DE69636754T2

DE69636754T2 - Haloperoxidasen aus curvularia verruculosa und nukleinsäuren, die für diese codieren

Info

Publication number: DE69636754T2
Application number: DE69636754T
Authority: DE
Inventors: Claus Fuglsang; M. Karen OXENBOELL; Torben Halkier; M. Randy Davis BERKA; Joel Davis CHERRY
Original assignee: Novozymes AS; Novozymes Inc
Current assignee: Novozymes AS; Novozymes Inc
Priority date: 1995-07-14
Filing date: 1996-07-09
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2016-07-10
Also published as: EP0843729A1; BR9609711A; ATE347602T1; JP2002507111A; US5965418A; AU721122B2; AU6450296A; CN1194003A; MX9800419A; CA2226625A1; AR002832A1; US5866393A; WO1997004102A1; DE69636754D1; EP0843729B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Curvularia-verruculosa-Haloperoxidasen und isolierte Nukleinsäurefragmente, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die die Haloperoxidasen codieren. Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Wirtszellen, die die Nukleinsäuresequenzen umfassen, sowie Verfahren zur Herstellung der Haloperoxidasen. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Verwendung der Haloperoxidasen.
Beschreibung des Technikstandes
Haloperoxidasen katalysieren die Oxidation eines Halogenidions (X = Cl^–, BR^– oder I^–) in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H₂O₂) zu der entsprechenden hypohalogenigen Säure (HOX): H₂O₂ + X^– + H⁺ → H₂O + HOX
Wenn eine entsprechende nukleophile Akzeptorverbindung vorhanden ist, reagiert die hypochlorige Säure mit der Verbindung unter Bildung einer halogenierten Verbindung. Haloperoxidasen können Peroxidasereaktionen an bestimmten Substraten in Abwesenheit von Halogenidionen ebenso katalysieren, allerdings wird das Substratspektrum in Gegenwart von Halogenidionen aufgrund unspezifischer Umsetzungen des Substrats und des Hypohalogenidions verbreitert.
Haloperoxidasen sind in der Natur weit verbreitet, da sie von Säugern, Pflanzen, Algen, Flechten, Bakterien und Pilzen produziert werden. Haloperoxidasen sind wahrscheinlich die Enzyme, die für die Bildung von natürlich vorkommenden halogenierten Verbindungen ver antwortlich sind. Es gibt drei Typen von Haloperoxidasen, die je nach ihrer Spezifität auf Halogenidionen klassifiziert werden.
Chlorperoxidasen (E.C. 1.11.1.10), die die Chlorierung, Bromierung und Iodierung von Verbindungen katalysieren; Bromperoxidasen, die Spezifität gegenüber Bromid- und Iodidionen zeigen; und Iodperoxidasen (E.C. 1.11.1.8), die nur die Oxidation von Iodidionen katalysieren.
Es wurde festgestellt, dass die ersten entdeckten Haloperoxidasen Häm als prosthetische Gruppe oder Co-Faktor enthalten. Allerdings wurde es in jüngster Zeit klar, dass es ebenfalls zahlreiche Nicht-Häm-Haloperoxidasen gibt. Bakterielle Haloperoxidasen wurden ohne prosthetische Gruppe festgestellt. Zusätzlich hat sich gezeigt, dass eine Anzahl von anderen Nicht-Häm-Haloperoxidasen eine Vanadin-prosthetische Gruppe besitzt. Haloperoxidasen, die eine Vanadin-prosthetische Gruppe enthalten, umfassen bekanntlich Seetang-Bromperoxidasen und mindestens einen Typ von Pilz-Chlorperoxidasen aus Curvularia inaequalis (van Schijndel et al., 1993, Biochimica Biophysica Acta 1161: 249–256; Simons et al., 1995, European Journal of Biochemistry 229: 566–574; WO 95/27046).
Haloperoxidasen sind wie andere Oxidoreduktasen von laufendem Interesse aufgrund ihres breiten Bereiches von potentiellen industriellen Anwendungen. Beispielsweise wurden Haloperoxidasen zur Verwendung als antimikrobielles Mittel vorgeschlagen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuer Haloperoxidasen, die in kommerziell brauchbaren Mengen produziert werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Haloperoxidasen und isolierte Nukleinsäurefragmente, die eine Nukleinsäuresequenz einschließen, welche die Haloperoxidasen codiert. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und rekombinante Wirtszellen bereit, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurefragment umfassen. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Produktion einer erfindungsgemäßen Haloperoxidase, Zusammensetzungen und Verfahren zum Abtöten mikrobieller Zellen oder zum Hemmen des Wachstums von mikrobiellen Zellen bereit.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 erläutert die Wirkung von Zinn, Vanadium und Eisen auf die Aktivität der Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase.
2 zeigt die Wirkung des pH-Wertes bei 30°C auf die Aktivität der Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase.
3 erläutert die Wirkung der Temperatur bei pH 5,5 auf die Aktivität der Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase.
4 zeigt die Wirkung der Temperatur bei pH 7 auf die Stabilität der Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase.
5 erläutert die Wirkung des pH-Wertes bei 30°C auf die Stabilität der Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase.
6 zeigt die Wirkung der H₂O₂-Konzentration bei pH 7 und 60°C auf die Stabilität der Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase.
7 erläutert ein elektrophoretisches Agarosegel des Produkts aus der PCR-Amplifikation der Haloperoxidase-spezifischen Gensequenzen unter Verwendung von Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Genom-DNA als Templat.
8 zeigt ein Autoradiogramm aus einem Southern Blot von Curvularia-verruculosa-Genom-DNA, sondiert mit einem PCR-abgeleiteten Segment des Haloperoxidase-Gens.
9 erläutert ein elektrophoretisches Agarosegel von Haloperoxidase-Klonen, die mit PstI plus HindIII oder XhoI plus HindIII verdaut wurden.
10 zeigt die codierende DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der Curvularia-verruculosa-Haloperoxidase.
11 erläutert ein Alignment der Curvularia-verruculosa- und Curvularia-inaequalis-Haloperoxidase-Aminosäuresequenz.
12 zeigt eine Restriktionskarte von pBANe6.
13 zeigt eine Restriktionskarte von pAJ014-1.
14 zeigt den zeitlichen Verlauf der Haloperoxidase-Produktion während der Fermentation.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Haloperoxidasen, die mindestens etwa 97% und vorzugsweise 99% Homologie mit der in 10 (SEQ ID NO:2) abgebildeten Aminosäuresequenz besitzen und die qualitativ die Aktivität der hier beschriebenen Proteine beibehalten.
Die erfindungsgemäße Haloperoxidase kann durch eine Vielzahl von Verfahrensweisen, die aus der Technik bekannt sind, aufgereinigt werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Chromatographie (z. B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Chromatographie, Chromatofokussierung und Größenausschlusschromatographie), elektrophoretische Verfahrensweisen (z. B. präparative isoelektrische Fokussierung (IEF)), differentielle Löslichkeit (z. B. Ammoniumsulfat-Fällung) oder Extraktion (siehe beispielsweise Protein Purification, Hrsg. J.-C. Janson und Lars Ryden, VCH Publishers, New York, 1989). Wie hier definiert, ist eine "isolierte Haloperoxidase" eine Haloperoxidase, die im Wesentlichen frei von anderen Nichthaloperoxidase-Proteinen ist, beispielsweise zumindest etwa 20% rein, vorzugsweise mindestens etwa 40% rein, stärker bevorzugt etwa 60% rein, noch stärker bevorzugt etwa 80% rein, besonders bevorzugt etwa 90% rein und ganz besonders bevorzugt, etwa 95% rein, wie bestimmt durch SDS-PAGE.
Nukleinsäurefragmente und -konstrukte
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäurefragmente, die eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die eine erfindungsgemäße Haloperoxidase codiert, und Nukleinsäurekonstrukte, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurefragment einschließen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform codiert die Nukleinsäuresequenz eine Haloperoxidase, die aus Curvularia-verruculosa-CBS-147.63, z. B. die in SEQ ID NO:1 ausgeführte Nukleinsäuresequenz, oder aus CBS 444.70 erhalten wurde. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nukleinsäuresequenzen, die eine Haloperoxidase mit der in SEQ ID NO:2 ausgeführten Aminosäuresequenz codieren, die sich von der SEQ ID NO:1 aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheiden. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen umfassen ferner sowohl die genomische Sequenz, die hier dargestellt ist, sowie die entsprechenden cDNA- und RNA-Sequenzen, und der Begriff "Nukleinsäuresequenzen", wie hier verwendet, wird so verstanden, dass alle derartigen Variationen, einschließlich synthetischer DNA, eingeschlossen sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurefragment umfassen. "Nukleinsäurekonstrukt" soll allgemein so verstanden werden, dass es ein Nukleinsäuremolekül, entweder einzel- oder doppelsträngig, bedeutet, das aus einem natürlich vorkommenden Gen isoliert wird oder das modifiziert worden ist, um Segmente von Nukleinsäure zu enthalten, die auf eine Weise kombiniert und aneinandergereiht wurden, die in der Natur sonst nicht vorkäme. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäurekonstrukte zu regulatorischen Regionen operabel verknüpft, die in der Lage sind, die Expression der Haloperoxidase in einem geeigneten Expressionswirt zu steuern.
Die vorliegende Erfindung stellt auch rekombinante Vektoren bereit, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz mit einer Promotorsequenz operabel verknüpft. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Vektoren außerdem ein Transkriptionsterminationssignal und/oder einen selektierbaren Marker.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Vektoren sind zur Expression des Curvularia-verruculosa-Haloperoxidase-Gens in aktiver Form geeignet. Ein geeigneter Expressionsvektor enthält ein Element, das die stabile Integration des Vektors in das Wirtszellengenom oder die autonome Replikation des Vektors in einer Wirtszelle unabhängig von dem Genom der Wirtszelle gestattet, und vorzugsweise einen oder mehrere phänotypische Marker, die die leichte Selektion von transformierten Wirtszellen gestatten. Der Vektor kann auch Kontrollsequenzen, wie einen Promotor, eine Ribosomen-Bindungsstelle, ein Translationsinitiationssignal und ggf. ein Repressor-Gen, einen selektierbaren Marker oder verschiedene Aktivator-Gene einschließen. Damit sich das exprimierte Gen sezernieren lässt, können Nukleinsäuren, die eine Signalsequenz codieren, vor der codierenden Sequenz des Gens inseriert werden. Zur Expression unter der Steuerung von Kontrollsequenzen wird ein Haloperoxidase-Gen, das erfindungsgemäß zu verwenden ist, operabel mit den Kontrollsequenzen in dem entsprechenden Leseraster verknüpft.
Der Vektor, der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt trägt, kann jeder beliebige Vektor sein, mit dem zweckmäßigerweise DNA-Rekombinationsverfahren durchgeführt werden können. Die Wahl eines Vektors hängt typischerweise von der Wirtszelle ab, in die der Vektor eingeführt werden soll. Der Vektor kann ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, z. B. ein Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom. Alternativ kann der Vektor ein Vektor sein, der, beim Einbau in eine Wirtszelle, in das Wirtszellengenom integriert und zusammen mit dem (den) Chromosom(en) repliziert wird, in das (die) er integriert worden ist. Das Vektorsystem kann ein einzelner Vektor oder ein einzelnes Plasmid oder zwei oder mehrere Vek toren oder Plasmide sein, die zusammen die Gesamt-DNA enthalten, die in das Genom integriert werden soll.
In dem Vektor sollte die DNA-Sequenz mit einer geeigneten Promotorsequenz operabel verknüpft sein. Der Promotor kann jede beliebige DNA-Sequenz sein, die transkriptionale Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt, und kann aus Genen erhalten werden, die Proteine codieren, die entweder zu der Wirtszelle homolog oder heterolog sind. Beispiele für geeignete Promotoren zur Steuerung der Transkription der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte, insbesondere in einem bakteriellen Wirt, sind der Promotor des lac-Operons von E. coli, die Streptomyces-coelicolor-Agarase-Gen-dagA-Promotoren, die Promotoren des Bacilluslicheniformis-α-Amylase-Gens (amyL), die Promotoren des Bacillus-stearothermophilusmaltogenen-Amylase-Gens (amyM), die Promotoren der Bacillus-amyloliquefaciens-α-Amylase (amyQ), die Promotoren der Bacillus-subtilis-xylA- und -xylB-Gene, der prokaryotische β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727–3731), oder des tac-Promotors (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21–25). Weitere Promotoren sind beschrieben in "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74–94; und in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor, New York, 1989). In einem Hefe-Wirt ist ein geeigneter Promotor der eno-1-Promotor. Zur Transkription in einem Pilz-Wirt sind Beispiele für geeignete Promotoren diejenigen, die aus dem Gen erhalten werden, das Aspergillus-oryzae-TAKA-Amylase, Rhizomucor-miehei-Asparaginsäure-Proteinase, Aspergillus-niger-neutrale-α-Amylase, säurestabile Aspergillus-niger-α-Amylase, Aspergillus-niger- oder Aspergillus-awamori-Glucoamylase (glaA), Rhizomucor-miehei-Lipase, Aspergillus-oryzae-Alkalische Protease, Aspergillus-oryzae-Triose-Phosphat-Isomerase oder Aspergillus-nidulans-Acetamidase codiert. Bevorzugte Promotoren sind die TAKA-Amylase und die glaA-Promotoren.
Der erfindungsgemäße Vektor kann auch einen geeigneten Transkriptionsterminator und in Eukaryoten Polyadenylierungssequenzen einschließen, die operabel mit der DNA-Sequenz verknüpft sind, die eine erfindungsgemäße Haloperoxidase codiert. Die Terminations- und Polyadenylierungssequenzen können aus der gleichen Quelle wie der Promotor erhalten wer den. Außerdem kann der Vektor eine DNA-Sequenz umfassen, die den Vektor zur Replikation in der in Frage kommenden Wirtszelle befähigt. Beispiele für solche Sequenzen sind die Replikationsursprünge der Plasmide pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 und pIJ702.
Der Vektor kann auch einen selektierbaren Marker einschließen, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle komplementiert, wie die dal-Gene aus Bacillus subtilis oder Bacilllus licheniformis, oder eines, welches Antibiotikumresistenz verleiht, wie Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclin-Resistenz. Beispiele für Aspergillus-Selektionsmarker umfassen amdS, pyrG, argB, niaD, sC, trpC und hygB, ein Marker, der Hygromycin-Resistenz entstehen lässt. Bevorzugt zur Verwendung in einer Aspergillus-Wirtszelle sind die amdS- und pyrG-Marker von Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzae. Ein häufig verwendeter Säugermarker ist das die Dihydrofolatreduktase-(DHFR)-Gen. Außerdem kann die Selektion durch Co-Transformation erreicht werden, z. B. wie beschrieben in WO 91/17243.
Um die Notwendigkeit des Aufbrechens der Zelle für den Erhalt der exprimierten Haloperoxidase zu vermeiden und um die Menge eines möglichen Abbaus der exprimierten Haloperoxidase in der Zelle zu minimieren, ist es bevorzugt, dass die Expression des Haloperoxidase-Gens ein Produkt entstehen lässt, das aus der Zelle sezerniert wird. Zu diesem Zweck können die erfindungsgemäßen Haloperoxidasen somit eine Präregion einschließen, durch die sich das exprimierte Gen in das Fermentationsmedium sezernieren lässt. Falls gewünscht, kann diese Präregion für eine erfindungsgemäße Haloperoxidase nativ sein oder kann mit einer unterschiedlichen Präregion oder einer Signalsequenz substituiert sein, was zweckmäßigerweise durch Substitution der DNA-Sequenzen, die die jeweiligen Präregionen codieren, erreicht wird. Beispielsweise kann die Präregion aus einer Glucoamylase oder einem Amylase-Gen aus einer Aspergillus-Spezies, einem Amylase-Gen aus einer Bacillus-Spezies, einem Lipase- oder Proteinase-Gen aus Rhizomucor miehei, dem Gen für den α-Faktor aus Saccharomyces cerevisiae oder aus dem Kälber-Präprochymosin-Gen erhalten werden. Besonders bevorzugt ist die Präregion für Aspergillus-oryzae-TAKA-Amylase, neutraler Aspergillus-niger-Amylase, die maltogene Amylase aus Bacillus NCIB 11837, Bacillus-stearothermo philus-α-Amylase oder für Bacillus-licheniformis-Subtilisin. Eine wirksame Signalsequenz für Pilz-Wirte ist das Aspergillus-oryzae-TAKA-Amylasesignal, das Rhizomucor-miehei-Asparaginproteinasesignal oder das Rhizomucor-miehei-Lipasesignal.
Die Verfahrensweisen, die zur Ligation des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukts, des Promotors, Terminators und der anderen Elemente bzw. zur ihrer Insertion in geeignete Vektoren, die die zur Replikation notwendige Information enthalten, verwendet werden, sind einem Fachmann gut bekannt (cf. z. B. Sambrook et al., supra).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt oder einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor umfassen, die zweckmäßigerweise bei der rekombinanten Produktion der erfindungsgemäßen Haloperoxidasen verwendet werden. Die Zelle kann mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt transformiert werden, zweckmäßigerweise durch Integration des Konstrukts in das Wirtschromosom. Diese Integration wird im Allgemeinen als ein Vorteil betrachtet, da die Sequenz eher stabil in der Zelle gehalten wird. Die Integration des Konstrukts in das Wirtschromosom kann nach herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, z. B. durch homologe oder heterologe Rekombination. Alternativ kann die Zelle mit einem Expressionsvektor, wie nachstehend in Verbindung mit den verschiedenen Typen von Wirtszellen beschrieben, transformiert werden.
Die Wahl der Wirtszellen und Vektoren hängt großenteils von der Haloperoxidase und ihrer Quelle ab. Die Wirtszelle kann aus prokaryotischen Zellen, wie Bakterienzellen, gewählt werden. Beispiele für geeignete Bakterien sind grampositive Bakterien wie Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensi, oder Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus oder gramnegative Bakterien wie E. coli. Die Transformation der Bakterien kann beispielsweise durch Protoplastentransformation oder durch die Verwendung kompetenter Zellen auf eine per se bekannte Weise durchgeführt werden.
Die Wirtszelle ist vorzugsweise ein Eukaryot, wie eine Säugerzelle, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle oder vorzugsweise eine Pilzzelle, einschließlich Hefe und Fadenpilze. Beispielsweise umfassen geeignete Säugerzellen CHO- oder COS-Zellen. Eine Hefewirtszelle kann aus einer Spezies von Saccharomyces oder Schizosaccharomyces, z. B. Saccharomyces cerevisiae, gewählt werden. Geeignete Fadenpilze können aus einer Spezies von Aspergillus, z. B. Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger, gewählt werden. Alternativ kann ein Stamm einer Fusarium-Spezies, z. B. Fusarium oxysporum oder Fusarium graminearum, als Wirtszelle verwendet werden. Pilzzellen können durch ein Verfahren transformiert werden, das die Protoplastenbildung, Transformation der Protoplasten und die anschließende Regeneration der Zellwand auf eine per se bekannte Weise einschließt. Eine geeignete Verfahrensweise zur Transformation von Aspergillus-Wirtszellen ist in EP 238 023 beschrieben. Ein geeignetes Verfahren zur Transformation von Fusarium-Spezies ist von Malardier et al., 1989, Gene 78: 147–156 oder in der mit anhängenden US-Patentschrift Serien-Nr. 08/269,449 beschrieben.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Expression des Haloperoxidase-Gens in einer Pilz-Wirtszelle, wie Aspergillus, erreicht. Das Haloperoxidase-Gen wird in ein Plasmid ligiert, das vorzugsweise den Aspergillus-oryzae-TAKA-Amylasepromotor oder den Aspergillus niger-neutralen-Amylase-NA2-Promotor und amdS oder pyrG als selektierbaren Marker enthält. Alternativ kann der selektierbare Marker auf einem getrennten Plasmid vorkommen und kann bei der Co-Transformation verwendet werden. Das Plasmid (oder die Plasmide) wird zur Transformation einer Aspergillus-Spezies-Wirtszelle, wie Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger nach Verfahren verwendet, die bei Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470–1474 beschrieben sind.
Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Haloperoxidasen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Haloperoxidase, umfassend (a) Fermentieren eines Curvularia-verruculosa-Stamms, um einen Überstand zu produzieren, der die Haloperoxidase einschließt; und (b) Gewinnen der Haloperoxidase.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur rekombinanten Herstellung einer erfindungsgemäßen Haloperoxidase, umfassend (a) Fermentieren einer Wirtszelle, umfassend ein Nukleinsäurekonstrukt, das eine Nukleinsäuresequenz, die die Haloperoxidase unter Bedingungen codiert, die für die Produktion des Enzyms geeignet sind, umfasst und (b) Gewinnen der Haloperoxidase. Wenn das Expressionssystem die Haloperoxidase in das Fermentationsmedium sezerniert, kann das Enzym direkt aus dem Medium gewonnen werden. Wenn die rekombinante Haloperoxidase nicht sezerniert wird, wird sie aus Zelllysaten gewonnen.
Wie hier definiert, ist der Begriff "Fermentation" jedes Verfahren zur Kultivierung einer Zelle, das zur Expression oder Isolierung der Haloperoxidase führt. Fermentation kann darum so verstanden werden, dass Schüttelkolbenkultivierung, Fermentation in kleinem oder großem Maßstab (einschließlich von kontinuierlichen, diskontinuierlichen, halbkontinuierlichen oder Festzustandsfermentationen) in Labor- oder Industriefermentern eingeschlossen sind, die in einem geeigneten Medium durchgeführt werden und unter Bedingungen, die die Expression oder Isolierung der Haloperoxidase erlauben.
Die Fermentation erfolgt in einem geeigneten Nährmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffzellen und anorganische Salze umfasst, unter Verwendung von aus der Technik bekannten Verfahrensweisen (siehe z. B. Bennett, J.W. und LaSure, L. (Hrsg.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Geeignete Medien stehen von herkömmlichen Lieferfirmen zur Verfügung oder können nach den veröffentlichten Zusammensetzungen (z. B. in den Katalogen der American Type Culture Collection) hergestellt werden.
Die resultierenden Haloperoxidasen, die durch die vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, können aus dem Fermentationsmedium durch herkömmliche Verfahrensweisen gewonnen werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Zentrifugation, Filtration, Sprühtrocknen, Verdampfen oder Präzipitation. Das gewonnene Protein kann anschließend weiter aufgereinigt werden durch eine Vielzahl von chromatographischen Verfahrensweisen, z. B. Ionenaustauscher-Chromatographie, Gel-Filtrations-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie oder dergleichen.
Anwendungen
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Oxidation eines Halogenidions zu der entsprechenden hypohalogenigen Säure, umfassend die Umsetzung des Halogenidions und einer Wasserstoffperoxid-Quelle in Gegenwart einer erfindungsgemäßen Haloperoxidase. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Halogenierung einer Verbindung, umfassend die Umsetzung der Verbindung, eines Halogenidions und einer Wasserstoffperoxid-Quelle in Gegenwart einer erfindungsgemäßen Haloperoxidase.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Abtötung oder Wachstumshemmung von mikrobiellen Zellen, umfassend das Zusammenbringen der Zellen mit einer erfindungsgemäßen Haloperoxidase, einer Wasserstoffperoxid-Quelle und einer Thiocyanat-Quelle in einer wässrigen Lösung.
Die Wasserstoffperoxid-Quelle kann Wasserstoffperoxid selbst oder ein Wasserstoffperoxid-Vorläufer sein, wie Percarbonat, Perborat, Peroxycarbonsäure oder ein Salze davon. Außerdem kann die Quelle ein Wasserstoffperoxid-erzeugendes Enzymsystem, wie eine Oxidase, z. B. eine Glucoseoxidase, Glycerinoxidase oder eine Aminosäureoxidase und ihr Substrat, sein. Die Wasserstoffperoxid-Quelle kann in einer Konzentration entsprechend einer Wasserstoffperoxid-Konzentration im Bereich von etwa 0,001 bis etwa 10 mM, vorzugsweise von etwa 0,01 bis etwa 1 mM zugesetzt werden.
Die Thiocyanat-Quelle kann Thiocyanat an sich oder ein Salz davon, z. B. Natrium oder Kalium sein. Wenn zudem die Umsetzung oral eintritt, ist Thiocyanat für die Saliva endogen. Die Thiocyanat-Quelle kann in einer Konzentration entsprechend einer Thiocyanat-Konzentration im Bereich von etwa 0,001 bis etwa 10 mM, vorzugsweise von etwa 0,01 bis etwa 1 mM zugesetzt werden.
Die Haloperoxidasen können als Konservierungsmittel und Desinfektionsmittel verwendet werden, wie in Anstrichfarben auf Wasserbasis und in Körperpflegeprodukten, z. B. Zahnpasta, Mundwasser, Hautpflegecremes und- Hautpflegelotionen, Haarpflege- und Körperpflege formulierungen, Lösungen zum Reinigen von Kontaktlinsen und Gebissen. Die Haloperoxidasen können auch zum Reinigen von Oberflächen und Kochgeräten in Lebensmittelverarbeitungsanlagen und in jedem beliebigen Bereich verwendet werden, in dem Nahrung hergestellt oder serviert wird. Die Haloperoxidasen können auch bei enzymatischen Bleichanwendungen, z. B. Pulpebleichen und Fleckenbleichen (in Waschpulverzusammensetzungen) eingesetzt werden.
Die Konzentration der Haloperoxidase bei den erfindungsgemäßen Verwendungsverfahren liegt vorzugsweise im Bereich von 0,0001 HU/ml bis 10 HU/ml, stärker bevorzugt im Bereich von 0,001 bis 1 HU/ml (wie nachstehend definiert).
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen erläutert, die keineswegs zur Einschränkung des Umfangs der Erfindung, wie beansprucht, gedacht sind.
Beispiele
Beispiel 1: Kultivierung von Curvularia-verruculosa-CBS 147.63
Curvularia-verruculosa-CBS 147.63 wird 165 Stunden bei 26°C und 250 U/min in einem Zweiliterfermenter mit einem Fermentationsmedium wachsengelassen, das die folgenden Bestandteile einschließt:

Glucose 15 g/l

Hefeextrakt 4 g/l

K₂HPO₄ 1 g/l

MgSO₄·7H₂O 0,5 g/l

VOSO₄ 167 mg/l
Das Medium wird vor dem Autoklavieren auf pH 7,2 eingestellt. Der Fermenter wird direkt aus Agar-Schrägröhrchen, suspendiert mit 10 ml sterilisiertem H₂O, enthaltend 0,1% Tween, beimpft, wobei 2,5 ml der Suspension zur Beimpfung jedes Schüttelkolbens verwendet wer den. Der Überstand wird durch Zentrifugation der gesamten Nährlösung gewonnen und wird gewaschen und unter Verwendung eines Filtron-Geräts mit einer 10-kDa-Ausschlussmembran 24fach konzentriert.
Beispiel 2: Haloperoxidase-Assays
Mikrotiter-Assays werden durch Mischen von 100 μl Haloperoxidase-Probe (etwa 0,2 μg/ml) und 100 μl 0,3 M Natriumphosphat pH 7 Puffer – 0,5 M Kaliumbromid – 0,08% Phenolrot, Zusetzen der Lösung zu 10 μl 0,3% H₂O₂ , und Messen der Absorption bei 595 nm als Funktion der Zeit durchgeführt..
Assays unter Verwendung von Monochlordimedon (Sigma M4632, ε = 20000 M^–1cm^–1 bei 290 nm) als Substrat werden wie nachstehend beschrieben durchgeführt. Die Abnahme der Absorption bei 290 nm wird als Funktion der Zeit gemessen. Die Assays werden in 0,1 M Natriumphosphat oder 0,1 M Natriumacetat, 50 μM Monochlordimedon, 10 mM KBr/KCl und 1 mM H₂O₂ unter Verwendung einer Haloperoxidase-Konzentration von etwa 1 μg/ml durchgeführt. Ein HU ist definiert als 1 Mikromol Monochlordimedon, das pro Minute bei pH 5 und 30°C chloriert oder bromiert wird. Temperatur-, pH- und H₂O₂-Stabilitätsexperimente werden durch Vorinkubation der Haloperoxidase unter den gegebenen Bedingungen und anschließendes Testen der Restaktivität in dem Mikrotiter-Assay durchgeführt.
Beispiel 3: Reinigung von Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase
30 ml konzentrierter Überstand aus der gesamten Nährlösung, beschrieben in Beispiel 1, werden auf eine 30-ml-Q-Sepharose-Säule (XK 16/60), äquilibriert mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0, geladen und mit 300 ml eines linearen Gradienten von Natriumchlorid von 0 bis 1 M bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min eluiert. Fraktionen von 3 ml werden gesammelt, und die Fraktionen, die die Haloperoxidase-Aktivität enthalten, werden vereinigt, konzentriert (Centricon-10, Amicon) und einer Gelfiltration auf einer HiLoad Superdex 75 (16/60) Säule (Pharmacia), äquilibriert in 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,1, unterzogen und mit dem gleichen Puffer bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Fraktionen von 1,5 ml werden gesammelt. Die Haloperoxidase-Assays werden wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.
Beispiel 4: Charakterisierung von Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase
Die, wie in Beispiel 3 beschrieben, aufgereinigte Haloperoxidase wird 45 min in 0,3 M Natriumphosphatpuffer pH 7 (Kontrolle) oder in 0,1 M Natriumcitrat-10 mM EDTA pH 3,8 vorbehandelt. Nach der Vorbehandlung wird die Haloperoxidase 2 h mit 10 mM Additiv in 0,2 M Tris-HCl pH 7,5 behandelt, wobei das Additiv entweder Na₃VO₄, FeCl₂ oder ZnCl₂ ist.
1 zeigt, dass die Haloperoxidase bei Behandlung mit EDTA Aktivität verliert, was die Gegenwart einer prosthetischen Gruppe, die für die Aktivität notwendig ist, anzeigt. Die Zugabe von Zink oder Eisen hat keine Auswirkung auf die Aktivität der Haloperoxidase. Allerdings ergab die Zugabe von Vanadat, dass die Haloperoxidase wieder die Aktivität zurückgewann, was anzeigt, dass sie eine Vanadium-prosthetische Gruppe enthält.
Das pH-Optimum und die Spezifität der Haloperoxidase gegenüber Br^– und Cl^– wird in 0,1 M Natriumacetatpuffer, enthaltend 50 mM Monochlordimedon, 1 mM H₂O₂, 10 mM KBr oder KCl und 0,4 μg/ml Haloperoxidase (Extinktionskoeffizient = 2,6 l/(g·cm), 30°C, bestimmt. Wie in 2 gezeigt, bevorzugt die Haloperoxidase Br^– gegenüber Cl^– als Substrat und besitzt ein pH-Optimum von etwa 5,75.
Das Temperaturoptimum der Haloperoxidase in 0,1 M Natriumacetatpuffer pH 5,5, enthaltend 50 mM Monochlordimedon, 10 mM KBr, 1 mM H₂O₂ und 0,1 μg/ml Enzym, beträgt etwa 60°C (3).
Die Stabilität der Haloperoxidase als Funktion der Temperatur wird durch Vorinkubation der Haloperoxidase für 1 h bei der gegebenen Temperatur in 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7 bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Haloperoxidase für mindestens 1 h bei Temperaturen bis zu 60°C stabil bleibt (4).
Die Haloperoxidase (4 μg/ml) ist auch über einen breiten pH-Bereich stabil, wie in 5 gezeigt, wobei mehr als 80% Aktivität nach 1 h Inkubation bei 30°C in 20 mM Britten-Robinson-Puffer bei variierendem pH von 5 bis 11 (Kontrolle bei pH 7,4°C) beibehalten werden.
Außerdem ist die Haloperoxidase (3 μg/ml) in Gegenwart von H₂O₂ äußerst stabil, wobei 75% Restaktivität nach 1 h Inkubation bei 60°C in Gegenwart von 0,1% H₂O₂ in 50 mM Natriumphosphat pH 7 (6) beibehalten werden.
Beispiel 5: Aminosäuresequenzierung von Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase
Reduzierte und S-carboxymethylierte Curvularia-verrucculosa-CBS147.63-Haloperoxidase (ca. 1 mg) wird mit 10 μg der Lysyl-spezifischen Protease aus Achromobacter in 20 mM NH₄·HCO₃ 16 h bei 37°C verdaut. Die resultierenden Peptide werden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Vydac-C18-Säule und 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) als Lösungsmittel A und 80% 2-Propanol, enthaltend 0,08% TFA, als Lösungsmittel B, getrennt. Die Säule wird zunächst mit 5% Lösungsmittel B (was 95% von Lösungsmittel A gleichkommt) äquilibriert. Anschließend wird die Säule mit 5% Lösungsmittel B 5 min nach Injektion des Peptidgemisches gewaschen. Die gebundenen Peptide werden schließlich bei einer Fließgeschwindigkeit von 150 μl/min mit einem linearen Gradienten von Lösungsmittel B, wobei der Gradient während 85 min läuft und bei 90 min Gesamtdauer mit 90% Lösungsmittel B (was 10% Lösungsmittel A entspricht) endet, eluiert. Die Peptide werden unter Verwendung eines linearen Gradienten, umfassend 0,1% TFA als Lösungsmittel A und 80% Acetonitril, enthaltend 0,08% TFA als Lösungsmittel B, bei einer Fließgeschwindigkeit von 250 μl/min erneut aufgereinigt.
Die Aminosäuresequenzierung wird nach den Anweisungen des Herstellers auf einem Applied Biosystems 473A Proteinsequenzierer durchgeführt.
Bei dem Verfahren der direkten Aminosäuresequenzierung wird es klar, dass der N-Terminus des Proteins blockiert ist und darum der Sequenzierung nicht zugänglich ist. Allerdings wird die Sequenz der acht internen Peptide bestimmt. Die erhaltenen Sequenzen sind wie folgt
Peptide 1:

Xaa-Phe-Ala-Thr-Gln-Ser-Glu-His-Ile-Leu-Ala-Asp-Pro-Pro-Gly-Leu-Arg-Ser-Asn-Ala-Asp-Glu-Thr-Ala-Glu-Tyr-Asp-Asp-Ser-Ile-Arg-Val-Ala-Ile-Ala-Met-Gly-Gly-Ala-Gln-Asp-Leu-Asn (SEQ ID NO:3)

Peptide 2:

Phe-Arg-Gln-Tyr-His-Ala-Pro-Phe-Tyr-Gly-Met-Thr-Thr-Lys (SEQ ID NO:4)

Peptide 3:

Asp-Val-Tyr-Ala-Val-Asp-Ser-Asn-Gly-Ala-Thr-Val-Phe-Gln-Asn-Val-Glu-Asp-Val-Arg-Tyr-Ser-Thr-Lys (SEQ ID NO:5)

Peptide 4:

Arg-Ser-Pro-Trp-Gln-Thr-Ala-Gln-Gly-Leu-Tyr-Trp-Ala-Tyr-Asp-Gly-Ser-Asn-Leu-Yal-Gly-Thr-Pro-Pro-Arg-Phe-Tyr-Asn-Gln-Ile-Val-Arg-Arg-Ile-Ala-Val-Thr-Tyr-Lys-Lys (SEQ ID NO:6)

Peptide 5:
Phe-Asp-Asp-Glu-Pro-Thr-His-Pro-Val-Val-Leu-Val-Pro-Val-Asp-Pro-Asn-Asn-Asn-Asn-Gly-Gly-Lys (SEQ ID NO:7)
Peptide 6:

Pro-Ala-Asp-Pro-Asn-Thr-Gly-Thr-Asn-Ile-Ser-Asp-Asn-Ala-Tyr-Ala-Gln-Leu-Ala-Leu-Val-Leu-Glu-Arg-Ala-Val-Val-Lys (SEQ ID NO:8)

Peptide 7:

Met-Leu-Ser-Ser-Leu-Tyr-Met-Lys (SEQ ID NO:9)

Peptide 8:

Net-Pro-Phe-Arg-Gln-Tyr-His-Ala-Pro-Phe-Tyr-Gly-Met-Thr-Thr-Lys (SEQ ID NO:10)

(SEQ ID NOS:3–10).
Peptid 8 ist identisch zu Peptid 2, mit der Ausnahme von zwei zusätzlichen Aminosäureresten am N-Terminus.
Beispiel 6: Aminosäureanalyse von Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase
Die Hydrolyse für die Aminosäureanalyse wird zweifach durchgeführt. Lyophilisierte Proben werden in evakuierten luftdicht verschlossenen Glasröhrchen, die 100 μl 6 N HCl, 0,1% Phenol enthalten, 16 h bei 110°C hydrolysiert. Die Analyse wird unter Verwendung eines Applied Biosystems 420 A Aminosäure-Analysis-System nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Die Ergebnisse der Aminosäure-Zusammensetzungsbestimmung sind in Tabelle 1 dargestellt (die Werte sind ein Durchschnitt von vier Bestimmungen). Tabelle 1. Aminosäurezusammensetzung der Haloperoxidase aus Curvularia-verruculosa. ND = nicht bestimmt
Beispiel 7: SDS-PAGE und IEF von Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase
SDS-PAGE (Novex) und IEF (Pharmacia) werden nach den Anweisungen der Hersteller durchgeführt. Das IEF-Gel wird zur Haloperoxidase-Aktivität unter Verwendung von Phenolrot-Reagens und H₂O₂ gefärbt.
SDS-PAGE zeigt, dass die Haloperoxidase ein Molekulargewicht von etwa 68 kDa besitzt, während IEF angibt, dass die Haloperoxidase einen isoelektrischen Punkt von etwa 3,8 aufweist.
Beispiel 8: Kohlehydrat-Analyse von Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase
Die Hydrolyse von Protein-gebundenem Kohlehydrat zur Monosaccharid-Zusammensetzungsanalyse wird zweifach durchgeführt. Lyophilisierte Proben werden in evakuierten verschlossenen Glasröhrchen mit 100 μl 2 M TFA für 1 h und 4 h bei 100°C hydrolysiert. Monosaccharide werden durch Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer Dionex PA1 Säule, eluiert mit 16 mM NaOH, getrennt und durch gepulste amperometrische Detektion nachgewiesen.
Die Monosaccharid-Zusammensetzungsanalyse zeigt, dass die Haloperoxidase glycosyliert ist, wie in Tabelle 2 gezeigt (die Werte sind ein Mittelwert aus vier Bestimmungen). Die Abwesenheit von Glucosamin bei der Analyse legt nahe, dass das Kohlehydrat wahrscheinlich O-verknüpft ist. Interessanterweise wird Glucose normalerweise nicht in Glycoproteinen festgestellt. Tabelle 2. Monosaccharid-Zusammensetzung der Haloperoxidase aus Curvularia verruculosa
Beispiel 9: Massenspektrometrie von Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase
Die Massenspektrometrie wird unter Verwendung einer Matrix-unterstützten Laserdesorption/Ionisation Flugzeitmassenspektrometrie in einem VG Analytical TofSpec durchgeführt. Für die Massenspektrometrie werden 2 μl der Haloperoxidase mit 2 μl gesättigter Matrixlösung (α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure in 0,1% TFA:Acetonitril (70:30)) vermischt, und 2 μl des Gemisches werden auf die Targetplatte aufgetüpfelt. Vor dem Einbringen in das Massenspektrometer wird das Lösungsmittel durch Verdampfen entfernt. Die Proben werden desorbiert und durch 4 ns Laserpulse (337 nm) an der Laser-Schwellenenergie ionisiert und in das feldfreie Flugrohr mit einer Beschleunigungsspannung von 25 kV beschleunigt. Die Ionen werden durch eine Mikrokanalplatteneinstellung bei 1850 V nachgewiesen. Intakte Haloperoxidase sowie alle Peptid-Ausgangsfraktionen werden durch Massenspektrometrie analysiert.
Die Massenspektrometrie zeigt eindeutig, dass die Glycosylierung der Haloperoxidase heterogen ist. Die durchschnittliche Masse der Haloperoxidase beträgt 64500 Da, was eine vernünftige Übereinstimmung mit dem Molekulargewicht von 66 kDa, bestimmt durch SDS-PAGE, ist. Die Masse der Haloperoxidase reicht von 62 kDa bis 66 kDa.
Beispiel 10: Spezifische Aktivitätsbestimmung von Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase
Die spezifische Aktivität der Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase wird unter den folgenden Bedingungen bestimmt: 0,1 M Natriumacetat, 50 μm Monochlordimedon, 1 mM H₂O₂ und 10 mM KCl bei pH 5 und 30°C.
Eine spezifische Aktivität von 13 HU/A₂₈₀ wird bestimmt, entsprechend einer spezifischen Aktivität von 33,8 U/mg Haloperoxidase, auf der Grundlage des gemessenen Extinktionskoeffizienten von 2,6 l/(g·cm). Unter vergleichbaren Bedingungen beträgt die von Simons et al., supra, angegebene spezifische Aktivität für die Curvularia-inaequalis-Haloperoxidase 7,5 U/mg. Somit scheint es, dass das Curvularia-verruculosa-Enzym eine etwa vierfach höhere spezifische Aktivität aufweist als diejenige von Curvularia inaequalis.
Beispiel 11: Genomische DNA-Extraktion
Curvularia-verruculosa-CBS-147.63 wird in 25 ml 0,5% Hefeextrakt-2% Glucose(YEG)-Medium 24 h bei 32°C und 250 U/min gezüchtet. Anschließend werden die Mycelien durch Filtration über Miracloth (Calbiochem, La Jolla, CA) gesammelt und einmal mit 25 ml 10 mM Tris-1 mM EDTA-(TE)-Puffer gewaschen. Überschüssiger Puffer wird von der Mycelien-Präparation getropft, welche anschließend in flüssigem Stickstoff eingefroren wird. Die eingefrorene Mycelien-Präparation wird in einer elektrischen Kaffeemühle zu einem feinen Pulver gemahlen, und das Pulver wird einem Einmal-Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff, enthaltend 20 ml TE-Puffer und 5 ml 20% Gew./Vol. Natriumdodecylsulfat (SDS) zugesetzt. Das Gemisch wird sorgfältig mehrmals invertiert, um das Mischen sicherzustellen, und zweimal mit einem gleichen Volumen von Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1 Vol./Vol./Vol.) extrahiert. Natriumacetat (3 M Lösung) wird der extrahierten Probe zugesetzt bis auf eine Endkonzentration von 0,3 M, gefolgt von 2,5 Volumina eiskaltem Ethanol, um die DNA auszufällen. Das Röhrchen wird bei 15000 × g 30 min zentrifugiert, um die DNA zu pelletisieren. Das DNA-Pellet wird 30 min lufttrocknen gelassen, bevor es in 0,5 ml TE-Puffer resuspendiert wird. DNase-freie Ribonuklease A wird dem resuspendierten DNA-Pellet bis auf eine Konzentration von 100 μg/ml zugesetzt, und anschließend wird das Gemisch 30 min bei 37°C inkubiert. Proteinase K (200 μg/ml) wird zugesetzt, und das Röhrchen wird noch eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert. Schließlich wird die Probe zweimal mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol extrahiert und die DNA mit Ethanol präzipitiert. Die präzipitierte DNA wird mit 70% Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet, in TE-Puffer resuspendiert und bei 4°C aufbewahrt.
Beispiel 12: PCR-Amplifikation von Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase-Gensegmenten
Auf der Grundlage der Aminosäuresequenzen der Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase, die vorstehend beschrieben wurden, und der Curvularia-inaequalis-Haloperoxidase, offenbart von Simons et al., supra, werden die nachstehend aufgeführten Oligonukleotid-Primer mit einem Applied Biosystems Modell 394 DNA/RNA Synthesizer nach den Anweisungen des Herstellers synthetisiert, um Haloperoxidase-Genfragmente aus Curvularia-verruculosa-CBS-147.63 zur PCR-Amplifikation zu verwenden.

Vorwärts-Primer: dGAAGAGTACAACACCAACTACATA

Rückwärts-Primer: dCCCATCGTAGGCCCAGTATAGGCCCTG
Amplifikationsreaktionen (100 μl) werden unter Verwendung von ungefähr 1 μg Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Genom-DNA als Templat vorbereitet. Jede Umsetzung enthält die folgenden Komponenten: 1 μg Genom-DNA, 40 pmol Vorwärts-Primer, 40 pmol Rückwärts-Primer, 200 μM von jedem dNTP, 1 × Taq-Polymerasepuffer (Perkin-Elmer Corp., Brauchburg, NJ) und 5 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin-Elmer Corp. Branchburg, NJ). Steriles Mineralöl (100 μl) wird über jedes Reaktionsgemisch geschichtet, und die Umsetzungen werden in einem Perkin-Elmer Modell 480 Thermal Cycler inkubiert, der wie folgt programmiert ist: Zyklus 1–5 min bei 95°C, 2 min bei 45°C und 5 min bei 67°C; Zyklus 2–2 min bei 30–95°C, 2 min bei 45°C und 2 min bei 67°C; und Einweichzyklus bei 4°C. Die Reaktionsprodukte werden auf einem niedrig schmelzendem 1%-Agarosegel (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) isoliert. Die Produktbanden werden aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung von β-Agarose (New England Biolabs, Beverly, MA) nach den Anweisungen des Herstellers aufgereinigt. Die aufgereinigten PCR-Produkte werden anschließend in einen pCRII-Vektor (Invitrogen, San Diego, CA) kloniert, und die DNA-Sequenzen werden unter Verwendung des lac-Vorwärts- und -Rückwärts-Primers (New England Biolabs, Beverly, MA) bestimmt.
Ein Haloperoxidase-Gensegment, bestehend aus ungefähr 278 Kodons (834 bp) wird aus Curvularia-verruculosa-CBS-147.63, wie in 7 gezeigt, mit den Haloperoxidase-spezifischen PCR-Primern, die vorstehend beschrieben sind, amplifiziert. Die DNA-Sequenzanalyse zeigt, dass das amplifizierte Gensegment einen Teil des entsprechenden Curvularia-verruculosa-Haloperoxidase-Gens codiert. Das Haloperoxidase-Gensegment wird zur Sondierung eines Southern Blots aus Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Genom-DNA verwendet.
Beispiel 13: Hybridisierungsanalyse der genomischen DNA
Gesamtzell-DNA-Proben, hergestellt aus Curvularia-verruculosa-CBS-147.63, beschrieben in Beispiel 11, werden durch Southern Hybridisierung (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) analysiert. Ungefähr 2–5 μg DNA werden mit XbaI, BamHI plus HindIII, BamHI plus PstI, oder BamHI plus XbaI verdaut und auf einem 1% Agarosegel fraktioniert. Das Gel wird unter kurzwelligem UV-Licht photographiert und 15 min in 0,5 M NaOH-1,5 M NaCl und anschließend 15 min in 1 M Tris-HCl pH 8–1,5 M NaCl eingeweicht. Die DNA in dem Gel wird auf eine Nytran^TM-Hybridisierungsmembran (Schleicher & Schuell, Keene, NH) durch Kapillar-Blotting in 20 × SSPE (3 M Natriumchlorid-0,2 M zweibasisches Natriumphosphat-0,02 M Dinatrium EDTA) nach Davis et al. (1980, Advanced Bacterial Genetics, A Manual for Generic Engineering, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) übergeführt. Die DNA wird auf die Membran unter Verwendung eines UV-Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA) vernetzt, und die Membran wird 2 h in dem folgenden Hybridisierungspuffer bei 45°C mit sanftem Rühren eingeweicht: 5 × SSPE, 50% Formamid (Vol./Vol.), 0,3% SDS und 200 μg/ml denaturierte und gescherte Lachshoden-DNA. Das Haloperoxidase-Genfragment, das aus dem Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-PCR-Klon, wie in Beispiel 2 beschrieben, isoliert wurde, wird radioaktiv markiert und zur Sondierung des Southern Blots von Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Genom-DNA verwendet. Insbesondere wird das Genfragment durch Nick-Translation (Maniatis et al., supra) mit α[³²P]dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL) radioaktiv markiert, durch Zugabe von NaOH bis zu einer Endkonzentration von 0,1 M denaturiert und dem Hybridisierungspuffer bei einer Aktivität von ungefähr 1 × 10⁶ cpm pro ml Puffer zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei 45°C in einem geschüttelten Wasserbad inkubiert. Nach der Inkubation werden die Membranen einmal in 0,2 × SSPE mit 0,1% SDS bei 45°C gewaschen , gefolgt von zwei Wäschen in 0,2 × SSPE (kein SDS) bei der gleichen Temperatur. Die Membranen werden auf Papiertüchern 15 min trocknengelassen, anschließend mit Saran-Wrap^TM eingepackt und über Nacht bei –70°C einem Röntgenfilm mit Intensivierungsschirmen (Kodak, Rochester, NY) ausgesetzt.
Die Analyse der Gesamtzell-DNA-Proben aus Curvularia-verruculosa-CBS-147.63 durch Southern Blot unter Bedingungen von mäßiger Stringenz unter Verwendung der PCR-abgeleiteten Haloperoxidase Gensegmentsonde aus Curvularia-verruculosa-CBS-147.63 zeigte ein einziges Hybridisierungssignal (8). Das einzige Hybridisierungssignal legt nahe, dass eine einzige Kopie des Haloperoxidase-Gens, das in dem Genom von Curvularia-verruculosa-CBS-147.63 vorhanden ist, vorliegt.
Beispiel 14: DNA-Bibliotheken und Identifizierung von Haloperoxidase-Klonen
Eine genomische DNA-Bibliothek wird in dem Bakteriophagen-Klonierungsvektor λZipLox (Life Technologies, Gaithersburg, MD) konstruiert. Zuerst wird die Gesamtzell-DNA teilweise mit Tsp509I abgebaut und auf 1% Agarosegelen größenfraktioniert. Die DNA-Fragmente, die im Größenbereich von 3–7 kb wandern, werden ausgeschnitten und aus dem Gel unter Verwendung von Prep-a-Genreagenzien (BioRad Laboratories, Hercules, CA) eluiert. Die eluierten DNA-Fragmente werden mit EcoRI-gespaltenen und dephosphorylierten λZipLox-Vektorarmen (Life Technologies, Gaithersburg, MD) ligiert, und die Ligationsgemische werden unter Verwendung von handelsüblichen Verpackungsextrakten (Stratagene, La Jolla, CA) verpackt. Die verpackten DNA-Bibliotheken werden ausgestrichen und in Escherichia-coli-Y1090ZL-Zellen (Life Technologies, Gaithersburg, MD) amplifiziert. Die unamplifizierte genomische DNA-Bibliothek enthielt 3,1 × 10⁵ pfu/ml (Hintergrundtiter ohne DNA betragen 2,0 × 10⁴ pfu/ml). Ungefähr 60 000 Plaques aus der Bibliothek werden durch Plaque-Hybridisierung unter Verwendung des Haloperoxidase-spezifischen PCR-Fragments aus Curvularia- verruculosa-CBS-147.63 als Sonde gescreent (Davis et al., 1980, Advanced Bacterial Genetics, A Manual for Genetic Engineering, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). Sechs Plaques, die starke Hybridisierungssignale mit der Sonde ergaben, werden zweimal in E-coli-Y1090ZL-Zellen aufgereinigt, und die Haloperoxidase-Gene werden anschließend aus dem λZipLox-Vektor als pZL1-Derivate (D'Alessio et al., 1992, Focus^® 14: 76) unter Verwendung der in vivo Exzision durch Infektion von E.-coli-DH10Bzip-Zellen (Life Technologies, Gaithersburg, MD) ausgeschnitten. Miniprep-DNA wird aus jedem dieser Klone hergestellt, und die Größe der Haloperoxidase-Inserts wird durch Agarosegelelektrophorese, wie in 9 gezeigt, bestimmt. Mehrere der Klone sind anscheinend verwandt, einschließlich zweier Klone, die mit 4A1 und 4A2 bezeichnet werden, die Inserts beherbergen, die mit der Plasmid-Bande (ca. 4,3 kb) co-migrieren. Der Haloperoxidase-Klon 4A (E.-coli-DH10B – pHAP4A.1) wird für eine DNA-Sequenzanalyse unter Verwendung eines Wizard 373 DNA-Aufreinigungs-Kits (Testsatzes) (Promega, Madison, WI) ausgewählt.
Beispiel 15: DNA-Sequenzanalyse von Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase-Gen

Die DNA-Sequenzierung des Haloperoxidase-Klons 4A (E.-coli-DH10B – pHAP4A.1), beschrieben in Beispiel 14, wird mit einem automatischen Applied Biosystem DNA-Sequenzierer Modell 373A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) an beiden Strängen unter Verwendung einer Kombination von Shotgun-DNA-Sequenzierung und der Primer-Walking-Technik mit der Farbstoff-Terminatorchemie (Giesecke et al., 1992; Journal of Virol. Methods 38: 47–60) durchgeführt. Zusätzlich zu den lac-Vorwärts- und lac-Rückwärtsprimern werden die folgenden Oligonukleotid-Sequenzierungsprimer, die zur Gensequenzierung verwendet werden, auf einem Applied Biosystems DNA/RNA-Synthesizer Modell 394 nach den Anweisungen des Herstellers synthetisiert:

Sequenzierungsprimer	Primersequenz
951337	dCATGTGGGACGAGCAGGTGCCGTTG (SEQ ID NO:11)
951338	dGATAGAAAAGTAGGCATCGTGGATA (SEQ ID NO:12)
951367	dCAGAGCTCTGGCAGAGAGAGGCGGTCC (SEQ ID NO:13)
951368	dCATTGGGGCTAGGCAGACGGTACGC (SEQ ID NO:14)
951369	dGAAGACAGCATCTTGAGAGCAGCTC (SEQ ID NO:15)
951455	dCAAGCGTAAGCAGCCAAACTGATCT (SEQ ID NO:16)
951456	dGAGATGTACATACGTCAGACCTGGC (SEQ ID NO:17)

Die Nukleotidsequenz des Gens, das die Curvularia-verrucrulosa-CBS-147.63-Haloperoxidase codiert, ist in 10 gezeigt. Die Sequenzanalyse des klonierten Inserts, das mit hpxI bezeichnet wird, ergibt ein großes offenes Leseraster von 1800 nt (ausschließlich des Stopp-Kodons), welches ein Protein von 600 Aminosäuren codiert. In dem Gen sind keine Introns vorhanden. Der G + C-Gehalt dieses offenen Leserasters beträgt 57%.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz der Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase, wie in 10 gezeigt, zeigt, dass das berechnete Molekulargewicht des primären Translationsprodukts 66,593 beträgt, was mit der Abschätzung von 68 kDa auf der Grundlage der Beweglichkeit des aufgereinigten Proteins auf SDS-PAGE und der Aminosäuresequenzen von Peptiden, die aus der aufgereinigten vorstehend beschriebenen Haloperoxidase stammten, übereinstimmt.
Die hergeleitete Aminosäuresequenz sagt die Gegenwart von nur zwei Cys-Resten in der Curvularia-verruculosa-Haloperoxidase voraus, die wahrscheinlich als freie Thiole in dem aktiven Enzym vorhanden sind, was mit der Haloperoxidase aus Curvularia inaequalis (Simons et al., 1995, European Journal of Biochemistry 229: 566–574) übereinstimmt. Es existieren drei potentielle Stellen für die N-Glycosylierung. Die Monosaccharid-Zusammensetzungsanalyse der Curvularia-verruculosa-Haloperoxidase, wie in Beispiel 8 beschrieben, gibt an, dass die Haloperoxidase mit 3 pmol Galactose, 16 pmol Glucose und 29 pmol Mannose pro pmol Haloperoxidase glycosyliert ist. Da jedoch das festgestellte Molekulargewicht der Curvularia-verruculosa-Haloperoxidase (68 kDa) der berechneten Größe (MW = 66,573) sehr nahe kommt, ist der Glycosylierungsgrad wahrscheinlich sehr gering. Außerdem legt die Abwesenheit von Glucosamin bei dieser Analyse nahe, dass die Kohlehydratgruppierungen O-verknüpft sind. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zur Haloperoxidase aus Curvularia inaequalis, die unglycosyliert beschrieben wird (Simons et al., 1995, European Journal of Biochemistry 229: 566–574).
Die hergeleitete Aminosäuresequenz der Curvularia-verruculosa-Haloperoxidase ist zu 90,9% mit derjenigen der Curvularia-inaequalis-Haloperoxidase identisch, wie in 11 gezeigt. Interessanterweise ist die Curvularia-inaequalis-Haloperoxidase um neun Reste länger als die Curvularia-verruculosa-Haloperoxidase und ist als zwei Cluster vorhanden, eines nahe am N-Terminus und das andere am C-Terminus der Curvularia-inaequalis-Haloperoxidase.
Beispiel 16: Produktion von Curvularia-verruculosa-CBS-444.70-Haloperoxidase
Eine Saatkultur von Curvularia-verruculosa-CBS-444.70 wird in einem 500-ml-Schüttelkolben hergestellt, enthaltend 100 ml Medium mit der folgenden Zusammensetzung:

Maisquellflüssigkeit (getrocknet) 1,2 g

Glucose 2,4 g

CaCO₃ 0,5 g

Sojaöl 0,5 ml
Der pH-Wert wird vor dem Autoklavieren auf 5,5 eingestellt.
Nach 3 Tagen Wachstum bei 26°C und 250 U/min wird ein 10-l-Laborfermenter mit der oben beschriebenen Saatkultur beimpft. Die Zusammensetzung des Mediums in dem Fermenter ist Folgende:

Hefeextrakt (Difco 0127) 8 g/l

K₂HPO₄ (Merck 5101) 2 g/l

MgSO₄·7H₂O (Merck 5886) 1 g/l

Dextrose (Roquelle 101-0441) 30 g/l

Na₃VO₄ 1 mg/l
Der pH-Wert wurde nicht eingestellt, sondern auf 6,2 gemessen. Die Fermentation findet bei 26°C, 550 U/min, 7 Tage statt.
Beispiel 17: Aufreinigung von Curvularia-verruculosn-CBS-444.70-Haloperoxidase
Die wie in Beispiel 16 beschrieben hergestellte Kulturlösung wird zentrifugiert, filtriert (GF/F Whatman) und auf einem Filtron-Apparat (Membranausschluss: 10 000 Da) ungefähr 80-fach aufkonzentriert und weiterhin in einer Amicon-Zelle (PM 10) konzentriert. Die konzentrierte Nährlösung wird auf eine Q-Sepharose-FF-Säule (100 ml, XK26, Pharmacia), die zuvor in 10 mM Kaliumphosphat pH 7 (Puffer A) bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min äquilibriert wurde, geladen. Die Säule wird mit 200 ml 10 mM Kaliumphosphat pH 7 gewaschen und sodann mit einem Gradienten von 0 → 1 M NaCl in dem gleichen Puffer während 200 min eluiert. Fraktionen von 10 ml werden gesammelt und je nach Gegenwart von Haloperoxidase-Aktivität, wie in Beispiel 2 beschrieben, vereinigt. Die Fraktionen 36–45 werden vereinigt und in einer Amicon-Zelle (PM 10) und einer Centricon-10-Zelle konzentriert. Proben von 1,5 ml des Konzentrats werden auf einer HiLoad Superdex 75-Säule (Pharmacia), äquilibriert mit 50 mM Natriumphosphat pH 7,1, geladen, und die Haloperoxidase wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Fraktionen von 1,5 ml werden gesammelt und, wie in Beispiel 2 beschrieben, auf Haloperoxidase-Aktivität getestet. Fraktionen, die Haloperoxidase-Aktivität enthalten, werden vereinigt.
Beispiel 18: Antibakterielle Aktivität von Curvularia-verruculosa-CBS-444.70-Haloperoxidase
Die antibakterielle Aktivität der Curvularia-verruculosa-CBS-444.70-Haloperoxidase, hergestellt wie in Beispiel 17 beschrieben, wird gegen die folgenden vier verschiedenen, nicht pathogenen Bakterien getestet:
Gramnegative Bakterien

Pseudomonas fluorescens (ATCC 13525)
Vibrio alginolyticus (ATCC 17749)

Grampositive Bakterien

Listeria innocua (ATCC 33090)
Micrococcus luteus (ATCC 10240)

Die Testorganismen werden in TY-Medium (mit Kaliumhydroxid auf pH 7,3 eingestellt), das die folgenden Komponenten einschloss, kultiviert:

Trypticase 20 g/l

Hefeextrakt 5 g/l

FeCl₂·4H₂O 6 mg/l

MnCl₂·7H₂O 1 mg/l

MgSO₄·7H₂O 15 mg/l
Antibakterielle Aktivität
Die Testorganismen (10⁷–10⁸ CFU/ml, wobei CFU = Kolonien-bildende Einheiten) in TY-Medien werden bei 30°C mit einer der folgenden Lösungen inkubiert (Haloperoxidase-Lösungen werden 0,2 μ Membran-filtriert):

(1) 10 ppm Benzalkoniumchlorid;
(2) eine Glucoseoxidase, erhalten aus Aspergillus niger, mit einer Aktivität von 0,2 GODU/ml (Sigma) + 10 mM Glucose;
(3) eine Glucoseoxidase, erhalten aus Aspergillus niger, mit einer Aktivität von 0,2 GODU/ml (Sigma) + 10 mM Glucose + 1 mM SCN^–;
(4) eine Glucoseoxidase, erhalten aus Aspergillus niger, mit einer Aktivität von 0,2 GODU/ml (Sigma) + 10 mM Glucose + 0,1 HU/ml C.-verruculosa-Haloperoxidase; und
(5) eine Glucoseoxidase, erhalten aus Aspergillus niger, mit einer Aktivität von 0,2 GODU/ml (Sigma) + 10 mM Glucose + 1 mM SCN^– + 0,1 HU/ml C.-verruculosa-Haloperoxidase.

Die Glucoseoxidase-Aktivität wird durch Oxidation von D-Glucose durch Sauerstoff zu Gluconsäure und Wasserstoffperoxid bestimmt. Das Wasserstoffperoxid, das dabei produziert wird, wird durch Peroxidase und 2,2-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat) zu Wasser reduziert. Die produzierte grünlich-blaue Farbe wird bei 418 nm gemessen. Die Analysebedingungen sind 0,1 M Natriumacetat, 90 mM β-D-Glucose, pH 5,6, 30°C und 20 min Umsetzung. Eine Glucoseoxidase-Einheit (GODU) ist definiert als die Menge an Glucoseoxidase, die die Umwandlung von 1 μmol Wasserstoffperoxid pro Minute unter diesen Bedingungen katalysiert.
Die Wachstumshemmung von Listeria und Micrococcus wird bei 30°C verfolgt, und die Trübung wird bei 490 nm gemessen.
Die in Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das Wachstum von Listeria oder Micrococcus nach Behandlung mit Lösung 5 gehemmt ist, obwohl das Wachstum von Micrococcus gegenüber Lösung 2 empfindlich war. Tabelle 3: Wachstum der grampositiven Bakterien, ausgedrückt in % relativ zur Kontrolle; Trübungszunahme bei 490 nm nach 24 h Inkubation wird gemessen
Die geringere Zellanzahl der Testorganismen (5¹⁰–10⁶ CFU/ml) werden mit den obigen Lösungen in 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7 1 h inkubiert und auf TY-Agar ausgestrichen. Wenn die Lösung 5 verwendet wird, werden die gramnegativen Bakterien (Pseudomonas und Vibrio) stark in Mitleidenschaft gezogen, während die grampositiven Bakterien unter den gegebenen Bedingungen überleben, wie in Tabelle 4 gezeigt. Das Überleben der grampositiven Bakterien kann auf der begrenzten Inkubationsdauer (1 h) beruhen. Tabelle 4: Antibakterielle Aktivität von aufgereinigter Haloperoxidase als % Überleben, bezogen auf CFU-Counts
Beispiel 19: Konstruktion eines Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase-(hpxI)-Aspergillus-oryzae-Expressionsplasmids
Die codierende Region des Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase-Gens (hpx) wird amplifiziert, und das resultierende Fragment wird zur Expression in Aspergillus oryzae in pBANe6 kloniert. pBANe6 stellt den TAKA/NA2-tpi-Promotor, den AMG3'-Terminator und das amdS-selektierbare Marker-Gen (12) bereit. Insbesondere wird das Fragment durch PCR unter Verwendung eines Sense-Primers (aHaP1) amplifiziert, der für das erste ATG im Raster ausgelegt war und der sich 20 bp stromabwärts erstreckte, und eines Antisense-Primers (aHaP1A), der für eine Region 14 bp stromabwärts des transkriptionalen Stopp-Kodons ausgelegt war und sich 19 bp stromabwärts erstreckte. Zur Erleichterung des Klonierens des amplifizierten Fragments enthalten der Sense- und Antisense-Primer eine SwaI- bzw. eine PacI-Restriktionsstelle. Die nachstehend gezeigten Oligonukleotid-Primer werden unter Verwendung eines ABI DNA/RNA-Synthesizers Modell 394 (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA) synthetisiert.

SwaI

aHaP1 5'GCATATTTAAATGATGGGGTCCGTTACACCAAT (SEQ ID NO:18)

PacI

aHaP1A 5'ATATTAATTAATCACTGGTAAACTCTGCCG (SEQ ID NO:19)
Die 50 μl PCR-Lösung (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% Gew./Vol. Gelatine) enthält ungefähr 200 ng hpxI-DNA, 200 μM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, und 50 pmol jeweils von jedem PCR-Primer, die vorstehend beschrieben sind. Fünf Einheiten von PWO-Polymerase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) werden zugesetzt, und die Umsetzung wird 3 min bei 95°C inkubiert und auf 80°C abgekühlt. Anschließend wird die Reaktion 30 Mal zyklisiert, jeder Zyklus 30 sec bei 95°C, 1 min bei 57°C und 1 min bei 72°C in einem Perkin-Elmer 9600 Thermal Cycler. Nach dem letzten Zyklus wird die Umsetzung 5 min bei 72°C inkubiert.
Ein vorausberechnetes 1,8-kb-Fragment wird durch Verdauung mit SwaI und PacI isoliert und wird in pBANe6, verdaut mit den gleichen Restriktionsendonukleasen, kloniert, um pAJ014-1 (13) zu erzeugen. Zur Verifizierung der Zuverlässigkeit des klonierten PCR-Fragments wird das Fragment nach dem Verfahren von Hattori und Sakaki (1986, Analytical Biochemistry 152: 232–237) unter Verwendung eines automatischen Applied Biosystems Sequenzierers Modell 373A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) sequenziert.
Die Sequenzierung des klonierten hpxL-amplifizierten Inserts von pAJ014-1 bestätigt, dass keine Unterschiede in der Sequenz, die in SEQ ID NO:1 beschrieben ist, bestehen.
Beispiel 20: Transformation des Aspergillus-oryzae-Stamms JaL142 mit pAJ014-1
Der Aspergillus-oryzae-Stamm JaL142 wird mit pAJ014-1 nach der folgenden Verfahrensweise transformiert. Die Transformation wird mit Protoplasten bei einer Konzentration von 2 × 10⁷ Protoplasten pro ml durchgeführt. 100 μl Protoplasten werden mit 10 μg DNA und 200 μl von 60% PEG 4000 – 10 mM HEPES – 10 mM CaCl₂ Lösung 30 min bei 34°C inkubiert. 3 ml SPTC (40% PEG 4000, 0,8 M Sorbitol, 0,05 M Tris pH 8,0, 0,05 M CaCl₂) werden zugesetzt, und die Protoplasten werden direkt auf COVE-Transformationsplatten (342,3 g Saccharose, 25 g Noble-Agar, 10 ml 1 M Acetamid, 20 ml COVE-Salzlösung und 10 ml 3 M CsCl pro Liter) für die amdS-Transformationen ausgestrichen. Die COVE-Salzlösung (50×) besteht aus 26 g KCl, 26 g MgSO₄·7H₂O, 76 g KH₂PO₄ und 50 ml COVE-Spurenmetall-lösung. Die COVE-Spurenmetalllösung besteht aus 0,04 g NaB₄O₇-10H₂O, 0,04 g CuSO₄-5H₂O, 0,70 g FeSO₄-H₂O, 0,80 g Na₂MoO₂-2H₂O und 10 g ZnSO₄ pro Liter. Die Platten werden bei 34°C 5–7 Tage inkubiert. Die Transformanten werden auf Platten des gleichen Mediums übertragen und bei 34°C 3–5 Tage inkubiert. Anschließend werden die Transformanten durch Spreiten der Sporen und Herauslesen von isolierten Kolonien unter Verwendung der gleichen Platten unter den gleichen Bedingungen aufgereinigt.
Beispiel 21: Expression von Curvularia-verruculosa-CBS-147.63-Haloperoxidase in Aspergillus oryzae
24 Transformanten aus Beispiel 20 werden jeweils in 1 ml 1/4 starkem MY50N-Medium, angereichert mit 1 mM V₂O₅, in einer 24-Well-Platte beimpft. MY50N-Medium besteht pro Liter aus 62,5 g Nutriose, 2 g MgSO₄-7H₂O, 2 g KH₂PO₄, 4 g Citronensäure, 8 g Hefeextrakt, 2 g Harnstoff, 0,1 g CaCl₂ und 0,5 ml Spurenmetalle. Die Spurenmetalllösung besteht aus 22 g ZnSO₄-7H₂O, 11 g H₃BO₃, 5 g FeSO₄-7H₂O, 1,6 g CoCl₂-5H₂O, 1,6 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄ und 50 g Na₄EDTA pro Liter. Die Kulturen werden 5 Tage bei 34°C unter Schütteln bei 150 U/min gezüchtet und sodann unter Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrensweise auf die Haloperoxidase-Aktivität getestet, mit der Ausnahme, dass der Assay-Puffer auch 1,25 mM V₂O₅ zur Aktivierung des Enzyms enthält. Die Assays werden durch Zugabe von 10 μl 0,3% H₂O₂ gestartet, und die Absorption bei 600 nm wird als Funktion der Zeit während der Inkubation bei 30°C aufgezeichnet. Die Aktivität wird als die Änderung der Extinktion bei 600 nm pro Minute pro ml (mOD₆₀₀/Minute-ml) ausgedrückt.
Die 24 Transformanten weise alle eine nachweisbare Haloperoxidase-Aktivität auf, die von 250 bis 8390 mOD₆₀₀/Minute-ml reicht. Die SDS-PAGE der Proben aus der 24-Well-Platte zeigt schnell die Gegenwart einer 66-kDa-Bande, entsprechend der Haloperoxidase, deren reichliches Vorhandensein sich gut mit den Testergebnissen deckt.
Die besten acht Transformanten werden anschließend zweimal als Spore aufgereinigt und in 125 ml Prallblech-Schüttelkolben, enthaltend 25 ml MY50N-Medium, angereichert mit 1 mM V₂O₅, aufgereinigt und 5 Tage bei 34°C unter Schütteln bei 250 U/min gezüchtet. Diese Kulturen werden nach 5 Tagen Wachstum getestet, und das beste Isolat, HaP14, wird in einem Fermenter bearbeitet.
HaP14 wird in einem Tankmedium bestehend aus 30 g Nutriose, 10 g Hefeextrakt, 2 g MgSO₄-7H₂O, 2 g K₂SO₄, 2 g Citronensäure, 3 g CaCl₂ und 0,5 ml Spurenmetalllösung (vorstehend beschrieben) pro Liter fermentiert, und während der Fermentation wird ein Medium bestehend aus 400 g Nutriose, 20 g Harnstoff und 1 g Citronensäure pro Liter zugeführt. Die Fermentation wird 7 Tage bei 34°C, pH 7,2, ablaufen gelassen, wonach ungefähr 1,2 l der Nährlösung geerntet werden. Tests, die mit den Proben der Nährlösung von Tag 1 bis 7 der Fermentation durchgeführt wurden, legen nahe, dass die Haloperoxidase-Produktion am Tage 4 maximal war und danach abfiel, obwohl die Produktion sich am Tag 7 etwas zu erholen schien (14).
HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
Die folgenden Stämmen wurden nach dem Budapester Vertrag in der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Laboratory, 1815 University Street, Peoria, Illinois 61604, USA hinterlegt.
Der Stamm wurde unter Bedingungen hinterlegt, die gewährleisten, dass der Zugriff auf die Kultur während der Anhängigkeit dieser Patentanmeldung möglich ist, von jemandem, der vom Comissioner of Patents and Trademarks zur Autorisierung dafür unter 37 C.F.R. § 1.14 und 35 U.S.C. § 122 bestimmt wird. Die Hinterlegung stellt eine im Wesentlichen reine Kultur jedes hinterlegten Stammes dar. Die Hinterlegung ist auf Anfrage für fremde Patentgesetze in Ländern verfügbar, in denen Entsprechungen zu der betreffenden Anmeldung oder ihrer Abkömmlinge eingereicht werden. Es sollte allerdings selbstverständlich sein, dass die Verfügbarkeit einer Hinterlegung keine Lizenz zur Ausübung der betreffenden Erfindung in Abkenntnis der Patentrechte, die durch behördliche Wirkung gewährt wurden, darstellt.
Die hier beschriebene und beanspruchte Erfindung ist im Umfang nicht durch die speziellen hier offenbarten Ausführungsformen eingeschränkt, da diese Ausführungsformen als Erläuterung von mehreren Aspekten der Erfindung gedacht sind. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Haloperoxidase mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 97% mit der in SEQ ID NO:2 ausgeführten Aminosäuresequenz homolog ist und die qualitativ die Aktivität des Proteins der SEQ ID NO:2 beibehält.
Haloperoxidase nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 99% mit der in SEQ ID NO:2 ausgeführten Aminosäuresequenz homolog ist.
Haloperoxidase nach Anspruch 1 mit einer in SEQ ID NO:2 ausgeführten Aminosäuresequenz.
Isolierte Haloperoxidase, die durch die codierende Region der in dem Plasmid pHAP4A.1 von E. coli DH10B, NRRL B-21519, enthaltenen Nucleinsäuresequenz codiert wird.
Isoliertes Nucleinsäurefragment, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, die eine Haloperoxidase nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.
Nucleinsäurefragment nach Anspruch 5, wobei die Nucleinsäuresequenz eine aus Curvularia verruculosa CBS 147.63 erhältliche Haloperoxidase codiert.
Nucleinsäurefragment nach Anspruch 5, wobei die Nucleinsäuresequenz in SEQ ID NO:1 ausgeführt ist.
Nucleinsäurekonstrukt, umfassend ein Nucleinsäurefragment nach einem der Ansprüche 5 bis 7, das mit den regulatorischen Regionen operabel verknüpft ist, die in der Lage sind, die Expression der Haloperoxidase in einem geeigneten Expressionswirt zu steuern.
Rekombinanter Vektor, umfassend ein Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 8.
Rekombinante Wirtszelle, umfassend das Nucleinsäurekonstrukt nach Anspruch 8.
Verfahren zur Herstellung der Haloperoxidase nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend (a) Fermentieren eines Curvularia-verruculosa-Stammes, um einen Überstand herzustellen, der die Haloperoxidase umfasst; und (b) Gewinnen der Haloperoxidase.
Verfahren zur Herstellung der Haloperoxidase nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend (a) Fermentieren einer Wirtszelle, die ein Nucleinsäurekonstrukt umfasst, das eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die die Haloperoxidase unter Bedingungen codiert, die der Expression der Haloperoxidase förderlich sind; und (b) Gewinnen der Haloperoxidase.
Verfahren zur Oxidation eines Halogenidions, umfassend die Umsetzung des Halogenidions und einer Wasserstoffperoxid-Quelle in Gegenwart einer Haloperoxidase nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Verfahren zur Halogenierung einer Verbindung, umfassend die Umsetzung der Verbindung, eines Halogenidions und einer Wasserstoffperoxid- Quelle in Gegenwart einer Haloperoxidase nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Verfahren zur Abtötung von mikrobiellen Zellen oder zur Hemmung des Wachstums mikrobieller Zellen, welches kein Verfahren zur therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers ist, umfassend das Zusammenbringen der Zellen mit einer Haloperoxidase nach einem der Ansprüche 1 bis 4, einer Wasserstoffperoxid-Quelle und einer Thiocyanat-Quelle in einer wässrigen Lösung.