JPH05146292A - 新規プロテア−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】配列表１のアミノ酸配列を有する耐熱性中性プ
ロテア−ゼにおいて、アミノ酸末端から１１０番目及び
／又は１５７番目のチロシン残基が他のアミノ酸残基に
置換された新規なプロテア−ゼ 【効果】本発明における変異体酵素は、基質特異性をよ
り厳密にした改良型サ−モリシン様金属プロテア−ゼで
ある。この基質特異性の上昇は、食品加工工程での苦み
の低減や、酵素の自己分解速度の低減等の効果が期待さ
れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】サ−モリシンは工業的に製造され
ている有用な酵素であり、基質特異性が極めて広く、至
適ｐＨが中性付近であることなどの特徴から、その用途
は皮なめし工業、海産物加工、食品製造、化粧品製造
等、広範な分野にわたっている。本発明は、サーモリシ
ン様金属プロテアーゼの改良に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】サーモリシンは好熱菌の一種であるバチ
ルス サーモプロテオリチカス（Bacillus thermoprote
olyticus）の培養上清中に見つけられた金属プロテア−
ゼであり（J. Fermentation Tech.,40,346 (1962) 参
照）、これまで数多くの研究が行われてきた。たとえ
ば、酵素蛋白質の一次構造（Titani K.,et al.,Nature
NewBiol.(1972) 238,35-37)や、三次構造( Holmes, M.
A., Matthews, B.W. J. Mol. Biol.(1982) 160,623-63
9)が明らかにされている。しかし、その遺伝子構造はま
だ報告されていない。ところが最近、バチルス ステア
ロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ) よ
り耐熱性中性プロテアーゼの遺伝子（ｎｐｒＭ）がクロ
ーン化され（Kubo M. and Imanaka T., J.Gen.Microbio
l. (1988) 134,1883-1892)、その塩基配列から推測され
る成熟酵素のアミノ酸配列（配列表１に記載）が、サー
モリシンと極めて類似していることが明らかになった。
以下、本明細書においてはこのｎｐｒＭ遺伝子に由来す
るプロテアーゼを「サーモリシン様金属プロテアーゼ」
と呼ぶ。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本酵素の基質特異性、
至適ｐＨ、物理的安定性等はアミノ酸配列により規定さ
れている。工業用酵素として本酵素の利用範囲を拡大す
るためには、これらの諸性質を利用分野に適するよう改
変しなければならない。一般に蛋白質の高次構造はアミ
ノ酸配列に由来しており、蛋白質の性質を改変するため
にはアミノ酸配列を改変することが一つの解決策であ
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】この様な課題を解決する
ために、本発明者らはタンパク質工学の手法を用いて、
上記 Bacillus stearothermophilus 由来のサーモリシ
ン様金属プロテアーゼの改変を行い、本発明を完成する
に至った。

【０００５】すなわち、配列表１のアミノ酸配列を有す
る上記サーモリシン様金属プロテアーゼにおいて、アミ
ノ末端から１１０番目のチロシン残基又は１５７番目の
チロシン残基の一つか或いは両方を他のアミノ酸に置換
することにより、新規なプロテアーゼを作成した。

【０００６】置換するアミノ酸としては種々のものが考
えられるが、たとえば１１０番目のチロシン残基に対し
てはアルギニン、リジン等に、１５７番目のチロシン残
基に対してはグルタミン酸等に置換した場合に、優れた
性質の酵素が得られることがわかった。以下、これらの
変異体酵素の作成方法について具体的に説明する。組換えＤＮＡ技術によるサーモリシン様金属プロテアー
ゼの生産 ｎｐｒ Ｍ遺伝子を枯草菌において発現させる方法が報告
されている(Kubo M.and Imanaka T., J. Bacteriol.(19
89) 171, 4080-4082) 。本報告における、プラスミドｐ
ＭＫ１はｎｐｒＭ遺伝子を含み枯草菌で複製される領域
およびカナマイシン耐性遺伝子を有する。本プラスミド
によって形質転換された枯草菌は培地中に多量のサーモ
リシン様金属プロテアーゼを分泌することが見出だされ
た。この結果からｎｐｒＭ遺伝子は枯草菌においても効
率よく発現されることがわかるが、さらに効率の良いプ
ロモーター等を導入することにより発現量を高めること
は可能であると考えられる。また枯草菌内で複製可能な
他のベクターを用いても同様に本遺伝子を発現させるこ
とができるであろう。ｎｐｒＭ遺伝子への変異導入 クローン化ＤＮＡへの部位特異的な変異導入方法は種々
の方法が報告されている。我々はVandeyarらの方法（Va
ndeyar M.,etal. Gene (1988) 65, 129.) を用いて、
Ｍ１３ファージにｎｐｒＭ遺伝子の全体または一部をク
ローン化して得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、化学合
成したオリゴヌクレオチドを変異プライマーとして、変
異体ｎｐｒＭ遺伝子断片を作成した。

【０００７】鋳型一本鎖ＤＮＡの作成はたとえば次のよ
うにして行うことができる。図１に示したように、プラ
スミドｐＭＫ１より制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ
で消化して得られる約３．５ｋｂの断片をプラスミドｐ
ＵＣ９にサブクローン化しｐＵＣＴＺ５５なるプラスミ
ドを作成した。

【０００８】さらに図２に示したように１１０番目に変
異を導入する場合にはｐＵＣＴＺ５５よりＢａｍＨＩ、
ＳｐｈＩで消化して得られる約７３０ｂｐの断片を、Ｍ
１３ファージｍｐ１９にクローン化し（Ｍ１３ＴＺＢａ
−Ｓｐ）一本鎖ＤＮＡを調製した。

【０００９】図３に示したように１５７番目に変異を導
入する場合にはｐＵＣＴＺ５５よりＳｐｈＩ、ＢｃｌＩ
で消化して得られる約５５０ｂｐの断片を、Ｍ１３ファ
ージｍｐ１８にクローン化し（Ｍ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ）
一本鎖ＤＮＡを調製した。変異プライマーは１１０番目
のチロシン残基または１５７番目のチロシン残基のコド
ンを含む鋳型一本鎖ＤＮＡと部分的に相補性があれば良
く、例えば次のようなものが考えられる。

【００１０】１１０番目のチロシン残基を他のアミノ酸
に置換する場合の例 アルギニン ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＣＧＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ リジン ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ ヒスチジン ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ アスパラギン ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＡＡＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ アスパラギン酸 ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＧＡＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ バリン ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＧＴＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ アラニン ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＧＣＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ フェニルアラニン５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＴＴＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ トリプトファン ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ ロイシン ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＣＴＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ イソロイシン ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＡＴＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ メチオニン ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＡＴＧＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ トレオニン ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ セリン ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＡＧＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ グルタミン ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ グルタミン酸 ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＧＡＡＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ グリシン ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ システイン ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ プロリン ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＣＣＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡ ３´ １５７番目チロシン残基を他のアミノ酸に置換する場合
の例 アルギニン ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＣＧＴＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ リジン ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ ヒスチジン ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＣＡＴＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ アスパラギン ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＡＡＴＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ アスパラギン酸 ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＧＡＴＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ バリン ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＧＴＴＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ アラニン ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＧＣＴＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ フェニルアラニン５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ トリプトファン ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＧＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ ロイシン ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＣＴＴＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ イソロイシン ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＡＴＴＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ メチオニン ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＡＴＧＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ トレオニン ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＡＣＴＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ セリン ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＡＧＴＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ グルタミン ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ グルタミン酸 ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＧＡＡＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ グリシン ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＧＧＧＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ システイン ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＴＧＴＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ プロリン ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＣＡＡＡＡＣＧＡＡ ３´ １１０番目及び１５７番目のチロシン残基を同時に他の
アミノ酸残基で置換する場合は、記述の２グル−プのア
ミノ酸残基のいずれの組み合わせでも良い。

【００１１】これらの変異プライマーを用いることによ
り所望のアミノ酸に置換することができる。部位特異的
変異導入を行った後、変異体Ｍ１３ファージをクローン
化し、ＤＮＡ塩基配列を決定することによって目的のア
ミノ酸置換が起こっていることを確認した。

【００１２】変異体Ｍ１３ファージの二本鎖ＤＮＡから
変異体ｎｐｒＭ遺伝子断片を切り出し、プラスミドｐＵ
ＣＴＺ５５の相当領域と置換することにより変異体ｎｐ
ｒＭ遺伝子を含むプラスミドｐＵＣＴＺ５５（ｍｕｔａ
ｎｔ）が得られた。２か所に変異を導入する場合には、
はじめにどちらかの変異体を作製し、得られた変異型一
本鎖ＤＮＡを鋳型として第２の変異導入を行わずに目的
物を得る方法がある。どちらの方法によっても２か所に
変異をもったプラスミドは得られた。変異体ｎｐｒＭ遺伝子の枯草菌における発現 図４に示したように、まず野性型サーモリシン様金属プ
ロテアーゼの遺伝子の一部を欠失したプラスミドｐＭＫ
８を作成した。これは以下の操作において野性型酵素の
組換体の出現を防ぐために重要な意味を持つ。

【００１３】図５に示す様に、ｐＭＫ８およびｐＵＣＴ
Ｚ５５（ｍｕｔａｎｔ）をそれぞれＢａｍＨＩで切断
し、ＤＮＡリガーゼで連結し、枯草菌を形質転換するこ
とによってｐＭＫ９（ｍｕｔａｎｔ）を作成した。本プ
ラスミドにより形質転換された枯草菌は変異体酵素を培
地中に分泌発現することができる。

【００１４】分泌された酵素は通常の方法、たとえば疎
水クロマトグラフィーやゲル濾過によって均一に精製す
ることが出来る。

【００１５】合成ペプチド（Ｌ−ペプチド）はＬＷＭＲ
ＦＡの６個のアミノ酸がつながったヘキサペプチドで、
野性型サ−モライシン様金属プロテア−ゼで消化すると
まずアルギニンとフェニルアラニンの間で優先的に切断
がおこり、次いでトリプトファンとメチオニンの間で切
断が起こる（図６及び図７）。

【００１６】一方、変異体酵素Ｙ１１０ＲやＹ１５７Ｅ
ではＬＷ断片の生成量が低いことから第二段階のトリプ
トファンとメチオニンの間の消化が極めて遅く、２か所
に変異を持つＹ１１０Ｒ／Ｙ１５７ＥではＬＷ断片が検
出されないことからこの部位は消化されなかったことが
わかる（図６及び図８〜１０）。このことは１１０番目
や１５７番目に変異を導入すると酵素の基質特異性が変
化することを示唆している。なお変異体酵素の表わし方
として、例えば１１０番目のチロシン残基をアルギニン
に置換したものをＹ１１０Ｒと示した。また１５７番目
のチロシン残基をグルタミン酸に置換したものをＹ１５
７Ｅと示し、又、両方のチロシン残基を置換したものを
Ｙ１１０Ｒ／Ｙ１５７Ｅと示した。

【００１７】本発明の新規プロテア−ゼは、上記で詳細
に記載したアミノ酸配列を有するポリペプチドの他に、
これと実質上同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを
包含する。特定の酵素活性を有するポリペプチド中の酵
素活性に関与しない領域においてアミノ酸配列に変更を
加えても、当該酵素活性が影響を受けない場合があるこ
とは、当業者により良く知られている。従って、その様
な変更を含むポリペプチドも、本発明の特徴を保持して
いる限り、即ち配列表１において１１０番目のチロシン
残基あるいは１５７番目のチロシン残基を置換したもの
である限り、本発明の範囲に属するものである。

【００１８】

【実施例】次に、本発明の実施例を説明するが、これら
の実施例は本発明を何等限定するものでない。

【００１９】実施例１ Bacillus stearothermophilus MK232 株由来のサ−モリ
シン様金属プロテア−ゼ遺伝子、ｎｐｒＭを含むプラス
ミドｐＭＫ１、１μｇを２０μｌの反応液（５０ｍＭ
トリス−塩酸 ｐＨ７．５ １０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム １００ｍＭ食塩 １ｍＭ ＤＴＴ）にＰｓｔＩ５ユ
ニットおよびＢａｍＨＩ５ユニットを加えて３７℃で２
時間反応させた。このサンプルを１％アガロ−スゲル電
気泳動で約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１
０１社ジ−ンクリ−ンＤＮＡ精製キットを用いて精製し
た。

【００２０】一方、プラスミドベクタ−ｐＵＣ９、１μ
ｇを含む２０μリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−
塩酸 ｐＨ７．５ １０ｍＭ 塩化マグネシウム１００
ｍＭ 食塩 １ｍＭ ＤＴＴ）にＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ
各５ユニットを加えて３７℃で２時間反応させた。

【００２１】このようにして得られたｎｐｒＭ遺伝子の
ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片と、ｐＵＣ９のＰｓｔＩ−Ｂ
ａｍＨＩ消化物を宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ションキッ
トを用いて反応させ、常法に従って大腸菌ＪＭ１０９に
形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断
片を含む組換体プラスミド（ｐＵＣＴＺ５５）を得た。
組換体プラスミドｐＵＣＴＺ５５、１μｇを含む２０
μリットルの反応液（５０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．
５ １０ｍＭ 塩化マグネシウム １００ｍＭ食塩 １
ｍＭ ＤＴＴ）にＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ各５ユニットを
加えて３７℃で２時間反応させた。このサンプルを１％
アガロ−スゲル電気泳動で約７３０ｂｐのＤＮＡ断片を
分離し、バイオ１０１社ジ−ンクリ−ンＤＮＡ精製キッ
トを用いて精製した。

【００２２】一方、ファ−ジベクタ−Ｍ１３ｍｐ１９、
１μｇを２０μリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−
塩酸 ｐＨ７．５ １０ｍＭ 塩化マグネシウム１００
ｍＭ 食塩 １ｍＭ ＤＴＴ）にＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ
各５ユニットを加えて３７℃で２時間反応させた。

【００２３】このようにして得られたｎｐｒＭ遺伝子の
ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片と、Ｍ１３ｍｐ１９のＢａｍ
ＨＩ−ＳｐｈＩ消化物を宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ショ
ンキットを用いて反応させ、常法に従って大腸菌ＪＭ１
０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子のＢａｍＨＩ−Ｓｐ
ｈＩ断片を含む組換体ファ−ジ（Ｍ１３ＴＺＢａ−Ｓ
ｐ）を得た。

【００２４】得られたＭ１３ＴＺＢａ−Ｓｐから、常法
に従って１本鎖ＤＮＡを調製し、変異の導入に用いた。
変異の導入に用いたオリゴヌクレオチドはアプライドバ
イオシステムズ社製３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置を用いて
作成し、その塩基配列の一例を以下に記す。

【００２５】 ５´ＡＧＣＣＡＡＧＧＣＣＧＴＡＡＴＡＡＣＧＣＡ３´ 変異の導入は、東洋紡社製Ｔ７−ＧＥＮインビトロミュ
−タゲネシスキットを用いて行い、ＤＮＡの配列決定に
よって確認した。

【００２６】変異を導入したＭ１３ＴＺＢａ−Ｓｐ及
び、ｐＵＣＴＺ５５の二本鎖ＤＮＡを、常法に従って調
整し、それぞれ１μｇを含む２０μリットルの反応液
（５０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．５ １０ｍＭ 塩
化マグネシウム １００ｍＭ 食塩 １ｍＭ ＤＴＴ）
にＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ各５ユニットを加えて３７℃で
２時間反応させた。このサンプルを１％アガロ−スゲル
で電気泳動しＭ１３ＴＺＢａ−Ｓｐ消化物からは、７３
０ベ−スペアのＤＮＡ断片を分離し、ｐＵＣＴＺ５５消
化物からは、５．１キロベ−スペアのＤＮＡ断片を分離
し、バイオ１０１社ジ−ンクリ−ンＤＮＡ精製キットを
用いて精製した。このようにして得られたｎｐｒＭ遺伝
子の変異の導入されたＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片と、ｐ
ＵＣＴＺ５５のＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片を宝酒造社製
ＤＮＡライゲ−ションキットを用いて反応させ、常法に
従って大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子
の変異の導入されたＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を含む組
換体プラスミドｐＵＣＴＺ５５（Ｙ１１０Ｒ）を得た。

【００２７】プラスミドｐＭＫ１、１μｇを含む２０μ
リットルの反応液（５０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．
５ １０ｍＭ 塩化マグネシウム １００ｍＭ 食塩
１ｍＭ ＤＴＴ）にＢａｍＨＩ、５ユニットを加えて３
７℃で２時間反応させた。ｐＭＫ１消化物を１％アガロ
−スゲルで電気泳動し、１５．８キロベ−スペアのＤＮ
Ａ断片を分離し、バイオ１０１社ジ−ンクリ−ンＤＮＡ
精製キットを用いて精製した。

【００２８】このようにして得られたｐＭＫ１のＢａｍ
ＨＩ断片を宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ションキットを用
いて反応させ、常法に従って枯草菌ＭＴ−２株（ｔｒｐ
Ｃ２ｌｅｕＣ７ ｈｓｄＲ ｈｓｄＭ Ｎｐｒ−）に形
質転換し、５μｇ／ｍリットルカナマイシンを含むＬＢ
寒天培地に塗布し、３７℃にて一夜培養し、コロニ−を
単離することにより、組換体プラスミドｐＭＫ８を持っ
た形質転換体を得た。これより定法に従ってプラスミド
ＤＮＡを調整した。

【００２９】プラスミドｐＭＫ８およびｐＵＣＴＺ５５
（Ｎ２２７Ｈ）それぞれ１μｇを２０μリットルの反応
液（５０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．５ １０ｍＭ
塩化マグネシウム １００ｍＭ 食塩 １ｍＭ ＤＴ
Ｔ）にＢａｍＨＩ、５ユニットを加えて３７℃で２時間
反応させた。これらを宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ション
キットを用いて反応させ、常法に従って枯草菌ＭＴ−２
株に形質転換し、１％カゼイン、５μｇ／ミリリットル
のカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃に
て一夜培養し、ハロー形成コロニーを単離することによ
り、組換体プラスミドｐＭＫ９（Ｙ１１０Ｒ）を持った
形質転換体を得た。

【００３０】実施例２ 組換体プラスミドｐＵＣＴＺ５５、１μｇを含む２０μ
リットルの反応液（５０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．
５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００ｍＭ食塩、１
ｍＭ ＤＴＴ）にＳｐｈＩ、ＢｃｌＩ各５ユニットを加
えて３７℃で２時間反応させた。このサンプルを１％ア
ガロ−スゲルで電気泳動しで約５５０ｂｐのＤＮＡ断片
を分離し、バイオ１０１社ジ−ンクリ−ンＤＮＡ精製キ
ットを用いて精製した。

【００３１】一方、ファ−ジベクタ−Ｍ１３ｍｐ１８、
１μｇを２０μリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−
塩酸 ｐＨ７．５，１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１０
０ｍＭ 食塩、１ｍＭ ＤＴＴ）にＳｐｈＩ、ＢａｍＨ
Ｉ各５ユニットを加えて３７℃で２時間反応させた。

【００３２】このようにして得られたｎｐｒＭ遺伝子の
ＳｐｈＩ−ＢｃｌＩ断片と、Ｍ１３ｍｐ１８のＳｐｈＩ
−ＢａｍＨＩ消化物とを宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ショ
ンキットを用いて反応させ、常法に従って大腸菌ＪＭ１
０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子のＳｐｈＩ−Ｂｃｌ
Ｉ断片を含む組換体ファ−ジ（Ｍ１３ＴＺＰＳｐ−Ｂ
ｃ）を得た。

【００３３】得られたＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃから、常法
に従って１本鎖ＤＮＡを調製し、変異の導入に用いた。
変異の導入に用いたオリゴヌクレオチドはアプライドバ
イオシステムズ社製３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置を用いて
作成し、その塩基配列の一例を以下に記す。

【００３４】 ５´ＧＧＡＣＴＣＡＴＴＧＡＡＣＡＡＡＡＣＧＡＡ３´ 変異の導入は、東洋紡社製Ｔ７−ＧＥＮインビトロミュ
−タゲネシスキットを用いて行い、ＤＮＡの配列決定に
よって確認した。

【００３５】変異を導入したＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ及
び、ｐＵＣＴＺ５５の二本鎖ＤＮＡを、常法に従って調
整し、それぞれ１μｇを含む２０μリットルの反応液
（５０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．５，１０ｍＭ 塩
化マグネシウム，１００ｍＭ 食塩，１ｍＭ ＤＴＴ）
にＳｐｈＩ、ＡａｔＩ各５ユニットを加えて３７℃で２
時間反応させた。このサンプルを１％アガロ−スゲルで
電気泳動しＭ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃ消化物からは、５５０
ベ−スペアのＤＮＡ断片を分離し、ｐＵＣＴＺ５５消化
物からは、５．３キロベ−スペアのＤＮＡ断片を分離
し、バイオ１０１社ジ−ンクリ−ンＤＮＡ精製キットを
用いて精製した。

【００３６】このようにして得られたｎｐｒＭ遺伝子の
変異の導入されたＳｐｈＩ−ＡａｔＩ断片と、ｐＵＣＴ
Ｚ５５のＳｐｈＩ−ＡａｔＩ断片を宝酒造社製ＤＮＡラ
イゲ−ションキットを用いて反応させ、常法に従って大
腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子の変異の
導入されたＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を含む組換体プラ
スミドｐＵＣＴＺ５５（Ｙ１５７Ｅ）を得た。

【００３７】プラスミドｐＭＫ８およびｐＵＣＴＺ５５
（Ｙ１５７Ｅ）それぞれ１μｇを含む２０μリットルの
反応液（５０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、１００ｍＭ 食塩、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ）にＢａｍＨＩ、５ユニットを加えて３７℃で２時間
反応させた。これらを宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ション
キットを用いて反応させ、常法に従って枯草菌ＭＴ−２
株に形質転換し、１％カゼイン、５μｇ／ミリリットル
のカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃に
て一夜培養し、ハロー形成コロニーを単離することによ
り、組換体プラスミドｐＭＫ９（Ｙ１５７Ｅ）を持った
形質転換体を得た。

【００３８】実施例３ ｐＵＣＴＺ５５（Ｙ１１０Ｒ）を１μｇ含む２０μリッ
トルの反応液（５０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．５、
１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００ｍＭ 食塩、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ）にＳｐｈＩ、ＡａｔＩ各５ユニットを加え
て３７℃で２時間反応させた。このサンプルを１％アガ
ロ−スゲルで電気泳動し、消化物から約５．３キロベ−
スペアのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社ジ−ンク
リ−ンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。

【００３９】このようにして得られたｐＵＣＴＺ５５
（Ｙ１１０Ｒ）のＳｐｈＩ−ＡａｔＩ断片と、実施例２
で単離した１５７番目をグルタミン酸に変異したＭ１３
ＴＺＳｐ−ＢｃのＳｐｈＩ−ＡａｔＩ断片を宝酒造社製
ＤＮＡライゲ−ションキットを用いて反応させ、常法に
従って大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子
の変異の導入されたＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を含む組
換体プラスミドｐＵＣＴＺ５５（Ｙ１１０Ｒ／Ｙ１５７
Ｅ）を得た。

【００４０】プラスミドｐＭＫ８およびｐＵＣＴＺ５５
（Ｙ１１０Ｒ／Ｙ１５７Ｅ）をそれぞれ１μｇを含む２
０μリットルの反応液（５０ｍＭ トリス−塩酸ｐＨ
７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００ｍＭ 食
塩、１ｍＭ ＤＴＴ）にＢａｍＨＩ、５ユニットを加え
て３７℃で２時間反応させた。これらを宝酒造社製ＤＮ
Ａライゲ−ションキットを用いて反応させ、常法に従っ
て枯草菌ＭＴ−２株に形質転換し、１％カゼイン、５μ
ｇ／ミリリットルのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に
塗布し、３７℃にて一夜培養し、ハロー形成コロニーを
単離することにより、組換体プラスミドｐＭＫ９（Ｙ１
１０Ｒ／Ｙ１５７Ｅ）を持った形質転換体を得た。

【００４１】実施例４ 反応緩衝液（４０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、
１０ｍＭ 塩化カルシウム）を９．６ミリリットル、基
質溶液（Ｌ−ペプチドの１ｍＭ溶液）を０．４ミリリッ
トル及び５μｇ／ミリリットルの濃度で精製酵素溶液４
０μリットルを混合し、室温で放置した。

【００４２】４０分ごとにサンプリングし、４０℃に保
温したＯＤＳ−８０ＴＭカラムを付したＨＰＬＣ８０１
０でペプチドを分離し、生成物のモル比を求めた。溶出
条件は０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ２．２）で、アセト
ニトリル１０−２５％の直線勾配を用いた。検出は２１
５ｎｍの吸光度を測定することにより行った。

【００４３】結果を図７〜図１０に示したが、元の野性
型プロテア−ゼであれば、図６で示した第２段階反応ま
で分解が進むのに対して、本発明の改良型プロテア−ゼ
のうち１置換体では第２段階反応が極めて遅く、２置換
体では第１段階で分解が止まる効果が生じた。

【００４４】

【発明の効果】本発明における変異体酵素は、基質特異
性をより厳密にした改良型サ−モリシン様金属プロテア
−ゼである。この基質特異性の上昇は、食品加工工程で
の苦みの低減や、酵素の自己分解速度の低減等の効果が
期待される。

【００４５】尚、本発明における配列表１は以下の様に
表現される。

【００４６】［配列表１］ 配列の長さ：３１６ トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源：バチルス属 Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu 20 25 30 Gln Asp Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys 35 40 45 Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn 50 55 60 Gln Phe Phe Ala Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr 65 70 75 Tyr Ala Gly Val Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg 80 85 90 Leu Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His 95 100 105 Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met 110 115 120 Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly 125 130 135 Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu Thr His Ala Val Thr Asp 140 145 150 Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu Ser Gly Ala Ile Asn 155 160 165 Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val Glu Phe Tyr Ala 170 175 180 Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val Tyr Thr Pro 185 190 195 Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Ala Lys 200 205 210 Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr Gln 215 220 225 Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala 230 235 240 Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val 245 250 255 Val Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala 260 265 270 Leu Thr Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg 275 280 285 Ala Ala Ala Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser 290 295 300 Gln Glu Val Ala Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val 305 310 315 Lys

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＭＫ１からプラスミドｐＵＣＴＺ
５５を構築する工程図である。

【図２】プラスミドｐＵＣＴＺ５５からＭ１３ファージ
Ｍ１３ＴＺＢａ−Ｓｐを構築する工程図である。

【図３】プラスミドｐＵＣＴＺ５５からＭ１３ファージ
Ｍ１３ＴＺＳｐ−Ｂｃを構築する工程図である。

【図４】プラスミドｐＭＫ１からプラスミドｐＭＫ８を
構築する工程図である。

【図５】プラスミドｐＭＫ８およびプラスミドｐＵＣＴ
Ｚ５５（ｍｕｔａｎｔ）からｐＭＫ９（ｍｕｔａｎｔ）
を構築する工程図である。

【図６】サ−モリシン様プロテア−ゼによるＬ−ペプチ
ドの消化パタ−ンを示している。

【図７】野性型サ−モリシン様金属プロテア−ゼにより
生じたＬ−ペプチド分解物の総量を経時的に表したグラ
フである。

【図８】Ｙ１１０Ｒにより生じたＬ−ペプチド分解物の
総量を経時的に表したグラフである。

【図９】Ｙ１５７Ｅにより生じたＬ−ペプチド分解物の
総量を経時的に表したグラフである。

【図１０】Ｙ１１０Ｒ／Ｙ１５７Ｅにより生じたＬ−ペ
プチド分解物の総量を経時的に表したグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三宅 俊男 神奈川県横浜市戸塚区戸塚町4501 (72)発明者 城所 俊一 神奈川県相模原市南台１−９−２ (72)発明者 三木 洋一郎 神奈川県相模原市西大沼４−４−１ (72)発明者 遠藤 きみ子 東京都町田市金森1733−10 (72)発明者 和田 昭允 東京都港区赤坂８−11−４

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表１のアミノ酸配列を有する耐熱性中
   性プロテアーゼにおいて、アミノ末端から１１０番目の
   チロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された新規なプ
   ロテアーゼ
2. 【請求項２】配列表１のアミノ酸配列を有する耐熱性中
   性プロテアーゼにおいて、アミノ末端から１５７番目の
   チロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された新規なプ
   ロテアーゼ
3. 【請求項３】配列表１のアミノ酸配列を有する耐熱性中
   性プロテアーゼにおいて、アミノ末端から１１０番目の
   チロシン残基及び１５７番目のチロシン残基が他のアミ
   ノ酸残基に置換された新規なプロテアーゼ
4. 【請求項４】請求項１に記載された他のアミノ酸残基が
   リジン又はアルギニンである新規なプロテアーゼ
5. 【請求項５】第２項に記載された他のアミノ酸残基がグ
   ルタミン酸である新規なプロテアーゼ
6. 【請求項６】第３項に記載された他のアミノ酸残基が１
   １０番目においてアルギニンであり１５７番目において
   グルタミン酸である新規なプロテアーゼ