CN106459937A - 用于产生脂肪酶的方法 - Google Patents

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CN106459937A CN201580024458.3A CN201580024458A CN106459937A CN 106459937 A CN106459937 A CN 106459937A CN 201580024458 A CN201580024458 A CN 201580024458A CN 106459937 A CN106459937 A CN 106459937A
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Abstract

本发明涉及用于产生具有增加的脂肪分解活性的脂肪酶制剂的方法，该方法包括改变多核苷酸中的一个或多个核苷酸的步骤，该多核苷酸包括编码前肽的第一多核苷酸，该第一多核苷酸可操作地连接至编码脂肪酶的第二多核苷酸上，其中在该第一多核苷酸中作出该一个或多个核苷酸的改变，并且该改变独立地导致编码的前肽氨基酸序列中的取代、插入或缺失。

Description

用于产生脂肪酶的方法
对序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。
发明领域
本发明涉及产生脂肪酶的方法。更具体而言，本发明涉及用于产生脂肪酶制剂的方法，该脂肪酶制剂具有通过采用编码脂肪酶的修饰的多核苷酸而增加的脂肪分解活性。该修饰的多核苷酸编码脂肪酶，其中修饰包括在编码前肽的多核苷酸中。
发明背景
脂肪酶是重要的工业酶，其广泛用于许多应用中。仍更广泛利用的主要障碍之一是脂肪酶的生产成本，并且为了通过优化生产步骤增加脂肪酶的产量已经作出了一些努力。
脂肪酶在细胞中的表达依赖于若干调节序列，这些调节序列并不是成熟蛋白的一部分。一个这样的调节子是当存在时N-端恰好位于成熟脂肪酶序列之前的前肽。少数出版物中已经描述过在米黑根毛霉脂肪酶的前肽中的修饰：
CN 102851263(丰益(上海)生物技术研发中心有限公司(Fengyi ShanghaiBiotech Res&Dev CT Co LTD))描述了L57V(L-14V)突变体，和进一步包括V67A(V-4A)、S65A(S-6A)连同在成熟脂肪酶中的突变的L57V(L-14V)突变体示出增加的活性。
CN 102337253(浙江大学(Zhejiang University))描述了包括突变D48V(D-23V)和/或V67A,D(V-4A,D)连同在成熟脂肪酶中的突变的突变体展示改进的活性和热稳定性。只有前肽中突变的作用没有披露。
王珏(Wang,J.)等人，2012，应用微生物学和生物技术(Appl MicrobiolBiotechnol)，卷96，443-450页，描述了具有以下突变的突变体：前肽中的L57V、D64A、S65A和V67A，示出相对野生型的活性增加(Kcat(min-1))。
刘悦(Lui,Y.)等人，2014，现代微生物学(Curr Microbiol)，卷68，186-191页，描述了与野生型相比，N8A(N-63A)和N58A(N-13A)突变体中前肽的去糖基化表现出两倍更高的活性。
挑战是产生增加量的活性形式的酶蛋白，该酶蛋白还将在不同应用，例如洗涤剂组合物中发挥功能。
因此，仍存在对用于改进脂肪酶的产量和质量的另外手段的需要。
发明概述
多年来，脂肪酶一直被成功地用于不同应用中。然而，可用于清洁组合物中的有效的脂肪酶的选择仍然是相当有限的。人们一直努力试图通过修饰脂肪酶来获得具有改变的特征，例如活性、稳定性等的变体从而提供具有与清洁组合物组分的更好的相容性的脂肪酶。到目前为止，提供不仅能在清洁组合物的严苛环境中生存，同时又能示出出洗涤性能的脂肪酶仍然是一项挑战。
本发明涉及用于产生脂肪酶制剂的方法，该脂肪酶制剂具有通过采用编码脂肪酶的修饰的多核苷酸而增加的脂肪分解活性。出人意料地，发现修饰的多核苷酸编码脂肪酶，其中修饰包括在编码前肽的多核苷酸中，会生成具有增加量的适合用于清洁组合物中的活性脂肪酶的制剂。
附图简要说明
图1示出了SEQ ID No:2、6、7和8的比对。
发明说明
定义
脂肪酶：术语“脂肪酶(lipase)”、“脂肪酶(lipase enzyme)”、“脂解酶”、“脂质酯酶”、“脂解多肽”以及“脂解蛋白”是指如酶命名法所定义的EC3.1.1类中的一种酶。它可以具有脂肪酶活性(三酰基甘油脂肪酶，EC3.1.1.3)、角质酶活性(EC3.1.1.74)、固醇酯酶活性(EC3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(EC3.1.1.50)。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定脂肪酶活性。在一方面，本发明的脂肪酶具有SEQ ID NO:3的多肽的至少20％，例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％的脂肪酶活性。
脂肪酶抑制活性：术语“脂肪酶抑制活性”在本文中定义为抑制脂肪酶活性的活性。本发明的前肽具有SEQ ID NO:4的多肽的至少20％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或100％的脂肪酶抑制活性。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指明变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或者外源的(即，来自不同基因)，或者相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及脂肪酶产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包含编码脂肪酶的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有脂肪酶活性。在一方面，片段包含SEQ ID NO:3的氨基酸1至269的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，但小于100％。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
改进的特性：术语“改进的特性”意指与变体相关的与亲本相比得到改进的特征。这些改进的特性包括但不限于：稳定性，例如像热稳定性、在洗涤剂中的热稳定性、在洗涤剂中的稳定性；活性，例如像水解活性、在洗涤剂中的水解活性，底物特异性，污渍去除能力例如像脂质污渍去除能力和洗涤性能。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N末端加工、C末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，成熟多肽是SEQID NO:2的1至269的氨基酸，其与SEQ ID NO:3的1至269的氨基酸一致。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有脂肪酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸292至1098。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
亲本或亲本脂肪酶：术语“亲本”或“亲本脂肪酶”意指一种脂肪酶，对该脂肪酶进行一个改变以产生本发明的酶变体。该亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
(一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有脂肪酶活性的片段。在一方面，子序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸292至1098的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％但是小于100％。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有脂肪酶活性的多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；而插入意指在邻接并紧接着占据某位置的氨基酸之后添加氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ ID NO:3的脂肪酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。
变体命名规则
出于本发明的目的，使用在SEQ ID NO:3中披露的多肽来确定另一种脂肪酶中的相应的氨基酸残基。将另一种脂肪酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:3进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定与SEQ ID NO:3中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种脂肪酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(NucleicAcids Research)32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法 (Methods in Molecular Biology)537:39-64；加藤和都，2010，生物信息学26:1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
当其他酶与SEQ ID NO:3的多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过一个迭代数据库搜索过程来产生多个特征曲线并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。使用多种算法(例如距离比对矩阵(赫尔姆(Holm)和桑德尔(Sander)，1998，蛋白杂志(Proteins)33:88-96)或者组合扩展(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程学11:739-747))可以比对两个或更多个蛋白结构，并且可以另外地利用这些算法的实施来随所感兴趣的结构查询结构数据库以便发现可能的结构同源物(例如，赫尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学16:566-567)。
出于本发明的目的，其他脂肪酶应该与图1中示出的脂肪酶作比对。图1中示出的多次比对是通过使用Muscle程序3.8.31版(http://www.drive5.com/muscle、埃德加(Edgar,R.C.)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，32(5),1792-97)产生，这一程序也被用于其他脂肪酶的比对。
Muscle程序3.8.31版基本使用方法
muscle-入<输入文件>-出<输出文件>
常用选项(关于完整列表，请参见用户指南)：
-入<输入文件>FASTA格式的输入文件(默认标准输入)
-出<输出文件>FASTA格式的输出比对(默认标准输出)
-对角线(diags)寻找对角线(对相似序列的速度更快)
-最大迭代(maxiters<n>)迭代的最大值(整数，默认16)
-最大时间(Maxhours<h>)以小时计的迭代的最大时间(默认为无限制)
-超文本标记语言(html)以HTML格式写输出(默认为FASTA)
-Msf以GCG MSF格式写输出(默认为FASTA)
-Clw以CLUSTALW格式写输出(默认为FASTA)
-clwstrict As-clw，有‘CLUSTAL W(1.81)’标题
-log[a]<日志档案>记录到文件中(追加，如果-loga，覆盖，如果-log)
-静谧模式 不要将进程消息写给标准错误
-版本 展示版本信息并退出
非精化(极快，平均精确度与T-Coffee相似)：-最大迭代(maxiters)2
最快可能(氨基酸)：-最大迭代(maxiters 1)-对角线(diags)-sv-距离1千位20_3
最快可能(核苷酸)：-最大迭代(maxiters 1)-对角线(diags)
在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于引用方便。采用已接受的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。
缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195*”或者“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、初始氨基酸、插入氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Glyl95GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：
亲本： 变体：
195 195 195a 195b
G G-K-A
多种改变。包括多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同的改变。可以在一个位置上引入不同的变化时，这些不同的变化由一个逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
多核苷酸
本发明涉及一种编码脂肪酶的多核苷酸，包括编码脂肪酶的前肽的第一多核苷酸，该第一多核苷酸可操作地连接至编码脂肪酶的成熟蛋白的第二多核苷酸上，其中编码的前肽在一个或多个位置上包括改变，其中该改变独立地为取代、插入或缺失。
在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中第一多核苷酸编码前肽，该前肽与SEQ IDNO:4具有至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列一致性。
在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中第二多核苷酸编码脂肪酶，该脂肪酶与SEQ ID NO:3具有至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。
出于计算序列一致性的目的，应该使用图1示出的脂肪酶的比对。图1应该形成图1中未示出的其他脂肪酶的比对的基础，该比对使用同上序列一致性定义中描述的程序。
该前肽在蛋白质合成期间与脂肪酶的成熟蛋白相关联，并且该前肽的氨基酸可以分成若干脂肪酶接触区，其中三个主要脂肪酶接触区和四个第二脂肪酶接触区可以被鉴定。该主要脂肪酶接触区对应于SEQ ID NO:2的残基-57至-46、-38至-26和-22至-8并且该四个第二脂肪酶接触区对应于SEQ ID NO:2的残基-70至-58、-45至-39、-25至-23和-7至-1。
在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中在一个或多个核苷酸上的改变选自编码前肽氨基酸的任一核苷酸，该前肽氨基酸包括在一个脂肪酶接触区中。
在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中该脂肪酶接触区是选自对应于SEQ IDNO:2的残基-57至-50、-40至-28和-22至-15的氨基酸的任一主要脂肪酶接触区，其条件是该改变不是对应于SEQ ID NO:2的S-24F的取代。
在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中该脂肪酶接触区是选自对应于SEQ IDNO:2的残基-70至-58、-49至-39、-27至-25和-14至-1的氨基酸的任一第二脂肪酶接触区。
在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中这些主要脂肪酶接触区中的一个或多个与SEQ ID NO:2的序列一致性是至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。
在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中在一个或多个位置上的改变对应于选自SEQ ID NO:2的-12、-13、-14、-15、-17、-18、-22、-23、-24、-25、-32、-33、-34、-35、-40、-41、-45、-46、-47、-48、-49、-50、-51、-52、-53、-54、-55、-56、-57、-58、-59、-60、-61、-62、-63、-64、-65的位置。
在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中该改变是对应于SEQ ID No:2的位置-13、-17、-18、-24、-34、-40、-41、-51、-52、-63的一个或多个位置上的取代，其条件是该取代不是N-63A、N-63I或N-13A。
在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中该取代选自：N-13Q、G-17W、Y-18R、S-24F、P-34R、T-40R、S-41K、S-51K、P-52F和N-63Q。
在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中该改变是对应于SEQ ID No:2的位置-15、-25、-35、-45、-55的一个或多个位置上的插入。
在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中该插入选自：A-15AASV、A-15ASTED、P-25PASV、P-25PSTED、A-35AASV、A-35ASTED、S-45SASV、S-45SSTED、P-55PASV、和P-55PSTED。
在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中该缺失对应于选自SEQ ID NO:2的-14*至-12*、-24*至-22*、-34*至-32*、-54*至-62*、-45*至-54*、-45*至-65*、-55*至-65*的位置。
在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中改变的数量是1-40、1-20、1-15、1-10或1-5，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个改变。
在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其进一步包括对应于位置N-63AI、S-62G、D-59V、T-49I、S-48T、S-44P、D-23V、L-14V、N-13A、S-10A、D-7A、S-6T、V-4AD的一个或多个位置上的取代。
编码该前肽的这些脂肪酶接触区的多核苷酸中的变化被认为对脂肪酶的前肽和成熟蛋白之间的相互作用具有影响。产生前肽变体的影响不会改变脂肪酶的成熟蛋白的一级结构，但是会赋予脂肪酶的构象中的变化。
在一些方面，本发明涉及编码前肽的多核苷酸，该多核苷酸与脂肪酶的成熟蛋白有改变的结合和/或解离。因此，与前肽关联的脂肪酶的量和不与前肽关联的脂肪酶的量可能会有改变。据认为，在以下非变性PAGE实例中示出的制备中观察到的高分子量条带表示与前肽关联的脂肪酶，而低分子量条带表示不与前肽关联的脂肪酶。因此，在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中改变导致制备中呈现出的HMW条带数量和/或LMW条带数量的改变。在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中改变导致在制备中呈现出的LMW条带与HMW条带的比率的改变。
如与未改变的前肽，即野生型前肽关联的脂肪酶，或不与前肽关联的脂肪酶相比，与前肽变体关联的脂肪酶，可能在如通过例如温度稳定性测定(TSA)测量的热稳定性，Tm(℃)和/或不同热变性温度Td(℃)方面有变化。在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中该改变导致脂肪酶热稳定性的变化。该改变可能会是热稳定性的增加抑或热稳定性的减小。
为进一步增强如所述改变根据本发明所述的脂肪酶的前肽的效果，可能会在脂肪酶的成熟蛋白中引入另外的变化。甚至仅在脂肪酶的成熟蛋白中作出改变也是足够的。RmL的结构分析表明，与前肽的脂肪酶接触区相互作用的脂肪酶的成熟蛋白中的某些前肽接触区的存在。
脂肪酶中的前肽接触区可以选自对应于SEQ ID NO:3的位置89-94、101-103、105、119-120、123-124、127、156、158-165、178、182-183、186-187、190、201-202、204、206-213、216、223-225、239-242、和246-255的任一位置。
在一些方面，本发明涉及一种编码脂肪酶的多核苷酸，包括编码脂肪酶的前肽的第一多核苷酸，该第一多核苷酸可操作地连接至编码脂肪酶的成熟蛋白的第二多核苷酸上，其中编码的前肽和编码脂肪酶的成熟蛋白的多核苷酸二者都在一个或多个位置上包括改变，其中该改变独立地为取代、插入或缺失。
在一些方面，本发明涉及一种编码脂肪酶的多核苷酸，包括编码脂肪酶的前肽的第一多核苷酸，该第一多核苷酸可操作地连接至编码脂肪酶的成熟蛋白的第二多核苷酸上，其中脂肪酶的编码的成熟蛋白在一个或多个位置上包括改变，其中该改变独立地为取代、插入或缺失。
在一些方面，本发明涉及多核苷酸，其中该改变增强了脂肪酶的编码的成熟区的生产。
核酸构建体
本发明还涉及包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
在细菌宿主细胞中，适合指导本发明的核酸构建体转录的启动子的实例是获得自以下各项的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖斯(Agaisse)和里瑞克拉斯(Lereclus)，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因)69:301-315)，天蓝链霉菌琼脂酶基因(dagA)、和原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡玛诺夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊75:3727-3731)、连同tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。另外的启动子描述于“来自重组细菌的有用蛋白(Useful proteins from recombinant bacteria)”，吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)，242:74-94；以及萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2tpi启动子(修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的优选终止子是从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，同上，描述了酵母宿主细胞的其他有用的终止子。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是前导序列，对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’端。在宿主细胞中起作用的任何前导子都可以使用。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
酵母宿主细胞的适合的前导子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3磷酸去氢酶(ADH2/GAP)。
该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的一个信号的一种序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。
该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。该多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，该编码序列的5’末端可以包含对于该编码序列来说是外来的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增加变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，同上，描述了其他有用的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于变体的N末端处的前肽的一个前肽编码序列。在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。在原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他例子是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包括编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。
细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可以根据披露于WO 00/24883中的方法来完成。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通技术人员而言是熟知的(参见，例如萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在重组产生一个变体中有用的任何细胞，例如一个原核细胞或一个真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括，但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括，但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟球菌属、假单胞菌属、沙门菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌的细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌的细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属的细胞，包括但不限于似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种的细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不局限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌细胞中可以通过以下方式实现：原生质体转化(参看例如，常(Chang)和柯汗(Cohen)，1979，分子和普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参看例如，杨(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志81:823-829，或杜布诺(Dubnau)和达维多夫-阿博森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志56:209-221)、电穿孔(参看例如，茂川(Shigekawa)和道维(Dower)，1988，生物技术6:742-751)或结合法(参看例如，科勒(Koehler)和斯奥姆(Thome)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见，例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(Folia Microbiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见，例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见，例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。可以通过天然感受态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，卡特(Catt)和卓林克(Jollick)，1991，微生物(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学65:3800-3804)或者共轭(参见，例如，克利威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)实现DNA到链球菌细胞中的引入。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在将来可能有变化，出于本发明的目的，酵母应如酵母生物学和活动性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会(Soc.App.Bacteriol.Symposium)系列第9期，1980)所述地进行定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或亚罗酵母属细胞，例如乳酸克鲁弗酵母、卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酶母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母、或亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞菌属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、白腐菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属的细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉菌、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊81:1470-1474、以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods inEnzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。
产生方法
本发明涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合于该变体的表达的条件下培养本发明的一种宿主细胞；和(b)回收所得变体。
所述宿主细胞使用本领域已知的方法在适合于产生所述变体的营养培养基中培养。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在适合的营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。
使用本领域已知的对这些变体特异的方法可以检测该变体。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定该变体的活性(例如实例中所述的那些测定)。
变体可以通过本领域已知的方法回收。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。
可以通过本领域已知的多种程序来纯化该变体，以获得基本上纯的变体，这些程序包括，但不局限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、有差别的溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如蛋白纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的来源。
出于成本-效益的目的，脂肪酶的生产可以优化，而导致脂肪酶蛋白质的高产量。然而，所有存在的脂肪酶蛋白质并不总是有活性的，和/或在组合物中足够稳定从而保持活性。在脂肪酶的一些制备中，活性蛋白质的产量非常低，并且这限制了这种脂肪酶在工业规模上的应用。已经开发了一种方法，由此具有增加的脂肪分解活性的脂肪酶制剂可以通过改变编码前肽的多核苷酸中的一个或多个核苷酸来产生。在该制剂中，可以鉴定出至少两种形式的脂肪酶：活性形式和无活性形式。不幸的是，大多数该脂肪酶是无活性形式。因此，改变这一平衡，并且鉴定一种方法，由此让大多数脂肪酶处于活性形式会是希望的。本发明的方法已经示出，生成具有增加量的活性形式的脂肪酶的脂肪酶制剂。
本发明涉及用于产生具有有增加的脂肪分解活性的脂肪酶制剂的方法，包括改变多核苷酸中的一个或多个核苷酸的步骤，该多核苷酸包括编码前肽的第一多核苷酸，该第一多核苷酸可操作地连接至编码脂肪酶的第二多核苷酸上，其中在第一多核苷酸中作出一个或多个核苷酸的改变，并且该改变独立地导致编码的前肽氨基酸序列中的取代、插入或缺失。
如上所述，前肽可以被分成由相应的多核苷酸区编码的不同脂肪酶接触区。
在一些方面，本发明涉及方法，其中一个或多个核苷酸的改变选自编码前肽氨基酸的任一核苷酸，该前肽氨基酸包括在一个脂肪酶接触区中。
在一些方面，本发明涉及方法，其中该脂肪酶接触区是选自对应于SEQ ID NO:2的残基-57至-46、-38至-26和-22至-8的氨基酸的任一主要脂肪酶接触区，其条件是该改变不是对应于SEQ ID NO:2的S-24F的取代。
在一些方面，本发明涉及方法，其中该脂肪酶接触区是选自对应于SEQ ID NO:2的残基-70至-58、-49至-39、-27至-25和-14至-1的氨基酸的任一第二脂肪酶接触区。
在一些方面，本发明涉及方法，其中这些主要脂肪酶接触区中的一个或多个与SEQID NO:2的序列一致性是至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。
在一些方面，本发明涉及方法，其中如与用不包括改变一个或多个核苷酸的步骤的相同方法产生的制剂相比，所述制剂具有LMW脂肪酶与HMW脂肪酶的增加的比率。
在一些方面，本发明涉及方法，其中如与不包括改变一个或多个核苷酸的步骤的相同方法产生的制剂相比，所述制剂包括具有更低的Tm(℃)和/或更低的Td(℃)的脂肪酶。
用本发明的方法制备的脂肪酶在洗涤剂组合物中已经示出活性，并且洗涤性能已经在实例中展示。在一些方面，本发明涉及用于制备洗涤剂组合物的方法，该洗涤剂组合物包括如所述根据本发明的方法获得的脂肪酶制剂。在一些方面，本发明涉及用于制备洗涤剂组合物的方法，该洗涤剂组合物包括通过用于产生具有增加的脂肪酶分解活性的脂肪酶制剂的方法制备的脂肪酶，该方法包括改变多核苷酸中的一个或多个核苷酸的步骤，该多核苷酸包括编码前肽的第一多核苷酸，该第一多核苷酸可操作地连接至编码脂肪酶的第二多核苷酸上，其中在第一多核苷酸中作出一个或多个核苷酸的改变，并且该改变独立地导致编码的前肽氨基酸序列中的取代、插入或缺失。
根据该方法制备的脂肪酶可以在与洗涤剂和/或蛋白酶接触时活化或再活化。在一些方面，本发明涉及用于增加根据本方法制备的脂肪酶的活性的方法，包括将所述脂肪酶与蛋白酶和/或洗涤剂接触的步骤。
在一些方面，本发明涉及如上所述由第一多核苷酸编码的分离的前肽变体。在一些方面，本发明涉及分离的前肽变体用于修饰脂肪酶的用途。参考涉及脂肪酶变体(12937)和用于修饰脂肪酶的方法(12961)的共同提交的专利申请，将其通过引用而结合在此。在一些方面，本发明涉及用于修饰脂肪酶的方法，包括使脂肪酶与分离的前肽变体接触的步骤。修饰的脂肪酶会具有改变的特性，例如像增加的活性、减少的活性、增加的稳定性、减少的稳定性连同在以上段落“改进的特性”中描述的其他的特性。该脂肪酶可以是如在专利申请12937中披露的脂肪酶变体。
洗涤剂
下文阐述的洗涤剂组合物组分的非限制性列表适合用于这些洗涤剂组合物中，并且在此的方法可以合宜地并入本发明的某些实施例中，例如用以辅助或增强清洁性能，用于处理有待清洁的底物，或用以在与香料、着色剂、染料或类似物一起的情况下修饰该组合物的美感。掺入任何组合物中的任何此类组分的水平是除了先前引用的用于掺入的任何材料之外的。这些另外的组分的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在其中使用组合物的清洁操作的性质。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。
除非另外表明，以百分比计的量是按该组合物的重量计(wt％)。适合的组分材料包括但不限于表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、分散剂、酶、以及酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、调色染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物软化剂、载体、助水溶物、加工助剂、溶剂和/或颜料。除了以下披露，此类其他组分的适合实例以及使用水平发现于US 5576282、US 6306812、和US 6326348中，通过引用将这些文献特此结合。
因此，在某些实施例中，本发明不包含以下附属材料的一种或多种：表面活性剂、皂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、分散剂、另外的酶、酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物软化剂、载体、助水溶物、加工助剂、溶剂和/或颜料。然而，当一种或多种组分存在时，这样的一种或多种组分可以是如下文详述地存在的：
表面活性剂-根据本发明的组合物可以包括表面活性剂或表面活性剂系统，其中该表面活性剂可以选自非离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂、及其混合物。当存在时，表面活性剂典型地以从0.1wt％至60wt％、从0,2wt％到40wt％、从0,5wt％至30wt％、从1wt％至50wt％、从1wt％至40wt％、从1wt％至30wt％、从1wt％至20wt％、从3wt％至10wt％、从3wt％至5wt％、从5wt％至40wt％、从5wt％至30wt％、从5wt％至15wt％、从3wt％至20wt％、从3wt％至10wt％、从8wt％至12wt％、从10wt％至12wt％或从20wt％至25wt％的水平存在。
适合的阴离子去污表面活性剂包括硫酸盐和磺酸盐去污表面活性剂。
适合的磺酸盐去污表面活性剂包括烷基苯磺酸盐，在一方面为C10-13烷基苯磺酸盐。可以通过磺化可商购的直链烷基苯(LAB)获得适合的烷基苯磺酸盐(LAS)，适合的LAB包括低碳2-苯基LAB，如或其他适合LAB包括高碳2-苯基LAB，如适合的阴离子去污表面活性剂是通过DETAL催化工艺获得的烷基苯磺酸盐，但其他合成途径(如HF)也可以是适合的。在一方面，使用LAS的镁盐。
适合的硫酸盐去污表面活性剂包括烷基硫酸盐，在一方面，为C8-18烷基硫酸盐，或主要为C12烷基硫酸盐。
另外的适合的硫酸盐去污表面活性剂是烷基烷氧基化硫酸盐，在一方面为烷基乙氧基化硫酸盐，在一方面为C8-18烷基烷氧基化硫酸盐，在另一方面为C8-18烷基乙氧基化硫酸盐，典型地烷基烷氧基化硫酸盐具有从0.5至20或从0.5至10的平均烷氧基化度，典型地烷基烷氧基化硫酸盐是C8-18烷基乙氧基化硫酸盐，具有0.5至10、从0.5至7、从0.5至5或从0.5至3的平均乙氧基化度。
烷基硫酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐和烷基苯磺酸盐可以是直链或支链的、取代或未取代的。
去污表面活性剂可以是中链分支的去污表面活性剂，在一方面为中链分支的阴离子去污表面活性剂，在一方面为中链分支的烷基硫酸盐和/或中链分支的烷基苯磺酸盐，例如中链分支的烷基硫酸盐。在一方面，中链分支是C1-4烷基，典型地为甲基和/或乙基。
阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地说是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
适合的非离子去污表面活性剂选自下组，该组由以下各项组成：C8-C18烷基乙氧基化物，如C6-C12烷基苯酚烷氧基化物，其中该烷氧基化物单元可以是乙烯氧基单元，丙烯氧基单元或其混合物；C12-C18醇和C6-C12烷基苯酚与环氧乙烷/环氧丙烷嵌段聚合物的缩合物，如普朗尼克 C14-C22中链分支的醇；C14-C22中链分支的烷基烷氧基化物，典型地具有从1至30的平均烷氧基化度；烷基多糖，在一方面为烷基多糖苷；多羟基脂肪酸酰胺；醚封端的聚(烷氧基化)醇表面活性剂；及其混合物。
适合的非离子去污表面活性剂包括烷基多糖苷和/或烷基烷氧基化醇。
在一方面，非离子去污表面活性剂包括烷基烷氧基化醇，在一方面为C8-18烷基烷氧基化醇，例如C8-18烷基乙氧基化醇，该烷基烷氧基化醇可以具有从1至50、从1至30、从1至20、或从1至10的平均烷氧基化度。在一方面，烷基烷氧基化醇可以是C8-18烷基乙氧基化醇，具有从1至10、从1至7，更多是从1至5或从3至7的平均乙氧基化度。烷基烷氧基化醇可以是直链或支链的、以及取代或未取代的。适合的非离子表面活性剂包括
非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品，及其组合。
适合的阳离子去污表面活性剂包括烷基吡啶鎓化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三锍化合物、及其混合物。
适合的阳离子去污表面活性剂是具有以下通式的季铵化合物：(R)(R1)(R2)(R3)N+X-，其中R是直链或支链的、取代或未取代的C6-18烷基或烯基部分，R1和R2独立地选自甲基或乙基部分，R3是羟基、羟甲基或羟乙基部分，X是提供电荷中性的阴离子，适合的阴离子包括卤化物，例如氯化物；硫酸盐；以及磺酸盐。适合的阳离子去污表面活性剂是单-C6-18烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。高度合适的阳离子去污表面活性剂是单-C8-10烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物、单-C10-12烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物以及单-C10烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。
阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、酯季铵及其组合。
适合的两性表面活性剂/兼性离子表面活性剂包括氧化胺和甜菜碱(如烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱)、或其组合。本发明的胺中和的阴离子表面活性剂-阴离子表面活性剂以及附属的阴离子共表面活性剂可以按酸形式存在，并且所述酸形式可以被中和以形成希望用于本发明洗涤剂组合物的表面活性剂盐。典型的用于中和的试剂包括金属反离子碱，例如氢氧化物，如NaOH或KOH。用于中和本发明的阴离子表面活性剂和处于其酸形式的附属阴离子表面活性剂或共表面活性剂的另外优选的试剂包括氨、胺、或烷醇胺。优选烷醇胺。适合的非限制性实例包括单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、以及其他本领域中已知的直链或支链的烷醇胺；例如，高度优选的烷醇胺包括2-氨基-1-丙醇、1-氨基丙醇、单异丙醇胺、或1-氨基-3-丙醇。胺中和可以进行到完全或部分的程度，例如，阴离子表面活性剂混合物的部分可以被钠或钾中和，并且阴离子表面活性剂混合物的部分可以被胺或烷醇胺中和。
半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，如烷基二甲胺氧化物
包含一种或多种阴离子表面活性剂以及另外一种或多种非离子表面活性剂、并可任选地与另外的表面活性剂例如阳离子表面活性剂的混合物的表面活性剂系统可以是优选的。优选的阴离子与非离子表面活性剂的重量比是至少2:1、或至少1:1至1:10。
皂-在此的组合物可以包含皂。不受理论的限制，可令人希望的是包括皂，因为它部分充当表面活性剂并且部分充当助洗剂，并且可用于抑制泡沫，并且此外，可以有利地与组合物的多种阳离子化合物相互作用以增强用本发明组合物处理的纺织品织物的柔软性。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何皂。在一个实施例中，这些组合物包含从0wt％至20wt％、从0.5wt％至20wt％、从4wt％至10wt％、或从4wt％至7wt％的皂。
在此有用的皂的实例包括油酸皂、棕榈酸皂、棕榈仁脂肪酸皂、及其混合物。典型的皂处于具有不同链长和取代度的脂肪酸皂混合物的形式。一种这样的混合物是拔顶棕榈仁脂肪酸。
在一个实施例中，该皂选自游离脂肪酸。合适的脂肪酸是饱和和/或不饱和的并且可以从天然来源如植物或动物酯(例如，棕榈仁油、棕榈油、椰子油、巴巴苏油、红花油、妥尔油、蓖麻油、牛油和鱼油、油脂、及其混合物)中获得，或合成地制备(例如，经由石油的氧化或者经由费托法(Fisher Tropsch process)氢化一氧化碳)。
用于在本发明的组合物中使用的适合的饱和脂肪酸的实例包括发酸(capricacid)、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸和山萮酸。适合的不饱和脂肪酸种类包括：棕榈油酸、油酸、亚麻油酸、亚麻酸和蓖麻油酸。优选的脂肪酸的实例是饱和Cn脂肪酸、饱和Ci2-Ci4脂肪酸、和饱和或不饱和的Cn至Ci8脂肪酸、及其混合物。
当存在时，织物软化阳离子辅助表面活性剂与脂肪酸的重量比优选地是从约1:3至约3:1，更优选地从约1:1.5至约1.5:1，最优选地约1:1。
在此的皂和非皂阴离子表面活性剂的水平是以酸式基础指定的按洗涤剂组合物的重量计的百分比。然而，正如本领域中通常理解的，在实践中使用钠、钾或链烷醇铵碱如氢氧化钠或单乙醇胺中和阴离子表面活性剂和皂。
助水溶剂–本发明的组合物可以包括一种或多种助水溶剂。助水溶剂是如下化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)(2007)的综述，胶体&界面科学新见(Current Opinion in Colloid&InterfaceScience)，12:121-128。助水溶剂并不显示临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多助水溶物显示连续类型的聚集过程，其中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包括极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高粘度。
洗涤剂可以包含从0至10wt％，如从0至5wt％、0.5wt％至5wt％、或从3wt％至5wt％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。
助洗剂-本发明的组合物可以包括一种或多种助洗剂、共助洗剂、助洗剂系统或其混合物。当使用助洗剂时，清洁组合物将典型地包括从0至65wt％、至少1wt％、从2wt％至60wt％或从5wt％至10wt％的助洗剂。在洗涤餐具清洁组合物中，助洗剂的水平典型地是40wt％至65wt％或50wt％至65wt％。该组合物可以是基本上不含助洗剂；基本上不含意思为“没有有意添加的”沸石和/或磷酸盐。典型的沸石助洗剂包括沸石A、沸石P和沸石MAP。典型的磷酸盐助洗剂是三聚磷酸钠。
助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螫合剂。可以使用本领域中已知用于在洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐(如三磷酸钠(STP或STPP))、碳酸盐(如碳酸钠)、可溶性硅酸盐(如偏硅酸钠)、层状硅酸盐(例如，来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺(如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚胺基二乙醇(DEA)和2,2’,2”-次氨基三乙醇(TEA))、以及羧甲基菊粉(CMI)、以及其组合。
清洁组合物可以单独地包括共助洗剂，或与助洗剂，例如沸石助洗剂组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N、N-二乙酸(SLDA)、氨基乙磺酸-N、N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
螯合剂和晶体生长抑制剂-在此的组合物可以包含螯合剂和/或晶体生长抑制剂。适合的分子包括铜、离子和/或锰螯合剂及其混合物。适合的分子包括DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、HEDP(羟基乙烷二膦酸)、DTPMP(二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸))、1,2-二羟基苯-3,5-二磺酸二钠盐氢氧化物、乙二胺、二亚乙基三胺、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、亚乙基二胺四丙酸(EDTP)、羧甲基菊粉以及2-膦羧基丁烷1,2,4-三羧酸(AM)及其衍生物。典型地，该组合物可以包括从0.005wt％至15wt％或从3.0wt％至10wt％的螯合剂或晶体生长抑制剂。
漂白组分-适合用于掺入本发明的方法和组合物中的漂白组分包括多于一种漂白组分中的一种或混合物。适合的漂白组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸及其混合物。通常，当使用漂白组分时，本发明的组合物可以包括从0至30wt％、从0.00001wt％至90wt％、0.0001wt％至50wt％、从0.001wt％至25wt％或从1wt％至20wt％。适合的漂白组分的实例包括：
(1)预形成的过酸：适合的预形成的过酸包括但不限于选自下组的化合物，该组由预先形成的过氧酸或其盐组成，典型地是过氧羧酸或其盐或过氧硫酸或其盐。
预形成的过氧酸或其盐优选是过氧羧酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：
其中：R14选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R14基团可以是直链或支链的、取代或未取代的；并且Y是达到电荷中性的任何适合的反离子，优选地Y选自氢、钠或钾。优选地，R14是直链的或支链的、取代的或未取代的C6-9烷基。优选地，过氧酸或其盐选自过氧己酸、过氧庚酸、过氧辛酸、过氧壬酸、过氧癸酸、其任何盐、或其任何组合。特别优选的过氧酸是邻苯二甲酰亚胺基-过氧基-链烷酸，特别是ε-邻苯二甲酰亚胺基过氧基己酸(PAP)。优选地，过氧酸或其盐具有处于从30℃至60℃的范围内的熔点。
预形成的过氧酸或其盐还可以是一种过氧硫酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：
其中：R15选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R15基团可以是直链或支链的、取代或未取代的；且Z是达到电荷中性的任何合适的反离子，优选地，Z选自氢、钠或钾。优选地，R15是直链的或支链的、取代的或未取代的C6-9烷基。优选地，此类漂白组分可以按从0.01wt％至50wt％或从0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。
(2)过氧化氢源包括例如无机过氧化氢合物盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是一水合物或四水合物)，过碳酸盐，过硫酸盐，过磷酸盐，过硅酸盐的钠盐及其混合物。在本发明的一个方面，无机过氧化氢合物盐是例如选自下组的那些，该组由以下各项组成：过硼酸盐、过碳酸盐的钠盐及其混合物。当使用时，无机过氧化氢合物盐典型地以整体组合物的0.05wt％至40wt％或1wt％至30wt％的量存在并且典型地被掺入此类组合物中作为可以被包衣的结晶固体。适合的包衣包括：无机盐，例如碱金属硅酸盐、碳酸盐或硼酸盐或其混合物，或有机材料，例如水溶性或水分散性聚合物、蜡、油或脂肪皂。优选地，此类漂白组分可以按0.01wt％至50wt％或0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。
(3)术语漂白活化剂在此意指与过氧化氢反应以经由过水解反应形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的漂白活化剂是具有R-(C＝O)-L的那些，其中R是烷基基团(优选是支链的)，当该漂白活化剂是疏水的时候，具有从6个至14个碳原子或从8个至12个碳原子，并且当该漂白活化剂是亲水的时，具有小于6个碳原子或小于4个碳原子；并且L为离去基团。适合的离去基团的实例是苯甲酸及其衍生物-尤其是苯磺酸盐。适合的漂白活化剂包括十二酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS或DOBA)、4-(壬酰基氧基)苯-1-磺酸盐(NOBS)、和/或披露于WO 98/17767中的那些。漂白活化剂的家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，例如6-(邻苯二甲酰亚胺基)过氧己酸(PAP)。适合的漂白活化剂还披露于WO 98/17767中。尽管可以使用任何适合的漂白活化剂，但是在本发明的一个方面，主题清洁组合物可以包括NOBS、TAED或其混合物。当存在时，基于织物及家居护理组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以0.1wt％至60wt％、0.5wt％至40wt％或0.6wt％至10wt％的量存在于组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。优选地，此类漂白组分可以按0.01wt％至50wt％或0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。
可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或甚至2:1至10:1。
(4)二酰基过氧化物-优选的二酰基过氧化物漂白种类包括选自具有以下通式的二酰基过氧化物的那些：R1-C(O)-OO-(O)C-R2，其中R1表示C6-C18烷基，优选地是包含具有至少5个碳原子的直链并且任选地包含一个或多个取代基(例如-N+(CH3)3、-COOH或-CN)和/或一个或多个在烷基的相邻碳原子之间插入的中断部分(例如-CONH-或-CH＝CH-)的C6-C12烷基基团，并且R2表示与过氧化物部分可相容的脂肪族基团，以使得R1和R2一起包含总共8个至30个碳原子。在一个优选方面，R1和R2是直链的未取代的C6-C12烷基链。最优选地，R1和R2是相同的。二酰基过氧化物(其中R1和R2均是C6-C12烷基基团)是特别优选的。优选地，R基团(R1或R2)中的至少一者、最优选地仅有一者在α位不包含分枝的或下垂的环，或优选在α位或β位都不包含分枝的或下垂的环，或最优选在α位或β位或γ位都不包含分枝的或下垂的环。在一个进一步优选的实施例中，DAP可以是不对称的，以使得优选地R1酰基基团的水解是迅速的以产生过酸，但是R2酰基基团的水解是缓慢的。
四酰基过氧化物漂白种类优选选自具有以下通式的四酰基过氧化物：R3-C(O)-OO-C(O)-(CH2)n-C(O)-OO-C(O)-R3，其中R3表示C1-C9烷基，或C3-C7基团，并且n表示从2至12或4至10(包括端值)的整数。
优选地，二酰基和/或四酰基过氧化物漂白种类以足够提供按重量计至少0.5ppm、至少10ppm、或至少50ppm的洗涤液的量存在。在一个优选实施例中，这些漂白种类以足够提供按重量计从0.5ppm至300ppm、从30ppm至150ppm的洗涤液的量存在。
优选地，漂白组分包括漂白催化剂(5和6)。
(5)优选的是有机(非金属)漂白催化剂，包括能够接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子并且将该氧原子转移至可氧化的底物的漂白催化剂。适用的漂白催化剂包括但不限于：亚胺盐阳离子和聚离子；亚胺两性离子；改性的胺；改性的氧化胺；N-磺酰基亚胺；N-磷酰基亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮及其混合物。
适合的亚胺鎓阳离子及聚离子包括但不限于，N-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓四氟硼酸盐，如四面体(Tetrahedron)(1992)，49(2)，423-38所述的进行制备(例如化合物4，第433页)；N-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓对-甲苯磺酸盐，如US 5360569所述的进行制备(例如第11栏，实例1)；以及正辛基-3,4-二氢异喹啉鎓对-甲苯磺酸盐，如US 5360568所述的进行制备(例如第10栏，实例3)。
适合的亚胺鎓兼性离子包括但不限于，N-(3-磺丙基)-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如US 5576282所述的进行制备(例如第31栏，实例II)；N-[2-(磺氧基)十二烷基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如US 5817614所述的进行制备(例如，第32栏，实例V)；2-[3-[(2-乙基己基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如WO 05/047264所述的进行制备(例如，第18页，实例8)，以及2-[3-[(2-丁基辛基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐。
适宜的改性胺氧转移催化剂包括但不限于1,2,3,4-四氢-2-甲基-1-异喹啉醇，其可依照描述于四面体通讯(Tetrahedron Letters)(1987)，28(48)，6061-6064中的方法制备。适合的改性氧化胺氧传递催化剂包括但不限于1-羟基-N-氧基-N-[2-(磺氧基)癸基]-1,2,3,4-四氢异喹啉钠。
适合的N-磺酰基亚胺氧传递催化剂包括但不限于根据有机化学杂志(Journal ofOrganic Chemistry)(1990)，55(4)，1254-61中描述的程序制备的3-甲基-1,2-苯并异噻唑1,1-二氧化物。
适宜的N-膦酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于[R-(E)]-N-[(2-氯-5-硝基苯基)亚甲基]-对苯基-对-(2,4,6-三甲基苯基)次膦酸酰胺，其可依照描述于化学学会杂志，化学通讯(Journal of the Chemical Society，Chemical Communications)(1994)，(22)，2569-70中的方法制备。
适合的N-酰基亚胺氧传递催化剂包括但不限于可以根据波兰化学杂志(PolishJournal of Chemistry)(2003)，77(5)，577-590中描述的程序制造的[N(E)]-N-(苯基亚甲基)乙酰胺。
适合的噻二唑二氧化物氧传递催化剂包括但不限于可以根据US 5753599(第9栏，实例2)中所述的程序制造的3-甲基-4-苯基-1,2,5-噻二唑1,1-二氧化物。
适宜的全氟亚胺氧转移催化剂包括但不限于(Z)-2,2,3,3,4,4,4-七氟-N-(壬氟丁基)丁酰亚胺氟化物，其可依照四面体通讯(Tetrahedron Letters)(1994)，35(34)，6329-30中所述的方法制备。
适合的环状糖酮氧传递催化剂包括但不限于如在US 6649085(第12栏，实例1)中制备的1,2:4,5-二-O-异亚丙基-D-赤-2,3-己二酮(hexodiuro)-2,6-吡喃糖。
优选地，所述漂白催化剂包含亚胺鎓和/或羰基官能团，并且通常能够在接受氧原子，尤其是从过氧酸和/或其盐接受氧原子后形成过氧亚胺正离子(oxaziridinium)和/或双环氧乙烷官能团。优选地，漂白催化剂包括过氧亚胺正离子官能团和/或在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成过氧亚胺正离子官能团。优选地，漂白催化剂包括环状亚胺鎓官能团，优选其中该环状部分具有从五个至八个原子(包括氮原子)、优选六个原子的环尺寸。优选地，漂白催化剂包括芳基亚胺鎓官能团，优选二环芳基亚胺官能团，优选是3,4-二氢异喹啉鎓官能团。典型地，亚胺官能团是季亚胺官能团并且典型地在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成季过氧亚胺正离子官能团。在另一方面，该洗涤剂组合物包括具有不大于0、不大于-0.5、不大于-1.0、不大于-1.5、不大于-2.0、不大于-2.5、不大于-3.0、或不大于-3.5的logPo/w的漂白组分。下面更加详细地描述用于确定logPo/w的方法。
典型地，漂白成分能够产生具有从0.01至0.30、从0.05至0.25或从0.10至0.20的XSO的漂白种类。下面更加详细地描述用于确定XSO的方法。例如，具有异喹啉鎓结构的漂白成分能够产生具有过氧亚胺正离子结构的漂白种类。在这一实例中，XSO是过氧亚胺正离子漂白种类的XSO。
优选地，漂白催化剂具有对应于以下化学式的化学结构：
其中：n和m独立地是从0至4，优选n和m均是0；每个R1独立地选自取代的或未取代的选自下组的基团，该组由以下各项组成：氢、烷基、环烷基、芳基、稠合芳基、杂环、稠合杂环、硝基、卤基、氰基、磺酸根、烷氧基、酮基、羧基以及烷氧羰基；并且任何两个连位的R1取代基可以合并以形成稠合芳基、稠合碳环或稠合杂环；每个R2独立地选自取代的或未取代的独立地选自下组的基团，该组由以下各项组成：氢、羟基、烷基、环烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、亚烷基、杂环、烷氧基、芳基羰基、羧基烷基以及酰胺基团；任何R2可以与任何其他的R2结合在一起以形成常见环的一部分；任何偕R2可以合并以形成羰基；并且任何两个R2可以合并以形成取代的或未取代的稠合的不饱和部分；R3是C1至C20取代的或未取代的烷基；R4是氢或Qt-A部分，其中：Q是分支或未分支的烯烃，t＝0或1，并且A是选自下组的阴离子基团，该组由以下各项组成：OSO3 -、SO3 -、CO2 -、OCO2 -、OPO3 2-、OPO3H-和OPO2 -；R5是氢或-CR11R12-Y-Gb-Yc-[(CR9R10)y-O]k-R8部分，其中：每个Y独立地选自下组，该组由以下各项组成：O、S、N-H、或N-R8；并且每个R8独立地选自下组，该组由以下各项组成：烷基、芳基和杂芳基，所述部分是取代或未取代的，并且无论是取代的还是未取代的，所述部分具有少于21个碳；每个G独立地选自下组，该组由以下各项组成：CO、SO2、SO、PO和PO2；R9和R10独立地选自下组，该组由以下各项组成：H和C1-C4烷基；R11和R12独立地选自下组，该组由以下各项组成：H和烷基，或者当放一起时可以结合形成羰基；b＝0或1；c可以＝0或1，但是如果b＝0，c必须＝0；y是从1至6的整数；k是从0至20的整数；R6是H，或是烷基、芳基或杂芳基部分；所述部分是取代或未取代的；并且X，如果存在的话，是适合的电荷平衡反离子，优选地当R4是氢时，X是存在的，适合的X包括但不限于：氯化物、溴化物、硫酸盐、甲氧硫酸盐(methosulphate)、磺酸盐、对甲苯磺酸盐、硼四氟化物以及磷酸盐。
在本发明的一个实施例中，漂白催化剂具有对应于以下通式的结构：
其中R13是包含从三个至24个碳原子(包括分支的碳原子)的支链烷基或包含从一个至24个碳原子的直链烷基；优选地，R13是包含从八个至18个碳原子的支链烷基或包含从八个至十八个碳原子的直链烷基；优选地，R13选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三基和异-十五烷基；优选地，R13选自下组，该组由以下各项组成：2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、异-十三基和异-十五烷基。
优选地，除了漂白催化剂、特别是有机漂白催化剂以外，漂白组分还包括过酸源。过酸源可以选自(a)预形成的过酸；(b)过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐(过氧化氢源)，优选与一种漂白活化剂组合；和(c)过水解酶以及酯，用于在纺织品或硬表面处理步骤中在水的存在下原位形成过酸。
当存在时，基于该组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以从0.1wt％至60wt％、从0.5wt％至40wt％或从0.6wt％至10wt％的量存在于组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。
可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或2:1至10:1。
(6)包含金属的漂白催化剂-可以由催化金属络合物提供漂白组分。一种类型的包含金属的漂白催化剂是以下催化系统，该催化系统包括一种具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，一种具有很少或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，以及一种对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的隔离物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐。此类催化剂披露于US 4430243中。优选的催化剂描述于WO 09/839406、US 6218351和WO00/012667中。特别优选的是过渡金属催化剂或因此作为跨桥(cross-bridged)多齿N-供体配体的配体。
如果希望的话，可以借助锰化合物催化在此的组合物。此类化合物以及使用水平在本领域中是熟知的并且包括例如披露于US 5576282中的基于锰的催化剂。
在此有用的钴漂白催化剂是已知的并且例如描述于US 5597936；US 5595967中。通过已知的程序可容易地制备此类钴催化剂，例如像US 5597936和US 5595967中传授的程序。
在此的组合物还可以适合地包括配体的过渡金属络合物，例如双哌啶酮(bispidone)(US 7501389)和/或大多环刚性配体-缩写为“MRL”。作为一个实际问题而并不作为限制之用，可以调整在此的组合物和方法，以在水性洗涤介质中提供大约至少一亿分之一的活性MRL种类，并且将典型地在洗涤液中提供从0.005ppm至25ppm、从0.05ppm至10ppm、或从0.1ppm至5ppm的MRL。
即成的过渡金属漂白催化剂中的适合的过渡金属包括例如锰、铁和铬。适合的MRL包括5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂二环[6.6.2]十六烷。通过已知的程序可容易地制备适合的过渡金属MRL，例如像US 6225464和WO 00/32601中传授的程序。
(7)光漂白剂-适合的光漂白剂包括例如磺化的酞菁锌、磺化的酞菁铝、呫吨染料及其混合物。用于在本发明的这些组合物中使用的优选漂白组分包括过氧化氢源、漂白活化剂和/或有机过氧酸，任选地通过过氧化氢源和漂白活化剂与漂白催化剂相组合的反应而原位产生。优选的漂白组分包括漂白催化剂，优选以上所述的有机漂白催化剂。
特别优选的漂白组分是漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂。
示例性漂白系统还描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO 2007/087242中。
织物调色剂-该组合物可以包括织物调色剂。适合的织物调色剂包括染料、染料-粘土轭合物、以及颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由以下各项组成：属于以下比色指数(C.I.)分类的染料：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物。
在另一方面，适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由以下各项组成：比色指数(染工和着色师学会(Society of Dyers and Colorists)，布拉德福德，英国)编号直接紫9、直接紫35、直接紫48、直接紫51、直接紫66、直接紫99、直接蓝1、直接蓝71、直接蓝80、直接蓝279、酸性红17、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性紫15、酸性紫17、酸性紫24、酸性紫43、酸性红52、酸性紫49、酸性紫50、酸性蓝15、酸性蓝17、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝40、酸性蓝45、酸性蓝75、酸性蓝80、酸性蓝83、酸性蓝90和酸性蓝113、酸性黑1、碱性紫1、碱性紫3、碱性紫4、碱性紫10、碱性紫35、碱性蓝3、碱性蓝16、碱性蓝22、碱性蓝47、碱性蓝66、碱性蓝75、碱性蓝159及其混合物。在另一方面，适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由以下各项组成：比色指数(染工和着色师学会，布拉德福德，英国)编号酸性紫17、酸性紫43、酸性红52、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝45、酸性蓝113、酸性黑1、直接蓝1、直接蓝71、直接紫51及其混合物。在另一方面，适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由以下各项组成：比色指数(染工和着色师学会，布拉德福德，英国)编号酸性紫17、直接蓝71、直接紫51、直接蓝1、酸性红88、酸性红150、酸性蓝29、酸性蓝113或其混合物。
适合的聚合物染料包括选自下组的聚合物染料，该组由以下各项组成：包含轭合色原体的聚合物(染料-聚合物轭合物)以及与色原体共聚合进聚合物主链中的聚合物，及其混合物。
在另一方面，适合的聚合物染料包括选自下组的聚合物染料，该组由以下各项组成：在(美利肯(Milliken))名称之下的织物实质性着色剂，从至少一种反应性染料和选自下组的聚合物形成的染料-聚合物轭合物，该组由以下各项组成：包含选自由羟基部分、一级胺部分、二级胺部分、硫醇部分及其混合物组成的组的部分的聚合物。在再另一方面，适合的聚合物染料包括选自下组的聚合物染料，该组由以下各项组成：紫色CT，与活性蓝、活性紫或活性红染料轭合的羧甲基纤维素(CMC)，如与C.I.反应性蓝19(由麦格酶(Megazyme)，威克洛，爱尔兰，以产品名AZO-CM-CELLULOSE，产品代码S-ACMC下售卖)轭合的CMC、烷氧基化的三苯基-甲烷聚合物着色剂，烷氧基化的噻吩聚合物着色剂、及其混合物。
优选的调色染料包括发现于WO 08/87497中的增白剂。这些增白剂可以由以下结构(I)表征：
其中R1和R2可以独立地选自：
a)[(CH2CR'HO)x(CH2CR"HO)yH]
其中R’选自下组，该组由以下各项组成：H、CH3、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中R”选自下组，该组由以下各项组成：H、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5；
b)R1＝烷基、芳基或芳基烷基，并且R2＝[(CH2CR'HO)x(CH2CR"HO)yH]
其中R’选自下组，该组由以下各项组成：H、CH3、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中R”选自下组，该组由以下各项组成：H、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中x+y≤10；其中y≥1；并且其中z＝0至5；
c)R1＝[CH2CH2(OR3)CH2OR4]并且R2＝[CH2CH2(O R3)CH2O R4]
其中R3选自下组，该组由以下各项组成：H、(CH2CH2O)zH、及其混合物；并且其中z＝0至10；
其中R4选自下组，该组由以下各项组成：(C1-C16)烷基、芳基基团、及其混合物；和
(d)其中R1和R2可以独立地选自氧化苯乙烯、缩水甘油甲醚、异丁基缩水甘油醚、异丙基缩水甘油醚、叔丁基缩水甘油醚、2-乙基己基缩水甘油醚、以及缩水甘油十六烷基醚的氨基加成产物，随后为从1至10个环氧烷单位的加成。
本发明的优选增白剂可以由以下结构(II)表征：
其中R’选自下组，该组由以下各项组成：H、CH3、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中R”选自下组，该组由以下各项组成：H、CH2O(CH2CH2O)zH、及其混合物；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5。
本发明的另外优选的增白剂可以由以下结构(III)表征：
典型地包括具有一共5个EO基团的混合物。适合的优选分子是处于结构I的具有以下上文中“部分a”中的侧基的那些。
表A：
R1 R2
R’ R” x y R’ R” x y
a H H 3 1 H H 0 1
b H H 2 1 H H 1 1
c＝b H H 1 1 H H 2 1
d＝a H H 0 1 H H 3 1
另外的使用的增白剂包括描述于US 2008/34511(联合利华(Unilever))中的那些。优选的试剂是“紫色13”。
适合的染料粘土轭合物包括选自下组的染料粘土轭合物，该组包括至少一种阳离子/碱性染料和绿土、及其混合物。在另一方面，适合的染料粘土轭合物包括选自下组的染料粘土轭合物，该组由阳离子/碱性染料和粘土组成，该阳离子/碱性染料选自下组，该组由以下各项组成：C.I.碱性黄1至108、C.I.碱性橙1至69、C.I.碱性红1至118、C.I.碱性紫1至51、C.I.碱性蓝1至164、C.I.碱性绿1至14、C.I.碱性棕色1至23、CI碱性黑1至11，并且该粘土选自下组，该组由以下各项组成：蒙脱石粘土、水辉石粘土、皂石粘土及其混合物。在再另一方面，适合的染料粘土轭合物包括选自下组的染料粘土轭合物，该组由以下各项组成：蒙脱石碱性蓝B7C.I.42595轭合物、蒙脱石碱性蓝B9C.I.52015轭合物、蒙脱石碱性紫V3C.I.42555轭合物、蒙脱石碱性绿G1C.I.42040轭合物、蒙脱石碱性红R1C.I.45160轭合物、蒙脱石C.I.碱性黑2轭合物、水辉石碱性蓝B7C.I.42595轭合物、水辉石碱性蓝B9C.I.52015轭合物、水辉石碱性紫V3C.I.42555轭合物、水辉石碱性绿G1C.I.42040轭合物、水辉石碱性红R1C.I.45160轭合物、水辉石C.I.碱性黑2轭合物、皂石碱性蓝B7C.I.42595轭合物、皂石碱性蓝B9C.I.52015轭合物、皂石碱性紫V3C.I.42555轭合物、皂石碱性绿G1C.I.42040轭合物、皂石碱性红R1C.I.45160轭合物、皂石C.I.碱性黑2轭合物及其混合物。
适合的颜料包括选自下组的颜料，该组由以下各项组成：黄士酮、阴丹酮、包含1至4个氯原子的含氯阴丹酮、皮蒽酮、二氯皮蒽酮、单溴二氯皮蒽酮、二溴二氯皮蒽酮、四溴皮蒽酮、二萘嵌苯-3,4,9,10-四羧酸二酰亚胺(其中该酰亚胺基团可以是未取代的或被C1-C3-烷基或苯基或杂环基团取代的，并且其中该苯基和杂环基团可以另外地带有不赋予在水中的溶解性的取代基)、蒽素嘧啶羧酸酰胺、蒽酮紫、异蒽酮紫、二噁嗪颜料、每个分子可以包含高达2个氯原子的酞菁铜、多氯-酞菁铜或每个分子包含高达14个溴原子的多溴氯-酞菁铜，及其混合物。
在另一方面，适合的颜料包括选自下组的颜料，该组由以下各项组成：群青(C.I.颜料蓝29)、群青紫(C.I.颜料紫15)及其混合物。
上述织物调色剂可以组合使用(可以使用织物调色剂的任何混合物)。适合的调色剂更详细地描述于US 7208459中。染料在本发明的组合物中的优选水平是0.00001wt％至0.5wt％、或0.0001wt％至0.25wt％。优选在水中用于处理和/或清洁步骤的染料的浓度是从1ppb至5ppm、10ppb至5ppm或20ppb至5ppm。在优选的组合物中，表面活性剂的浓度将是从0.2至3g/l。
胶囊化物-该组合物可以包含胶囊化物。在一方面，胶囊化物包括一个核心，具有内表面和外表面的包壳，所述包壳胶囊化所述核心。
在所述胶囊化物的一个方面，所述核心可以包括一种选自下组的材料，该组由以下各项组成：香料；增亮剂；染料；驱虫剂；硅酮；蜡；调味剂；维生素；织物软化剂；护肤剂，在一个方面是石蜡；酶；抗菌剂；漂白剂；感受剂(sensate)；及其混合物；并且所述包壳可以包括一种选自下组的材料，该组由以下各项组成：聚乙烯；聚酰胺；聚乙烯醇，可任选地包含其他共聚单体；聚苯乙烯；聚异戊二烯；聚碳酸酯；聚酯；聚丙烯酸酯；氨基塑料，在一个方面，所述氨基塑料可以包括聚脲、聚氨酯和/或聚脲聚氨酯(polyureaurethane)，在一个方面，所述聚脲可以包括聚氧基亚甲基脲和/或三聚氰胺甲醛；聚烯烃；多糖，在一个方面，所述多糖可以包括海藻酸盐和/或壳聚糖；明胶；虫胶；环氧树脂；乙烯基聚合物水不溶性无机物；硅酮；及其混合物。
在所述胶囊化物的一个方面，所述核心可以包括香料。
在所述胶囊化物的一个方面，所述包壳可以包括三聚氰胺甲醛和/或交联的三聚氰胺甲醛。
在一方面，披露了适合的胶囊化物可以包括核心材料和包壳，所述包壳至少部分地包围所述核心材料。所述胶囊化物的85％或90％可以具有从0.2MPa至10MPa、从0.4MPa至5MPa、从0.6MPa至3.5MPa、或从0.7MPa至3MPa的抗断强度；并且具有从0至30％、从0至20％、或从0至5％的有益试剂泄露。
在一方面，所述胶囊化物的85％或90％可以具有从1至80微米、从5至60微米、从10至50微米、或从15至40微米的粒度。
在一方面，所述胶囊化物的85％或90％可以具有从30至250nm、从80至180nm、或从100至160nm的颗粒壁厚。
在一方面，所述胶囊化物的核心材料可以包括一种选自由香料原材料组成的组的材料，和/或任选地包括一种选自下组的材料，该组由以下各项组成：植物油，包括纯净植物油和/或共混植物油，包括蓖麻油(caster oil)、椰子油、棉籽油、葡萄籽油、油菜籽、大豆油、玉米油、棕榈油、亚麻籽油、红花油、橄榄油、花生油、椰子油、棕榈仁油、蓖麻油(castoroil)、柠檬油及其混合物；植物油的酯，酯，包括己二酸二丁酯、酞酸二丁酯、己二酸丁基苄酯、己二酸辛基苄酯、磷酸三甲苯酯、磷酸三辛酯及其混合物；直链或支链烃，包括具有高于约80℃的沸点的那些直链或支链烃；部分氢化的三联苯、二烷基邻苯二甲酸酯、烷基联苯(包括单异丙基联苯)、烷基化的萘(包括二丙基萘)、石油精(包括煤油)、矿物油及其混合物；芳香族溶剂，包括苯、甲苯及其混合物；硅酮油；及其混合物。
在一方面，所述胶囊化物的壁材料可以包括适合的树脂，该树脂包括醛和胺的反应产物，适合的醛包括甲醛。适合的胺包括三聚氰胺、脲、苯并胍胺、甘脲、及其混合物。适合的三聚氰胺包括羟甲基三聚氰胺、甲基化的羟甲基三聚氰胺、亚氨基三聚氰胺及其混合物。适合的脲包括二羟甲基脲、甲基化的二羟甲基脲、脲-间苯二酚、及其混合物。
在一方面，在将胶囊化物添加至组合物之前、期间或之后，适合的甲醛清除剂可以与例如处于胶囊浆料中的胶囊化物一起使用和/或添加至这种组合物中。适合的胶囊可以通过US 2008/0305982；和/或US 2009/0247449的以下传授来制成。
在一个优选方面，该组合物还可以包括沉积酸，优选由下组组成，该组包括阳离子或非离子聚合物。适合的聚合物包括阳离子淀粉、阳离子羟基乙基纤维素、聚乙烯甲醛、槐树豆胶、甘露聚糖、木葡聚糖、罗望子胶、聚乙烯对苯二酸盐，以及包含二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯的且任选具有一种或多种选自下组的单体的聚合物，该组包括丙烯酸和丙烯酰胺。
香料-在一方面，该组合物包括含有选自下组的一种或多种香料原材料的香料，该组由以下各项组成：1,1'-氧基双-2-丙醇；1,4-环己烷二羧酸，二乙基酯；(乙氧基甲氧基)环十二烷；1,3-壬二醇，单乙酸酯；(3-甲基丁氧基)乙酸，2-丙烯基酯；β-甲基环十二烷乙醇；2-甲基-3-[(1,7,7-三甲基二环[2.2.1]庚-2-基)氧基]-1-丙醇；氧杂环十六-2-酮；α-甲基-苯甲醇乙酸盐；反式-3-乙氧基-1,1,5-三甲基环己烷；4-(1,1-二甲基乙基)环己醇乙酸酯；十二氢-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,1-b]呋喃；β-甲基苯丙醛；β-甲基-3-(1-甲基乙基)苯丙醛；4-苯基-2-丁酮；2-甲基丁酸，乙基酯；苯甲醛；2-甲基丁酸，1-甲基乙基酯；二氢-5-戊基-2(3H)呋喃酮；(2E)-1-(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；十二醛；十一醛；2-乙基-α,α-二甲基苯丙醛；癸醛；α,α-二甲基苯乙醇乙酸酯；2-(苯基亚甲基)辛醛；2-[[3-[4-(1,1-二甲基乙基)苯基]-2-甲基亚丙基]氨基]苯甲酸，甲基酯；1-(2,6,6-三甲基-3-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；2-戊基环戊酮；3-氧代-2-戊基环戊烷乙酸，甲基酯；4-羟基-3-甲氧基苯甲醛；3-乙氧基-4-羟基苯甲醛；2-庚基环戊酮；1-(4-甲基苯基)乙酮；(3E)-4-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮；(3E)-4-(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮；苯乙醇；2H-1-苯并吡喃-2-酮；4-甲氧基苯甲醛；10-十一烯醛；丙酸，苯基甲基酯；β-甲基苯戊醇；1,1-二乙氧基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯；α,α-二甲基苯乙醇；(2E)-1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；乙酸，苯基甲基酯；环己烷丙酸，2-丙烯基酯；己酸，2-丙烯基酯；1,2-二甲氧基-4-(2-丙烯基)苯；1,5-二甲基-二环[3.2.1]辛-8-酮肟；4-(4-羟基-4-甲基戊烷基)-3-环己烯-1-甲醛；3-丁烯-2-醇；2-[[[2,4(或3,5)-二甲基-3-环己烯基-1-基]亚甲基]氨基]苯甲酸，甲基酯；8-环十六-1-酮；甲基紫罗酮；2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇；2-甲氧基-4-(2-丙烯基)苯酚；(2E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇；2-羟基-苯甲酸，(3Z)-3-己烯基酯；2-十三烯腈；4-(2,2-二甲基-6-亚甲基环己基)-3-甲基-3-丁烯-2-酮；四氢-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃；乙酸，(2-甲基丁氧基)-，2-丙烯基酯；苯甲酸，2-羟基-，3-甲基丁基酯；2-丁烯-1-酮，1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-，(Z)-；环戊烷羧酸，2-己基-3-氧代-，甲基酯；苯丙醛，4-乙基-α，α-二甲基-；3-环己烯-1-甲醛，3-(4-羟基-4-甲基戊基)-；乙酮，1-(2,3,4,7,8,8a-六氢-3,6,8,8-四甲基-1H-3a,7-甲醇甘菊蓝-5-基)-，[3R-(3.α.,3a.β.,7.β.,8a.α.)]-；十一醛，2-甲基-2H-吡喃-2-酮，6-丁基四氢-；苯丙醛、4-(1,1-二甲基乙基)-.α.-甲基-；2(3H)-呋喃酮、5-庚基二氢-；苯甲酸，2-[(7-羟基-3，7-二甲基亚辛基)氨基]-、甲基；苯甲酸，2-羟基-，苯基甲基酯；萘，2-甲氧基-；2-环戊烯-1-酮，2-己基-；2(3H)-呋喃酮、5-己基二氢-；氧杂环丙烷羧酸，3-甲基-3-苯基-，乙基酯；2-氧杂二环[2.2.2]辛烷，1,3,3-三甲基-；苯戊醇，.γ.-甲基-；3-辛醇，3,7-二甲基-；3,7-二甲基-2,6-辛二烯腈；3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇；萜品醇乙酸酯；2-甲基-6-亚甲基-7-辛烯-2-醇，二氢衍生物；3a,4,5,6,7,7a-六氢-4,7-甲醇-1H-茚-6-酚丙酸酯；3-甲基-2-丁烯-1-醇乙酸酯；(Z)-3-己烯-1-醇乙酸酯；2-乙基-4-(2,2,3-三甲基-3-环戊烯-1-基)-2-丁烯-1-醇；4-(八氢-4,7-甲醇-5H-亚茚-5-基)-丁醛；3-2,4-二甲基-环己烯-1-甲醛；1-(1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-2,3,8,8-四甲基-2-萘基)-乙酮；2-羟基-苯甲酸，甲基酯；2-羟基-苯甲酸，己基酯；2-苯氧基-乙醇；2-羟基-苯甲酸，戊基酯；2,3-庚烷二酮；2-己烯-1-醇；6-辛烯-2-醇、2,6-二甲基-；突厥酮(α，β，γ或δ或其混合物)，4,7-甲醇-1H-茚-6-酚，3a,4,5,6,7,7a-六氢-，乙酸酯；9-十一烯醛；8-十一烯醛；异环柠檬醛；乙酮，1-(1,2,3,5,6,7,8，8a-八氢-2，3，8,8-四甲基-2-萘基)-；3-环己烯-1-甲醛，3,5-二甲基-；3-环己烯-1-甲醛，2,4-二甲基-；1,6-辛二烯-3-醇，3,7-二甲基-；1,6-辛二烯-3-醇，3,7-二甲基-，乙酸酯；铃兰醛(p-t-Bucinal)，以及环戊酮、2-[2-(4-甲基-3-环己烯-1-基)丙基]-以及1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯及其混合物。
在一方面，该组合物可以包括胶囊化的香料颗粒，该颗粒包含水溶性羟基化合物或三聚氰胺-甲醛或改性的聚乙烯醇。在一方面，胶囊化物包括(a)至少部分水溶的固体基质，包含一种或多种水溶性羟基化合物，优选淀粉；以及(b)由该固体基质包封的香料油。
在另一方面，该香料可以是与多胺(优选聚乙烯亚胺)预复合的，以形成席夫碱(Schiff base)。
聚合物-该组合物可以包括一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯)、马来酸/丙烯酸共聚物、以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
该组合物可以包括一种或多种两亲清洁聚合物，例如具有以下通用结构的化合物：双((C2H5O)(C2H4O)n)(CH3)-N+-CxH2x-N+-(CH3)-双((C2H5O)(C2H4O)n)，其中n＝从20至30，并且x＝从3至8，或其硫酸化的或磺化的变体。
该组合物可以包括两亲烷氧基化油脂清洁聚合物，这些聚合物具有平衡的亲水和疏水特性，使得它们从织物和表面去除油脂颗粒。本发明的两亲烷氧基化油脂清洁聚合物的具体实施例包括一个核心结构和与那个核心结构连接的多个烷氧基化基团。这些可以包括烷氧基化的聚烯属烃亚胺(polyalkylenimine)，优选具有内聚环氧乙烷嵌段和外聚环氧丙烷嵌段。
在此，烷氧基化的聚羧酸酯(例如从聚丙烯酸酯制备的那些)可用于提供另外的油脂去除性能。此类材料描述于WO 91/08281和PCT 90/01815中。化学上地，这些材料包括聚丙烯酸酯，每7-8个丙烯酸脂单位具有一个乙氧基侧链。侧链具有化学式-(CH2CH2O)m(CH2)nCH3，其中m是2-3并且n是6-12。侧链是酯连接至聚丙烯酸酯“主链”，以提供“梳子状”聚合物类型结构。分子量可以不同，但典型地处于2000至50,000的范围内。此类烷氧基化的聚羧酸酯可以包括在此的组合物的从0.05wt％至10wt％。
本发明的类异戊二烯衍生的表面活性剂，以及与其他辅助表面活性剂和其他佐剂成分一起形成的混合物特别适合与两亲接枝共聚物使用，优选地该两亲接枝共聚物包括(i)聚乙二醇主链；以及(ii)和至少一种下垂物部分，选自聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇及其混合物。优选的两亲接枝共聚物是由巴斯夫(BASF)供应的Sokalan HP22。适合的聚合物包括随机接枝共聚物，优选聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，具有聚环氧乙烷主链和多重聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量优选是6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比是40比60，并且每50个环氧乙烷单位有不多于1个接枝点。
羧酸酯聚合物-本发明的组合物还包括一种或多种羧酸酯聚合物，例如马来酸酯/丙烯酸酯随机共聚物或聚丙烯酸酯均聚物。在一方面，该羧酸酯聚合物是具有从4,000Da至9,000Da或从6,000Da至9,000Da的分子量的聚丙烯酸酯均聚物。
污物释放聚合物-本发明的组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些聚合物具有如由以下结构(I)、(II)或(III)之一所定义的结构：
(I)-[(OCHR1-CHR2)a-O-OC-Ar-CO-]d
(II)-[(OCHR3-CHR4)b-O-OC-sAr-CO-]e
(III)-[(OCHR5-CHR6)c-OR7]f
其中：
a、b和c是从1至200；
d、e和f是从1至50；
Ar是1,4-取代的亚苯基；
sAr是1,3-取代的亚苯基，该亚苯基在5位上被SO3Me取代；
Me是Li，K，Mg/2，Ca/2，Al/3，铵，单-、二-、三-、或四烷基铵，其中烷基是C1-C18烷基或C2-C10羟基烷基，或其混合物；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自H或C1-C18正-或异-烷基；并且
R7是直链或支链的C1-C18烷基，或直链或支链的C2-C30烯基，或具有5至9个碳原子的环烷基，或C8-C30芳基，或C6-C30芳基烷基。
适合的去污聚合物是聚酯去污聚合物，例如Repel-o-tex聚合物，包括Repel-o-tex、SF-2和SRP6，由罗地亚(Rhodia)供应。其他适合的去污聚合物包括Texcare聚合物，包括Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325，由科莱恩(Clariant)供应。其他适合的去污聚合物是Marloquest聚合物，例如Marloquest SL，由萨索尔(Sasol)供应。
纤维素聚合物-本发明的组合物还包括一种或多种纤维素聚合物，包括选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧基烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素的那些。在一方面，纤维素聚合物选自下组，该组包括羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素、及其混合物。在一方面，羧甲基纤维素具有从0.5至0.9的羧甲基取代度以及从100,000Da至300,000Da的分子量。
酶-该组合物可以包括提供清洁性能和/或织物护理益处的一种或多种另外的酶。适合的酶的实例包括但不限于半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、黄原胶酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、聚戊糖酶、马拉纳酶(malanase)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、叶绿素酶和淀粉酶、或其混合物。典型的组合是酶混合物，可以包含例如蛋白酶和脂肪酶连同淀粉酶。当存在于组合物中时，前述另外的酶可以按组合物的重量计以从0.00001wt％至2wt％、从0.0001wt％至1wt％或从0.001wt％至0.5wt％酶蛋白的水平存在。
一般而言，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶-适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体。适合的纤维素酶包括来自以下属的纤维素酶：芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢菌属、梭孢壳属、枝顶孢霉属，例如US 4435307、US 5648263、US 5691178、US5776757以及WO 89/09259中披露的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉以及尖孢镰孢菌产生的真菌纤维素酶。
特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的实例是EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397、和WO 98/08940中所述的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，如WO 94/07998、EP 0531315、US 5457046、US5686593、US 5763254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO 99/001544中所述的那些。
其他纤维素酶是具有一种序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与WO 02/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％一致性，或一种家族44木葡聚糖酶，该木葡聚糖酶具有一种序列，该序列与WO 01/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60％一致性。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Carezyme PremiumTM(诺维信公司)、CellucleanTM(诺维信公司)、CellucleanClassicTM(诺维信公司)、CellusoftTM(诺维信公司)、WhitezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM和Puradax HATM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
蛋白酶-适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物起源的那些，例如植物或微生物起源。优选微生物来源的。包括化学修饰的变体或蛋白质工程变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程学(ProteinEngng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是源自芽孢杆菌属的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶迟缓(lentus)、枯草杆菌蛋白酶诺和(Novo)、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢菌蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及衍生自纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。
进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在例如WO95/23221中所述)、及其变体(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际公司(Genencor Int.))中的中性金属蛋白酶，例如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是于以下各项中的变体：WO 92/19729、WO 96/034946、WO98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’编号。更优选地，这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’编号)。
适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：DuralaseTm、DurazymTm、Ultra、Ultra、 Ultra、Ultra、和(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些： PurafectPreferenzTm、PurafectPurafectPurafectEffectenzTm、以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、AxapemTm(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-BrocasesN.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(Henkel AG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
脂肪酶和角质酶-适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如如描述于EP258068和EP 305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO 96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP 331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO 10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO 11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。
其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中的那些。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(最初来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(最初来自吉斯特-博克德斯公司(Gist-Brocades))。
再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。
淀粉酶-可以与本发明的酶/变体/酶共混物一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB 1296839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。
适合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列一致性的变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。
不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
其他适合的淀粉酶是包括示于WO 06/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 06/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。这一杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
适合的另外的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQID NO:6具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7具有90％序列一致性的变体。使用WO 96/023873的SEQ ID 2用于编号，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置，例如181和182、182和183、或位置183和184具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476的一个或多个中具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列一致性或与WO01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQID NO:2具有90％序列一致性的变体。SEQ ID NO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有C-末端的截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。
其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28，R118，N174；R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314；R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的变体，以及另外在选自下组的一个或多个位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。
其他实例是例如描述于WO 2011/098531、WO 2013/001078及WO 2013/001087中的那些淀粉酶变体。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、StainzymeTM、StainzymePlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X及BANTM(来自诺维信公司)，以及RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase及Preferenz S100(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(GenencorInternational Inc./DuPont))。
过氧化物酶/氧化酶-根据本发明所述的适合的过氧化物酶是由如由国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(IUBMB)陈述的酶分类EC 1.11.1.7包括的过氧化物酶，或源自其中的展示出过氧化物酶活性的任何片段。
适合的过氧化物酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的变体或蛋白质工程变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自拟鬼伞属，例如来自灰盖拟鬼伞(C.cinerea)的过氧化物酶(EP 179486)，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、和WO98/15257中描述的那些。
过氧化物酶还包括卤代过氧化物酶，例如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶以及展示出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。根据其对卤素离子的特异性将卤代过氧化物酶加以分类。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化从氯根离子形成次氯酸盐。
在一个实施例中，本发明的卤代过氧化物酶是氯过氧化物酶。优选地，该卤代过氧化物酶是钒卤代过氧化物酶，即含钒酸盐的卤代过氧化物酶。在本发明的优选方法中，将含钒酸盐的卤代过氧化物酶与氯根离子来源组合。
已经从许多不同真菌，特别是从暗色丝孢菌(dematiaceous hyphomycete)真菌组中分离出了卤代过氧化物酶，比如卡尔黑霉属(Caldariomyces)(例如煤卡尔黑霉(C.fumago))、链格孢属、弯孢属(例如疣枝弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis))、内脐蠕孢属、细基格孢属以及葡萄孢属。
还已经从细菌，如假单胞菌属(例如，吡咯假单胞菌(P.pyrrocinia))和链霉菌属(例如，金色链霉菌(S.aureofaciens))中分离出了卤代过氧化物酶。
在一个优选实施例中，该卤代过氧化物酶可源自弯孢属，特别是疣枝弯孢(Curvularia verruculosa)和不等弯孢，例如如描述于WO 95/27046中的不等弯孢CBS102.42或描述于WO 97/04102中的疣枝弯孢CBS 147.63或疣枝弯孢CBS 444.70；或可源自如描述于WO 01/79459中的Drechslera hartlebii，如描述于WO 01/79458中的盐沼小树状霉(Dendryphiella salina)、如描述于WO 01/79461中的Phaeotrichoconis crotalarie或如描述于WO 01/79460中的Geniculosporium sp.。
根据本发明的氧化酶具体包括由酶分类EC 1.10.3.2囊括的任何漆酶或源自其中的展示出漆酶活性的片段、或展示出类似活性的化合物，例如儿茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)。
优选的漆酶是微生物来源的酶。这些酶可以源自植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。
来自真菌适合的实例包括源自以下项的菌株的漆酶：曲霉属(Aspergillus)，脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(N.crassa)，柄孢壳属(Podospora)，葡萄孢属(Botrytis)，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属(Lentinus)，侧耳属(Pleurotus)，栓菌属(Trametes)，例如，长绒毛栓菌和变色栓菌，丝核菌属(Rhizoctonia)，例如，立枯丝核菌(R.solani)，鬼伞属(Coprinus)，例如，灰盖鬼伞(C.cinereus)、毛头鬼伞(C.comatus)、费赖斯鬼伞(C.friesii)、和褶纹鬼伞(C.plicatilis)，小脆柄菇属(Psathyrella)，例如，P.condelleana，斑褶菇属(Panaeolus)，例如，蝶形斑褶菇(P.papilionaceus)，毁丝霉属(Myceliophthora)，例如，嗜热毁丝霉(M.thermophila)，柱顶孢属(Schytalidium)，例如，S.thermophilum，多孔菌属(Polyporus)，例如，匹斯特斯多孔菌(P.pinsitus)，射脉菌属(Phlebia)，例如，射脉菌(P.radita)(WO 92/01046)，或拟革盖菌属(Coriolus)，例如，毛革盖菌(C.hirsutus)(JP 2238885)。
来自细菌的适合实例包括可源自芽孢杆菌属的菌株的漆酶。
优选的是源自拟鬼伞属或毁丝霉属的漆酶；特别是源自灰盖拟鬼伞的漆酶，如披露于WO 97/08325中；或源自嗜热毁丝霉，如披露于WO 95/33836中。
其他优选的酶包括在商标名下售卖的果胶裂解酶，以及在商标名下售卖的甘露聚糖酶(诺维信公司)，以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))。
该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等，优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。
非尘颗粒可以例如如US 4106991和US 4661452中所披露来制造，并且可以任选地通过本领域中已知的方法来涂布。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚(ethoxylated nonylphenol)；具有15至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪族醇，其中醇含有12至20个碳原子；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单-和双-和三甘油酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238216中披露的方法来制备。
染料转移抑制剂-本发明的组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于组合物中时，染料转移抑制剂可以按从0.0001wt％至10wt％、从0.01wt％至5wt％或从0.1wt％至3wt％的水平存在。
增亮剂-本发明的组合物还可包含另外的组分,这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增亮剂。
该组合物可以包括C.I.荧光增亮剂260，处于具有以下结构的α-晶体形式：
在一方面，增亮剂是冷水可溶增亮剂，例如处于α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260。在一方面，增亮剂主要处于α-晶体形式，这意味着典型地至少50wt％、至少75wt％、至少90wt％、至少99wt％、或甚至基本上全部的C.I.荧光增亮剂260是处于α-晶体形式。
增亮剂典型地是处于微粒化微粒形式，具有从3至30微米、从3微米至20微米、或从3至10微米的加权平均初级粒度。
该组合物可以包括处于β-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260，并且(i)处于α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260与(ii)处于β-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260的重量比可以是至少0.1或至少0.6。BE 680847涉及用于制得处于α-晶体形式的C.I.荧光增亮剂260的方法。
可以用于本发明中的商业光学增亮剂可以划分为多个亚组，这些亚组包括但不是必须限制于：二苯乙烯、吡唑啉、香豆素、羧酸、次甲基菁、二苯并噻吩-5,5-二氧化物、唑、5和6元环杂环的衍生物以及其他混杂剂。此类增亮剂的实例披露于“荧光增亮剂的生产和应用”，M.佐赫劳德尼克(Zahradnik)，由约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约(1982)出版。可以用于本发明组合物的光学增亮剂的具体非限制性实例是在US 4790856和US3646015中鉴定的那些。
另外适合的增亮剂具有以下结构：
适合的荧光增亮剂水平包括从0.01wt％、从0.05wt％、从0.1wt％或从0.2wt％的较低水平至0.5wt％或0.75wt％的较高水平。
在一方面，增亮剂可以装载在粘土上以形成颗粒。硅酸盐-本发明的组合物还可以包含硅酸盐，例如硅酸钠或硅酸钾。该组合物可以包括从0wt％至小于10wt％硅酸盐，至9wt％、或至8wt％、或至7wt％、或至6wt％、或至5wt％、或至4wt％、或至3wt％、或甚至至2wt％，并且从高于0wt％、或从0.5wt％、或从1wt％的硅酸盐。适合的硅酸盐是硅酸钠。
分散剂-本发明的组合物还可以包含分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。
酶稳定剂-用于在组合物中使用的酶可以通过各种技术来稳定。在此使用的酶可以通过钙和/或镁离子的水溶性来源的存在来稳定。常规稳定剂的实例是，例如多元醇，如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制该组合物。在包含蛋白酶的水性组合物的情况下，可以添加可逆蛋白酶抑制剂，例如包括硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸及其衍生物的硼化合物，或例如甲酸钙、甲酸钠和1,2-丙二醇的化合物，以进一步改进稳定性。
溶剂-适合的溶剂包括水和其他溶剂，例如亲脂性流体。适合的亲脂性流体的实例包括硅氧烷、其他硅酮、烃、乙二醇醚、甘油衍生物(例如甘油醚)、全氟化的胺、全氟化的和氢氟醚溶剂、低挥发性非氟化的有机溶剂、二醇溶剂、其他环境友好型溶剂及其混合物。
结构化剂/增稠剂-结构化液体可以从内部结构化，由此结构由初级成分(例如，表面活性剂材料)形成，和/或通过使用次级成分(例如，聚合物、粘土和/或硅酸盐材料)提供三维基质结构而从外部结构化。该组合物可以包括从0.01wt％至5wt％、或从0.1wt％至2.0wt％的结构化剂。该结构化剂典型地选自下组，该组由以下各项组成：甘油二酯和甘油三酯、硬脂酸乙二醇双酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、微纤维纤维素、疏水改性的碱性可膨胀的乳液(例如Polygel W30(3VSigma))、生物聚合物，黄原胶、吉兰糖胶、及其混合物。适合的结构化剂包括氢化的蓖麻油及其非乙氧基化的衍生物。适合的结构化剂披露于US6855680中。此类结构化剂具有螺纹样结构化系统，该系统具有一系列纵横比。其他适合的结构化剂和用于制得它们的方法描述于WO 10/034736中。
调节剂-本发明的组合物可以包括高熔点脂肪化合物。在此有用的高熔点脂肪化合物具有25℃或更高的熔点，并且选自下组，该组由以下各项组成：脂肪醇、脂肪酸、脂肪醇衍生物、脂肪酸衍生物、及其混合物。此类具有低熔点的化合物并非旨在被包括在此部分中。高熔点化合物的非限制性实例发现于国际化妆品成分词典，第五版，1993，以及CTFA化妆品成分手册，第二版，1992中。
鉴于提供改进的调节益处(如在施用至湿发的过程中的湿滑感、柔和以及对干发的保湿感)，高熔点脂肪化合物被以从0.1wt％至40wt％、从1wt％至30wt％、从1.5wt％至16wt％、从1.5wt％至8wt％的水平包括在该组合物中。
本发明的组合物可以包含阳离子聚合物。在组合物中阳离子聚合物的浓度典型地范围为从0.05wt％至3wt％、从0.075wt％至2.0wt％、或从0.1wt％至1.0wt％。在预期使用该组合物的pH下，适合的阳离子聚合物将具有至少0.5meq/gm、至少0.9meq/gm、至少1.2meq/gm、至少1.5meq/gm、或小于7meq/gm、以及小于5meq/gm的阳离子电荷密度，该pH的范围将大体上是从pH 3至pH 9、或在pH 4与pH 8之间。在此，聚合物的“阳离子电荷密度”是指聚合物上的正电荷数目与聚合物的分子量之比。此类适合的阳离子聚合物的平均分子量将大体上是在10,000与1000万之间、在50,000与500万之间、或在100,000与300万之间。
用于在本发明的组合物中使用的适合的阳离子聚合物包含阳离子含氮部分，例如季铵或阳离子质子化的氨基部分。可以将任何阴离子反离子与阳离子聚合物关联使用，只要聚合物保持溶解于水中、组合物中、或组合物的凝聚相中，并且只要反离子在物理和化学上与组合物的主要成分相容或以另外的方式不会不适当地损害组合物性能、稳定性或美感。此类反离子的非限制性实例包括卤化物(例如，氯化物、氟化物、溴化物、碘化物)、硫酸盐和甲基硫酸盐。
此类聚合物的非限制性实例描述于CTFA化妆品成分词典，第三版，埃斯特林(Estrin)、克罗斯利(Crosley)、和海恩斯(Haynes)编写(化妆品、化妆用具以及香水联合公司(The Cosmetic,Toiletry,and Fragrance Association,Inc.)，华盛顿(1982))。
用于在该组合物中使用的其他适合的阳离子聚合物包括多糖聚合物，阳离子瓜尔豆胶衍生物，含四价氮的纤维素醚，合成聚合物，醚化纤维素、瓜尔豆胶和淀粉的共聚物。当使用的时候，在此的阳离子聚合物可溶解于组合物中或可溶解于组合物中的复合凝聚相中，该凝聚相是由上文所述的阳离子聚合物和阴离子、两性和/或兼性离子表面活性剂组分形成。阳离子聚合物的复合凝聚物还可以与组合物中其他带电荷的材料形成。适合的阳离子聚合物描述于US 3962418；US 3958581；和US 2007/0207109中。
本发明的组合物可以包括作为调节剂的非离子聚合物。在此具有大于1000的分子量的聚二醇(polyalkylene glycol)是有用的。具有以下通式的那些是有用的：
其中R95选自下组，该组由以下各项组成：H、甲基及其混合物。调节剂，并且特别是硅酮，可以被包括在组合物中。用于本发明的组合物中的调节剂典型地包括形成乳化液体颗粒的水不溶性、水分散性、非挥发性的液体。用于在该组合物中使用的适合的调节剂是通常表征为以下项的那些调节剂：硅酮(例如，硅酮油、阳离子硅酮、硅酮胶、高折射性硅酮、以及硅酮树脂)、有机调节油(例如，烃油、聚烯烃、以及脂肪酯)或其组合，或者以另外方式在于此的水性表面活性剂基质中形成液体分散颗粒的那些调节剂。此类调节剂应该在物理和化学上是与组合物的主要组分相容的，并且不应该以另外的方式不适当地损害组合物稳定性、美感或性能。
在组合物中调节剂的浓度应该足以提供所希望的调节益处。这种浓度可以随着调节剂、所希望的调节性能、调节剂颗粒的平均大小、其他组分的类型和浓度以及其他类似因素而变化。
硅酮调节剂的浓度范围典型地是从0.01wt％至10wt％。适合的硅酮调节剂以及对于硅酮的任选的悬浮剂的非限制性实例描述于美国再公告专利号34,584；US 5104646；US5106609；US 4152416；US 2826551；US 3964500；US 4364837；US 6607717；US 6482969；US5807956；US 5981681；US 6207782；US 7465439；US 7041767；US 7217777；US 2007/0286837 A1；US 2005/0048549 A1；US 2007/0041929 A1；GB 849433；DE 10036533中，将所有文献通过引用结合于此；硅酮的化学与技术(Chemistry and Technology ofSilicones)，纽约：学术出版社(1968)；通用电气硅酮橡胶产品数据列表SE 30、SE 33、SE54和SE 76；硅酮化合物(Silicon Compounds)，彼特拉克系统公司(Petrarch Systems,Inc.)(1984)；以及聚合物科学与工程化百科全书(Encyclopedia of Polymer Scienceand Engineering)，第15卷，第2版，第204-308页，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.)(1989)中。
本发明的组合物还可以包括从0.05wt％至3wt％的至少一种有机调节油作为调节剂，单独或与其他调节剂例如硅酮(在此所述的)组合。适合的调节油包括烃油、聚烯烃、以及脂肪酯。还适合用于在此的组合物中的是在US 5674478和US 5750122或在US 4529586；US 4507280；US 4663158；US 4197865；US 4217914；US 4381919；以及US 4422853中所描述的调节剂。
卫生学与恶味-本发明的组合物还可以包括蓖麻酸锌、百里酚、季铵盐(例如)、聚乙烯亚胺(例如来自巴斯夫的)及其锌复合物、银和银化合物(尤其是被设计为缓慢释放Ag+或纳米银分散体的那些)中的一种或多种。
益生素-这些组合物可以包括益生素，如描述于WO 09/043709中的那些。
增泡剂-如果高的起泡是希望的，增泡剂(例如C10-C16烷醇酰胺或C10-C14烷基硫酸酯)可以典型地以1wt％至10wt％的水平掺入组合物中。C10-C14单乙醇和二乙醇酰胺阐述了此类增泡剂的典型的类别。此类增泡剂与高的起泡佐剂表面活性剂(例如，以上提及的氧化胺、甜菜碱、以及磺基甜菜碱(sultaine))一起使用也是有利的。如果希望的话，水溶性镁和/或钙盐(例如MgCl2、MgSO4、CaCl2、CaSO4等)可以典型地以0.1wt％至2wt％的水平添加，以提供另外的泡沫并且以增强油脂去除性能。
泡沫抑制剂-用于减少或抑制泡沫形成的化合物可以掺入本发明的组合物中。泡沫抑制在如在US 4489455和US 4489574中描述的所谓“高浓度清洁工艺”中以及在前载式(front-loading-style)洗涤机中可能是特别重要的。多种多样的材料可以用作泡沫抑制剂，并且泡沫抑制剂对于本领域的技术人员而言是熟知的。参见，例如柯克·奥思默化工百科全书(Kirk Othmer Encyclopedia of Chemical Technology)，第三版，第7卷，第430-447页(约翰威利父子公司，1979)。泡沫抑制剂的实例包括单羧基脂肪酸以及其中的可溶盐，高分子量烃例如石蜡，脂肪酸酯(例如，脂肪酸甘油三酯)，单价醇的脂肪酸酯，脂肪族C18-C40酮(例如硬脂酮)，N-烷基化的氨基三嗪，优选具有约100℃之下的熔点的蜡烃，硅酮泡沫抑制剂，以及二级醇。泡沫抑制剂描述于US 2954347；US 4265779；US 4265779；US3455839；US 3933672；US 4652392；US 4978471；US 4983316；US 5288431；US 4639489；US4749740；US 4798679；US 4075118；EP 89307851.9；EP 150872；以及DOS 2,124,526中。
对于有待用于自动洗衣机中的任何洗涤剂组合物，泡沫不应该形成到它们溢出洗涤机的程度。当使用时，泡沫抑制剂优选是以“泡沫抑制量”存在的。“泡沫抑制量”意指组合物的配制者可以选择这种泡沫控制剂的量，这个量将充分地控制泡沫以导致用于自动洗衣机中的低起泡衣物洗涤剂。
在此的组合物将通常包括从0至10wt％的泡沫抑制剂。当用作泡沫抑制剂时，单羧基脂肪酸以及其中的盐将典型地以高至5wt％的量存在。优选地，使用从0.5wt％至3wt％的脂肪单羧酸酯泡沫抑制剂。典型地以高至2.0wt％的量使用硅酮泡沫抑制剂，虽然可以使用更高的量。通常以从0.1wt％至2wt％的范围的量使用单硬脂酰磷酸酯泡沫抑制剂。典型地以从0.01wt％至5wt％的范围的量使用烃泡沫抑制剂，虽然可以使用更高的水平。典型地以0.2wt％至3wt％使用醇泡沫抑制剂。
在此的组合物可以在宽的pH范围内具有清洁活性。在某些实施例中，这些组合物具有从pH 4至pH 11.5的清洁活性。在其他实施例中，这些组合物从pH 6至pH 11、从pH 7至pH 11、从pH 8至pH 11、从pH 9至pH 11、或从pH 10至pH 11,5具有活性。
在此的组合物可以在宽范围的温度(例如从10℃或更低至90℃)内具有清洁活性。优选地，该温度将低于50℃或40℃或甚至30℃。在某些实施例中，对于这些组合物来说的最适温度范围是从10℃至20℃、从15℃至25℃、从15℃至30℃、从20℃至30℃、从25℃至35℃、从30℃至40℃、从35℃至45℃、或从40℃至50℃。
洗涤剂组合物的形式
在此描述的洗涤剂组合物被有利地用在例如私人家庭的衣物洗涤应用中连同在工业清洁和机构清洁中。本发明的组合物具体是固体或液体清洁和/或处理组合物。在一方面，本发明涉及一种组合物，其中该组合物的形式选自下组，该组由以下各项组成：一种常规的，压缩的或浓缩的液体；一种凝胶；一种膏；一种皂条；一种常规的或压缩的粉末；一种粒状固体；一种具有两个或更多个层(相同或不同相)的均匀或多层片剂；一种具有一个或多个室的袋；一种单个或多个室单位剂型；或其任何组合。
该组合物的形式可以将多个室(例如像可水溶的袋)中或片剂的不同层中的组分物理地彼此分离。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为具有袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，该共混组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSolLLC公司销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与包括固体的室不同(US 2009/0011970 A1)。
脂肪酶颗粒
包含在本发明的水溶性膜中的脂肪酶变体可以存在为脂肪酶颗粒。这些脂肪酶颗粒可以甚至包含一种或多种另外的酶，如以下所述。
脂肪酶颗粒是处于固体微粒形式的脂肪酶变体的任何形式。脂肪酶颗粒可以是脂肪酶晶体、脂肪酶沉淀、喷雾或冻干的脂肪酶或任何形式的粒状脂肪酶，为粉末或液体中的悬浮液。典型地，脂肪酶颗粒的粒度，测量为当量球径(基于体积的平均粒度)是低于2mm，优选低于1mm，低于0.5mm，低于0.25mm，或低于0.1mm；并且高于0.05μm，优选高于0.1μm，高于0.5μm，高于1μm，高于5μm或高于10μm。
在一个优选实施例中，脂肪酶颗粒的粒度是从0.5μm至100μm。
脂肪酶颗粒包含至少1％w/w脂肪酶蛋白、优选至少5％w/w脂肪酶蛋白、至少10％w/w脂肪酶蛋白、至少20％w/w脂肪酶蛋白、至少30％w/w脂肪酶蛋白、至少40％w/w脂肪酶蛋白、至少50％w/w脂肪酶蛋白、至少60％w/w脂肪酶蛋白、至少70％w/w脂肪酶蛋白、至少80％w/w脂肪酶蛋白、或至少90％w/w脂肪酶蛋白。
在一个优选实施例中，脂肪酶颗粒是脂肪酶晶体，或脂肪酶蛋白是在晶型上。
可以按如本领域中已知的多种方式进行酶结晶(例如，如描述于WO 91/09943或WO94/22903中)。
脂肪酶可以被配制在如本领域已知的脂肪酶颗粒中，用于固体酶配制品，例如用于减少粉尘、改进稳定性和/或改变酶的释放速率的配制品。脂肪酶颗粒还可以被配制在基质中或涂覆有试剂，这些基质或试剂抑制酶颗粒在用于制备水溶性膜的PVOH/膜溶液中溶解。
脂肪酶颗粒的表面上的脂肪酶分子还可以是交联的，像CLEC(交联酶晶体)或CLEA(交联酶聚集体)。
水溶性膜
水溶性膜、用于其中的任选成分以及制备它们的方法在本领域是众所周知的。在一类实施例中，该水溶性膜包括PVOH。PVOH是一种通常通过醇解(通常被称为水解或皂化)聚乙酸乙烯酯而制备的合成树脂。完全水解的PVOH，其中几乎所有乙酸基已被转化为醇基，是一种仅在热水(高于约140°F(60℃))中溶解的强氢键键合的高度结晶聚合物。如果在聚乙酸乙烯酯水解之后允许剩余足够数目的乙酸基，那么该PVOH聚合物被称作部分水解的，它的氢键键合更弱并且结晶度更低并且在冷水(低于约50°F(10℃))中是可溶的。一种中间冷/热水溶性膜可以包括例如中间部分水解的PVOH(例如，具有约94％至约98％的水解度)，并且仅在温水(例如，在约40℃及以上的温度下快速溶解)中易溶。完全和部分水解的PVOH类型都通常被称为PVOH均聚物，尽管部分水解的类型在技术上是一种乙烯醇-乙酸乙烯酯共聚物。
包含于本披露的水溶性膜中的PVOH的水解度可以是约75％至约99％。当水解度降低时，由树脂制成的膜将具有降低的机械强度但是在约20℃以下的温度下更快的溶解。当水解度增加时，由树脂制成的膜将倾向于机械强度更高并且热成型性将倾向于降低。可以对PVOH的水解度进行选择以使得该树脂的水溶性是温度依赖性的，并且因此由树脂、相容性试剂以及另外的成分制成的膜的溶解度也受到影响。在一类实施例中，该膜是冷水溶性的。一种冷水溶性膜(在低于10℃的温度下可溶于水中)可以包括水解度在约75％至约90％范围内、或在约80％至约90％范围内、或在约85％至约90％范围内的PVOH。在另一类实施例中，该膜是热水溶性的。一种热水溶性膜(在至少约60℃的温度下可溶于水中)可以包括水解度为至少约98％的PVOH。
除了PVOH之外或在PVOH的替代方案中，其他所使用的成膜树脂可包括但不限于改性的聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、水溶性丙烯酸脂共聚物、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、普鲁兰，水溶性天然聚合物包括但不限于瓜尔胶、黄原胶、角叉菜胶、以及淀粉，水溶性聚合物衍生物包括但不限于乙氧基化的淀粉和羟丙基化的淀粉、、聚(丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸钠)、聚马来酸单甲酯、其共聚物以及上述任何项的组合。在一类实施例中，该成膜树脂是一种由乙烯醇、乙酸乙烯酯以及丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸钠组成的三元共聚物。出人意料地，基于乙烯醇、乙酸乙烯酯以及丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸钠的三元共聚物的水溶性膜已经展示出高百分比的酶回收。
水溶性树脂可以按任何合适的量被包括在该水溶性膜中，例如，在约35wt％至约90wt％范围内的量。该水溶性树脂的量与所有酶、酶稳定剂和辅助添加剂的组合量相比的优选重量比可以是任何适合的比率，例如在约0.5至约5、或约1至约3、或约1至约2范围内的比率。
用于在于此描述的膜中使用的水溶性树脂(包括，但不限于PVOH树脂)可以由对于所希望的膜特性而言适合的任何粘度来表征，任选地在约5.0至约30.0cP、或约10.0cP至约25cP范围内的粘度。PVOH树脂的粘度通过使用具有UL适配器的布氏(Brookfield)LV型粘度计来测量新制备的溶液而确定，如在英国标准EN ISO 15023-2:2006附录E布氏测试法中所描述的。在20℃下阐述4％聚乙烯醇水溶液的粘度是国际惯例。在此以cP指定的所有PVOH粘度应被理解为指的是在20℃下4％聚乙烯醇水溶液的粘度，除非另外说明。
本领域中众所周知的是，PVOH树脂的粘度与同一PVOH树脂的重量平均分子量相关，并且该粘度通常被用作的代理。因此，该水溶性树脂的重量平均分子量任选地可以在约35,000至约190,000、或约80,000至约160,000的范围内。该树脂的分子量只需要足以使得它被适宜技术模制形成塑料薄膜即可。
根据本披露的水溶性膜可以例如以适合于其预期目的的量包括其他任选添加剂成分，包括但不限于，增塑剂、表面活性剂、消泡剂、成膜剂、防粘连剂、内脱模剂、抗黄变剂以及其他功能性成分。
水被认为是对于PVOH和其他聚合物而言一种非常有效的增塑剂，然而，水的挥发性使得它的效用受限，因为聚合物膜需要对多种环境条件(包括低的和高的相对湿度)具有至少一些耐受性(稳健性)。甘油的挥发性比水小得多，并且已经被很好地确立为对于PVOH和其他聚合物而言一种有效的增塑剂。如果在膜配制品中所使用的水平太高，甘油或其他这种液态增塑剂它们自身可以引起表面“出汗(sweating)”和油腻。这在膜中可以导致以下问题，例如给消费者的手以不可接受的触感，并且如果没有以一定的方式(例如，表面撒粉)减轻出汗，甚至会将膜阻断在辊上或成堆薄片中。这可以表征为过塑化。然而，如果添加至膜的增塑剂太少，该膜对很多最终用途可能缺乏足够的延展性和柔性，例如被转化成最终使用类型，例如袋。
用于在本披露的水溶性膜中使用的增塑剂包括但不限于山梨醇、甘油、双甘油、丙二醇、乙二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、聚乙二醇(高达400MW)、2-甲基-1,3-丙二醇、乳酸、甘油一乙酸酯、三乙酸甘油酯、柠檬酸三乙酯、1,3-丁二醇、三羟甲基丙烷(TMP)、聚醚三醇及其组合。如上所述，多元醇通常可用作增塑剂。增塑剂使用越少，膜可能变得越脆，而增塑剂使用越多，膜可能失去拉伸强度。增塑剂可以按例如在约25phr至约50phr，或从约30phr至约45phr，或从约32phr至约42phr范围内的量被包括在该水溶性膜中。
用于在水溶性膜中使用的表面活性剂在本领域是众所周知的。任选地，包括表面活性剂以在浇铸时辅助树脂溶液的分散。用于本披露的水溶性膜的适合的表面活性剂包括但不限于二烷基磺基琥珀酸酯、甘油和丙二醇的乳酸化脂肪酸酯、脂肪酸乳酰酯、烷基硫酸钠、聚山梨酯20、聚山梨酯60、聚山梨酯65、聚山梨酯80、烷基聚氧乙烯醚、卵磷脂、甘油和丙二醇的乙酰化脂肪酸酯、月桂基硫酸钠、脂肪酸乙酰化酯、肉豆蔻基二甲基氧化胺、三甲基牛脂烷基氯化铵、季铵化合物、其盐以及上述任何项的组合。因此，表面活性剂可以按例如小于约2phr，例如小于约1phr、或小于约0.5phr的量被包括在该水溶性膜中。
考虑使用的一种类型的辅助成分是消泡剂。消泡剂可以有助于聚结泡沫气泡。用于在根据本披露的水溶性膜中使用的适合的消泡剂包括但不限于疏水性二氧化硅，例如细粒度的二氧化硅或锻制二氧化硅，包括Foam消泡剂(可获得自爱墨瑞得高性能材料公司(Emerald Performance Materials))，包括Foam327、FoamUVD、Foam163、Foam269、Foam338、Foam290、Foam332、Foam349、Foam550以及Foam339，它们是专有非矿物油消泡剂。在实施例中，可以按0.5phr或更少的量使用消泡剂，例如0.05phr、0.04phr、0.03phr、0.02phr或0.01phr。优选地，为了避免应力致白，将避免显著量的二氧化硅。
用于制备水溶性物品(包括膜)的方法包括浇铸、吹塑、挤出或吹制挤出，如本领域中已知的。一类考虑的实施例由在此描述的水溶性膜通过浇铸形成表征，例如通过将在此描述的成分与水混合以产生水性混合物(例如具有任选分散的固体的溶液)，向表面施用该混合物，并且干燥除去水以产生膜。类似地，可通过干燥该混合物，同时将其局限为所希望的形状以形成其他组合物。
在一类考虑的实施例中，通过浇铸水溶性混合物形成该水溶性膜，其中该水溶性混合物根据以下步骤制备：
(a)提供水溶性树脂、水以及任何任选添加剂(排除增塑剂)的一种混合物；
(b)煮沸混合物30分钟；
(c)将混合物在烘箱中在至少40℃的温度下脱气；任选地在40℃至70℃的范围内，例如约65℃；
(d)在65℃或更低的温度下向混合物中添加一种或多种酶、增塑剂以及另外的水；并且
(e)在无涡旋的情况下搅拌混合物，直到混合物的颜色和稠度看起来大体上一致；任选地持续在30分钟至90分钟的范围内的一段时间，任选地至少1小时；并且
(f)在搅拌的时间段之后迅速浇铸混合物(例如，在4小时、或2小时、或1小时内)。
如果过早地将酶添加至混合物(例如，与辅助添加剂或树脂一起)，酶活性可能降低。不旨在受任何具体理论的束缚，据信将具有酶的混合物煮沸导致酶变性并且在溶液中储存延长的时间段同样导致酶活性降低。
在一类实施例中，在中度至温和条件下通过迅速干燥膜使得根据本披露的水溶性膜保持高的酶活性。如在此所用的，迅速干燥是指小于24小时的干燥时间，任选地小于12小时、任选地小于8小时、任选地小于2小时、任选地小于1小时、任选地小于45分钟、任选地小于30分钟、任选地小于20分钟、任选地小于10分钟，例如在约6分钟至约10分钟或8分钟的范围内。如在此所用的，中度至温和条件是指低于170°F(77℃)的干燥温度，任选地在约150°F至约170°F(约66℃至约77℃)的范围内，例如，165°F(74℃)。随着干燥温度增加，酶倾向于越快变性，而随着干燥温度降低，干燥时间增加，由此使酶在延长的时间段内暴露在溶液中。
该膜有用于产生一种包以包含一种组合物，例如，衣物洗涤或餐具洗涤组合物，由此形成一种袋。在此描述的膜还可用于制备一种具有两个或更多个隔室的包，其由相同的膜或者结合其他聚合材料的膜制成。另外的膜可以是例如通过浇铸、吹塑、挤出或吹制挤出相同或者不同的聚合材料而获得的，如本领域中已知的。在一个类型的实施例中，适于用作另外的膜的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧烷、聚丙烯酸、纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺、聚乙酸乙烯酯、聚羧酸和盐、聚氨基酸或肽、聚酰胺、聚丙烯酰胺、马来酸/丙烯酸的共聚物、多糖(包括淀粉和明胶)、天然胶(例如黄原胶和角叉菜胶)。例如，聚合物可以选自聚丙烯酸酯和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯及其组合，或选自聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物和羟丙基甲基纤维素(HPMC)及其组合。
本披露的袋和/或包包括至少一个密封的隔室。因此，这些袋可以包括单个隔室或多个隔室。这些袋可以具有含酶和不含酶的区域。在包括多个隔室的实施例中，每个隔室可以包含相同的和/或不同的组合物。进而，这些组合物可以采取任何适合的形式，包括但不限于，液体、固体及其组合(例如，悬浮在液体中的固体)。在一些实施例中，这些袋包括第一、第二和第三隔室，其中每一个隔室分别包含一种不同的第一、第二和第三组合物。在一些实施例中，如描述于EP 2258820中，这些组合物可以是视觉上不同的。
多隔室袋和/或包的这些隔室可以具有一个或多个相同的或不同的尺寸和/或体积。本发明多隔室袋的这些隔室可以是分开的或以任何适合方式结合的。在一些实施例中，该第二和/或第三和/或随后的隔室叠加在该第一隔室上。在一个实施例中，该第三隔室可以叠加在该第二隔室上，该第二隔室进而以一种夹层构型叠加在该第一隔室上。可替代地，该第二和第三隔室可以叠加在该第一隔室上。然而，还可以同样地设想的是，该第一、第二和任选地第三和随后的隔室可以按并排的关系相互附接。这些隔室可以被包装成一串，每个隔室通过穿孔线是各自地可分开的。因此，每个隔室可以被终端用户从该串的剩余部分单独地撕去。
在一些实施例中，多隔室袋和/或包包括三个隔室，其由一个大的第一隔室和两个较小的隔室组成。较小的第二和第三隔室叠加在大的第一隔室上。对这些隔室的尺寸和几何结构进行选择，以使得此安排是可实现的。这些隔室的几何结构可以是相同或不同的。在一些实施例中，与该第一隔室相比，该第二和任选地第三隔室各自具有一个不同的几何结构和形状。在这些实施例中，该第二和任选地第三隔室以一种设计被安排在该第一隔室上。该设计可以是装饰性的、教导性的、或说明性的，例如以说明一个概念或指导，和/或用于指示该产品的来源。在一些实施例中，该第一隔室是最大的隔室，其具有两个大的围绕周边密封的面，而该第二隔室较小，其覆盖小于约75％、或小于约50％的该第一隔室的一个面的表面积。在存在有一个第三隔室的实施例中，上述结构可以是相同的，但是该第二和第三隔室覆盖小于约60％、或小于约50％、或小于约45％的该第一隔室的一个面的表面积。
本披露的袋和/或包可以包括一种或多种不同的膜。例如，在单个隔室的实施例中，该包可以由一个折叠到其自身上并且在边缘处密封的壁制成，或者可替代地，由两个在边缘处密封在一起壁制成。在多个隔室的实施例中，该包可以由一种或多种膜制成，以使得任何给定的包隔室可以包括由单种膜或具有不同组成的多种膜制成的壁。在一个实施例中，一种多隔室袋包括至少三个壁：一个外上壁；一个外下壁；以及一个分隔壁。该外上壁和该外下壁通常是相对的并且形成该袋的外部。该分隔壁在该袋的内部并且沿着密封线被固定至这些通常相对的外壁。该分隔壁将该多隔室袋的内部分隔成至少一个第一隔室和一个第二隔室。在一类实施例中，该分隔壁可以是唯一含有酶的膜由此最小化消费者暴露在这些酶中。
袋和包可用任何合适的设备和方法制成。例如，单个隔室袋可用本领域公知的立式填充、卧式填充或转鼓填充技术制成。此类工艺可以是连续的或间断的。可以将该膜润湿和/或加热以提高其延展性。该方法还可涉及使用真空以将该膜牵引到一个合适的模具中。将该膜牵引到该模具中的真空可实施约0.2至约5秒、或约0.3至约3、或约0.5至约1.5秒，一旦该膜处在该表面的水平部分上。这种真空可以是这样的，使得它提供例如在10毫巴至1000毫巴的范围内、或在100毫巴至600毫巴的范围内的一个下压。
这些模具(包可以在其中制成)可具有任何形状、长度、宽度和深度，取决于这些袋所需要的维度。这些模具还可以彼此在大小和形状上不同，如果希望的话。例如，最终的袋的体积可以为约5ml至约300ml、或约10至150ml、或约20至约100ml，并且这些模具大小可相应被调整。
在一个实施例中，该包包括一个第一和一个第二密封隔室。通常，该第二隔室与该第一密封隔室处于一种叠加关系，以使得该第二密封隔室和该第一密封隔室共用该袋内部的一个分隔壁。
在一个实施例中，包括一个第一和一个第二隔室的包进一步包括一个第三密封隔室。通常，该第三密封隔室与该第一密封隔室处于一种叠加关系，以使得该第三密封隔室和该第一密封隔室共用该袋内部的一个分隔壁。
在不同实施例中，该第一组合物和该第二组合物选自以下组合之一：液体、液体；液体、粉末；粉末、粉末；以及粉末、液体。
在不同实施例中，该第一、第二和第三组合物选自以下组合之一：固体、液体、液体以及液体、液体、液体。
在一个实施例中，该单个隔室或多个密封隔室包含一种组合物。该多个隔室可以各自包含相同或不同的组合物。该组合物选自一种液体、固体或其组合。
在该方法中，热可以被施加至该膜，通常称为热成型。可以用任何合适的方法施加热。例如，在将该膜供给到表面上之前或一旦在表面上，可以通过使它处于加热元件之下或通过热空气而直接对其加热。可替代地，例如，可以通过加热表面或将一种热物品施加到该膜上而间接对其加热。可以使用红外光加热该膜。该膜可以被加热至至少50℃，例如，约50℃至约150℃、约50℃至约120℃、约60℃至约130℃、约70℃至约120℃或约60至℃约90℃的温度。
可替代地，可以通过任何合适的手段润湿该膜，例如，直接通过将一种润湿剂(包括水、该膜组合物的溶液、用于该膜组合物的增塑剂、或前述项的任何组合)喷雾到该膜上，在将它供给到表面上之前或一旦在表面上，或间接通过润湿表面或通过将一种湿润物品施加到该膜上。
一旦膜已经被加热和/或润湿，可以将它牵引到一个适当的模具中，优选地使用真空。例如，该膜可以按至少约1.5的拉伸比，以及例如，任选地高达2的拉伸比热成型。可以通过使用任何适合的手段完成该模制膜的填充。在一些实施例中，最优选的方法将取决于产品形式和所需要的填充速度。在一些实施例中，通过在线填充技术填充该模制膜。然后通过任何适合的方法，使用第二膜将经填充的开口包封闭，以形成袋。这可以当处于水平位置并且在连续匀速运动中完成。可以通过以下方式完成封闭：连续地将第二膜(优选水溶性膜)供给到这些开口包上方和上面，并且然后优选将第一和第二膜一起密封，典型地在模具之间的区域并且因此在包之间。
可以利用任何适合的密封包和/或其独立隔室的方法。这类手段的非限制性实例包括热密封、溶剂焊接、溶剂密封或液封及其组合。可以在至少200°F(93℃)的温度下将该水溶性包和/或其独立隔室热密封，例如在约220°F(约105℃)至约290°F(约145℃)、或约230°F(约110℃)至约280°F(约140℃)的范围内。典型地，只用热或溶剂处理将形成密封的区域。典型地，可以通过任何方法将热或溶剂施加到封闭材料上，并且典型地，只施加到将形成密封的区域上。如果使用溶剂密封或液封或焊接，可以优选的是同样施加热。优选的液封或溶剂密封/焊接方法包括选择性地将溶剂施加到模具之间的区域或封闭材料上、通过例如将其喷雾或印刷到这些区域上，并且然后施加压力到这些区域上，以形成密封。例如，可以使用如上所述的密封辊和带(任选地也提供热)。
然后，可以通过切割装置将所形成的袋切割。可以使用任何已知方法完成切割。可以优选的是，还可以按连续方式进行切割，并且优选地以恒定的速度并且优选地当处于水平位置时。该切割装置可以是例如一种锋利物品、或一种热物品、或激光，由此，在后者的情况下，该热物品或激光‘烧’穿该膜/密封区域。
多隔室袋的不同隔室可以按并排样式一起制成，其中所得到的连体袋可以通过切割而被分开或可以不被分开。可替代地，这些隔室可以被分开地制成。
在一些实施例中，可以根据一种包括以下步骤的方法制成袋：
a)形成一个第一隔室(如上所述)；
b)在步骤(a)中形成的封闭隔室的一些或全部内形成凹口，以产生一个叠加在该第一隔室之上的第二模制隔室；
c)借助一种第三膜填充并封闭该第二隔室；
d)密封该第一、第二和第三膜；并且
e)切割这些膜，以产生一种多隔室袋。
可以通过向步骤(a)中制备的隔室施加真空来实现步骤(b)中形成的凹口。
在一些实施例中，第二和/或第三隔室可以在分开的步骤中制成，并且然后与该第一隔室结合，如描述于EP 2088187或WO 2009/152031中。
在其他实施例中，可以根据一种包括以下步骤的方法制成袋：
a)任选地使用热和/或真空，在第一成型机上使用第一膜形成一个第一隔室；
b)用第一组合物填充该第一隔室；
c)在第二成型机上，任选地使用热和真空使第二膜变形，以制成一种第二和任选地第三模制隔室；
d)填充该第二和任选地第三隔室；
e)使用第三膜密封该第二和任选地第三隔室；
f)将该密封的第二和任选地第三隔室放到该第一隔室上；
g)密封该第一、第二和任选地第三隔室；并且
h)切割这些膜，以产生一种多隔室袋。
可以基于该第一和第二成型机进行以上方法的适合性对其进行选择。在一些实施例中，该第一成型机优选为一种卧式成型机，而该第二成型机优选为一种转鼓成型机，优选地位于该第一成型机之上。
应当理解的是，通过使用适当的进料站，有可能制造掺入多种不同或独特组合物和/或不同或独特液体、凝胶或糊状组合物的多隔室袋。
实例
材料
除非另外指出，用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。
实例1：变体产生、转化和表达
米黑根毛霉脂肪酶(RmL)基因SEQ ID No:1被克隆到表达载体pENI2516中，并且转化进表达宿主米曲霉ToC1512中。
SEQ ID No:1列出了RmL的核苷酸序列，包括编码以下切割的前原肽(有下划线的部分)的序列：
SEQ ID No:2列出了RmL的氨基酸序列，包括以下切割的前原肽序列(preprosequence)(有下划线的部分)：
SEQ ID No:3列出了RmL成熟蛋白的氨基酸序列：
SEQ ID No:4列出了RmL的前肽的氨基酸序列：
VPIKRQSNST VDSLPPLIPS RTSAPSSSPS TTDPEAPAMS RNGPLPSDVE TKYGMALNATSYPDSVVQAM
RmL WT对照的纯化：RmL WT和RmL WT pur
来自米曲霉培养液的培养上清液在布氏漏斗(产品编号：PW90，J Brand)中使用Seitz过滤器(产品编号：K250，颇尔印度公司(Pall India corporatio))和WHATMAN玻璃过滤器GF/F级(产品编号：1825-25，沃特曼-通用电气(GE)医疗集团(WHATMAN-GEHealthcare))的组合通过真空过滤来澄清，接着在TFF系统(产品编号：56-4101-81，GEHealthcare)上施加大约15psi的跨膜压进行0.2u无菌过滤。
用洗涤缓冲液50mM HEPES、pH 7.0+1M NaCl缓冲液对癸胺柱进行预平衡。将1MNaCl添加至澄清的培养上清液，该培养上清液以271cm/hr的线性流速被施加在癸胺琼脂糖柱(15x200mm，柱床体积25mL)上。然后施加洗涤缓冲液,直至流出物在80nm的OD低于0.1吸光度单位。使用50mM HEPES，pH 7进行洗脱。RmL蛋白质并不结合在癸胺-琼脂上，并且洗脱在流出物部分中。
用洗涤缓冲液50mM HEPES，pH 7.0对UNOQ阴离子交换柱进行预平衡。从癸胺琼脂糖柱上收集的流出物在50mM HEPES，pH 7中经缓冲液交换,并且以271cm/hr的线性流速施加至UNOQ柱(15x200mm、柱床体积25mL)上。用洗涤缓冲液洗涤该柱直至流出物在280nm的OD低于0.1吸光度单位。结合于该柱的RmL使用50mM HEPES，pH 7和1M NaCl进行洗脱。
如实例2中所述的非变性PAGE上的分析示出一条主要高分子量(HMW)条带和一条低分子量(LMW)条带的存在。如实例3中所述的酶谱分析证实了水解活性位于LMW条带中。
RmL对照(RmL WT pur)的更有活性的制剂是在癸胺琼脂糖柱上通过纯化RML WT对照获得。示出LMW条带的存在的这一制剂没有可检测的HMW条带。
前肽变体的产生
以下方法被用于产生变体，这些变体具有涉及在RmL基因中的前肽区域中的一至四个氨基酸的取代、插入或缺失。
基于PCR的定点诱变(SDM)使用具有希望的氨基酸变化(取代/缺失)和20-30个碱基对的单一诱变引物进行。如此设计用于诱变的引物，这样使得突变位于具有足够侧翼残基(9-15个碱基对)的寡核苷酸的中部。在PCR反应中，引物对产生突变单链DNA。然后在37℃下，在PCR机中用DpnI限制性内切酶处理PCR产物6小时。DpnI消化甲基化的或亲本模板DNA，而未被甲基化的新形成的突变DNA链保持完整。然后完整的新合成的单链PCR产物被用于转化感受态大肠杆菌细胞，该细胞合成PCR产物的互补链。
为产生具有长于十个或更多氨基酸的缺失的变体，使用以下方法。
用各自正向引物和反向引物进行PCR以扩增排除缺失的完整质粒DNA。在PCR反应之前，引物已磷酸化来帮助产生的PCR引物更容易地连接进带切口的环状质粒中，然后将质粒在大肠杆菌中转化。
质粒DNA从单个分离的转化体中分离，并发送用于序列分析，这确认所希望的突变的存在。序列确认的质粒DNA在米曲霉ToC1512中通过转化的原生质体方式得到转化。通过在12孔培养板中的2mL表达培养基(M400：50g/L麦芽糊精；2g/L硫酸镁；2g/L磷酸二氢钾；4g/L一水柠檬酸；8g/L酵母提取物；2g/L尿素；0.5ml/L痕量金属(KU6)溶液；和0.5g/L氯化钙)中接种孢子，并在34℃下静置生长4天，其后在SDS-PAGE上分析蛋白表达并随后进行非变性PAGE和酶谱分析，针对小规模的蛋白表达，筛选转化体。然后将表达菌落在COVE-N琼脂斜面上划线，在1L带挡板的摇瓶中的M400培养基中由此进行摇瓶发酵，在34℃，180rpm下持续4天。在SDS-PAGE上分析蛋白表达。一旦确认表达，给出发酵培养液用于蛋白质纯化。
用于PCR反应的聚合酶是Phusion DNA聚合酶(飞酶公司(Finnzymes)，目录号F530L.DpnI来自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，(目录号R0176S))。PCR机来自应用生物系统公司(Applied Biosystems)(型号GeneAmp9700)。使用Sigma GenElute质粒小量制备试剂盒(目录号PLN350-1KT)分离质粒DNA。
实例2：非变性PAGE
通过首先倒入分离胶(4.0mL 30％丙烯酰胺(丙烯酰胺-二-丙烯酰胺溶液)；2.5mL1.5M Tris(pH 8.8)；0.1mL 10％过硫酸铵(APS)；0.004mL四甲基乙二胺(TEMED)；3.3mL水)，随后用丁醇-水覆盖并允许其聚合30-45分钟，来浇注非变性PAGE。洗掉丁醇-水，并且然后将积层凝胶(1.7mL 30％丙烯酰胺(丙烯酰胺-二-丙烯酰胺溶液)；1.25mL 1.5M Tris(pH 6.8)；0.1mL 10％过硫酸铵(APS)；0.01mL四甲基乙二胺(TEMED)；6.8mL水)倾注到聚合的分离胶上，随后立即插入梳子。允许此胶聚合大约15分钟。将蛋白质样品(培养上清液)与上样染料(5x组合物(2mL)：0.62mL 1M Tris pH 6.8；0.1mL 1％溴酚蓝；1.0mL甘油；0.28mL水)混合并且上样到非变性PAGE的孔中。在25mA的恒电流下将凝胶在无SDS的电泳缓冲液(3.0g Tris碱；14.4g甘氨酸；加水至1L)中跑胶。
表1：高分子量(HMW)条带和低分子量(LMW)条带的检测和主要条带的确定
实例3：温度稳定性测定(TSA)
通过使用荧光蛋白质结合染料(宝石橙(SYPRO Orange)；SIGMA S5692)测量蛋白质热稳定性来确定热转移(Tm)。宝石橙(SYPRO Orange)非非特异性地结合至疏水的表面，当蛋白质展开结合染料的暴露的疏水表面时，导致荧光增加。通过逐渐增加温度来展开蛋白质并且测量在各点上的荧光来获得稳定性曲线和中点值(熔解温度，Tm)。
可以在将样品温度控制和染料荧光检测组合的仪器(7500快速实时PCR，应用生物系统公司(Applied Biosystems))上，进行基于荧光的热转移测定。该仪器在缓冲液100mMHEPE，pH 7中，将样品从25℃加热至96℃。
将10uL的RML样品(等价于5uM；浓度0.2mg/mL)与17.5uL的缓冲液(100mM HEPES、pH 7)和2.5uL的2.5X TAMRA染料混合。将总反应体积保持在仅30uL并在室温下制备。最后将平板离心并且用应用生物系统公司(Applied Biosystems)微AMP光学粘附膜(4311971)覆盖。
在96-孔应用生物系统公司(Applied Biosystems)微AMP快速光学反应板(43669320)中制备反应混合物。
基于来自每条荧光曲线(玻尔兹曼方法)的Tm(通过蛋白质热转移软件计算；商标为应用生物系统公司(Applied Biosystems))以及还有荧光的Tm(导数方法)。导数Tm值是取自导数图中峰值的顶端，而玻尔兹曼Tm值是取自荧光曲线的拐点。将当与野生型Tm相比较时具有更高的热稳定性的变体挑出。以大约+/-0.2℃的精确度确定熔解温度。
表2：温度稳定性
实例4：酶谱分析
取出非变性PAGE并且放置在具有底物的合适的平板上；在这种情况下，使用具有亮绿色的橄榄油琼脂糖平板。凝胶不应该被染色。为了区别蛋白质，将样品分成两组进行，一组放置在底物平板上而将另一组先染色后褪色来检查带型。在适当的温度(25℃)下将平板孵育适当时间(2h)直至观察到有色/无色的区域。
表3：存在于低分子量(LMW)条带中的脂肪酶活性的检测
实例5：癸胺琼脂糖色谱法
在癸胺琼脂糖上的纯化之前，澄清的培养上清液是从米曲霉培养液中，通过在布氏漏斗(产品编号PW90，J Brand)中，使用Seitz过滤器(产品编号K250，颇尔印度公司(PallIndia corporatio))和WHATMAN玻璃过滤器GF/F级(产品编号1825-25，沃特曼-通用电气(GE)医疗集团(WHATMAN-GE Healthcare))的组合进行真空过滤，随后在真空过滤单元(产品编号50060，TARSONS)上，使用-200 0.2u过滤器(产品编号60301，颇尔公司(Pallcorporatio))进行无菌过滤制得。
用洗涤缓冲液(50mM HEPES；pH 7；2M NaCl)对癸胺琼脂糖柱进行预平衡。用洗涤缓冲液按照1:1的比例对澄清的培养上清液进行稀释以达到最终的NaCl浓度1M。将200mL的样品以115cm/hr的线性流速施加到癸胺琼脂糖柱(10x200mm，柱床体积6mL)上。通过用洗涤缓冲液洗涤该柱直至280nm的OD低于0.1吸光度单位，去除未结合或弱结合的蛋白质。第一次洗脱使用洗脱缓冲液1(10mM HEPES；pH 7)进行。第二次洗脱使用洗脱缓冲液2(50％EtOH；10mM HEPES；pH 7)进行。
表4：脂肪酶结合至癸胺琼脂糖上。
实例6：相对洗涤性能
自动机械应力测定(AMSA)
为了评估在衣物洗涤中的洗涤性能，使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。AMSA平板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子针对所有缝开口强力挤压洗涤样品(有待洗涤的纺织品)。在洗涤时间期间，将平板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性振荡方式施加机械压力。关于进一步描述，参见WO02/42740，尤其是第23-24页的“特定方法实施例(Special method embodiments)”段落。
在不同pH的甘氨酸缓冲液中并且在具有不同表面活性剂水平的标准洗涤剂中进行衣物洗涤实验。实验条件在以下指定：
洗涤剂/缓冲液：50mM甘氨酸缓冲液pH 8
50mM甘氨酸缓冲液pH 9
50mM甘氨酸缓冲液pH 10
3.3g/L洗涤剂0％表面活性剂，50mM甘氨酸缓冲液pH 8
3.3g/L洗涤剂10％表面活性剂，50mM甘氨酸缓冲液pH 8
3.3g/L洗涤剂20％表面活性剂，50mM甘氨酸缓冲液pH 8
3.3g/L洗涤剂60％表面活性剂，50mM甘氨酸缓冲液pH 8
3.3g/L洗涤剂100％表面活性剂，50mM甘氨酸缓冲液pH 8
测试溶液体积：160uL
洗涤时间：15分钟
温度：25℃
水硬度：15°dH
脂肪酶剂量：0ppm或1ppm
测试材料：根据WO 06/125437的奶油姜黄污渍
用NaOH或柠檬酸进行最后调节至指定pH。通过将CaCl2和MgCl2(Ca2+:Mg2+＝4:1)添加到测试系统中，将水硬度调节至15°dH。
洗涤之后，将纺织品在自来水中沖洗并且使用滤纸将过量的水从纺织品中去除，并且之后立即将纺织品在85℃下干燥5min。
将洗涤性能测量为所洗涤的脏纺织品的颜色变化。该污渍是与姜黄混合的奶油。姜黄包含着色剂姜黄素，其作为pH指示剂通过具有pH依赖性颜色变化起作用。脂肪酶活性导致游离脂肪酸从乳脂酰基甘油酯释放并且这导致pH降低并且由此导致姜黄素pH指示剂的颜色变化。脂肪酶洗涤性能因此可以被表示为当用白光照亮时，从所洗涤的脏纺织品反射-发射的光的变色程度。
使用专业平板扫描仪(EPSON EXPRESSION 10000XL，阿特亚公司(Atea A/S)，Lautrupvang 6，2750巴勒鲁普，丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤的脏纺织品的图像。为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24位像素值转化为红色、绿色和蓝色(RGB)值。
归因于脂肪酶活性的颜色变化被测量为相对于反射-发射的蓝色(B)和红色(R)光的总和，绿色光(G)的反射-发射的增加。相对于参比脂肪酶(WT)，脂肪酶的洗涤性能(RP(洗涤))被计算为：RP(洗涤)＝(G/(B+R)(测试的脂肪酶)-G/(B+R)(无酶))/(G/(B+R)(参比脂肪酶)-G/(B+R)(无酶))。
表5：根据本发明的方法制得的脂肪酶制剂的洗涤性能。
在此描述并且要求保护的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这样的实施例也旨在落入所附权利要求的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 用于产生脂肪酶的方法
<130> 12960-WO-PCT
<160> 8
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 1110
<212> DNA
<213> 米黑根毛霉
<220>
<221> CDS
<222> (13)..(1101)
<220>
<221> 信号肽
<222> (13)..(84)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (85)..(294)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (295)..(930)
<400> 1
ggatccttca cc atg gtt ctc aag cag cgt gca aac tac cta gga ttt ctg 51
Met Val Leu Lys Gln Arg Ala Asn Tyr Leu Gly Phe Leu
-90 -85
att gta ttc ttc acg gcc ttc ctg gtg gaa gcg gta ccc atc aag aga 99
Ile Val Phe Phe Thr Ala Phe Leu Val Glu Ala Val Pro Ile Lys Arg
-80 -75 -70
caa tcg aat tcc acg gtc gac agt ctg ccg cct ctc atc ccc tcg aga 147
Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser Arg
-65 -60 -55 -50
acc tcg gca cct tca tca tca cca agc aca acc gac cct gaa gct cca 195
Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro
-45 -40 -35
gcc atg agt cgc aat gga ccg ctg ccc tcg gat gta gag act aaa tat 243
Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Asp Val Glu Thr Lys Tyr
-30 -25 -20
ggc atg gct ttg aat gct act tcc tat ccg gat tct gtg gtc caa gca 291
Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Val Gln Ala
-15 -10 -5
atg agc att gat ggt ggt atc cgc gct gcg acc tcg caa gaa atc aat 339
Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn
-1 1 5 10 15
gaa ttg act tat tac act aca cta tct gcc aac tcg tac tgc cgc act 387
Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr
20 25 30
gtc att cct gga gct acc tgg gac tgt atc cac tgt gat gca acg gag 435
Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu
35 40 45
gat ctc aag att atc aag act tgg agc acg ctc atc tat gat aca aat 483
Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn
50 55 60
gca atg gtt gca cgt ggt gac agc gaa aaa act atc tat atc gtt ttc 531
Ala Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe
65 70 75
cga ggt tcg agc tct atc cgc aac tgg att gct gat ctc acc ttt gtg 579
Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val
80 85 90 95
cca gtt tca tat cct ccg gtc agt ggt aca aaa gta cac aag gga ttc 627
Pro Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe
100 105 110
ctg gac agt tac ggg gaa gtt caa aac gag ctt gtt gct act gtt ctt 675
Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu
115 120 125
gat caa ttc aag caa tat cca agc tac aag gtt gct gtt aca ggt cac 723
Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His
130 135 140
tca ctc ggt ggt gct act gcg ttg ctt tgc gcc ctg gat ctc tat caa 771
Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Asp Leu Tyr Gln
145 150 155
cga gaa gaa gga ctc tca tcc agc aac ttg ttc ctt tac act caa ggt 819
Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly
160 165 170 175
caa cca cgg gta ggc gac cct gcc ttt gcc aac tac gtt gtt agc acc 867
Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr
180 185 190
ggc att cct tac agg cgc acg gtc aat gaa cga gat atc gtt cct cat 915
Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His
195 200 205
ctt cca cct gct gct ttt ggt ttt ctc cac gct ggc gag gag tat tgg 963
Leu Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp
210 215 220
att act gac aat agc cca gag act gtt cag gtc tgc aca agc gat ctg 1011
Ile Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu
225 230 235
gaa acc tct gat tgc tct aac agc att gtt ccc ttc aca agt gtt ctt 1059
Glu Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu
240 245 250 255
gac cat ctc tcg tac ttt ggt atc aac aca ggc ctc tgt act taactcgag 1110
Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Thr
260 265
<210> 2
<211> 363
<212> PRT
<213> 米黑根毛霉
<400> 2
Met Val Leu Lys Gln Arg Ala Asn Tyr Leu Gly Phe Leu Ile Val Phe
-90 -85 -80
Phe Thr Ala Phe Leu Val Glu Ala Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn
-75 -70 -65
Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala
-60 -55 -50
Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser
-45 -40 -35
Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Asp Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala
-30 -25 -20 -15
Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Val Gln Ala Met Ser Ile
-10 -5 -1 1
Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr
5 10 15
Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro
20 25 30
Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp Leu Lys
35 40 45 50
Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met Val
55 60 65
Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser
70 75 80
Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Ser
85 90 95
Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser
100 105 110
Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp Gln Phe
115 120 125 130
Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly
135 140 145
Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Glu
150 155 160
Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg
165 170 175
Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly Ile Pro
180 185 190
Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro
195 200 205 210
Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp
215 220 225
Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Thr Ser
230 235 240
Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu
245 250 255
Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Thr
260 265
<210> 3
<211> 269
<212> PRT
<213> 米黑根毛霉
<400> 3
Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu
1 5 10 15
Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val
20 25 30
Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp
35 40 45
Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala
50 55 60
Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg
65 70 75 80
Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro
85 90 95
Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu
100 105 110
Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp
115 120 125
Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser
130 135 140
Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Asp Leu Tyr Gln Arg
145 150 155 160
Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln
165 170 175
Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly
180 185 190
Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu
195 200 205
Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile
210 215 220
Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu
225 230 235 240
Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp
245 250 255
His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Thr
260 265
<210> 4
<211> 70
<212> PRT
<213> 米黑根毛霉
<400> 4
Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro
1 5 10 15
Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr
20 25 30
Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Asp
35 40 45
Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro Asp
50 55 60
Ser Val Val Gln Ala Met
65 70
<210> 5
<211> 269
<212> PRT
<213> 疏棉状嗜热丝孢菌
<400> 5
Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr
20 25 30
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp
35 40 45
Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr
50 55 60
Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe
65 70 75 80
Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp
85 90 95
Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly
100 105 110
Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val
115 120 125
Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly
130 135 140
His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg
145 150 155 160
Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val
165 170 175
Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr
180 185 190
Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro
195 200 205
Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser
210 215 220
Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly
225 230 235 240
Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro
245 250 255
Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu
260 265
<210> 6
<211> 384
<212> PRT
<213> 卷枝毛霉
<400> 6
Met Val Ser Phe Val Ser Ile Ser Gln Gly Ile Ser Leu Phe Ile Val
1 5 10 15
Val Ser Ser Met Leu Thr Gly Ser Ala His Ala Ala Pro Ala Ser Ser
20 25 30
His Ser Asn Ser Ser Lys Asn Ala Thr Thr Ser Asp Ala Ser Thr Phe
35 40 45
Thr Leu Pro Pro Ile Ile Ser Ser Arg Val Thr Pro Pro Lys Val Pro
50 55 60
Ser Gly Ser His Asn Val Glu Asp Ala Asn Val Ala Lys Asn Lys Lys
65 70 75 80
Trp Phe Glu Ala His Gly Gly Lys Leu Asn Val Thr Lys Arg Ala Asp
85 90 95
Glu Thr Val Gly Gly Tyr Thr Met Asp Leu Pro Ser Asn Ala Pro Pro
100 105 110
Leu Pro Ala Val Pro Ser Thr Ser Thr Val Val Ile Ala Ser Thr Ala
115 120 125
Gln Ile Ser Glu Phe Lys Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ser Thr Ala Tyr
130 135 140
Cys Arg Ser Val Val Pro Leu Asn Gln Trp Ser Cys Thr Asn Cys Leu
145 150 155 160
Lys Phe Val Pro Asp Gly Lys Leu Ile Lys Thr Phe Thr Ser Leu Val
165 170 175
Thr Asp Thr Asn Gly Phe Val Leu Arg Ser Asp Ala Gln Lys Thr Ile
180 185 190
Tyr Val Val Phe Arg Gly Thr Asn Ser Ile Arg Ser Ala Ile Thr Asp
195 200 205
Leu Val Phe Glu Leu Thr Asn Tyr Thr Pro Val Ser Gly Ala Lys Val
210 215 220
His Thr Gly Phe Tyr Ala Ser Tyr Lys Ala Val Val Ser Asp Tyr Phe
225 230 235 240
Pro Ala Val Gln Ser Gln Leu Thr Ala Tyr Pro Gly Tyr Lys Val Ile
245 250 255
Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met
260 265 270
Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Pro Arg Leu Ser Lys Ser Asn Leu Ala Ile
275 280 285
Tyr Thr Val Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Pro Ala Phe Ala Tyr Tyr
290 295 300
Val Asp Ser Thr Gly Ile Thr Phe Ser Arg Ser Val Asn Asn Arg Asp
305 310 315 320
Ile Val Pro His Val Pro Pro Gln Ala Trp Gly Phe Leu His Pro Gly
325 330 335
Val Glu Ala Trp Ala Arg Ser Ser Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Pro
340 345 350
Asn Ile Glu Thr Gly Leu Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser
355 360 365
Phe Thr Asp His Leu Thr Tyr Tyr Asp Leu Asn Glu Gly Leu Cys Leu
370 375 380
<210> 7
<211> 389
<212> PRT
<213> 小孢根霉华变种
<400> 7
Met Val Ser Phe Ile Ser Ile Ser Gln Gly Val Ser Leu Cys Leu Leu
1 5 10 15
Val Ser Ser Met Met Leu Gly Ser Ser Ala Val Pro Val Ala Gly His
20 25 30
Lys Gly Ser Val Lys Ala Thr Asn Gly Thr Asp Phe Gln Leu Pro Pro
35 40 45
Leu Ile Ser Ser Arg Cys Thr Pro Pro Ser His Pro Glu Thr Thr Gly
50 55 60
Asp Pro Asp Ala Glu Ala Tyr Tyr Ile Asn Lys Ser Val Gln Trp Tyr
65 70 75 80
Gln Ala His Gly Gly Asn Tyr Thr Ala Leu Ile Lys Arg Asp Thr Glu
85 90 95
Thr Val Gly Gly Met Thr Leu Asp Leu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Ile
100 105 110
Pro Ala Thr Ser Thr Ala Pro Ser Ser Asp Ser Gly Glu Val Val Thr
115 120 125
Ala Thr Ala Ala Gln Ile Lys Glu Leu Thr Asn Tyr Ala Gly Val Ala
130 135 140
Ala Thr Ala Tyr Cys Arg Ser Val Val Pro Gly Thr Lys Trp Asp Cys
145 150 155 160
Lys Gln Cys Leu Lys Tyr Val Pro Asp Gly Lys Leu Ile Lys Thr Phe
165 170 175
Thr Ser Leu Leu Thr Asp Thr Asn Gly Phe Ile Leu Arg Ser Asp Ala
180 185 190
Gln Lys Thr Ile Tyr Val Thr Phe Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser
195 200 205
Ala Ile Thr Asp Met Val Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Pro Val Lys
210 215 220
Gly Ala Lys Val His Ala Gly Phe Leu Ser Ser Tyr Asn Gln Val Val
225 230 235 240
Lys Asp Tyr Phe Pro Val Val Gln Asp Gln Leu Thr Ala Tyr Pro Asp
245 250 255
Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu
260 265 270
Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Lys Arg Leu Ser Pro Lys
275 280 285
Asn Leu Ser Ile Tyr Thr Val Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Asn Ala
290 295 300
Phe Ala Tyr Tyr Val Asp Ser Thr Gly Ile Pro Phe His Arg Thr Val
305 310 315 320
His Lys Arg Asp Ile Val Pro His Val Pro Pro Gln Ala Phe Gly Tyr
325 330 335
Leu His Pro Gly Val Glu Ser Trp Ile Lys Glu Asp Pro Ala Asp Val
340 345 350
Gln Ile Cys Thr Ser Asn Ile Glu Thr Lys Gln Cys Ser Asn Ser Ile
355 360 365
Val Pro Phe Thr Ser Ile Ala Asp His Leu Thr Tyr Phe Gly Ile Asn
370 375 380
Glu Gly Ser Cys Leu
385
<210> 8
<211> 392
<212> PRT
<213> 米根霉
<400> 8
Met Val Ser Phe Ile Ser Ile Ser Gln Gly Val Ser Leu Cys Leu Leu
1 5 10 15
Val Ser Ser Met Met Leu Gly Ser Ser Ala Val Pro Val Ser Gly Lys
20 25 30
Ser Gly Ser Ser Asn Thr Ala Val Ser Ala Ser Asp Asn Ala Ala Leu
35 40 45
Pro Pro Leu Ile Ser Ser Arg Cys Ala Pro Pro Ser Asn Lys Gly Ser
50 55 60
Lys Ser Asp Leu Gln Ala Glu Pro Tyr Asn Met Gln Lys Asn Thr Glu
65 70 75 80
Trp Tyr Glu Ser His Gly Gly Asn Leu Thr Ser Ile Gly Lys Arg Asp
85 90 95
Asp Asn Leu Val Gly Gly Met Thr Leu Asp Leu Pro Ser Asp Ala Pro
100 105 110
Pro Ile Ser Leu Ser Ser Ser Thr Asn Ser Ala Ser Asp Gly Gly Lys
115 120 125
Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile Gln Glu Phe Thr Lys Tyr Ala
130 135 140
Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg Ser Val Val Pro Gly Asn Lys
145 150 155 160
Trp Asp Cys Val Gln Cys Gln Lys Trp Val Pro Asp Gly Lys Ile Ile
165 170 175
Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ser Asp Thr Asn Gly Tyr Val Leu Arg
180 185 190
Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu Val Phe Arg Gly Thr Asn Ser
195 200 205
Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val Phe Asn Phe Ser Asp Tyr Lys
210 215 220
Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala Gly Phe Leu Ser Ser Tyr Glu
225 230 235 240
Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val Val Gln Glu Gln Leu Thr Ala
245 250 255
His Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala
260 265 270
Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Pro Arg Leu
275 280 285
Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr Val Gly Gly Pro Arg Val Gly
290 295 300
Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ser Thr Gly Ile Pro Phe Gln
305 310 315 320
Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro His Val Pro Pro Gln Ser
325 330 335
Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu Ser Trp Ile Lys Ser Gly Thr
340 345 350
Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Glu Ile Glu Thr Lys Asp Cys Ser
355 360 365
Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Ile Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe
370 375 380
Asp Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu
385 390

Claims (26)

1.用于产生具有增加的脂肪分解活性的脂肪酶制剂的一种方法，该方法包括改变多核苷酸中的一个或多个核苷酸的步骤，该多核苷酸包括编码前肽的第一多核苷酸，该第一多核苷酸可操作地连接至编码脂肪酶的第二多核苷酸上，其中在该第一多核苷酸中作出该一个或多个核苷酸的改变，并且该改变独立地导致编码的前肽氨基酸序列中的取代、插入或缺失。
2.如权利要求1所述的方法，其中该一个或多个核苷酸的改变选自编码前肽氨基酸的任一核苷酸，该前肽氨基酸包括在脂肪酶接触区中。
3.如权利要求2所述的方法，其中该脂肪酶接触区是选自对应于SEQ IDNO:2的残基-57至-50、-40至-28和-22至-15的氨基酸的任一主要脂肪酶接触区，其条件是该改变不是对应于SEQ ID NO:2的S-24F的取代。
4.如权利要求3所述的方法，其中这些主要脂肪酶接触区中的一个或多个与SEQ IDNO:2的序列一致性是至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中如与不包括改变一个或多个核苷酸的步骤的相同方法产生的制剂相比，所述制剂具有增加的LMW脂肪酶与HMW脂肪酶的比率。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中如与不包括改变一个或多个核苷酸的步骤的相同方法产生的制剂相比，所述制剂包括具有更低的Tm的脂肪酶。
7.一种编码脂肪酶的多核苷酸，包括编码脂肪酶的前肽的第一多核苷酸，该第一多核苷酸可操作地连接至编码脂肪酶的成熟蛋白的第二多核苷酸上，其中编码的前肽在一个或多个位置上包括改变，其中该改变独立地为取代、插入或缺失。
8.如权利要求7所述的多核苷酸，其中该第一多核苷酸编码前肽，该前肽与SEQ ID NO:4具有至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列一致性。
9.如权利要求7-8中任一项所述的多核苷酸，其中该第二多核苷酸编码脂肪酶，该脂肪酶与SEQ ID NO:3具有至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。
10.如权利要求7-9中任一项所述的多核苷酸，其中在一个或多个核苷酸上的该改变选自编码前肽氨基酸的任一核苷酸，该前肽氨基酸包括在脂肪酶接触区中。
11.如权利要求10所述的多核苷酸，其中该脂肪酶接触区是选自对应于SEQ ID NO:2的残基-57至-50、-40至-28和-22至-15的氨基酸的任一主要脂肪酶接触区，其条件是该改变不是对应于SEQ ID NO:2的S-24F的取代。
12.如权利要求11所述的多核苷酸，其中这些主要脂肪酶接触区中的一个或多个与SEQID NO:2的序列一致性是至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％。
13.如权利要求7-12中任一项所述的多核苷酸，其中在一个或多个位置上的该改变对应于选自SEQ ID NO:2的-12、-13、-14、-15、-17、-18、-22、-23、-24、-25、-32、-33、-34、-35、-40、-41、-45、-46、-47、-48、-49、-50、-51、-52、-53、-54、-55、-56、-57、-58、-59、-60、-61、-62、-63、-64、-65的位置。
14.如权利要求13所述的多核苷酸，其中该改变是在对应于SEQ ID No:2的-13、-17、-18、-24、-34、-40、-41、-51、-52、-63的位置的一个或多个位置上的取代，其条件是该取代不是N-63A、N-63I或N-13A。
15.如权利要求14中所述的多核苷酸，其中该取代选自：N-13Q、G-17W、Y-18R、S-24F、P-34R、T-40R、S-41K、S-51K、P-52F和N-63Q。
16.如权利要求13所述的多核苷酸，其中该改变是在对应于SEQ ID No:2的位置-15、-25、-35、-45、-55的一个或多个位置上的插入。
17.如权利要求16所述的多核苷酸，其中该插入选自：A-15AASV、A-15ASTED、P-25PASV、P-25PSTED、A-35AASV、A-35ASTED、S-45SASV、S-45SSTED、P-55PASV、和P-55PSTED。
18.如权利要求13所述的多核苷酸，其中该缺失对应于选自SEQ ID NO:2的-14*至-12*、-24*至-22*、-34*至-32*、-54*至-62*、-45*至-54*、-45*至-65*、-55*至-65*的位置。
19.如权利要求7-18中任一项所述的多核苷酸，其中改变的数量是1-40、1-20、1-15、1-10或1-5，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、
29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个改变。
20.如权利要求7-19中任一项所述的多核苷酸，进一步包括在对应于位置N-63AI、S-62G、D-59V、T-49I、S-48T、S-44P、D-23V、L-14V、N-13A、S-10A、D-7A、S-6T、V-4AD的一个或多个位置上的取代。
21.如权利要求7-20中任一项所述的多核苷酸，其中该改变增强了脂肪酶的编码的成熟区的生产。
22.一种由如权利要求7-21中任一项中所述的第一多核苷酸编码的分离的前肽变体。
23.一种核酸构建体，包含如权利要求7-21中任一项所述的多核苷酸。
24.一种表达载体，包含如权利要求7-21中任一项所述的多核苷酸。
25.一种宿主细胞，包含如权利要求7-21中任一项所述的多核苷酸。
26.一种用于产生来自如权利要求7-21中任一项所述的多核苷酸的脂肪酶的方法，该方法包括：(a)在适合于表达该脂肪酶的条件下培养如权利要求24所述的宿主细胞；和(b)回收该脂肪酶。
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