CN110777016A - 具有脂肪酶变体的洗涤剂组合物 - Google Patents

具有脂肪酶变体的洗涤剂组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种获得洗涤剂组合物的方法，包括引入(a)一种母体脂肪酶的一种脂肪酶变体，该变体与SEQ ID NO:2具有至少60％序列一致性、在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的D254的一个位置处具有一个取代并且具有脂肪酶活性；和(b)一种阴离子表面活性剂，其中所述组合物与包含该母体脂肪酶的一种相对应的组合物相比具有增加的稳定性。

Description

具有脂肪酶变体的洗涤剂组合物
本申请是申请日为2012年12月20日，申请号201280064779.2，发明名称为“具有脂肪酶变体的洗涤剂组合物”的中国发明专利申请的分案申请。
序列表的引用
本申请含有一个呈计算机可读形式的序列表，它通过引用结合在此。
技术领域
本发明涉及洗涤剂组合物和获得其的方法。
背景技术
持续研发洗涤剂组合物以优化并改进其清洁效率。它们基于不同成分的一种复杂混合物，在这些成分之中涵盖表面活性剂和酶。然而，脂肪酶在阴离子表面活性剂的存在下通常不稳定，从而影响组合物的稳定性。因此将希望获得包含阴离子表面活性剂以及脂肪酶两者的具有改进的稳定性的洗涤剂组合物。
WO 92/05249涉及具有改进的性质的疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)的脂肪酶变体。尽管该文献描述到变体可以在氨基酸位置D254处包括一个取代，但未显示也未表明这一具体位置对于获得可以用于提供包含阴离子表面活性剂的稳定化的洗涤剂组合物的一种稳定变体来说是重要的。
发明内容
本发明涉及一种获得洗涤剂组合物的方法，包括引入(a)一种母体脂肪酶的一种脂肪酶变体，该变体与SEQ ID NO:2具有至少60％序列一致性、在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的D254的一个位置处具有一个取代并且具有脂肪酶活性；和(b)一种阴离子表面活性剂，其中所述组合物与包含该母体脂肪酶的一种相对应的组合物相比具有增加的稳定性。
本发明提供以下内容：
1.一种获得洗涤剂组合物的方法，包括引入(a)一种母体脂肪酶的一种脂肪酶变体，该变体与SEQ ID NO:2具有至少60％序列一致性、在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的D254的一个位置处具有一个取代并且具有脂肪酶活性；和(b)一种阴离子表面活性剂，其中所述组合物与包含该母体脂肪酶的一种相对应的组合物相比具有增加的稳定性。
2.如项1所述的方法，其中对应于SEQ ID NO:2的该成熟多肽的D254 的该位置处的该氨基酸取代是S、T、N、Y、H、L或Q。
3.如项1或2所述的方法，其中该至少一种阴离子表面活性剂是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基烷烃磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、烯属烃磺酸盐、烷烃-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基烷烃磺酸盐和二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES 或AEOS或FES，也称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲烷烃磺酸盐 (SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化脂肪酸甘油酯、α-磺基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基或烯基琥珀酸、十二碳烯基/十四碳烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺基-琥珀酸的二酯和单酯、皂或其任何组合。
4.如项1到3中任一项所述的方法，其中该脂肪酶变体选自下组，该组由以下各项组成：
a.与SEQ ID NO:2的该成熟多肽具有至少60％序列一致性的一种多肽；
b.由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严谨度条件下与(i) SEQ IDNO:1的该成熟多肽编码序列、(ii)(i)的全长互补体杂交；
c.由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的该成熟多肽编码序列具有至少60％一致性；以及
d.SEQ ID NO:2的该成熟多肽的一个片段，该片段具有脂肪酶活性。
5.如项1到4中任一项所述的方法，其中该脂肪酶变体与SEQ ID NO:2 的该成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少 96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％序列一致性。
6.如项1到5中任一项所述的方法，其中该脂肪酶变体由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件或非常高严谨度条件下与(i)SEQID NO:1的该成熟多肽编码序列或(ii)(i)的该全长互补体杂交。
7.如项1到6中任一项所述的方法，其中取代的数目是1-20个，例如 1-10个和1-5个，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、 10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或 20个取代。
8.如项1到7中任一项所述的方法，该方法进一步包括在对应于SEQ ID NO:2的该成熟多肽的位置N33Q、T231R和/或N233R的一个或多个位置处的一个取代。
9.如项1到8中任一项所述的方法，其中该脂肪酶变体包括或含有选自以下各项的取代：
a.T231R+D254S
b.N233R+D254S
c.T231R+N233R+D254S
d.N33Q+D254S
e.N33Q+T231R+D254S
f.N33Q+N233R+D254S
g.N33Q+T231R+N233R+D254S
h.T231R+D254T
i.N233R+D254T
j.T231R+N233R+D254T
k.N33Q+D254T
l.N33Q+T231R+D254T
m.N33Q+N233R+D254T
n.N33Q+T231R+N233R+D254T
o.T231R+D254N
p.N233R+D254N
q.T231R+N233R+D254N
r.N33Q+D254N
s.N33Q+T231R+D254N
t.N33Q+N233R+D254N
u.N33Q+T231R+N233R+D254N
v.T231R+D254Y
w.N233R+D254Y
x.T231R+N233R+D254Y
y.N33Q+D254Y
z.N33Q+T231R+D254Y
aa.N33Q+N233R+D254Y
bb.N33Q+T231R+N233R+D254Y
cc.T231R+D254H
dd.N233R+D254H
ee.T231R+N233R+D254H
ff.N33Q+D254H
gg.N33Q+T231R+D254H
hh.N33Q+N233R+D254H
ii.N33Q+T231R+N233R+D254H
jj.T231R+D254L
kk.N233R+D254L
ll.T231R+N233R+D254L
mm.N33Q+D254L
nn.N33Q+T231R+D254L
oo.N33Q+N233R+D254L
pp.N33Q+T231R+N233R+D254L
qq.T231R+D254Q
rr.N233R+D254Q
ss.T231R+N233R+D254Q
tt.N33Q+D254Q
uu.N33Q+T231R+D254Q
vv.N33Q+N233R+D254Q
ww.N33Q+T231R+N233R+D254Q。
10.如以上项中任一项所述的方法，其中该母体脂肪酶包括SEQ ID NO: 2的该成熟多肽或由其组成。
11.如以上项中任一项所述的方法，其中该组合物进一步包含CaCl2。
12.一种洗涤剂组合物，通过如项1到11中任一项所述的方法而获得。
13.一种清洁的方法，包括将如项12所述的洗涤剂组合物分配到待清洁的一个物体的一个步骤。
定义
脂肪酶：术语“脂肪酶”或“脂解酶”或“脂质酯酶”是如酶命名法所定义的EC 3.1,1类中的一种酶。它可以具有脂肪酶活性(三酰基甘油脂肪酶， EC 3.1.1.3)、角质酶活性(EC3.1.1.74)、固醇酯酶活性(EC 3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(EC 3.1.1.50)。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序测定脂肪酶活性。在一个方面，本发明的变体具有SEQ IDNO:2的成熟多肽的脂肪酶活性的至少20％、例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少 75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异通过突变天然地出现，并且可以在群体内产生多态现象。基因突变可以沉默的(在所编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。一种多肽的一种等位基因变体是由一种基因的一种等位基因变体编码的一种多肽。
cDNA：术语“cDNA”意指一种DNA分子，该分子可以通过由获自一种真核或原核细胞的一种成熟拼接的mRNA分子反转录而制备。cDNA缺乏内含子序列，这些序列可能存在于相对应的基因组DNA中。初始初级RNA 转录物是mRNA的一种前体，该前体通过一系列步骤(包括拼接)进行加工，随后呈现为成熟拼接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指一种多核苷酸，该多核苷酸直接规定了一种变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、 cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指为编码本发明的一种变体的一种多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个控制序列对于编码变体的多核苷酸可以是天然的(即来自同一基因)或外来的(即来自一种不同基因)或对于彼此是天然的或外来的。这样的控制序列包括(但不限于)一个前导区、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子。控制序列至少包括一个启动子以及转录和翻译终止信号。控制序列可以具备连接子用于引入促进控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区的连接的特异性限制位点的目的。
表达：术语“表达”包括涉及一种变体的制造的任何步骤，包括(但不限于)转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种变体的一种多核苷酸并且可操作地连接于提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指在一种成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在一个或多个(例如若干个)氨基酸的一种多肽；其中该片段具有脂肪酶活性。在一个方面，一个片段含有成熟多肽的氨基酸数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少 90％以及至少95％。
高严谨度条件：术语“高严谨度条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5×SSPE、0.3％SDS、 200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及50％甲酰胺中预杂交和杂交 12到24小时。最终在65℃下将载体材料使用2×SSC、0.2％SDS洗涤三次各15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易与包括本发明的一种多核苷酸的一种核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖了一种母体细胞的任何子代，该子代由于在复制期间发生的突变而与母体细胞不相同。
改进的性质：术语“改进的性质”意指与母体相比得到改进的与一种变体相关的一种特征。这样的改进的性质包括(但不限于)化学稳定性、氧化稳定性、pH稳定性、储存条件下的稳定性、对表面活性剂和表面活性剂胶束的稳定性以及热稳定性。
分离的：术语“分离的”意指在自然界中不存在的一种形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分从一种或多种或全部天然存在的成分移出的任何物质(性质上与这些成分相关)，包括(但不限于)任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于见于自然界中的那个物质由人修饰的任何物质；或(4)通过增加物质相对于其他组分(与这些组分天然地相关)的量修饰的任何物质(例如编码该物质的一种基因的多个复本；使用一个比与编码该物质的基因天然地相关的启动子更强的启动子)。一种分离的物质可以存在于一种发酵液样品中。
低严谨度条件：术语“低严谨度条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5×SSPE、0.3％SDS、 200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及25％甲酰胺中预杂交和杂交 12到24小时。最终在50℃下将载体材料使用2×SSC、0.2％SDS洗涤三次各15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(如N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等)之后呈其最终形式的一种多肽。在一个方面，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1到269。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有脂肪酶活性的一种成熟多肽的一种多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸67到873。
中严谨度条件：术语“中严谨度条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5×SSPE、0.3％SDS、 200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交 12到24小时。最终在55℃下将载体材料使用2×SSC、0.2％SDS洗涤三次各15分钟。
中-高严谨度条件：术语“中-高严谨度条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5×SSPE、0.3％SDS、 200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及或者35％甲酰胺中预杂交和杂交12到24小时。最终在60℃下将载体材料使用2×SSC、0.2％SDS洗涤三次各15分钟。
突变体：术语“突变体”意指编码一种变体的一种多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指一种或者单链或者双链的核酸分子，该核酸分子由一种天然存在的基因分离或被修饰以按否则将不存在于自然界中的方式含有核酸区段或是合成的，它包括一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指一种配置，其中一个控制序列相对于一种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指引编码序列的表达。
母体或母体脂肪酶：术语“母体”或“母体脂肪酶”意指一种脂肪酶，对该脂肪酶进行一个取代以制造本发明的酶变体。母体可以是一种天然存在的(野生型)多肽或一种其变体或片段。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。
出于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的序列一致性使用尼德曼-王氏算法(Needleman-Wunsch algorithm)(尼德曼(Needleman)和王氏(Wunsch)， 1970，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)48:443-453)测定，如EMBOSS套装(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包，赖斯(Rice)等人，2000，《遗传学趋势》(Trends Genet.)16:276-277)(优选地5.0.0版或更新版)的尼德尔(Needle)程序中实施。所用的参数是空隙开口罚分10、空隙扩展罚分0.5 以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长一致性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为一致性百分比并且如下计算：
(一致残基×100)/(比对的长度-比对中的空隙的总数)
出于本发明的目的，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性使用尼德曼-王氏算法(尼德曼和王氏，1970，同前文献)测定，如EMBOSS套装 (EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包，赖斯等人，2000，同前文献)(优选地5.0.0版或更新版)的尼德尔程序中实施。所用的参数是空隙开口罚分 10、空隙扩展罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本) 取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长一致性”的输出(使用-nobrief选项获得) 作为一致性百分比并且如下计算：
(一致脱氧核糖核苷酸×100)/(比对的长度-比对中的空隙的总数)
子序列：术语“子序列”意指在一种成熟多肽编码序列的5'和/或3'末端不存在一个或多个(例如若干个)核苷酸的一种多核苷酸；其中该子序列编码具有脂肪酶活性的一个片段。在一个方面，一个子序列含有编码成熟多肽的核苷酸的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％以及至少95％。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如若干个)位置处包括一个取代的具有脂肪酶活性的一种多肽。一个取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸。本发明的变体具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的脂肪酶活性的至少20％、例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。
非常高严谨度条件：术语“非常高严谨度条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及50％甲酰胺中预杂交和杂交12到24小时。最终在70℃下将载体材料使用2X SSC、0.2％SDS洗涤三次各15分钟。
非常低严谨度条件：术语“非常低严谨度条件”意指对于至少100个核苷酸长度的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及25％甲酰胺中预杂交和杂交12到24小时。最终在45℃下将载体材料使用2X SSC、0.2％SDS洗涤三次各15分钟。
野生型脂肪酶：术语“野生型”脂肪酶意指由见于自然界中的一种天然存在的微生物(如一种细菌、酵母或丝状真菌)表达的一种脂肪酶。
用于变体的命名的公约
出于本发明的目的，将SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽用以测定另一种脂肪酶中的相对应的氨基酸残基。将另一种脂肪酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽比对，并且基于比对，将对应于SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置数目使用尼德曼-王氏算法 (尼德曼和王氏，1970，《分子生物学杂志》48:443-453)测定，如EMBOSS 套装(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包，赖斯等人，2000，《遗传学趋势》16:276-277)(优选地5.0.0版或更新版)的尼德尔程序中实施。所用的参数是空隙开口罚分10、空隙扩展罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62 的EMBOSS版本)取代矩阵。
另一种脂肪酶中的相对应的氨基酸残基的鉴别可以通过多个多肽序列使用若干种计算机程序使用其对应的缺省参数的一个比对来测定，这些计算机程序包括(但不限于)MUSCLE(通过对数-期望的多序列比较；3.5版或更新版；埃德加(Edgar)，2004，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)32:1792-1797)、MAFFT(6.857版或更新版；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，《核酸研究》30:3059-3066；加藤等人，2005，《核酸研究》33:511-518；加藤和都(Toh)， 2007，《生物信息学》(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)537:39-64；加藤和都，2010，《生物信息学》26:1899-1900)以及使用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更新；汤普森(Thompson)等人，1994，《核酸研究》22:4673-4680)。
当另一种酶已经与SEQ ID NO:2的成熟多肽不同以使得传统基于序列的比较不能检测其关系(林达尔(Lindahl)和埃洛夫松(Elofsson)，2000，《分子生物学杂志》295:613-615)时，可以使用其他成对序列比较算法。可以使用利用多肽家族的可能代表(轮廓)的搜寻程序搜寻数据库来获得基于序列的搜寻的更大灵敏度。举例来说，PSI-BLAST程序通过一种迭代数据库搜寻过程产生轮廓并且能够检测远的同源物(阿特科尔(Atschul)等人，1997，《核酸研究》25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表，那么可以达到甚至更大灵敏度。如GenTHREADER (琼斯(Jones)，1999，《分子生物学杂志》287:797-815；麦古芬(McGuffin) 和琼斯，2003，《生物信息学》19:874-881)的程序利用来自多个来源 (PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对轮廓以及溶合可能性)的信息作为一个神经网络的输入，该神经网络预测一个查询序列的结构折叠。类似地，高夫(Gough)等人，2000，《分子生物学杂志》313:903-919的方法可以用以将具有未知结构的一个序列与SCOP数据库中存在的超家族模型比对。这些比对又可以用以产生多肽的同源性模型，并且可以使用多种研发用于那个目的的工具评估这样的模型的准确性。
对于具有已知结构的蛋白质来说，若干种工具和资源可用于检索和产生结构比对。举例来说，已经结构上比对蛋白质的SCOP超家族，并且那些比对是可存取并且可下载的。可以使用多种算法比对两个或更多个蛋白质结构，这些算法如距离比对矩阵(霍尔姆(Holm)和桑德尔(Sander)，1998，《蛋白质》(Proteins)33:88-96)或组合延伸(欣达洛夫(Shindyalov)和伯恩 (Bourne)，1998，《蛋白质工程》(Protein Engineering)11:739-747)，并且这些算法的实现可以另外用以查询具有一个所关注结构的结构数据库以便发现可能的结构同源物(例如霍尔姆(Holm)和帕克(Park)，2000，《生物信息学》16:566-567)。
在描述本发明的变体时，下文描述的命名法适于提及的便利性。使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于一个氨基酸取代来说，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，苏氨酸在位置226处经丙氨酸的取代命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变由加号标记(“+”)分隔，例如“Gly205Arg +Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表对应地在位置205和411处甘氨酸(G) 经精氨酸(R)和丝氨酸(S)经苯丙氨酸(F)的取代。
多个取代。包括多个取代的变体由加号标记(“+”)分隔，例如“Arg170Tyr +Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表精氨酸和甘氨酸对应地在位置170 和195处经酪氨酸和谷氨酸的一个取代。
不同取代。在可以在一个位置处引入不同取代时，不同取代由一个逗点分隔，例如“Arg170Tyr,Glu”代表精氨酸在位置170处经酪氨酸或谷氨酸的一个取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”命名了以下变体：“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+ Arg170Gly”以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
具体实施方式
本发明涉及与SEQ ID NO:2具有至少60％序列一致性的衍生自一种母体脂肪酶的一种脂肪酶变体的用途，该变体具有脂肪酶活性并且与该母体脂肪酶相比在对应于SEQ IDNO:2的成熟多肽的D254的一个位置处包括一个取代，该脂肪酶变体用于获得一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含至少一种阴离子表面活性剂，该组合物与包含该母体脂肪酶的一种相对应的组合物相比更稳定。
本发明此外提供了洗涤剂组合物和获得其的方法。
变体
在一个实施例中，该变体是与SEQ ID NO:2具有至少60％序列一致性的衍生自一种母体脂肪酶的一种脂肪酶变体，该变体具有脂肪酶活性，并且与该母体脂肪酶相比在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的D254的一个位置处包括一个取代，并且在阴离子表面活性剂存在下与该母体脂肪酶相比更稳定。
在一个实施例中，该变体与该母体脂肪酶的氨基酸序列具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、如至少96％、至少 97％、至少98％或至少99％但小于100％序列一致性。
在一个方面，本发明的变体中的取代的数目是1-20个，例如1-10个和1-5 个，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、 12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个取代。
在另一个方面，一种变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的254位置处包括一个取代。在另一个方面，一种变体在对应于位置254和位置33、231 以及233中的任一者的两个位置处包括一个取代。在另一个方面，一种变体在对应于位置254和位置33、231以及233中的任一者的三个位置处包括一个取代。在另一个方面，一种变体在对应于位置22、231、233以及254的每个位置处包括一个取代。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置254的一个位置处的一个取代或由其组成。在另一个方面，对应于位置254的一个位置处的氨基酸被Ala、 Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、 Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2 的成熟多肽的取代D254S、T、N、Y、H、L、Q或由其组成。
在另一个方面，该变体进一步包括在对应于位置33的一个位置处的一个取代或由其组成。在另一个方面，对应于位置33的一个位置处的氨基酸被 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、 Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO: 2的成熟多肽的取代N33Q。
在另一个方面，该变体进一步包括在对应于位置231的一个位置处的一个取代或由其组成。在另一个方面，对应于位置231的一个位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、 Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代T231R。
在另一个方面，该变体进一步包括在对应于位置233的一个位置处的一个取代或由其组成。在另一个方面，对应于位置233的一个位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、 Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N233R。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置D254S、T、N、Y、H、L、Q 和N33Q的位置处的取代(如上述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置D254S、T、N、Y、H、L、Q 和T231R的位置处的取代(如上述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置D254S、T、N、Y、H、L、Q 和N233R的位置处的取代(如上述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置D254S、T、N、Y、H、L、Q、 N33Q以及T231R的位置处的取代(如上述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置D254S、T、N、Y、H、L、Q、 N33Q以及N233R的位置处的取代(如上述的那些)或由其组成。
在另一个方面，该变体包括在对应于位置D254S、T、N、Y、H、L、Q、N33Q、T231R以及N233R的位置处的取代(如上述的那些)或由其组成。
这些变体可以在一个或多个(例如若干个)其他位置处进一步包括一个或多个另外的取代。
在另一个方面，该变体包括或含有选自以下各项的取代：T231R+D254S、 N233R+D254S、T231R+N233R+D254S、N33Q+D254S、N33Q+T231R+ D254S、N33Q+N233R+D254S、N33Q+T231R+N233R+D254S、T231R+ D254T、N233R+D254T、T231R+N233R+D254T、N33Q+D254T、N33Q+T231R+D254T、N33Q+N233R+D254T、N33Q+T231R+N233R+D254T、 T231R+D254N、N233R+D254N、T231R+N233R+D254N、N33Q+D254N、 N33Q+T231R+D254N、N33Q+N233R+D254N、N33Q+T231R+N233R+ D254N、T231R+D254Y、N233R+D254Y、T231R+N233R+D254Y、N33Q +D254Y、N33Q+T231R+D254Y、N33Q+N233R+D254Y、N33Q+T231R +N233R+D254Y、T231R+D254H、N233R+D254H、T231R+N233R+ D254H、N33Q+D254H、N33Q+T231R+D254H、N33Q+N233R+D254H、 N33Q+T231R+N233R+D254H、T231R+D254L、N233R+D254L、T231R +N233R+D254L、N33Q+D254L、N33Q+T231R+D254L、N33Q+N233R +D254L、N33Q+T231R+N233R+D254L、T231R+D254Q、N233R+ D254Q、T231R+N233R+D254Q、N33Q+D254Q、N33Q+T231R+D254Q、 N33Q+N233R+D254Q或N33Q+T231R+N233R+D254Q。
氨基酸改变可以具有一种微量性质，就是说，不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小氨基或羧基末端延伸，如一个氨基末端甲硫氨酸残基；一种至多20-25个残基的小连接肽；或通过改变净电荷或另一种功能(如一种多组氨酸序列、一种抗原表位或一种结合域)促进纯化的一种小延伸。
保守取代的实例在下组内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸以及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸以及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代在本领域中已知，并且由例如H. 诺伊拉特(H.Neurath)和R.L.希尔(R.L.Hill)，1979《蛋白质》(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约(New York)描述。常见取代是Ala/Ser、 Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、 Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu以及Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有使得多肽的物理化学性质改变的一种性质。举例来说，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变pH 最佳值等。
一种多肽中的必需氨基酸可以根据本领域中已知的程序鉴别，这些程序如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁安(Cunningham)和威尔斯(Wells)， 1989，《科学》(Science)244:1081-1085)。在后种技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的脂肪酶活性以鉴别对分子的活性关键的氨基酸残基。还参看希尔顿(Hilton)等人，1996，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。酶的活性位点或其他生物学相互作用还可以通过结构的物理分析(如通过如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和性标记的技术测定)与推定接触位点氨基酸的突变结合测定。参看例如德沃斯(de Vos)等人，1992，《科学》255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，《分子生物学杂志》224:899-904；沃洛达维尔(Wlodaver)等人， 1992，《欧洲生物化学学会联盟通讯》(FEBS Lett.)309:59-64。必需氨基酸的一致性还可以由与一种相关多肽的一个比对推断。
变体可以由150到450个氨基酸、例如200到400个、250到350个以及约300个氨基酸组成。
在一个实施例中，变体与母体酶相比具有改进的化学稳定性。
在一个实施例中，变体与母体酶相比具有改进的氧化稳定性。
在一个实施例中，变体与母体酶相比具有改进的pH稳定性。
在一个实施例中，变体与母体酶相比具有改进的储存条件下稳定性。
在一个实施例中，变体与母体酶相比具有改进的对表面活性剂的稳定性。
在一个实施例中，变体与母体酶相比具有改进的底物稳定性。
在一个实施例中，变体与母体酶相比具有改进的热稳定性。
母体脂肪酶
母体脂肪酶可以是(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性的一种多肽；(b)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严谨度条件下与(i)SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补体杂交；或(c)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1 的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性。
在一个方面，母体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、例如至少 65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或100％的一种序列一致性，它们具有脂肪酶活性。在一个方面，母体的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不超过10个、例如1 个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸。
在另一个方面，母体包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，母体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一个方面，母体包括SEQ ID NO:2的氨基酸1到269或由其组成。
在另一个方面，母体是含有SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少 80％、至少85％、至少90％或至少95％的一个片段。
在另一个实施例中，母体是SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种等位基因变体。
在另一个方面，母体由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或(ii)(i)或(ii) 的全长互补体杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，《分子克隆，实验手册》(Molecular Cloning,A LaboratoryManual)，第2版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。
SEQ ID NO:1的多核苷酸或一种其子序列以及SEQ ID NO:2的多肽或一个其片段可以用以设计核酸探针以根据本领域中熟知的方法从不同属或物种的品系鉴别和克隆编码一种母体的DNA。具体地说，这样的探针可以用于与一种所关注细胞的基因组DNA或cDNA杂交，接着进行标准DNA印迹程序，以便在其中鉴别和分离相对应的基因。这样的探针可以比整个序列显著更短，但应该具有至少15个、例如至少25个、至少35个或至少70个核苷酸长度。优选地，核酸探针具有至少100个核苷酸长度，例如至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或至少900个核苷酸长度。可以使用DNA和RNA探针两者。探针典型地被标记用于检测相对应的基因(例如被32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白标记)。这样的探针由本发明涵盖。
由这样的其他品系制备的一种基因组DNA或cDNA库可以被筛选用于与上述探针杂交并且编码一种母体的DNA。来自这样的其他品系的基因组或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术分离。来自库的DNA或被分离的DNA可以转移到并且固定在硝化纤维素或其他适合载体材料上。为了鉴别与SEQ ID NO:1或一种其子序列杂交的一种无性系或 DNA，将载体材料用于DNA印迹中。
出于本发明的目的，杂交表明，多核苷酸在极低等到非常高严谨度条件下与一种被标记的核酸探针杂交，该探针对应于(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)一种其子序列。核酸探针在这些条件下杂交的分子可以使用例如X射线胶片或本领域中已知的任何其他检测手段检测。
在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸67到873。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽的一种多核苷酸；其成熟多肽；或一个其片段。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1。
在另一个实施例中，母体由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少 94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的一个序列一致性。
多肽可以是一种杂交体多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N末端或C末端处融合。
母体可以是一种融合多肽或可裂解融合多肽，其中另一种多肽在本发明的多肽的N末端或C末端处融合。一种融合多肽通过使编码另一种多肽的一种多核苷酸与本发明的一种多核苷酸融合而制造。用于制造融合多肽的技术在本领域中已知，并且包括连接编码多肽的编码序列，以使得它们在框架中并且融合多肽的表达在相同启动子(多个)和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽(intein)技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库柏 (Cooper)等人，1993，《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，《科学》266:776-779)。
一种融合多肽可以进一步包括两种多肽之间的一个裂解位点。在分泌融合蛋白后，使位点裂解，释放两种多肽。裂解位点的实例包括(但不限于) 以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，《工业微生物学与生物技术杂志》(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina) 等人，2000，《生物技术杂志》(J.Biotechnol.)76:245-251；罗斯苗逊-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，《应用与环境微生物学》(Appl.Environ. Microbiol.)63:3488-3493；华德(Ward)等人，1995，《生物技术》 (Biotechnology)13:498-503；以及孔特勒拉(Contreras)等人，1991，《生物技术》9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，《生物化学》(Biochemistry) 25:505-512；柯林斯-拉奇(Collins-Racie)等人，1995，《生物技术》13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，《蛋白质：结构、功能以及遗传学》(Proteins:Structure, Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，《药物发现世界》(Drug Discovery World)4:35-48。
母体可以获自任何属的微生物。出于本发明的目的，如在此结合一个既定来源所用，术语“获自”意指，由一种多核苷酸编码的母体通过该来源或通过来自该来源的多核苷酸已经被插入的一种品系制造。在一个方面，母体在胞外分泌。
母体可以是一种细菌脂肪酶。举例来说，母体可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如一种芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属 (Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属 (Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)或链霉菌属(Streptomyces) 脂肪酶；或一种革兰氏阴性细菌多肽，如一种曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺旋杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或尿素原体(Ureaplasma)脂肪酶。
在一个方面，母体是一种嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌 (Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)脂肪酶。
在另一个方面，母体是一种类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽疫(Streptococcus equi Zooepidemicus)亚种脂肪酶。
在另一个方面，母体是一种不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、阿佛曼链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或青紫链霉菌(Streptomyces lividans)脂肪酶。
母体可以是一种真菌脂肪酶。举例来说，母体可以是一种酵母脂肪酶，如一种假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属 (Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)脂肪酶；或一种丝状真菌脂肪酶，如一种枝顶孢霉属 (Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、家白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小球腔菌属(Leptospaeria)、稻瘟菌属(Magnaporthe)、马兰诺菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属 (Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉属 (Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱霉属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳菌属(Thielavia)、弯颈霉菌(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)脂肪酶。
在另一个方面，母体是一种卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)脂肪酶。
在另一个方面，母体是一种解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉 (Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、因奥普斯金孢子菌属(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌 (Chrysosporium lucknowense)、莫达瑞姆金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带多金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢菌(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢菌(Fusarium cerealis)、库威镰孢菌(Fusarium crookwellense)、黄色镰孢菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢菌(Fusarium graminum)、异孢镰孢菌(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢菌(Fusarium negundi)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢菌(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢菌(Fusariumroseum)、接骨木镰孢菌(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢菌(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢菌 (Fusarium sulphureum)、圆镰孢菌(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢菌 (Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusarium venenatum)、灰腐质霉 (Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳菌(Thielaviaachromatica)、阿波梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳菌(Thielaviaalbopilosa)、澳洲梭孢壳菌(Thielavia australeinsis)、菲美蒂梭孢壳菌(Thielaviafimeti)、小孢梭孢壳菌(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳菌(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳菌(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳菌(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳菌(Thielavia spededonium)、亚嗜热梭孢壳菌(Thielavia subthermophila)、太瑞斯梭孢壳菌(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)脂肪酶。
在另一个方面，母体是一种柔毛腐质霉(Humicola lanuginose)脂肪酶，例如SEQID NO:2的脂肪酶或其成熟多肽。
应理解，对于前述物种来说，本发明涵盖了完美和不完美的状态两者以及其他分类等效物(例如无性型)，与它们所已知的物种名称无关。本领域的普通技术人员将容易识别适当等效物的身份。
这些物种的品系容易由公众在许多培养物保藏所获得，如美国典型培养物保藏所(ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏有限公司(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(CBS)以及农业研究服务专利培养物保藏北方区域研究中心 (NRRL)。
母体可以使用上述探针从其他来源鉴别和获得，这些来源包括从自然(例如土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接获自天然材料(例如土壤、堆肥、水等)的DNA样品。用于从天然生境直接分离微生物和DNA的技术在本领域中是熟知的。编码一种母体的一种多核苷酸然后可以通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的一种基因组DNA或cDNA库而获得。在已经用探针(多种)检测了编码一种母体的一种多核苷酸后，可以将多核苷酸通过利用本领域普通技术人员已知的技术来分离或克隆(参看例如萨姆布鲁克等人，1989，同前文献)。
组合物
在一个实施例中，本发明针对洗涤剂组合物，包含脂肪酶变体与一种或多种另外的清洁组合物组分组合。另外的组分的选择在业内人士的技术之内，并且包括常规成分，包括下文阐述的示例性非限制性组分。
对于洗衣应用来说，组分的选择可以包括以下考虑因素：待清洁的纺织品的类型、污垢的类型和/或程度、进行清洁所处的温度以及洗涤剂产品的配方。虽然下文提及的组分根据一种具体功能由一般标头分类，但这不应理解为一个限制，因为如熟练的业内人士应了解，一种组分可以包括另外的功能。
酶
在本发明的一个实施例中，脂肪酶变体可以按对应于0.001-100mg蛋白质/升洗液、如0.01-100mg、0.005-50mg、0.01-25mg、0.05-10mg、0.05-5mg 或0.01-1mg蛋白质/升洗液的一个量添加到一种洗涤剂组合物。同样，脂肪酶变体可以按对应于0.001-1000mg蛋白质/g洗涤剂、如0.01-1000mg、 0.005-500mg、0.01-250mg、0.05-100mg、0.05-50mg、0.01-10mg或0.02-2mg 蛋白质/g洗涤剂的一个量添加到一种洗涤剂组合物。
洗涤剂组合物可以进一步包含一种或多种另外的酶，如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如一种虫漆酶)和/或过氧化酶。
一般来说，包含的所有酶(多种)(即脂肪酶变体(多种)以及另外的酶两者)的性质应该与所选的洗涤剂相容(即pH最佳、与其他酶和非酶成分相容等)，并且酶(多种)应该以有效量存在。在本发明的一个实施例中，酶 (多种)可以按对应于0.001-100mg蛋白质/升洗液、如0.01-100mg、0.005-50 mg、0.01-25mg、0.05-10mg、0.05-5mg或0.01-1mg蛋白质/升洗液的一个量添加到一种洗涤剂组合物。同样，酶(多种)可以按对应于0.001-1000mg 蛋白质/g洗涤剂、如0.01-1000mg、0.005-500mg、0.01-250mg、0.05-100mg、 0.05-50mg、0.01-10mg或0.02-2mg蛋白质/g洗涤剂的一个量添加到一种洗涤剂组合物。
酶(多种)可以使用常规稳定剂来稳定化，这些稳定剂例如一种多元醇，如丙二醇(1,2-丙二醇)、甘油、山梨糖醇、己二醇；一种糖或糖醇；乳酸；硼酸，或一种硼酸衍生物，例如一种芳香族硼酸酯，或一种苯基硼酸衍生物，如4-甲酰基苯基硼酸；或一种肽醛，优选地一种三或四肽醛，可能呈其次硫酸盐加合物形式，并且组合物可以如例如WO 92/19709和WO92/19708中所述来配制。
纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自以下属的纤维素酶：芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢菌属、梭孢壳菌属、枝顶孢属，例如US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中披露的从特异腐质霉、嗜热毁丝霉以及尖孢镰孢菌产生的真菌纤维素酶。
尤其适合的纤维素酶是具有色彩护理效益的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的实例是EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397、 WO 98/08940中所述的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，如WO 94/07998、 EP 0531315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中所述的那些。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM烯醇酶；Celluclean(诺维信有限公司(Novozymes A/S))、ClazinaseTM和Puradax HATM(杰能科国际公司(GenencorInternational Inc.))以及KAC-500(B)TM(花王公司(Kao Corporation))。
蛋白酶：适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选微生物来源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。蛋白酶可以是一种丝氨酸蛋白酶或一种金属蛋白酶，优选地一种碱性微生物蛋白酶或一种胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，尤其衍生自芽孢杆菌属的那些，例如诺沃枯草杆菌蛋白酶、卡尔斯贝尔格枯草杆菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(WO 89/06279中所述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是WO 89/06270和WO 94/25583中所述的胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢菌属蛋白酶。
有用的蛋白酶的实例是WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116以及 WO 98/34946中所述的变体，尤其在以下位置中的一者或多者具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、 218、222、224、235以及274。
优选的可商购的蛋白酶包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、 DuralaseTM、EsperaseTM、KannaseTMLiquanaseTM、EverlaseTM、DurazymTM、 OvozymeTM、CoronaseTM、RelaseTM、PolarzymeTM、Blaze TM、中性蛋白酶 (诺维信有限公司)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、 PurafectTM、Purafect OxPTM、OpticleanTM、Purafect OxTM、Purafact PrimeTM、 ExcellaseTMFN2TM以及FN3TMFN4TM(杰能科国际公司)。其他实例是可获自汉高(Henkel)的PrimaseTM和DuralaseTM.Blap R、Blap S以及BlapX。
脂肪酶和角质酶：适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变酶。实例包括来自嗜热丝孢菌属 (Thermomyces)、例如来自疏绵状嗜热丝孢菌(先前称为柔毛腐质霉)的脂肪酶，如EP 258068和EP 305216中所述；来自腐质霉属、例如特异腐质霉的角质酶(WO 96/13580)；来自假单胞菌属品系(其中的一些现改名为伯克霍尔德菌属(Burkholderia))(例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、假单胞菌种品系SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康里假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012))的脂肪酶；GDSL型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的角质酶(WO 10/107560)；来自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶(US 5389536)；来自褐色喜热裂孢菌(Thermobifidafusca)的脂肪酶(WO 11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)脂肪酶(WO 11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO 11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)(WO12/137147) 的脂肪酶。
其他实例是脂肪酶变体，如EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、 WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、 WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、 WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中所述的那些。
优选的商业脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM、LipolexTM和LipocleanTM (诺维信有限公司)、Lumafast(最初来自杰能科)和Lipomax(最初来自吉斯特-布罗卡特斯(Gist-Brocades))。
再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。
淀粉酶：适合的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如获自芽孢杆菌属(例如地衣芽孢杆菌的一个特殊品系)的α-淀粉酶，更详细描述于GB 1,296,839中。
有用淀粉酶的实例是WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873以及 WO 97/43424中所述的变体，尤其是在以下位置中的一者或多者具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、 202、208、209、243、264、304、305、391、408以及444。
可商购的淀粉酶是Stainzyme；Stainzyme Plus；DuramylTM、TermamylTM、Termamyl Ultra；Natalase、FungamylTM以及BANTM(诺维信有限公司)、 RapidaseTM和PurastarTM(来自杰能科国际公司)。
过氧化酶/氧化酶：适合的过氧化酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用过氧化酶的实例包括来自鬼伞属、例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化酶和其变体，如WO 93/24618、WO 95/10602以及WO 98/15257中所述的那些。
可商购的过氧化酶包括GuardzymeTM(诺维信有限公司)。
洗涤剂酶(多种)可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加剂或通过添加包含全部这些酶的一种组合添加剂而包括于一种洗涤剂组合物中。本发明的一种洗涤剂添加剂(即一种单独添加剂或一种组合添加剂)可以例如以一种颗粒、一种液体、一种浆液等形式配制。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或浆液。
无粉尘颗粒可以例如如US 4,106,991和US 4,661,452中所披露来制造，并且可以任选地通过本领域中已知的方法来涂布。蜡状涂布材料的实例是具有1000到20000的平均摩尔量的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有从16到50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；其中醇含有从12到20个碳原子并且其中存在15到80个环氧乙烷单元的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯以及甘油三酯。适用于通过流化床技术涂覆的成膜涂布材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过添加以下各项根据确定的方法来稳定化：一种多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇；一种糖或糖醇；盐；乳酸；硼酸、一种芳香族硼酸酯或一种苯基硼酸衍生物，如4-甲酰基苯基硼酸；或一种肽醛，优选地一种三或四肽醛，可能呈其次硫酸盐加合物形式。受保护的酶可以根据EP 238216中披露的方法来制备。
表面活性剂
本发明的洗涤剂组合物包含至少一种阴离子表面活性剂。在一些实施例中，组合物可以进一步包含一种或多种表面活性剂，该或这些表面活性剂可以是阳离子的、非离子的、半极性的、两性离子的或其任何混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种阴离子表面活性剂与一种或多种非离子表面活性剂的一种混合物。表面活性剂(多种)典型地以从0.1wt％到约70wt％、如从1wt％到约60wt％、从2wt％到约50wt％、从3wt％到约 40wt％、从4wt％到约30wt％、从5wt％到约25wt％或从10wt％到约20wt％的一个总水平存在。表面活性剂(多种)基于所希望的清洁应用来选择，并且包括本领域中已知的任何常规表面活性剂(多种)。可以使用本领域中已知用于洗涤剂中的任何表面活性剂。
适合的阴离子表面活性剂包括：烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐以及其混合物。阴离子表面活性剂可以选自下组，该组由以下各项组成：C10-C18烷基苯磺酸盐(LAS)，优选地C10-C13烷基苯磺酸盐；C10-C20伯的支链、直链以及无规链烷基硫酸盐(AS)，典型地具有下式：CH3(CH2)XCH2-OSO3 -M+，其中M是氢或提供了电中和的一个阳离子，优选的阳离子是钠和铵阳离子，其中x是至少7、优选地至少9的一个整数；C10-C18仲(2,3)烷基硫酸盐，典型地具有下式：
Figure BDA0002260737020000261
其中M是氢或提供了电中和的一个阳离子，阳离子包括钠和铵阳离子，其中x是至少7或至少9的一个整数，y是至少8或至少9的一个整数；C10-C18 烷基烷氧基羧酸盐；中链支链烷基硫酸盐，如US 6,020,303和US 6,060,443 中更详细描述；改性的烷基苯磺酸盐(MLAS)，如WO 99/05243、WO 99/05242、WO 99/05244、WO 99/05082、WO 99/05084、WO 99/05241、WO 99/07656、WO 00/23549以及WO 00/23548中更详细描述；甲酯磺酸盐(MES)；α-烯烃磺酸盐(AOS)以及其混合物。
阴离子表面活性剂包括：直链或支链被取代或未被取代的烷基苯磺酸盐表面活性剂，优选地直链C8-C18烷基苯磺酸盐表面活性剂；直链或支链被取代或未被取代的烷基苯硫酸盐表面活性剂；直链或支链被取代或未被取代的烷基硫酸盐表面活性剂，包括直链C8-C18烷基硫酸盐表面活性剂、C1-C3烷基支链C8-C18烷基硫酸盐表面活性剂、直链或支链烷氧基化C8-C18烷基硫酸盐表面活性剂以及其混合物；直链或支链被取代或未被取代的烷基磺酸盐表面活性剂；以及其混合物。
烷氧基化烷基硫酸盐表面活性剂可以是具有从1到30、从1到10或从3 到7的一个平均烷氧基化程度的直链或支链被取代或未被取代的C8-18烷基烷氧基化硫酸盐表面活性剂。
阴离子表面活性剂可以选自下组，该组由以下各项组成：直链或支链被取代或未被取代的C12-18烷基硫酸盐；直链或支链被取代或未被取代的 C10-13烷基苯磺酸盐，优选地直链C10-13烷基苯磺酸盐；以及其混合物。高度优选的是直链C10-13烷基苯磺酸盐。高度优选的是通过磺化可商购的直链烷基苯(LAB)可获得、优选地获得的直链C10-13烷基苯磺酸盐；适合的 LAB包括低碳2-苯基LAB，如由萨索(Sasol)以商标Isochem(R)供应的那些或由帕蒂里莎(Petresa)以商标Petrelab(R)供应的那些，其他适合LAB 包括高碳2-苯基LAB，如由萨索以商标Hyblene(R)供应的那些。一种适合的阴离子洗涤剂表面活性剂是通过DETAL催化工艺获得的烷基苯磺酸盐，但其他合成途径(如HF)也可以是适合的。另一种适合的阴离子表面活性剂是烷基乙氧基羧酸盐。
阴离子表面活性剂典型地以其盐形式存在，典型地与一种适合阳离子络合。适合的平衡离子包括Na+和K+、被取代的铵(如Ci-C6烷醇铵，优选地单乙醇胺(MEA)、三乙醇胺(TEA)、二乙醇胺(DEA))以及其任何混合物。在一些实施例中，至少20wt％或至少30wt％或至少40wt％或至少50wt％或至少60wt％或至少70wt％或至少80wt％或甚至或至少90wt％的阴离子表面活性剂通过一种钠阳离子中和。
阴离子表面活性剂可以具有从8.0到9.1的一个亲水性指数(HIc)，或它甚至可以具有一个较低亲水性指数(HIc)，如在从6.0到8.0或从7.0到低于8.0 的范围内的亲水性指数。亲水性指数(HIc)更详细描述于WO 00/27958中。
洗涤剂通常将含有从0.1wt％到70wt％、如从1wt％到约60wt％、从2 wt％到约50wt％、从3wt％到约40wt％、从4wt％到约30wt％、从5wt％到约25wt％或从10wt％到约20wt％的一种阴离子表面活性剂。优选的阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，特别是直链烷基苯磺酸盐 (LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基烷烃磺酸盐、α- 烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、烯属烃磺酸盐、烷烃-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基烷烃磺酸盐和二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或 FES，也称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲烷烃磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化脂肪酸甘油酯、α-磺基脂肪酸甲酯(α-SFMe 或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基或烯基琥珀酸、十二碳烯基/十四碳烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺基-琥珀酸的二酯和单酯或皂以及其组合。
当包括在其中时，洗涤剂将通常含有从0,01wt％到约40wt％、如从0,05 wt％到约10wt％、从0,1wt％到5wt％的一种阳离子界面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇胺季铵(ADMEAQ)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)、氯化二甲基二硬脂酰基铵(DSDMAC)和烷基苯甲基二甲基铵以及其组合、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)，
当包括在其中时，洗涤剂通常将含有从0.2wt％到约60wt％或甚至从40 wt％到约70wt％、例如从0.5wt％到约40wt％、从1wt％到约30wt％、从1wt％到约20wt％、从3wt％到约10wt％、从2wt％到约5wt％或从6wt％到约15 wt％的一种非离子表面活性剂。非离子表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化脂肪醇(PFA)、烷氧基化脂肪酸烷基酯(如乙氧基化和/或丙氧基化脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺GA，或脂肪酸葡糖酰胺FAGA)以及以商标名SPAN和TWEEN可获得的产品以及其组合。
当包括在其中时，洗涤剂通常将含有从约0.1wt％到约40wt％、例如从约0.5wt％到约30wt％、从约1wt％到约20wt％、从约3wt％到约10wt％、从约3wt％到约5wt％或从约8wt％到约12wt％的一种半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括胺氧化物(AO)，如烷基二甲基氧化胺、N-(椰油烷基)-N,N-二甲基氧化胺以及N-(动物脂油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺；脂肪酸烷醇酰胺和乙氧基化脂肪酸烷醇酰胺；以及其组合。
当包括在其中时，洗涤剂通常将含有从约0.2wt％到约40wt％、例如从约0.5wt％到约30wt％、从约1wt％到约20wt％、从约3wt％到约10wt％、从约3wt％到约5wt％或从约8wt％到约12wt％的一种两性离子表面活性剂。两性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱和磺基甜菜碱以及其组合。
助水溶物
一种助水溶物是使疏水性化合物增溶于水溶液中(或相反地，极性物质于一种非极性环境中)的一种化合物。洗涤剂组合物中助水溶物的使用提供了例如表面活性剂的更浓缩的配制品(如在通过移除水使液体洗涤剂浓缩的过程中)而不诱发不希望的现象(如相分离或高粘度)。
洗涤剂可以含有从0到约10wt％、如从0.5wt％到约5wt％或从3wt％到约5wt％的一种助水溶物。在一些情况下，它可以含有从0到约50wt％、如从0到约25wt％或从25wt％到约50wt％的一种助水溶物。可以使用本领域中已知用于洗涤剂中的任何助水溶物。助水溶物的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、异丙苯磺酸钠(SCS)、异丙基甲苯磺酸钠、胺氧化物、醇和聚二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基硫酸钠、多元醇以及其组合。
助洗剂和共助洗剂
洗涤剂组合物可以含有从0到约65wt％或从0到约20wt％的洗涤剂助洗剂、共助洗剂或其混合物。在一种餐具洗涤洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是从40wt％到约65wt％或从50wt％到约65wt％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体地说是与Ca和Mg形成水溶性络合物的一种螯合剂。可以使用本领域中已知用于洗涤剂中的任何助洗剂和/或共助洗剂。
助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐(如三磷酸钠(STP或STPP))、碳酸盐(如碳酸钠)、可溶性硅酸盐(如偏硅酸钠)、层状硅酸盐(例如来自赫斯特(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺(如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚氨基二乙醇(DEA)以及2,2',2"-次氮基三乙醇(TEA)) 和羧甲基菊粉(CMI)以及其任何组合。
共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。其他非限制性实例包括柠檬酸盐；螯合剂，如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐以及膦酸盐；以及烷基或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2',2"-次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(2- 磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N- 二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA) 以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸酯 (HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)以及其任何组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
漂白系统
洗涤剂可以含有从0到约50wt％、从0.1wt％到约25wt％、从0.5wt％到约20wt％、从1wt％到约15wt％或从2wt％到约10wt％的一种漂白系统。可以使用本领域中已知用于洗涤剂中的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白剂活化剂、氢过氧化物源(如过碳酸钠和过硼酸钠)、预先形成的过酸以及其混合物。适合的预先形成的过酸包括(但不限于)过氧羧酸和盐、过碳酸和盐、过亚氨酸和盐、过氧单硫酸和盐(例如Oxone(R))以及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，它们可以包括例如一种无机盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是单或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐，与一种形成过酸的漂白剂活化剂组合。漂白剂活化剂在此意指与过氧漂白样过氧化氢反应以形成一种过酸的一种化合物。由此形成的过酸构成了活化的漂白剂。在此待用的适合漂白剂活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、3,5,5三甲基己酰氧基苯磺酸钠、二过氧十二烷酸、4-(十二酰氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(3,5,5-三甲基己酰氧基)苯磺酸盐 (ISONOBS)、四乙酰基乙二胺(TAED)和4-(壬酰氧基)苯磺酸盐(NOBS) 和/或WO 98/17767中披露的那些。所关注漂白剂活化剂的一个具体家族披露于EP 624154中，并且特别优选那个家族是乙酰基柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC 或一种短链甘油三酯(如Triacin)具有以下优势，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰基柠檬酸三乙酯和三醋精在储存后在产品中具有一个良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白剂活化剂。最终， ATC向洗衣添加剂提供了一种良好的增效能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，如6-(酞酰基氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括一种漂白剂催化剂。在一些实施例中，漂白剂组分可以是一种选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：
(iii)以及其混合物；其中每个R1独立地是含有从9到24个碳的一个支链烷基或含有从11到24个碳的直链烷基，优选地每个R1独立地是含有从9 到18个碳的一个支链烷基或含有从11到18个碳的直链烷基，更优选地每个 R1独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 07/087258、WO 07/087244、WO 07/087259、WO 07/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌
聚合物
洗涤剂可以含有从0到约10wt％、如从0.5wt％到约5wt％、从2wt％到约5wt％、从0.5wt％到约2wt％或从0.2wt％到约1wt％的一种聚合物。可以使用本领域中已知用于洗涤剂中的任何聚合物。聚合物可以充当如上所述的一种共助洗剂，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油脂清洁和/或抗泡沫性质。一些聚合物可以具有以上提及的性质中的多于一者和/或以下提及的基元中的多于一者。
示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化聚(乙亚胺)、羧甲基菊糖(CMI)和聚羧酸酯(如PAA、PAA/PMA)、聚天冬氨酸和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水性改性的CMC(HM-CMC)和有机硅、对苯二甲酸与低聚二醇的共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯与聚氧对苯二甲酸乙二酯的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯咪唑)(PVI)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯咪唑(PVPVI)。其他示例性聚合物包括磺化聚羧酸酯、聚环氧乙烷与聚环氧丙烷(PEO-PPO) 以及乙氧基硫酸二季铵。其他示例性聚合物披露于例如WO 06/130575中。还涵盖以上提及的聚合物的盐。
聚合物还可以是一种表面活性加强聚合物。优选的聚合物是两亲烷氧基化油脂清洁聚合物和/或无规接枝共聚物。两亲烷氧基化油脂清洁聚合物是指具有平衡的亲水性与疏水性性质以使得它们从织物和表面移除油脂颗粒的任何烷氧基化聚合物。本发明的两亲烷氧基化油脂清洁聚合物的具体实施例包括一个核心结构和与那个核心结构连接的多个烷氧基化基团。核心结构可以包括如WO 11/156297中所述的一个聚烯属烃亚胺结构或一个聚烷醇胺结构。
织物调色剂染料
本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂染料。调色剂被配制得从洗液沉积到织物上以便改进织物白度感觉。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，调色剂改变一个表面的色彩，因为它们吸收至少一部分可见光谱。适合的调色剂包括染料和染料-粘土结合物，并且还可以包括颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由以下各项组成：属于以下比色指数(C.I.)分类的染料：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物，例如如WO 05/03274、WO 05/03275、WO 05/03276以及EP 1876226 (通过引用结合在此)中所述。
优选地，调色剂是蓝色或紫色的。优选地，调色染料(多种)具有从550 nm到650nm、优选地从570nm到630nm的一个峰吸收波长。一起对人眼具有呈单个染料形式的视觉效果的一种染料组合对于聚酯具有从550nm到 650nm、优选地从570nm到630nm的一个峰吸收波长。这可以例如通过混合一种红色和绿色-蓝色染料以产生一种蓝色或紫色调色来提供。
适合染料的实例是直接紫7、直接紫9、直接紫11、直接紫26、直接紫 31、直接紫35、直接紫40、直接紫41、直接紫51、直接紫66、直接紫99、酸性紫50、酸性蓝9、酸性紫17、酸性黑1、酸性红17、酸性蓝29、溶剂紫 13、分散紫27、分散紫26、分散紫28、分散紫63和分散紫77、碱性蓝16、碱性蓝65、碱性蓝66、碱性蓝67、碱性蓝71、碱性蓝159、碱性紫19、碱性紫35、碱性紫38、碱性紫48；碱性蓝3、碱性蓝75、碱性蓝95、碱性蓝 122、碱性蓝124、碱性蓝141、噻唑鎓染料、活性蓝19、活性蓝163、活性蓝182、活性蓝96、Liquitint(R)Violet CT(米利肯(Milliken)，斯帕坦堡，美国)以及Azo-CM-Cellulose(梅格奇酶(Megazyme)，布雷(Bray)，爱尔兰共和国)。
洗涤剂组合物优选地包含从0.00003wt％到约0.2wt％、从0.00008wt％到约0.05wt％或甚至从0.0001wt％到约0.04wt％织物调色剂。组合物可以包含从0.0001wt％到0.2wt％织物调色剂染料，这在组合物呈一个单位用量袋形式时可以是尤其优选的。适合的调色剂还披露于例如WO 07/087257、WO 07/087243中。
消泡剂
洗涤剂组合物可以包含从0.001wt％到约4.0wt％消泡剂，该消泡剂选自有机硅消泡剂化合物；硅油消泡剂化合物和疏水性颗粒；以及其混合物。在一个实施例中，在此的组合物包含从0.01wt％到约2.0wt％或从0.05wt％到约1.0wt％有机硅消泡剂(以不包括任何载体的活性量计的百分比)。在一个实施例中，消泡剂选自：具有芳基或烷基芳基取代基的有机改性的有机硅聚合物与聚硅氧树脂和改性的二氧化硅组合；M/Q树脂；以及其混合物。
钙和镁阳离子
优选地，组合物包含从0.01wt％到5.0wt％的二价阳离子(如钙和/或镁阳离子)。组合物可以包含从0.01wt％到0.2wt％、从0.2wt％到1.0wt％、从 1.0wt％到2.0wt％、从2.0wt％到3.0wt％、从3.0wt％到4.0wt％或从4.0wt％到5.0wt％。
辅助材料
还可以使用本领域中已知用于洗涤剂中的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、防皱剂、杀菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂/崩解试剂、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、 CMC、蛋白酶抑制剂(如4-FPBA和肽醛)和/或多元醇(如丙二醇、甘油、山梨糖醇等))、织物调理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、发泡剂、泡沫(肥皂泡)调节剂、香料、污垢悬浮剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，或者单独或者呈组合形式。可以使用本领域中已知用于洗涤剂中的任何成分。这样的成分的选择完全在业内人士的技术内。
本发明的洗涤剂组合物还可以含有分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包含分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合酸或其盐，其中聚羧酸包含由不超过两个碳原子与彼此分离的至少两个羧基。适合的分散剂描述于例如粉状洗涤剂(PowderedDetergents)，表面活性剂科学系列(Surfactant science series)第71卷，马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)中。
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合染料转移抑制剂包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多元胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于一种标的组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物的从0.0001wt％到约10wt％、从0.01wt％到约5wt％或从0.1wt％到约3wt％的水平存在。
本发明的洗涤剂组合物优选地还将含有可以使被清洁的物品有色泽的另外的组分，如荧光增白剂或光学增亮剂。在存在时，增亮剂优选地在从0,01 wt％到约0,5wt％的一个水平下。适用于一种洗衣洗涤剂组合物中的任何荧光增白剂可以用于本发明的组合物中。最常用的荧光增白剂是属于二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物以及双苯基-联苯乙烯衍生物类别的那些。二氨基芪-磺酸衍生物型的荧光增白剂的实例包括以下各项的钠盐：4,4'-双-(2- 二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基- 乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基) 芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；以及2-(芪基-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可获自汽巴-盖基股份公司(Ciba-Geigy AG)，巴塞尔(Basel)，瑞士(Switzerland)的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS 是4,4'-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝 CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学(Paramount Minerals and Chemicals)，孟买(Mumbai)，印度(India)供应。适用于本发明中的其他荧光增白剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷基氨基香豆素。适合的荧光增白剂水平包括从0.01wt％、从0.05wt％、从0.1wt％或从0.2wt％的较低水平到约0.5 wt％或约0.75wt％的较高水平。
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(如棉布和基于聚酯的织物)移除污垢，特别是从基于聚酯的织物移除疏水性污垢。污垢释放聚合物可以例如是非离子或阴离子基于对苯二酸酯的聚合物、聚乙烯己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参看例如粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列第71卷，马塞尔德克尔公司的第7章。另一种类型的污垢释放聚合物是两亲烷氧基化油脂清洁聚合物，包括一个核心结构和与那个核心结构连接的多个烷氧基化基团。核心结构可以包括如WO 09/087523(通过引用结合在此)中详细描述的一个聚烯属烃亚胺结构或一个聚烷醇胺结构。此外，无规接枝共聚物是适合的污垢释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细描述于W O07/138054、WO 06/108856 以及WO 06/113314(通过引用结合在此)中。其他污垢释放聚合物是被取代的多糖结构，尤其是被取代的纤维素结构，如改性的纤维素衍生物，如EP1867808或WO 03/040279(都通过引用结合在此)中所述的那些。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺以及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、两性离子改性的纤维素以及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素以及其混合物。
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙烯亚胺。在以上污垢释放聚合物下描述的基于纤维素的聚合物还可以充当抗再沉积剂。
其他适合的辅助材料包括(但不限于)防缩剂、防皱剂、杀菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶物、香料、颜料、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性化剂。
用途
在洗涤剂中的用途。本发明的脂肪酶可以用以制备稳定化的洗涤剂组合物。因此，本发明涉及一种获得洗涤剂组合物的方法，包括引入(a)一种母体脂肪酶的一种脂肪酶变体，该变体与SEQ ID NO:2具有至少60％序列一致性、在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的D254的一个位置处具有一个取代并且具有脂肪酶活性；和(b)一种阴离子表面活性剂，其中所述组合物与包含该母体脂肪酶的一种相对应的组合物相比具有增加的稳定性。
稳定性可以(但不限于)借助于如在此描述的实时或加速储存稳定性和/ 或DSC分析监测。它们可以被添加到一种洗涤剂组合物并且因此变为一种其组分。洗涤剂组合物可以呈任何适合形式，包括颗粒、液体、凝胶、软膏、皂条、单位用量/胶囊等或其任何组合。
本发明的洗涤剂组合物可以例如配制为手工或机器洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污垢的织物的一种洗衣添加剂组合物和一种冲洗添加的织物软化剂组合物；或配制为用于一般家庭硬面清洁操作中的一种洗涤剂组合物；或配制用于手工或机器洗碗操作。
在一个具体方面，本发明提供了一种洗涤剂添加剂，包含如在此描述的本发明的一种多肽。
本发明还针对用于使用其组合物的方法。
本发明还涉及以下实施例：
1.与SEQ ID NO:2具有至少60％序列一致性的衍生自一种母体脂肪酶的一种脂肪酶变体的用途，该变体具有脂肪酶活性并且与该母体脂肪酶相比在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的D254的一个位置处包括一个取代，该脂肪酶变体用于获得一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含至少一种阴离子表面活性剂，该组合物与包含该母体脂肪酶的一种相对应的组合物相比更稳定。
2.如实施例1所述的用途，其中对应于SEQ ID NO:2的该成熟多肽的 D254的该位置处的该氨基酸取代是S、T、N、Y、H、L或Q。
3.如实施例1或2的用途，其中该至少一种阴离子表面活性剂是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基烷烃磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、烯属烃磺酸盐、烷烃-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基烷烃磺酸盐和二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES 或AEOS或FES，也称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲烷烃磺酸盐 (SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化脂肪酸甘油酯、α-磺基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基或烯基琥珀酸、十二碳烯基/十四碳烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺基-琥珀酸的二酯和单酯、皂或其任何组合。
4.如实施例1到3中任一项所述的用途，其中该脂肪酶变体选自下组，该组由以下各项组成：
a.与SEQ ID NO:2的该成熟多肽具有至少60％序列一致性的一种多肽；
b.由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严谨度条件下与(i) SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列、(ii)(i)的全长互补体杂交；
c.由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的该成熟多肽编码序列具有至少60％一致性；以及
d.SEQ ID NO:2的该成熟多肽的一个片段，该片段具有脂肪酶活性。
5.如实施例1到4中任一项所述的用途，其中该脂肪酶变体与SEQ ID NO:2的该成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少 85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％序列一致性。
6.如实施例1到5中任一项所述的用途，其中该脂肪酶变体由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的该成熟多肽编码序列或(ii)(i)的该全长互补体杂交。
7.如实施例1到6中任一项所述的用途，其中取代的数目是1-20个，例如1-10个和1-5个，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9 个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个取代。
8.如实施例1到7中任一项所述的用途，该用途进一步包括在对应于 SEQ ID NO:2的该成熟多肽的位置N33Q、T231R和/或N233R的一个或多个位置处的一个取代。
9.如实施例1到8中任一项所述的用途，其中该脂肪酶变体包括或含有选自以下各项的取代：
a.T231R+D254S
b.N233R+D254S
c.T231R+N233R+D254S
d.N33Q+D254S
e.N33Q+T231R+D254S
f.N33Q+N233R+D254S
g.N33Q+T231R+N233R+D254S
h.T231R+D254T
i.N233R+D254T
j.T231R+N233R+D254T
k.N33Q+D254T
l.N33Q+T231R+D254T
m.N33Q+N233R+D254T
n.N33Q+T231R+N233R+D254T
o.T231R+D254N
p.N233R+D254N
q.T231R+N233R+D254N
r.N33Q+D254N
s.N33Q+T231R+D254N
t.N33Q+N233R+D254N
u.N33Q+T231R+N233R+D254N
v.T231R+D254Y
w.N233R+D254Y
x.T231R+N233R+D254Y
y.N33Q+D254Y
z.N33Q+T231R+D254Y
aa.N33Q+N233R+D254Y
bb.N33Q+T231R+N233R+D254Y
cc.T231R+D254H
dd.N233R+D254H
ee.T231R+N233R+D254H
ff.N33Q+D254H
gg.N33Q+T231R+D254H
hh.N33Q+N233R+D254H
ii.N33Q+T231R+N233R+D254H
jj.T231R+D254L
kk.N233R+D254L
ll.T231R+N233R+D254L
mm.N33Q+D254L
nn.N33Q+T231R+D254L
oo.N33Q+N233R+D254L
pp.N33Q+T231R+N233R+D254L
qq.T231R+D254Q
rr.N233R+D254Q
ss.T231R+N233R+D254Q
tt.N33Q+D254Q
uu.N33Q+T231R+D254Q
vv.N33Q+N233R+D254Q
ww.N33Q+T231R+N233R+D254Q
10.如以上实施例中任一项所述的用途，其中该母体脂肪酶包括SEQ ID NO:2的该成熟多肽或由其组成。
11.如以上实施例中任一项所述的用途，其中该组合物进一步包含 CaCl2。
12.一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物通过使用根据实施例1到11中任一项所述的一种脂肪酶变体获得。
13.一种洗涤剂组合物，包含(a)一种母体脂肪酶的一种脂肪酶变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的D254的一个位置处具有一个取代并且具有脂肪酶活性；和(b)一种阴离子表面活性剂，其中所述组合物与包含该母体脂肪酶的一种相对应的组合物相比具有增加的稳定性。
14.一种获得洗涤剂组合物的方法，包括引入(a)一种母体脂肪酶的一种脂肪酶变体，该变体在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的D254的一个位置处具有一个取代并且具有脂肪酶活性；和(b)一种阴离子表面活性剂，其中所述组合物与包含该母体脂肪酶的一种相对应的组合物相比具有增加的稳定性。
15.如实施例12或13所述的组合物的用途，该组合物用于清洁。
本发明通过以下实例进一步描述，这些实例不应视为限制本发明的范围。
实例
实例1：差示扫描热量测定(DSC)
使用一台VP-毛细管差示扫描量热仪(微量热公司(MicroCal Inc.)，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)通过差示扫描热量测定(DSC)测定脂肪酶的热稳定性。将热变性温度Td(℃)视为温谱图(Cp相较于T)中的变性峰(主要吸热峰)的顶端，这些温谱图在200K/hr的一个恒定程序加热率下在缓冲液(50mM HEPES缓冲液pH 8.0，添加或不添加有1mM CaCl2)中加热酶溶液之后获得。
将样品和参考溶液(约0.2ml)从10℃下的储存条件装载到量热仪中(参考：不具有酶的缓冲液)，并且在20℃下热预平衡20分钟，随后从20℃到 110℃进行DSC扫描。以约+/-1℃的一个准确性测定变性温度。
实例2a：实时储存稳定性分析
将被纯化的脂肪酶用HSB缓冲液(2.5mM HEPES pH 7；10M NaCl； 0.02％Brij-35)稀释到100ppm的一个浓度。添加20微升100ppm脂肪酶溶液到一个180微升洗涤剂组合物，搅拌5分钟，并且密封。将样品储存在4℃ (非应激)和35℃(应激)下。根据脂肪酶参考的半衰期选择储存时间。
在储存之后，将可能的冷凝液体通过离心收集。将10微升样品等分试样在一个0.05M pH 9硼酸盐缓冲液(9mM CaCl2；0.0225％Brij-35；0.85％ 4-FBPA(31.5g/l))中稀释200倍。将一份被稀释的等分试样与四份1mM pNP- 棕榈酸盐、1mM氯化钙、100mM Tris(pH8.0)、6.5mM脱氧胆酸盐、1.4g/L AOS混合，并且以分光光度法测量pNP发色团的释放20分钟。
将残余活性计算为应激的相较于非应激的样品的测量速度比。基于两个到四个重复计算残余活性的平均值。
基于下式计算实验6、7以及8中所示的半衰期：半衰期＝应激时间* ln(0,5)/ln(残余活性)。
通过将脂肪酶的半衰期除以脂肪酶参考的半衰期来计算相对于一种脂肪酶参考的半衰期改进因子(HIF)。除非另外提及，否则脂肪酶参考是包括突变T231R和N233R的一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶。
表1
Figure BDA0002260737020000401
Figure BDA0002260737020000411
*量基于实际干物质含量。
D002是在2010年购入英国(UK)的一种不具有酶的商业洗涤剂(宝莹 (Persil)Small&Mighty非生物，2x浓缩的)。它基于LAS/SLES/NI并且具有直接测量的pH 8.4。
实例2b：在阴离子表面活性剂存在下的实时储存稳定性分析。
设定一个简单分析系统以测试在一种阴离子表面活性剂(如LAS)存在下的稳定性。
表2
组成 X001 X002 X013
LAS 11.1％ 11.1％ -
TRIS 22.2mM 22.2mM 22.2mM
NaCl 111.1mM 111.1mM 111.1mM
pH 7 9 7
将被纯化的脂肪酶用HSB缓冲液(2.5mM HEPES pH 7；10mM NaCl；0.02％Brij-35)稀释到100ppm的一个浓度。添加20微升100ppm脂肪酶溶液到一个180微升缓冲溶液，搅拌5分钟，并且密封。将样品在室温下储存在不具有表面活性剂的一种参考缓冲液X013(非应激)中和在具有表面活性剂X001或X002的一种缓冲液(应激)中。在1、2、3、4、6、24以及48 小时之后取用四个重复的样品等分试样。
在储存之后，将可能的冷凝液体通过离心收集。将10微升样品等分试样在一个0.05M pH 9硼酸盐缓冲液(9mM CaCl2；0.0225％Brij-35；0.85％ 4-FBPA(31.5g/l))中稀释200倍。将一份被稀释的等分试样与四份1mM pNP- 棕榈酸盐、1mM氯化钙、100mM Tris(pH8.0)、6.5mM脱氧胆酸盐、1.4g/L AOS混合，并且以分光光度法测量pNP发色团的释放20分钟。
将残余活性计算为应激的相较于非应激的样品的测量速度比。基于两个到四个重复计算残余活性的平均值。
通过拟合一个y＝A*2^(-x/B)型曲线计算半衰期，其中y是残余活性，并且x是孵育时间。B的最优值则是半衰期。使用nls函数以R进行拟合 (http://www.r-project.org)。
实例2c：实时储存稳定性分析
添加在2mg EP/g储备溶液中的被纯化的脂肪酶到68ppm的一个浓度的 96.3％洗涤剂。将样品搅拌最少1小时，随后分布到密封的玻璃小瓶中，接着储存。在最后储存之后，将所有样品冷冻，并且分析残余活性，并且与从实验开始起冷冻的一种参考样品相比。除非另外提及，否则脂肪酶参考是包括突变T231R和N233R的一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶。
通过一种方法测量脂肪酶活性，其中将脂肪酶稀释到0.0145-0.0490 M:LCLU/L，并且与底物PNP-棕榈酸盐一起孵育(pH 8；37℃)；在405nm 下在65秒内以分光光度法检测释放的PNP。针对一个标准曲线读取绝对活性。基于两个重复计算绝对活性的平均值。
通过拟合一个y＝A*2^(-x/B)型曲线计算半衰期，其中y是残余活性，并且x是孵育时间。B的最优值则是半衰期。使用nls函数以R进行拟合 (http://www.r-project.org)。
实例3：热稳定性
如实例1中所述在不存在CaCl2下测定热稳定性。一种D254S被取代的脂肪酶变体和其参考脂肪酶在不存在或存在LAS下的热变性温度Td展示在表3中。
表3
Figure BDA0002260737020000421
Figure BDA0002260737020000431
实例4：热稳定性
如实例1中所述在存在CaCl2下测定热稳定性。不同的D254被取代的脂肪酶变体和其参考脂肪酶在不存在或存在LAS下的热变性温度Td展示在表4中。
表4
Figure BDA0002260737020000432
实例5：热稳定性
如实例1中所述测定热稳定性。一种D254S脂肪酶变体在不存在或存在 LAS和CaCl2下的热变性温度Td展示在表5中。
表5
Figure BDA0002260737020000433
实例6：实时储存稳定性数据
如实例2a中所述测定在洗涤剂D001中的储存稳定性。脂肪酶变体和其参考脂肪酶的残余活性和半衰期改进因子(HIF)展示在表6中。
表6
Figure BDA0002260737020000434
Figure BDA0002260737020000441
实例7：实时储存稳定性数据
如实例2a中所述测定在洗涤剂D001中的储存稳定性。脂肪酶变体和其参考脂肪酶的残余活性和半衰期改进因子(HIF)展示在表7中。
表7
实例8：在不同洗涤剂中的稳定性
如实例2a中所述测定在洗涤剂D001、D002以及D003中的储存稳定性。脂肪酶变体和其参考脂肪酶的以小时为单位的半衰期展示在表8中。
表8
突变 D001 D002 D003
T231R+N233R 255 1131 613
T231R+N233R+D254S 2478 3716 1323
实例9：在LAS系统中的稳定性
在两种包含LAS的组合物：X001和X002中对应地在pH 7和pH 9下在四个重复中如实例2b中所述测定在1、2、3、4、6、24以及48小时之后的储存稳定性。脂肪酶在观测的时间周期内在参考缓冲液X013中是稳定的。脂肪酶变体和其参考脂肪酶的以小时为单位的半衰期展示在表9中。
表9
Figure BDA0002260737020000443
实例10：实时储存稳定性数据
如实例2c中所述测定储存稳定性。脂肪酶变体和其参考脂肪酶在不同温度下在洗涤剂D001、D002以及D003中的以周为单位的半衰期和半衰期改进因子(HIF)对应地展示在表10a、10b以及10c中。
表10a
突变 35℃ 37℃ 40℃
T231R+N233R 1.2 0.7 0.2
T231R+N233R+D254S 6.5 4.4 1.6
HIF 5.3 6.4 10.1
表10b
突变 35℃ 37℃ 40℃
T231R+N233R 6.2 5.8 3.2
T231R+N233R+D254S 13.2 16.7 12.3
HIF 2.1 2.9 3.8
表10c
突变 35℃ 37℃ 40℃
T231R+N233R 1.7 1.2 0.5
T231R+N233R+D254S 2.2 1.9 1.2
HIF 1.3 1.6 2.3
实例11：在混合表面活性剂系统中的稳定性
在含有如表11a中列出的不同pH下的不同表面活性剂的洗涤剂混合物中在四个重复中测定在19.25、161.75以及329.25小时之后的储存稳定性。如实例2b中所述但在指示的储存温度下进行测试。脂肪酶在测试的时间周期内在参考缓冲液X013中是稳定的。脂肪酶变体和其参考脂肪酶的以小时为单位的半衰期展示在表11b中。改进因子展示为具有D254S突变的变体相较于不具有情况下的半衰期比。
表11a
Figure BDA0002260737020000452
Figure DA00022607370261438
Figure BDA0002260737020000461
表11b
Figure BDA0002260737020000462
Figure BDA0002260737020000471
实例12：脂肪酶在储存于洗涤剂D001中之后的洗涤性能
将被纯化的脂肪酶稀释(50mM H3BO3/NaOH，1M NaCl pH 9)到6.0 mg/mL的一个浓度。添加0.25mg脂肪酶到5g洗涤剂D001(表1)，搅拌30 分钟，并且密封。将样品储存在37℃(应激)下0天、7天以及14天并且此后转移到-18℃(非应激)。
在储存之后，在实验室规模下使用类似于ASTM D3050(ASTM国际 (ASTMInternational)，西康舍霍肯(West Conshohocken)，宾夕法尼亚州)、具有此处提及的修改的一种方法测量洗涤性能。将有污垢的测试布样(CS-10：被乳脂和着色剂污染的棉布，测试材料中心(Center For Testmaterials))在一台Terg-O-tometer中在90rpm下使用含有5g洗涤剂D001和0mg或0.25mg 脂肪酶的1L洗涤剂溶液洗涤。将布样在30℃下使用具有15°dHCa++/Mg++/HCO3-(比率4:1:7.5)的硬度的人造水洗涤15分钟，然后在流动自来水下冲洗10分钟。在洗涤和冲洗之后，将布样在室温下干燥过夜。使用460nm的比色计测量(麦克贝斯(Macbeth)Colour Eye 7000反射分光光度计)通过光的减轻测定布样的清洁度，并且通过减去已经用不具有酶的洗涤剂洗涤的空白的减轻将结果表示为ΔR。
表12
Figure BDA0002260737020000472
Figure BDA0002260737020000481
在此描述和要求的本发明范围不应受在此披露的具体方面限制，因为这些方面预期为本发明的若干方面的展示。任何等效方面旨在属于本发明的范围内。实际上，除了在此展示并且描述的内容之外，对于本领域的普通技术人员来说本发明的不同的修改将从以上描述变得很清楚。这样的修改还旨在属于随附权利要求书的范围内。在有矛盾的情况下，将以本披露(包括定义) 为准。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 具有脂肪酶变体的洗涤剂组合物
<130> 12315-WO-PCT
<160> 2
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 918
<212> DNA
<213> 疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(873)
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(66)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (67)..()
<400> 1
atg agg agc tcc ctt gtg ctg ttc ttt gtc tct gcg tgg acg gcc ttg 48
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu
-20 -15 -10
gcc agt cct att cgt cga gag gtc tcg cag gat ctg ttt aac cag ttc 96
Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe
-5 -1 1 5 10
aat ctc ttt gca cag tat tct gca gcc gca tac tgc gga aaa aac aat 144
Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn
15 20 25
gat gcc cca gct ggt aca aac att acg tgc acg gga aat gcc tgc ccc 192
Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro
30 35 40
gag gta gag aag gcg gat gca acg ttt ctc tac tcg ttt gaa gac tct 240
Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser
45 50 55
gga gtg ggc gat gtc acc ggc ttc ctt gct ctc gac aac acg aac aaa 288
Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys
60 65 70
ttg atc gtc ctc tct ttc cgt ggc tct cgt tcc ata gag aac tgg atc 336
Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile
75 80 85 90
ggg aat ctt aac ttc gac ttg aaa gaa ata aat gac att tgc tcc ggc 384
Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly
95 100 105
tgc agg gga cat gac ggc ttc act tcg tcc tgg agg tct gta gcc gat 432
Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp
110 115 120
acg tta agg cag aag gtg gag gat gct gtg agg gag cat ccc gac tat 480
Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr
125 130 135
cgc gtg gtg ttt acc gga cat agc ttg ggt ggt gca ttg gca act gtt 528
Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val
140 145 150
gcc gga gca gac ctg cgt gga aat ggg tat gat atc gac gtg ttt tca 576
Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser
155 160 165 170
tat ggc gcc ccc cga gtc gga aac agg gct ttt gca gaa ttc ctg acc 624
Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr
175 180 185
gta cag acc ggc gga aca ctc tac cgc att acc cac acc aat gat att 672
Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile
190 195 200
gtc cct aga ctc ccg ccg cgc gaa ttc ggt tac agc cat tct agc cca 720
Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro
205 210 215
gag tac tgg atc aaa tct gga acc ctt gtc ccc gtc acc cga aac gat 768
Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp
220 225 230
atc gtg aag ata gaa ggc atc gat gcc acc ggc ggc aat aac cag cct 816
Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro
235 240 245 250
aac att ccg gat atc cct gcg cac cta tgg tac ttc ggg tta att ggg 864
Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly
255 260 265
aca tgt ctt tagtggccgg cgcggctggg tccgactcta gcgagctcga gatct 918
Thr Cys Leu
<210> 2
<211> 291
<212> PRT
<213> 疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)
<400> 2
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu
-20 -15 -10
Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe
-5 -1 1 5 10
Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn
15 20 25
Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro
30 35 40
Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser
45 50 55
Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys
60 65 70
Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile
75 80 85 90
Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly
95 100 105
Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp
110 115 120
Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr
125 130 135
Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val
140 145 150
Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser
155 160 165 170
Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr
175 180 185
Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile
190 195 200
Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro
205 210 215
Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp
220 225 230
Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro
235 240 245 250
Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly
255 260 265
Thr Cys Leu

Claims (22)

1.洗涤剂组合物，其包含：
(a)母体脂肪酶的脂肪酶变体，该变体与SEQ ID NO:2具有至少95％序列一致性、在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的T231R+D254S的位置处具有取代并且具有脂肪酶活性；和
(b)阴离子表面活性剂，
其中所述组合物与包含该母体脂肪酶的相对应的组合物相比具有增加的稳定性。
2.权利要求1的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂组合物包含一种或多种阴离子表面活性剂与一种或多种非离子表面活性剂的混合物。
3.权利要求1或2的洗涤剂组合物，其中所述阴离子表面活性剂是直链烷基苯磺酸盐(LAS)。
4.权利要求2或3的洗涤剂组合物，其中所述非离子表面活性剂是醇乙氧基化物(AEO)。
5.权利要求1-4中任一项的洗涤剂组合物，其中所述组合物包含CaCl2。
6.权利要求1-5中任一项的洗涤剂组合物，其中所述脂肪酶变体包含或含有取代T231R+N233R+D254S。
7.权利要求1-6中任一项的洗涤剂组合物，其中与所述母体酶相比，所述变体具有改进的储存条件下的稳定性。
8.权利要求1-6中任一项的洗涤剂组合物，其中与所述母体酶相比，所述变体具有改进的对表面活性剂的稳定性。
9.权利要求1-6中任一项的洗涤剂组合物，其中与所述母体酶相比，所述变体具有改进的热稳定性。
10.权利要求1-9中任一项的洗涤剂组合物，其中所述组合物与包含所述母体脂肪酶的相应组合物相比具有增加的pH 8.0时的热稳定性。
11.权利要求1-9中任一项的洗涤剂组合物，其中与所述母体酶相比，所述变体具有改进的pH 9.0的储存条件下的稳定性。
12.清洁的方法，其包括将权利要求1-11中任一项的洗涤剂组合物分配到待清洁的物体的步骤。
13.洗衣清洁的方法，其包括将洗涤剂组合物分配到待清洁的纺织品或织物的步骤，所述洗涤剂组合物包含：
(a)母体脂肪酶的脂肪酶变体，该变体与SEQ ID NO:2具有至少95％序列一致性、在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的T231R+D254S的位置处具有取代并且具有脂肪酶活性；和
(b)阴离子表面活性剂，其中所述组合物与包含所述母体脂肪酶的相应组合物相比具有增加的稳定性。
14.权利要求13的方法，其中所述洗涤剂组合物包含一种或多种阴离子表面活性剂与一种或多种非离子表面活性剂的混合物。
15.权利要求13或14的方法，其中所述阴离子表面活性剂是直链烷基苯磺酸盐(LAS)。
16.权利要求14或15的方法，其中所述非离子表面活性剂是醇乙氧基化物(AEO)。
17.权利要求13-16中任一项的方法，其中所述组合物包含CaCl2。
18.权利要求13-17中任一项的方法，其中所述脂肪酶变体包含或含有取代T231R+N233R+D254S。
19.权利要求13-18中任一项的方法，其中与所述母体酶相比，所述变体具有改进的储存条件下的稳定性。
20.权利要求13-19中任一项的方法，其中与所述母体酶相比，所述变体具有改进的对表面活性剂的稳定性。
21.权利要求13-20中任一项的方法，其中与所述母体酶相比，所述变体具有改进的热稳定性。
22.权利要求21的方法，其中所述组合物与包含所述母体脂肪酶的相应组合物相比具有增加的pH 8.0或9.0时的热稳定性。
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