CN105339002B - 治疗tau病变的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供治疗tau病变(tauopathy)的方法，其涉及施用抗‑Tau抗体。本发明还提供了抗‑Tau抗体，以及包含抗‑Tau抗体的制剂，其用于在所述方法中使用。

Description

治疗tau病变的方法
交叉引用
本申请要求申请日为2013年11月27日的美国专利申请No.14/092,539；申请日为2013年8月15日的国际专利申请；和申请日为2013年6月10日的美国临时专利申请No.61/833,355的权益；其每一项在此通过以其整体并入本申请。
发明背景
微管相关的蛋白tau在中枢神经系统中含量丰富，并且主要由神经元产生。Tau的主要功能是使微管稳定化。成人脑中存在6个tau同种型；tau同种型是单个基因可变剪接的产物。
Tau病变(tauopathy)是一类神经退行性疾病，其由脑中所谓的神经纤维缠结(NFT)中的tau蛋白的病理学聚集而造成。tau病变的一些例子包括额颞痴呆(FTD)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性(corticobasaldegeneration)、和额颞叶变性。
本领域需要用于治疗tau病变的方法，并且需适于在此类方法中使用的制剂。
发明概述
本发明提供治疗tau病变的方法，其涉及施用抗-Tau抗体。本发明还提供了抗-Tau抗体、和包含抗-Tau抗体的制剂，其用于在所述方法中使用。
技术特征
本发明的提供了在个体中降低神经元细胞和/或细胞外液中Aβ40和/或Aβ42的方法，所述方法包括对个体施用：a)有效量的抗体，所述抗体结合至细胞外tau(eTau)肽的N末端区域内的表位；或b)包含所述抗体的药物组合物。在一些实施方案中，抗体结合至eTau的氨基酸1-158内的表位。在一些实施方案中，抗体结合至eTau的氨基酸2-68内的表位。在一些实施方案中，抗体结合至eTau的氨基酸15-24内的表位。在一些实施方案中，表位在与SEQID NO:48(eTau4)具有至少95％氨基酸序列同一性的Tau多肽内。在一些实施方案中，抗体与Tau的氨基酸7-13、25-30、19-46、或150-158内的表位结合。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体结合线性表位。在一些实施方案中，所述抗体特异性结合至表位，所述结合与表位内的氨基酸磷酸化无关。在一些实施方案中，抗体与包含如下结构的抗体竞争结合所述表位：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，当抗体是人源化抗体时，所述人源化抗体包含同种型IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的重链区。在一些实施方案中，当抗体是人源化抗体时，所述人源化抗体是Fv、scFv、Fab、F(ab')2、或Fab'。在一些实施方案中，所述抗体通过静脉内、鞘内、或皮下施用途径来施用。在一些实施方案中，所述细胞外液是脑脊液、间质液、血液、或血液级分(例如血液级分如血浆或血清)。在一些实施方案中，所述抗体包含：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
本发明的提供了治疗与个体内Aβ积累相关的疾病的方法，所述方法包括对个体施用：a)有效量的抗体，所述抗体结合至细胞外tau(eTau)肽的N末端区域内的表位；或b)包含所述抗体的药物组合物。在一些实施方案中，抗体结合至eTau的氨基酸1-158内的表位。在一些实施方案中，抗体结合至eTau的氨基酸2-68内的表位。在一些实施方案中，抗体结合至eTau的氨基酸15-24、eTau的氨基酸25-30、eTau的氨基酸7-13、或eTau的氨基酸19-46内的表位。在一些实施方案中，表位在与SEQ ID NO:48(eTau4)具有至少95％氨基酸序列同一性的Tau多肽内。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体结合线性表位。在一些实施方案中，所述抗体特异性结合至表位，所述结合与表位内的氨基酸磷酸化无关。在一些实施方案中，抗体与包含如下结构的抗体竞争结合所述表位：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，当抗体是人源化抗体时，所述人源化抗体包含同种型IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的重链区。在一些实施方案中，当抗体是人源化抗体时，所述人源化抗体是Fv、scFv、Fab、F(ab')2、或Fab'。在一些实施方案中，所述抗体通过静脉内、鞘内、或皮下施用途径来施用。在一些实施方案中，所述细胞外液是脑脊液、间质液、血液、或血液级分(例如血液级分如血浆或血清)。在一些实施方案中，所述抗体包含：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述疾病是阿尔茨海默氏病。
本发明的提供了一种在个体中的神经元细胞和/或细胞外液中降低β-淀粉样多肽(amyloid beta polypeptide)的水平的方法，所述方法包括对个体施用药物组合物，其包含：a)有效量的抗体，所述抗体结合至细胞外tau(eTau)肽的N末端区域内的表位；或b)药学上可接受的载体。
本发明的提供了一种分离的人源化抗体，其在个体中的神经元细胞和/或细胞外液中降低Aβ40和/或Aβ42的水平，其中所述抗体特异性结合至2N4R Tau的氨基酸1-158内的表位。在一些实施方案中，抗体特异性结合Tau的氨基酸2-18内的表位。在一些实施方案中，抗体特异性结合Tau的氨基酸7-13、或Tau的氨基酸25-30内的表位。在一些实施方案中，抗体特异性结合Tau的氨基酸15-24内、氨基酸2-68内、或氨基酸19-46内的表位。在一些实施方案中，抗体特异性地结合2N4R Tau的氨基酸28-126内的表位。在一些实施方案中，抗体特异性地结合2N4R Tau的氨基酸150-158内的表位。在一些实施方案中，所述抗体结合线性表位。在一些实施方案中，表位在与SEQ ID NO:48(eTau4)具有至少95％氨基酸序列同一性的Tau多肽内。在一些实施方案中，抗体与包含如下结构的抗体竞争结合所述表位：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VH CDR1，其包含SEQID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在上述实施方案的任一个中，所述抗体特异性结合至表位，所述结合与表位内的氨基酸磷酸化无关。本发明提供了药物组合物，其包含：a)如上文或此处所述的分离的人源化抗体；和b)药学上可接受的赋形剂。
本发明提供了分离的人源化单克隆抗体，其特异性结合Tau多肽的氨基酸15-24内的表位。在一些情况中，表位不包含磷酸化的氨基酸。在一些情况中，表位不包含硝化的氨基酸。在一些情况中，表位包含磷酸化的氨基酸、硝化的氨基酸、或磷酸化的氨基酸和硝化的氨基酸两者。
本发明提供了分离的抗体，其包含人源化的轻链框架区；和人源化的重链框架区，其中所述分离的抗体与另一抗体竞争结合至Tau多肽的N末端区中的表位，所述另一抗体包含：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VLCDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些情况中，轻链区和重链区存在于不同的多肽中。在一些情况中，轻链区和重链区存在于单一多肽中。在一些情况中，重链区是同种型Ig G1、IgG2、IgG3或IgG4的。在一些情况中，重链区是同种型IgG4的。在这些实施方案的一些中，铰链区包含S241P取代。参见例如Angal等(1993)Mol.Immunol.30:105。在一些情况中，抗体是Fv、scFv、Fab、F(ab')2或Fab'。在一些情况中，抗体包含共价连接的非肽合成聚合物，例如聚(乙二醇)聚合物。在一些情况中，所述抗体直接或经接头与促进穿过血脑屏障的载体分子、肽或蛋白质融合。在一些情况中，表位在Tau多肽的氨基酸15-24内。在一些情况中，人源化轻链框架区包含表3中所示的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10处氨基酸取代。在一些情况中，人源化重链框架区包含表2中所示的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12处氨基酸取代。本发明提供了分离的抗体，其中所述抗体是Fv、scFv、Fab、F(ab')2或Fab'，并且其中所述抗体与另一抗体竞争结合至Tau多肽的N末端区中的表位，所述另一抗体包含：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VLCDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VHCDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些情况中，分离的抗体包含人源化轻链框架区。在一些情况中，人源化轻链框架区包含表3中所示的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10处氨基酸取代。在一些情况中，分离的抗体包含人源化重链框架区。在一些情况中，人源化重链框架区包含表2中所示的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12处氨基酸取代。
本发明提供了分离的抗体，其中所述分离的抗体包含人轻链恒定区和人重链恒定区，并且其中所述分离的抗体与另一抗体竞争结合至Tau多肽的N末端区中的表位，所述另一抗体包含：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
本发明提供了药物制剂，其包含：a)本发明的抗-Tau抗体；和b)药学上可接受的赋形剂。
本发明提供了药物制剂，其包含：a)抗体，其特异性地结合Tau的N末端部分内的表位，其中所述抗体包含：(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(iii)VL CDR3，其包含SEQID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；(iv)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(v)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(vi)VHCDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列；和b)适于对人施用的药学上可接受的赋形剂，其中所述制剂不含内毒素。在一些情况中，抗体包含人源化轻链框架区。在一些情况中，人源化轻链框架区包含表3中所示的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10处氨基酸取代。在一些情况中，抗体包含人源化重链框架区。在一些情况中，人源化重链框架区包含表2中所示的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12处氨基酸取代。在一些情况中，抗体是囊封于脂质体中的。在一些情况中，抗体与促进穿过血脑屏障的药剂配制在一起。在一些情况中，所述抗体直接或经接头与促进穿过血脑屏障的载体分子、肽或蛋白质融合。在一些情况中，抗体是Fv、scFv、Fab、F(ab')2或Fab'。
本发明提供了重组表达载体，其包含编码本发明的抗-Tau抗体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与在真核细胞中有活性的转录控制元件可操作连接。本发明提供了体外宿主细胞，其用本发明的重组表达载体进行遗传修饰。
本发明提供了无菌容器，其包含本发明的药物配制剂。在一些情况中，容器是注射器。
本发明提供了治疗个体中的tau病变的方法，该方法包括对个体施用本发明的抗-Tau抗体，或本发明的药物组合物。
本发明提供了治疗个体中的tau病变的方法，所述方法包括对个体施用药物组合物，所述药物组合物包含：a)抗体，其与另一抗体竞争结合至Tau多肽的N末端区中的表位，所述另一抗体包含：i)图1B中所示的抗体的轻链互补决定区(CDR)；和图1A中所示的抗体的重链CDR；或ii)图2B中所示的抗体的轻链CDR；和图2A中所示的抗体的重链CDR；和b)适合于对人施用的药学可接受的赋形剂。在一些情况中，所述抗体包含：(i)VL CDR1，其包含SEQID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；(iv)VHCDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(v)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(vi)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些情况中，抗体包含人源化轻链框架区。在一些情况中，抗体包含人源化重链框架区。在一些情况中，抗体囊封于脂质体中。在一些情况中，抗体与促进穿过血脑屏障的药剂配制在一起。在一些情况中，所述抗体直接或经接头与促进穿过血脑屏障的载体分子、肽或蛋白质融合，在一些情况中，抗体是Fv、scFv、Fab、F(ab')2或Fab'。在一些情况中，施用是静脉内的。在一些情况中，施用是鞘内的。
在一些情况中，主题抗-Tau抗体的施用导致下列一个或多个变化：a)脑组织中游离的胞外tau的量；b)间质液(ISF)中游离的胞外tau的量；c)脑脊液(CSF)中游离的胞外tau的量；d)tau的神经元至神经元扩散；e)神经元内tau聚集体的量；f)小胶质细胞和/或星形胶质细胞活化的程度；g)磷酸化的或超磷酸化的Tau的量；h)ISF或CSF中总的Tau或游离的tau的量；i)胞内N末端tau片段的量；j)神经元过度活跃；k)CSF中Aβ40和/或Aβ42的量；l)Aβ斑负荷(plaque burden)；m)从神经元分泌Aβ40和/或Aβ42；n)淀粉样前体蛋白(APP)促进剂活性；o)APP mRNA和/或蛋白质水平；p)β-分泌酶和/或γ分泌酶的活性；q)Aβ诱导的信号传输途径的活化状态；r)细胞内总的tau或游离的tau的量；s)ISF或CSF中抗-Tau抗体结合的tau的量；和t)胞内与抗-Tau抗体结合的tau的量。
在一些情况中，本发明用于治疗个体中的tau病变的方法进一步包括施用至少一种治疗所述tau病变的额外的药剂。
本发明提供了一种监测个体中的tau病变进展的方法，该方法包括：a)测定在第一时间点处从所述个体获得的生物样品中的Tau多肽的第一水平；b)测定在第二时间点处从所述个体获得的生物样品中的Tau多肽的第二水平；并c)比较Tau的第二水平与Tau的第一水平，其中所述测定包括：i)使所述生物样品与权利要求1、5、16和21中任一项的抗体接触；并ii)定量所述抗体对所述样品中存在的Tau多肽的结合。在一些情况中，生物样品是脑脊液、血液、血浆、血清、尿液或唾液。在一些情况中，定量的Tau多肽是总的Tau多肽.在一些情况中，定量的Tau多肽是全长Tau多肽的N末端片段。在一些情况中，所述第一时间点是启动治疗方案前的时间点，且其中所述第二时间点是启动治疗方案后的时间点。
本发明提供了在体内检测活个体中的Tau多肽的方法，所述方法包括：a)对所述个体施用权利要求1、5、16和21中任一项的抗体；并b)使用成像方法检测所述抗体对所述个体的脑组织中Tau多肽的结合。在一些情况中，抗体包含适于在所述成像方法中使用的造影剂。在一些情况中，成像方法是磁共振成像或正电子发射断层摄影术。
本发明提供了检测从个体获得的生物样品中的Tau多肽的体外方法，所述方法包括：a)使所述生物样品与抗体接触，所述抗体与另一抗体竞争结合至Tau的N末端区中的表位，所述另一抗体包含：i)图1B中所示的抗体的轻链互补决定区(CDR)；和图1A中所示的抗体的重链CDR；或ii)图2B中所示的抗体的轻链CDR；和图2A中所示的抗体的重链CDR；和b)检测所述抗体对所述样品中存在的Tau多肽的结合。在一些情况中，生物样品是血液、血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液。在一些情况中，所述个体疑患tau病变、已经诊断为患有tau病变，或具有患上tau病变的遗传易感性。在一些情况中，所述方法是定量的。在一些情况中，检测的所述Tau多肽是总的Tau多肽。在一些情况中，检测的所述Tau多肽是全长Tau多肽的N末端片段。
附图简述
图1A和1B提供了IPN001VH(图1A)和VL(图1B)的氨基酸序列。互补决定区(CDR)为粗体文本且加下划线。
图2A和2B提供了IPN002VH(图2A)和VL(图2B)的氨基酸序列。互补决定区(CDR)为粗体文本且加下划线。
图3A-D描绘了抗-Tau抗体IPN002对皮质神经元中Tau介导的膜去极化的影响。
图4A-C描绘了从脑脊液(CSF)亲和分离Tau。
图5描绘了Tau亲和分离之前和之后CSF和条件化培养基(CM)样品的定量。
图6A-D提供了全长人Tau的氨基酸序列。
图7描绘了对条件化培养基中、来自P301L tau小鼠的间质液(ISF)中、及来自PSP和AD患者的CSF中的Tau片段的检测。
图8A-D描绘了通过胞外tau(eTau)片段诱导皮质神经元过度活跃(图8A-C)；和通过抗-Tau抗体IPN001降低eTau诱导的神经元过度活跃。
图9描绘了人源化IPN002VH变体1的氨基酸序列；和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列。
图10描绘了人源化IPN002VH变体2的氨基酸序列；和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列。
图11描绘了人源化IPN002VH变体3的氨基酸序列；和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列。
图12描绘了人源化IPN002VH变体4的氨基酸序列；和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列。
图13描绘了人源化IPN002 Vκ变体1的氨基酸序列；和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列。
图14描绘了人源化IPN002 Vκ变体2的氨基酸序列；和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列。
图15描绘了人源化IPN002 Vκ变体3的氨基酸序列；和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列。
图16描绘了人源化IPN002 Vκ变体4的氨基酸序列；和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列。
图17提供了表4，其显示了人源化IPN-002变体对eTau蛋白的结合特性。
图18提供了表5，其显示了人源化IPN-002变体对Tau-383的结合特性。
图19A和19B描绘了人源化IPN002变体的特性。图19A描绘了人源化IPN-002变体对iPSC-CN条件化培养基；iPSC-CN裂解物；AD脑裂解物；和P301L tau小鼠脑皮质裂解物；和猕猴脑裂解物中存在的tau的结合。图19B描绘了人源化IPN002变体对eTau诱导的神经元过度活跃的抑制。
图20描绘了与胎儿tau氨基酸序列比对的eTau片段的氨基酸序列。
图21A-C描绘了对人源化抗-Tau抗体(图21A)、嵌合抗体(图21B)、和人源化A33(图21C)的增殖响应。
图22描绘了IPN002对磷酸化的Tau体内水平的影响。
图23描绘了用IPN002处理后间质液(ISF)中的游离tau水平和总的tau水平的降低。
图24描绘了用IPN002处理后脑脊液(CSF)中游离的tau水平的降低。
图25描绘了通过IPN002降低eTau诱导的神经元过度活跃。
图26描绘了来自可能患有慢性创伤性脑病(chronic traumaticencephalopathy)的个体的CSF中Tau片段的存在。
图27描绘了使用固相测定法得到的IPN002人源化变体对合成的tau蛋白的结合。
图28描绘了使用液相测定法得到的IPN002人源化变体对合成的tau蛋白的结合。
图29描绘了IPN002人源化变体对重组Tau和对PAD肽的结合。
图30描绘了合成的tau肽的非生物素化形式与合成的tau肽的生物素化形式竞争对IPN002人源化变体的结合。
图31描绘了施用对照IgG、PHF1或IPN002对P310L小鼠模型中紧握得分(claspingscore)的影响。
图32描绘了施用对照IgG、PHF1、或IPN002对P310L小鼠模型中横杆行走测试(beamwalk test)中的平均等待时间(average latency)的影响。
图33描绘了施用对照IgG、PHF1、或IPN002对P310L小鼠模型中CSF样品中游离的tau(不与抗-Tau抗体结合的tau)水平的影响。
图34描绘了抗体对eTaula诱导的神经元超兴奋性的抑制。
图35描绘了全长PHF1反应性tau，或eTau1a在体外对皮质神经元中的神经元超兴奋性的影响。
图36用图描绘了全长PHF1反应性tau，或eTau1a在体外对皮质神经元中的神经元超兴奋性的影响。
图37描绘了对照IgG、BACE抑制剂、或IPN002对分泌自皮质神经元的Aβ40(左侧小图)或Aβ42(右侧小图)水平的影响。
图38描绘了对照IgG、BACE抑制剂、或抗-Tau抗体对分泌自初级皮质神经元的Aβ40水平的影响。
图39描绘了对照IgG、BACE抑制剂、或抗-Tau抗体对从初级皮质神经元分泌的Aβ42水平的影响。
图40描绘了IPN002人源化变体(hu-IPN002)的表位定位的结果。
图41描绘了用于检测CSF中的多个Tau多肽的测定法。
图42描绘了IPN002、PHF1、或多克隆抗体对CSF中Tau的结合，所述多克隆抗体结合Tau的C末端部分中的线性表位(pAb-tau线性表位)。
图43描绘了用对照IgG、PHF1、或IPN002处理P301L小鼠对CSF中总的tau水平的影响。
图44A-H描绘了用对照IgG、PHF1、或IPN002处理P301L小鼠对多个脑区和组织中AT8磷酸(phospho)Tau的影响。
图45A-E描绘了用对照IgG、PHF1、或IPN002处理P301L小鼠对多个脑区和组织中磷酸化的Tau的影响。
图46描绘了用对照IgG、PHF1、或IPN002处理P301L小鼠对后脑中AT8磷酸Tau组织学水平的影响。
图47描绘了用对照lgG、PHF1、或IPN002处理P301L小鼠对后脑中AT100磷酸Tau组织学水平的影响。
图48A和48B描绘了用对照IgG、PHF1、或IPN002处理P301L小鼠对海马体均浆(hippocampal homogenate)中和皮质均浆中的GFAP蛋白水平的影响。
图49A和49B描绘了用对照IgG、PHF1、或IPN002处理P301L小鼠对海马体均浆中和皮质均浆中的Iba1蛋白水平的影响。
图50A和50B描绘了用对照IgG、PHF1、或IPN002处理P301L小鼠对皮质均浆中和皮质S1级分中Aβ40水平的影响。
图51描绘了用对照IgG、PHF1、或IPN002处理P301L小鼠对能够在横杆行走测试中完成任务的小鼠的百分比的影响。
图52描绘了hu-IPN002对各种Tau肽的结合。
图53描绘了各种生物素化的Tau肽与hu-IPN002的结合。
图54A和54B是针对不与IPN002结合的Tau(游离的Tau)(图54A)；和与IPN002结合的Tau(结合的Tau)(图54B)的测定的示意图。
图55A和55B描绘了人胎儿神经元(HFN)的条件化培养基中Tau多肽对Aβ40(图55A)和Aβ42(图55B)水平的影响。
图56A和56B描绘了HFN的条件化培养基中抗-Tau抗体对Aβ40(图56A)和Aβ42(图56B)水平的影响。
图57A和57B描绘了HFN的条件化培养基中抗-Tau抗体对Aβ40(图57A)和Aβ42(图57B)水平的影响。
图58A和58B描绘了HFN的条件化培养基中抗-Tau抗体在5天(d5)、10天(d10)、15天(d15)、和20天(d20)的时段内对Aβ40(图58A)和Aβ42(图58B)水平的影响。
图59是显示多种抗体结合的Tau的区域的示意图。
图60描绘了IPN002的人源化变体在非人灵长类脑脊液中对Aβ水平的影响。
图61提供了2N4R Tau与eTau4比对的氨基酸序列。
定义
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白，保留对抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。可以例如用放射性同位素、生成可检测产物的酶、荧光蛋白等来可检测地标记抗体。抗体可以进一步与其它模块，诸如特异性结合对的成员，例如生物素(生物素-亲和素特异性结合对的成员)等缀合。抗体也可以与固体支持物结合，所述固体支持物包括但不限于聚苯乙烯板或珠，等等。该术语还涵盖Fab’、Fv、F(ab’)2、和或保留对抗原的特异性结合的其它抗体片段，和单克隆抗体。抗体可以是单价的或二价的。
如本文中使用的，术语“人源化免疫球蛋白”指包含不同起源的免疫球蛋白部分的免疫球蛋白，其中至少一个部分包含人起源的氨基酸序列。例如，人源化抗体可以包含来源于具有所需特异性的非人起源(如小鼠)的免疫球蛋白的部分和来源于人起源的免疫球蛋白序列的部分(例如嵌合免疫球蛋白)，它们通过常规技术(例如合成)化学连接在一起或者用遗传工程技术制备为连续多肽(例如编码嵌合抗体的蛋白部分的DNA，所述嵌合抗体可以表达产生连续多肽链)。人源化免疫球蛋白的另一个例子是含有一个或多个免疫球蛋白链的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白链包含来源于非人起源的抗体的CDR和来源于人起源的轻链和/或重链的框架区(例如具有或没有框架变化的CDR嫁接抗体)。术语人源化免疫球蛋白也涵盖嵌合或CDR嫁接的单链抗体。参见例如Cabilly等,美国专利No.4,816,567；Cabilly等,欧洲专利No.0,125,023 B1；Boss等,美国专利No.4,816,397；Boss等,欧洲专利No.0,120,694 B1；Neuberger,M.S.等,WO 86/01533；Neuberger,M.S.等,欧洲专利No.0,194,276B1；Winter,美国专利No.5,225,539；Winter,欧洲专利No.0,239,400 B1；Padlan,E.A.等,欧洲专利Application No.0,519,596 A1。关于单链抗体，还可参见Ladner等,美国专利No.4,946,778；Huston,美国专利No.5,476,786；和Bird,R.E.等,Science,242:423-426(1988))。
例如，可以使用合成和/或重组核酸制备编码所需的人源化链的基因(例如cDNA)来生成人源化免疫球蛋白。例如，可以使用PCR诱变法来改变编码人或人源化的链的DNA序列(例如来自之前已人源化的可变区的DNA模板)，来构建编码人源化可变区的核酸(例如DNA)序列(参见例如Kamman,M.,等,Nucl.Acids Res.,17:5404(1989))；Sato,K.,等,Cancer Research,53:851-856(1993)；Daugherty,B.L.等,Nucleic Acids Res.,19(9):2471-2476(1991)；和Lewis,A.P.和J.S.Crowe,Gene,101:297-302(1991))。使用这些或其它合适的方法，还可以容易地生成变体。例如，可以诱变克隆的可变区，并且可以选择编码具有所需特异性的变体的序列(例如从噬菌体文库中；参见例如Krebber等,美国专利No.5,514,548；Hoogenboom等,WO 93/06213,1993年4月1日出版)。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，例如，完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体(Zapata等，ProteinEng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶对抗体的消化生成两个各具有单个抗原结合位点的相同抗原结合片段(称作“Fab”片段)和残留的“Fc”片段(反映容易结晶的能力的名称)。胃蛋白酶处理生成F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点，并且仍能够交联抗原。
“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此区域由紧密的非共价连接的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。每个可变域的3个CDR在此构象中相互作用以限定VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。6个CDR共同对抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单个可变域(或Fv的一半，其仅包含对抗原有特异性的3个CDR)也具有识别并结合抗原的能力，尽管亲和力比完整的结合位点低。
“Fab”片段也含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab片段与Fab'片段的差异在于重链CH1域的羧基端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中Fab'的名称，其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离的硫醇基团。F(ab')2抗体片段最初以成对的Fab'片段生成，所述Fab'片段具有它们之间的铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是己知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”基于其恒定域的氨基酸序列可以归入两个明显不同的类型(称作κ和λ)之一。根据其重链的恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以归入不同的类别。存在有主要的5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL域，其中这些域存在于单一多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽进一步包含VH和VL域之间的多肽接头，其使sFv能够形成抗原结合的所需结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,卷113,Rosenburg和Moore编.,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一多肽链(VH-VL)中相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用短至不能容许同一链上的两个域之间进行配对的接头，迫使所述域与另一条链的互补域配对，并且创建两个抗原结合位点。双抗体更完整描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448中.
如本文中使用的，术语“亲和力”指两种药剂(例如抗体和抗原)的可逆结合的平衡常数，并且表示为解离常数(Kd)。亲和力可以比抗体对无关氨基酸序列的亲和力大至少1倍，大至少2倍，大至少3倍，大至少4倍，大至少5倍，大至少6倍，大至少7倍，大至少8倍，大至少9倍，大至少10倍，大至少20倍，大至少30倍，大至少40倍，大至少50倍，大至少60倍，大至少70倍，大至少80倍，大至少90倍，大至少100倍，或大至少1000倍或更多。抗体对靶蛋白的亲和力可以是例如约100纳摩尔(nM)至约0.1nM，约100nM至约1皮摩尔(pM)，或约100nM至约1飞摩尔(fM)或更多。如本文中使用的，术语“亲合力”指两个或更多个药剂的复合物对稀释后解离的抗性。术语“免疫反应性”和“优先结合”就抗体和/或抗原结合片段而言在本文中可互换使用。
术语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、和离子和/或氢键相互作用，包括如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。主题抗-Tau抗体特异性结合至Tau多肽内的表位。非特异性结合会指以小于约10-7M的亲和力结合，例如以10-6M，10-5M，10-4M等的亲和力结合。
如本文中使用的，术语“CDR”或“互补决定区”意指重链和轻链多肽两者的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。CDR已经由Kabat等,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of proteinsof immunological interest”(1991)；由Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；和MacCallum等,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)描述，其中限定包括在彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。不过，任一限定指抗体或嫁接抗体或其变体的CDR的应用意在本文中限定并使用的术语的范围内。涵盖了如通过每篇上文引用的参考文献限定的CDR的氨基酸残基在下文表1中列出作为比较。
表1：CDR限定
<u>Kabat<sup>1</sup>(序列表)<sup>2</sup></u> <u>Chothia<sup>3</sup></u> <u>MacCallum<sup>4</sup></u>
V<sub>H</sub> CDR1 31-35(31-35) 26-32 30-35
V<sub>H</sub> CDR2 50-65(50-66) 53-55 47-58
V<sub>H</sub> CDR3 95-102(99-106) 96-101 93-101
V<sub>L</sub> CDR1 24-34(24-39) 26-32 30-36
V<sub>L</sub> CDR2 50-56(55-61) 50-52 46-55
V<sub>L</sub> CDR3 89-97(94-102) 91-96 89-96
1残基编号遵循Kabat等的命名法，见上文
2根据编号所对应的残基在序列表中提供
3残基编号遵循Chothia等的命名法，见上文
4残基编号遵循MacCallum等的命名法，见上文
如本文中使用的，术语“框架”在提及抗体可变区使用时意指抗体的可变区内的CDR区外部的所有氨基酸残基。可变区框架通常是长度为约100-120个氨基酸的不连续的氨基酸序列，但是意图仅指CDR外部的那些氨基酸。如本文中使用的，术语“框架区”意图指以CDR隔开的框架的每个域。
“分离的”抗体指已经从其天然环境的组分鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染性组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素、和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。在一些实施方案中，抗体会纯化(1)至大于90％、大于95％、或大于98％(按抗体重量计)，如通过Lowry法所确定的，例如超过99％(按重量计)，(2)至足以通过使用旋转杯序列分析仪(spinning cup sequenator)获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至同质性，其通过使用考马斯蓝或银染在还原性或非还原性条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。分离的抗体包括重组细胞内原位的抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分不会存在。在一些情况中，通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码的和非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生化的氨基酸，和具有经修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列(具有或没有N端甲硫氨酸残基)的融合物；带免疫学标签的蛋白质(immunologically tagged protein)；等等。
如本文中使用的，术语“治疗”和“处理”指获得期望的药理和/或生理效果。效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是防范性的和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不利影响而言可以是治疗性的。如本文中使用的，“治疗/处理”涵盖哺乳动物中，特别是人中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在受试者中发生，所述受试者可以具有疾病的素因，但是尚未诊断为具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滞其形成；和(c)减轻疾病，即引起疾病消退。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于鼠(大鼠，小鼠)、非人灵长类、人、犬、猫、有蹄动物(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)等。
“治疗有效量”或“有效量”指在对哺乳动物或其它受试者施用以治疗疾病时足以实现对疾病的所述治疗的抗-Tau抗体量。“治疗有效量”会根据抗-Tau抗体、要治疗的受试者的疾病和其严重性以及年龄、重量等而变化。
“生物样品”涵盖从个体获得的多种样品类型，并且可以在诊断或监测测定法中使用。该定义涵盖生物来源的血液和其它液体样品，实体组织样品，如活组织检查样本或组织培养物或自其衍生的细胞及其后代。该定义还包括在其获得后已经以任何方式操作的样品，如多核苷酸，所述操作如通过用试剂处理，溶解，或富集某些组分。术语“生物样品”涵盖临床样品，并且还包括培养的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体、和组织样品。术语“生物样品”包括尿液、唾液、脑脊液、血液级分，如血浆和血清，等等。
在进一步描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方案，因此，其当然可以变化。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体的实施方案，而并不意为限制性的，因为本发明的范围仅会以所附权利要求书限定。
在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值(至下限单位的十分之一，上下文另有明确叙述的除外)涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义，本文中使用的所有科技术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。本文中提及的所有出版物在此通过提及并入本文以公开并描述引用的出版物结合的方法和/或材料。
应当注意到，如本文中和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“人源化抗-Tau抗体”包括多个所述抗体，并且提及“tau病变”包括提及一种或多种tau病变及本领域技术人员已知的其等价物，等等。进一步注意到权利要求书可以以排除任何可选要素的方式撰写。因此，对于结合权利要求要素叙述使用诸如“单独”、“仅”等排除式术语，或使用“否定”限制，此叙述意在充当前项基础。
应当了解，本发明的某些特征(为了清楚，其在不同实施方案的背景中使用)也可以与单个实施方案结合提供。相反，本发明的多个特征(为了简短，其在单个实施方案的背景中描述)也可以分开提供或在任何合适的亚组合中提供。本发明明确涵盖了属于本发明的实施方案的所有组合，并且其在本文中公开，就像每一个组合单独且明确公开一样。另外，本发明还明确涵盖各个实施方案及其要素的所有亚组合，并且在本文中公开，就像每一个此类亚组合单独且明确在本文中公开一样。
本文中讨论的出版物仅提供其在本申请的提交日前的公开内容。凭借在先发明，本文中的任何内容不应解释为承认本发明没有资格早于此类出版物。此外，提供的出版物的日期可能不同于实际出版日，这可能需要单独确认。
发明详述
本发明提供了治疗tau病变的方法，其涉及施用抗-Tau抗体。本发明还提供了在方法中使用的抗-Tau抗体和包含抗-Tau抗体的制剂。本发明进一步提供了使用本文中描述的抗-Tau抗体的体外和体内检测方法。
治疗Tau病变的方法
本发明提供了治疗tau病变的方法。该方法一般涉及对其由需要的个体施用有效量的本发明的抗-Tau抗体。在一些情况中，主题抗-Tau抗体的施用降低个体的细胞、组织、或流体中病理性Tau多肽的水平，并治疗tau病变。
在一些情况中，本发明的方法涉及通过施用抗-Tau抗体来减少β-淀粉样蛋白(Amyloid beta)(Aβ)(例如神经元细胞和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中的Aβ40和/或Aβ42)，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸1-158内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R Tau氨基酸序列。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸2-18内的氨基酸残基。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位是线性表位，且其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸2-68内的氨基酸残基。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau4多肽，所述eTau4多肽与SEQ ID NO:48(eTau4；示于图61中)中所示的氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％、或至少100％氨基酸序列同一性。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau多肽内的线性表位，其中所述表位在Tau的氨基酸2-68内。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau多肽内的线性表位，其中所述表位在Tau的氨基酸15-24内。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸7-13内的氨基酸残基，例如氨基酸EFEVMED(SEQ ID NO:87)。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸25-30内的氨基酸残基，例如氨基酸DQGGYT(SEQ ID NO:88)。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸28-126内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R Tau氨基酸序列。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸150-158内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R Tau氨基酸序列。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸19-46内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R Tau氨基酸序列。
在一些情况中，本发明的方法涉及通过施用特异性地结合胞外Tau(eTau)的抗体来减少β-淀粉样蛋白(Aβ)(例如神经元细胞和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中的Aβ40和/或Aβ42)，其中所述抗体结合的表位包含eTau的氨基酸1-158内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R Tau氨基酸序列。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸2-18内的氨基酸残基。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau，其中所述抗体结合的表位是线性表位，且其中所述抗体结合的表位包含eTau的氨基酸2-68内的氨基酸残基。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau4多肽，所述eTau4多肽与SEQID NO:48(eTau4；示于图61中)中所示的氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％、或至少100％氨基酸序列同一性。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau多肽内的线性表位，其中所述表位在Tau的氨基酸2-68内。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau多肽内的线性表位，其中所述表位在Tau的氨基酸15-24内。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau，其中所述抗体结合的表位包含eTau的氨基酸7-13内的氨基酸残基，例如氨基酸EFEVMED(SEQ ID NO:87)。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau，其中所述抗体结合的表位包含eTau的氨基酸25-30内的氨基酸残基，例如氨基酸DQGGYT(SEQ ID NO:88)。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau，其中所述抗体结合的表位包含eTau的氨基酸28-126内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R Tau氨基酸序列。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau，其中所述抗体结合的表位包含eTau的氨基酸150-158内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R Tau氨基酸序列。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸19-46内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R Tau氨基酸序列。
例如，在一些实施方案中，主题方法可以包括将有效量的分离的人源化单克隆抗体施用于对其有需要的个体，所述单克隆抗体特异性地结合Tau多肽的氨基酸15-24内的表位。在一些实施方案中，所述抗体与药学上可接受的赋形剂一起存在于药物制剂中，例如适于对人施用的药学上可接受的赋形剂。
例如，在一些实施方案中，主题方法可以包括将有效量的分离的抗体施用于对其有需要的个体，所述分离的抗体包含人源化的轻链框架区；和人源化的重链框架区，其中所述分离的抗体与另一抗体竞争结合至Tau多肽的N末端区中的表位，所述另一抗体包含：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VLCDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体与药学上可接受的赋形剂一起存在于药物制剂中，例如适于对人施用的药学上可接受的赋形剂。
例如，在一些实施方案中，主题方法可以包括将有效量的分离的抗体施用于对其有需要的个体，其中所述抗体是Fv、scFv、Fab、F(ab')2、或Fab'，并且其中所述抗体与另一抗体竞争结合至Tau多肽的N末端区中的表位，所述另一抗体包含：a)轻链区，其包含(i)VLCDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体与药学上可接受的赋形剂一起存在于药物制剂中，例如适于对人施用的药学上可接受的赋形剂。
例如，在一些实施方案中，主题方法可以包括将有效量的分离的抗体施用于对其有需要的个体，其中所述分离的抗体包含人轻链恒定区和人重链恒定区，并且所述分离的抗体与另一抗体竞争结合至Tau多肽的N末端区中的表位，所述另一抗体包含：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体与药学上可接受的赋形剂一起存在于药物制剂中，例如适于对人施用的药学上可接受的赋形剂。
本发明的抗-Tau抗体结合胞外tau。如本文所用的，“胞外tau”(“eTau”)涵盖脑脊液或(CSF)间质液(ISF)中能检测到的任何Tau多肽。在一些实施方案中，eTau是长度为175个氨基酸、包含全长tau的氨基酸2-176的多肽，例如，在一些实施方案中eTau是包含SEQ IDNO:45中所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，eTau是长度为171个氨基酸且包含全长tau的氨基酸2-172(SEQ ID NO:44)的多肽；例如，在一些实施方案中eTau是包含SEQ IDNO:44中所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，eTau是包含SEQ ID NO:46中所示氨基酸序列的eTau-2多肽。在一些实施方案中，是eTau是包含SEQ ID NO:47中所示氨基酸序列的eTau-3多肽。eTau是包含SEQ ID NO:48中所示氨基酸序列的eTau-4多肽。
在一些情况中，eTau多肽的长度是约50个氨基酸至约175个氨基酸，例如约50个氨基酸至约75个氨基酸、约75个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约125个氨基酸、约125个氨基酸至约150个氨基酸、或约150个氨基酸至约175个氨基酸；并可以包含全长tau的氨基酸2-176的50至约75、约75至约100、约100至约125、约125至约150、或约150至约175个连续氨基酸。示例性的eTau多肽如图20中所示。
如下文更为详细描述的，本发明的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中被抗原结合的表位是线性表位，且包含Tau的氨基端(N末端)部分内，例如Tau的氨基酸1-25内、Tau的氨基酸1-18内、Tau的氨基酸9至18内、Tau的氨基酸13-24内、Tau的氨基酸15-44内、或Tau的氨基酸15-24内的氨基酸残基。人Tau同种型的氨基酸序列如图6A-D中所示。Tau的氨基酸1-18为：MAEPRQEFEVMEDHAGTY(SEQ ID NO:53)。参见例如Garcia-Sierra等(2003)J.Alzheimer’s Disease 5:65；和Horowitz等(2004)J.Neurosci.24:7895.Tau的氨基酸15-24为：AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)。
在一些实施方案中，本发明的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中被抗体结合的表位是线性表位，且包含Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内的氨基酸残基。在一些情况中，本发明的人源化抗-Tau抗体特异性地结合包含Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内的氨基酸残基的线性表位，其中所述表位不包含磷酸化的氨基酸。在一些情况中，本发明的人源化抗-Tau抗体特异性地结合包含Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内的氨基酸残基的线性表位，其中所述表位包含磷酸化的氨基酸。在一些情况中，本发明的人源化抗-Tau抗体特异性地结合包含Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内的氨基酸残基的线性表位，其中所述表位不包含硝化的氨基酸。在一些情况中，本发明的人源化抗-Tau抗体特异性地结合包含Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内的氨基酸残基的线性表位，其中所述表位包含硝化的氨基酸。在一些情况中，本发明的人源化抗-Tau抗体特异性地结合线性表位，所述线性表位包含Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内的氨基酸残基，其中所述表位包含硝化的氨基酸，并且不包含磷酸化的氨基酸。在一些情况中，本发明的人源化抗Tau扰体特异性地结合线性表位，所述线性表位包含Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内的氨基酸残基，其中所述表位所述包含磷酸化的氨基酸，并且不包含硝化的氨基酸。在一些情况中，本发明的人源化抗-Tau抗体特异性地结合线性表位，所述线性表位包含Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内的氨基酸残基，其中所述表位包含硝化的氨基酸和磷酸化的氨基酸。
例如，在一些实施方案中，本发明的抗-Tau抗体特异性地结合线性表位，所述线性表位包含Tau的氨基酸AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)内的氨基酸残基。在一些实施方案中，本发明的人源化抗-Tau抗体特异性地结合线性表位，所述线性表位包含Tau的氨基酸AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)内的氨基酸残基。
在一些情况中，本发明的人源化抗-Tau抗体特异性地结合线性表位，所述线性表位包含Tau的氨基酸AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)内的氨基酸残基，其中所述表位不包含磷酸化的氨基酸。在一些情况中，本发明的人源化抗-Tau抗体特异性地结合线性表位，所述线性表位包含Tau的氨基酸AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)内的氨基酸残基，其中所述表位包含磷酸化的氨基酸。在一些情况中，本发明的人源化抗-Tau抗体特异性地结合线性表位，所述线性表位包含Tau的氨基酸AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)内的氨基酸残基，其中所述表位不包含硝化的氨基酸。在一些情况中，本发明的人源化抗-Tau抗体特异性地结合线性表位，所述线性表位包含Tau的氨基酸AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)内的氨基酸残基，其中所述表位包含硝化的氨基酸。在一些情况中，本发明的人源化抗-Tau抗体特异性地结合线性表位，所述线性表位包含Tau的氨基酸AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)内的氨基酸残基，其中所述表位包含硝化的氨基酸，并且不包含磷酸化的氨基酸。在一些情况中，本发明的人源化抗-Tau抗体特异性地结合线性表位，所述线性表位包含Tau的氨基酸AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)内的氨基酸残基，其中所示表位包含磷酸化的氨基酸，并且不包含硝化的氨基酸。在一些情况中，本发明的人源化抗-Tau抗体特异性结合线性表位，所述线性表位包含Tau的氨基酸AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)内的氨基酸残基，其中所述表位包含硝化的氨基酸和磷酸化的氨基酸。
在一些情况中，本发明用于治疗tau病变的方法包括对其有需要的个体施用药物组合物，该药物组合物包含：a)抗-Tau抗体，其包含：i)图1中所示的抗体的1、2或3个轻链互补决定区(CDR)；和图1中所示的抗体的1、2或3个重链CDR；或ii)图2中所示的抗体的1、2或3个轻链CDR；和图2中所示的抗体的1、2或3个重链CDR；和b)适于对人施用的药学上可接受的赋形剂。
在一些情况中，用于治疗tau病变的本发明的方法包括对其有需要的个体施用药物组合物，该药物组合物包含：a)特异性地结合人Tau多肽内的表位的抗体，其中所述抗体与包含如下结构的抗体竞争结合所述表位：i)图1B中所示的抗体的轻链互补决定区(CDR)；和图1A中所示的抗体的重链CDR；或ii)图2B中所示的抗体的轻链CDR；和图2A中所示的抗体的重链CDR；和b)适于对人施用的药学上可接受的赋形剂。
在一些情况中，本发明用于治疗tau病变的方法包括对其有需要的个体施用药物组合物，该药物组合物包含：a)抗体，该抗体与人源化IPN002(hu-IPN002)竞争结合至Tau中由hu-IPN002识别的表位(例如Tau的N端部分内，例如Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸1-18内，Tau的氨基酸9至18内，Tau的氨基酸15-44内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内的线性表位)；和b)适于对人施用的药学上可接受的赋形剂。
IPN001(在本文中又称为“IPN1”或“IPN-1”)和IPN002(在本文中又称为“IPN2”或“IPN-2”)特异性地结合Tau。IPN001结合的表位是线性表位，并且包含Tau的氨基端(N末端)部分内，例如Tau的氨基酸1-25内的氨基酸残基。
在一些实例中，适合于在治疗tau病变的方法中使用的本发明的抗-Tau抗体包含：a)轻链可变区，其包含：i)IPN001抗体的1、2或3个VL CDR；和ii)人源化轻链框架区；以及b)重链可变区，其包含：i)IPN001抗体的1、2或3个VH CDR；和ii)人源化重链框架区；其中所述VH和VL CDR如Kabat限定(参见例如上文表1；和Kabat等,U.S.Dept.of Health and HumanServices,“Sequences of proteins of immunological interest”(1991))。
在一些情况中，适合于在治疗tau病变的方法中使用的本发明的抗Tau抗体包括：a)轻链区，其包含：i)IPN001抗体的1、2或3个VL CDR；和ii)人源化轻链框架区；以及b)重链区，其包含：i)IPN001抗体的1、2或3个VH CDR；和ii)人源化重链框架区；其中所述VH和VLCDR如Chothia限定(参见例如上文表1；和Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
在其他例子中，适合于在治疗tau病变的方法中使用的本发明的抗-Tau抗体包含：a)轻链区，其包含：i)IPN002抗体的1、2或3个VL CDR；和i)人源化轻链框架区；以及b)重链区，其包含：i)IPN002抗体的1、2或3个VHCDR；和ii)人源化重链框架区；其中所述VH和VL CDR如Kabat限定(参见例如上文表1；和Kabat等,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of proteins of immunological interest”(1991))。
在其他例子中，本发明的抗-Tau抗体(例如特异性结合Tau多肽中的表位的主题抗体，其中所述表位在Tau的氨基端(N末端)部分内，例如Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸1-18内，Tau的氨基酸9至18内，Tau的氨基酸15-44内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内)包含：a)轻链区，其包含：i)IPN002抗体的1、2或3个VL CDR；和ii)人源化轻链框架区；以及b)重链区，其包含：i)IPN002抗体的1、2或3个VH CDR；和ii)人源化重链框架区；其中所述VH和VL CDR如Chothia限定(参见例如上文表1；和Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
在一些情况中，用于治疗tau病变的本发明的方法包括将有效量的药物组合物施用于对其有需要的个体，该药物组合物包含：a)抗体，其特异性结合Tau的氨基端(N末端)部分内，例如Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸1-18内，Tau的氨基酸9至18内(其中Tau的氨基酸1-18是：MAEPRQEFEVMEDHAGTY；SEQ ID NO:53)，Tau的氨基酸15-44内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内(其中Tau的氨基酸15-24是：AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51))的线性表位，其中所述抗体包含：(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；(iv)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:10的氨基酸序列；(v)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(vi)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列；和b)适于对人施用的药学上可接受的赋形剂，
图1A和1B中描绘了IPN001的VH和VL氨基酸序列。CDR(如Kabat所限定的)为粗体文本且加下划线。图2A和2B中描绘了IPN002的VH和VL氨基酸序列。CDR(如Kabat所限定的)为粗体文本且加下划线。
SEQ ID NOs:1-12如下文所示：
RSSQTILHSNGNTYLE(SEQ ID NO:1)；
KVSKRFS(SEQ ID NO:2)；
FQGSLVPWA(SEQ ID NO:3)；
SYGMS(SEQ ID NO:4)；
TISSSGSRTYFPDSVKG(SEQ ID NO:5)；
TWDGAMDY(SEQ ID NO:6)；
KSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:7)；
KVSNRFS(SEQ ID NO:8)；
FQGSLVPWA(SEQ ID NO:9)；
KYGMS(SEQ ID NO:10)；
TISSSGSRTYYPDSVKG(SEQ ID NO:11)；
SWDGAMDY(SEQ ID NO:12).
在一些情况中，抗体包含人源化轻链框架区和/或人源化重链框架区。下文更为详细地描述了人源化的抗-Tau抗体。
tau病变是以个体的细胞、组织或体液中异常的tau水平为特征的病症。在一些情况中，tau病变以细胞、组织或体液中存在升高(高于正常)的tau或Tau多肽水平和/或tau的病理形式为特征。例如，在一些情况中，tau病变以脑组织和/或脑脊液中存在升高(高于正常)的tau或Tau多肽水平和/或tau的病理形式为特征。细胞、组织或体液中“高于正常”的tau水平指示组织或流体中的tau水平高于正常对照永平，例如高于相同年龄组的个体或个体群体的正常对照水平。参见Blomberg等(2001)“Cerebrospinal fluid tau levelsincrease with age in healthy individuals”Dement.Geriatr.Cogn.Disord.12:127。在一些情况中，患有tau病变的个体展现出tau病变的一种或多种其他的症状(例如认知下降)。
在其他情况中，tau病变以细胞、组织或体液中存在低于正常的tau水平为特征。组织或流体中“低于正常”的tau水平指示细胞、组织或体液中的tau水平低于正常、对照水平，例如低于相同年龄组的个体或个体群体的正常、对照水平。
阿尔茨海默氏病和额颞痴呆的某些形式(匹克(Pick)氏病、散发性额颞痴呆和与第17号染色体有关的额颞痴呆伴帕金森病(Parkinsonism))是tau病变的最常见形式。本发明提供了如上文描述的治疗方法，其中tau病变是阿尔茨海默氏、匹克氏病、散发性额颞痴呆和与第17号染色体有关的额颞痴呆伴帕金森病。其他tau病变包括但不限于进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底变性(CBD)和亚急性硬化性全脑炎(Subacute sclerosingpanencephalitis)。
神经变性性tau病变包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化(amyotrophiclateral sclerosis)/帕金森病-痴呆综合症(parkinsonism-dementia complex)、嗜银颗粒性痴呆(argyrophilic grain dementia)、英国型淀粉样血管病(British type amyloidangiopathy)、脑淀粉样血管病(cerebral amyloid angiopathy)、皮质基底变性、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、拳击员痴呆(dementia pugilistica)、弥散性神经原纤维缠结伴有钙化、唐氏综合征(Down's syndrome)、额颞痴呆(FTD)、与染色体17有关的额颞叶痴呆伴帕金森病、额颞叶变性、格斯特曼-施特劳斯纳-杉克病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、包涵体肌炎(inclusion body myositis)、多系统萎缩(multiple system atrophy)、肌强直性营养不良(myotonic dystrophy)、尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease)C型、非关岛运动神经元病(non-Guamanian motor neuron disease)伴神经原纤维缠结、皮克氏病(Pick'sdisease)、脑炎后帕金森病(postencephalitic parkinsonism)、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病(prion protein cerebral amyloid angiopathy)、进行性皮质下神经胶质增生(progressive subcortical gliosis)、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎(subacute sclerosing panencephalitis)、仅缠结痴呆(Tangle only dementia)、多发性梗死性痴呆(multi-infarct dementia)、缺血性中风(ischemic stroke)、慢性创伤性脑病(chronic traumatic encephalopathy，CTE)、创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)和中风。
本发明还提供了治疗共核蛋白病(synucleinopathy)，例如帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)；路易体痴呆(dementia with Lewy Bodies，DLB)；多器官萎缩(MSA)等的方法。例如，PD伴有痴呆(PDD)可以用主题方法治疗。
在一个实施方案中，本发明的抗-Tau抗体阻止或延缓受试者中神经变性性tau病变的至少一种症状的发作。在一个实施方案中，主题抗-Tau抗体降低或消除受试者中神经变性tau病变的至少一种症状。所述症状可以是在受试者的脑或脊髓中形成下列一项或多项：病理性tau沉积物；胞外可溶性Tau和/或Tau片段；超磷酸化的Tau沉积物；不溶性tau沉积物；神经原纤维缠结；神经原纤维纤维；前缠结磷酸-tau聚集体(pre-tangle phospho-tau aggregate)；神经元内神经原纤维缠结；神经元过度活跃；和神经元外神经原纤维缠结。所述症状可以是神经学症状，例如，受损的认知功能、记忆损伤、运动功能丧失，等等。在一些情况中，本发明的抗-Tau抗体可以改善认知功能。在一些情况中，本发明的抗-Tau抗体可以降低认知功能的下降速率。在一些情况中，本发明的抗-Tau抗体可以改善运动功能。在一些情况中，本发明的抗-Tau抗体可以降低运动功能的下降速率。
症状也可以是个体的CSF中的Tau多肽水平。例如，在一些实施方案中，与在用抗Tau抗体治疗前个体的CSF中的Tau多肽水平相比，主题抗-Tau抗体在作为单一疗法或在联合疗法中以一剂或多剂对患有tau病变的个体施用时将个体的CSF中的Tau多肽水平降低至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，或超过50％。
对个体施用主题抗-Tau抗体可以导致下列一项或多项：脑组织中游离的胞外tau量减少；tau(例如Tau片段)的神经元至神经元扩散的降低(例如神经元至神经元扩散)；tau聚集体(例如胞内(例如神经元内)tau聚集体)量的减少；脑组织中神经原纤维缠结量的减少；小胶质细胞活化和/或星形胶质细胞活化水平的降低；磷酸化的Tau量的减少；超磷酸化的Tau量的减少；总的Tau(例如总胞内Tau；和/或总胞外Tau)的减少；游离的Tau(例如不与主题抗-Tau抗体结合的Tau)减少；神经元过度活跃的降低；和N末端Tau片段量的减少。“总的Tau”可以包括任何同种型的全长Tau；和存在并且展示出被主题抗-Tau抗体识别的表位的任何N末端Tau片段的总和。人全长Tau的氨基酸序列呈现于图6A-D中。可以使用任何己知的方法，例如使用抗磷酸-Tau抗体的免疫学方法，来测定磷酸化的Tau的减少。
主题抗-Tau抗体对个体的施用可以导致下列一项或多项的变化：a)脑组织中游离的胞外tau的量；b)间质液(ISF)中游离的胞外tau的量；c)脑脊液(CSF)中游离的胞外tau的量；d)tau的神经元至神经元扩散；e)神经元内tau聚集体的量；f)小胶质细胞和/或星形胶质细胞活化的程度；g)磷酸化的或超磷酸化的Tau的量；h)ISF或CSF中总的Tau或游离的tau的量；i)胞内N末端tau片段的量；j)神经元过度活跃；k)CSF中Aβ40和/或Aβ42的量；l)Aβ斑负荷；m)Aβ40和/或Aβ42自神经元的分泌；n)淀粉样前体蛋白(APP)促进剂活性；o)APP mRNA和/或蛋白质水平；p)β-分泌酶和/或γ分泌酶的活性；q)Aβ诱导的信号传输途径的活化状态；r)胞内总的tau或游离的tau的量；s)ISF或CSF中抗Tau抗体结合的tau的量；和t)胞内抗-Tau抗体结合的tau的量。
在一些情况中，个体施用主题抗-Tau抗体可以改善个体的认知功能，或至少降低个体的认知功能的下降速率。
在一些情况中，与施用抗-Tau抗体前个体中游离的胞外tau多肽量相比，主题抗Tau抗体对个体的施用将游离的胞外tau多肽量(例如脑组织中的游离的胞外tau多肽量)减少至少约10％，至少约20％，至少约25％，至少约50％，或超过50％。
在一些情况中，与用施用主题抗-Tau抗体前的细胞至细胞扩散相比，对个体施用主题抗-Tau抗体将Tau多肽(例如病理性Tau多肽)的细胞至细胞(例如神经元至神经元)扩散降低至少约10％，至少约20％，至少约25％，至少约50％，或超过50％。
在一些情况中，与施用抗-Tau抗体前的tau聚集体的量相比，主题抗-Tau抗体对个体的施用将tau聚集体(例如胞内(例如神经元内)tau聚集体)的量减少至少约10％，至少约20％，至少约25％，至少约50％，或超过50％。
在一些情况中，对个体施用主题抗-Tau抗体降低个体中的神经毒性；和/或降低个体中的神经炎症；和/或降低星形胶质细胞和小胶质细胞细胞的活化；和/或降低病理性电生理效应的诱导；和/或降低外来体(exosome)中的tau量。
在一些情况中，与施用抗-Tau抗体前神经元过度活跃程度的水平相比，对个体施用主题抗Tau抗体将神经元过度活跃降低至少约10％，至少约20％，至少约25％，至少约50％，或超过50％。在一些情况中，对个体施用主题抗-Tau抗体将神经元过度活跃降低至少约10％，至少约20％，至少约25％，至少约50％，或超过50％，如通过神经元的全细胞膜片钳所记录的；例如来源于诱导多能性干细胞的皮质神经元(iPSC-CN)或人皮质神经元培养物(HCC)的全细胞膜片钳记汞所测定的。
可以通过不同方式，例如通过静脉内，腹膜内，皮下，颅内，鞘内，动脉内(例如经由颈动脉)，肌内，鼻内，表面或皮内施用或脊髓或脑投递来实现合适的组合物的施用。气溶胶制剂如鼻喷雾制剂包含活性剂的纯化的水性或其它溶液及防腐剂和等渗剂。将此类制剂调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。
在一些情况中，以如下的方式修饰或配制主题抗-Tau抗体，从而提供抗体穿过血脑屏障的能力。可以通过各种肠内和胃肠外施用路径，包括口服，静脉内等对患有tau病变的个体施用此类抗体或抗体组合物。
用于胃肠外施用的制备物包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性(alcoholic)/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖和氯化钠、林格氏乳酸盐(lactated Ringer's)、或固定油。静脉内媒介物包含液体和营养补充物、电解质补充物(如基于林格氏右旋糖的那些)，等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体，等等。此外，根据药学组合物的意图用途，本发明的药物组合物可以包含其他药剂，诸如多巴胺或精神药理学药物。
主治医师或其他医学人员会基于各种临床因素确定剂量方案。如医学领域中公知的，任一患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、施用次数和路径、总体健康、和同时施用的其它药物。主题抗-Tau抗体的剂量范围可以例如为0.001μg至1000μg；然而，高于或低于此例示性范围的剂量也涵盖在内，特别是考虑到上述的因素。一般来说，剂量范围可以为例如约0.0001至100mg/kg，或约0.01至5mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg，2mg/kg等等)宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围，或至少1mg/kg。上述范围中的中间剂量也意图在本发明的范围内。受试者可以每天、隔天(on alternative days)、每周或根据通过经验分析确定的任何其它日程表施用此类剂量。一种例示性的治疗必需在例如至少6个月的延长时段里多剂施用。其它例示性的治疗方案必需每两周一次或一月一次或每3至6个月一次施用。例示性的剂量日程表包括连续几天1-10mg/kg或15mg/kg，隔天30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，同时施用两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，在该情况中施用的每种抗体的剂量落在指定的范围内。可以通过定期评估监测进展。
联合疗法
可以单独(例如作为单一疗法)；或在与一种或多种额外的治疗剂的联合疗法中对有此需要的个体施用本发明的抗-Tau抗体。
为了治疗AD，合适的额外的治疗剂包括但不限于乙酰胆碱酯酶抑制剂，包括但不限于安理申(Aricept)(多奈哌齐(donepezil))、艾斯能(Exelon)(利凡斯的明(rivastigmine))、美曲膦酯(metrifonate)、和他克林(tacrine)(Cognex)；抗-Aβ抗体；非类固醇消炎剂，包括但不限于布洛芬(ibuprofen)和茚甲新(indomethacin)；环加氧酶-2(Cox2)抑制剂，如西乐葆(Celebrex)；和单胺氧化酶抑制剂，如司来吉兰(Selegilene)(Eldepryl或Deprenyl)。每种上述药剂的剂量是本领域中己知的。
在治疗AD中的另一种合适的额外的治疗剂是抑制tau聚集的药剂，例如抑制tau聚集的萘醌衍生物，如美国专利No.7,605,179中所记载的。另一种合适的额外的治疗剂是抑制tau磷酸化的药剂，例如抑制tau蛋白激酶1的3-取代-4-嘧啶酮衍生物，如美国专利No.7,572,793中所记载的。
如本文中使用的，“与…组合”指如下的用途，其中例如第一化合物在第二化合物的整个施用过程期间施用；其中第一化合物施用的一段时间与第二化合物的施用重叠，例如其中第一化合物的施用在第二化合物的施用前开始，并且第一化合物的施用在第二化合物的施用结束前结束；其中第二化合物的施用在第一化合物的施用前开始，并且第二化合物的施用在第一化合物的施用结束前结束；其中第一化合物的施用在第二化合物的施用开始前开始，并且第二化合物的施用在第一化合物的施用结束前结束；其中第二化合物的施用在第一化合物的施用开始前开始，并且第一化合物的施用在第二化合物的施用结束前结束。因此，“组合”也可以指涉及两种或更多种化合物的施用的方案。如本文中使用的，“与……组合”也指可以在相同或不同制剂中，通过相同或不同路径，及在相同或不同剂量形式类型中施用的两种或更多种化合物的施用。
要治疗的个体
适合于用主题抗-Tau抗体治疗的个体包括已经诊断为患有tau病变的个体；在患上tau病变方面比一般人群具有更大风险的个体(例如具有形成tau病变的遗传易感性的个体)；具有PDD的个体；等等。在一些情况中，所述个体是成年人。在一些情况中，成年人是30岁龄或更年长；40岁龄或更年长，50岁龄或更年长，60岁龄或更年长，70岁龄或更年长，或80岁龄或更年长。例如，成年人可以是40岁至50岁，50岁至60岁，60岁至70岁，或年龄超过70岁。
降低Aβ40和Aβ42水平的方法
本发明提供了降低个体的神经元细胞和/或细胞外液中的β-淀粉样多肽水平(例如Aβ40和/或Aβ42)的方法。该方法一般涉及对个体施用：a)有效量的特异性结合Tau多肽的N末端区域的抗体；或b)包含所述抗体的药物组合物。在一些情况中，所述抗体是人源化的。所述细胞外液可以是例如CSF、ISF、或血液级分如血浆或血清。
在一些情况中，结合Tau多肽的N末端区域并且适于在用于减少神经元细胞和/或细胞外液中的Aβ40和Aβ42的主题方法中使用的抗体是如下的抗体，其结合Tau的氨基酸2-176内的，例如Tau的氨基酸2-15，氨基酸15-24，氨基酸24-50，氨基酸2-25，氨基酸15至50，氨基酸50至75，氨基酸40至60，氨基酸75至100，氨基酸60至80，氨基酸100至125，氨基酸80-115，氨基酸125至150，氨基酸115至140，氨基酸150至176，或氨基酸140至160内的Tau表位。图20中描绘了例示性的Tau多肽；降低个体的神经元细胞和/或细胞外液中的Aβ40和/或Aβ42水平的抗体可以是特异性结合图20中所示的Tau多肽中的表位的人源化抗体。
结合Tau多肽的N末端区域并且适于在用于减少神经元细胞和/或细胞外液中的Aβ40和Aβ42的主题方法中使用的人源化抗体是如下的人源化抗体，其结合Tau的氨基酸2-176内的，例如Tau的氨基酸2-15，氨基酸15-24，氨基酸24-50，氨基酸2-25，氨基酸15至50，氨基酸50至75，氨基酸40至60，氨基酸75至100，氨基酸60至80，氨基酸100至125，氨基酸80-115，氨基酸125至150，氨基酸115至140，氨基酸150至176，或氨基酸140至160内的Tau表位。图20中描绘了例示性的Tau多肽；降低个体的神经元细胞和/或细胞外液中的Aβ40和/或Aβ42水平的抗体可以是特异性结合图20中所示的Tau多肽中的表位的人源化抗体。
在一些情况中，降低个体的神经元细胞和/或细胞外液中的Aβ40和/或Aβ42水平并且适于在主题方法中使用的抗体是本发明的人源化抗-Tau抗体。在一些情况中，所述抗体是结合Tau的氨基酸15-24内的表位的人源化抗体。
在一些情况中，结合Tau多肽的N末端区域且适于在用于减少神经元细胞和/或细胞外液(例如CSF、ISF、或血液级分如血浆或血清)中的Aβ40和Aβ42的主题方法中使用的抗体是如下的抗体，其结合Tau的氨基酸1-158内的Tau表位，例如氨基酸1-15，氨基酸7-13，氨基酸2-18，氨基酸15-24，氨基酸24-50，氨基酸2-25，氨基酸25-30，氨基酸15至50，氨基酸19-46，氨基酸28-126，氨基酸50至75，氨基酸40至60，氨基酸75至100，氨基酸60至80，氨基酸100至125，氨基酸80-115，氨基酸125至150，氨基酸115至140，或氨基酸150至158内的Tau表位，其中所述氨基酸编号是基于2N4R Tau的氨基酸序号的，例如如图61中所示。在一些情况中，所述抗体是人源化的。
在一些情况中，结合Tau多肽的N末端区域且适于在用于减少神经元细胞和/或细胞外液(例如CSF、ISF、或血液级分如血浆或血清)中的Aβ40和Aβ42的主题方法中使用的抗体是如下的抗体，其结合Tau的氨基酸1-158内的Tau表位，例如氨基酸1-15，氨基酸7-13，氨基酸2-18，氨基酸15-24，氨基酸24-50，氨基酸2-25，氨基酸25-30，氨基酸15至50，氨基酸19-46，氨基酸28-126，氨基酸50至75，氨基酸40至60，氨基酸75至100，氨基酸60至80，氨基酸100至125，氨基酸80-115，氨基酸125至150，氨基酸115至140，或氨基酸150至158内的Tau表位，其中所述氨基酸编号是基于2N4R Tau的氨基酸序号的，例如如图61中所示。在一些情况中，所述抗体是人源化的。
在一些情况中，结合Tau多肽的N末端区域且适于在用于减少神经元细胞和/或CSF中的Aβ40和Aβ42的主题方法中使用的抗体是如下的抗体，其结合Tau的氨基酸1-158内的Tau表位，例如氨基酸1-15，氨基酸7-13，氨基酸2-18，氨基酸15-24，氨基酸24-50，氨基酸2-25，氨基酸25-30，氨基酸15至50，氨基酸19-46，氨基酸28-126，氨基酸50至75，氨基酸40至60，氨基酸75至100，氨基酸60至80，氨基酸100至125，氨基酸80-115，氨基酸125至150，氨基酸115至140，或氨基酸150至158内的Tau表位，其中所述氨基酸编号是基于2N4R Tau的氨基酸序号的，例如如图61中所示。在一些情况中，所述抗体是人源化的。
在一些情况中，结合Tau多肽的N末端区域且适于在用于减少神经元细胞和/或ISF中的Aβ40和Aβ42的主题方法中使用的抗体是如下的抗体，其结合Tau的氨基酸1-158内的Tau表位，例如氨基酸1-15，氨基酸7-13，氨基酸2-18，氨基酸15-24，氨基酸24-50，氨基酸2-25，氨基酸25-30，氨基酸15至50，氨基酸19-46，氨基酸28-126，氨基酸50至75，氨基酸40至60，氨基酸75至100，氨基酸60至80，氨基酸100至125，氨基酸80-115，氨基酸125至150，氨基酸115至140，或氨基酸150至158内的Tau表位，其中所述氨基酸编号是基于2N4R Tau的氨基酸序号的，例如如图61中所示。在一些情况中，所述抗体是人源化的。
在一些情况中，本发明的方法涉及通过施用抗-Tau抗体来减少β(例如神经元细胞中和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆或血清)中的Aβ40和/或Aβ42)，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸1-158内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R Tau的氨基酸序列。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸2-18内的氨基酸残基。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位是线性表位，且其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸2-68内的氨基酸残基。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau4多肽，所述eTau4多肽与SEQ ID NO:48(eTau4；示于图61中)中所示的氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％、或至少100％氨基酸序列同一性。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau多肽内的线性表位，其中所述表位在Tau的氨基酸2-68内。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau多肽内的线性表位，其中所述表位在Tau的氨基酸15-24内。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸7-13内的氨基酸残基，例如氨基酸EFEVMED(SEQID NO:87)。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸25-30内的氨基酸残基，例如氨基酸DQGGYT(SEQ ID NO:88)。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸28-126内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R Tau氨基酸序列。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸150-158内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R Tau氨基酸序列。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸19-46内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R Tau氨基酸序列。
在一些情况中，本发明的方法涉及通过施用特异性地结合胞外Tau(eTau)的抗体来减少β-淀粉样蛋白(Aβ)(例如神经元细胞和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中的Aβ40和/或Aβ42)，其中所述抗体结合的表位包含eTau的氨基酸1-158内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R Tau氨基酸序列。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸2-18内的氨基酸残基。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau，其中所述抗体结合的表位是线性表位，且其中所述抗体结合的表位包含eTau的氨基酸2-68内的氨基酸残基。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau4多肽，所述eTau4多肽与SEQID NO:48(eTau4；示于图61中)中所示的氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％、或至少100％氨基酸序列同一性。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau多肽内的线性表位，其中所述表位在Tau的氨基酸2-68内。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau多肽内的线性表位，其中所述表位在Tau的氨基酸15-24内。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau，其中所述抗体结合的表位包含eTau的氨基酸7-13内的氨基酸残基，例如氨基酸EFEVMED(SEQ ID NO:87)。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau，其中所述抗体结合的表位包含eTau的氨基酸25-30内的氨基酸残基，例如氨基酸DQGGYT(SEQ ID NO:88)。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau，其中所述抗体结合的表位包含eTau的氨基酸28-126内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R Tau氨基酸序列。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau，其中所述抗体结合的表位包含eTau的氨基酸150-158内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R Tau氨基酸序列。在一些情况中，所施用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸19-46内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R Tau氨基酸序列。
本发明提供了治疗与β-淀粉样蛋白聚集(例如神经元细胞中和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中的Aβ40和/或Aβ42的聚集)相关的疾病的方法。所述方法通常涉及对个体施用：a)有效量的结合Tau多肽的N末端区域的抗体(例如单克隆抗体)，该抗体可以任选地是人源化抗体；或b)包含所述人源化抗体的药物组合物。
与β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病可以是这样的疾病，在所述疾病中个体的神经元细胞中和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中的Aβ40和/或Aβ42水平比正常对照水平高。例如，与β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病包括阿尔茨海默氏病。与未用抗-Tau抗体治疗的个体中的β-淀粉样蛋白水平相比，本发明的方法能提供将β-淀粉样蛋白水平(例如神经元细胞中和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中的Aβ40和/或Aβ42)减少至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约50％，或超过50％。因此，例如，在一些情况中，抗-Tau抗体的有效量是这样的量，与未用抗-Tau抗体治疗或用抗-Tau抗体治疗之前的神经元细胞和/或细胞外液中的Aβ40相比，所述量将神经元细胞中和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中的Aβ40减少至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约50％，或超过50％。在一些情况中，抗-Tau抗体的有效量是这样的量，与未用抗-Tau抗体治疗或用抗-Tau抗体治疗之前的神经元细胞和/或细胞外液中的Aβ42相比，所述量将神经元细胞中和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中的Aβ42减少至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约50％，或超过50％。在一些情况中，抗-Tau抗体的有效量是这样的量，与未用抗-Tau抗体治疗或用抗-Tau抗体治疗之前的神经元细胞和/或细胞外液中的Aβ40和Aβ42相比，所述量将神经元细胞中和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中的Aβ40和Aβ42减少至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约50％，或超过50％。
结合Tau多肽的N末端区域且适于在治疗与β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病的主题方法中使用的抗体是这样的抗体，所述抗体结合Tau的氨基酸1-158内的Tau表位，例如氨基酸1-15，氨基酸7-13，氨基酸2-18，氨基酸15-24，氨基酸24-50，氨基酸2-25，氨基酸19-46，氨基酸25-30，氨基酸15至50，氨基酸28-126，氨基酸50至75，氨基酸40至60，氨基酸75至100，氨基酸60至80，氨基酸100至125，氨基酸80-115，氨基酸125至150，氨基酸115至140，或氨基酸150至158内的Tau表位，其中所述氨基酸编号是基于2N4R Tau的氨基酸序号的，例如如图61中所示。在一些情况中，所述抗体是人源化的。
在一些情况中，降低个体的神经元细胞中和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中的β-淀粉样蛋白水平(例如Aβ40和/或Aβ42)且适于在治疗与β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病的主题方法中使用的抗体是本发明的人源化抗-Tau抗体。在一些情况中，所述抗体是结合Tau的氨基酸15-24内的表位(例如线性表位)的人源化抗体。
在一些情况中，降低β-淀粉样蛋白水平的方法涉及施用抗-Tau抗体，所述抗-Tau抗体不需要Tau的2N插入物的存在以供结合至Tau。在一些情况中，适于在降低个体的神经元细胞和/或细胞外液中的β-淀粉样蛋白水平(例如Aβ40和/或Aβ42)的主题方法中使用的抗-Tau抗体所识别的表位不在Tau的2N插入物内。Tau的2N插入包括图61所示的2N4R氨基酸序列的氨基酸45-102。
在一些情况中，适于在治疗与β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病的主题方法中使用的抗-Tau抗体特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸2-68内的氨基酸残基。在一些情况中，适于在治疗与β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病的主题方法中使用的抗-Tau抗体特异性地结合胞外Tau(eTau)，其中所述抗体结合的表位包含eTau的氨基酸2-68内的氨基酸残基。在一些情况中，适于在治疗与β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病的主题方法中使用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau，其中所述抗体结合的表位是线性表位，并且其中所述抗体结合的表位包含eTau的氨基酸2-68内的氨基酸残基。在一些情况中，适于在治疗与β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病的主题方法中使用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau4多肽，所述eTau4多肽与SEQ ID NO:48中所示氨基酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％、或100％氨基酸同一性。在一些情况中，适于在治疗与β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病的主题方法中使用的抗-Tau抗体特异性地结合eTau4多肽内的线性表位，其中所述表位在eTau4的氨基酸2-68内。在上述任一实施方案中，所述抗体是人源化的。
在一些情况中，在个体的神经元细胞和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中降低β-淀粉样蛋白水平(例如Aβ40和/或Aβ42)、且适于在治疗与β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病的主题方法中使用的抗体，其特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸1-158内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于2N4R形式的Tau，例如如图61中所示。在这些实施方案的一些中，所述抗体是人源化的。在这些实施方案的一些中，所述表位是线性表位。
在一些情况中，在个体的神经元细胞和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中降低β-淀粉样蛋白水平(例如Aβ40和/或Aβ42)、且适于在治疗与β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病的主题方法中使用的抗体，其特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸2-18内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于2N4R形式的Tau，例如如图61中所示。在这些实施方案的一些中，所述抗体是人源化的。在这些实施方案的一些中，所述表位是线性表位。
在一些情况中，在个体的神经元细胞和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中降低β-淀粉样蛋白水平(例如Aβ40和/或Aβ42)、且适于在治疗与β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病的主题方法中使用的抗体，其特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸7-13内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于2N4R形式的Tau，例如如图61中所示。在这些实施方案的一些中，所述抗体是人源化的。在这些实施方案的一些中，所述表位是线性表位。
在一些情况中，在个体的神经元细胞和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中降低β-淀粉样蛋白水平(例如Aβ40和/或Aβ42)、且适于在治疗与β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病的主题方法中使用的抗体，其特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸25-30内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于2N4R形式的Tau，例如如图61中所示。在这些实施方案的一些中，所述抗体是人源化的。在这些实施方案的一些中，所述表位是线性表位。
在一些情况中，在个体的神经元细胞和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中降低β-淀粉样蛋白水平(例如Aβ40和/或Aβ42)、且适于在治疗与β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病的主题方法中使用的抗体，其特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸28-126内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于2N4R形式的Tau，例如如图61中所示。在这些实施方案的一些中，所述抗体是人源化的。在这些实施方案的一些中，所述表位是线性表位。
在一些情况中，在个体的神经元细胞和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中降低β-淀粉样蛋白水平(例如Aβ40和/或Aβ42)、且适于在治疗与β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病的主题方法中使用的抗体，其特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸19-46内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于2N4R形式的Tau，例如如图61中所示。在这些实施方案的一些中，所述抗体是人源化的。在这些实施方案的一些中，所述表位是线性表位。
在一些情况中，在个体的神经元细胞和/或细胞外液(例如CSF、ISF、血液、或血液级分如血浆和血清)中降低β-淀粉样蛋白水平(例如Aβ40和/或Aβ42)、且适于在治疗与β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病的主题方法中使用的抗体，其特异性地结合Tau，其中所述抗体结合的表位包含Tau的氨基酸150-158内的氨基酸残基，其中所述氨基酸编号基于2N4R形式的Tau，例如如图61中所示。在这些实施方案的一些中，所述抗体是人源化的。在这些实施方案的一些中，所述表位是线性表位。
抗-Tau抗体
本发明提供了分离的抗-Tau抗体和包含抗-Tau抗体的药物制剂。
本发明提供了分离的抗体，其特异性地结合Tau多肽的N端区内的表位(例如Tau的氨基端(N末端)部分内的表位，例如Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸1-18内，Tau的氨基酸9至18内(其中Tau的氨基酸1-18是：MAEPRQEFEVMEDHAGTY；SEQ ID NO:53)，Tau的氨基酸15-44内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内(其中Tau的氨基酸15-24是：AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)的线性表位)。在一些实例中，抗体是人源化的，例如重链可变区和/或轻链可变区的一个或多个框架区包含来源于人免疫球蛋白框架的序列。
本发明提供了分离的人源化单克隆抗体，其特异性地结合Tau多肽的氨基酸15-24内的表位。在一些情况中，表位不包含磷酸化的氨基酸。在一些情况中，表位不包含硝化的氨基酸。在一些情况中，表位包含磷酸化的氨基酸、硝化的氨基酸、或磷酸化的氨基酸和硝化的氨基酸两者。
框架区的人源化降低了抗体在人中引发人-抗-小鼠抗体(HAMA)应答的风险。可以实施本领域公认的测定免疫应答的方法以在特定患者中或在临床试验期间监测HAMA应答。可以在开始实施疗法时及贯穿疗法实施过程对施用人源化抗体的患者给予免疫原性评估。例如，使用本领域技术人员己知的方法，包括表面等离子体共振技术(BIACORE)和/或固相酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析，通过检测来自患者的血清样品中的针对人源化治疗剂的抗体来测量HAMA应答。在许多情况中，主题的人源化抗-Tau抗体基本上不引发人受试者中的HAMA应答。在一些情况中，主题的人源化抗-Tau抗体具有降低的免疫原性潜力，如通过使用CD8+消减的外周血单核细胞实施的EpiScreen rw测定法所测定的那样。在一些情况中，主题的人源化抗-Tau抗体展现出小于2.0的刺激指数(Stimulation Index)。
基于其对CDR构象和/或对抗原的结合的可能影响，选择来自人可变区框架残基的某些氨基酸用于取代。鼠CDR区与人可变框架区的非天然毗邻可以导致非天然的构象约束，其导致结合亲和力的丧失，除非通过取代某些氨基酸残基进行校正。
可以通过计算机建模来部分确定用于取代的氨基酸残基选择。用于产生免疫球蛋白分子的三维图像的计算机硬件和软件是本领域中己知的。一般而言，分子模型的产生是从其免疫球蛋白链或域的解析结构开始的。将要建模的链与已经解析了三维结构的链或域进行氨基酸序列相似性的比较，并选择显示最大序列相似性的链或域作为构建分子模型的起始点。选择共享至少50％序列同一性的链或域进行建模，例如选择那些共享至少60％、70％、80％、90％，或超过90％序列同一性或更多的链或域进行建模。将已解析的起始结构修饰为容许所建模的免疫球蛋白链或域中的实际氨基酸和起始结构中的氨基酸之间的差异。然后，将经修饰的结构装配成组合的免疫球蛋白。最后，通过能量最小化及通过验证所有原子在彼此的合适距离内并且键长和键角在化学可接受限度内，从而改进模型。
CDR和框架区如Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991)限定。备选结构限定已经由Chothia等,J.Mol.Biol.196:901(1987)；Nature 342:878(1989)；和J.Mol.Biol.186:651(1989)(collectively referred to as“Chothia”)提出。在如Kabat(见上文)所限定的框架残基构成如Chothia(见上文)限定的结构环残基时，可以选择存在于小鼠抗体中的氨基酸用于人源化抗体中的取代。“与CDR区邻近”的残基包括刚好与人源化免疫球蛋白链的一级序列中的一个或多个CDR邻近的位置中的氨基酸残基，例如在刚好与Kabat限定的CDR、或Chothia(参见例如Chothia和Lesk JMB 196:901(1987))限定的CDR邻近的位置中的氨基酸残基。这些氨基酸很可能与CDR中的氨基酸相互作用，并且若从接受体选择，则可能扭曲供体CDR并降低亲和力。此外，邻近的氨基酸可以与抗原直接相互作用(Amit等,Science,233:747(1986))，并且从供体选择这些氨基酸对于保持提供初始抗体亲和力的所有抗原接触而言可以是期望的。
本发明提供了分离的抗体，其包含人源化轻链框架区；和人源化重链框架区，所述抗体与另一抗体竞争结合至Tau多肽的N末端区中的表位，所述另一抗体包含：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些情况中，在一些情况中，轻链区和重链区存在于不同的多肽中。在一些情况中，轻链区和重链区存在于单一多肽中。在一些情况中，分离的抗体可以包含重链区，所述重链区包含同种型Ig G1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。在其他情况中，所述抗体是是Fv、scFv、Fab、F(ab')2、或Fab'。在一些情况中，抗体包含共价连接的非肽合成聚合物，例如聚(乙二醇)聚合物。在一些情况中，所述抗体直接或经接头与促进穿过血脑屏障的载体分子、肽或蛋白质融合。在一些情况中，表位在Tau多肽的氨基酸15-24内。在一些情况中，人源化轻链框架区包含表3中所示的l、2、3、4、5、6、7、8、9或10处氨基酸取代。在一些情况中，人源化重链框架区包含表2中所示的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12处氨基酸取代。
在一些实施方案中，本发明的抗-Tau抗体(例如主题抗体，其特异性地结合Tau多肽中的表位，例如Tau的氨基端(N末端)部分内的线性表位，例如Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸1-18内，Tau的氨基酸9至18内(其中Tau的氨基酸1-18是：MAEPRQEFEVMEDHAGTY；SEQID NO:53)，Tau的氨基酸15-44内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内(其中Tau的氨基酸15-24是：AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)的线性表位)包含：a)轻链区，其包含：i)IPN001抗体的1、2或3个互补决定区(CDR)，其中CDR如Kabat(参见例如上文表1；和Kabat等，U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of proteins of immunologicalinterest”(1991))所限定的。
在一些实施方案中，本发明的抗-Tau抗体(例如主题抗体，其特异性地结合Tau多肽中的表位，例如Tau的氨基端(N末端)部分内的线性表位，例如Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸1-18内，Tau的氨基酸9至18内(其中Tau的氨基酸1-18是：MAEPRQEFEVMEDHAGTY；SEQID NO:53)，Tau的氨基酸15-44内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内(其中Tau的氨基酸15-24是：AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)的线性表位)包含：a)轻链区，其包含：i)IPN001抗体的1、2或3个VL CDR；和ii)人源化轻链框架区；和b)重链区，其包含：i)IPN001抗体的1、2或3个VH CDR；和ii)人源化重链框架区；其中VH和VL CDR如Kabat(参见例如上文表1；及Kabat等，U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of proteins ofimmunological interest”(1991))所限定。在这些实施方案的一些中，抗-Tau抗体包含人源化VH和/或VL框架区。
在一些实施方案中，本发明的抗-Tau抗体(例如主题抗体，其特异性地结合Tau多肽中的表位，例如Tau的氨基端(N末端)部分内的线性表位，例如Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸1-18内，Tau的氨基酸9至18内(其中Tau的氨基酸1-18是：MAEPRQEFEVMEDHAGTY；SEQID NO:53)，Tau的氨基酸15-44内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内(其中Tau的氨基酸15-24是：AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)的线性表位)包含：a)轻链区，其包含：i)IPN001抗体的1、2或3个VL CDR；和ii)人源化轻链框架区；和b)重链区，其包含：i)IPN001抗体的1、2或3个VH CDR；和ii)人源化重链框架区；其中VH和VL CDR如Chothia(参见例如上文表1；和Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))所限定。
在一些实施方案中，本发明的抗-Tau抗体(例如主题抗体，其特异性地结合Tau多肽中的表位，例如Tau的氨基端(N末端)部分内线性表位，例如Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸1-18内，Tau的氨基酸9至18内(其中Tau的氨基酸1-18是：MAEPRQEFEVMEDHAGTY；SEQ IDNO:53)，Tau的氨基酸15-44内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内(其中Tau的氨基酸15-24是：AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)的线性表位)包含：a)轻链区，其包含：i)IPN002抗体的1、2或3个VL CDR；和ii)人源化轻链框架区；和b)重链区，其包含：i)IPN002抗体的1、2或3个VH CDR；和ii)人源化重链框架区；其中VH和VL CDR如Kabat(参见例如上文表1；及Kabat等，Kabat等,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of proteinsof immunological interest”(1991))所限定。
在一些实施方案中，本发明的抗-Tau抗体(例如主题抗体，其特异性地结合Tau多肽中的表位，例如Tau的氨基端(N末端)部分内的线性表位，例如Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸1-18内，Tau的氨基酸9至18内(其中Tau的氨基酸1-18是：MAEPRQEFEVMEDHAGTY；SEQID NO:53)，Tau的氨基酸15-44内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内(其中Tau的氨基酸15-24是：AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)的线性表位)包含：a)轻链区，其包含：i)IPN002抗体的1、2或3个VL CDR；和ii)人源化轻链框架区；和b)重链区，其包含：i)IPN002抗体的1、2或3个VH CDR；和ii)人源化重链框架区；其中VH和VL CDR如由Chothia(参见例如上文表1；及Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))所限定。
在一些实施方案中，本发明的抗-Tau抗体(例如主题抗体，其特异性地结合Tau多肽中的表位，例如Tau的氨基端(N末端)部分内的线性表位，例如Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸1-18内，Tau的氨基酸9至18内(其中Tau的氨基酸1-18是：MAEPRQEFEVMEDHAGTY；SEQID NO:53)，Tau的氨基酸15-44内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内(其中Tau的氨基酸15-24是：AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)的线性表位)包含：a)轻链区，其包含：i)选自下组的1、2或3个CDR：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，和SEQ ID NO:3；和ii)人源化轻链框架区；和b)重链区，其包含：i)选自下组的1、2或3个CDR：SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，和SEQ IDNO:6；和ii)人源化重链框架区。
在一些实施方案中，本发明的抗-Tau抗体(例如主题抗体，其特异性地结合Tau多肽中的表位，例如Tau的氨基端(N末端)部分内的线性表位，例如Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸1-18内，Tau的氨基酸9至18内(其中Tau的氨基酸1-18是：MAEPRQEFEVMEDHAGTY；SEQID NO:53)，Tau的氨基酸15-44内，Tau的氨基酸13-24内，或Tau的氨基酸15-24内(其中Tau的氨基酸15-24是：AGTYGLGDRK(SEQ ID NO:51)的线性表位)包含：a)轻链区，其包含：i)选自下组的1、2或3个CDR：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、和SEQ ID NO:9；和ii)人源化轻链框架区；和b)重链区，其包含：i)选自下组的1、2或3个CDR：SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、和SEQID NO:12；和ii)人源化重链框架区。
在一些情况中，抗体包含：a)轻链区，其包含：i)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL CDR1；(ii)包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL CDR2；(iii)包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR3；和(iv)人源化轻链框架区；和b)重链区，其包含：(i)包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VH CDR1；(ii)包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH CDR2；(iii)包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VH CDR3；和iv)人源化重链框架区。
在一些实施方案中，主题抗-Tau抗体包含重链可变区，该重链可变区包含具有选自SEQ ID NOs:4、5和6之一或多项的氨基酸序列的1、2或3个重链CDR；和人源化的1、2、3或4个FR区。例如，在一些实施方案中，主题抗体包含重链可变区，该重链可变区以N末端至C末端的次序包含：人源化重链FR1；包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的CDR1；人源化重链FR2；包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的CDR2；人源化重链FR3；包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的CDR3；和人源化重链FR4。
在一些实施方案中，主题抗-Tau抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含具有选自SEQ ID NO:1、2、和3之一或多项的多肽序列的1、2或3个轻链CDR；和人源化的1、2、3或4个FR区。例如，在一些实施方案中，主题抗体包含轻链可变区，该轻链可变区以N末端至C末端的次序包含：人源化轻链FR1；包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的CDR1；人源化轻链FR2；包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的CDR2；人源化轻链FR3；包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的CDR3；和人源化轻链FR4。
在一些实施方案中，主题抗-Tau抗体包含重链可变区，该重链可变区包含具有选自SEQ ID NO:10、11和12之一或多项的氨基酸序列的1、2或3个重链CDR；和人源化的1、2、3或4个FR区。例如，在一些实施方案中，主题抗体包含重链可变区，该重链可变区以N端至C末端的次序包含：人源化重链FR1；包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的CDR1；人源化重链FR2；包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的CDR2；人源化重链FR3；包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的CDR3；和人源化重链FR4。
在一些实施方案中，主题抗-Tau抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含具有选自SEQ ID NO:7、8、和9之一或多项的多肽序列的1、2或3个轻链CDR；和人源化的1、2、3或4个FR区。例如，在一些实施方案中，主题抗体包含轻链可变区，该轻链可变区以N末端至C末端的次序包含：人源化轻链FR1；包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的CDR1；人源化轻链FR2；包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的CDR2；人源化轻链FR3；包含SEQ IDNO:9中所示的氨基酸序列的CDR3；和人源化轻链FR4。
图1A和1B中描绘了IPN001的VH和VL氨基酸序列。CDR(如Kabat限定的)为粗体文本且加下划线。图2A和2B中描绘了IPN002的VH和VL氨基酸序列。CDR(如Kabat限定的)为粗体文本且加下划线。
SEQ ID NOs:1-12如下所示：
RSSQTILHSNGNTYLE(SEQ ID NO:1)；
KVSKRFS(SEQ ID NO:2)；
FQGSLVPWA(SEQ ID NO:3)；
SYGMS(SEQ ID NO:4)；
TISSSGSRTYFPDSVKG(SEQ ID NO:5)；
TWDGAMDY(SEQ ID NO:6)；
KSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:7)；
KVSNRFS(SEQ ID NO:8)；
FQGSLVPWA(SEQ ID NO:9)；
KYGMS(SEQ ID NO:10)；
TISSSGSRTYYPDSVKG(SEQ ID NO:11)；
SWDGAMDY(SEQ ID NO:12).
主题抗-Tau抗体可以包含轻链可变区，该轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与描绘于图1B中且示于SEQ ID NO:13中的序列85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
主题抗-Tau抗体可以包含重链可变区，该轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与描绘于图1A中且示于SEQ ID NO:14中的序列85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
主题抗-Tau抗体可以包含轻链可变区，该轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与描绘于图2B中且示于SEQ ID NO:15中的序列85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
主题抗-Tau抗体可以包含重链可变区，该轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与描绘于图2A中且示于SEQ ID NO:16中的序列85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
主题抗-Tau抗体可以包含重链可变区，该轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与描绘于图9中的序列(VH变体1)85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
主题抗-Tau抗体可以包含重链可变区，该轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与描绘于图10中的序列(VH变体2)85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
主题抗-Tau抗体可以包含重链可变区，该轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与描绘于图11中的序列(VH变体3)85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
主题抗-Tau抗体可以包含重链可变区，该轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与描绘于图12中的序列(VH变体4)85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
主题抗-Tau抗体可以包含轻链可变区，该轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与描绘于图13中的序列(Vk变体1)85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
主题抗-Tau抗体可以包含轻链可变区，该轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与描绘于图14中的序列(Vk变体2)85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
主题抗-Tau抗体可以包含轻链可变区，该轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与描绘于图15中的序列(Vk变体3)85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
主题抗-Tau抗体可以包含轻链可变区，该轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与描绘于图16中的序列(Vk变体4)85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
主题抗-Tau抗体可以包含重链可变区，该重链可变区包含相对于表2中所示的IPN002亲本抗体FR氨基酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12处框架(FR)氨基酸取代。
表2：VH变体
例如，主题抗-Tau抗体可以包含重链可变区，该重链可变区包含VH FR1中的氨基酸位置3处的H→Q取代和/或VH FR1中的氨基酸位置19处的K→R取代。
作为另一个例子，主题抗-Tau抗体可以包含重链可变区，该重链可变区包含VHFR2中的氨基酸位置40处的T→A取代和/或VH FR2中的氨基酸位置42处的D→G取代和/或VHFR2中的位置44处的R→G取代。
作为另一个例子，主题抗-Tau抗体可以包含重链可变区，该重链可变区包含VHFR3中的氨基酸位置66处的Q→R取代和/或VH FR3中的氨基酸位置83处的S→N取代和/或VHFR3中的氨基酸位置85处的L→S取代和/或FR3中的氨基酸位置86处的K→R取代和/或VHFR3中的氨基酸位置87处的S→A取代和/或VH FR3中的氨基酸位置93处的S→A取代。
作为另一个例子，主题抗-Tau抗体可以包含重链可变区，该重链可变区包含VHFR4中的氨基酸位置108处的S→T取代。
在一些情况中，主题分离的抗-Tau抗体可以以N末端至C末端的次序包含：EVX1LVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFSFS(SEQ ID NO:83)；如图2A中所示的VH CDR1；WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:84)；如图2A中所示的VH CDR2；RFTISRDNAKNTLYLQMX2SX3X4X5EDTAMYYCX6I(SEQ ID NO:85)；如图2A中所示的VH CDR3；WGQGTX7VTVSS(SEQ ID NO:86)，其中X1是H或Q；X2是S或N；X3是S或L；X4是K或R；X5是S或A；X6是S或A；以及X7是S或T。
主题抗-Tau抗体能包含轻链可变区，该轻链可变区包含相对于表3中所示的IPN002亲本抗体FR氨基酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10处框架(FR)氨基酸取代。
表3：Vk变体
例如，主题抗-Tau抗体可以包含轻链可变区，该轻链可变区包含VL FR1中的氨基酸位置3处的L→V取代和/或VL FR1中的氨基酸位置7处的T→S取代和/或VL FR1中的氨基酸位置14处的S→T取代和/或VL FR1中的氨基酸位置17处的D→Q取代和/或VL FR1中的氨基酸位置18处的Q→P取代。
作为另一个例子，主题抗-Tau抗体可以包含轻链可变区，该轻链可变区包含VLFR2的氨基酸位置45处的K→Q取代和/或VL FR2的氨基酸位置48处的V→I取代。
作为另一个例子，主题抗-Tau抗体可以包含轻链可变区，该轻链可变区包含VLFR3的氨基酸位置83处的L→V取代和/或VL FR3的氨基酸位置85处的T→V取代。
作为另一个例子，主题抗-Tau抗体可以包含轻链可变区，该轻链可变区包含VLFR4的氨基酸位置104处的L→V取代。
在一些情况中，主题分离的抗-Tau抗体可以以从N末端至C末端的次序包含VL区，其包含：DVX1MTQSPLSLPVTLGQPASISC(SEQ ID NO:54)；如图2B中所示的VL CDR1；WYLQKPGQSPQLLX2Y(SEQ ID NO:55)；如图2B中所示的VL CDR2；GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGX3YYC(SEQ ID NO:56)；如图2B中所示的VL CDR3；FGGGTKVEIK(SEQ ID NO:57)；其中X1是L或V；X2是V或I；以及X3是T或V。
在一些情况中，本发明的抗-Tau抗体包含：
a)包含图9中所示的氨基酸序列的VH变体1；和包含图13中所示的氨基酸序列的Vk变体1；
b)包含图9中所示的氨基酸序列的VH变体1；和包含图14中所示的氨基酸序列的Vk变体2；
c)包含图9中所示的氨基酸序列的VH变体1；和包含图15中所示的氨基酸序列的Vk变体3；
d)包含图9中所示的氨基酸序列的VH变体1；和包含图16中所示的氨基酸序列的Vk变体4；
e)包含图10中所示的氨基酸序列的VH变体2；和包含图13中所示的氨基酸序列的Vk变体1；
f)包含图10中所示的氨基酸序列的VH变体2；和包含图14中所示的氨基酸序列的Vk变体2；
g)包含图10中所示的氨基酸序列的VH变体2；和包含图15中所示的氨基酸序列的Vk变体3；
h)包含图10中所示的氨基酸序列的VH变体2；和包含图16中所示的氨基酸序列的Vk变体4；
i)包含图11中所示的氨基酸序列的VH变体3；和包含图13中所示的氨基酸序列的Vk变体1；
j)包含图11中所示的氨基酸序列的VH变体3；和包含图14中所示的氨基酸序列的Vk变体2；
k)包含图11中所示的氨基酸序列的VH变体3；和包含图15中所示的氨基酸序列的Vk变体3；
l)包含图11中所示的氨基酸序列的VH变体3；和包含图16中所示的氨基酸序列的Vk变体4；
m)包含图12中所示的氨基酸序列的VH变体4；和包含图13中所示的氨基酸序列的Vk变体1；
n)包含图12中所示的氨基酸序列的VH变体4；和包含图14中所示的氨基酸序列的Vk变体2；
o)包含图12中所示的氨基酸序列的VH变体4；和包含图15中所示的氨基酸序列的Vk变体3；
p)包含图12中所示的氨基酸序列的VH变体4；和包含图16中所示的氨基酸序列的Vk变体4；
在一些实施方案中，主题抗体包含单一多肽链中的抗-Tau重链CDR和抗-Tau轻链CDR，例如在一些实施方案中，主题抗体是scFv。在一些实施方案中，主题抗体以N末端至C末端的次序包含：长度约5个氨基酸至约25个氨基酸的第一氨基酸序列；包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的CDR1；长度约5个氨基酸至约25个氨基酸的第二氨基酸序列；包含SEQID NO:2中所示的氨基酸序列的CDR2；长度约5个氨基酸至约25个氨基酸的第三氨基酸序列；包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的CDR3；长度约5个氨基酸至约25个氨基酸的第四氨基酸序列；包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的CDR1；长度约5个氨基酸至约25个氨基酸的第五氨基酸序列；包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的CDR2；长度约5个氨基酸至约25个氨基酸的第六氨基酸序列；包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的CDR3；和长度约5个氨基酸至约25个氨基酸的第七氨基酸序列。
在一些实施方案中，主题抗体以N末端至C末端的次序包含：轻链FR1区；包含SEQID NO:1中所示的氨基酸序列的CDR1；轻链FR2区；包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的CDR2；轻链FR3区；包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的CDR3；任选轻链FR4区；接头区；任选重链FR1区；包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的CDR1；重链FR2区；包含SEQ IDNO:5中所示的氨基酸序列的CDR2；重链FR3区；包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的CDR3；和重链FR4区。在这些实施方案的一些中，一个或多个FR区是人源化FR区。在这些实施方案的一些中，每个FR区是人源化FR区。接头区的长度可以是约5个氨基酸至约50个氨基酸，例如长度为约5个aa至约10个aa，约10个aa至约15个aa，约15个aa至约20个aa，约20个aa至约25个aa，约25个aa至约30个aa，约30个aa至约35个aa，约35个aa至约40个aa，约40个aa至约45个aa，或约45个aa至约50个aa。
在一些实施方案中，主题抗体以从N末端至C末端的次序包含：重链FR1区；包含SEQID NO:4中所示的氨基酸序列的CDR1；重链FR2区；包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的CDR2；重链FR3区；包含SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列的CDR3；任选重链FR4区；接头；任选轻链FR1区；包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的CDR1；轻链FR2区；包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的CDR2；轻链FR3区；包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的CDR3；和轻链FR4区。在这些实施方案的一些中，一个或多个FR区是人源化FR区。在这些实施方案的一些中，每个FR区是人源化FR区。接头区的长度可以是约5个氨基酸至约50个氨基酸，例如长度为约5个aa至约10个aa，约10个aa至约15个aa，约15个aa至约20个aa，约20个aa至约25个aa，约25个aa至约30个aa，约30个aa至约35个aa，约35个aa至约40个aa，约40个aa至约45个aa，或约45个aa至约50个aa。
在一些实施方案中，主题抗体以从N末端至C末端的次序包含：轻链FR1区；包含SEQID NO:7中所示的氨基酸序列的CDR1；轻链FR2区；包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的CDR2；轻链FR3区；包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列的CDR3；任选轻链FR4区；接头区；任选重链FR1区；包含SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的CDR1；重链FR2区；包含SEQ IDNO:11中所示的氨基酸序列的CDR2；重链FR3区；包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的CDR3；和重链FR4区。在这些实施方案的一些中，一个或多个FR区是人源化FR区。在这些实施方案的一些中，每个FR区是人源化FR区。接头区的长度可以是约5个氨基酸至约50个氨基酸，例如长度为约5个aa至约10个aa，约10个aa至约15个aa，约15个aa至约20个aa，约20个aa至约25个aa，约25个aa至约30个aa，约30个aa至约35个aa，约35个aa至约40个aa，约40个aa至约45个aa，或约45个aa至约50个aa。
在一些实施方案中，主题抗体以从N末端至C末端的次序包含：重链FR1区；包含SEQID NO:10中所示的氨基酸序列的CDR1；重链FR2区；包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的CDR2；重链FR3区；包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的CDR3；任选重链FR4区；接头；任选轻链FR1区；包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的CDR1；轻链FR2区；包含SEQ IDNO:8中所示的氨基酸序列的CDR2；轻链FR3区；包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列的CDR3；和轻链FR4区。在这些实施方案的一些中，一个或多个FR区是人源化FR区。在这些实施方案的一些中，每个FR区是人源化FR区。接头区的长度可以是约5个氨基酸至约50个氨基酸，例如长度为约5个aa至约10个aa，约10个aa至约15个aa，约15个aa至约20个aa，约20个aa至约25个aa，约25个aa至约30个aa，约30个aa至约35个aa，约35个aa至约40个aa，约40个aa至约45个aa，或约45个aa至约50个aa。
适合于主题抗体使用的接头包括“柔性接头”。若存在的话，接头分子一般具有足够的长度，从而容许连接区域之间的一些灵活运动。接头分子一般长约6-50个原子。例如，接头分子也可以是芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚物、二胺(diamines)、二酸(diacids)、氨基酸、或其组合。根据本发明可以使用能够结合多肽的其他接头分子。
合适的接头可以容易地选择，并且可以具有任何合适的不同长度，如1个氨基酸(例如Gly)至20个氨基酸，2个氨基酸至15个氨基酸，3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸，5个氨基酸至9个氨基酸，6个氨基酸至8个氨基酸，或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
例示性的柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、GSGGSn(SEQ ID NO:58)和GGGSn(SEQ ID NO:59)，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、和本领域中己知的其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是受关注的，因为这两种氨基酸都是相对无结构的，因此可以充当组分间的中性系链。甘氨酸聚合物是备受关注的，因为甘氨酸甚至比丙氨酸得到显著更多的phi-psi空间，并且比具有更长侧链的残基收到的约束小得多(参见Scheraga,Rev.ComputationalChem.11173-142(1992))。例示性的柔性接头包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:60)、GGSGG(SEQ ID NO:61)、GSGSG(SEQ ID NO:62)、GSGGG(SEQ ID NO:63)、GGGSG(SEQ ID NO:64)、GSSSG(SEQ ID NO:65)等。本领域技术人员会认可与上文描述的任何元件缀合的肽的设计可以包含接头，该接头是完全或部分柔性的，从而接头可以包含柔性接头及赋予较小柔性结构的一个或多个部分。
在一些情况中，主题分离的抗体是抗体片段、Fv、scFv、Fab、F(ab')2或Fab'。因此，本发明提供了分离的抗体，其中抗体是Fv、scFv、Fab、F(ab')2或Fab'，且其中所述抗体与另一抗体竞争结合至Tau多肽的N末端区中的表位，所述另一抗体包含：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(iii)VHCDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在这些实施方案的一些中，分离的抗体包含1、2、3或4个人源化VL框架区，如上文所述。在这些实施方案的一些中，分离的抗体1、2、3或4个人源化VH框架区，如上文所述。
在一些实施方案中，本发明的抗-Tau抗体是scFv抗体。在一些实施方案中，本发明的抗-Tau抗体包含scFv多聚体。例如，在一些实施方案中，主题抗体是scFv二聚体(例如包含2个串联的scFv(scFv2))、scFv三聚体(例如包含3个串联的scFv(scFv3))、scFv四聚体(例如包含4个串联的scFv(scFv4))，或者是超过4个scFv(例如串联)的多聚体。scFv单体可以由接头串联连接，所述接头长度为约2个氨基酸至约10个氨基酸(aa)，例如长度为2个aa、3个aa、4个aa、5个aa、6个aa、7个aa、8个aa、9个aa、或10个aa。合适的接头包括例如(Gly)x，其中x是2至10的整数。其他合适的接头是上文讨论的那些接头。在一些实施方案中，主题scFV多聚体中的每个scFv单体是人源化的，如上文所述。
在一些情况中，主题抗体包含免疫球蛋白的恒定区(例如Fc区)。Fc区(若存在的话)可以是人Fc区。若存在恒定区，则抗体可以含有轻链和重链恒定区两者。合适的重链恒定区包含CH1、铰链、CH2、CH3、和CH4区。本文中描述的抗体包含具有所有类型的恒定区(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)，和任何同种型(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的抗体。合适的重链Fc区的例子是人同种型IgG1Fc。在一些情况中，重链区是同种型IgG4的。在这些实施方案的一些中，铰链区包含S241P取代。参见例如Angal等(1993)Mol.Immunol.30:105。轻链恒定区可以是λ或κ。主题抗体(例如主题人源化抗体)可以包含来自多于一个类或同种型的序列。抗体可以作为含有两个轻链和两个重链的四聚体，作为分开的重链、轻链，作为Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv，或作为重链和轻链可变域经间隔区连接的单链抗体而表达。
在一些实施方案中，本发明提供了分离的抗体，其中分离的抗体包含人轻链恒定区和人重链恒定区，且其中所述分离的抗体与另一抗体竞争结合至Tau多肽的N末端区中的表位，所述另一抗体包含：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VLCDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VHCDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在这些实施方案的一些中，分离的抗体包含1、2、3或4个人源化VL框架区，如上文所述。在这些实施方案的一些中，分离的抗体包含1、2、3或4个人源化VH框架区，如上文所述。
主题抗体可以包含羧基端的游离硫醇(-SH)基团，其中所述游离硫醇基团可以用于将抗体附接于第二多肽(例如另一种抗体，包括主题抗体)、支架、载体，等等。
在一些实施方案中，主题抗体包含一个或多个非天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，非天然编码的氨基酸包含羰基基团、乙酰基基团、氨氧基基团、肼基团、酰肼基团、氨基脲基团、叠氮化物基团、或炔基团。关于合适的非天然存在的氨基酸，参见例如美国专利No.7,632,924。非天然存在的氨基酸的纳入可以提供与聚合物、第二多肽、支架等的连接。例如，可以通过使包含羰基基团的水溶性聚合物(例如PEG)与抗体起反应生成与水溶性聚合物连接的主题抗体，其中抗体包含含有氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基团的非天然编码的氨基酸。作为另一个例子，可以通过使包含含有炔的氨基酸的主题抗体与包含叠氮化物模块的水溶性聚合物(例如PFG)起反应生成与水溶性聚合物连接的主题抗体；在一些实施方案中，所述叠氮化物或炔基团经由酰胺连接与PEG分子连接。“非天然编码的氨基酸”指不是20个常见的氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸之一的氨基酸。可以与术语“非天然编码的氨基酸”同义使用的其他术语是“非天然氨基酸”、“非自然氨基酸”、“非天然存在的氨基酸”和其各种以连字符号连接和非以连字符号连接的型式。术语“非天然编码的氨基酸”还包括但不限于如下的氨基酸，其通过修饰(例如翻译后修饰)天然编码的氨基酸(包括但不限于20个常见的氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸)而存在，但是它们自身不被翻译复合物天然地掺入到生长中的多肽链中。此类非天然存在的氨基酸的例子包括但不限于N-乙酰基葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基葡糖胺基-L-苏氨酸、和O-磷酸酪氨酸。
在一些实施方案中，主题抗体与聚合物(例如除多肽以外的聚合物)连接(例如共价连接)。合适的聚合物包括例如生物相容性聚合物和水溶性生物相容性聚合物。合适的聚合物包括合成聚合物和天然存在的聚合物。合适的聚合物包括例如经取代的或未经取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧亚烷基聚合物或分支或未分支的多糖，例如同多糖或杂多糖。合适的聚合物包括例如乙烯乙烯醇共聚物(以通用名称EVOH或商品名EVAL公知)；聚甲基丙烯酸丁酯；聚(羟基戊酸酯)；聚(L-乳酸)；聚己酸内酯；聚(丙交酯-共-乙交酯)；聚(羟基丁酸酯)；聚(羟基丁酸酯-共-戊酸酯)；聚二恶烷酮(polydioxanone)；聚原酸酯(polyorthoester)；聚酐；聚(乙醇酸)；聚(D,L-乳酸)；聚(乙醇酸-共-三亚甲基碳酸酯(trimethylene carbonate))；聚磷酸酯(polyphosphoester)；聚磷酸酯尿烷(polyphosphoester urethane)；聚(氨基酸)；氰基丙烯酸酯类(cyanoacrylates)；聚(三亚甲基碳酸酯)；聚(亚氨基碳酸酯)；共聚(醚-酯)(例如聚(环氧乙烷)-聚(乳酸)(PEO/PLA)共聚物)；聚亚烷基草酸酯(polyalkylene oxalates)；聚磷腈(polyphosphazenes)；生物分子，如纤维蛋白、纤维蛋白原、纤维素、淀粉、胶原和透明质酸；聚氨酯(polyurethanes)；硅酮；聚酯；聚烯烃；聚异丁烯和乙烯-α烯烃(alphaolefin)共聚物；丙烯酸聚合物和共聚物；乙烯基卤化物(vinyl halide)聚合物和共聚物，如聚氯乙烯；聚乙烯醚，如聚乙烯甲醚；聚偏二乙烯卤化物(polyvinylidene halides)，诸如聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride)和聚偏二氯乙烯(polyvinylidene chloride)；聚丙烯腈；聚乙烯酮(polyvinylketones)；聚乙烯芳香烃(polyvinyl aromatics)，诸如聚苯乙烯；聚乙烯酯，如聚乙酸乙烯酯；乙烯基单体彼此的共聚物和乙烯基单体与烯烃的共聚物(copolymers of vinylmonomers with each other and olefins)，如乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物，丙烯腈-苯乙烯共聚物，ABS树脂，和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；聚酰胺，如Nylon 66和聚己内酰胺；醇酸树脂；聚碳酸酯；聚甲醛(polyoxymethylenes)；聚酰亚胺(polyimides)；聚醚；环氧树脂；聚氨酯；人造丝(rayon)；人造丝-三乙酸酯；纤维素；乙酸纤维素；丁酸纤维素；乙酸丁酸纤维素；赛璐玢(cellophane)；硝酸纤维素；丙酸纤维素；纤维素醚；无定形Teflon；聚(乙二醇)；和羧甲基纤维素。
合适的合成聚合物包括未经取代的和经取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)、及其衍生物，例如取代的聚(乙二醇)，如甲氧基聚(丙二醇)、及其衍生物。合适的天然存在的聚合物包括例如白蛋白、直链淀粉(amylose)、右旋糖苷、糖原、及其衍生物。
合适的聚合物的平均分子量范围可以是500Da至50000Da，例如5000Da至40000Da，或25000至40000Da。例如，在一些实施方案中，其中主题抗体包含聚(乙二醇)(PEG)或甲氧基聚(乙二醇)聚合物，PEG或甲氧基聚(乙二醇)聚合物的分子量范围可以是约0.5千道尔顿(kDa)至1kDa，约1kDa至5kDa，5kDa至10kDa，10kDa至25kDa，25kDa至40kDa，或40kDa至60kDa。
如上文所述，在一些实施方案中，主题抗体与PEG聚合物共价连接。在一些实施方案中，主题scFv多聚体与PEG聚合物共价连接。参见例如Albrecht等(2006)J.Immunol.Methods 310:100。适于蛋白质的聚乙二醇化的方法和试剂是本领域中公知的，并且可以参见例如美国专利5,849,860。适合于与蛋白质缀合的PEG于室温一般在水中可溶，并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R是氢或保护基，诸如烃基或烷醇基团，且其中n是1至1000的整数。在R是保护基的情况下，其一般具有1至8个碳。
与主题抗体缀合的PEG可以是线性的。与主题蛋白缀合的PEG也可以是分支的。分支的PEG衍生物，如记载于美国专利No.5,643,575的PEG衍生物，“星-PEG”和多臂PEG(multi-armed PEG)，如记载于Shearwater Polymers，Inc.产品目录编码“聚乙二醇衍生物1997-1998”的那些。星PEG在本领域中记载，包括例如记载于美国专利No.6,046,305。
主题抗体可以是糖基化的，例如主题抗体可以包含共价连接的碳水化合物或多糖模块。抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的指碳水化合物模块附接于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸外的任意氨基酸)是用于将碳水化合物模块酶促附接于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一种在多肽中的存在都创建了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附接于羟基氨基酸，最常见是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列，使得其含有一个或多个上文描述的三肽序列，从而方便实现向抗体添加糖基化位点(用于N-连接的糖基化位点)。也可以通过对初始抗体的序列添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基，从而进行改变(用于O-连接的糖基化位点)。类似地，可以通过抗体的天然糖基化位点内的氨基酸改变来实现糖基化位点的消除。
在一些实施方案中，主题抗体会包含“不透射线的”标记物，例如使用例如x-射线可以容易显现的标记物。不透射线的材料是本领域技术人员公知的。最常见的不透射线的材料包括碘化物、溴化物或钡盐。其他不透射线的材料也是己知的，并且包括但不限于有机铋衍生物(参见例如美国专利No.5,939,045)、不透射线的多脲烷(multiurethanes)(参见美国专利No.5,346,981)、有机铋(organobismuth)合成物(参见例如美国专利No.5,256,334)、不透射线的钡多聚体复合物(参见例如美国专利No.4,866,132)，等等。
例如，可以使用戊二醛、同双功能性交联剂、或异双功能性交联剂将主题抗体与第二模块(例如脂质、除主题抗体以外的多肽、合成聚合物、碳水化合物，等等)共价连接。戊二醛与多肽经由其氨基模块交联。同双功能性交联剂(例如同双功能性亚氨酸酯(imidoester)、同双功能性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，或同双功能性巯基反应性交联剂)含有两个或更多个相同的反应性模块，并且可以用于一步反应程序，其中将交联剂添加至含有要连接的多肽的混合物的溶液。同双功能性NHS酯和亚氨酸酯交联含有氨基的多肽。在轻度碱性pH中，亚氨酸酯仅与伯胺起反应以形成亚氨酰氨(imidoamides)，并且交联多肽的总电荷不受影响。同双功能性巯基反应性交联剂包括二马来酰亚胺己烷(bismaleimidhexane，BMH)、1,5-二氟-2,4-二硝基苯(DFDNB)、和1,4-二-(3',2'-吡啶二硫代)丙酰胺丁烷(1,4-di-(3',2'-pyridyldithio)propinoamido butane,DPDPB)。
异双功能性交联剂具有两个或更多个不同的反应性模块(例如胺反应性模块和巯基反应性模块)，并且经由胺或巯基反应性模块与多肽之一交联，然后经由未反应的模块与另一个多肽起反应。多种异双功能性卤乙酰基(haloacetyl)交联剂是可用的，吡啶基二硫化物交联剂亦然。碳化二亚胺(carbodiimides)是用于偶联羧基与胺，产生酰胺键的异双功能性交联剂的一个经典的例子。
可以将主题抗体在固体支持物上固定化。合适的支持物是本领域中公知的，并且特别包括商品化的柱材料，聚苯乙烯珠、胶乳珠、磁珠、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅芯片和表面、硝化纤维素条、尼龙膜、片、Duracytes、反应盘(例如多孔板)的孔、塑料管，等等。固体支持物可以包括多种物质之任一，包括例如玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、右旋糖苷、尼龙、直链淀粉、天然的和经修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖、和磁铁(magnetite)。适合于将主题抗体固定于固体支持物上的方法是公知的，并且包括但不限于离子、疏水性、共价相互作用，等等。例如在水性溶液中，固体支持物可以是可溶的或不溶的。在一些实施方案中，合适的固体支持物在水性溶液中一般是不溶的。
在一些实施方案中，主题抗体包含可检测标记物。合适的可检测标记物包括通过分光术、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段可检测的任何成分。合适物包括但不限于磁珠(例如DynabeadsTM)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红(texasred)、罗丹明(rhodamine)+绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白，等等)、放射性标记物(例如3H、125I、35S、14C、或32P)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤光素酶、和在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中通常使用的其他物质)，和比色标记物，诸如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等等)珠。
在一些实施方案中，主题抗体包含造影剂或放射性同位素，其中造影剂或放射性同位素是适合于用于成像，例如对人实施的成像程序的。标记物的非限制性例子包括放射性同位素，诸如1231I(碘)、118F(氟)、99Tc(锝)、111In(铟)、和67Ga(镓)，和造影剂诸如钆(Gd)、镝、和铁。放射性Gd同位素(153Gd)也是可用的，并且适合于非人哺乳动物中的成像程序。可以使用标准的技术来标记主题抗体。例如，可以使用氯胺T或1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯基甘脲来碘化主题抗体。对于氟化，通过氟化物离子置换反应在合成期间对主题抗体添加氟。关于具有此类放射性同位素的蛋白质合成的综述，参见Muller-Gartner,H.,TIB Tech.,16:122-130(1998)和Saji,H.,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.,16(2):209-244(1999)。也可以通过标准技术用造影剂来标记主题抗体。例如，可以通过将低分子Gd螯合物，如Gd二乙烯三胺五乙酸(GdDTPA)或Gd四氮杂环十二烷四乙酸(GdDOTA)缀合至抗体，从而用Gd标记主题抗体。参见Caravan等,Chem.Rev.99:2293-2352(1999)和Lauffer等,J.Magn.Reson.Imaging,3:11-16(1985)。例如，可以通过将多赖氨酸-Gcl螯合物缀合至抗体，从而用Gd标记主题抗体。参见例如Curtet等,Invest.Radiol.,33(10):752-761(1998)。或者，可以将包含Gd螯合剂脂质的顺磁性聚合脂质体与亲和素和生物素化的抗体一起温育，从而用Gd标记主题抗体。参见例如Sipkins等,Nature Med.,4:623-626(1998).
可以与主题蛋白连接的合适的荧光蛋白包括但不限于来自维多利亚多管水母属(Aequoria victoria)的绿色荧光蛋白或其突变体或衍生物，例如记载于美国专利No.6,066,476；6,020,192；5,985,577；5,976,796；5,968,750；5,968,738；5,958,713；5,919,445；5,874,304的；例如增强的GFP，可购自例如Clontech，Inc.的许多此类GFP；红色荧光蛋白；黄色荧光蛋白；来自珊瑚虫(Anthozoan)物种的多种荧光蛋白和有色蛋白的任一种；如记载于例如Matz等(1999)Nature Biotechnol.17:969-973中的；等等。
在一些实施方案中，主题抗体会连接(例如共价或非共价连接)至融合配对物，例如配体；表位标签；肽；抗体以外的蛋白质；等等。合适的融合配对物包括这样的肽和多肽，所述肽和多肽赋予增强的体内稳定性(例如增强的血清半衰期)；提供纯化便利，例如(His)n，例如6His，等等；提供融合蛋白自细胞的分泌；提供表位标签，例如GST、凝集素(HA；例如YPYDVPDYA；SEQ ID NO:71)、FLAG(例如DYKDDDDK；SEQ ID NO:69)、c-myc(例如EQKLISEEDL；SEQ ID NO:68)，等等；提供可检测信号，例如生成可检测产物的酶(例如β-半乳糖苷酶、萤光素酶)，或自身可检测的蛋白质，例如绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，等等；提供多聚化，例如多聚化结构域，诸如免疫球蛋白的Fc部分；等等。
融合物还可以包含亲和域，包括可以与结合配对物相互作用的肽序列，例如固体支持物上固定化的肽序列，其可用于鉴定或纯化。连续的单一氨基酸(诸如组氨酸)在与蛋白质融合时可以用于通过对树脂柱，诸如镍Sepharose的高亲和力结合进行的融合蛋白的一步纯化。例示性的亲和域包括His5(HHHHH)(SEQ ID NO:66)、HisX6(HHHHHH)(SEQ ID NO:67)、C-myc(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO:68)、Flag(DYKDDDDK)(SEQ ID NO:69)、StrepTag(WSHPQFEK)(SEQ ID NO:70)、血细胞凝集素，例如HA标签(YPYDVPDYA；SEQ ID NO:71)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白、纤维素结合域、RYIRS(SEQ ID NO:72)、Phe-His-His-Thr(SEQ ID NO:73)、几丁质(chitin)结合域、S-肽、T7肽、SH2域、C末端RNA标签、WEAAAREACCRECCARA(SEQ ID NO:74)、金属结合域、例如锌结合域或钙结合域，如来自钙结合蛋白的那些，例如钙调蛋白、肌钙蛋白C、钙调磷酸酶B(calcineurin B)、肌球蛋白轻链、恢复蛋白、S-调制蛋白(modulin)、视锥蛋白、VILIP、神经钙蛋白、海马钙蛋白(hippocalcin)、frequenin、钙牵蛋白(caltractin)、钙激活中性蛋白酶大亚基、S100蛋白、小清蛋白(parvalbumin)、钙结合蛋白D9K、钙结合蛋白D28K、和钙视网膜蛋白(calretinin)、内含肽、生物素、链霉亲和素、MyoD、亮氨酸拉链序列、和麦芽糖结合蛋白。
在一些实施方案中，主题抗体会与结合内源血脑屏障(BBB)受体的多肽融合。连接主题抗体与结合内源BBB受体的多肽，促进穿过BBB，例如在主题治疗方法(参见下文)中，所述主题治疗方法涉及对其有需要的个体施用主题抗体。结合内源BBB受体的合适的多肽包括抗体，例如单克隆抗体，或其抗原结合片段，其特异性结合内源BBB受体。合适的内源BBB受体包括但不限于胰岛素受体、转铁蛋白受体、瘦蛋白受体、脂蛋白受体、和胰岛素样生长因子受体。参见例如美国专利公开文本No.2009/0156498。
作为一个例子，主题抗-Tau抗体可以是包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分的双特异性抗体，所述第一抗原结合部分特异性结合Tau多肽中的表位(例如Tau的氨基端(N末端)部分，例如Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸1-18内，或Tau的氨基酸9至18内的线性表位)，所述第二抗原结合部分结合内源BBB受体。例如，在一些情况中，主题抗-Tau抗体是包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分的双特异性抗体，所述第一抗原结合部分特异性结合Tau多肽中的表位(例如Tau的氨基端(N末端)部分，例如Tau的氨基酸1-25内，Tau的氨基酸1-18内，或Tau的氨基酸9至18内的线性表位)，所述第二抗原结合部分结合转铁蛋白受体。
例如，本发明的抗-Tau抗体可以与促进穿过BBB的肽融合，所述肽长度为约15个氨基酸至约25个氨基酸，并且包含与下列肽之一具有至少约85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：Angiopep-1(TFFYGGCRGKRNNFKTEEY；SEQ ID NO:75)；Angiopep-2(TFFYGGSRGKRNNFKTEEY；SEQ ID NO:76)；cys-Angiopep-2(CTFFYGGSRGKRNNFKTEEY；SEQ IDNO:77)；Angiopep-2-cys(TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC；SEQ ID NO:78)；and an aprotininfragment(TFVYGGCRAKRNNFKS；SEQ ID NO:79)。参见例如美国专利公开文本Nos.2011/0288011；和2009/0016959。促进穿过BBB的肽可以与抗-Tau轻链区的N末端，抗-Tau轻链区的C末端，抗-Tau重链区的N末端，抗-Tau重链区的C末端，主题抗-Tau单链抗-体的N末端，主题抗-Tau单链抗-体的C末端等融合。
在一些实施方案中，主题抗体包含聚胺修饰。主题抗体的聚胺修饰增强了经修饰的抗体在BBB处的通透性。可以用天然存在的或合成的聚胺来修饰主题抗体。参见例如美国专利No.5,670,477。有用的天然存在的聚胺包括腐胺，亚精胺，精胺，1,3-二氨基丙烷、降亚精胺(norspermidine)、合成-高亚精胺(syn-homospermidine)、热胺、热精胺(thermospermine)、嗜热性五胺(caldopentamine)、高嗜热性五胺(homocaldopentamine)、和刀豆四胺(canavalmine)。腐胺、亚精胺和精胺是特别有用的。合成的聚胺由经验式CXHYNZ构成，可以是环状或非环状的，分支或无分支的3-12碳原子的烃链，其进一步包含1-6个NR或N(R)2模块，其中R是H、(C1-C4)烃基、苯基或苯甲基。可以使用标准的交联方法将聚胺与抗体连接。
在一些实施方案中，将主题抗体修饰为包含碳水化合物模块，其中所述碳水化合物模块可以与抗体共价连接。在一些实施方案中，将主题抗体修饰为包含脂质模块，其中所述脂质模块可以与抗体共价连接。合适的脂质模块包括例如N-脂肪酰基基团，如N-月桂酰、N-油酰，等等；脂肪胺诸如十二烷基胺，油酰胺，等等；C3-C16长链脂肪族脂质；等等。参见例如美国专利No.6,638,513)。在一些实施方案中，将主题抗体掺入脂质体中。
生产主题抗体的方法
可以通过任何己知的方法，例如用于蛋白质合成的常规合成方法；重组DNA方法等等来生产主题抗体。
当主题抗体是单链多肽时，其可以使用标准的化学肽合成技术来合成。当通过化学合成多肽时，可以经液相或固相进行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中将序列的C末端氨基酸附接于不溶性支持物，接着序贯添加序列中剩余的氨基酸)是适合于主题抗体的化学合成的方法的例子。各种形式的SPPS，诸如Fmoc和Boc可用于合成主题抗体。用于固相合成的技术描述于Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284页于The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis,PartA.,Merrifield,等J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963)；Stewart等,Solid PhasePeptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和GanesanA.2006Mini Rev.Med Chem.6:3-10和Camarero JA等2005Protein Pept Lett.12:723-8中。简言之，用其上构建有肽链的功能性单元处理小的不溶性多孔珠。在偶联/去保护的重复循环后，将附接的固相的游离N末端胺与单个受N保护的氨基酸单元偶联。然后，将此单元去保护，露出可以与别的氨基酸附接的新的N末端胺。所述肽保持固定在固相上，并且经历过滤过程，之后将其切掉。
可以使用标准重组方法来生产主题抗体。例如，将编码轻链和重链可变区(其任选地连接至恒定区)的核酸插入表达载体中。可以将轻链和重链克隆于相同或不同表达载体中。将编码免疫球蛋白链的DNA区段与确保免疫球蛋白多肽表达的表达载体中的控制序列可操作地连接。表达控制序列包括但不限于启动子(例如天然关联的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件、和转录终止序列。表达控制序列可以是载体中的真核启动子系统，所述载体其能够转化或转染真核宿主细胞(例如COS或CHO细胞)。一旦将载体掺入合适的宿主中，在适合于核苷酸序列的高水平表达及抗体的收集和纯化的条件下维持宿主。
由于代码的简并性，每种免疫球蛋白氨基酸序列可以由多种核酸序列编码。可以通过从头固相DNA合成或者通过所需多核苷酸的早期制备变体的聚合酶链式反应(PCR)诱变生成期望的核酸序列。寡核苷酸介导的诱变是适合于制备靶多肽DNA的取代、缺失和插入突变的方法的例子。参见Adelman等，DNA 2:183(1983)。简言之，通过将编码所需突变的寡核苷酸与单链DNA模板杂交改变靶多肽DNA。在杂交后，使用DNA聚合酶合成模板的完整第二互补链，其掺入寡核苷酸引物，并且编码靶多肽DNA中的选定变化。
合适的表达载体通常在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分可复制。通常，表达载体含有选择标志物(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)以容许用期望的DNA序列转化的那些细胞的检测。
大肠杆菌(Escherichia coli)是可以用于克隆主题抗体编码多核苷酸的原核宿主细胞的例子。适合于使用的其它微生物宿主包括杆菌，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以生成表达载体，其通常会含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外，会存在许多公知的启动子，诸如乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统，beta-内酰胺酶启动子系统，或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常会控制表达，任选在操纵基因序列的情况中，并且具有核糖体结合位点序列等，以启动并完成转录和翻译。
其他微生物，诸如酵母也可用于表达。酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母(Pichia)是合适的酵母宿主细胞的例子，其中合适的载体根据需要具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。诱导型酵母启动于特别包括来自醇脱氢酶、异细胞色素(isocytochrome)C、和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
在微生物外，哺乳动物细胞(例如在体外细胞培养物中培养的哺乳动物细胞)也可以用于表达并生成本发明的抗-Tau抗体(例如编码主题抗-Tau抗体的多核苷酸)。参见Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、和经转化的B细胞或杂交瘤。用于这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列，如复制起点，启动子和增强子(Queen等,Immunol.Rev.89:49(1986))，以及必需的加工信息位点，诸如核糖体结合位点，RNA剪接位点，多聚腺苷酸化位点，和转录终止子序列。合适的表达控制序列的例子是免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等衍生的启动子。参见Co等,J.Immunol.148:1149(1992)。
一旦合成(化学或重组方式)，可以依照本领域的标准规程，包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，高效液相层析(HPLC)，凝胶电泳等来纯化主题抗体的全抗体、其二聚体、单独的轻链和重链、或其它形式(例如scFv等)(一般参见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,(1982))。主题抗体可以是基本上纯的，例如至少约80％至85％纯的，至少约85％至90％纯的，至少约90％至95％纯的，或98％至99％纯的或更多，例如不含污染物，所述污染物如细胞碎片，除主题抗体以外的大分子，等等。
组合物
本发明提供了包含主题抗体的组合物。在主题抗体外，主题抗体组合物可以包含下列一项或多项：盐，例如NaCl、MgCl2、KC1、MgSO4，等等；缓冲剂，例如Tris缓冲剂，N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙烷磺酸)(HEPES)，2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)，2-(N-吗啉代)乙烷磺酸钠盐(MES)，3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)，N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)，等等；加溶剂；去污剂，例如非离子型去污剂如Tween-20，等等；蛋白酶抑制剂；甘油；等等。
核酸、表达载体和宿主细胞
本发明提供了包含编码主题抗-Tau抗体的核苷酸序列的核酸。
编码主题抗-Tau抗体的核苷酸序列可以包含如下的核苷酸序列，其编码轻链可变区并且与图1B中描述且SEQ ID NO:17中所列的核苷酸序列具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％核苷酸序列同一性。
编码主题抗-Tau抗体的核苷酸序列可以包含如下的核苷酸序列，其编码重链可变区并且与图1A中描述且SEQ ID NO:18中所列的核苷酸序列具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％核苷酸序列同一性。
编码主题抗-Tau抗体的核苷酸序列可以包含如下的核苷酸序列，其编码轻链可变区并且与图2B中描述且SEQ ID NO:19中所列的核苷酸序列具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％核苷酸序列同一性。
编码主题抗-Tau抗体的核苷酸序列可以包含如下的核苷酸序列，其编码重链可变区并且与图2A中描述且SEQ ID NO:20中所列的核苷酸序列具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％核苷酸序列同一性。
可以将编码主题抗体的核苷酸序列可操作地连接至一种或多种容许核苷酸序列在意图的靶细胞(例如经遗传修饰以合成编码的抗体的细胞)中表达的调控元件，如启动子和增强子。
合适的启动子和增强子元件是本领域中己知的。对于在细菌细胞中表达而言，合适的启动子包括但不限于lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。对于在真核细胞中表达，合适的启动子包括但不限于轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒立即早期启动子(immediate early promoter)；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；存在于来自逆转录病毒的长末端重复中的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；和各种本领域己知的组织特异性启动子。
在一些实施方案中，例如对于在酵母细胞中的表达而言，合适的启动子是组成性启动子如ADH1启动子，PGK1启动子，ENO启动子，PYK1启动子等等，或是可调控的启动子如GAL1启动子，GAL10启动子，ADH2启动子，PHO5启动子，CUP1启动子，GAL7启动子，MET25启动子，MET3启动子，CYC1启动子，HIS3启动子，ADH1启动子，PGK启动子，GAPDH启动子，ADC1启动子，TRP1启动子，URA3启动子，LEU2启动子，ENO启动子，TP1启动子和AOX1(例如用于毕赤酵母).。合适的载体和启动子的选择完全在本领域普通技术人员的水平内。
在原核宿主细胞中使用的合适启动子包括但不限于噬菌体T7RNA聚合酶启动子trp启动子；lac operon启动子；hybrid启动子，例如lac/tac hybrid启动子，tac/trc杂交启动子，trp/lac启动子,T7/lac启动子；trc启动子；tac启动子，等等；araBAD启动子；体内调控的启动子，如ssaG启动子或相关的启动子(参见例如美国专利公开文本No.20040131637)，pagC启动子(Pulkkinen和Miller,J.Bacteriol.,1991:173(1):86-93；Alpuche-Aranda等,PNAS,1992；89(21):10079-83)，nirB启动子(Harborne等(1992)Mol.Micro.6:2805-2813)，等等(参见例如Dunstan等(1999)Infect.Immun.67:5133-5141；McKelvie等(2004)Vaccine 22:3243-3255；和Chatfield等(1992)Biotechnol.10:888-892)；sigma70启动子，例如共有sigma70启动子(参见例如GenBank登录号AX798980、AX798961、和AX798183)；固定相启动子，例如dps启动子，spv启动子，等等；来源于病原性胰岛SPI-2的启动子(see,e.g.,WO96/17951)；actA启动子(参见例如Shetron-Rama等(2002)Infect.Immun.70:1087-1096)；rpsM启动子(参见例如Valdivia和Falkow(1996).Mol.Microbiol.22:367)；tet启动子(参见例如Hillen,W.和Wissmann,A.(1989)于Saenger,W.和Heinemann,U.(eds),Topics in Molecular and Structural Biology,Protein–Nucleic Acid Interaction.Macmillan,London,UK,Vol.10,pp.143–162中)；SP6启动子(参见例如Melton等(1984)Nucl.Acids Res.12:7035)；等等。适于在原核细胞如大肠杆菌中使用的强启动子包括但不限于Trc，Tac，T5，T7，和PLambda。在细菌宿主细胞中使用的操纵基因的非限制性例子包括乳糖启动子操纵基因(Lacl阻遏蛋白在与乳糖接触时改变构象，由此阻止Lacl阻遏蛋白结合操纵基因)，色氨酸启动子操纵基因(在与色氨酸复合时，TrpR阻遏蛋白具有结合操纵基因的构象；在缺乏色氨酸的情况中，TrpR阻遏蛋白具有不结合操纵基因的构象)，和tac启动子操纵基因(参见例如deBoer等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25)。
编码主题抗体的核苷酸序列可以存在于表达载体和/或克隆载体中。当主题抗体包含两个分开的多肽时，可以将编码两个多肽的核苷酸序列在相同或分开的载体中克隆。表达载体可以包含选择标志物、复制起点、和提供载体复制和/或维持的其它特征。
大量合适的载体和启动子是本领域技术人员己知的；许多是商品化的，用于生成主题重组构建体。提供下列载体作为例子。细菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescriptSK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene、La Jolla、Calif.、USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、and pRIT5(Pharmacia、Uppsala、Sweden).Eukaryotic:pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。
表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点以提供编码异源蛋白质的核酸序列的插入。可以存在在表达宿主中起作用的选择标志物。合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于痘病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见例如Li等,InvestOpthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994；Borras等,Gene Ther 6:515 524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等,H Gene Ther 5:1088 1097,1999；WO94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺伴随病毒(参见例如Ali等,Hum Gene Ther 9:81 86,1998,Flannery等,PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等,Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997；Jomary等,Gene Ther4:683 690,1997,Rolling等,Hum Gene Ther 10:641 648,1999；Ali等,Hum Mol Genet 5:591 594,1996；Srivastava in WO 93/09239,Samulski等,J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等,Virol.(1988)166:154-165；和Flotte等,PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒(参见例如Miyoshi等,PNAS 94:10319 23,1997；Takahashi等,J Virol 73:7812 7816,1999)的载体；逆转录病毒载体(例如鼠白血病病毒、脾坏死病毒，和来源于逆转录病毒诸如劳斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈维(Harvey)肉瘤病毒、禽白血病病毒(avian leukosis virus)、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒、和乳房肿瘤病毒)的载体；等等。
如上文所述，主题核酸包含编码主题抗体的核苷酸序列。主题核酸可以包含编码IPN001的重链和轻链CDR的核苷酸序列。在一些实施方案中，主题核酸包含编码IPN002的重链和轻链CDR的核苷酸序列，其中CDR编码序列之间穿插有FR编码核苷酸序列。在一些实施方案中，FR编码核苷酸序列是人FR编码核苷酸序列。
宿主细胞
本发明提供了分离的经遗传修饰的宿主细胞(例如体外细胞)，其用主题核酸遗传修饰。在一些实施方案中，主题的分离的经遗传修饰的宿主细胞可以生成主题抗体。
合适的宿主细胞包括真核宿主细胞，诸如哺乳动物细胞，昆虫宿主细胞，酵母细胞；和原核细胞，诸如细菌细胞。例如，可以通过磷酸钙沉淀、DEAE右旋糖苷介导的转染、脂质体介导的转染、电穿孔、或其它己知的方法实现主题核酸对宿主细胞的导入。
合适的哺乳动物细胞包括原代细胞和永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括人细胞系，非人灵长类细胞系，啮齿类(例如小鼠，大鼠)细胞系，等等。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞(例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)No.CCL-2)，CHO细胞(例如ATCC Nos.CRL9618，CCL61，CRL9096)，293细胞(例如ATCC No.CRL-1573)，Vero细胞，NIH3T3细胞(例如ATCC No.CRL-1658)，Huh-7细胞，BHK细胞(例如ATCC No.CCL10)，PC12细胞(ATCC No.CRL1721)，COS细胞，COS-7细胞(ATCC No.CRL1651)，RAT1细胞，小鼠L细胞(ATCCNo.CCLI.3)，人胚肾(HEK)细胞(ATCC No.CRL1573)，HLHepG2细胞，等等。在一些情况中，所述细胞是HEK细胞。在一些情况中，所述细胞是CHO细胞，例如CHO-K1细胞(ATCC No.CCL-61)，CHO-M细胞，CHO-DG44细胞(ATCC No.PTA-3356)，等等。
合适的酵母细胞包括但不限于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia opuntiae、耐热毕赤酵母(Pichiathermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、毕赤酵母属菌种(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母属菌种(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属菌种(Kluyveromyces sp.)、乳糖克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白念珠菌(Candidaalbicans)、构巢曲霉(Aspergillus niclulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、镰孢菌属菌种(Fusarium sp.)、禾谷镰孢菌(Fusarium gramineum)、Fusarium venenatum、粗糙链孢菌(Neurospora crassa)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，等等。
合适的原核细胞包括但不限于大肠杆菌、乳杆菌属菌种(Lactobacillus sp.)等的多种实验室菌株的任一种。参见例如J.Immunol.148:1176-1181；美国专利No.6,447,784；和Sizemore等(1995)Science 270:299-302。典型地，实验室菌株是非病原性的。其它合适的细菌的非限制性例子包括但不限于枯草芽孢杆菌等。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。
药物制剂
本发明提供了包含主题抗体的组合物，包括药物组合物。一般地，制剂包含有效量的主题抗体。“有效量”意指足以产生期望的结果的剂量，所述期望的结果例如与tau病变有关的不利症状的减少，tau病变症状的改善，tau病变进展的减缓，等等。一般而言，期望的结果是与对照相比至少tau病变的症状减少。可以以如下的方式递送主题抗体，从而避免血脑屏障，下文对其有更为详细的描述。可以配制和/或修饰主题抗体以使抗体能够穿过血脑屏障。
本发明提供了药物制剂，其包含：a)特异性地结合Tau的N末端部分内的表位的抗体，其中所述抗体包含：(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；(iii)VL CDR3，其包含SEQID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；(iv)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(v)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(vi)VHCDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列；和b)适于对人施用的药学上可接受的赋形剂，其中所述制剂不含内毒素。
本发明提供了药物制剂，其包含：a)分离的人源化单克隆抗体，其特异性地结合Tau多肽的氨基酸15-24内的表位；和b)药学上可接受的赋形剂，其中在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂适于对人施用。
本发明提供了药物制剂，其包含：A)分离的抗体，其包含人源化轻链框架区；和人源化重链框架区，其中所述分离的抗体与另一抗体竞争结合至Tau多肽的N末端区中的表位，所述另一抗体包含：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VLCDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VHCDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列；和B)药学上可接受的赋形剂，其中在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂适于对人施用。
本发明提供了药物制剂，其包含：A)分离的抗体，其中所述抗体是Fv、scFv、Fab、F(ab')2或Fab'，且其中所述抗体与另一抗体竞争结合至Tau多肽的N末端区中的表位，所述另一抗体包含：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12的氨基酸序列；和B)药学上可接受的赋形剂，其中在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂适于对人施用。
本发明提供了药物制剂，其包含：A)分离的抗体，其中所述分离的抗体包含人轻链恒定区和人重链恒定区，且其中所述分离的抗体与另一抗体竞争结合至Tau多肽的N末端区中的表位，所述另一抗体包含：a)轻链区，其包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:7的氨基酸序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及b)重链区，其包含(i)VH CDR1，其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQID NO:5或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和(iii)VH CDR3，其包含SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:12的氨基酸序列；和B)药学上可接受的赋形剂，其中在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂适于对人施用。
制剂
在主题方法中，可以使用能够产生期望的治疗效果或诊断效果的任何方便的手段对宿主施用主题抗体。如此，可以将药剂掺入多种制剂中以进行治疗性施用。更具体来说，可以通过与合适的药学上可接受的的载体或稀释剂组合将主题抗体配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊、粉末、颗粒剂、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。
在药用剂量形式中，主题抗体可以以其药学上可接受的盐的形式施用，或者它们也可以单独或与其它药学活性化合物适当联合及组合使用。以下方法和赋形剂仅仅是示例性的，而绝不是限制性的。
对于口服制剂，主题抗体可以单独使用或与合适的添加剂组合使用以生成片剂、粉末、颗粒剂或胶囊，例如与常规的添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；粘合剂，如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶(acacia)、玉米淀粉或明胶；崩解剂(disintegrator)，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；润滑剂，如滑石或硬脂酸镁组合使用；且若需要的话，与稀释剂，缓冲剂，湿润剂，防腐剂和矫味剂(flavoring agent)组合使用。
可以通过如下方法将主题抗体配制成注射制剂，即将它们在水性或非水性溶剂如植物油或其它类似的油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸或丙二醇的酯中溶解、悬浮或乳化；且若需要的话，具有常规的添加剂，诸如增溶剂，等张剂，悬浮剂，乳化剂，稳定剂和防腐剂。
通过混合具有所需纯度的抗体与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和/或张力剂来制备包含主题抗体的药物组合物。可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂在采用的剂量和浓度处对于接受者是无毒的，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸和柠檬酸；防腐剂(如乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟苯甲酸甲酯或丙酯、苯扎氯铵或其组合)；氨基酸如精氨酸，甘氨酸，鸟氨酸，赖氨酸，组氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，丝氨酸，脯氨酸及其组合；单糖、二糖和其它碳水化合物；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如明胶或血清白蛋白；螯合剂如EDTA；糖类诸海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、半乳糖胺、和神经氨酸；和/或非离子型表面活性剂如Tween、Brij Pluronics、Triton-X、或聚乙二醇(PEG)。
药物组合物可以为液体形式，冻干形式或自冻干形式重建的液体形式，其中冻干制剂在施用前要用无菌溶液重建。用于重建冻干的组合物的标准规程是反向添加一定体积的纯水(通常等于冻干期间除去的体积)；然而，可以使用包含抗细菌剂的溶液生成供胃肠外施用的药物组合物；还可参见Chen(1992)Drug Dev Ind Pharm 18,1311-54。
主题药物组合物中的例示性抗体浓度范围可以为约1mg/mL至约200mg/ml或约50mg/mL至约200mg/mL，或约150mg/mL至约200mg/mL。
可以在pH缓冲溶液中，例如范围为绚4.0至约7.0，或约5.0至约6.0，或备选约5.5的pH中制备抗体的水性制剂。适合于此范围内的pH的缓冲剂的例子包括磷酸盐、组氨酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐缓冲剂和其它有机缓冲剂。缓冲剂浓度可以是约1mM至约100mM，或约5mM至约50mM，这取决于例如缓冲剂和制剂的期望张力。
抗体制剂中可以包含张力剂以调控制剂的张力。例示性的张力剂包括氯化钠、氯化钾、甘油和来自氨基酸组的任何组分，糖类及其组合。在一些实施方案中，水性制剂是等张的，尽管高张的或低张的溶液可以是合适的。术语“等张的”意指与同其比较的一些其它溶液具有相同张力的溶液，诸如生理盐溶液或血清。张力剂可以以约5mM至约350mM，例如以100mM至350nM的量使用。
也可以将表面活性剂添加至抗体制剂以降低配制抗体的聚集和/或最小化制剂中颗粒的形成和/或降低吸附。例示性的表面活性剂包括聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯(polyoxyethylensorbitan fatty acid ester，Tween)，聚氧乙烯烷基醚(polyoxyethylene alkyl ether)(Brij)，烷基苯基聚氧乙烯醚(alkylphenylpolyoxyethylene ether)(Triton-X)。聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer)(Poloxamer，Pluronic)，和十二烷基硫酸钠(SDS)。可溶性聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯的例子是聚山梨醇酯20(以Tween 20TM商标出售)和聚山梨醇酯80(以Tween 80TM商标出售)。合适的聚乙烯-聚丙烯共聚物的例子是以F68或Poloxamer188TM的名称出售的那些。合适的聚氧乙烯烷基醚的例子是以BrijTM商标出售的那些。表面活性剂的例示性浓度的范围可以是约0.001％至约1％w/v。
也可以添加冻干保护剂(lyoprotectant)以在冻干过程期间对抗去稳定化(destabilizing)条件而保护不稳定的活性成分(例如蛋白质)。例如，己知的冻干保护剂包括糖类(包括葡萄糖和蔗糖)；多元醇(包括甘露醇、山梨糖醇和甘油)；和氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。冻干保护剂可以以约10mM至500nM的量包含在内。
在一些实施方案中，主题制剂包含主题抗体，和一种或多种上文鉴定的药剂(例如表面活性剂、缓冲剂、稳定剂、张力剂)，并且基本上不含一种或多种防腐剂，如乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟苯甲酸甲酯或丙酯、苯扎氯铵及其组合。在其它实施方案中，防腐剂以约0.001至约2％(w/v)的浓度范围包含在制剂中。
例如，主题制剂可以是适合于胃肠外施用的液体或冻干制剂，并且可以包含：约1mg/mL至约200mg/mL主题抗体；约0.001％至约1％至少一种表面活性剂；约1mM至约100mM缓冲剂；任选约l0mM至约500mM稳定剂；和约5mM至约305mM张力剂；并且具有约4.0至约7.0的pH。
作为另一个例子，主题胃肠外制剂是液体或冻干制剂，其包含：约1mg/mL至约200mg/mL主题抗体；0.04％Tween 20w/v；20mM L-组氨酸；和250mM蔗糖；并且具有5.5的pH。
作为另一个例子，主题胃肠外制剂包含冻干制剂，其包含：1)15mg/mL主题抗体：0.04％Tween 20w/v；20mM L-组氨酸；和250mM蔗糖；并且具有5.5的pH；或2)75mg/mL主题抗体；0.04％Tween 20w/v；20mM L-组氨酸；和250mM蔗糖；并且具有5.5的pH；或3)75mg/mL主题抗体；0.02％Tween 20w/v；20mM L-组氨酸；和250mM蔗糖；并且具有5.5的pH；或4)75mg/mL主题抗体；0.04％Tween 20w/v；20mM L-组氨酸；和250mM海藻糖；并且具有5.5的pH；或6)75mg/mL主题抗体；0.02％Tween 20w/v；20mM L-组氨酸；和250mM海藻糖；并且具有5.5的pH。
作为另一个例子，主题胃肠外制剂包含液体制剂，其包含：1)7.5mg/mL主题抗体；0.022％Tween 20w/v；120mM L-组氨酸；和250125mM蔗糖；并且具有5.5的pH；或2)37.5mg/mL主题抗体；0.02％Tween 20w/v；10mM L-组氨酸；和125mM蔗糖；并且具有5.5的pH；或3)37.5mg/mL主题抗体；0.01％Tween 20w/v；10mM L-组氨酸；和125mM蔗糖；并且具有5.5的pH；或4)37.5mg/mL主题抗体；0.02％Tween 20w/v；10mM L-组氨酸；125mM海藻糖；并且具有5.5的pH；或5)37.5mg/mL主题抗体；0.01％Tween 20w/v；10mM L-组氨酸；和125mM海藻糖；并且具有5.5的pH；或6)5mg/mL主题抗体；0.02％Tween 20w/v；20mM L-组氨酸；和250mM海藻糖；并且具有5.5的pH；或7)75mg/mL主题抗体；0.02％Tween 20w/v；20mM L-组氨酸；和250mM甘露醇；并且具有5.5的pH；或8)75mg/mL主题抗体；0.02％Tween 20w/v；20mM L组氨酸；和140mM氯化钠；并且具有5.5的pH；或9)150mg/mL主题抗体；0.02％Tween 20w/v；20mML-组氨酸；和250mM海藻糖；并且具有5.5的pH；或10)150mg/mL主题抗体；0.02％Tween 20w/v；20mM L-组氨酸；和250mM甘露醇；并且具有5.5的pH；或11)150mg/mL主题抗体；0.02％Tween 20w/v；20mM L-组氨酸；和140mM氯化钠；并且具有5.5的pH；或12)10mg/mL主题抗体；0.01％Tween 20w/v；20mM L-组氨酸；和40mM氯化钠；并且具有5.5的pH。
可以在要经吸入施用的气雾剂制剂中利用主题抗体。可以将主题抗体配制入加压的可接受推进剂如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。
此外，可以通过与多种基质如乳化基质或水溶性基质混合将主题抗体制成栓剂。可以通过栓剂经直肠施用主题抗体。栓剂可以包含媒介物如可可油、Carbowaxes和聚乙二醇，其在体温熔解，但在室温是凝固的。
可以提供用于口服或直肠施用的单位剂量形式，如糖浆剂、酏剂、和悬浮液，其中每个剂量单位(例如茶匙(teaspoonful)、汤匙(tablespoonful)、片(tablet)或栓剂(suppository))含有预先确定量的含有一种或多种抑制剂的组合物。类似地，用于注射或静脉内施用的单位剂量形式可以包含在组合物中的主题抗体，其作为无菌水、生理盐水或另一种药学上可接受的载体中的溶液。
如本文中使用的，术语“单位剂量形式”指生理上适合作为人和动物受试者的单位剂量的离散单位，每个单位含有预先确定量的本发明的抗-Tau抗体，经计算其量足以与药学可接受的稀释剂、载体或媒介物结合产生所需的效果。主题抗体的规格可以取决于采用的具体抗体和要实现的效果，以及受主中与每种抗体相关的药效学特性。
其它施用模式也会在本发明的方法中得到应用。例如，可以将主题抗体配制成栓剂，以及在一些情况中是气雾剂和鼻内组合物。对于栓剂，媒介物组合物会包含传统的粘合剂和载体，如聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)或甘油三酯。此类栓剂可以自含有范围为约0.5％至约10％(w/w)，例如约1％至约2％的活性成分的混合物形成。
鼻内制剂通常会包含既不引起鼻粘膜的刺激也不显著扰乱纤毛功能的媒介物。可以采用稀释剂，如水、水性盐水或其他己知的物质。鼻制剂也可以含有防腐剂，例如但不限于氯丁醇和苯扎氯铵。可以存在表面活性剂以增强鼻粘膜对主题抗体的吸附。
主题抗体可以作为可注射制剂施用。通常，可注射组合物制备为液体溶液或悬浮液；也可以制备适合于用于液体媒介物中的溶液或悬浮液中的注射前固体形式。也可以将制剂进行乳化或者将抗体囊封于脂质体媒介物中。
合适的赋形剂媒介物是例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，及其组合。另外，若需要的话，媒介物可以含有少量的辅助物质，如湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。制备此类剂量形式的实际方法是己知的，或者对于本领域技术人员是显而易见的。参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania，第17版，1985。要施用的组合物或制剂无论如何都会含有足以实现所治疗受试者中期望的状态的主题抗体量。
药学上可接受的赋形剂，诸如媒介物、佐剂、载体或稀释剂是公众容易可获得的。此外，药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂等是公众容易可获得的。
在一些实施方案中，将主题抗体配制为受控释放制剂。可以使用本领域中公知的方法制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，其中所述基质为定形制品形式，例如膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、水凝胶、聚交酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。可以通过使用合适的添加剂，通过控制含湿量及通过开发特定的聚合物基质组合物来阻止持续释放制剂中包含的抗体的生物学活性的可能丧失和免疫原性的可能变化。
在本发明的范围内的受控释放可以理解为意指多种延长释放剂量形式的任一种。出于本发明的目的，可以认为以下术语基本上等同于受控释放：连续释放、受控释放、延迟释放、贮积(depot)、逐渐释放、长期释放、程序化释放(programmed release)、延长释放、成比例释放、拖延释放、储库(repository)、延迟、缓慢释放、间隔释放、持续释放、时间涂层(time coat)、时受控释放放(timed release)、延迟作用、延长作用、分层时间作用(layered-time action)、长效、延长作用、重复作用、减缓起作用、持续作用、持续作用药物、和延长的释放。这些术语的其它讨论可以参见Lesczek Krowczynski,Extended- Release Dosage Forms,1987(CRC Press,Inc.)。
各种受控释放技术涵盖非常广谱的药物剂量形式。受控释放技术包括但不限于物理系统和化学系统。
物理系统包括但不限于具有速率控制膜的贮存库(reservoir)系统，如微囊化、宏囊化(macroencapsulation)，和膜系统；没有速率控制膜的贮存库系统，诸如中空纤维、超微孔三乙酸纤维素、和多孔聚合基底和泡沫；单片系统，包括在非多孔、聚合、或弹性体基质(例如非可侵蚀的、可侵蚀的、环境因素进入(environmental agent ingression)、和可降解的)中物理溶解的那些系统，和在非多孔、聚合、或弹性体基质(例如非可侵蚀的、可侵蚀的、环境因素进入、和可降解的)中物理分散的材料；层状结构，包括与外部控制层化学相似或不相似的贮存库层；和其它物理方法，如渗透泵或吸附到离子交换树脂上。
化学系统包括但不限于聚合物基质的化学侵蚀(例如异质或同质侵蚀)，或聚合物基质的生物侵蚀(例如异质或同质的)。关于受控释放的系统的类别的其它讨论可以参见Agis F.Kydonieus,Controlled Release Technologies:Methods,Theory and Applications,1980(CRC Press,Inc.)。
研发用于口服施用的受控释放药物制剂有许多。这些包括但不限于渗透压控制的胃肠外递送系统；流体动力学压力控制的胃肠外递送系统；膜渗入控制胃肠外递送系统，其包括微孔膜渗入控制胃肠外递送系统；胃液抗性肠靶向控制释放胃肠外递送装置；凝胶扩散控制胃肠外递送系统；和离子交换控制胃肠外递送系统，其包含阳离子和阴离子药物。关于受控释放药物递送系统的其它信息可以参见Yie W.Chien,Novel Drug Delivery Systems,1992(Marcel Dekker,Inc.)。
剂量
主治内科医生或其他有资格的医学人员基于各种临床因素可以确定合适的剂量。如医学领域中公知的，用于任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体格、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、患者的性别、时间、和施用路径、总体健康、和同时施用的其它药物。主题抗体可以以每剂1ng/kg体重至20mg/kg体重，例如0.1mg/kg体重至10mg/kg体重，例如0.5mg/kg体重至5mg/kg体重的量施用；然而，也涵盖低于或高于此例示性范围的剂量，特别是考虑前述因素。如果方案是连续输注，那么其范围也可以为每千克体重每分钟1μg至10mg。
本领域技术人员容易理解剂量水平可以作为具体抗体、症状的严重性和受试者对副作用的易感性的函数而变化。本领域技术人员通过多种手段容易确定给定化合物的优选剂量。
施用路径
使用适合于药物递送的任何可用方法和路径，包括体内和离体方法及全身和局部施用路径对个体施用主题抗体。
常规的且药学上可接受的施用路径包括鼻内、肌内、气管内、鞘内、皮下、皮内、局部施用、静脉内、动脉内、直肠、鼻、口服、和其他肠和胃肠外施用路径。若需要的话，可以将施用路径进行组合，或者根据抗体和/或所需的效果进行调整。主题抗体组合物可以在单剂或多剂中施用。在一些实施方案中，口服施用主题抗体。在一些实施方案中，经吸入途径施用主题抗体组合物。在一些实施方案中，鼻内施用主题抗体组合物。在一些实施方案中，局部施用主题抗体组合物。在一些实施方案中，颅内施用主题抗体组合物。在一些实施方案中，静脉内施用主题抗体组合物。在一些实施方案中，鞘内施用主题抗体组合物。
可以使用任何可用的常规方法和适合于递送常规药物的路径对受主施用本发明的抗体，包括全身或局部路径。一般地，本发明涵盖的施用路径包括但不必然限于肠、胃肠外、或吸入路径。
与吸入施用不同的胃肠外施用路径包括但不必然限于表面、经皮、皮下、肌内、框内、囊内、脊柱内、胸骨内、鞘内、和静脉内路径，即与经由消化道不同的任何施用路径。可以实施胃肠外施用以实现系统性或局部递送主题抗体。在需要全身性递送时，施用通常涉及药物制剂的侵入或全身性吸收的局部或粘膜施用。
也可以通过肠施用来对受试者递送主题抗体。肠施用路径包括但不必然限于口服和肠(例如使用栓剂)递送。
治疗(treatment)意指至少改善与使宿主痛苦的病理学状况有关的症状，其中改善(以其广义使用)指至少与治疗的病理学状况(如tau病变)有关的参数(例如症状)幅度的降低。因此，治疗还包括将病理学状况，或至少与其有关的症状完全抑制，例如阻止发生，或停止(例如终止)，使得宿主不再患有病理学状况，或至少表征病理学状况的症状的情况。
例如，在一些实施方案中，通过注射和/或递送至脑动脉中的位置或直接递送到脑组织中，从而施用主题抗体。例如，也可以通过生物弹射(biolistic)递送至靶部位，从而直接对靶部位施用主题抗体。
多种受主(其中术语“受主”在本文中与术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用)根据主题方法是可治疗的。一般而言，此类宿主是“哺乳动物”，其中这些术语广泛用于描述哺乳动物类内的生物体，包括食肉动物目(carnivore)(例如犬和猫)、啮齿目(rodentia)(例如小鼠、豚鼠、和大鼠)、和灵长目(primates)(例如人、黑猩猩和猴)内的生物体。在一些实施方案中，受主是人。
提供了具有单位剂量的主题抗体的(例如口服或可注射剂量的)试剂盒。在此类试剂盒中，含有单位剂量的容器外有信息包装插页，其描述了抗体在治疗感兴趣的病理学状况中的用途和伴随益处。优选的化合物和单位剂量是上文描述的那些。
检测方法
本发明提供了检测自个体获得的生物样品中Tau多肽的体外方法；及体内检测活个体中Tau多肽的方法。主题体外检测方法可以是定量的。如此，Tau可以充当用于tau病变进展，或对tau病变治疗的响应的生物标志物。
检测/定量的Tau多肽可以是：a)全长Tau；b)全长Tau的N末端片段；c)总的Tau，其中“总的Tau”可以包括任何同种型的全长Tau；d)游离的Tau，例如未与主题抗Tau抗体结合的Tau；和e)存在于生物样品中并且展现出被主题抗-Tau抗体识别的表位的任何N末端Tau片段。人全长Tau的氨基酸序列如图6A-D中所示。
在一些情况中，主题检测方法可以进一步包括测定生物样品中的Aβ40和/或Aβ42水平。可以使用免疫学测定法(例如ELISA)，例如使用结合Aβ40和/或Aβ42的抗体来实施测定生物样品中的Aβ40和/或Aβ42水平。
合适的生物样品包括例如脑脊液、血液、血浆、血清、尿液和唾液。
本发明检测自个体获得的生物样品中Tau多肽的体外方法一般涉及：a)使生物样品与如本文所述的抗-Tau抗体接触；并b)检测抗体对样品中存在的Tau多肽的结合。在一些情况中，抗-Tau抗体包含图1A和1B中所示的VH和/或VL CDR。在一些情况中，抗-Tau抗体包含图2A和2B的VH和/或VL CDR。
可以使用本发明的检测方法测定个体是否具有或有风险形成tau病变。可以使用本发明的检测方法测定tau病变的阶段(严重程度)。可以使用本发明的检测方法测定患者对治疗tau病变的治疗方案的响应。可以使用主题检测方法测试生物样品，其中生物样品获自怀疑患有tau病变的个体，已经诊断为患有tau病变的个体，具有形成tau病变的遗传素因的个体，等等。
本发明提供了诊断个体中的神经变性性tau病变的方法。该方法一般涉及(a)评估自个体获得的生物样品中Tau多肽的水平；并(b)将Tau多肽水平与指示正常对照受试者中Tau水平的参照、标准、或正常对照数值进行比较。生物样品中的Tau多肽水平和正常对照数值之间的显著差异指示个体患有神经变性性tau病变。
本发明提供了监测个体中神经变性性tau病变的进展的方法，或监测对个体中神经变性性tau病变的治疗的响应的方法。所述方法一般涉及将第一时间点处自个体获得的生物样品中的Tau多肽水平与第二时间点处自个体获得的生物样品中的Tau多肽水平进行比较。与在第一时间点处自个体获得的生物样品中的Tau多肽水平相比，在第二时间点处自个体获得的生物样品中的Tau多肽水平的差异可以提供关于以下的指示：i)tau病变是否在进展或疾病的进展是否已经停止；和/或ii)tau病变是以怎样快速地在进展；和/或iii)个体是否在展现出有益的临床响应，所述临床响应是针对用药物或用其他治疗tau病变的其它治疗方案治疗的。
本发明提供了对tau病变分期的方法。例如，主题方法可以提供对阿尔茨海默氏病的分期。例如，来自活个体的生物样品(例如CSF或其它液体生物样品)中的Tau多肽水平可以提供关于AD的Braak阶段的指示。Braak和Braak(1995)Neurobiol.Aging 16:271。例如，来自活个体的生物样品中的Tau多肽水平可以提供关于个体是否为AD的跨内嗅带(transentorhinal)I-II期；AD的边缘III-IV期；或AD的新皮质V-VI期的指示。
可以通过本领域中己知的任何合适的方法来评估生物样品中的Tau多肽水平。合适的方法包括但不限于蛋白质(“Western”)印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射性免疫测定法(RIA)、荧光活化细胞分选(FACS)、二维凝胶电泳、质谱法(MS)、基质辅助激光解吸/离子化飞行时间-MS(MALDI-TOF)、表面增强的激光解吸离子化-飞行时间(SELDI-TOF)、高效液相色谱(HPLC)、快速蛋白质液相色谱(FPLC)、多维液相色谱(LC)然后是串联质谱术(MS/MS)、和激光密度计量术。
本发明提供了监测个体中的tau病变进展的方法，其中方法一般涉及：a)测定在第一时间点处自个体获得的生物样品中Tau多肽的第一水平；b)测定在第二时间点处自个体获得的生物样品中Tau多肽的第二水平；并c)比较Tau的第二水平与Tau的第一水平。测定步骤可以包括：i)使生物样品与主题抗-Tau抗体接触；并ii)对抗体对样品中存在的Tau多肽的结合进行定量。
在一些情况中，第一时间点是启动治疗方案前的时间点，而第二时间点是启动治疗方案后的时间点。如此，本发明提供了监测对用治疗tau病变的药剂治疗的响应的方法，其中所述方法涉及：a)测定在第一时间点处自个体获得的生物样品中Tau多肽的第一水平，所述第一时间点在用治疗tau病变的药剂治疗启动前；b)测定在第二时间点处自个体获得的生物样品中Tau多肽的第二水平，所述第二时间点在用治疗tau病变的药剂治疗启动后；以及c)比较Tau的第二水平与Tau的第一水平。
也可以将监测tau病变进展的主题方法应用于监测共核蛋白病(synucleinopathy)，例如帕金森氏病(PD)；路易体痴呆(DLB)；多器官萎缩(MSA)等的进展的方法。例如，可以用主题方法监测PD伴痴呆(PDD)的进展。
在一些tau病变中，Tau的水平随疾病进展而升高。在其它tau病变中，Tau的水平随疾病进展而降低。因此，例如Tau的水平随AD进展而升高；并且随FTD进展而降低。
主题方法可以涉及包含主题抗-Tau抗体的试剂盒或测定装置的用途。本发明提供了用于实施如本文中描述的方法的试剂盒和测定装置。主题试剂盒包含本发明的抗-Tau抗体。
可以将抗-Tau抗体在不溶性支持物(例如测试条，多孔板的孔，珠(例如磁珠)等)
上固定化。合适的支持物是本领域中公知的，并且特别包括商品化的柱材料、聚苯乙烯珠、胶乳珠、磁珠、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅芯片和表面、硝酸纤维素条、尼龙膜、薄片、反应盘(例如多孔板)的孔、塑料管，等等。固体支持物可以包含多种物质之任一，包括例如玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、右旋糖苷、尼龙、直链淀粉、天然的和经修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖、和磁铁矿(magnetite)。适合于将主题抗体固定于固钵支持物上的方法是公知的，并且包括但不限于离子、疏水性、共价相互作用等。固体支持物可以是可溶的或不可溶的，例如在水性溶液中。在一些实施方案中，合适的固体支持物一般在水性溶液中是不可溶的。
本发明的抗-Tau抗体可以包含可检测标记物。在抗体包含可检测标记物的情况中，主题试剂盒可以包含一种或多种用于显现可检测标记物的试剂。经标记的抗体可以包含标记物，诸如化学发光剂、颗粒标记物、比色剂、能量转移剂、酶、荧光剂、或放射性同位素。合适的可检测标记物包括通过分光、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学、或化学手段可检测的任何组合物。合适的可检测标记物包括但不限于荧光标记物(例如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白，等等)；放射性标记物(例如3H、125I、35S、14C、或32P)；和酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤光素酶、和对底物起作用以生成可以通过荧光、比色、或分光光度手段检测的产物的其它酶)。
主题试剂盒可以进一步包含一种或多种额外组分，其中合适的额外组分包括：1)阳性对照；2)缓冲液(例如结合缓冲液；洗涤缓冲液；等等)；3)用于产生可检测信号的用途的试剂；等等。试剂盒的其它任选组分包含：蛋白酶抑制剂；可检测标记物；等等。根据期望，试剂盒的各种组分可以存在于不同的容器中或者某些相容的组分可以预先组合到单一容器中。
在上文提及的组分外，主题试剂盒可以包括使用试剂盒的组分实施主题方法的用法说明。一般在合适的记录介质上记录用于实施主题方法的用法说明。例如，可以在基底，诸如纸或塑料等上印刷用法说明。因此，用法说明可以以包装插页存在于试剂盒中，在试剂盒或其组分(即与包装或分包有关)的容器的标签等中。在其它实施方案中，用法说明以合适的计算机可读存储介质，例如光碟只读存储器(CD-ROM)、数字通用盘(DVD)、磁盘等上存在的电子存储数据文件存在。在又一些实施方案中，试剂盒中不存在真正的用法说明，但是提供了用于从远端来源获得用法说明的手段，例如通过因特网。此实施方案的一个例子是包含可以查看用法说明和/或可以下载用法说明的网址的试剂盒。就用法说明而言，在合适的介质上记录这种用于获得用法说明的手段。
测定装置可以包含固体基片上固定的主题抗-Tau抗体。测定装置可以为多种形式的任一种，例如测试条，浸渍条等。
体内成像
如上文讨论的，本发明提供了检测活个体中的Tau多肽的方法，例如通过体内成像技术进行。例如，在一个实施方案中，可以通过正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射断层摄影术(SPECT)、近红外(NIR)光学成像、或磁共振成像(MRI)实现Tau多肽的体内成像。对个体施用主题抗-Tau抗体，并且检测Tau多肽的存在和/或水平。抗-Tau抗体可以包含适合于在PET、SPECT、NIR或MRI中使用的标记物。此类标记物包括造影剂或放射性同位素，其中造影剂或放射性同位素是适合于在成像，例如对人实施的成像规程中使用的造影剂或放射性同位素，如上文描述的。在一些情况中，抗-Tau抗体包含IPN001的VH和/或VL CDR。在一些情况中，抗-Tau抗体包含IPN002的VH和/或VL CDR。抗-Tau抗体可以包含一个或多个人源化框架区，如上文描述的。
生成报告
在一些情况中，主题检测方法包括检测自个体获得的生物样品中的Tau多肽；并且基于检测的Tau多肽的水平，生产报告和/或指导获得生物样品的个体的疗法或管理。
报告可以包括下列一项或多项：关于个体是否可能患有tau病变的指示；tau病变严重性的指示；关于个体是否展现出对tau病变治疗的有益临床响应的指示；等等。
因此，报告可以包括信息，如预测的个体患有或会患上tau病变的可能性；关于进一步评估的推荐；关于治疗药物和或其它健康管理干预的推荐，等等。
例如，本文中公开的方法可以进一步包括产生或输出提供受试者评估的结果的报告的步骤，所述报告可以以电子介质(例如计算机监视器上的电子显示器)形式，或以有形介质(例如纸或其它有形介质上印刷的报告)形式提供。关于个人患有或有风险形成tau病变的可能性的评估可以称为“风险报告”、“风险得分”、或“可能性得分”。准备报告的个人或单位(“生成报告者”)也可以实施诸如样品聚集、样品加工等步骤。或者，生成报告者以外的单位可以实施诸如样品聚集、样品加工等步骤。可以给用户提供风险评估报告。“用户”可以是健康专家专业人员(例如临床医生、实验室技术人员或内科医生)。
指导健康管理
在一些情况中，主题检测方法包括检测自个体获得的生物样品中的Tau多肽；并且基于检测的Tau多肽的水平，生成报告和/或指导获得生物样品的个体的疗法或管理。
因此，例如根据主题检测方法的结果，可以生成推荐，其推荐个体进行tau病变的治疗性干预(治疗)和/或考虑个体进行特殊健康管理。
治疗性干预可以包括例如用于治疗阿尔茨海默氏病的药物疗法。用于治疗阿尔茨海默氏病的药物疗法的例子包括但不限于乙酰胆碱酯酶抑制剂，包括但不限于
安理申(多奈哌齐(donepezil))、艾斯能(利凡斯的明(rivastigmine))、美曲膦酯、和他克林(Cognex)；抗-Aβ抗体(例如Solanezumab)；非类固醇消炎剂，包括但不限于布洛芬(ibuprofen)和茚甲新；环加氧酶-2(Cox2)抑制剂，如西乐葆；和单胺氧化酶抑制剂，如司来吉兰(Eldepryl或Deprenyl)。例如，安理申可以以每天50mg口服施用6周，并且若个体耐受良好的话，此后每天以10mg施用。
测定游离的和结合的胞外Tau的量
在对个体施用抗-eTau抗体后，可以有兴趣测定没有与抗-eTau抗体结合的CSF或ISF中剩余的eTau量。本发明提供了用于测定此类游离的eTau量的方法。图54A中描绘了用于测定没有与抗-eTau抗体结合的CSF或ISF中剩余的eTau量的方法的示意图。在对个体施用抗-eTau抗体后，也可以有兴趣测定与抗-eTau抗体结合的CSF或ISF中的eTau量。图54B中描绘了用于测定与抗-eTau抗体结合的CSF或ISF中的eTau量的方法的示意图。
测定游离的胞外tau的量
本发明提供了在自经历用抗-eTau抗体治疗的受试者获得的CSF或ISF样品中测定与抗-eTau抗体未结合的胞外Tau(eTau)的量的方法。方法一般涉及：a)使固定化抗体与自受试者获得的CSF或ISF样品接触，其中固定化抗体与对受试者施用的抗-eTau抗体竞争对eTau的结合，且其中在适于使未结合的eTau与固定化抗体结合的条件下接触；并b)测定与固定化抗体结合的eTau的量。与固定化抗体结合的eTau的量指示样品中与抗-Tau抗体未结合的eTau的量。在一些情况中，使用可检测标记的不与固定化抗体竞争结合eTau的第三抗体来测定与固定化抗体结合的eTau的量。
如上文所述，测定法测量了获取自经历用抗-eTau抗体治疗的个体的CSF或ISF样品中的eTau量。在一些情况中，抗-eTau抗体是治疗性人源化抗-eTau抗体。在一些情况中，抗-eTau抗体是本发明的人源化抗-eTau抗体。在一些情况中，抗-eTau抗体是hu-IPN002。
在一些情况中，主题方法包括：a)测定获取自经历用抗-eTau抗体治疗的受试者的CSF或ISF样品中的eTau量，如上文所描述的；和b)测定样品中总的tau的水平。
在一些情况中，主题方法包括：a)测定获取自经历用抗-eTau抗体治疗的受试者的CSF或ISF样品中未与抗-eTau抗体结合的eTau量，如上文所描述的；和b)将样品中未结合的Tau的水平与在用抗-eTau抗体治疗前自该个体获得的CSF或ISF样品中总tau的水平进行比较。
主题检测方法适合于测定胞外tau的水平。如本文中使用的，“胞外tau”(“eTau”)涵盖可以在脑脊液(CSF)或间质液(ISF)中检出的任何Tau多肽。在一些实施方案中，eTau是具有175个氨基酸的长度并且包含全长tau的氨基酸2-176的多肽；例如，在一些实施方案中，eTau是包含SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，eTau是具有171个氨基酸的长度并且包含全长tau的氨基酸2-172的多肽；例如，在一些实施方案中，eTau是包含SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，eTau是包含SEQID NO:46中所示的氨基酸序列的eTau-2多肽。在一些实施方案中，eTau是包含SEQ ID NO:47中所示的氨基酸序列的eTau-3多肽。在一些实施方案中，eTau是包含SEQID NO:48中所示的氨基酸序列的eTau-4多肽。
在一些情况中，eTau多肽长度为约50个氨基酸至约175个氨基酸，例如约50个氨基酸(aa)至约75个aa，约75个aa至约100个aa，约100个aa至约125个aa，约125个aa至约150个aa，或约150个aa至约175个aa；并且可以包含全长tau的氨基酸2-176的50至约75个，约75至约100个，约100至约125个，约125至约150个，或约150至约175个连续氨基酸。图20中描绘了例示性的eTau多肽。
测定与抗-eTau抗体结合的胞外Tau的量
本发明提供了在自经历用治疗性抗-eTau抗体治疗的受试者获得的CSF或ISF样品中测定与治疗性抗-eTau抗体结合的eTau量的方法。方法一般涉及：a)使固定化抗体与自受试者获得的CSF或ISF样品接触，其中固定化抗体不与对受试者施用的抗-eTau抗体竞争结合eTau，所述接触在适合于治疗性抗体结合的eTau与固定化抗体结合的条件下；并b)测定与固定化抗体结合的治疗性抗eTauleTau复合物的量，其中与固定化抗体结合的治疗性抗-eTau抗体/eTau复合物的量指示样品中存在的治疗性抗体结合的eTau的量。通过检测抗-eTau抗体/eTau复合物中存在的抗-eTau抗体测定与固定化抗体结合的治疗性抗-eTau抗体/eTau复合物的量。通过检测抗-eTau抗体/eTau复合物中存在的抗-eTau抗体测定与固定化抗体结合的治疗性抗-eTau抗体/eTau复合物的量，提供CSF或ISF样品中与治疗性抗体结合的Tau量的指示。
如上文所述，测定法测量了获取自经历用抗-eTau抗体治疗的个体的CSF或ISF样品中的治疗性抗体结合的eTau量。在一些情况中，抗-eTau抗体是治疗性人源化抗-eTau抗体。在一些情况中，抗-eTau抗体是本发明的人源化抗-eTau抗体。在一些情況中，抗-eTau抗体是hu-IPN002。
在一些情况中，主题方法包括：a)测定自经历用抗-eTau抗体治疗的受试者获得的CSF或ISF样品中与抗-eTau抗体结合的eTau量，如上文所描述的；和b)测定样品中总的tau的水平。在一些情况中，主题方法包括：a)测定自经历用抗-eTau抗体治疗的受试者获得的CSF或ISF样品中与抗-eTau抗体结合的eTau量，如上文所描述的；和b)测定不与治疗性抗-eTau抗体结合的CSF或ISF样品中的eTau量。在一些情况中，主题方法包括：a)测定自经历用抗-eTau抗体治疗的受试者获得的CSF或ISF样品中与抗-eTau抗体结合的eTau量，如上文所描述的；b)测定样品中总的tau的水平；和c)测定不与治疗性抗-eTau抗体结合的CSF或ISF样品中的eTau量。
在一些情况中，主题方法包括：a)测定自经历用抗-eTau抗体治疗的受试者获得的CSF或ISF样品中与抗-eTau抗体结合的eTau量，如上文所描述的；和b)将样品中抗e-Tau抗体结合的Tau的水平与在用抗-eTau抗体治疗前自该个体获得的CSF或ISF样品中总的tau的水平进行比较。
在一些情况中，主题方法会包括：a)测定自经历用抗-eTau抗体治疗的受试者获得的CSF或ISF样品中与抗-eTau抗体未结合的eTau量，如上文上描述的；b)测定自经历用抗-eTau抗体治疗的受试者获得的CSF或ISF样品中与抗-eTau抗体结合的eTau量，如上文所描述的；并c)将样品中未结合的Tau的水平和抗e-Tau抗体结合的Tau的水平与在用抗-eTau抗体治疗前自该个体获得的CSF或ISF样品中总的tau的水平进行比较。
主题检测方法适合于测定与治疗性抗体结合的胞外tau的水平。如本文中使用的，“胞外tau”(“eTau”)涵盖可以在脑脊液(CSF)或间质液(ISF)中检出的任何Tau多肽。在一些实施方案中，eTau是长度为175个氨基酸并且包含全长tau的氨基酸2-176的多肽；例如，在一些实施方案中，eTau是包含SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，eTau是具有171个氨基酸的长度并且包含全长tau的氨基酸2-172的多肽；例如，在一些实施方案中，eTau是包含SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，eTau是包含SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列的eTau-2多肽。在一些实施方案中，eTau是包含SEQ ID NO:47中所示的氨基酸序列的eTau-3多肽。在一些实施方案中，eTau是包含SEQID NO:48中所示的氨基酸序列的eTau-4多肽。
在一些情况中，eTau多肽长度为约50个氨基酸至约175个氨基酸，例如约50个氨基酸(aa)至约75个aa，约75个aa至约100个aa，约100个aa至约125个aa，约125个aa至约150个aa，或约150个aa至约175个aa；并且可以包含全长tau的氨基酸2-176的50至约75个，约75至约100个，约100至约125个，约125至约150个，或约150至约175个连续氨基酸。图20中描绘了例示性的eTau多肽。
生成报告
在一些情况中，主题方法包括：a)测定获取自经历用抗-eTau抗体治疗的受试者的CSF或ISF样品中未与抗-eTau抗体结合的eTau量，如上文所描述的；和b)产生报告和/或指导获得生物样品的个体的疗法或管理。在一些情况中，主题方法包括：a)测定自经历用抗-eTau抗体治疗的受试者获得的CSF或ISF样品中未与抗-eTau抗体结合的eTau量，如上文所描述的；b)将样品中未结合的Tau的水平与在用抗-eTau抗体治疗前自该个体获得的CSF或ISF样品中总的tau的水平进行比较；和c)产生报告和/或指导获得生物样品的个体的疗法或管理。
在一些情况中，主题方法会包括：a)测定获取自经历用抗-eTau抗体治疗的受试者的CSF或ISF样品中与抗-eTau抗体结合的eTau量，如上文所描述的；和b)产生具有测定结果的报告。报告可以进一步包括下列一项或两项：在用抗-Tau抗体治疗后样品中未结合的Tau量对比CSF或ISF样品中总的tau的水平；和在用抗-eTau抗体治疗前自该个体获得的CSF或ISF样品中总的tau的量。
报告可以包括例如关于个体是否展现出对tau病变治疗的有益临床响应的指示；关于是否应当维持、提高或降低抗-eTau抗体剂量的指示；等等。
如此，报告可以包括如下信息，如关于进一步评估的推荐；关于治疗药物和/或其它健康管理干预的推荐；提高抗-eTau抗体剂量的推荐；维持抗-eTau抗体剂量的推荐；降低抗-eTau抗体剂量的推荐；等等。
例如，本文中公开的方法可以进一步包括生成或输出提供受试者评估的结果的报告的步骤，所述报告可以以电子介质(例如计算机监视器上的电子显示器)形式，或以有形介质(例如纸或其它有形介质上印刷的报告)形式提供。准备报告的个人或单位(“生成报告者”)也可以实施诸如样品采集、样品加工等步骤。或者，生成报告者之外的单位可以实施诸如样品聚集、样品加工等步骤。可以给用户提供风险评估报告。“用户”可以是健康专家专业人员(例如临床医生、实验室技术人员或内科医生)。
指导健康管理
在一些情况中，主题方法包括a)测定自经历用抗-eTau抗体治疗的受试者获得的CSF或ISF样品中与抗-eTau抗体未结合的eTau量，如上文所描述的；并且基于与抗-eTau抗体未结合的eTau的测定量，产生报告和/或指导获得生物样品的个体的疗法或管理。
在一些情况中，主题方法包括a)测定自经历用抗-eTau抗体治疗的受试者获得的CSF或ISF样品中未与抗-eTau抗体结合的eTau量，如上文所描述的；并且基于与抗-eTau抗体未结合的eTau的测定量，维持对受试者施用的抗-eTau抗体的剂量。在一些情况中，主题方法包括a)测定自经历用抗-eTau抗体治疗的受试者获得的CSF或ISF样品中未与抗-eTau抗体结合的eTau量，如上文所描述的；并且基于与抗-eTau抗体未结合的eTau的测定量，提高对受试者施用的抗-eTau抗体的剂量。在一些情况中，主题方法包括a)测定自经历用抗-eTau抗体治疗的受试者获得的CSF或ISF样品中未与抗-eTau抗体结合的eTau量，如上文所描述的；并且基于与抗-eTau抗体未结合的eTau的测定量，降低对受试者施用的抗-eTau抗体的剂量。
实施例
提出以下实施例，从而给本领域普通技术人员提供如何产生和使用本发明的完全公开和描述，而并不意图限制发明人视为其发明的主题的范围，它们也不意图表示下文的实验是实施的所有或唯一实验。就使用的数字(例如量、温度等)而言已经努力确保精确性，但是应当考虑一些实验误差和偏差。除非另有指示，份数是重量份，分子量是重量平均分子量，温度以摄氏度计，而压力为或接近大气压。可以使用标准缩写，例如bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，干碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌肉内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；等等。
实施例1：IPN001和IPN002VH和VL区的克隆和测序
确定IPN001(在本文中又称为“IPN1”或“IPN-1”)和IPN002(在本文中又称为“IPN2”或“IPN-2”)抗体的VH和VL区的氨基酸序列。图1A和1B中分别描绘了IPN001的VH和VL区的氨基酸序列。图2A和2B中分别描绘了IPN002的VH和VL区的氨基酸序列。CDR为粗体文本且加下划线。使用Kabat等的方法(参见表1；及J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；和Kabat等,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of proteins ofimmunological interest”(1991))确定CDR。
实施例2：对抗-Tau抗体效果的电生理学分析
材料和方法
使用填充溶液的膜片移液管(2-5MOhm)实施在正常人星形胶质细胞的单层上培养的诱导多能干细胞(iPSC)衍生的皮质神经元的全细胞膜片钳记录，所述溶液含有(mM)：K-甲基-硫酸盐(140)、NaCl(10)、CaCl2(1)、Mg-ATP(3)；Na-GTP(0.4)、EGTA(0.2)、HEPES(10)、磷酸肌酸，具有调节的pH＝7.3和mOsm＝300。用含有(mM)：NaCl(140)、KCl(2.5)、MgCl2(2)、CaCl2(2)、Hepes(10)、D-葡萄糖(10)、蔗糖(20)的人工脑脊髓液灌注(2ml/min)神经元。调节pH＝7.4mOsm＝310。使用pClamp-10.3数据获得软件(Molecular Devices)和MultiClamp700B放大器(Axon Instrument；Foster City CA)完成记录。经由MinisQuirt微灌注系统(AutoMate,Berkeley,CA)来施用AD tau和与IPN001或IPN002预温育的AD Tau(以10:1重量比于室温2-hr或4摄氏度24-hr温育)。使用Clampfit 10.2分析软件(Molecular Devices)离线完成数据分析。于室温完成所有记录。
结果
数据如图3A-D中所示
AD-Tau(6μg/ml)的施用引起皮质神经元膜去极化(A、B、和C)。将AD-Tau(6μg/ml)与IPN001(60μg/ml)(A)或IPN002(60μg/ml)(B)预温育大于2hr降低AD-Tau介导的膜去极化。C.将AD-Tau(6μg/ml)与小鼠IgG(60μg/ml)预温育没有降低皮质神经元中的AD-Tau介导的膜去极化。D.数据汇总，其显示了IPN001和IPN002显著降低AD-Tau介导的膜去极化(配对t-检验*p<0.037；**p<0.009，p<0.003)。
实施例3：IPN001和IPN002与来自AD患者的CSF中的Tau的免疫反应性
合并来自10名健康供体(每名1ml)的脑脊液(CSF)。并合并来自10名阿尔茨海默氏病(AD)患者(每名1ml)的CSF。保存CSF合并物的等份试样以进行ELISA分析。使用10ml来自皮质神经元的条件化培养基作为CSF亲和分离的对照，所述皮质神经元从唐氏(Down's)诱导的多能干细胞(iPSC)iPSC系(8941.1)分化315天，并且还保存等份试样以进行ELISA分析。为了测定CSF是否含有IPN002反应性Tau，将CSF合并样品和条件化培养基之每种在IgG1偶联树脂上预先澄清，随后将流过物应用于IPN001偶联树脂。将IPN001树脂用磷酸盐缓冲盐水(PBS)彻底洗涤，并用50mM甘氨酸、150mM NaCl，pH 2.3洗脱结合的蛋白质，并在洗脱后用1M Tris，pH 8.3中和。将洗脱的蛋白质在YM10浓缩仪上浓缩，并添加至样品缓冲液以进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳和Western印迹分析。
为了测定IPN002是否与CSF中的任何Tau形式起反应，用IPN001、Santa CruzTauH-150(aa1-150)和用Dako的Tau#A0024抗体探查IPN002洗脱蛋白质的Western印迹，所述Tau#A0024抗体与Tau的C末端(aa#243-441)起反应。图4A-C中描绘了数据。
Western印迹显示了来自健康和AD CSF两者的经IPN002亲和纯化的蛋白质中存在的IPN001(图4a)和Tau H-150(图4b)免疫反应性条带，其分子量范围为约25kd至37kd。这些Tau片段与唐氏系(Down’s line)条件化培养基分离的eTau片段在其大小上相似，但在其相对丰度上不相似。Dako C末端tau抗体(图4c)没有检出来自从CSF或条件化培养基的IPN002亲和分离的任何反应性种类。全长Tau没有被来自IPN002亲和分离的任何Tau抗体检出。由于IPN002亲和分离的蛋白质与Western印迹上的IPN001和IPN002是反应性的，推断CSF中的Tau也是IPN001反应性的。
然后，将来自IPN002亲和树脂的CSF和条件化培养基流过物序贯应用于T46(Tau#428-441)和HT7(Tau#159-163)并且从T46(Tau#428-441)和HT7(Tau#159-163)洗脱以测定是否存在不被IPN002分离的任何C末端或中间区tau片段。用Dako C末端抗体探查洗脱液(图4c)，并且没有检出免疫反应性。这些数据提示了IPN001和IPN002免疫反应性tau比全长、仅中间区或C末端tau片段更丰富。
保存来自CSF和条件化培养基中每种的流过物的等份试样以进行分离前对分离后比较，从而使用商品化试剂盒测定在分离期间是否除去了全部可检出的tau，所述商品化试剂盒通常用于测定CSF中的Tau水平。图5中显示了数据。此分析证明了全部可检出的tau在亲和分离过程期间从后CSF样品(post-CSF sample)除去。
这些数据提供强有力的证据，即IPN001和IPN002两者与来自健康人和AD患者两者的CSF中存在的主要tau种类起反应。
实施例4：患者样品中eTau的检测
材料和方法
自iPSC来源的皮质神经元的条件化培养基收集
使用Yamanaka法(Takahashi等(2007)Cell 131(5),861)从健康年龄匹配对照和阿尔茨海默氏病患者生成iPSC(诱导多能性干细胞)，如记载于Dimos等(2008)Science321:1218中的。大体上符合使用双重SMAD单层法的发表方案(Chambers等(2009)Nat.Biotechnol.27:275)将iPSC分化成皮质神经元，接着进行皮质神经元分化，其类似于记载于Shi等(2012)Nat.Neurosci.15:477)中的。将培养108天的iPSC衍生的皮质神经元(iPSC-CN)进行洗涤，添加新鲜的培养基，并在3天后收集条件化培养基，除非另外指明。对所述品系(line)进行多次分拣(differenctiation)以确保eTau水平的再现性。将条件化培养基以15,000rpm旋转15分钟，之后加工以进行Western印迹或tau ELISA。对于布雷菲尔德菌素(brefeldin)A实验，用PBS洗涤iPSC-CN培养物，之后添加具有和没有1μM布雷菲尔德菌素A的新鲜培养基，并将培养基条件化1小时，之后收集。
自人初级皮质神经元的条件化培养基收集
制备人皮质神经元培养物(HCC)，如记载于(2007)Neurobiol.Aging 28:226中的。简言之，通过Advanced Bioscience Resources(Alameda，CA)并且遵守联邦胎儿研究指南(federal guidelines for fetal research)和统一解剖捐赠法案(UniformedAnatomical Gift Act)获得人胎儿脑皮质组织。将组织在汉克氏缓冲盐水溶液(Cellgro)中漂洗，并且在存在1μg/ml DNA酶(EMD)的情况中磨碎，并通过100μm细胞过滤器。在离心后，将沉淀物在0.05％胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)中于37℃重悬20min。通过添加等体积的含有10％胎牛血清(FBS)的培养基灭活胰蛋白酶，并在存在DNA酶的情况下再次温和磨碎样品。在离心后，将细胞在铺板培养基(含有B27的Neurobasal，Invitrogen)中重悬，并计数。将细胞在用多聚-d-赖氨酸及层粘连蛋白包被的盖玻片上或板中铺开。洗涤3周龄HCC，添加新鲜培养基，并在条件化3天后收集培养基。将条件化培养基以15,000rpm旋转15分钟，之后加工以进行Western印迹。
P301L小鼠ISF和人CSF收集
使用异氟烷(2％,800mL/min O2)使小鼠麻醉。使用布比卡因(Bupivacain)/肾上腺素进行局部止痛法，并使用fynadine或carprophen进行手术期间/术后止痛。将动物置于立体定位架(Kopf instruments,USA)中。将推拉式微透析探头(磷脂酰乙醇胺(PEE)膜，Brainlink,the Netherlands)插入海马体中(3mm暴露表面)。手术后24和48小时实施微透析取样。在取祥当天，将动物的探头用氟化乙烯丙烯(FEP)管道与微灌注泵(Harvard PHD2000注射器泵，Holliston，MA或类似装置)连接。用含有147mM NaCl，3.0mM KC1，1.2mMCaCl2，和1.2mM MgCl2，和0.15％牛血清白蛋白(BSA)的人工CSF(aCSF)以0.75μL/min的流速灌注微透析探头。将微透析样品收集60分钟时段。在稳定期后，收集基底样品。在取样的第二天，重复上述程序(Brains Online)。将间质液(ISF)以15,000rpm旋转15分钟，并使用经澄清的上清液进行eTau Western印迹。
将来自10名健康者(Precision Med)、10名AD患者(Precision Med)和10名PSP患者的集合的10ml CSF(Precision Med)收集，以15,000rpm旋转15分钟，将上清液在IgG亲和树脂上预先澄清，接着在IPN002抗-tau亲和树脂上进行tau分离，洗涤，用50mM甘氨酸，pH2.3及150mM NaCl洗脱到含有1M TBS，pH 8.3的管中以中和pH，在YM10滤器上浓缩，并制备用于tau Western印迹。与阳性对照类似地分离来自fAD PSEN1患者的iPSC-CN条件化培养基以比较条带型。
Western印迹
将条件化培养基在Laemmli缓冲液(Sigma)中稀释。将培养的神经元用PBS漂洗，之后在DMEM(Invitrogen)中的0.05％胰蛋白酶中温育，漂洗，并在Laemmli缓冲液中裂解。将所有样品煮沸，在tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上分开，并使用iBlot(Invitrogen)转移至硝化纤维素。将膜在封闭缓冲液(LiCor)中温育，用含有0.1％Tween-20的封闭缓冲液中0.5μg/ml针对tau的IPNO01抗体和针对β-肌动蛋白的抗体(1:2000；Abcam)、和抗小鼠680和抗兔800二抗(LiCor)探查。用Odyssey SA红外成像系统扫描印迹，并使用Odyssey SA软件(LiCor)分析。
Tau ELISA
在3天条件化期后从iPSC衍生的皮质神经元培养物收集培养基，并使用Alphascreen同质测定法测定以测量tau。将10μg/ml抗-tau AlphaLISA受体珠和1nM生物素化的抗-Tau抗体与条件化培养基于室温混合过夜。将40μg/ml链霉亲和素-供体珠(PerkinElmer)于室温添加30分钟，并在Envision读板仪上读板。
eTau纯化
将自来自AD患者的iPSC-CN收集的条件化培养基以15,000rpm旋转15分钟，收集上清液，并在IgG亲和树脂上预先澄清。将预先澄清的上清液通过IPN002抗-Tau抗体树脂，洗涤，并用50mM柠檬酸钠，pH 2.3及150mM NaCl将eTau洗脱到含有1M TBS，pH 8.3的管中以中和pH。将洗脱液浓缩.并将缓冲液交换成PBS。
免疫荧光
将MCC用PBS漂洗，在4％低聚甲醛中固定，用PBS中的10％正常猴血清(JacksonImmunoResearch)封闭，用PBS中的0.2％Triton-x-100透明化(除非另有规定)15分钟，并使用针对tau的IPN001抗体及驴抗小鼠-A488二抗(Molecular Probes)和DAPI(Invitrogen)染色。使用40倍的Leica DMI 600B显微镜使用LAS AF软件(Leica)获得图像。使用NikonEclipse Ti共焦显微镜(Nikon)获得共焦图像。
结果
进行测定法以检测各种流体中的eTau片段。图7中显示了结果。如图7，左侧小图中显示的，内源tau从来源于人诱导多能干细胞(人iPSC-皮质神经元；iPSC-CN)的皮质神经元分泌，其中分泌性Tau称为胞外Tau或“eTau”。如图7，来自左侧的第二个小图中显示的，eTau也存在于来自人初级神经元(人皮质细胞；“HCC”)的条件化培养基中，这确认了eTau不是iPSC分化的人为因素。在神经元裂解物中也检出这些eTau片段，提示了tau在eTau分泌前在神经元内部被切割。
如图7，中间小图中显示的，在来自P301L tau小鼠的间质液(ISF)中检出类似的tau片段，其中在任一系统中没有检出全长tau。P301L小鼠是转基因的，所述转基因是对于具有P301L突变的人tau形式而言；P301L小鼠是人tau病变模型。参见例如(2001)J.Biol.Chem.276:529；和Lewis等(2000)Nature Genetics 25:402。
如图7，右侧小图中显示的，与来自健康患者的品系相比，eTau水平在来自AD患者的CSF中及来自家族性AD(fAD)患者的多个品系中是升高的。如图7，右侧小图中显示的，在来自PSP患者的CSF中也检出了eTau。
实施例5：eTau诱导神经元过度活跃
方法
使用填充溶液的微移液管(2-5MOhm)在正常人星形胶质细胞的单层上培养的iPSC-CN的全细胞膜片钳记录，所述溶液含有(mM)：K-甲基-硫酸盐(140)、NaCl(10)、CaCl2(1)、Mg-ATP(3)；Na-GTP(0.4)、EGTA(0.2)、HEPES(10)、磷酸肌酸，具育调节的pH＝7.3和mOsm＝305。用含有(mM)：NaCl(140),KCl(2.5)、MgCl2(2)、CaCl2(2)、Hepes(10)、D-葡萄糖(10)、蔗糖(20)的人工脑脊髓液灌注(2ml/min))神经元，调节pH＝7.4mOsm＝310。使用pClamp-10.3数据获得软件(Molecular Devices)和MultiClamp 700B放大器(AxonInstrument；Foster City CA)完成记录。使用MiniSquirt微灌注系统(AutoMate,Berkeley,CA)实施eTau，或eTau与抑制剂河豚毒素(TTX)(Tocris)、MK801(Sigma)、NBox(Tocris)或抗-Tau抗体IPNO01的喷出(puff)应用。离线数据分析使用Clampfit 10.2分析软件(Molecular Devices)。于34-37℃进行记录。
结果
为了测定eTau是否可以改变神经元功能，将纯化的eTau片段eTau应用于iPSC-CN或HCC。结果显示于图8A-C中。
如图8A中显示的，将纯化的eTau片段混合物添加到这些神经元上促进过度活跃。如图8B中显示的，由eTau混合物诱导的过度活跃被河豚毒素(TTX)及被NMDA和AMPA谷氨酸受体拮抗剂(分别为MK801和NBQX)抑制。TTX通过结合神经细胞膜中电压门控的快速钠通道阻断神经中的动作电位。这些数据提示了eTau诱导的神经元过度活跃依赖于动作电位介导的谷氨酸释放。比较而言，如图8A的中间小图中显示的，全长tau的应用即使是在实际上更高的浓度也不产生神经元活性的可检测变化，显示了eTau诱导的活动过度依赖于tau片段。这些eTau诱导的过度活跃结果强烈提示了在神经元中可发生钙动员(mobilization)。为了测定钙动员是否在神经元中发生，测试eTau对钙动员的影响。如图8C中显示的，eTau-1a强力动员钙。若在慢性背景诸如AD中维持，则此类神经元活动过度可以经由改变的突触触发和异常的神经元刺激导致神经元功能障碍。eTau-1a包括胎儿tau的氨基酸2-166，即SEQ IDNO:27的氨基酸2-166。
实施例6：抗-Tau抗体降低eTau介导的神经元过度活跃
如实施例5中描述的来实施电生理学分析。评估IPN001和IPN002对e-Tau介导的神经元过度活跃的影响。
如图8D中显示的，IPN001降低eTau介导的神经元过度活跃。如图19B中显示的，IPN002降低eTau介导的神经元过度活跃。
实施例7：人源化抗-Tau抗体
生成IPN002的人源化变体。人源化变体1-4的重链VH域的氨基酸序列，和编码人源化变体的重链VH域的核苷酸序列显示于图9-12。人源化变体1-4的轻链VH域的氨基酸序列，和编码人源化变体的轻链VH域的核苷酸序列显示于图13-16。表4和5中汇总了相对于IPN002的氨基酸序列的氨基酸差异。
表4：VH变体
表5：Vk变体
单字母氨基酸代码如下：
G-甘氨酸(Gly)
P-脯氨酸(Pro)
A-丙氨酸(Ala)
V-缬氨酸(Val)
L-亮氨酸(Leu)
I-异亮氨酸(Ile)
M-甲硫氨酸(Met)
C-半胱氨酸(Cys)
F-苯丙氨酸(Phe)
Y-酪氨酸(Tyr)
W-色氨酸(Trp)
H-组氨酸(His)
K-赖氨酸(Lys)
R-精氨酸(Arg)
Q-谷氨酰胺(Gln)
N-天冬酰胺(Asn)
E-谷氨酸(Glu)
D-天冬氨酸(Asp)
S-丝氨酸(Ser)
T-苏氨酸(Thr)
实施例8：人源化IPN002变体的表征
表4(其呈现于图17)中显示了VH#1-4与Vk#l-4的16个抗体组合的每种结合重组tau(383个氨基酸的重组tau)及eTau 1a、eTau1b、eTau2、eTau3和eTau4之每种的相对tau结合亲和力。针对每种tau和eTau种类的相对结合亲和力的范围对于每种VH/Vk抗体组合为121pM至1030pM。eTau 1a包括胎儿tau的氨基酸2-166，即SEQ ID NO:27的氨基酸2-166；而eTau 1b包括胎儿tau的氨基酸2-196和217-228，即SEQ ID NO:27的氨基酸2-196和217-228。图20中描绘了eTau3和eTau 4的氨基酸序列。
为了获得这些VH/Vk人抗体的绝对亲和力及Kon和Kdis，使用tau(383个氨基酸的重组tau)进行Octet分析。KD的范围为42.6pM至2120pM。对于所有VH/Vk变体，Kon值较高，而Kdis值较低(对于Tau及对于每种eTau种类)。表5(其呈现于图18)中提供了数据。
在别的分析中测试上文描述的人源化IPN002变体的亚组。如图19A中显示的，在多种含有tau的样品的情况中在Western印迹测定法中使用三种变体VH2/Vk1、VH2/Vk2、和VH2/Vk3。含有tau的样品包括iPSC-CN条件化培养基；iPSC-CN裂解物；AD脑裂解物；和P301Ltau小鼠脑皮质裂解物；和猕猴脑裂解物。数据显示了上文描述的人源化IPN002变体与多种样品中的tau是反应性的。
对上文描述的人源化IPN002变体的亚组测试降低eTau诱导的神经元过度活跃的能力。如图19B中显示的，亲本IPN002和变体VH2/Vk1、VH2/Vk2和VH2/Vk3阻断eTau诱导的过度活跃。
实施例9：测试人源化IPN002变体的免疫原性
对人源化抗-Tau抗体评估免疫原性潜力。使用EpiScreenrM测定法。参见例如Jones等(2004)J.Interferon Cytokine Res.24:560；和Jones等(2005)J.Thromb.Haemost.3:991。使用CD8+消减的外周血单核细胞(PBMC)实施时间过程T细胞测定法(time couse T cell assay)；并且通过在添加测试抗体样品后的多个时间点时掺入[3H]-胸苷测量T细胞增殖。
自健康团体供体血沉棕黄层(例如来自测试的14小时内抽出的血液)分离PBMC。与临床标准抗体比较T细胞对测试抗体(例如人源化IPN002变体)的响应。
将纯化的测试抗体(人源化IPN002变体)添加至PBMC体外培养物至在培养基中50μg/ml的终浓度，从而生成测试样品。包括临床抗体对照(阳性对照)，和仅含培养基的对照(未刺激的对照)作为对照样品。将测试样品(加有测试抗体的PBMC)和对照样品于37℃在5％CO，的情况下温育8天。在第5天、第6天、第7天、和第7天，将测试和对照样品中的细胞悬浮，并转移至多孔培养板的孔。将测试和对照样品用0.75μCi[3H]-胸苷脉冲，并再温育18小时，之后收获到滤器垫上。使用闪烁计数测定每孔的每分钟计数(cpm)。
对于增殖测定法，使用等于或大于2的SI阈值，其中认为诱导高于此阈值的增殖响应的样品是阳性。SI(刺激指数)是用均值测试样品计数除以未刺激对照的均值。
图21A-C中显示了数据。健康供体T细胞增殖响应人源化IPN002测试抗体。将来自大批培养物的PBMC取样，并在与测试样品一起温育后第5天、第6天、第7天和第8天评估增殖。认为以水平虚线标示的具有SI≥2.0(p<0.05)的增殖响应(其使用未配对两样品学生t检验(student’s t test)是显著的(p<0.05))是阳性。
如图21A中显示的，测试完全人源化IPN002抗体具有低免疫原性潜力(低于2.0的SI阈值)。图21B显示了用参照嵌合抗体得到的结果，其中参照嵌合抗体具有IPN002鼠重链和轻链可变区和人IgG4恒定区；并且图21C显示了用免疫原性临床对照人源化A33抗体得到的结果。
实施例10：IPN002在体内降低磷酸化的Tau的水平
评估了IPN002施用对氨基酸202和205处磷酸化的Tau水平的影响。
使用了P301L小鼠模型。P301L小鼠是转基因的，所述转基因是对于含有P301L突变的人tau形式而言；P301L小鼠是人tau病变的模型。参见例如等(2001)J.Biol.Chem.276:529。
用下列各项处理P301L小鼠(3-4个月龄)：1)对照IgG；2)PHF1抗磷酸化的Tau抗体；或3)IPN002。将IgG对照和IPN002抗体以10mg/kg的浓度腹膜内注射4周；然后以20mg/kg再注射4周。将PHF1以10mg/kg施用整个8周过程。在开始抗体治疗方案后第60天，在海马体中测量磷酸化的Tau的水平。数据如图22中所述。
在氨基酸202和205处磷酸化的Tau称为“AT8”。如图22中显示的，与IgG对照处理相比，用IPN002的处理导致不溶性磷酸-Tau(AT8)在统计学上的显著降低，如通过ELISA评估的(左侧小图)，和降低的趋势，如通过Western印迹分析评估的(右侧小图)。PHF1处理显示处不溶性AT8的降低的趋势，这支持Chai等((2011)J.Biol.Chem.286:34457)和Boutajangout等((2011)J.Neurochem.118:658)的发现。
实施例11：IPN002降低ISF和CSF两者中的游离tau水平
测定IPN002施用对CSF和间质液(ISF)中游离的tau的水平的影响。如实施例10中的描述来处理P301L小鼠。使用IPN001测定存在于ISF中的不与IPN002结合的游离tau的水平。如图23中显示的，IPN002处理降低用IPN002处理的P301L小鼠的ISF中的游离的Tau(不与IPN002结合的Tau)水平(左侧小图)。
为了测定IPN002是否与其在ISF中那样以相同的程度降低CSF中的游离Tau水平，如实施例10中描述的那样处理P301L小鼠，并且测定IPN002处理对经处理小鼠的CSF中游离tau(不与IPN002结合的tau)水平的影响。结果如图24中所示。
在图24的左侧小图中，显示了未处理的、仅对照IgG处理的、经PHF1处理的、和经IPN002处理的小鼠的CSF中游离的tau(未与IPN002结合的tau；称为“(无IPN002的)游离的tau”)的水平。如图24的右侧小图中显示的，CSF中游离的tau水平与经IPN002处理的小鼠的ISF中游离的tau水平相当，这证明了ISF tau分析与更为临床相关的物质CSF完全相关联。
实施例12：抗-Tau抗体降低eTau介导的神经元过度活跃
如实施例5中描述的那样实施电生理学分析。评估IPN002对e-Tau诱导的神经元过度活跃的影响。
如图25中显示的，IPN002降低eTau介导的神经元过度活跃。
实施例13：从可能患有慢性创伤性脑病(CTE)的个体获得的CSF中存在Tau片段
自前国家橄榄球联赛(National Football League)前锋(linemen)(其展现出行为/认知缺陷，并被认为可能患有CTE)获得CSF样品。对CSF样品测定eTau片段的存在。从来自健康个体和可能患有CTE的个体的合并CSF亲和分离eTau片段。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分开分离的eTau片段；并且将分开的片段转移至膜。用IPN001探查膜。图26中呈现的结果显示了Tau片段存在于从可能患有CTE的个体获得的CSF中。
实施例14：IPN002的人源化变体对合成的Tau肽的结合
在固相和溶液相测定法两者中测试IPN002的人源化变体(“hu-IPN002”)对合成的生物素化的Tau肽1和2的结合。
肽1和肽2的氨基酸序列如下：
肽1(Tau氨基酸13-24)：DHAGTYGLGDRK(SEQ ID NO:49)；
肽2(Tau氨基酸15-44)：AGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLK(SEQ ID NO:50)。
将抗体或生物素化的肽在磷酸盐缓冲盐水中稀释。终浓度如下：1μg/ml hu-IPN002；1μg/ml rTau383(全长重组Tau)；5μg/ml(生物素化的肽1)；和5μg/ml(生物素化的肽2)。将PBS中的100μl 0.1％酪蛋白添加至多孔板的孔。添加150μl的1μg/ml hu-IPN002溶液。进行连续稀释。将100μl生物素-肽添加至含有连续稀释的抗体的孔。将多孔板于室温温育1小时。在温育期后，将孔用PBS中的0.05％Tween 20溶液洗涤5次；然后用PBS洗涤2次。
将缀合有链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)的二抗添加至孔，并将平板于室温温育1小时。在温育期后，将孔用PBS中的0.05％Tween 20溶液洗涤5次；然后用PBS洗涤2次。
添加HRP底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)，并温育1-15分钟。通过添加100μl1N硫酸停止反应。读取了450nm的吸光度。
结果显示于图27和28，并且汇总于表6。
表6
图29描绘了hu-IPN002对全长重组Tau(rTau-383)和磷酸酶活化域(PAD)肽(tau氨基酸2-28；AEPRQEFEVMEDHAGTY；SEQ ID NO:80)的结合。如图29中所示，hu-IPN002不结合PAD肽。
图30显示了非生物素化的Tau肽1(Tau氨基酸13-24)和非生物素化的肽2(Tau氨基酸15-44)与Tau肽1和Tau肽2的生物素化形式竞争结合hu-IPN002。这些数据显示了Tau肽1和Tau肽2与hu-IPN002的结合是特异性的，而不是由于生物素的添加。
实施例15：IPN002对病理学的体内影响
在此研究中，研究治疗性干预对tau病变转基因小鼠模型(hTau.P301L-Tg)中降低的活动性和Tau病理学的影响。在这些小鼠中，在鼠Thy1启动子的控制下表达人Tau的临床突变体(P301L)(神经元特异性表达)。在7、8、8.5和9个月龄及终止日前一天测量行为(横杆行走)。研究的终点包括：(1)存活；(2)行为：横杆行走表现和紧握得分；(3)生物化学：总均浆、可溶性和不溶性脑干级分中的泛-Tau；和(4)生物标志物：总均浆和不溶性脑干级分中的AT8。
材料和方法
用下列各项处理P301L小鼠(3-4个月龄)：1)对照IgG；2)PHF1抗-磷酸化的Tau抗体；或3)IPN002。IgG对照和IPN002杭体以20mg/kg的浓度一周一次腹膜内注射6个月。以10mg/kg施用PHF1达6个月。PHF1是一种小鼠单克隆抗体，其识别包含磷酸-Ser396和磷酸-Ser404的表位。Santacruz等(2005)Science 309:476。
体重和紧握行为
在处理期间每周和在处死时测定体重。研究开始直到7个月龄每周记录体重和紧握得分。从7个月龄起，一周两次对小鼠监测在家笼中的活动性，重量减轻和后肢和前肢的第一紧握体征。在存在紧握体征后，每天测定体重，并且对紧握行为评分，直到“过早处死(premature sacrifice)”之时。为了对紧握行为评分，将小鼠在其尾巴基本上约1.5cm保持约10秒。使用4点分级量表分别对每个肢评分紧握。将初始处死小鼠(preliminarysacrified mice)归于最大得分。前肢得分主要用作处死决定的支持证据。后一种对紧握、体重减轻和家笼中的活动性的组合观察并且依照预定的标准进行。使用统一为1个紧握得分的左和右后肢得分评估整个治疗的紧握演变及在研究终止时评估组差异。从分析排除过早死于癫痫的小鼠。对处死前最后一次紧握得分的组平均值，分别使用伴重复测量的2因素ANOVA、然后是Bonferroni事后检验以及使用学生t检验来实施统计学分析。
横杆行走
用基线组及在7、8、8.5、和9个月龄，以及研究终止前一天用处理组实施横杆行走测试以测定运动功能障碍和运动学习。给定小鼠在横杆上平衡的能力和在1米的距离里行走需要的时间是其平衡、协调、身体状况和运动计划的量值。在30°的角度下放置具有12mm的圆形直径的铜横杆。横杆的开始区用台灯照明，而在末端放置室内逃生平台。对于初始的训练试验，使用较宽的横杆训练小鼠平衡和行走至平台。在训练试验后，在1m的距离里对小鼠的反应时间计时。另外，通过步态观察，测定运动功能障碍的第一个症状(脚滑移和腹部拖动)。使用2因素ANOVA，然后是Bonferroni事后检验来实施反应时间得分的统计学分析。
结果
紧握行为和横杆行走
图31中描绘了IPN002对紧握行为的影响。如图31中显示的，与对照IgG相比，IPN002处理降低紧握得分。图32中描述了IPN002对运动功能的影响，如通过横杆行走所评估的影响。如图32中所示，与对照IgG相比，IPN002处理显著降低平均等待时间(及如此改善运动功能)。因此，IPN002处理显著降低P301L tau转基因小鼠中的运动缺陷。使用相同的统计学方法，用PHF1处理得到的结果没有达到显著性。
Tau水平
评估在对照IgG、PHF1或TPN002处理后P301L小鼠的CSF中游离的tau(未结合IPN002的tau)的水平。使用IPN001测定CSF中存在的未与IPN002结合的游离的tau的水平。数据如图33中所示。如图33中显示的，与用对照IgG处理的小鼠中的水平相比，IPN002处理将游离的tau(未与IPN002结合的tau)水平降低了96％。
实施例16：IPN002对eTau诱导的神经元超兴奋性的影响
材料和方法
对人原代皮质培养物进行全细胞膜片钳记录。用人工脑脊液灌注(2ml/min)神经元，所述人工脑脊液含有(mM)：NaCl(140)、KCl(2.5)、MgCl2(2)CaCl2(2)，Hepes(10)、D-葡萄糖(10)、蔗糖(20)，调节pH＝7.4mOsm＝310。使用pClamp-10.3数据获得软件(MolecularDevices)和MultiClamp 700B放大器(Axon Instrument；Foster City CA)进行记录。使用MiniSquirt微灌注系统(AutoMate,Berkeley,CA)来进行1)eTau1a(氨基酸2-166)；2)磷酸化的Tau或eTau伴随抑制剂；3)对照IgG；或4)抗-Tau抗体PHF1、IPN001、或Dako(多克隆抗-C末端tau)的喷出应用。离线数据分析使用Clampfit 10.2分析软件(Molecular Devices)。于34-37℃进行记录。
结果
数据显示于图34和35。如图34中显示的，IPN002降低eTau1a诱导的神经元活动过度。对照IgG和“Dako”(抗-C末端多克隆Ab)都不导致神经元过度活跃的显著降低。PHF1不降低eTau1a诱导的神经元过度活跃。
比较了eTau1a对神经元过度活跃的影响与全长PHF1反应性磷酸化的Tau(磷酸-Tau)对神经元过度活跃的影响。如图35中间小图中所显示的，与基线(顶部小图)相比，全长PHF1反应性磷酸-Tau在测试的3个细胞中的2个中没有诱导神经元过度活跃，测试的第三个细胞仅显示较小程度的神经元过度活跃。比较而言，eTaula在测试的所有3个细胞中都诱导神经元过度活跃(底部小图)。图36中以图形描绘了这些数据。
实施例17：IPN002对Aβ水平的影响
材料和方法
来源于iPSC的皮质神经元的Aβ分泌
将iPSC衍生的皮质神经元(iPSC-CN)体外培养。从健康个体；患有早老蛋白(PSEN1)突变的家族性AD的个体；患有早老蛋白(PSEN2)突变的家族性AD的个体；和患有散发性AD(sAD)的个体生成iPSC。在培养大致约55-60天后，基于L1-CAM(CD171)表达对iPSC-CN进行分选，以富集成熟的皮质神经元；将分选的细胞在与正常的人星形胶质细胞的共培养物中培养30天。在共培养30天后，用多个浓度的beta位点淀粉样前体蛋白切割酶(BACE)抑制剂、对照IgG、或IPN002将iPSC-CN再处理25天，其中培养基变化2X/周。收集条件化培养基，并在Millipore高灵敏性人淀粉样蛋白-β40和淀粉样蛋白-β42ELISA中对其进行测试，以检测Aβ1-40(“Aβ40”)和Aβ1-42(“A42”)。Aβ40和Aβ42是淀粉样前体蛋白的切割产物；老年斑含有Aβ42和Aβ40两者。
来自原代(primary)人皮质神经元的Aβ分泌
人胎儿脑皮质组织通过Advanced Bioscience Resources(Alameda,CA)获得，并且遵守联邦胎儿研究指南和统一解剖捐赠法案。将组织在汉克氏(Hank’s)缓冲盐水溶液(Cellgro)中漂洗，并且在存在1mg/ml DNA酶(EMD)的情况中磨碎，并通过100mm细胞过滤器。在离心后，将沉淀物在0.05％胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)中于37℃重悬20min。通过添加等体积的含有10％胎牛血清(FBS)的培养基灭活胰蛋白酶，并在存在DNA酶的情况中再次温和磨碎样品。在离心后，将细胞在铺板培养基(含有B27的Neurobasal，Invitrogen)中重悬，并计数。将细胞铺开，培养5周，并在每3-4天改变培养基的情况下添加含有所述浓度的抗体的新鲜培养基达10天，在处理10天后收集条件化培养基。将条件化培养基以15,000rpm旋转15分钟，之后加工，以进行Aβ40和Aβ42 ELISA分析，如上文所描述的那样。
结果
结果如图37-39所示。
如图37中显示的，用IPN002处理iPSC-CN降低所有iPSC-CN分泌的Aβ40 40和Aβ42的水平，而对照IgG不降低Aβ40或Aβ42分泌。
图38显示了各种抗体对原代人皮质神经元分泌的Aβ40量的剂量依赖性影响。如图38中显示的，原代人皮质神经元与10μg/ml或30μg/ml IPN001、IPN002或hu-IPN002(IPN002的人源化变体)的温育减少分泌的Aβ40的量。对照IgG和PHF1对分泌的Aβ40的量都没有任何显著影响。
图39显示了各种抗体对原代人皮质神经元分泌的Aβ42量的剂量依赖性影响。如图39中显示的，原代人皮质神经元与10μg/ml或30μg/ml IPN001、IPN002或hu-IPN002的温育降低分泌的Aβ42的量。无论对照IgG还是PHF1对分泌的Aβ42量都没有任何显著的影响。
实施例18：IPN002的人源化变体的表位定位
材料和方法
将抗体或生物素化的肽在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释。终浓度如下：1μg/mlIPN002的人源化变体(hu-IPN002)；1μg/ml rTau383(全长重组Tau)；5μg/ml生物素化的肽。将PBS中的100μl 0.1％酪蛋白添加至多孔板的孔。添加150μl hu-IPN002的1μg/ml溶液。制成hu-IPN002的连续稀释物，并涂覆至多孔板的孔上。将100μl生物素-肽或生物素-全长Tau添加至含有连续稀释的抗体的孔。将多孔板于室温温育1小时。在温育期后，将孔用PBS中的0.05％Tween 20溶液洗涤5次；然后用PBS洗涤2次。
将缀合有链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)的二抗添加至孔，并将平板于室温温育1小时。在温育期后，将孔用PBS中的0.05％Tween 20溶液洗涤5次；然后用PBS洗涤2次。
添加HRP底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)，并温育1-15分钟。通过添加100μl1N硫酸停止反应。读取450nm处的吸光度。
结果
数据如图40中所述。图40中呈现的数据显示了生物素-Tau 13-24、生物素-Tau15-24、生物素-Tau 15-44、和生物素-磷酸Tau 15-24(具有与全长Tau的氨基酸18对应的磷酸化的Tyr)，和全长Tau(rTau383)均有效结合至hu-IPN002。因此，不管Tyr-18的磷酸化状态如何，hu-IPN002都结合Tau氨基酸15-24内的表位。
实施例19：抗体对CSF中的tau的结合
评估了IPN002、PHF1(一种对线性磷酸化表位特异性的抗体)、和对照抗体对CSF中存在的tau的结合。
开发鉴定结合CSF中存在的tau的抗体的结合测定法。图41中示意性描绘了测定法。将对照IgG(对线性磷酸化表位特异性的多克隆抗体(“多Ab-C末端tau”)、PHF1或IPN002涂覆于多孔板的孔上。将抗体在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释。终浓度如下：5μg/mlIPN002、IgG、PHF1、或多Ab-C末端tau。将PBS中的100μl 0.1％酪蛋白添加至多孔板的孔。添加100μl人CSF，并于RT温育1小时。将100μl生物素BT2+生物素-HT7添加至孔。BT2是一种结合人tau的氨基酸194-198内的表位的小鼠单克隆抗体。HT7是一种结合人tau的氨基酸159-163内的表位的小鼠单克隆抗体。将多孔板于室温温育1小时。在温肓期后，将孔用PBS中的0.05％Tween 20溶液清洗5次；然后用PBS清洗2次。
将缀合有链霉亲合素-辣根过氧化物酶(HRP)的二抗添加至孔，并将板于室温温育1小时。在温育期后，将孔用PBS中的0.05％Tween 20溶液清洗5次；接着用PBS清洗2次。添加HRP底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)，并温育1-15分钟。通过添加100μl 1N硫酸停止反应。读取450nm处的吸光度。
使用己知量的全长磷酸-tau或己知量的eTau1a(tau的氨基酸2-166)定量测定法。如图41下部小图中显示的，以0ng/ml、0.16ng/ml、0.8ng/ml、4ng/ml、20ng/ml和100ng/ml的浓度使用全长tau(下左小图)或eTau-1a(下右小图)进行测定。如图41下左小图中显示的，IPN002、多Ab-C末端tau、和PHF1结合全长tau。如图41下右小图中显示的，仅IPN002结合eTau1a。
进行上文所述的测定以测试多Ab-C末端tau、PHF1和IPN002对来自以下的人CSF中存在的tau的结合：1)对照(健康)患者；2)MCI患者；3)患有轻度AD的患者(“轻度”)；4)患有中等AD的患者(“中等”)；和患有重度AD的患者。结果如图42所示。如图42中显示的，CSF中存在的tau被IPN002结合，而不被pAb-tau线性表位或PHF1结合。数据显示了：1)N末端Tau片段存在于CSF中；2)在CSF中检测出全长tau；和3)在CSF中没有检测出包含BT2和HT7表位的C末端tau片段。
实施例20：IPN002的体内效果
结果获取自P301L tau转基因小鼠中的6个月tau抗体功效研究。发现了IPN002全面降低疾病进展，如以CSF中显著降低的游离tau水平，星形胶质增生(astrogliosis)的蛋白质标志物降低的水平、跨越多个脑区和磷酸tau表位间的tau病理学改善、和行为/功能读数改善所例示的。IPN002与抗-Tau抗体PHF1表现得一样好或更好。最终，新的分泌性tau作用机制得到了体内证实：β-淀粉样蛋白水平正反馈调节。此研究清楚区分了与PHF1相比eTau抗体、IPN002调控β-淀粉样蛋白水平的能力。
材料和方法
动物研究
使用P301L转基因小鼠模型。P301L转基因小鼠包含鼠Thyl启动子(神经元特异性表达)表达驱动的4R2N人tau，其在P301L处突变作为转基因。P301L转基因模型在脊髓、脑干、中脑和皮质中展现出tau(AT8和AT100)的年龄依赖性超磷酸化。超磷酸化的Tau显示导致tau聚集的构象变化，并且小鼠从6个月龄起形成神经原纤维缠结，尽管发作的变动高。与病理学伴随的是，这些小鼠逐步形成肌肉运动缺陷，诸如后肢紧握、横杆行走上的活动性降低，并且需要在8-11个月的龄期范围时过早处死(premature sacrifice)。Terwel等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 280:3963。
从3.5个月龄持续6个月到9.5个月龄用抗体对100个随机化的小鼠每周i.p.给药。将20mg/kg(mpk)IPN002处理与阴性对照抗体20mpk IgG1及抗-Tau抗体10mpk PHF1进行比较。PHF1是一种识别包含磷酸-Ser396和-Ser404的表位的小鼠单克隆抗体。Santacruz等(2005)Science 309:476。检查活的小鼠的紧握缺陷，以及在横杆行走上的表现。使用预先确定的标准过早处死(9.5个月龄前)快速进展到末期疾病的小鼠。获得血清、CSF、海马体、皮质、中脑和后脑；并且将半脑径向切片以用于组织病理学分析。在血清和CSF中测量抗体水平；在CSF中测量总的tau和游离的tau(未与IPN002结合的tau；“无IPN002”的tau)；进行对人和小鼠tau的生物化学/组织学分析；并分析小鼠β-淀粉样蛋白、炎性和突触蛋白标志物和炎性、突触和神经元活性标志物的基因表达变化。以盲化的方式进行所有分析。
专用于此研究的小鼠的数目是每个研究臂(arm)的25-33只小鼠和用于基线的10只。保留用于此研究的所有小鼠由计算机给予随机数字，并且随机分配至处理。小鼠组如表7中所示。
表7
组 N 株 处理
1 10 hTau.P301L-Tg 无(基线)
2 32 hTau.P301L-Tg 介质中的20mpk mIgG1
3 25 hTau.P301L-Tg 介质中的10mpk PHF1
4 33 hTau.P301L-Tg 介质中的20mpk IPN002
所有的动物实验依照完全遵从国际公认的实验动物护理和使用原则的生物伦理指南进行。处理参数提供于表8。
表8
施用途径 i.p.
给药体积、浓度 10ml/kg；1mg/ml；10mpk/天
处理频率 每周一次
处理持续期 多至6个月，取决于生存期
至处理组的分配 随机化
在处理期间和在处死时每周测定体重。从7个月龄起每周记录紧握得分。从7个月龄起，一周两次监测小鼠在笼中的运动性、重量减轻和后肢紧握的第一个体征。
紧握行为：为了评估紧握行为，将小鼠以其尾基部保持10秒。使用3点分级量表对后肢紧握评分：0.后肢伸展并且脚趾展开。1.一条后肢在>50％的时间部分缩回。2.两条后肢都在>50％的时间部分缩回。3.两条后肢在>50％的时间期间都完全缩回。根据以下对前肢紧握评分：0.前肢向前且远离身体伸展。1.一条前肢部分缩回>50％的时间。2.两条前肢都部分缩回>50％的时间。3.两条前肢完全缩回，不能移动，肌肉损失，小鼠是“祈祷型”。将显示出重度紧握表型的小鼠早期处死。
横杆行走。在7个月、8个月、8.5个月、9个月、和8.5个月龄时进行横杆行走以测定运动功能障碍和运动学习。其平衡、协调、身体状况和运动计划的量值是小鼠在横杆上平衡的能力和行走1米需要的时间。在30°的角度下放置具有12mm的圆形直径的铜横杆。照明开始区，而在远端放置室内逃生平台。在训练试验后，对小鼠的反应时间计时。另外，对脚滑移和腹部牵拉进行计数。
在研究开始前处死基线组。将展现出重度紧握、降低的体重和/或变得垂死的研究臂中的小鼠过早处死(早期处死)。在处理6个月后处死剩余的小鼠(后期处死)。
表9
通过添加适当稀释的血浆至经tau涂覆的平板，以及使用ELISA用HRP-抗小鼠IgG抗体和TMB检测，来测量血浆中游离的PHF1。游离的PHF1测定法的灵敏性不足以测量CSF中游离的PHF1水平。
通过添加适当稀释的血浆或CSF至经tau涂覆的平板，和使用ELISA用HRP-抗小鼠IgG抗体和TMB检测，来测量血浆和CSF中游离的IPN002。
使用已证明为不与IPN002或PHF1竞争的涂覆抗-Tau抗体和检测抗-Tau抗体两者，使用三明治式ELISA来测量CSF中的总tau。
使用两种抗-Tau抗体捕捉CSF中的tau使用同质ELTSA测量CSF中(IPN002的)游离的tau。这些抗体之一与IPN002竞争，因此不会与CSF中之前已与IPN002结合的tau相互作用。
通过在10个重量体积的冷TBS/Roche蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物中匀浆来对海马体和皮质分级。通过以10,000x g旋转出碎片(spinning debris)达15分钟从而生成匀浆。对匀浆进行BCA蛋白质含量；将所有匀浆稀释至1mg/ml，并且等同稀释相应的级分。将匀浆的一部分以100,000x g于4℃旋转1小时以生成可溶性级分(S1)和不溶性沉淀物。将不溶性沉淀物在1％肌氨酰/Roche蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物中重悬，并以100,000x g再旋转1小时。对肌氨酰(Sarkosyl)溶解的上清液进行标记(P1)；将肌氨酰不溶性沉淀物重悬，并标记(P2)。将后脑类似地进行分级，除了高盐(0.85M NaCl)外，接着使用1％肌氨酰溶解P1沉淀物。
人tau同质ELISA特异性地报告人tau，并且用于测定海马体、皮质和后脑中的匀浆、S1、P1和P2级分中的人tau水平。
人AT8同质ELISA特异性地报告人p202/205tau，并且用于测定海马体、皮质和后脑中的匀浆、S1、P1和P2级分中的人AT8水平。
对海马体、皮质和/或后脑级分(匀浆、Sl、Pl和/或P2)进行HT7、IPN001、Dako多克隆-tau、AT8、AT100、抗-p262、抗-p396和AD2、GFAP、Iba1、突触蛋白SDS-PAGE Western印迹。在每个凝胶上运行一个或多个裂解物对照以确保凝胶间的正确标准化。相对于相应的匀浆样品中的β-肌动蛋白标准化所有分析的条带。抗体及其靶标显示于表10。
表10
为了进行组织病理学分析，在AT8和AT100方面对6/32个随机化的径向切片的半脑进行染色；用DAB显色信号。将丘脑下核附加未定带(Subthalamic nucleus annex zonaincerta)(前囱2.08-1.12)和小脑(前端和后端部分)附加外侧小脑核(annex lateralcerebellarnucleus)的中间核(IntA/P/LAT；前囱2.28-1.32)两者进行量化(盲化的)。
进行小鼠β-淀粉样蛋白ELISA(Aβ40和Aβ42两者)以特异性检测小鼠脑匀浆中的Aβ40和Aβ42。小鼠Aβ42 ELISA对于要可靠地检测小鼠脑匀浆中的水平来说是不够灵敏的。小鼠Aβ40 ELISA检测出完全在测定法的线性范围内的小鼠Aβ40水平。使用小鼠Aβ40 ELISA来确定所有分组匀浆和可溶性(S1)级分中的Aβ40水平。
对炎症标志物、突触标志物和神经元活性标志物进行Taqman分析。标志物于表ll列出。
表11
统计学
紧握和横杆行走纵向统计学分析由独立的统计学家进行。简言之，对每只小鼠在紧握缺陷和横杆行走这两方面测定下降曲线的斜率，并且使用这些系数测定在组间是否存在显著差异。使用多种方法测定曲线的斜率和显著性。对于紧握，这些包括纵向完整情况分析(Longitudinal Complete Case Analysis)、调整缺失数据的联合模型(Joint ModelAdjusting for Missing Data)和贝叶斯有序纵向分析(Bayesian Ordered LongitudinalAnalysis)。对于横杆行走，这些包括纵向完整情况分析、调整丢失数据的联合模型、使用30个第二值(Second Values)的纵向分析、具有缺失数值的贝叶斯纵向分析和有效但非交叉分析(Alive but Non-cross Analysis).
使用单因素ANOVA，然后是Dunnett’s事后分析对整个分组、早期处死和晚期处死分组进行对生物化学、组织学和基因表达测定显著性的统计学分析。还对疾病进展(3.5个月基线对9.5个月IgG处理臂)进行t检验作为自单因素ANOVA分析得到的显著性的比较者。在PHF1或IPN002表现为极大地趋向变化但通过单因素ANOVA分析不反映这一点时，仅进行比较IgG与PHF1或IPN002的t检验以测定趋向方式在未达到单因素ANOVA显著性的情况下是否在所述终点出现。
为了测定116个终点中的哪些彼此最佳关联，进行矩阵关联；并且将最高的关联者基于其r2值和p值的组合秩排序。
结果
抗体水平和靶标结合
在处死前获得血浆和CSF。测定血浆中游离的IPN002和游离的PHF1，及CSF中游离的IPN002的水平。游离的PHF1测定法对于测量CSF中游离的PHF1水平不够灵敏。还获得足够的CSF以测定总的Tau和游离的Tau(不含IPN002的Tau)两者的水平。
血浆游离的IPN002和游离的PHF1水平
用20mpk IgG、20mpk IPN002或10mpk PHF1处理P301L Tau转基因小鼠。这些剂量基于来自靶标结合#1研究的结果选择。汇总数据显示于表12。
表12
在靶标结合#1中发现了10mpk IPN002持续4周，接着20mpk IPN002再持续4周平均产生血浆中的0.65μM游离的IPN002。贯穿8周用恒定的10mpk PHF1获得了相同浓度0.65μM游离的PHF1。在目前的研究中，如表12中显示的，平均血浆浓度是0.55μM游离的PHF1和0.9μM IPN002。因此，游离的IPN002的平均水平高于血浆中的游离PHF1。
CSF游离的IPN002水平平均而言，0.9nM游离的IPN002存在于经IPN002处理的P301L tau小鼠的CSF中，如表13中所示。这转化成CSF:血浆中0.1％游离的IPN002；即CSF中的IPN002浓度是血浆中0.1％的IPN002浓度(CSF中0.9nM；血浆中0.9μM)。CSF中的0.1％抗体与对在外周施用后进入脑并排入CSF中的其它抗体测定的百分比一致。然而，游离IPN002测定法仅报告未与tau结合的IPN002。Tau与CSF中的IPN002结合；从而，0.1％数值低度呈现(underrepresent)CSF中的总IPN002。将游离的IPN002水平添加至与tau结合的IPN002水平的计算提示了CSF中的总IPN002水平是约0.2％的血浆水平。如方法中所述，游离PHF1测定法对于测量游离的PHF1的CSF水平而言是不足够灵敏的。
表13
CSF中的总tau
测量CSF中的总Tau水平以确定PHF1或IPN002是否改变了这些水平。如图43中显示的，通过PHF1或IPN002处理没有显著改变CSF中的总Tau水平。从靶标结合研究中获得的数据预期此结果。
图43：使用tau抗体三明治式ELISA测定法测量P301L tau转基因小鼠CSF中的总tau水平。如图43中显示的，CSF中的tau水平随龄期而显著升高(比较3个月基线与小鼠IgG)。PHF1和IPN002都不改变总的tau水平。
CSF中游离的Tau(无IPN002的)
如方法中描述的CSF测定法中的游离Tau(无IPN002的)是两种tau抗体之一与IPN002竞争的ELISA；因此，该测定法不会检测与IPN002结合的tau。此测定法指示IPN002是否已经进入脑和CSF及是否已经结合其靶标(即已经与tau结合)。若IPN002已经结合其靶标，测定法中的信号会是降低的。此测定法对IPN002的游离tau是特异性的，因此没有检出游离的Tau(无PHF1的)。如图33中显示的，游离的Tau(无IPN002的)水平随疾病进展而升高，这与上文显示的数据一致。PHF1不影响游离的Tau水平。比较而言，TPN002处理导致游离Tau(无IPN002的)信号水平的96％降低。这些数据显示了IPN002已经完全结合其靶标CSF tau。
Tau和磷酸Tau生物化学和组织学
如方法中描述的，将海马体、皮质、和后脑分级成匀浆、可溶性(Sarkosyl溶解的)和不溶性(肌氨酰不溶性)级分。对级分分析人和小鼠tau两者，及阿尔茨海默氏病脑中超磷酸化的多种磷酸tau表位(AT8、AT100、p262、p396和AD2)。如图44A-H中显示的，与用小鼠IgG对照抗体处理相比，IPN002处理降低海马体匀浆(图44A)、海马体S1级分(图44B)、海马体P1级分(图44C)、海马体P2级分(图44D)、皮质匀浆(图44E)、和皮质P1级分(图44G)中的AT8水平。图44A-H中的数据显示了IPN002处理与PHF1处理相比以相似或更大的程度降低AT8水平。相对于BCA标准化图44A-H中描绘的数据。
如图45A中显示的，与用小鼠IgG对照抗体处理相比，IPN002处理降低皮质S1级分中的人p396-tau水平。如图45B和45C中显示的，与用小鼠IgG对照抗体处理相比，IPN002处理降低皮质均浆(图45B)和皮质S1级分(图45C)中的磷酸-tau S262水平。如图45D和45E中显示的，与用小鼠IgG对照抗体处理相比，用IPN002处理降低皮质S1级分中的小鼠p396-tau水平(图45D)，并且降低皮质S1级分中的小鼠AT100水平(图45E)。
在后脑内的两个不同核，即丘脑下核附加未定带(subthalamic nucleus annexzona incerta)(STH)和小脑(前端和后端部分)附加外侧小脑核的中间核(IntA/P/LAT)中分析Tau组织病理学(AT8和AT100)。如图46中显示的，IPN002(在后期处死的小鼠中)昱著改善AT8疾病病理学。PHF1趋于降低，但是不显著改善tau组织病理学。如图47中显示的，与用对照IgG处理相比，IPN002处理改善AT100和MC1疾病病理学。
炎症
星形胶质增生和小胶质细胞增生(microgliosis)两者在AD和tau病变的模型中形成。然而，活化的星形胶质细胞或小胶质细胞在疾病中发挥的作用不是完全清楚的。若星形胶质细胞或小胶质细胞在P301L tau转基因模型中是活化的，则此类活化会源自突变tau过表达。假设分泌性tau诱导AD病理学。若分泌性tau诱导AD病理学，则它也可以诱导神经胶质活化。因此，测定星形胶质增生(GFAP)或小胶质细胞增生(Iba1)中增加的蛋白质在P301L转基因小鼠模型中是否增加。
如图48A和48B中显示的，GFAP蛋白质水平在海马体和皮质两者中随疾病进展而增加。这些数据指示星形胶质细胞在海马体和皮质中是活化的或者它们已经浸润这些脑区。IPN002处理显著降低海马体和皮质两者中的GFAP蛋白质水平，显示了IPN002处理降低疾病相关的星形胶质增生升高。PHF1显著降低海马体而非皮质中的GFAP。
在海马体和皮质两者中测量Iba1蛋白质水平(小胶质细胞的一种标志物)。如图49A和49B中显示的，Iba1在海马体中不随疾病进展而增加，而是在皮质中增加。IPN002处理对Iba1蛋白质水平的疾病进展没有影响。比较而言，PHF1处理确实显著降低Iba1蛋白质水平。数据提示了IPN002和PHF1的不同作用机制。
β-淀粉样蛋白水平的调控
如实施例17中显示的，用IPN002处理iPSC-CN，降低了由所有iPSC-CN分泌的Aβ40和Aβ42水平，而对照IgG不降低Aβ40或Aβ42分泌。然后，测定IPN002是否也调控Aβ体内水平。在P301L小鼠模型中，没有人APP的过表达：因此，测量小鼠Aβ水平。小鼠Aβ42 ELISA的灵敏性对于测量这些匀浆中的Aβ42水平是不足够的。然而，小鼠Aβ40 ELISA是足够灵敏的，因此用于测定匀浆和上清液级分中的小鼠Aβ40水平。小鼠Aβ40水平随疾病进展而升高。观察到的Aβ40水平升高可以是tau依赖性的和/或年龄依赖性的。如图50A和50B中显示的，IPN002处理降低匀浆(图50A)和可溶性级分(图50B)两者中的Ab40水平。
图50A和50B中的数据显示了tau过表达(可能与变老结合)驱动疾病进展相关的水平升高。数据提示分泌性tau是驱动Aβ水平升高的致因因素，IPN002继而通过阻断eTau功能抑制。比较而言，PHF1(一种非eTau结合抗体)对Aβ水平没有影响。
运动功能
测定IPN002处理对运动功能的影响，如通过紧握和横杆行走测试所评估的。数据显示于图31、32、51和52中。
如图31中显示的，与用小鼠IgG对照处理相比IPN002处理改善紧握得分。
如图32和51中显示的，与用小鼠IgG对照处理相比，IPN002处理改善横杆行走测试中的平均等待时间(图32)，并且降低不能走横杆的小鼠的百分比(图51)。
实施例21：表位定位
如上文实施例18中的描述来实施肽结合和竞争测定。
使用了下列肽：
IPIG-1：EVMEDHAGTYGLGDRK(SEQ ID NO:81；tau的氨基酸9-24)；
IPIG-2：DHAGTYGLGDRK(SEQ ID NO:49；tau的氨基酸13-24)；
IPIG-3：AGTYGLGD(SEQ ID NO:82；tau的氨基酸15-22)；
IPIG-4：AGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLK(SEQ ID NO:50；tau的氨基酸15-44)；
PAD肽：AEPRQEFEVMEDHAGTY(SEQ ID NO:80；tau的氨基酸2-18)。
结果显示于图53-55。
图30显示了未生物素化的tau肽与生物素化形式的tau竞争。上部小图显示了生物素化的Tau 13-24肽(IPIG-2；SEQ ID NO:49)与未生物素化的Tau13-24竞争结合至hu-IPN002。
图52显示了全长tau、IPIG-1、IPIG-2和IPIG-4被hu-IPN002结合。IPIG-3(其缺乏残基23和24)不被hu-IPN002结合，PAD也不被hu-IPN002结合。如此，残基23和24表现为是hu-IPN002结合所需要的。
图53显示了eTau-4肽结合hu-IPN002；然而，PAD(tau 2-18)、Tau 15-22、Tau 19-28和Tau 21-31肽不结合hu-IPN002。
数据指示残基15-24表现为是hu-IPN002结合必需的。
实施例22：合成的eTau-4在HFN中对Aβ40和Aβ42水平的影响
通过人胎儿神经元(HFN)评估了合成的eTau-4多肽对Aβ40和Aβ42的产生的影响。将HFN在含有500nM eTau4(SEQ ID NO:48)、1μM重组Tau-383、或模拟物对照多肽的培养基中培养5天(d05)、10天(d10)、15天(d15)或20天(d20)。如上文所述那样测量了培养基中存在的Aβ40和Aβ42的量。结果在图55A和55B中显示。
如图55A所示，在用500nM eTau4处理的HFN中，来自HFN第15天和第20天的条件化培养基的Aβ40的量减少了。如图55B所示，在用500nM eTau4处理的HFN中，来自HFN第15天和第20天的条件化培养基的Aβ42的量增加了。
实施例23：抗-Tau抗体在HFN中对Aβ40和Aβ42水平的影响
通过HFN评估了抗-Tau抗体对Aβ40和Aβ42的产生的影响。将HFN在含有终浓度为30μg/μL的多种抗-Tau抗体或对照抗体的培养基中培养20天的时期。
对照抗体和抗-Tau抗体如下所示：
1)mo IgG：(非特异性小鼠IgG)；
2)hu IgG(非特异性人IgG)；
3)IPN002(识别Tau的氨基酸15-24内的表位的抗-Tau抗体，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R氨基酸序列)；
4)IPN002的人源化变体(hu-IPN002)；
5)IPN002的人源化变体(hu-IPN002v1)；
6)IPN002的人源化变体(hu-IPN002v2)；
7)TNT-1–一种小鼠单克隆抗体，其使用Tau 2-18肽而产生作为免疫原(参见例如Kanaan等(2011)J.Neurosci.31:9858)，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R氨基酸序列；
8)5A6-一种小鼠单克隆抗体，其已被报道为识别Tau的氨基酸19-46内的表位(参见例如Horowitz等(2004)J.Neurosci.24:7895)，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R氨基酸序列；
9)MC1–一种小鼠单克隆抗体，其识别Tau的氨基酸28-126内的表位，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R氨基酸序列；
10)HT7–一种小鼠单克隆抗体，其已被报道为识别包含Tau的氨基酸PPGQK(Tau的氨基酸159-163；参见例如USPN 7,387,879)的表位，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R氨基酸序列；
11)BT2–一种小鼠单克隆抗体，其已被报道为识别包含Tau的氨基酸RSGYS(Tau的氨基酸194-198；参见例如USPN 6,232,437)的表位，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R氨基酸序列；
12)Tau5–一种小鼠单克隆抗体，其已被报道为识别Ser210-Arg230内的表位(参见例如Carmel等(1996)J.Biol.Chem.271:32789)，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R氨基酸序列；
13)IPN008–一种抗-Tau抗体，其识别tau的C末端区内的表位；
14)PHF1–一种小鼠单克隆抗体，其已被报道为识别包含磷酸-Ser396和磷酸-Ser404的表位(参见例如Santacruz等(2005)Science 309:476)，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R氨基酸序列；
15)DC39n1–一种小鼠单克隆抗体，其识别tau的2N插入物内的表位；
16)DA31–一种小鼠单克隆抗体，其识别Tau的氨基酸150-190内的表位，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R氨基酸序列；和
17)Dako–一种多克隆抗体，其识别Tau的氨基酸243-441内的表位，其中所述氨基酸编号基于图61中所示的2N4R氨基酸序列。
图59中提供了多种抗体所识别的表位的位置示意图。图61提供了eTau4的氨基酸序列(其不包含2N插入物)与Tau的2N4R的氨基酸序列(其含有2N插入物，从2N4R Tau的氨基酸45至102)的比对。
在20天培养期结束时，测量培养基中存在的Aβ40和Aβ42的量，如上文所述。结果显示于图56A和56B。
如图56A所示，特异性针对eTau的氨基酸2-68内表位的抗体降低了HFN的Aβ40生产。如图56B所示，特异性针对eTau的氨基酸2-68内表位的抗体降低了HFN的Aβ42生产。
评估了抗-Tau抗体DA31对HFN的Aβ40和Aβ42的生产的影响。将HFN在含有终浓度为30μg/μL的多种抗-Tau抗体或对照抗体的培养基中培养20天的时期。结果显示于图57A和57B。
DA31是结合Tau的氨基酸150-190内(编号基于图61中所示的2N4R Tau)的表位的小鼠单克隆抗体。如图57A所示，DA31降低了HFN的Aβ40生产，而HT7(特异性针对氨基酸159-163内的表位)则无此效果。如图57B所示，DA31降低了HFN的Aβ42生产，而HT7则无此效果。
评估了抗-Tau抗体随时间对Aβ40和Aβ42的生产的影响。将HFN在含有如上文所述的多种抗体的培养基中培养5天(d5)、10天(d10)、15天(d15)、或20天(d20)的时期。测试了对照IgG、MC1、IPN002、PHF1、和DC39n1(“N1插入物”)。DC39n1是结合Tau的2N插入物内的表位(例如图61中所示的2N4R Tau氨基酸序列的氨基酸45-102内)的小鼠单克隆抗体。在培养期结束时，测量培养基中存在的Aβ40和Aβ42的量，如上文所述。结果显示于图58A和58B。
如图58A所示，MC1和IPN002降低了HFN的Aβ40生产，而PHF1或DC39n1则无此效果。如图58A所示，MC1和IPN002降低了HFN的Aβ42生产，而PHF1或DC39n1则无此效果。
实施例24：IPN002的人源化变体对非人灵长类动物的CSF中A-β水平的影响
评估了IPN002的人源化变体，hu-IPN002，对于的非人灵长类动物的CSF中Aβ水平的影响。对雄性食蟹猴(Macaca fascicularis)以5mg/kg或20mg/kg的剂量水平给予hu-IPN002的单一缓慢推注。在注射后的不同时间点收集脑脊液(CSF)。用市售的ELISA测定法来测量CSF样品中的Aβ40存在。结果显示于图60。数值代表在特定时间点收集的所有样品的均值(平均值±平均值的标准误)。
如图60所示，20mg/kg hu-IPN002的单一注射在约150小时后降低了CSF中的Aβ40水平。CSF中的Aβ40水平继续降低至约350小时。
虽然本发明已经参考其具体的实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应当理解，可以在不偏离本发明的真正精神和范围的前提下进行各种变化及可以替代等同方案。另外，可以进行许多修改以使具体的情况、材料、物质组成、方法、一个或多个方法步骤适合于本发明的目的、精神和范围。所有此类修改均意图在所附的权利要求书的范围内。

Claims (11)

1.一种药物制剂，其包含：
a)抗体，其特异性地结合Tau，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；和
b)适于对人施用的药学上可接受的赋形剂，其中所述制剂不含内毒素。
2.权利要求1的药物制剂，其中所述抗体包含重链，所述重链包含所述重链可变区和人IgG4重链恒定区。
3.权利要求1的药物制剂，其中所述抗体包含重链，所述重链包含所述重链可变区和人IgG4重链恒定区，其中所述重链包含铰链区，所述铰链区包含S241P取代，该编码基于Kabat编码。
4.权利要求1的药物制剂，其中所述抗体包含：
(i)重链，所述重链包含所述重链可变区和人IgG4重链恒定区，和
(ii)轻链，所述轻链包含所述轻链可变区和人κ轻链恒定区。
5.权利要求1的药物制剂，其中所述抗体包含：
(i)重链，所述重链包含所述重链可变区和人IgG4重链恒定区，其中所述重链包含铰链区，所述铰链区包含S241P取代，该编码基于Kabat编码，和
(ii)轻链，所述轻链包含所述轻链可变区和人κ轻链恒定区。
6.权利要求1的药物制剂，其中所述抗体是Fv、scFv、Fab、F(ab')2或Fab'。
7.权利要求1的药物制剂，其中所述抗体与促进穿过血脑屏障的药剂配制在一起。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的药物制剂在制备用于治疗人受试者中Tau病变的药物中的用途。
9.权利要求8的用途，其中所述Tau病变是进行性核上性麻痹。
10.权利要求8的用途，其中所述Tau病变是额颞叶痴呆。
11.权利要求8的用途，其中所述Tau病变是阿尔茨海默氏病。
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