Mascot 得分 = 51；

G-V-L-H-S-S-L-L-L-L-S-C-G（SEQ ID NO:3的氨基酸244-256），Mascot得分 = 64。

因此，虽然健康个体的血液含有BMP-1-3（且不含其他BMP-1同种型），但具有持续性急性心肌梗死的人个体的血液含有BMP-1-3和BMP-1-4两者。这是首次BMP-1-4同种型蛋白质已在蛋白质水平上得到证实，并且显示存在于急性心肌梗死的人患者的血液中，而不是健康个体的血液中。因此，在人个体的血液样品中BMP-1-4的检测指示该个体具有持续性急性心肌梗死。

实施例 2. BMP-1-4 在人心脏中的定位。

使用BMP-1-4 抗体，BMP-1-4已定位于发育中的人胚胎的心脏和胎盘中（数据未显示）。在成人心脏切片中，BMP-1-4蛋白质在肌原纤维和心肌细胞中检测到，但在来自多种其他主要器官的组织中未检测到（数据未显示）。结果指示BMP-1-4同种型的表达与人心脏的发育和功能独特相关。

实施例 3. 用于研究急性心肌梗死治疗的材料与方法。

抗体产生

使用衍生自BMP-1-3和BMP-1-4氨基酸序列（分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3）的合成肽片段，生成针对BMP-1-3和BMP-1-4的多克隆和单克隆抗体。

为了产生针对BMP-1-3蛋白质的单克隆抗体，用具有BMP-1-3蛋白质的C末端区域的下述氨基酸序列的合成肽，给小鼠免疫接种：

R-Y-T-S-T-K-F-Q-D-T-L-H-S-R-K（SEQ ID NO:2的氨基酸残基972-986）。

为了产生针对BMP-1-4蛋白质的单克隆和多克隆抗体，用具有下述氨基酸序列的合成肽，给动物免疫接种：

C-G-S-R-N-G-A-S-F-P-S-S-L-E-S-S-T-H-Q-A（SEQ ID NO:8）。

这种肽具有与BMP-1-4的氨基酸残基255-274（SEQ ID NO:3）相同的氨基酸序列，除了在位置265处的半胱氨酸（Cys）已替换为丝氨酸（Ser）之外。这阻止巯基交联的形成，所述巯基交联可以阻塞用于生成抗BMP-1-4抗体的所需免疫原性位点。

使用酶联免疫吸附测定（ELISA）与纯化的重组BMP-1-3（Genera Research Lab）鉴定肽特异性抗体。使抗体亲和力成熟。

在制造商的杂交瘤操作中使用上述肽免疫接种Balb/C小鼠，从ProMab（Richmond，California，美国）获得针对BMP-1-3和BMP-1-4的单克隆抗体。使用标准切割测定，通过BMP-1-3介导的前胶原或牙本质基质蛋白1（DMP-1）切割的抑制，来证实BMP-1-3抗体的中和活性（数据未显示）。参见例如，Kessler等人（1996）和Li等人（1996）（前胶原1切割测定）；Qin等人（2003）和Steiglitz等人（2004）（DMP-1切割测定）。如下文描述的研究中所示，BMP-1-3 mAb和BMP-1-4 mAb两者在疾病的大鼠模型中均有效治疗急性心肌梗死。

急性心肌梗死的大鼠模型

本文描述的研究采用在大鼠中的实验性急性心肌梗死模型。这种模型呈现类似于在人中在急性心肌梗死后发生的那些的病理生理学改变，并且是选择用于研究使在梗死后可以发生的形态和功能改变降到最低的治疗干预的模型。参见例如，Zornoff等人（2009）。六个月大的Sprague-Dawley大鼠起初饲养在恒定温度（25℃）和日夜光周期的标准条件下。称重250-300克的雄性大鼠用腹膜内施用的赛拉嗪（0.6 ml/kg，Rompun®，Bayer AG，Leverkusen，德国）和氯胺酮（Narketan，0.8 ml/kg，Chassot GmbH，德国）的组合进行麻醉。在第四肋间隙处进行左侧开胸术后，切开心包膜。心脏通过胸部的横向按压而外向化。将结扎线（6/0 Ethilon™缝线，Ethicon，Somerville，New Jersey，美国）置于左冠状动脉主干周围，接近于其起点以及在左心房和肺动脉沟之间。随后，将心脏快速送回胸腔，并且用正压通气使肺扩张。

血浆 CK-MB 和肌钙蛋白 t 的测量

通过测量两种心脏标记物即心肌带肌酸激酶（"CK-MB"）和肌钙蛋白（"Tn-T"）的血浆水平，在如本文描述的实施结扎诱导的急性心肌梗死（AMI）的大鼠中评估心肌细胞损伤和坏死，所述两种心脏标记是确定的心脏组织损伤标记。在血液中CK-MB和Tn-T的水平上升指示心脏组织损伤，包括来自急性心肌梗死的心脏组织损伤。血液样品从动物的眼血管丛中抽取，并且收集在肝素化的管中。样品迅速以2000 x g离心15分钟，直至采取测量时。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）测量两种AMI标记。

使用商业ELISA试剂盒（Troponin T hs STAT，Roche Diagnostics，Mannheim，德国），在下述研究中确定血液样品中的肌钙蛋白t（"Tn-T"）水平。这种特定ELISA是定量夹心酶免疫测定，其采用具有已由对于Tn-T特异性的抗体预包被的孔的微量滴定板。将标准和样品加入孔中，并且标准或样品中存在的任何Tn-T由固定抗体结合。在去除任何未结合的物质后，将同样对于Tn-T特异性的生物素缀合的抗体加入孔中。在洗涤后，将抗生物素蛋白缀合的辣根过氧化物酶（HRP）加入孔中。随后将HRP酶底物TMB（3,3',5,5'四甲基联苯胺）加入孔中，以起始HRP反应。在温育期过程中，HRP反应生成与在起始步骤中与微量滴定板孔结合的Tn-T量成比例的颜色。用停止溶液（硫酸溶液）终止反应，并且在450 nm ± 2 nm处分光光度计测量每个孔中的反应混合物的颜色。随后通过比较样品的O.D.与标准曲线来确定样品中的Tn-T浓度。

血液样品中的CK-MB水平也使用ELISA试剂盒（Creatine Kinase - MB，CKMBL，Roche Diagnostics，Indianapolis，Indiana，美国）进行确定。

超声心动图评价

下述研究中的所有动物（大鼠）均经历在麻醉下的超声心动图检查。用氯胺酮和赛拉嗪组合使动物轻微麻醉。执行二维（2D）引导下M模式经胸超声心动图检查。对于M模式记录，胸骨旁短轴切面用于使在乳头肌水平上的2D心脏成像。左心室（LV）体积通过公式经由2D测量进行计算。测定下述M模式测量：LV（左心室）舒张期和收缩期内径（分别为LVIDd和LVIDs）、LV舒张期和收缩期后壁厚度（分别为LVPWd和LVPWs）、以及舒张期和收缩期室间隔尺寸（分别为IVSd和IVSs）。根据这些测量，衍生射血分数（EF）和缩短分数（ES）。超声心动图通过两个不同医生对每只动物执行三次，并且结果呈现为平均值。

PET 数据采集和数据分析

正电子发射断层扫描术（PET）是核医学成像技术，其通过跟踪注射到实验动物内的放射性标记的生物活性分子在空间和时间中的分布，产生体内的特定功能过程的三维（3D）图像。该系统检测通过来自连接至生物活性分子的正电子发射放射性核素（示踪剂）的正电子湮没产生的γ射线对，并且随后通过计算机分析重构在体内的示踪剂浓度的三维图像。在本文描述的急性心肌梗死研究中，生物活性分子是氟脱氧葡萄糖（FDG，氟代脱氧葡萄糖），其是可以静脉内注射到实验动物内的葡萄糖类似物。FDG通过功能心肌组织而不是无功能的缺血心肌组织吸收。该技术依赖在大约相反的方向上（在它们的质心框中将确切相反）移动的光子对的重合检测。

本文描述的研究关注经过相对长时间段发生的过程。特别地，对于急性心肌梗死研究中的每只动物，获取测量以获得在三个时间点时的图像：（1）在实验前，以确定每只动物的基线，（2）在产生缺血效应的结扎后（1周），以及在手术后更久（1个月）。以这种方式，涵盖恢复过程的所有阶段：基线（正常摄取），急性期（在手术后立即）和长期恢复。

使用PMOD软件的3.3版本执行数据分析，其关于来自ClearPet照相机的输入而同步和校正。

将分析分成两个步骤：（1）定性分析和（2）定量分析。为了确定定量效应，设计下述操作：首先，确定可接受时帧的时间平均值。随后，FUSION PMOD程序用于共记录不同测量（使其达到相同位置）。对于急性心肌梗死实验，所有测量均与基线测量共记录。接下来，以SURFACE型模式的3D PMOD程序获得关于每个实验的心脏的3D图像，但将表面阈值从最小值变为更高的值，以描绘所有动物中的等活度线。

实施例 4. 用针对 BMP-1-3 的单克隆抗体处理的具有急性心肌梗死的大鼠血浆中的 CK-MB 酶分析。

这个研究确定具有结扎诱导的急性心肌梗死的大鼠中的心肌带肌酸激酶（CK-MB）蛋白质的血浆水平，所述大鼠在手术前和后用针对BMP-1-3的单克隆抗体（BMP-1-3 mAb）进行处理。总共使用16只大鼠。将动物分成由6只动物组成的对照组和由10只大鼠组成的治疗组，所述10只大鼠用BMP-1-3单克隆抗体（15 µg/kg）进行预处理。在手术后，将存活动物分成两组：（1）具有结扎的冠状动脉的对照大鼠（n = 4），和（2）具有结扎的冠状动脉并且在第一周期间的每一天用BMP-1-3单克隆抗体处理的大鼠（n = 7）。在不同时间点收集血液：在手术前，以及在手术后第一天、第二天、第三天和第七天。如图2中所示，在结扎前的CK-MB值是相似的，而在手术后24小时（1天），该值在抗体处理的大鼠中更低（用BMP-1-3 mAb处理的组中的376.7 U/L相对于未经处理的对照组中的459 U/L）。在第二天时，CK-MB在未经处理的对照大鼠中为621.8，而它在用BMP-1-3 mAb处理的大鼠中仅为441.9（p<0.05）。在以后时间点时，与未经处理的对照大鼠相比较，CK-MB值在用BMP-1-3 mAb处理的大鼠中也更低。参见图2。

结果指示BMP-1-3是急性心肌梗死的治疗靶，并且施用针对BMP-1-3的抗体是用于就急性心肌梗死治疗个体的有效疗法。

实施例 5. 用针对 BMP-1-4 的多克隆抗体处理的具有急性心肌梗死的大鼠血浆中的 CK-MB 酶分析。

在这个实验中总共使用20只大鼠。测量在不同时间点时在大鼠血液中的CK-MB水平：在冠状动脉结扎手术前以及在结扎后第一天、第二天、第三天、第六天和第七天）。十只大鼠用BMP-1-4多克隆抗体（15 µg/kg）进行预处理。在手术后，将存活过冠状动脉结扎的大鼠分成两组：（1）无治疗的具有结扎诱导的急性心肌梗死的对照大鼠（n = 8），和（2）具有结扎诱导的急性心肌梗死并且用BMP-1-4多克隆抗体处理的大鼠（n=6）。如图3中所示，与未经处理的对照大鼠相比较，在手术后2天，用BMP-1-4多克隆抗体处理显著降低大鼠中的CK-MB血清值（例如对照组中的563.8相对于抗体处理的大鼠中的441.5）。在以后时间点时，与未经处理的对照大鼠相比较，CK-MB值在用BMP-1-4多克隆抗体处理的大鼠中也更低（例如在第7天时，对照组中的395.5与用BMP-1-4多克隆抗体处理的大鼠中的237.2比较）。

结果指示BMP-1-4是急性心肌梗死的治疗靶，并且施用针对BMP-1-4的抗体是用于治疗急性心肌梗死的有效疗法。

实施例 6. 用 BMP-1-3 和 BMP-1-4 单克隆抗体的组合处理的具有急性心肌梗死的大鼠血浆中的肌钙蛋白 t 分析。

这个研究跟踪具有经诱导的急性心肌梗死（AMI）的大鼠中的肌钙蛋白t（"Tn-T"）水平，在诱导AMI的结扎手术前和后，所述大鼠用BMP-1-3 mAb和BMP-1-4 mAb的组合进行处理。在这个研究中总共使用21只大鼠。在冠状动脉结扎前，七只大鼠用组合（BMP-1-3抗体 + BMP-1-4抗体；每种抗体15 μg/kg）进行预处理，而十四只大鼠保持未处理（对照组）。在24小时后，大鼠经历左冠状动脉的手术结扎。将存活动物分成两组：（1）具有结扎的冠状动脉的对照大鼠（n = 6），和（2）BMP-1-3 mAb + BMP-1-4 mAb处理的具有经诱导的AMI的大鼠（n = 3）。在手术后24和48小时，抗体处理的动物接受15 μg/kg的每种抗体。血液在不同时间点时进行收集：在手术前，在结扎手术后第一天、第二天、第三天和第六天（图4）。相对于具有AMI的未经处理的对照动物，抗体的组合显示降低血清Tn-T水平的显著功效。在第一天、第二天和第三天期间，未经处理的对照大鼠中的该值为7.8、3.26、1.18，而在抗体处理的动物中，该值为5.72、1.63和0.24。参见图4。

结果指示BMP-1-3 mAb和BMP-1-4 mAb的组合疗法有效治疗急性心肌梗死。

实施例 7. 具有急性心肌梗死的大鼠中的心脏功能的超声心动图评价。

通过未经处理的冠状动脉结扎的对照大鼠和用BMP-1-3单克隆抗体（15 µg/kg）处理的冠状动脉结扎的大鼠以M模式的心脏超声心动图，进一步研究抗体疗法的功能性结果和纤维化形成。总共19只大鼠用于这个长期随访研究。在手术后，将存活大鼠分成三组：（1）假手术组：正常、健康动物（n=3）,（2）对照组：具有经诱导的急性心肌梗死的未经处理的大鼠（n=4）,（3）治疗组：在手术前和在手术后的第一周期间，用BMP-1-3单克隆抗体处理的具有经诱导的急性心肌梗死的大鼠（n=7）。在手术后45天执行超声心动图。使用健康大鼠的分析，根据如下限定平均值：IVSd = 1.1 mm，LVIDd = 5.3 mm，LVPWd = 1.77 mm，IVSs = 2.3 mm，LVIDs = 2.7 mm，LVPWs = 2.4 mm，EF = 85.5%，FS = 49.1%。具有经诱导的急性心肌梗死的对照大鼠具有功能中的显著降低，这在超声心动图参数中发生：: IVSd = 1 mm，LVPWd = 1.73 mm，IVSs = 1.1 mm，EF = 68.8%，FS = 33.9%。用BMP-1-3单克隆抗体处理（治疗）增强心脏功能：IVSd = 1.38 mm，LVIDd = 5.9 mm，IVSs = 2.7 mm，EF = 88.2%，FS = 52.9%。参见下表1。

表1. 在急性心肌梗死的动物模型中，大鼠的心脏尺寸和功能的超声心动图测量。

假的 = 假手术大鼠；对照 = 实施结扎诱导的急性心肌梗死的未经处理的大鼠；BMP1-3 mAb = 实施结扎诱导的急性心肌梗死的大鼠的BMP-1-3单克隆抗体处理；*p<0.05（与对照大鼠相比较的统计学意义）。

实施例 8. 正电子发射断层扫描术（ PET ）数据采集和数据分析。

在这个实验中，在急性心肌梗死的大鼠模型中，20只大鼠在手术前通过PET进行扫描。在手术前，将大鼠分成对照大鼠（n=10）和用BMP-1-3 mAb处理的动物（n=10）。在手术后，死亡率在对照大鼠中为50%，并且在手术前用BMP-1-3 mAb处理的大鼠中为30%。随后在第2、7和14天时，用BMP-1-3 mAb以15 μg/kg的剂量处理大鼠。除在手术前的第一次PET扫描之外，大鼠还在第一周和第一个月后进行扫描，以评估梗死的进展和治疗的影响。来自对照组和BMP-1-3 mAb处理组的动物的代表性心脏图像显示于图5中。在第一周后，两个组均显示在梗死区中降低的FDG摄取（0.36相对于0.38）。在用BMP-1-3 mAb处理一个月后的大鼠中，在梗死区中的FDG摄取恢复（0.42），指示在以前的梗死区中的功能心肌组织的基本重塑和再生，而在未经处理的对照大鼠中，摄取仍很低（0.36），指示无功能的瘢痕组织。参见图5。

实施例 9. 在急性心肌梗死后心肌的组织学分析。

对具有结扎诱导的急性心肌梗死（AMI）的大鼠的心肌执行组织学分析，以评价用BMP-1-3单克隆抗体（BMP-1-3 mAb）处理的效果。将大鼠（n = 16）分成由六只动物组成的对照组和由10只动物组成的治疗组，所述10只动物用BMP-1-3 mAb（15 µg/kg）进行预处理。在手术后，将存活动物（n = 11）分成两组：（1）具有结扎的冠状动脉的对照大鼠（n = 4，不使用BMP-1-3 mAb的预处理），和（2）已用BMP-1-3预处理并且随后在第一周期间的每一天用BMP-1-3 mAb处理的具有结扎的冠状动脉的大鼠（n = 7）。

取出来自AMI大鼠的左心室的心肌组织（厚度大约2 mm）。将样品在4%预冷多聚甲醛固定72小时，并且在石蜡中包埋用于组织学研究。将石蜡包埋的组织切片成大约5 μm厚的切片。切片用标准苏木精和伊红（"H&E"）进行染色，以揭示细胞组分，并且用天狼星红（和苦味酸）染色，以鉴定纤维胶原组织累积。图像在光学显微镜下显现。

图6显示了对于具有AMI的未经处理的对照大鼠和用BMP-1-3 mAb处理的具有AMI的大鼠，在冠状动脉结扎后来自大鼠的心肌的组织学分析的显微照片。图6A 显示了在诱导AMI的左冠状动脉结扎后一周时，来自未经处理的对照大鼠心脏的梗死区的心脏切片（图6A中4X放大率）。图6B显示了图6A中的矩形区域的组织的天狼猩红染色（在20X放大率下），指示早期胶原沉积。参见图6B中的箭头。图6C显示了用苏木精和伊红染色的，来自具有AMI的未经处理的大鼠对照的心肌组织切片，揭示了在一个月后由损伤的心肌纤维围绕的残留纤维化瘢痕组织。参见图6C中的箭头。图6D显示了来自大鼠的心脏梗死区的心脏切片，所述大鼠在诱导AMI的左冠状动脉结扎之前用BMP-1-3 mAb（15 µg/kg）进行处理，并且随后在手术后的第一周期间每一天用BMP-1-3 mAb进行处理。在AMI后的纤维化区域明显小于在对照大鼠中观察到的那种。参见图6D中的箭头。图6E 显示了通过图6D中的箭头指示的区域的更高倍放大率，揭示了新的再生肌纤维斑点。参见图6E中的箭头。图6F显示了通过图6E中的箭头指示的区域的更高倍放大，揭示了新近形成的肌纤维以及纤维组织周围的细胞，其与来自未经处理的对照大鼠的组织中观察到的那种相比明显更不致密。

在AMI后的心脏肌肉组织的组织学分析指示用BMP-1-3 mAb处理显著降低瘢痕的尺寸，并且促进在原始梗死区中具有新近形成的肌纤维的结节形成。

总之，上述实施例的结果明确指示施用针对BMP-1-3的抗体和/或针对BMP-1-4的抗体有效减少个体心脏中的原始梗死区的进展，所述个体具有持续性急性心肌梗死，并且有效促进原始梗死区中的组织重塑，以形成具有比在不存在抗体处理的情况下的那种显著更高的质量和更有功能的修复和瘢痕组织。

上文正文中引用的所有专利、申请和公开均通过引用并入本文。

本文描述的本发明的其他变化和实施方案目前对于本领域技术人员将是显而易见的，而不背离本发明的公开内容或下文权利要求书。

序列表

<110> GENERA ISTRAZIVANJA d.o.o.

VUKICEVIC, Slobodan

GRGUREVIC, Lovorka

DUMIC-CULE, Ivo

<120> 用于治疗和诊断急性心肌梗死的方法和组合物

<130> ZGR-416.1PCT

<140> PCT/US2013/038294

<141> 2013-04-25

<150> 61/638,373

<151> 2012-04-25

<150> 61/638,424

<151> 2012-04-25

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 730

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

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<221> 尚未归类的特性

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<223> X为任意氨基酸

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<220>

<221> 尚未归类的特性

<222> (3)..(3)

<223> X为任意氨基酸

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Trp Gly Xaa Gly

1

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自BMP-1-4的经修饰的肽片段

<400> 8

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Thr His Gln Ala

20

Claims (16)

1.治疗个体中的急性心肌梗死的方法，其包括给该个体施用针对BMP-1-3的抗体、针对BMP-1-4的抗体、或针对BMP-1-3的抗体和针对BMP-1-4的抗体的组合。

2.根据权利要求1的方法，其包括给该个体施用针对BMP-1-3的抗体。

3.根据权利要求1的方法，其包括给该个体施用针对BMP-1-4的抗体。

4.针对BMP-1-3的抗体、针对BMP-1-1的抗体、或两种抗体的组合产品，其用于治疗个体中的急性心肌梗死。

5.根据权利要求4的抗体，其由针对BMP-1-3的抗体组成。

6.根据权利要求4的抗体，其由针对BMP-1-4的抗体组成。

7.根据权利要求4的抗体，其由针对BMP-1-3的抗体和针对BMP-1-4的抗体的组合组成。

8.确定个体是否具有持续性急性心肌梗死的方法，其包括测定先前得自该个体的血液样品中BMP-1-4的存在，其中该血液样品中BMP-1-4的存在指示该个体具有持续性急性心肌梗死。

9.根据权利要求8的方法，其中测定所述血液样品中BMP-1-4的存在的步骤包括使所述血液样品与BMP-1-4结合配偶体接触，以形成在所述结合配偶体和所述血液样品中存在的BMP-1-4之间的结合复合物。

10.根据权利要求9的方法，其中在所述结合配偶体和所述血液样品中存在的BMP-1-4之间形成的结合复合物通过与所述BMP-1-4结合配偶体相关的可检测标记进行检测。

11.根据权利要求9的方法，其中在所述BMP-1-4结合配偶体和所述血液样品中存在的BMP-1-4之间形成的结合复合物通过下述进行检测：加入与所述BMP-1-4结合配偶体结合或与所述结合复合物中存在的所述BMP-1-4结合的抗体，并且通过在所述抗体上存在的可检测标记检测所述抗体。

12.根据权利要求8-11中任一项的方法，其中所述BMP-1-4结合配偶体是结合BMP-1-4的抗体。

13.针对BMP-1-4的抗体作为用于诊断急性心肌梗死的生物标记的用途。

14.针对肽免疫原R-Y-T-S-T-K-F-Q-D-T-L-H-S-R-K（SEQ ID NO:2的氨基酸残基972-986）生成的抗BMP-1-3抗体。

15.针对肽免疫原C-G-S-R-N-G-A-S-F-P-S-S-L-E-S-S-T-H-Q-A（SEQ ID NO:8）生成的抗BMP-1-4抗体。

16.通过如保藏于DSMZ，登记号 的杂交瘤产生的抗BMP-1-3抗体。