CN109788762B

CN109788762B - 磁性固定化的杀生物酶和杀生物化学品

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Publication number: CN109788762B
Application number: CN201780049627.8A
Authority: CN
Inventors: S·科尔吉耶; Z·汉森
Original assignee: Zymtronix Inc
Current assignee: Zymtronix Inc
Priority date: 2016-08-13
Filing date: 2017-08-06
Publication date: 2023-07-11
Anticipated expiration: 2037-08-06
Also published as: US10993436B2; WO2018034877A1; CA3031802A1; EP3496539A4; CN109788762A; US20190174746A1; EP3496539A1; US20190174745A1

Abstract

本发明提供用于减少植物、动物、织物和由此所得产品中的微生物和线虫污染或感染的组合物和方法。本发明还提供用于减少人类感染和抗微生物药耐药性出现的组合物和方法。具体地说，本发明提供磁性纳米颗粒，其包含在一种组分中的杀生物酶或生物抑制酶，在第二组分中的所述酶的底物，和与所述酶组合或与之以协同方式起作用的杀生物化学试剂。这些组合物处于休眠状态，且在暴露于水合作用、氧气或混合时变得有活性。

Description

磁性固定化的杀生物酶和杀生物化学品

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年8月13日提交的美国临时申请No.62/374,836和于2017年5月25日提交的美国临时申请No.62/511,331的权益，两者通过引用以其全文并入本文。

发明领域

发明背景

污染和感染性微生物显著降低世界范围内农产品和动物产品的产量、质量和安全性。仅在美国，所造成的经济损失为每年数千亿美元。此外，目前用于减少植物和动物感染的方法在很大程度上依赖于抗微生物化学品的使用，这些化学物质可能导致杀真菌剂和抗生素抗性，由此又增加了选择抗药性植物、动物和人类病原体的可能性。这些微生物被选择以在存在医学和农业上重要的抗微生物化学品的情况下存活，并且是对人类健康和食物安全的重大威胁。

例如，抗生素抗性微生物(ARM)是一种日益增长的公共健康问题，因为感染变得越来越困难且治疗费用昂贵。关注在医院环境中变成了危机。最后的致胜手段抗生素例如万古霉素正逐渐变得对超级菌株无效。耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(Enterobacteriaceae)(CRE)是环境中最普遍存在的一些微生物，现在几乎对所有抗生素都有抵抗力。CRE感染很难治疗，50％感染它们的患者死亡。在2013年抗生素耐药性威胁报告中，CDC确定了三个主要问题：1)新的活性分子难以发现和生产；2)开发成本过高；和3)耐药性传播速度比以往任何时候都快。世界卫生组织(WHO)警告说，“由于缺乏紧急的纠正和保护行动，世界正朝着抗生素后时代的方向发展，在这个时代，许多常见感染将不再有治愈方法，[将]再次持续地杀伤。”(World Health Day，Combat Drug Resistance：No Action Today Means No CureTomorrow，Statement，WHO Director-General，Dr.Margaret Chan，2011年4月6日，http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2011/whd_20110407/en/。)2013年，疾病控制和预防中心(CDC)估计，导致医院获得性感染的细菌中有70％对至少一种相关抗生素有抗药性(Antibiotic Resistance Threats in the United States，2013，Centers forDisease Control and Prevention：Atlanta，GA，http://www.cdc.gov/drugresistance/threat-report-2013/。)公众宣传团体如谨慎使用抗生素联盟(Alliance for thePrudent Use of Antibiotics)长期以来一直在争论抗生素是社会药物。个人使用会影响整个社区。

由于研究和报道抗生素过度使用的后果，因此正在这种抗生素抗性已成为全世界关注的问题。CDC现在估计，在美国，每年至少有23,000人死于多种抗生素抗性细菌感染。文献同上。仅在美国，这些超级细菌感染造成200亿美元的医疗保健费用，350亿美元的社会成本以及每年800万的额外住院。(Roberts等人，Clin.Infect.Dis.49(8)：1175-84(2009)。)

在农业中，种子可以跨农场、州和国家传播植物细菌和真菌疾病。在某些情况下，幼苗由于“猝倒病”而死亡。这是由于根和/或下茎分解而在出苗之前或之后不久的幼苗死亡。控制这些疾病可以从种子开始。种子处理应保护种子免受例如细菌、病毒和真菌这样的病原体的侵害。因此，高质量、无病的种子是获得更高植物产量和食品安全的重要部分。

在农业中，细菌还可以在高密度育种操作中污染动物环境。进入食物链的致病微生物如沙门氏菌属(Salmonella)和利斯特氏菌属(Listeria)在产品召回和住院治疗方面耗资数亿美元。(Hoffmann，S.和T.D.Anekwe，Making Sense of Recent Cost-of-Foodborne-Illness Estimates，美国农业部，经济研究局，2013，http://www.ers.usda.gov/publications/eib-economic-information-bulletin/eib118.aspx；Hoffmann等人，J.Food Prot.75(7)：1292-1302(2012)。)

还已知一些食源性病原体变得抗生素抗性。食源性病原体对美国人具有巨大影响，每年导致4800万病例，28,000例住院治疗和至少3,000例死亡。(http://www.cdc.gov/foodborneburden/2011-foodborne-estimates.html。)它们对企业和医疗保健系统也产生了巨大影响，每年造成140-160亿美元的成本。这包括直接医疗费用和因疾病损失的时间价值。细菌是罪魁祸首。它们包括导致疾病的五大病原体中的四种，导致住院治疗的五大病原因中的三种，以及导致死亡的五大病原体中的三种。

线虫是微观蠕虫，每年在世界上造成800亿美元的作物损失。植物寄生线虫威胁着全世界的作物。事实上，所有作物都被至少一个线虫物种损坏。它们几乎攻击植物的每个部分，包括根、茎、叶、果实和种子。

估计约5,000种线虫是脊椎动物和人类的寄生虫。这些物种通常以较大的蠕虫寄生虫群为特征。控制家养脊椎动物的线虫寄生虫的策略包括控制次生宿主或载体以及使用化学驱虫剂。蛔虫可以感染狗、猫、牛、绵羊、猪和家禽。

大多数寄生蛔虫具有直接的生命周期，即不需要用于发育的中间宿主的自由生命阶段。它们可以直接感染其最终宿主，在那里它们迁移到偏好地点并完成对成年者的发育。在最终宿主内部，妊娠的雌性产生数千个卵，这些卵通常随宿主的粪便排泄并污染牧场、河流、湖泊等。

控制植物病原体非常依赖合成化学品来维持高产量。然而，公众越来越担忧农用化学品残留对人类健康和环境的影响(Mark等人，FEMS Microbiol.Ecol.56(2)：167-77(2006)；Ritter等人，J.Tox.Environ.Health 9(6)：441-56(2006)。)使用合成农用化学品的农民有较多的神经问题，包括头痛、疲劳、失眠、头晕和手颤(http://www.niehs.nih.gov/health/topics/agents/pesticides/)。农用化学品也会引起出生缺陷、神经损伤、癌症、精子活力下降和急性中毒(Moses，AAOHN J.，37(3)：115-30(1989)；Reeves and Schafer Int’l J.，Occup.Environ.Health 9(1)：30-39(2003)；Carozza等人，Environ.Health Perspect.116(4)：559-65(2008)；美国环境保护署，2014，http://www.epa.gov/pesticides/food/risks.htm)。此外，防止作物受到真菌病原体侵害对于不能使用合成抗真菌化学品的有机作物而言特别具有挑战性。

杀真菌剂和抗生素广泛用于发达的农业系统中以控制疾病并保护作物产量和质量。然而，随着时间的推移，对许多最有效的杀真菌剂和抗生素的抗性已经出现并在病原体种群中传播(Lucas等人，Adv Appl Microbiol.，90：29-92(2015))。常规给予农场动物抗真菌药和抗生素的广泛做法正在助长这种威胁。这种用法大部分用于预防而不是治疗疾病。农场动物携带的耐药微生物可通过食用受污染的食物、直接接触动物或通过环境传播(例如污染的水或土壤)传播给人类。人类和农场动物的抗生素和杀真菌剂抗性病原体正在出现并以新药开发可能不包含的速度传播。

因此，非常需要控制引起农业污染或感染以及人类感染的真菌、细菌、卵菌和线虫病原体的新方法。

发明概述

本发明提供用于减少植物、动物、织物和由此所得产品中的微生物污染或感染的组合物和方法。本发明还提供用于减少人类感染的组合物和方法。本发明还减少针对化学杀生物剂的微生物中的耐药性出现。具体地说，本发明提供磁性纳米颗粒，所述磁性纳米颗粒包含在一种组分中的杀微生物酶和/或微生物抑制酶，在第二种组分中的所述酶的底物，和与酶以协同作用方式起作用的化学杀微生物试剂。这些组合物处于休眠状态，且在暴露于水合作用、氧气或混合时变得有活性。

因此，本发明提供固体杀真菌组合物，其包含：第一组分，其具有磁性纳米颗粒的自组装中孔聚集体，所述聚集体包含产生过氧化氢的酶和产生自由基的酶；第二组分，其具有所述产生过氧化氢的酶的第一底物和所述产生自由基的酶的第二底物；和化学杀真菌剂；其中所述组合物基本上无活性，其中使所述第一组分和所述第二组分暴露于水合作用或氧气使所述组合物活化，并导致所述产生过氧化氢的酶的所述底物被氧化成过氧化氢，其中所述过氧化氢充当所述产生自由基的酶的底物，并且其中产生具有杀真菌活性的所述自由基。

在一些实施方案中，所述化学杀真菌剂选自精甲霜灵(mefenoxam)，腈菌唑，百菌清，丙硫菌唑(prothioconazole)，肟菌酯，丙环唑，代森锰锌和铜。在一个优选的实施方案中，所述化学杀真菌剂是百菌清。在另一个优选的实施方案中，所述化学杀真菌剂是代森锰锌。

本发明还提供固体杀细菌组合物，其包含：第一组分，其具有磁性纳米颗粒的自组装中孔聚集体，所述聚集体包含产生过氧化氢的酶和产生自由基的酶；第二组分，其具有所述产生过氧化氢的酶的第一底物和所述产生自由基的酶的第二底物；和化学抗生素；其中所述组合物基本上无活性，其中使所述第一组分和所述第二组分暴露于水合作用或氧气使所述组合物活化，并导致所述产生过氧化氢的酶的所述底物被氧化成过氧化氢，其中所述过氧化氢充当所述产生自由基的酶的底物，并且其中产生具有杀细菌活性的所述自由基。

在一些实施方案中，所述化学抗生素选自氨苄青霉素、链霉素、万古霉素和铜。

本发明提供液体杀真菌组合物，其包含：第一组分，其具有磁性纳米颗粒的自组装中孔聚集体，所述聚集体包含产生自由基的酶；第二组分，其具有所述产生自由基的酶的底物和过氧化氢源；和化学杀真菌剂；其中所述组合物基本上无活性，其中混合所述第一组分和所述第二组分使所述组合物活化，并导致所述过氧化氢源充当所述产生自由基的酶的底物，并且其中产生具有杀真菌活性的所述自由基。

在一些实施方案中，所述化学杀真菌剂选自由精甲霜灵，腈菌唑，百菌清，丙硫菌唑，肟菌酯，丙环唑，代森锰锌，精油和铜。在优选的实施方案中，所述化学杀真菌剂是百菌清。在另一个优选的实施方案中，所述精油是茶树油(TTO)。

本发明还提供液体杀细菌组合物，其包含：第一组分，其具有磁性纳米颗粒的自组装中孔聚集体，所述聚集体包含产生自由基的酶；第二组分，其具有所述产生自由基的酶的底物和过氧化氢源；和化学抗生素；其中所述组合物基本上无活性，其中混合所述第一组分和所述第二组分使所述组合物活化，并导致所述过氧化氢源充当所述产生自由基的酶的底物，并且其中产生具有杀细菌活性的所述自由基。

在一些实施方案中，最终的化学杀真菌剂浓度为半数最大有效浓度(EC₅₀)的约10％至2500％。在其他实施方案中，最终的化学抗生素浓度为最低抑制浓度(MIC)或最低杀菌浓度(MBC)的约1％至100％。

在本发明的其他实施方案中，本文公开的组合物和方法包含杀微生物组合物，其包含化学抗生素和化学杀真菌剂。

在本发明的一些实施方案中，所述磁性纳米颗粒的中孔聚集体具有氧化铁组合物。在本发明的其他实施方案中，所述磁性纳米颗粒的中孔聚集体具有磁性纳米颗粒尺寸分布，其中至少90％的磁性纳米颗粒具有至少约3nm和至多约30nm的尺寸，以及聚集颗粒尺寸分布，其中至少约90％的所述磁性纳米颗粒的中孔聚集体具有至少约10nm和至多500nm的尺寸。在本发明的其他实施方案中，所述磁性纳米颗粒的中孔聚集体具有至少10emu/g的饱和磁化强度。

在本发明的一些实施方案中，所述产生自由基的酶和产生过氧化氢的酶以至多约100％的饱和容量包含在所述磁性纳米颗粒的中孔聚集体中。

在本发明的一些实施方案中，所述产生过氧化氢的酶是氧化酶。在本发明的其他实施方案中，所述氧化酶是葡糖氧化酶或醇氧化酶。

本发明提供农产品，其包含本文公开的杀真菌和杀细菌组合物。在一些实施方案中，本发明提供包含本文公开的杀真菌和杀细菌组合物的液体杀有害生物剂(pesticide)产品。在其他实施方案中，本发明提供种子包衣，其包含本文公开的杀真菌或杀细菌组合物。在一些实施方案中，本发明提供包含本文公开的种子包衣的种子，其中所述种子选自蔬菜、果实、花和大田作物。

在优选的实施方案中，所述蔬菜种子选自：番茄、豌豆、洋葱、大蒜、香芹菜、牛至、罗勒属植物、芫荽叶、胡萝卜、甘蓝、玉米、黄瓜、萝卜、胡椒、青花菜(broccoli)、花椰菜、黄瓜、菠菜、羽衣甘蓝、牛皮菜(chard)、朝鲜蓟和莴苣。在其他优选的实施方案中，所述果实种子选自：柑橘、番茄、橙、柠檬、酸橙(lime)、鳄梨、克莱门氏小柑橘、苹果、柿、梨、桃、油桃、浆果、草莓、树莓、葡萄、蓝莓、黑莓、樱桃、杏、葫芦、笋瓜、西葫芦、茄子、南瓜、椰子、番石榴、芒果、番木瓜、甜瓜、蜜瓜(honeydew)、香瓜(cantaloupe)、西瓜、香蕉、车前草、菠萝、榲桲(quince)、花楸(sorbus)、枇杷(loquata)、李子、穗醋栗、石榴、无花果、橄榄、果实核、坚果、花生、杏仁、腰果、榛子、巴西坚果、阿月浑子果实和澳洲坚果。在其他更优选的实施方案中，所述大田作物选自玉米、小麦、大豆、低芥酸菜子(canola)、高粱、马铃薯、甘薯、山药、小扁豆、豆类(beans)、木薯、咖啡、干草(hay)、荞麦、燕麦、大麦、油菜、柳枝稷、象草、甜菜、甘蔗和稻。在其他更优选的实施方案中，所述花种子选自：一年生植物(annual)、多年生植物(perennial)、鳞茎、开花木本茎、康乃馨、玫瑰、郁金香、罂粟、金鱼草、百合、菊花、鸢尾属植物、六出花属植物、绒球花(pom)、紫藤和鹤望兰(bird of paradise)。

本发明提供动物衬料，其包含本文公开的杀真菌或杀细菌组合物。

本发明提供伤口敷料，其包含本文公开的杀真菌或杀细菌组合物。

本发明提供织物，其包含本文公开的杀真菌或杀细菌组合物。

本发明提供提高植物产品产量的方法，所述方法包括在所述植物的种植或萌发之前或期间使本文公开的改良种子暴露于水合作用和氧合作用。

本发明还提供提高动物产品产量的方法，所述方法包括在被所述动物使用之前或期间使本文公开的动物垫料暴露于水合作用和氧气。在优选的实施方案中，所述水合作用来自于所述动物尿液。在其他优选的实施方案中，所述动物产品可选自：活动物、乳、肉、脂肪、蛋、体液、血液、血清、抗体、酶、粗制凝乳酶、骨、动物副产品和动物废物。

在其他优选的实施方案中，所述动物可选自：奶牛、猪、鸡、火鸡、马、绵羊、山羊、驴、骡子、鸭、鹅、水牛、骆驼、牦牛、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠、豚鼠、爬行动物、两栖动物、鹦鹉、长尾小鹦鹉(parakeets)、凤头鹦鹉(cockatiels)、金丝雀、鸽子(pigeons)、斑鸠(doves)和昆虫。

本发明提供减少脓毒症的方法，所述方法包括将本文所述伤口敷料施用至伤口。

本发明提供生产本文公开的杀真菌或杀细菌组合物的方法，所述方法包括用选自水溶性纤维素衍生物、水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物和壳聚糖衍生物的基质材料配制所述第一组分，并用选自水溶性纤维素衍生物、水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物和壳聚糖衍生物的基质材料配制所述第二组分。在优选的实施方案中，所述第一组分还经受喷雾干燥、冷冻干燥、转鼓式干燥、脉动燃烧干燥或旋转种子包衣。在其他优选的实施方案中，所述第二组分进一步经受喷雾干燥、冷冻干燥、转鼓式干燥、脉动燃烧干燥或旋转种子包衣。

本发明提供减少或消除真菌或细菌生长的方法，所述方法包括用本文披露的液体杀真菌或杀细菌组合物对物质进行喷雾。

本发明提供保护农产品免受病原体侵害的方法，所述方法包括将所述产品暴露于本文公开的杀真菌或杀细菌组合物。在优选的实施方案中，所述病原体是植物、动物或人类病原体。在其他优选的实施方案中，所述病原体是真菌、卵菌或细菌。在更优选的实施方案中，所述真菌选自丝核菌属物种(Rhizoctonia speices)和镰刀菌属物种(Fusariumspeices)。在其他优选的实施方案中，所述病原体是选自下组的细菌：野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)，密执安棍状杆菌(Clavibacter michiganensis)，燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)，绿黄假单胞菌(Pseudomonas viridiflava)，丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)，大肠杆菌(Escherichia coli)，沙门氏菌属物种(Salmonellaspecies)和利斯特氏菌属物种(Listeria species)。在其他优选的实施方案中，所述病原体是选自腐霉属物种(Pythium species)和疫霉属物种(Phytophthora species)的卵菌。

本发明提供减少或消除植物中的猝倒病的方法，所述方法包括使所述植物暴露于本文公开的杀真菌或杀细菌组合物。

本发明提供固体杀线虫组合物，所述固体杀线虫组合物包含第一组分，其具有磁性纳米颗粒的自组装中孔聚集体，所述聚集体包含产生过氧化氢的酶和产生自由基的酶，和第二组分，其具有所述产生过氧化氢的酶的第一底物和所述产生自由基的酶的第二底物；其中所述组合物基本上无活性，其中所述第一组分和所述第二组分暴露于水合作用或氧气是所述组合物活化，并导致所述产生过氧化氢的酶的底物被氧化成过氧化氢，其中所述过氧化氢充当所述产生自由基的酶的底物，并且其中产生具有杀真菌活性的所述自由基。

本发明提供液体杀线虫组合物，所述液体杀线虫组合物包含第一组分，其具有磁性纳米颗粒的自组装中孔聚集体，所述聚集体包含产生自由基的酶；和第二组分，其具有所述产生自由基的酶的底物和过氧化氢源；其中所述组合物基本上无活性，其中混合所述第一组分和所述第二组分使所述组合物活化，并导致所述过氧化氢源充当所述产生自由基的酶的底物，并且其中产生具有杀真菌活性的所述自由基。

在优选的实施方案中，杀线虫组合物还包含精油。在更优选的实施方案中，所述精油选自茶树(TTO)，木橘属，藿香，柑橘，香茅，橙，松，桉树，万寿菊，天竺葵，柠檬草，橙，玫瑰草，薄荷，椒样薄荷(peppermint)，肉桂，丁香，迷迭香，百里香，大蒜，牛至，茴香(anise)，枯茗(cumin)，姜黄根(turmeric)，姜黄(curcuma)，香菜，小茴香(fennel)，洋葱和广藿香油。在最优选的实施方案中，所述精油是TTO。

本发明提供农产品，其包含本文公开的杀线虫组合物。在另外的实施方案中，本发明提供液体杀有害生物剂产品，其包含本文所述的杀线虫组合物。

本发明提供种子包衣，其包含本文所述的杀线虫组合物。在一些实施方案中，所述种子选自蔬菜、果实、花和大田作物。在优选的实施方案中，所述蔬菜种子选自番茄、豌豆、洋葱、大蒜、香芹菜、牛至、罗勒属植物、芫荽叶、胡萝卜、甘蓝、玉米、黄瓜、萝卜、胡椒、青花菜、花椰菜、黄瓜、菠菜、羽衣甘蓝、牛皮菜、朝鲜蓟和莴苣。

在其他优选的实施方案中，所述果实种子选自柑橘、番茄、橙、柠檬、酸橙、鳄梨、克莱门氏小柑橘、苹果、柿、梨、桃、油桃、浆果、草莓、树莓、葡萄、蓝莓、黑莓、樱桃、杏、葫芦、笋瓜、西葫芦、茄子、南瓜、椰子、番石榴、芒果、番木瓜、甜瓜、蜜瓜、香瓜、西瓜、香蕉、大蕉、菠萝、榲桲、山梨、枇杷、李子、穗醋栗、石榴、无花果、橄榄、果实核、坚果、花生、杏仁、腰果、榛子、巴西坚果、阿月浑子果实和澳洲坚果。

在其他优选的实施方案中，所述大田作物选自玉米、小麦、大豆、低芥酸菜子、高粱、马铃薯、甘薯、山药、小扁豆、豆类、木薯、咖啡、干草、荞麦、燕麦、大麦、油菜、柳枝稷、象草、甜菜、甘蔗和稻。

在其他优选的实施方案中，所述花种子选自一年生植物、多年生植物、鳞茎、开花木本茎、康乃馨、玫瑰、郁金香、罂粟、金鱼草、百合、菊花、鸢尾属植物、六出花属植物、绒球花、紫藤和鹤望兰。

本发明提供动物衬垫，其包含本文所述的杀线虫组合物。

本发明提供提高植物产量的方法，所述方法包括在所述植物的种植或萌发之前或期间将本文所述的种子暴露于水合作用和氧合作用。

本发明提供改善动物产品产量的方法，所述方法包括在被所述动物使用之前或期间将本文所述的动物衬垫暴露于水合作用和氧气。在一些实施方案中，所述水合作用来自于所述动物的尿液。在其他实施方案中，所述动物产品选自活动物，乳，肉，脂肪，蛋，体液，血液，血清，抗体，酶，粗制凝乳酶，骨，动物副产物和动物废物。在其他实施方案中，所述动物选自奶牛、猪、鸡、火鸡、马、绵羊、山羊、驴、骡子、鸭、鹅、水牛、骆驼、牦牛、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠、豚鼠、爬行动物、两栖动物、鹦鹉、长尾小鹦鹉、凤头鹦鹉、金丝雀、鸽子、斑鸠和昆虫。

本发明提供制备本文所述的杀线虫组合物的方法，所述方法包括：用选自水溶性纤维素衍生物、水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物和壳聚糖衍生物的基质材料配制所述第一组分和用选自水溶性纤维素衍生物、水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物和壳聚糖衍生物的基质材料配制所述第二组分。在一些实施方案中，所述第一组分进一步经受喷雾干燥，冷冻干燥，转鼓式干燥，脉冲燃烧干燥或旋转种子包衣。在其他实施方案中，所述第二组分进一步经受喷雾干燥，冷冻干燥，转鼓式干燥，脉冲燃烧干燥或旋转种子包衣。

本发明提供减少或消除线虫生长的方法，所述方法包括用本文所述的液体杀线虫组合物对物质进行喷雾。

本发明提供保护农产品免受线虫侵害的方法，所述方法包括将所述产品暴露于本文公开的杀线虫组合物。在一些实施方案中，所述线虫选自：根结线虫属物种(Meloidogynespecies(spp.))、异皮线虫属物种(Heterodera spp.)、球胞囊属物种(Globodera spp.)、短体属短体属物种(Pratylenchus spp.)、螺旋属物种(Helicotylenchus spp.)、香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、续断双垫刃线虫(Ditylenchus dipsaci)、肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)、剑线虫属物种(Xiphinema spp.)、滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)、弓蛔虫属物种(Toxocara spp.)、松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)和旋毛线虫(trichinella spiralis)。在优选的实施方案中，所述线虫是根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)、旋毛线虫(trichinella spiralis)或弓蛔虫属物种(Toxocara spp.)。

附图简述

图1A、1B和1C.LP:GOx酶之比和底物浓度对干酶盘(enzyme disk)杀菌效能的影响。分析进行两次，并且结果在两次重复中是一致的。显示单个分析运行的数据。LP:GOx之比对野油菜黄单胞菌莴苣致病变种(Xanthomonas campestris pv.Vitians)(Xcv)的抑制区(ZOI)的效果显示为1X(图1A)和10X(图1B)底物浓度。每个棒形条代表两次技术重复的平均值。图1C显示了在所有五种LP:GOx酶之比中平均1X与10X底物浓度的影响。每个棒形条代表十次重复的平均值。使用Tukey的可靠显著性差异(HSD)进行统计分析，P<0.05)。

图2.LP:GOx酶浓度对干酶盘对真菌生长(立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum))效能的影响。每个棒形条代表两次重复的平均值。上面带有星号的列具有显著性差异(Tukey的HSD，P<0.05)。

图3.三种LP:GOx酶浓度对终极腐霉(Pythium ultimum)生长的影响。平板A是仅具有干底物盘(substrate disk)的对照。平板B显示最低酶浓度(0.0034X或0.8nM酶)相对于对照不抑制终极腐霉的生长。平板C显示中等酶浓度(0.68X或161nM酶)完全抑制终极腐霉的生长。平板D显示高酶浓度(2X或476nM酶)也完全抑制终极腐霉的生长。

图4.通过

+酶盘(黑色条)、仅/>

(灰色条)和仅酶盘(虚线)处理后相对于未处理的对照的终极腐霉生长减少。酶盘中的酶浓度为81nM。

图5.通过

+酶盘(黑色条)、仅/>

(灰色条)和仅酶盘(虚线)处理后相对于未处理的对照的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)生长减少。酶盘中的酶浓度为81nM。

图6.

酶盘和/>

+酶盘处理后终极腐霉生长减少。酶盘中的酶浓度为81nM。较小的菌落直径表明卵菌生长抑制较大。平板A显示相对于未处理的对照，仅

处理(0.0078％/>

)导致生长减少18％。平板B显示未处理的对照。平板C显示，相对于未处理的对照，0.0078％/>

+酶盘处理导致生长减少97％，与仅杀真菌剂和仅酶盘处理的添加剂效果相比具有32％的协同效应。平板D显示相对于未处理的对照，仅酶盘处理导致生长减少46％。

图7.

酶盘和/>

+酶盘处理后瓜果腐霉生长减少。酶盘中的酶浓度为81nM。平板A显示相对于未处理的对照，仅/>

处理(0.078％/>

)导致生长减少34％。平板B显示未处理的对照。平板C显示，相对于未处理的对照，0.078％/>

+酶盘处理导致生长减少100％。培养填料周围的小白色光环归因于/>

的应用而不是菌丝生长。平板D显示相对于未处理的对照，仅酶盘处理导致生长减少84％。

图8.氨苄青霉素与干酶盘对Xcv的活性增强。酶盘中的酶浓度为238nM。平板A显示单独的100μg氨苄青霉素导致干扰区(ZOI)为36mm并且没有清除区(ZOC)。在整个ZOI中可以看到稀疏的氨苄青霉素抗性菌落。平板B显示100μg氨苄青霉素+干酶盘导致ZOC为32.5mm并且另外的ZOI延伸超过ZOC边缘4.5mm。平板C显示单独的干酶盘导致ZOC为33mm，没有超过ZOC边界的ZOI。使用反向黑白成像可视化平板A-C以增强生长可视化。

图9：在孵育三天后杀死的线虫百分比。每个棒形条代表三次重复的平均值。

图10A和10B：处理对线虫孵化(图10A)和卵(图10B)的影响。黑色条显示活的线虫幼虫计数，白色条显示死线虫幼虫计数。每个棒形条代表三次重复的平均值。

发明详述

本发明提供用于减少植物、动物、织物和其产品中的微生物污染或感染的组合物和方法。这首次通过化学抗微生物剂与多组分组合物的协同作用实现，所述多组分组合物包含(1)在一种组分中自组装磁性纳米颗粒中产生过氧化氢(HPP)的酶和产生自由基(FRP)的酶；和(2)另一种组分中酶的底物。这些磁性固定化酶可以是固体或液体组合物，它们是稳定的或无活性的。因此，它们可以在掺入产品之前或之后储存。当需要杀真菌活性时，这些多组分组合物通过暴露于水合作用和/或氧气而活化。HPP酶作用于底物以产生过氧化氢，例如，D-葡萄糖酸-δ-内酯。FRP酶作用于过氧化氢和一种或多种其他底物以产生自由基。过氧化氢和自由基具有抗微生物特性。在替代实施方案中，提供过氧化氢而不是产生过氧化氢的酶及其底物。通过暴露于水合作用和/或氧气来激活抗微生物活性。国际公开号WO2012122437和WO2014055853以及国际申请号PCT/US16/31419的公开内容通过引用整体并入本文。

包含包埋过氧化物酶的自组装中孔纳米簇具有高度活性且稳固。该技术是生物化学、纳米技术和生物工程的强力结合，一体化组织水平有三：第1水平是过氧化物酶和氧化酶与磁性纳米颗粒(MNP)自组装以便合成磁性中孔纳米簇。该水平利用分子自包埋机制固定和稳定酶。第2水平是使MNP稳定成其他矩阵。第3水平是产品整修和封装以递送水平1+2。吸附到酶的磁性纳米颗粒的集合在本文中也称为“生物纳米催化剂”(BNC)。

MNP固定作用提供高活性且具成本效益的过氧化物酶。过氧化物酶是非常强力的酶，但众所周知在工业环境下难以部署，因为存在过量过氧化物有强烈抑制作用。NP增加过氧化反应活性并减少其抑制作用，这使得NP具有工业用途。此外，MNP允许有较宽范围的操作条件，诸如温度、离子强度和pH。(MNP的尺寸和磁化强度影响NP的形成和结构，两者都对包埋的酶的活性具有重大影响。借助它们在各种反应条件下出乎意料的弹性，MNP可用作改良的酶剂或催化剂，当前正在使用其他的此类试剂。此外，可将它们用在其中尚未考虑或发现酶是适用的其他应用中。

BNC包含作为磁性纳米颗粒间空隙空间的中孔。酶优选地包埋或固定在BNC的中孔的至少一部分内。如本文所用，术语“磁性”涵盖所有类型的有用磁性特性，包括永久磁性、超磁性、顺磁性、铁磁体和亚铁磁性行为。

磁性纳米颗粒或BNC具有纳米级别的尺寸，即通常不超过500nm。如本文所用，当磁性纳米颗粒近乎或基本上为球形时，术语“尺寸”可指磁性纳米颗粒的直径。在磁性纳米颗粒不是近乎或基本上为球形(例如，基本上卵形或不规则)的情况下，术语“尺寸”可指磁性纳米颗粒的最长尺寸或三个尺寸的平均值。术语“尺寸”也可以指一群磁性纳米颗粒的尺寸的平均值(即“平均尺寸”)。

在不同的实施方案中，磁性纳米颗粒具有精确地、大约、至多或小于例如500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、50nm、40nm、30nm、25nm、20nm、15nm、10nm、5nm、4nm、3nm、2nm或1nm的尺寸，或具有在以上示例性尺寸中任何两者所界定的范围内的尺寸。

在BNC中，单个磁性纳米颗粒可视为具有以上提供的任何尺寸的初级纳米颗粒(即，初级微晶)。BNC中纳米颗粒的聚集体在尺寸上大于纳米颗粒，且通常具有至少约5nm的尺寸(即，次级尺寸)。在不同的实施例中，聚集体具有精确地、大约、至少、大于、至多或小于例如5nm、8nm、10nm、12nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm或800nm的尺寸，或具有在以上示例性尺寸中任何两者所界定的范围内的尺寸。

典型地，初级和/或聚集磁性纳米颗粒或其BNC具有尺寸分布，即，它们的尺寸通常是分散的，分散得或窄或宽。在不同的实施例中，初级或聚集体尺寸的任何范围可构成整个初级或聚集体尺寸范围的大部分或小部分。例如，在一些实施例中，特定的初级颗粒尺寸范围(例如，至少约1、2、3、5或10nm和至多15、20、25、30、35、40、45或50nm)或特定的聚集体颗粒尺寸范围(例如，至少约5、10、15或20nm和至多50、100、150、200、250或300nm)构成整个初级颗粒尺寸范围的至少或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。在其他实施例中，特定的初级颗粒尺寸范围(例如，小于约1、2、3、5或10nm或大于约15、20、25、30、35、40、45或50nm)或特定的聚集体颗粒尺寸范围(例如，小于约20、10或5nm、或大于约25、50、100、150、200、250或300nm)构成整个初级颗粒尺寸范围的不超过或小于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％。

磁性纳米颗粒聚集体(即，“聚集体”)或其BNC可具有任何孔隙度，包括实质上没有孔隙率，这取决于制成它们的单个初级微晶的数量。在特定实施例中，聚集体是中孔的，因为含有间隙中孔(即，位于初级磁性纳米颗粒之间，通过堆积排列形成的中孔)。中孔的尺寸通常为至少2nm和至多50nm。在不同的实施方案中，中孔可具有精确地或大约例如2、3、4、5、10、12、15、20、25、30、35、40、45或50nm的孔尺寸，或在以上示例性孔尺寸中任何两者所界定的范围内的孔尺寸。类似于颗粒尺寸的情形，中孔通常存在尺寸分布，即，它们的尺寸通常是分散的，分散得或窄或宽。在不同的实施例中，任何中孔尺寸范围可构成整个中孔尺寸范围或整个孔内容积的大部分或小部分。例如，在一些实施例中，特定的中孔尺寸范围(例如，至少约2、3或5和至多8、10、15、20、25或30nm)构成整个中孔尺寸范围或整个孔内容积的至少或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。在其他实施例中，特定的中孔尺寸范围(例如，小于约2、3、4或5nm，或大于约10、15、20、25、30、35、40、45或50nm)构成整个中孔尺寸范围或整个孔内容积的不超过或小于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％。

磁性纳米颗粒可具有本领域中已知的任何组成。在一些实施方案中，磁性纳米颗粒是或包括具有磁性的零价金属部分。此类零价金属的一些实例包括钴、镍和铁，以及它们的混合物和合金。在其他实施例中，磁性纳米颗粒是或包括磁性金属的氧化物，诸如钴、镍或铁的氧化物，或它们的混合物。在一些实施方案中，磁性纳米颗粒具有不同的核心和表面部分。例如，磁性纳米颗粒可具有由元素铁、钴或镍组成的核心部分以及由钝化层(如金属氧化物或贵金属包衣，如金层、铂层、钯层或银层)组成的表面部分。在其他实施例中，金属氧化物磁性纳米颗粒或其聚集体涂覆有贵金属包衣。贵金属包衣可以例如减少磁性纳米颗粒表面上的电荷数量，这可以有益地增加在溶液中的分散性，并更好地控制BNC的尺寸。在将螯合有机酸，如柠檬酸、丙二酸或酒石酸用在生物化学反应或过程中时，贵金属包衣防止磁性纳米颗粒因沥滤或螯合引起的氧化、溶解。钝化层可具有任何合适的厚度，且具体地、至少、至多或少于、约例如，0.1nm、0.2nm、0.3nm、0.4nm、0.5nm、0.6nm、0.7nm、0.8nm、0.9nm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm或10nm，或在这些值中任何两者所界定的范围内的厚度。

本发明可使用的磁性材料在本领域中是熟知的。非限制性实例包括铁磁体和铁磁体材料，包括矿石，如铁矿石(磁铁矿或天然磁石)、钴和镍。在其他实施例中，使用稀土磁体。非限制性实例包括钕、钆、镝、钐-钴、钕-铁-硼等。在另外的其他实施例中，磁体包括复合材料。非限制性实例包括陶瓷、铁氧体和铝镍钴磁体。在优选的实施例中，磁性纳米颗粒具有氧化铁组合物。氧化铁组合物可以是以下任一者：本领域中已知的磁性或超顺磁性氧化铁组合物，例如，磁铁矿(FesO/O、赤铁矿(α-Fe2θ3)、磁赤铁矿(γ-Fe2C>3)或根据化学式AB₂O₄的尖晶石铁氧体，其中A是二价金属(例如，Xn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺或其组合)，且B是三价金属(例如，Fe³⁺、Cr³⁺或其组合)。

单个磁性纳米颗粒或其聚集体或其BNC具有任何合适程度的磁性。例如，磁性纳米颗粒、BNC或BNC骨架组件可具有至少或至多5、10、15、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90或100emu/g的饱和磁化强度(Ms)。磁性纳米颗粒、BNC或BNC-骨架组件优选地具有不超过(即，至多)或小于5emu/g，和更优选地，至多或小于4emu/g、3emu/g、2emu/g、1emu/g、0.5emu/g或0.1emu/g的剩余磁化强度(Mr)。磁性纳米颗粒、BNC或BNC-骨架组件的表面磁场可以是约或至少例如约0.5、1、5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000高斯(G)，或在以上值中任何两者所界定的范围内的磁场。如果包括微粒，微粒也可以具有任何上述磁场强度。

磁性纳米颗粒或其聚集体可制成吸附适量的酶，至多或低于饱和水平，这取决于应用，以产生最终BNC。在不同的实施例中，磁性纳米颗粒或其聚集体可吸附约、至少、至多或少于例如，1、5、10、15、20、25或30pmol/m2的酶。可替代地，磁性纳米颗粒或其聚集体可吸附量为约、至少、至多或少于例如，约饱和水平的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的酶。

磁性纳米颗粒或其聚集体或其BNC具有任何合适的孔体积。例如，磁性纳米颗粒或其聚集体可具有约、至少、至多或低于例如约0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1cm3/g的孔体积，或在上述数值任意两个为边界的范围内的孔体积。磁性纳米颗粒或其聚集体或其BNC具有任意适合的比表面积。例如，磁性纳米颗粒或其聚集体可以具有约、至少、至多或小于例如约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200m2/g的比表面积。

MNP、其结构、组织化、适合的酶和用途描述在WO2012122437和WO2014055853中，其作为引用整体并入本文。

此外，本发明的组合物和方法减少或消除由病原体引起的植物死亡。在一些实施例中，本发明减少或消除“猝倒病”。美国植物病理学会将猝倒病定义为“由于根和/或下茎分解而在出苗前或出苗后不久幼苗的死亡；通常区分出苗前猝倒和出苗后猝倒。出苗前猝倒发生在幼苗从土壤线出现之前。出苗后猝倒发生在幼苗从土壤线出现后不久。这种疾病通常由真菌立枯丝核菌和卵菌属腐霉属中的许多物种引起，尽管其他真菌和卵菌可以起作用。该疾病不是作物特异性的，而对所有农作物造成损失。

在其他实施方案中，所述组件可有效对抗众多病原体。在一些实施方案中，所述病原体包括病原性植物细菌物种，诸如燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderia andropogonis)、石竹伯克霍尔德氏菌(Burkholderia caryophylli)、荚壳伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaglumae)、韧皮层杆菌属(Candidatus Liberibacter)、玉米红化病植原体(CandidatusPhytoplasma solani)、密执安棍状杆菌(Clavibacter michiganensis)、达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii)、番石槽欧文氏菌(Erwinia psidii)、黑胫病果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum)、甜菜果胶杆菌(Pectobacterium betavasculorum)、胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)、胡萝卜果胶杆菌甜菜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.betavasculorum)、山葵果胶杆菌(Pectobacteriumwasabiae)、植原体(Phytoplasma)、扁桃假单胞菌(Pseudomonas amygdali)、铁角藏假单胞菌(Pseudomonas asplenii)、番木瓜假单胞菌(Pseudomonas caricapapayae)、菊苣属假单胞菌(Pseudomonas cichorii)、晕斑假单胞菌(Pseudomonas coronafaciens)、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugate)、天仙果假单胞菌(Pseudomonas ficuserectae)、变黄假单胞菌(Pseudomonas flavescens)、褐鞘假单胞菌(Pseudomonas fuscovaginae)、向日葵假单胞菌(Pseudomonas helianthi)、边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)、栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)、帕勒隆尼氏假单胞菌(Pseudomonas palleroniana)、罂粟壳假单胞菌(Pseudomonas papaveris)、萨洛蒙假单胞菌(Pseudomonas salomonii)、萨氏假单胞菌(Pseudomonas savastanoi)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、番茄假单胞菌(Pseudomonas tomato)、涡轮假单胞菌(Pseudomonas turbinellae)、绿黄假单胞菌(Pseudomonas viridiflava)、Psyllid yellows、青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)、带化红球菌(Rhodococcus fascians)、柑桔顽固病菌(Spiroplasmacitri)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)、水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎沙门氏菌亚属(Salmonella enterica)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)和其他植物、动物、人类、土壤传播的和环境病原体。

在其他实施方案中，所述组件具有对抗非植物病原体细菌的抗微生物特性，包括大肠杆菌(Escherishia Coli)、布氏杆菌属物种(Brucella sp.)、弧菌属物种(Vibriosp.)、沙雷氏菌属物种(Serratia sp.)、诺卡氏菌属物种(Nocardia sp.)、钩端螺旋体属物种(Leptospira sp.)、分枝杆菌属物种(Mycobacterium sp.)、梭菌属物种(Clostridiumsp.)、芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)、葡萄球菌属物种(Staphylococcus sp.)、奈瑟氏菌属物种(Neisseria sp.)、嗜血杆菌属物种(Haemophilus sp.)、螺杆菌属物种(Helicobacter sp.)、支原体属物种(Mycoplasmasp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)、密螺旋体属物种(Treponema sp.)和耶尔森菌属物种(Yersinia sp.)。

在其他实施方案中，所述杀真菌组件有效抵抗植物病原性真菌，包括以下属，诸如链格孢属物种(Alternaria sp.)、蜜环菌属物种(Armillaria sp.)、壳二孢属物种(Ascochyta sp.)、曲霉属物种(Aspergillus sp.)、双极霉属物种(Bipoloaris)、烟管菌属物种(Bjerkandera sp.)、葡萄孢属物种(Botrytis sp.)、角担菌属物种(Ceratobasidiumsp.)、尾孢菌属物种(Cercospora sp.)、金锈菌属物种(Chrysimyxa sp.)、枝孢属物种(Cladosporium sp.)、旋孢腔菌属物种(Cochliobolus sp.)、鞘锈菌属物种(Coleosporiumsp.)、刺盘孢属物种(Colletotrichum sp.)、帚梗柱孢属物种(Cylindrocladium sp.)、壳囊孢属物种(Cytospora sp.)、间座壳属物种(Diaporthe sp.)、亚隔孢壳属物种(Didymella sp.)、内脐蠕孢属物种(Drechslera sp.)、白粉菌属物种(Erysiphe sp.)、外担菌属物种(Exobasidium sp.)、镰刀菌属物种(Fusarium sp.)、灵芝属物种(Ganodermasp.)、赤霉菌属物种(Gibberella sp.)、胶锈菌属物种(Gymnospragium sp.)、卷担菌属物种(Helicobasidium sp.)、纤孔菌属物种(Inonotus sp.)、小球腔菌属物种(Leptosphaeria sp.)、白壳菌属物种(Leucostoma sp.)、小皮伞属物种(Marasmius sp.)、叉丝壳属物种(Microspaera sp.)、毛霉属物种(Mucor sp.)、球腔菌属物种(Mycosphaerella sp.)、丛赤壳属物种(Nectria sp.)、粉孢属物种(Oidium sp.)、钉孢属物种(Passalora sp.)、拟盘多毛孢属物种(Pestalotiopsis sp.)、色链隔孢属物种(Phaeoramularia sp.)、茎点霉属物种(Phoma sp.)、叶点霉属物种(Phyllosticta sp.)、假尾孢菌属物种(Pseudocercospora sp.)、柄锈菌属物种(Puccinia sp.)、核腔菌属物种(Pyrenophora sp.)、丝核菌属物种(Rhizoctonia sp.)、根霉属物种(Rhizopus sp.)、壳针孢属物种(Septoria sp.)、痂圆孢属物种(Sphaceloma sp.)、匐柄霉属物种(Stemphyliumsp.)、小点霉属物种(Stigmina sp.)、腥黑粉菌属物种(Tilletia sp.)、核瑚菌属物种(Typhula sp.)、单胞锈菌属物种(Uromyces sp.)、黑粉菌属物种(Ustilago sp.)、轮枝孢属物种(Verticillium sp.)。

在其他实施方案中，杀真菌组件有效对抗植物病原性卵菌，包括以下属，例如丝囊霉属物种(Aphanomyces sp.)、盘霜霉属物种(Bremia sp.)、指霜霉属物种(Peronosclerospora sp.)、斜尖状孢子菌属物种(Peronospora sp.)、疫霉属物种(Phytophthora sp.)、轴霜霉属物种(Plasmopara sp.)、简述假霜霉属物种(Pseudoperonospora sp.)、腐霉属物种(Pythium sp.)和简述指疫霉属物种(Sclerophthora sp.)。在优选的实施方案中，卵菌是致病疫霉(Phytophthorainfestans)、活体营养型卵菌(Hyaloperonospora arabidopsidis)、栎树猝死病菌(Phytophthora ramorum)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、对葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)、樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)、寄生疫霉菌(Phytophthora parasitica)、终极腐霉或白锈菌(Albugo candida)。

许多线虫属和物种对大范围的植物具有高度破坏性，包括观叶植物，农艺和蔬菜作物，水果和坚果树，草坪和林木。因此，在一些实施方案中，本发明的组件可有效对抗线虫，例如根结线虫属物种(Meloidogyne species(spp.))、异皮线虫属物种(Heteroderaspp.)、球胞囊属物种(Globodera spp.)、短体属短体属物种(Pratylenchus spp.)、螺旋属物种(Helicotylenchus spp.)、香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、续断双垫刃线虫(Ditylenchus dipsaci)、肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)、剑线虫属物种(Xiphinema spp.)、滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)、弓蛔虫属物种(Toxocaraspp.)、松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)和旋毛线虫(trichinella spiralis)。

在其他实施方案中，本发明对植物病毒有效，所述植物病毒包括植物病毒，例如花叶病病毒，斑点病毒，菜豆金黄花叶病毒属，石竹隐潜病毒属，麝香石竹斑驳病毒属，线性病毒属，豆病毒属，真菌传棒状病毒组，蕃茄丛矮病毒科，马铃薯Y病毒科，蕃茄丛矮病毒科，马铃薯X病毒属，纤细病毒属，和蕃茄斑萎病毒属。

在一些实施方案中，本发明提供产生过氧化氢(HPP)的酶。在某些实施方案中，HPP酶是氧化酶，其可以是EX1.1.3亚属的。在特定实施方案中，氧化酶可以是EC1.1.3.3(苹果酸氧化酶)、EC1.1.3.4(葡糖氧化酶)、EC1.1.3.5(己糖氧化酶)、EC1.1.3.6(胆固醇氧化酶)、EC1.1.3.7(芳基-醇氧化酶)、EC1.1.3.8(L-古洛糖酸内酯氧化酶)、EC1.1.3.9(半乳糖氧化酶)、EC1.1.3.10(吡喃糖氧化酶)、EC1.1.3.11(L-山梨糖氧化酶)、EC1.1.3.12(吡哆醇4-氧化酶)、EC1.1.3.13(醇氧化酶)、EC1.1.3.14(儿茶酚氧化酶)、EC1.1.3.15(2-羟酸氧化酶)、EC1.1.3.16(蜕皮素氧化酶)、EC1.1.3.17(胆碱氧化酶)、EC1.1.3.18(仲醇氧化酶)、EC1.1.3.19(4-羟基扁桃酸氧化酶)、EC1.1.3.20(长链醇氧化酶)、EC1.1.3.21(甘油-3-磷酸氧化酶)、EC1.1.3.22、EC1.1.3.23(硫胺氧化酶)、EC1.1.3.24(L-葡糖酸内酯氧化酶)、EC1.1.3.25、EC1.1.3.26、EC1.1.3.27(羟基植烷酸氧化酶)、EC1.1.3.28(核苷氧化酶)、EC1.1.3.29(N-酰基氨基己糖氧化酶)、EC1.1.3.30(聚乙烯醇氧化酶)、EC1.1.3.31、EC1.1.3.32、EC1.1.3.33、EC1.1.3.34、EC1.1.3.35、EC1.1.3.36、EC1.1.3.37(D-阿拉伯糖-l,4-内酯氧化酶)(D-arabinono-l,4-lactoneoxidase)、EC1.1.3.38(香草醇氧化酶)、EC1.1.3.39(核苷氧化酶，H₂O₂形成)、EC1.1.3.40(D-甘露醇氧化酶)或EC1.1.3.41(木糖醇氧化酶)。

本发明在固体杀真菌组合物的一个顺序组分中提供产生自由基(FRP)的酶。在一些实施方案中，FRP是过氧化物酶。过氧化物酶广泛见于生物系统中并形成将过氧化氢(H₂O₂)还原为水以将大量从苯酚到芳香胺的各种芳香化合物氧化的氧化还原酶的子集。

过氧化物酶属于亚属EC1.11.1。在某些实施方案中，EC1.11.1酶可以更具体地是例如，EC1.11.1.1(NADH过氧化物酶)、EC1.11.1.2(NADPH过氧化物酶)、EC1.11.1.3(脂肪酸过氧化物酶)、EC1.11.1.4、EC1.11.1.5(细胞色素-c过氧化物酶)、EC1.11.1.6(过氧化氢酶)、EC1.11.1.7(过氧化物酶)、EC1.11.1.8(碘化物过氧化物酶)、EC1.11.1.9(谷胱甘肽过氧化物酶)、EC1.11.1.10(氯化物过氧化物酶)、EC1.11.1.11(L-抗坏血酸过氧化物酶)、EC1.11.1.12(磷脂-氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶)、EC1.11.1.13(锰过氧化物酶)、EC1.11.1.14(二芳基丙烷过氧化物酶)或EC1.11.1.15(过氧化物氧还蛋白(peroxiredoxin))。

在其他实施方案中，过氧化物酶也可以通过功能进一步具体化，例如，木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶或多功能过氧化物酶。过氧化物酶也可以指定为真菌、微生物、动物或植物过氧化物酶。过氧化物酶也可以指定为I类、II类或III类过氧化物酶。过氧化物酶也可以指定为髓过氧化物酶(MPO)、嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)、乳过氧化物酶(LPO)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、前列腺素H合成酶(PGHS)、谷胱甘肽过氧化物酶、卤代过氧化物酶、过氧化氢酶、细胞色素c过氧化物酶、山葵过氧化物酶、花生过氧化物酶、大豆过氧化物酶、芜青过氧化物酶、烟草过氧化物酶、番茄过氧化物酶、大麦过氧化物酶或过氧蛋白。在这些具体实施方案中，过氧化物酶是乳过氧化物酶。

乳过氧化物酶/葡糖氧化酶(LP/GOX)抗微生物系统在体液如乳、唾液、泪液和粘液中天然存在(Bosch等人，J.Applied Microbiol.，89(2)，215-24(2000))。这个系统利用硫氰酸盐(SCN-)和碘化物(I-)，两种天然存在的化合物，它们对哺乳动物和高等动物无害(Welk等人，Archives of Oral Biology，2587(2011))。LP在过氧化氢(H₂O₂)存在下将硫氰酸根和碘离子分别氧化为次硫氰酸根(OSCN-)和次碘酸根(OI-)。这个系统中的H₂O₂是GOX在氧气存在下作用于β-D-葡萄糖而提供。这些自由基化合物进而氧化微生物的细胞膜中的巯基基团(Purdy，Tenovuo等人，Infection and Immunity，39(3)，1187(1983)；Bosch等人，J.Applied Microbiol.，89(2)，215-24(2000)，导致膜渗透性受损(Wan，Wang等人，Biochemistry Journal，362，355-362(2001))，并最终导致微生物细胞死亡。次硫氰酸根和次碘酸根的浓度低至20μM可导致抑制细胞生长(Bosch，van Doorne等人，2000)。LP/GOX系统仅凭自己就有效作用于硫氰酸盐；当与碘化物成对时，存在协同作用，改善抑生物或杀生物活性，并扩展易受影响的目标范围，包括革兰氏阴性菌(例如，大肠杆菌、铜绿假单胞菌)、革兰氏阳性菌(例如，金黄色葡萄球菌、链球菌属物种)和真菌(例如，白念珠菌(C.albicans))(Reiter，Marshall等人，Infection and Immunity，13(3)，800-807(1976)；Bosch等人，J.Applied Microbiol.，89(2)，215-24(2000)；Welk等人，Archives of OralBiology，2587(2011))。此外，LP/GOX系统在两个阶段起作用：(1)产生次硫氰酸根和次碘酸根并作用于细胞膜上，然后在耗尽这些化合物时，(2)过量H₂O₂累积，将其自身的氧化损伤作用于细胞结构(Reiter，Marshall等人，1976)。前述参考文件通过引用以其全文结合在此。

工业上已经使用并批准该酶系统来控制生物膜，诸如牙膏和乳防变质剂。该系统大致上无特异性且稳固，反应要求极少。一项研究发现，在每两个月再进行接种18个月后，具有针对革兰氏(-)和(+)细菌和白念珠菌的稳定抑生物或杀生物活性，Bosch等人，J.Applied Microbiol.，89(2)，215-24(2000)。有效的pH范围为3-7，LP活性峰值是在pH 5处(Reiter，Marshall等人，1976；Purdy，Tenovuo等人，1983)。通常在pH 3下见到针对细菌的较高活性，但这有可能是因为低pH抑制生长(Reiter，Marshall等人，1976)。除pH外，LP/GOX系统的唯一严格要求是存在氧气，没有氧气，GOX无法从葡萄糖产生H₂O₂。前述参考文件通过引用以其全文结合在此。

LP/GOX已经被描述为用于微生物(包括细菌和真菌)的杀有害生物剂。(还参见美国专利号6,447,811，通过引用将其全文并入本文)。因此，在一些实施方案中，本文所述发明提供呈固体或液体制剂的磁性固定化的杀有害生物剂。杀有害生物剂包含产生自由基的过氧化物酶。在一些实施方案中，过氧化物酶是乳过氧化物酶。杀有害生物剂还包含过氧化物源，其可包括氧化葡萄糖的酶。

在本发明的一些实施方案中，化学杀真菌剂可以是以下的一种或多种：精甲霜灵，腈菌唑，百菌清，丙硫菌唑，肟菌酯，丙环唑，代森锰锌，铜，甲基苯并咪唑氨基甲酸酯，N-辛基二环庚烯二甲酰亚胺，去甲基化抑制剂(DMI)，苯酰胺(PA)，胺，硫代磷酸酯，二硫杂环戊烷，甲酰胺，羟基-(2-氨基-)嘧啶，苯胺基-嘧啶(AP)，N-苯基氨基甲酸酯，醌外抑制剂(QOI)，苯基吡咯(PP)，喹啉，芳香族碳氢化合物(AH)，杂芳香族化合物，黑色素生物合成抑制剂-脱水酶(MBI-D)，羟基苯胺，琥珀酸酯生物合成抑制剂(SBI)，多氧霉素，苯脲，醌内抑制剂(QiI)，苯甲酰胺，enopyranuronic acid抗生素，吡喃己糖基(hexopyranosyl)抗生素，吡喃葡糖基(glucopyranosyl)抗生素，氰基乙酰胺-肟，氨基甲酸酯，氧化磷酸化解偶联剂，有机锡化合物，羧酸，杂芳族化合物，膦酸酯，邻苯二甲酸，苯并三嗪，苯磺酰胺，哒嗪酮，ATP生成抑制剂，呼吸抑制剂复合物I，羧酰胺(CAA)，四环素抗生素，硫代氨基甲酸酯，包括水杨酸途径的宿主植物防御诱导剂，具有未知目标位点的杀真菌剂，具有多位点接触活性的杀真菌剂，矿物油，有机油或碳酸氢钾。

在本发明的一些实施方案中，使用化学抗生素，其可以是以下的一种或多种：氨基糖苷类，安沙霉素类，碳头孢烯类，碳青霉烯类，头孢菌素类，糖肽类，林可胺类，脂肽类，大环内酯类，单内酰胺类，硝基呋喃类，噁唑烷酮，青霉素类，多肽抗生素，喹诺酮类，氟喹诺酮类，磺胺类，四环素类。氨基糖苷类，安沙霉素类，碳青霉烯类，头孢菌素类，糖肽类，林可胺类，脂肽类，大环内酯类，单环内酰胺类，硝基呋喃类，噁唑烷酮类，青霉素类，多肽类，喹诺酮类，利福霉素类，链霉素类，磺胺类，四环素，结核放线菌素类或具有抗分枝杆菌活性的药物。在优选的实施方案中，化学抗生素是氨苄青霉素。

本发明提供了化学杀真菌剂和抗生素(化学杀微生物剂)可以通过本文所述组合物和方法中的最低抑制浓度(MIC)来测量。MIC是阻止细菌、真菌或卵菌可见生长的化学物质的最低浓度。例如，可以通过制备浓度逐渐增加的化学品溶液，将溶液与不同批次的培养细菌一起温育，并使用琼脂稀释液或肉汤微量稀释液测量结果来确定杀微生物剂的MIC。

最低杀菌浓度(MBC)是杀死特定细菌所需的抗菌剂的最低浓度。可以通过在不含测试试剂的琼脂平板上传代培养从肉汤稀释最小抑制浓度(MIC)测试来确定。通过确定降低初始细菌接种物存活率≥99.9％的最低抗菌剂浓度来鉴定MBC。MBC是对MIC的补充；而MIC测试显示抑制生长的最低水平的抗微生物剂，MBC显示出最低水平的抗微生物剂结合微生物死亡。这意味着即使特定的MIC显示出抑制作用，将细菌接种到琼脂上仍可能导致生物体增殖，因为抗菌剂不会导致死亡。如果MBC不超过MIC的四倍，则抗菌剂通常被认为是杀菌的。微生物可以在杀微生物剂中存活，因为它们对它们产生抗性。

本发明中的最终的化学杀真菌剂或抗生素的终浓度小于1％或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的最低抑制浓度(MIC)或最低杀菌浓度(MBC)。

本发明中的化学杀微生物剂也可以通过它们的EC₅₀来测量。术语半最大有效浓度(EC₅₀)是指在指定的暴露时间后在基线和最大值之间诱导响应的药物、抗体或毒物的浓度。它在本文中用作杀微生物剂效能的量度。因此，分级剂量响应曲线的EC₅₀代表化合物的浓度，其中观察到其最大效应的50％。量子剂量响应曲线的EC₅₀表示化合物的浓度，其中50％的群体在指定的暴露持续时间后表现出响应。本发明中的杀微生物剂，包括杀真菌剂和抗生素，其终浓度小于1％或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。在其他实施方案中，最终的化学生物微生物剂浓度为约100％-500％、500％-1000％、1000％-2000％、2000％-2500％、2500％-5000％、5000％-10,000％。

本发明提供无活性磁性固定化的酶。这些酶可以是无活性的，因为它们未暴露于水、氧气、底物或它们的任何组合。在本发明的一个优选实施方案中，磁性固定化的酶在油基中。这限制了使用之前的酶促活性。固定化酶在暴露于水合作用和/或氧气时活化。在一个更优选的实施方案中，磁性固定化的酶在油基中，该油基包含使油在水性溶液中乳化以形成水包油乳液的试剂。在另一个更优选的实施方案中，该油是矿物油、植物油或动物油。示例性矿物油包括石蜡油和煤油型油。示例性动物油包括鱼油，诸如鲱鱼油和鲭鱼油。植物油的实例是花生油、芝麻油、油菜籽油、亚麻籽油、蓖麻油、大豆油、玉米胚芽油和棉籽油。

在其他实施方案中，为了进一步促进磁性固定化的酶分布在表面上，还可向组合物或油基添加本领域中已知的一种或多种分散剂。在一些实施方案中，分散剂是非离子型表面张力降低物质。在优选的实施方案中，分散剂是乙氧基化醇和磷脂酰基脂质。

在其他实施方案中，可以添加一种或多种粘合剂。粘合剂可帮助防止磁性固定化的酶被雨水或其他条件从植物上淋洗掉。粘合剂在本领域中是熟知的。实例是淀粉，胶如黄原胶、阿拉伯树胶和羧甲基纤维素(CMC)。

可通过涂布、喷雾、喷洒、雾化、顶置喷雾、浇洒、沉浸和滴灌来施用组合物。特别有利于施用组合物的方法是同时以低体积方法(雾化系统)和高体积方法。可将滴灌用于在石棉和其他生长衬底上的培养系统。根据本发明的磁性固定化的酶也可以用于为滴灌系统消毒。在后两种情况中，存在油基严格来说不是最优活性所必需。浸没在有组合物的浴中尤其适合处理植物部分，具体地说可收获的部分，诸如鳞茎、块茎、果实等。

磁性固定化的酶可以制成不同形式以便可商购获得。在一个优选的实施方案中，过氧化物酶活性被尽可能长久地延缓，因为这会增加产品的储存寿命。酶活性在暴露于水合作用(即，水)和氧气时开始。在这种情况下，葡糖氧化酶/葡萄糖系统是过氧化氢供体。在更优选的实施方案中，过氧化氢供体与过氧化物酶分开提供。此外，如果需要，油基和分散剂也可以分开封装。

在另一实施方案中，提供试剂盒来形成组合物，该试剂盒包含含过氧化物酶(例如乳过氧化物酶)的任选地浓缩的酶组合物和过氧化氢供体(例如葡糖氧化酶和葡萄糖)。在优选的实施方案中，试剂盒还可包含硫氰酸盐、碘化物、油、乳化剂或分散剂。在更优选的实施方案中，这些成分在使用前彼此混合。在另一实施方案中，试剂盒可包含一种或多种浓缩形式的成分，以在使用前或在使用的同时稀释或水合。

在β-D-葡萄糖氧化为H₂O₂或纤维素衍生的糖氧化为H₂O₂的实施方案中，纤维素酶可与本发明组合物一起提供。在一些实施方案中，种子包衣还包含纤维素酶。

在一些实施方案中，纤维素酶是本领域内已知的外切纤维素酶、内切纤维素酶、半纤维素酶或它们的组合。内切纤维素酶(EC3.2.1.4)随机裂解非晶态位点的内键，产生新的链末端。外切纤维素酶(EC3.2.1.91)裂解内切纤维素酶产生的暴露链末端的两个至四个单元，得到四糖或二糖，诸如纤维二糖。主要有两类外切纤维素酶[或纤维二糖水解酶(CBH)]-CBHI从还原端逐渐起作用，而CBHII从纤维素的非还原端逐渐起作用。纤维二糖酶(EC3.2.1.21)或β-葡糖苷酶将外切纤维素酶产物水解成单个单糖。氧化性纤维素酶通过自由基反应使纤维素解聚，正如纤维二糖脱氢酶(受体)。纤维素磷酸化酶利用磷酸而非水使纤维素解聚。

在其他实施方案中，内切纤维素酶可包括EC3.2.1.4、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、纤维素酶A、纤维素酶AP、内切葡聚糖酶D、碱性纤维素酶、纤维素酶A3、环糊精酶、9.5纤维素酶、微晶纤维素酶、pancellaseSS和1,4-(1,3,1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶)。纤维素酶通常是由纤维素的真菌、细菌和原生动物产生。‘内切葡聚糖酶’的其他名称是：内切-1,4-β-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶(CMCase)、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶和环糊精酶。

在一些实施方案中，本文所述方法使用表达本发明中使用的酶的重组细胞。重组DNA技术在本领域中是已知的。在一些实施方案中，细胞经表达载体转化，诸如表达这些酶的质粒。在其他实施方案中，载体具有例如用于转录起始、转录终止翻译起始和翻译终止的一个或多个遗传信号。此处，将编码这些酶的核酸克隆进载体，以便在正确地转化到合适宿主生物中时表达。合适的宿主细胞可来自如本领域中熟知的细菌、真菌、植物或动物。

在一些实施方案中，本发明提供了基质材料是生物聚合物。实例包括多糖(例如，纤维素、半纤维素、木聚糖、壳聚糖、菊粉、葡聚糖、琼脂糖和藻酸)、聚乳酸和聚乙醇酸。在其他实施方案中，基质材料是水溶性纤维素衍生物、水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物和壳聚糖衍生物。

在一些实施方案中，基质包括纤维素。纤维素是化学式为(C₆H₁₀O₅)n的有机化合物，一种由几百到几千个β(1→4)连接的D-葡萄糖单元的直链组成的多糖。本发明中使用的纤维素可以得自或源自植物、藻类或微生物来源。在一些实施方案中，本发明提供本领域中已知的纤维素衍生物。纤维素的羟基(-OH)可与本领域中已知的试剂部分或完全反应。在优选的实施方案中，纤维素衍生物是纤维素酯和纤维素醚(-OR)。在更优选的实施方案中，纤维素衍生物是醋酸纤维素、三乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丙酸纤维素(CAP)、乙酸丁酸纤维素(CAB)、硝化纤维(硝酸纤维素)、硫酸纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(HPC)、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、乙基羟乙基纤维素和羧甲基纤维素(CMC)。

在一些实施方案中，基质包含羧甲基纤维素。羧甲基纤维素(CMC)或纤维素胶[1]是纤维素衍生物，其中羧甲基(-CH₂-COOH)结合到组成纤维素主链的吡喃葡萄糖单体的一些羟基上。它是利用本领域内已知的技术合成，例如通过纤维素与氯乙酸的碱催化反应。极性(有机酸)羧基使纤维素变得可溶并具有化学活性。CMC的功能性质取决于纤维素结构的取代度(即，多少羟基已经参与取代反应)，以及纤维素主链结构的链长和羧甲基取代基的群聚度。

在一些实施方案中，基质包含羟丙基纤维素(HPC)。HPC是纤维素的衍生物，具有水溶性和有机溶性。HPC是纤维素的醚，其中重复葡萄糖单元中的一些羟基已经利用环氧丙烷被羟丙基化，形成-OCH₂CH(OH)CH₃基团。每个葡萄糖单元的被取代羟基的平均数目被称为取代度(DS)。完全取代提供的DS为3。因为添加的羟丙基包含羟基，这也可以在制备HPC期间醚化。当发生这种情况时，每个葡萄糖环的羟丙基的摩尔数量，即取代摩尔(MS)可大于3。因为纤维素是非常结晶的，HPC必须具有约4的MS，以在水中达到良好溶解度。HPC具有疏水基团和亲水基团的组合，所以具有较低的临界溶解温度(LCST)，为45℃。在低于LCST的温度下，HPC易于溶解在水中；高于LCST时，HPC不可溶。根据在水中的浓度，HPC形成液晶和许多中间相。此类中间相包括各向同性的、各向异性的、向列型和胆甾相。最后一种产生许多颜色，诸如紫色、绿色和红色。

在一些实施方案中，基质包含甲基纤维素。甲基纤维素衍生自纤维素。它是一种亲水的纯净形式的白色粉末，并溶解在冷(而不是热)水中，形成透明粘稠的溶液或凝胶。甲基纤维素并不天然存在，且是通过加热纤维素与苛性溶液(例如氢氧化钠溶液)并用氯甲烷处理。在随后的取代反应中，羟基残基(-OH官能团)被甲醇盐(-OCH₃基团)替代。

依据被取代的羟基数目，可以制备不同类型的甲基纤维素。纤维素是由许多连接的葡萄糖分子组成的聚合物，每个分子暴露三个羟基。将给定形式的甲基纤维素的取代度(DS)定义为每个葡萄糖被取代的羟基的平均数量。因此，DS的理论最大值为3.0，然而，较通常的数值是1.3-2.6。

在一些实施方案中，基质包含藻酸盐。藻酸盐(Alginate)，也称为藻酸(Alginicacid)和褐藻胶，是广泛分布在褐藻的细胞壁中的阴离子多糖。当与水结合时，形成粘性胶。在萃取形式下，它迅速吸水；它能够在水中吸收200-300倍于自身的重量。它以丝状、颗粒状或粉末形式销售。本发明提供已知藻酸盐和藻酸盐衍生的材料的基质材料。在优选的实施方案中，藻酸盐-衍生的材料包括藻酸盐-聚赖氨酸-藻酸盐(APA)、藻酸盐/聚-l-赖氨酸/胶质/聚-1-赖氨酸/藻酸盐(APPPA)、藻酸盐/聚-1-赖氨酸/胶质/聚-l-赖氨酸/胶质(APPPP)和藻酸盐/聚-L-赖氨酸/壳聚糖/聚-l-赖氨酸/藻酸盐(APCPA)、藻酸盐-聚亚甲基-共-胍-藻酸盐(A-PMCG-A)、羟甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸甲酯(HEMA-MMA)、多层HEMA-MMA-MAA、聚丙烯腈-氯乙烯(PAN-PVC)。

在一些实施方案中，基质包含壳聚糖。壳聚糖是线性多糖，其由随机分布的β-(1-4)-连接D-葡糖胺(脱乙酰单元)和N-乙酰基-D-葡糖胺(乙酰化单元)构成。壳聚糖的氨基具有约6.5的pKa值，这导致酸性至中性溶液的质子化，其中电荷密度取决于pH和％DA-值。这使得壳聚糖具有水溶性，并使其成为生物粘合剂，容易结合至待负电荷表面，如粘膜膜。它在商业上通过用氢氧化钠使几丁质脱乙酰产生，几丁质是甲壳类(诸如蟹和虾)的外骨骼以及真菌的细胞壁中的结构元件。壳聚糖在农业中作为种子处理剂和杀有害生物剂使用。在酿酒中，它被用作澄清剂，也帮助防止腐败。它也用在绷带中用来减少出血和用作抗细菌剂。它也用来帮助通过皮肤递送药物。

在其他实施方案中，基质材料可以是丙烯腈/甲基丙烯磺酸钠、(AN-69)、聚乙二醇/聚五甲基环戊硅氧烷/聚二甲基硅氧烷(PEG/PD5/PDMS)、聚JVjiV-二甲基丙烯酰胺(PDMAAm)、硅质封装物和硫酸纤维素/藻酸钠/聚亚甲基-共-胍(CS/A/PMCG)。

在一些实施方案中，本发明提供尤其用于种子包衣的抗微生物组合物。易受到响应本文披露的酶系统的病原体伤害的任何种子将受益。在一些实施方案中，种子可以是植物、果实、大田作物和花的。在其他实施方案中，本发明提供尤其用于工业或商业相关驯养动物的垫料和由此衍生的产品的抗微生物组合物。许多驯养动物是本领域中已知的。在其他实施方案中，本发明提供尤其用于伤口敷料的抗微生物组合物。许多伤口敷料是本领域中已知的。本发明提供抵抗响应本文披露的酶系统的病原体或污染物的织物。织物包含本文所述的抗微生物组合物。

本发明的一些实施方案提供用于减少人类感染的组合物和方法。这是首次通过在一种组分中包含呈磁性纳米颗粒的产生过氧化氢(HPP)的酶和产生自由基(FRP)的酶和在另一种组分中包含这些酶的底物的多组分组合物来实现。固体组合物稳定且无活性。因此，可以在掺入产品之前或之后储存。当需要杀真菌活性时，多组分组合物通过水合作用活化。HPP酶作用于底物，产生过氧化氢和D-葡萄糖酸-δ-内酯。FRP酶作用于过氧化氢和一种或多种其他底物，产生自由基。过氧化氢和自由基具有杀真菌性质。

为了使在此所述的本发明可以得到更完全的理解，列出了以下实施例。应理解的是这些实施例仅出于说明性目的而不应理解为以任何方式限制本发明。

实施例1-干酶和底物盘的杀微生物优化

材料和方法

在干酶盘中分析五种不同的乳过氧化物酶(LP)与葡糖氧化酶(GOx)的摩尔比，以确定最大化杀细菌活性的最佳酶之比。还分析了干底物盘中的两种不同浓度的底物。这些分析在体外对细菌野油菜黄单胞菌莴苣致病变种分离物‘09131A’进行，其最初在纽约州采集并由康奈尔大学植物病理学教授Christine Smart分离和鉴定(http://blogs.cornell.edu/smartlab/.)。

进行第二次分析以确定抑制真菌生长的最佳酶浓度。在干酶盘中分析四种浓度的酶以确定使杀真菌活性最大化的最佳酶浓度。所有分析均在植物病原微生物培养物上体外进行，所述植物病原微生物培养物获自康奈尔大学植物病理学和植物微生物学部(CornellUniversity Section of Plant Pathology and Plant-Microbe Biology)(CornellUniversity，Ithaca，NY)的合作者。在纽约州采集真菌立枯丝核菌(分离物‘AC1-A1’)和禾谷镰刀菌(分离物‘GZ014NY98’)，其分别由Eric Nelson教授和Gary Bergstrom教授分离和鉴定。卵菌终极腐霉(分离物‘Geneva16’)在纽约州采集并由Eric Nelson教授分离和鉴定。https://pppmb.cals.cornell.edu/people/eric-nelson。

进行第三次分析以确定抑制卵菌生长的最佳酶浓度。分析三种浓度的酶以确定针对卵菌的最佳活性。卵菌终极腐霉(分离物‘Geneva16’)在纽约州采集并由Eric Nelson教授分离和鉴定(Cornell University，Ithaca，NY)。

为了优化杀菌活性的酶之比，将乳过氧化物酶(LP)和葡糖氧化酶(GOx)酶以五种不同的LP:GOx摩尔比固定(参见表1)。干酶盘组成与实施例2(表2)中列出的相同，除了酶浓度，其列于表1中。由于将1:1LP:GOx酶盘视为标准品，因此将GOx浓度成比例地降低以产生10:1和5:1的盘并且LP浓度成比例地降低以产生1:5和1:10的盘。将磁性纳米颗粒(pH 3)与LP+GOx酶混合物(pH 7.4)以1:1体积比例混合以固定酶。调节纳米颗粒浓度以维持30％酶:纳米颗粒质量之比(表1)。将所分析的两种干底物盘制剂、称为1X和10X列于表2中。将酶盘和底物盘组分与蒸馏的去离子H₂O混合以达到期望的浓度，并在真空下用干燥剂干燥除去H₂O。重复该过程以产生所有干酶和底物盘。

如US20150252352、PCT/US16/31419和Corgié等人，Adv.Functional Materials22：1940-51(2012)中所述制备磁性纳米颗粒并且用于过氧化物酶的分子俘获。上述内容通过引用整体并入本文。

进行两次分析以优化干酶和底物盘制剂的杀菌效能。每个处理一式两份进行。LP:GOx之比优化中总计包括10种处理。用1X和10X底物盘分析五种LP:GOx之比中的每一种。每个分析还包括仅1X和10X底物盘的对照。通过在包含LB琼脂的85-mm培养皿上生成Xcv的菌苔来建立分析。将100μl 1X 10⁷CFU/ml细菌悬浮液分配到每个培养皿(每个培养皿1X10⁶CFU)上，其含有三个无菌玻璃珠。旋转珠粒以使接种物均匀地铺展在平板的表面上。然后使用无菌镊子将干燥的底物盘置于每个平板的中心。然后将干酶盘置于干燥的底物盘上部，并用石蜡膜包裹每个平板并在26.7℃温育。在三天后测量围绕每个处理盘的抑制区域。使用包lme4和lsmeans、通过R Studio版本3.3.0(R Studio，Boston，MA)中的方差分析来分析数据，并且使用Tukey的可靠显著性差异分析进行平均值分离。P<0.05时平均值被视为具有值显著性差异。

表1.乳过氧化物酶和葡糖氧化酶在干酶盘中的优化

表2.干底物盘组成

组分	1X浓度	10X浓度
			碘化钾	0.3mM	3mM
硫氰酸铵	0.5mM	5mM
			羧甲基纤维素	0.7％	0.7％
葡萄糖	50mM	500mM

为了优化酶浓度对真菌的活性，以1:1摩尔比的LP:GOx分析四种酶浓度(1X，2X，5X和10X)。将1250μg/ml的LP和2580μg/ml的GOx以1:1的比例(pH 7.4)混合，并将LP+GOx悬浮液与12.77mg/ml(pH 3)的纳米颗粒在1:1的酶:NP体积比中混合。然后将成比例体积的固定化酶加入到实施例2中列出的酶盘组分中(参见表3)，以达到以下酶浓度：1X＝238nM；2X＝476nM；5X＝1190nM；和10X＝2380nM。在使用前将盘真空干燥。

分析干酶盘立枯丝核菌和禾谷镰刀菌的效能。将10X底物盘(表2)置于含有马铃薯葡萄糖琼脂的85-mm平板的中心。然后将干酶盘置于底物盘的上部，每个平板一个，然后将7mm真菌培养填料直接置于酶盘菌丝体侧面向下。在5天(立枯丝核菌)和6天(禾谷镰刀菌)后测量真菌菌落直径。

为了优化针对卵菌的活性，分析了三种酶浓度(0.0017X，0.34X，1X，1:1摩尔比的LP:GOx)。如前所述固定酶，然后将成比例体积的固定化酶加入实施例2(表3)中列出的酶盘组分中，以达到以下酶浓度：0.0034X＝0.8nM；0.68X＝161nM；和2X＝476nM。在使用前将片干燥。

分析干酶盘对抗终极腐霉的效能。将10X底物盘(见表2)置于含有马铃薯葡萄糖琼脂的85-mm平板的中心。然后将干燥的酶盘置于底物盘的上部，每层一个，然后将7mm真菌培养塞直接置于酶盘菌丝体侧面向下。5天后测量卵菌菌落直径。

杀细菌酶之比优化

当使用1X底物浓度分析LP:GOx之比时，1:1之比和有利于更高GOx浓度的比率导致Xcv的最大抑制区域(图1A)。在第一次分析中，基于方差分析和Tukey可靠显著性差异(Tukey的HSD，P<0.05)，该结果无统计学意义，但除1:10之比外，在第二次分析中具有显著性。当使用10X底物浓度分析LP:GOx之比时，观察到类似的模式(参见图1B)。在分析2中，与所有其他处理相比，1:1之比导致显著更大的抑制区域。1:5和1:10之比也比10:1和5:1之比具有显著更高的效能。在两种分析中，10X底物浓度导致比1X底物浓度显著更大的抑制区(参见图1C)。确定最大化杀菌效力的最佳干酶和底物盘配方为1:1LP:GOx摩尔比和10X底物浓度。

杀真菌酶浓度优化

禾谷镰刀菌对干酶盘比对立枯丝核菌更敏感(参见图2)。随着对禾谷镰刀菌和立枯丝核菌的观察到的酶浓度增加，存在增加的生长抑制模式。由于重复之间的高度变异性，所以观察到的差异很少有统计学意义(Tukey的HSD，P<0.05)。在10X浓度下，立枯丝核菌的生长受到的抑制显著高于1X浓度(见图2)。总体而言，LP:GOx酶浓度对真菌生长具有剂量效应，并且10X酶浓度通过分别减少22％和50％的立枯丝核菌和禾谷镰刀菌的生长而导致最大的抑制效果。

对卵菌的活性优化

在干酶盘中分析三种LP:GOx浓度对抗终极腐霉的效能。相对于对照，最低浓度(0.0034X)不抑制终极腐霉生长；然而，0.68X和2X浓度均杀灭了培养物填料，从而有效地使生长减少了100％(见图3)。

实施例2-化学杀真菌剂与固定化LP:GOx之间的协同作用

材料和方法

在体外对两种属于腐霉属的卵菌植物病原体分析了商品化学杀真菌剂与固定化酶组合对微生物生长的影响。将每种终极腐霉的分离物之一(分离物'Geneva 16')和腐霉菌(分离物'Pa58')分别收集在纽约州，并由Eric Nelson教授(Cornell UniversitySection of Plant Pathology and Plant-Microbe Biology，Cornell University，Ithaca，NY)鉴定。https://pppmb.cals.cornell.edu/people/eric-nelson。将分离物储存在玉米粉琼脂(CMA)上。

以1:1M之比、1.613μM的浓度和pH 7.4制备乳过氧化物酶(LP)和葡糖氧化酶(GOx)的悬浮液。通过将1.613μM酶悬浮液与1.277mg/ml纳米颗粒(NP)悬浮液(pH 3)以1:1的体积比组合来固定酶。然后将固定化的酶与固体基质组分组合，如表3中所述。根据表3中列出的底物盘组成制备单独的干底物盘。将液体酶和底物盘悬浮液以50μl等分试样分配到石蜡膜上，并在真空下干燥约1小时。将干酶和底物盘储存在环境温度(约22℃)下。

将

杀真菌剂(百菌清26.6％，由GardenTech，Palatine，IL制造，购自Amazon，Seattle，WA，目录号B000RUGIY0)。)/>

与无菌DDI H₂O混合以产生一系列4种稀释液(0.78％/>

0.078％/>

0.039％/>

0.0078％/>

)。分析的最高浓度(0.78％/>

)是蔬菜最高标记率的两倍，并且恰好低于/>

对腐霉的半数最大有效浓度(EC₅₀)值。将EC₅₀定义为在基线和最大响应之间诱导响应的杀真菌剂浓度。基于对图5所示数据的回归分析，/>

对腐霉菌的EC₅₀值为0.2％。基于回归，估计完全杀真菌浓度为约5％/>

通过在每个平板的中心堆叠两个无菌7mm滤纸片并将50μl杀真菌剂溶液或无菌DDI H₂O(对照)施加到堆叠的片上，将杀真菌剂施加到含有CMA的85mm培养皿的中心。包括

+固定化酶盘的处理通过在每个CMA平板的中心堆叠放置一个底物盘，一个酶盘和2个滤纸片以及50μl杀真菌剂作为最后一步来制备。放置7mm活跃生长的腐霉菌丝体塞，菌丝体侧朝下，直接在每个平板中心处理的顶部。对终极腐霉和瓜果腐霉进行了一次完整的分析。处理方法如下：

·仅

(0.78％)

·仅

(0.078％)

·仅

(0.039％)

·仅

(0.0078％)

·对照-H₂O滤纸上

·对照-1干酶盘和1干底物盘+H₂O滤纸上

·

(0.78％)+1干酶盘和1干底物盘

·

(0.078％)+1干酶盘和1干底物盘

·

(0.039％)+1干酶盘和1干底物盘

·

(0.0078％)+1干酶盘和1干底物盘

将平板储存在工作台上，使菌落生长2天，然后记录每个平板的两个垂直菌落直径测量值。对每个平板求两个垂直测量值的平均值。

表3.固体固定化酶和底物盘组成

与仅

和仅酶处理相比，/>

+酶盘处理导致终极腐霉和瓜果腐霉的抑制增加(参见图4、5、6和7)。/>

+酶盘的累加效应是通过将仅由/>

引起的生长减少和仅由酶盘引起的生长减少加在一起计算的。仅酶处理导致终极腐霉和瓜果腐霉生长分别减少46％和84％。/>

+酶盘对于瓜果腐霉的累加效应超过100％，这归因于其对酶盘的高敏感性。因此，仅报道了终极腐霉的累加和协同效应(参见图4)。

+酶盘对终极腐霉的协同活性从最高/>

浓度下的生长抑制增加13％到最低/>

浓度下32％生长抑制。在对终极腐霉分析的四种/>

浓度中的每一种中均观察到/>

与酶盘之间的协同作用(参见图4)。图4和5中报告的值是相对于未处理对照的腐霉属生长的减少百分比。

使终极腐霉和瓜果腐霉体外暴露于四种浓度的商品化学杀真菌剂

仅酶盘和/>

+酶盘相对于未处理的对照在每次处理中减少菌丝体生长。分析仅底物盘和无菌滤纸+H₂O的作用作为对照，并且均未发现抑制菌丝体生长。在所有四种/>

浓度下观察到/>

与酶盘组合对终极腐霉抑制的协同作用(见图4)。这表明

或含百菌清的产品通过包含固定化酶盘而具有增强的效能。另外，在酶盘存在下可以使用较少的化学杀真菌剂以达到与不存在酶盘时更高的杀真菌剂施用率相同的真菌抑制或疾病控制水平。

由于该物种对该分析中使用的酶盘的高敏感性，所以不能计算出瓜果腐霉的

与酶盘之间的协同作用。然而，与仅/>

和仅酶盘处理相比，/>

+酶盘的处理始终导致对瓜果腐霉生长的更大抑制(参见图5)。还分析了与和不与/>

一起的固定化酶盘中LP:GOx的较低酶浓度对瓜果腐霉的影响。

实施例3-抗生素与固定化LP:GOx之间的协同作用

材料和方法

将抗生素悬浮液(氨苄青霉素)稀释至4个浓度，使得应用于无菌滤纸片的最终量为0.1μg，1μg，10μg和100μg。氨苄青霉素对野油菜黄单胞菌的最低抑制浓度(MIC)估计在10μg至50μg之间。MIC被定义为完全抑制被评估细菌生长的抗生素的最低浓度，并且最低杀菌浓度(MBC)被定义为杀灭细菌的最低抗生素浓度。对于野油菜黄单胞菌没有测定，因为抗性菌落在最高抗生素浓度下持续存在。根据表3中的配方制备干酶盘，除外酶浓度为238nM。根据表2中的配方制备10X干底物盘。分析了以下处理方法：

·仅0.1μg抗生素

·仅1μg抗生素

·仅10μg抗生素

·仅100μg抗生素

·对照-无菌DDI H₂O滤纸上

·对照-1干酶盘和1干底物盘+无菌DDI H₂O滤纸上

·对照-1干底物盘+无菌DDI H₂O滤纸上

·0.1μg抗生素+1干酶盘和1干底物盘

·1μg抗生素仅+1干酶盘和1干底物盘

·10μg抗生素仅+1干酶盘和1干底物盘

·100μg抗生素仅+1干酶盘和1干底物盘

如实施例1中所述，通过在85-mm培养皿上产生Xcv的菌苔来进行分析。它遵循实施例2中描述的方法，除外使用四种浓度的抗生素悬浮液代替杀真菌剂。还测量了两天后细菌生长的抑制区域，而不是在处理顶部放置7-mm真菌填料并测量菌落直径。

结果：

在四种氨苄青霉素单独处理中，仅100μg氨苄青霉素单独处理抑制Xcv的生长。该处理导致ZOI为36mm(图8)。单独使用100μg氨苄青霉素不会导致ZOC，并且在36mm ZOI中可以看到氨苄青霉素抗性细菌菌落(图8)。所有四种氨苄青霉素+干酶处理导致ZOC从31mm到33.5mm(表4)。100μg氨苄青霉素+干酶盘处理导致ZOC为32.5mm，另外ZOI延伸超过ZOC边界4.5mm。通过清除处理周围的ZOC中的所有存活细菌并抑制超过ZOC的细菌生长，100μg氨苄青霉素+干酶处理比单独的氨苄青霉素或单独的酶盘对Xcv产生更大的抑制作用。没有酶的对照无法抑制Xcv的生长。

表4.单独的氨苄青霉素和氨苄青霉素+干酶盘处理周围的Xcv清除区(ZOC)和抑制区(ZOI)

处理	ZOC(mm)	ZOI(mm)
			100ug氨苄青霉素	0	36
10ug氨苄青霉素	0	0
			1ug氨苄青霉素	0	0
0.1ug氨苄青霉素	0	0
			对照-fp+H₂O	0	0
100ug氨苄青霉素+酶盘	32.5	37
			10ug氨苄青霉素+酶盘	33.5	0
1ug氨苄青霉素+酶盘	31	0
			0.1ug氨苄青霉素+酶盘	32.5	0
对照-底物盘+fp+H₂O	0	0
			对照-酶盘	33	0

实施例4-使用稳定的杀生物酶和杀生物蔬菜提取物的植物病原体控制

精油，例如茶树油，具有抗微生物特性。茶树油(TTO)与稳定的杀生物酶组合控制植物病原体，如使用植物病原性卵菌腐霉菌所示。将TTO的稀释液浸渍到滤纸(FP)片中，与稳定的杀生物酶盘组合，并置于具有终极腐霉培养物填料的玉米粉琼脂平板上。测量菌落生长的减少，并与不存在杀生物酶和TTO时的菌落生长进行比较。

材料和方法

稳定的杀生物酶盘制备。通过组合3μl KI(1M)，5μl NH₄SCN(1M)，175μl 4％羧甲基纤维素(CMC)，295μl稳定的乳过氧化物酶+葡糖氧化酶(LPO+GOx)(119nM+152.2nM)和3μl蓝色食用色素，用DDI H₂O使最终体积达到1ml制备干酶盘。如下进行酶稳定化：将乳过氧化物酶(LPO)(125μg/ml，pH 7.4)和葡糖氧化酶(GOx)(330μg/ml，pH 7.4)混合以获得1:1.3MLPO:GOx之比和存放在冰上。将磁铁矿纳米颗粒(NP)(1.277mg/ml，pH 3，约5ml原液)以40％振幅超声处理1分钟，在水浴中冷却至环境温度(约21℃)，并用移液管以1:1酶:NP之比混合LPO:GOx酶悬浮液。干底物盘通过合并30μl KI(1M)，50μl NH₄SCN(1M)，350μl 4％CMC，500μl葡萄糖(1M)和3μl红色食用色素，用DDI H₂O将加至终体积1ml制备。包括染料以区分酶盘与底物盘，并且不是盘的生物活性或结构组分。将每种溶液用移液管混合数次并短暂涡旋。将溶液以50μl等分试样分配到石蜡膜上，并在环境温度下在-50kPa含有干燥剂的真空烘箱中干燥。约2小时后，将干酶和底物盘在黑暗中于4℃保存直至使用。

茶树油盘制备和培养生长测定。将茶树油(活性成分(AI)：茶树油100％，MasonNatural，Miami Lakes，FL)(TTO)在无菌DDI H₂O中稀释。使用3孔冲头将

定性1级滤纸(Sigma-Aldrich)切成7mm圆片，并在使用前对圆片进行高压灭菌。用5μl四种TTO稀释液中的每一种浸渍FP盘。对照FP盘用5μl无菌DDI H₂O浸渍。通过将一个底物盘放置在含有玉米粉琼脂的培养皿的中心，然后是一个酶盘，一个TTO浸渍的FP盘和一个培养塞菌丝体侧向下来测试TTO和酶盘相互作用。对于终极腐霉，酶盘中的最终酶浓度为4nM。终极腐霉的培养填料直径为7mm。每个实验包括不用底物和酶盘铺板的相同TTO稀释系列，以及底物+酶盘-仅处理和未处理的对照。包括对照的所有平板都含有FP盘，每个处理重复一次。将平板在环境温度下放置在工作台上2天。那时，对照群落已经几乎成长到平板边缘。记录终极腐霉的两个垂直菌落直径测量值。

结果

与稳定的酶制剂组合的茶树油在两种最低TTO浓度下产生统计学上的协同效应，并且在两种最高浓度下是累加的(表5)。组合的效果显著大于单独的酶制剂和单独的四种TTO浓度中的三种的效果。单独的最高TTO浓度比单独的酶制剂产生显著更大的效果，并且与四种组合效果中的任何一种没有显著差异(表5)。

表5：用单独的稳定LPO制剂及其与茶树油的组合、应用TTO-浸渍的滤纸片对终极腐霉的抑制

^a相对于未从处理的对照的生长减少。每个值是两次重复试验的平均值。

^b杀真菌剂(+)酶制剂的测定效果与期望的累加效果之间的差异。对于每种杀真菌浓度通过累加单独的杀真菌剂的效果和单独的酶制剂的效果计算的期望值。

^c跟随相同字母的平均值不具有显著性差异，Tukey的HSD(P<0.0

实施例5-使用稳定的酶和稳定的乳化茶树油的病原性线虫控制

来自根结线虫属的根结线虫感染多种植物，包括木本作物和蔬菜，导致产量损失。囊线虫甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)导致受感染植物的生长迟缓，并且在高群体密度下可导致大量产量损失。对线虫种群的控制对于减少与作物减产相关的损失至关重要。稳定的杀生物酶结合TTO控制植物病原体，但TTO不与水混溶，难以与杀生物酶结合。在本实施例中，将微囊化的TTO与稳定的杀生物酶组合用于植物病原体的控制。将线虫幼体、卵和孢囊与含有杀生物稳定的酶、TTO或两者的处理一起孵育，以测量植物病原性线虫的杀灭或控制。

材料和方法

微囊化TTO和稳定的杀生物酶的制备。通过组合2ml2％(w/w)EHM(乙基羟乙基纤维素EHM300，Akzonobel)溶液，4ml TTO(纯)和4ml DDI H₂O制备稳定的微囊化TTO(40％，40X强度)。将该溶液各自在40％振幅、1/4英寸喇叭下超声处理两次，持续1分钟。通过组合100μl稳定的EHM TTO混合物(40％TTO)，500μl葡萄糖(1M)，3μl红色食用色素制备20X TTO底物溶液，并用DDI H₂O使最终体积达到1ml。标准底物溶液通过将500μl葡萄糖(1M)，3μl红色食用色素染料组合，并用DDI H₂O使最终体积为1ml来制备。通过组合3μl KI(1M)，5μl NH₄SCN(1M)，70μl 4％羧甲基纤维素(CMC)，295μl稳定的乳过氧化物酶+葡糖氧化酶(LPO+GOx)(119nM+152.2nM)，和3μl蓝色食用色素用DDI H₂O达到最终体积1ml来制备酶溶液。如下进行酶稳定化：将LPO(125μg/ml，pH 7.4)和GOx(330μg/ml，pH 7.4)混合以获得1:1.3M LPO:GOx之比并储存在冰上。将磁铁矿纳米颗粒(NP)(1.277mg/ml，pH 3，约5ml原液)以40％振幅超声处理1分钟，在水浴中冷却至环境温度(约21℃)，并用移液管以1:1酶:NP之比混合LPO:GOx酶悬浮液。将每种溶液用移液管混合数次并短暂涡旋。将溶液在4℃下避光储存直至使用。

使用微囊化TTO和稳定化的杀生物酶对植物病原线虫进行控制。对于线虫幼虫分析，制备浓度为300幼虫/ml的南方根结线虫(Meloidogyne incognita)幼虫储备悬浮液。如下制备四种处理溶液(总体积1ml)：处理溶液(Tmt)1＝33μl酶溶液(1.96nM乳过氧化物酶+2.51nM葡糖氧化酶)+33μl标准底物溶液(500mM葡萄糖)+934μl水，Tmt 2＝33μl 0.066％茶树油(TTO)溶液+967μl水，Tmt 3＝33μl酶溶液(1.96nM乳过氧化物酶+2.51nM葡糖氧化酶)+33μl 0.066％TTO溶液+934μl水，Tmt 4(对照)＝1000μl水。将每种处理溶液与1ml的南方根结线虫悬浮液在10ml烧杯中混合，每次实验300只幼虫。对于每种处理，分析是一式三份，总共产生12个样品。将它们分别储存在密封的盒子中，以减少由于在室温下蒸发三天而导致的体积损失。3天后，从每个样品中取出100个幼虫并计为活的或死的。如果在计数期间观察到移动，则将幼虫视为活的。如果没有观察到任何移动，则将幼虫视为死亡的。

在线虫孢囊分析中，每个样品(10ml烧杯)接受约50个甜菜胞囊线虫孢囊。在解剖显微镜下手工挑选孢囊并将其加入每个烧杯中。如下制备四种储备溶液(总体积2ml)：Tmt1＝33μl酶溶液(1.96nM乳过氧化物酶+2.51nM葡糖氧化酶)+33μl标准底物溶液(500mM葡萄糖)+1934μl水，Tmt2＝33μl 0.066％茶树油(TTO)溶液+1967μl水，Tmt3＝33μl酶溶液(1.96nM乳过氧化物酶+2.51nM葡糖氧化酶)+33μl0.066％TTO溶液+1934μl水，和Tmt4(对照)＝2000μl水。每个具有50个孢囊的样品接受2ml处理溶液(2ml总实验体积)。对于每种处理，分析一式三份，总共产生12个样品。将样品在室温下单独储存在盒子中1周。1周后，取出300μl样品体积，如前所述计数活的或死亡的幼虫数。

在线虫卵分析中，制备浓度为1200卵/ml的甜菜胞囊线虫卵的悬浮液。每个样品(10ml烧杯)接受800μl卵悬浮液，每个实验单位960个卵。如下制备四种储备溶液(总体积1.2ml)：Tmt1＝33μl酶溶液(1.96nM乳过氧化物酶+2.51nM葡糖氧化酶)+33μl标准底物溶液(500mM葡萄糖)+1134μl水，Tmt2＝33μl 0.066％茶树油(TTO)溶液+1167μl水，Tmt3＝33μl酶溶液(1.96nM乳过氧化物酶+2.51nM葡糖氧化酶)+33μl 0.066％TTO溶液+1134μl水，和Tmt4(对照)＝1200μl水。每个样品用800μl甜菜胞囊线虫卵悬浮液接受1.2ml处理溶液(2ml总实验体积)。对于每种处理，分析一式三份，总共产生12个样品。将样品在室温下单独储存在盒子中1周。1周后，取出300μl样品体积，如前所述计数活的或死亡的幼虫数。

结果

来自每个分析的结果显示通过稳定的酶有效控制线虫。图9显示了线虫幼虫实验的结果，其中单独用稳定的酶处理和用茶树油稳定的酶处理在杀死南方根结线虫幼虫时显示出100％的有效性。78％的线虫幼虫仅在茶树油溶液中被杀死。在对照样品中仅有5％的线虫幼虫被杀死。

图10A和10B显示线虫卵和孢囊分析的结果。在图10A中，在用稳定酶，TTO或两者的处理中观察到的活的和死亡的甜菜胞囊线虫孢囊孵化的线虫幼虫的总数从对照溶液中观察到的线虫总数显著减少。处理抑制了孢囊的孵化。与单独的TTO相比，酶处理对孵化更具抑制性。在孵化期结束后，在治疗后从孢囊孵化的幼虫几乎全部死亡。图10B显示了在用稳定酶，TTO或两者的处理中观察到的活的和死的卵孵化的线虫幼虫的数量。在这种情况下，处理不会抑制孵化，不过，孵化期间孵化的幼虫随后在孵化期间被处理杀死。

实施例6-使用稳定的杀生物酶和代森锰锌的植物病原体控制

代森锰锌是一种非系统性杀真菌剂，用于农业以控制多种大田作物中的真菌病害。显示了代森锰锌和稳定的杀生物酶组合的增强的杀真菌作用。用代森锰锌以四种浓度改良固体培养生长培养基。将稳定的杀生物酶盘和标准底物盘与终极腐霉菌或禾谷镰刀菌培养物一起置于这些平板上。测量菌落生长的减少，并与不存在杀生物酶和代森锰锌的菌落生长进行比较。

材料和方法

稳定的杀生物酶盘制备。通过组合3μl KI(1M)、5μl NH4SCN(1M)、175μl 4％羧甲基纤维素(CMC)、295μl稳定的乳过氧化物酶+葡糖氧化酶(LPO+GOx)(119nM+152.2nM)和3μl蓝色食用色素与DDI H₂O使最终体积达到1ml制备干酶盘。如下进行酶稳定化：将乳过氧化物酶(LPO)(125μg/ml，pH 7.4)和葡糖氧化酶(GOx)(330μg/ml，pH 7.4)混合以获得1:1.3MLPO:GOx之比和存放在冰上。将磁铁矿纳米颗粒(NP)(1.277mg/ml，pH 3，约5ml原液)以40％振幅超声处理1分钟，在水浴中冷却至环境温度(约21℃)，并向移液管中混合在1:1酶：NP之比的LPO:GOx酶悬浮液。干底物盘由我合并30μl KI(1M)、50μl NH₄SCN(1M)、350μl 4％CMC、500μl葡萄糖(1M)和3μl红色食用色素与DDI H₂O至终体积1ml制备。包括染料以区分酶盘与底物盘，并且所述盘不是生物活性或结构组分。将每种溶液用移液管混合数次并短暂涡旋。将溶液以50μl等分试样分配到石蜡膜上，并在环境温度下在-50kPa含有干燥剂的真空烘箱中干燥。约2小时后，将干酶和底物盘在黑暗中于4℃保存直至使用。

代森锰锌改良的平板和培养物生长测定。玉米粉琼脂(CMA)和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)(分别用于终极腐霉和禾谷镰刀菌)用含有代森锰锌可流动的锌(活性成分(AI)：代森锰锌37％、Bonide，Oriskany，NY)进行改良，以达到最终浓度为10mg/l、5mg/l、2mg/l、0.5mg/l和0mg/l(对照)。通过将一个底物盘放置在含有用代森锰锌(禾谷镰刀菌)改良的PDA或用代森锰锌改良的CMA的每个培养皿的中心上分析代森锰锌和酶盘相互作用。接下来是一个酶盘和一个培养填料菌丝体侧向下。酶盘中的最终酶浓度对于终极腐霉是4nM，对于禾谷镰刀菌是119nM并且基于来自初步酶制剂优化实验的结果。终极腐霉的填料直径为7mm，禾谷镰刀菌的填料直径为4mm。

初步测试揭示出终极腐霉对酶处理比对禾谷镰刀菌更敏感。因此，与未处理的对照相比，选择酶浓度和填料大小以在仅酶处理中实现可测量的生长减少而不是完全抑制。每个分析包括相同的没有底物和酶盘铺板的杀真菌剂稀释系列以及底物+酶盘-仅处理和未处理的对照。每次处理都复制一次。对于终极腐霉，将平板在环境温度下放置在工作台上2天，并且对于禾谷镰刀菌为5天。孵育期后，对照菌落几乎长到平板边缘。记录终极腐霉的两个垂直菌落直径测量值。使用公共领域图像处理程序ImageJ测量禾谷镰刀菌的菌落。

结果

与稳定的酶制剂组合的代森锰锌在最低的杀真菌剂浓度下对终极腐霉产生统计学上的协同作用，并且在三个最高浓度下为累加作用(表6)。组合的效果显著大于单独的酶制剂和单独的所有四种杀真菌剂浓度的效果。单独的酶制剂的效果显著大于单独的三种最低的杀真菌剂浓度，但与单独的最高浓度没有显著差异(表6)。在所有四种杀真菌剂浓度下，对禾谷镰刀菌的组合活性是累加的(表6)。在三个最高浓度下，组合效果显著大于单独的相应杀真菌剂浓度。单独的酶制剂的效果与任何组合效果和单独的杀真菌剂没有显著差异(表6)。

表6：使用单独的稳定化LPO制剂及其与代森锰锌组合、应用杀真菌剂改良的培养基对终极腐霉和禾谷镰刀菌的抑制

^c跟随相同字母的平均值不具有显著性差异，Tukey的HSD(P<0.05)。

在此披露或提及的所有公开物和专利文件通过引用以其全文结合在此。前述说明书已经仅出于说明和描述的目的得以呈现。本说明书不旨在限制本发明为所披露的精确形式。本发明的范围应旨在由所附权利要求书来限定。

Claims

1.固体杀真菌组合物，包含：

a.用第一水可溶剂化基质配制的第一组分，所述第一组分具有磁性纳米颗粒的自组装中孔聚集体，所述聚集体包含产生过氧化氢的酶和产生自由基的酶；

b.用第二水可溶剂化基质配制的第二组分，所述第二组分具有所述产生过氧化氢的酶的第一底物和所述产生自由基的酶的第二底物；和

c.化学杀真菌剂；

其中所述第一和第二水可溶剂化基质包括水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物或壳聚糖衍生物，其中所述组合物无活性，其中所述第一和第二组分暴露于水合作用或氧气使所述组合物活化，并导致所述产生过氧化氢的酶的所述底物被氧化成过氧化氢，其中所述过氧化氢充当所述产生自由基的酶的底物，并且其中产生具有杀真菌活性的所述自由基，其中所述化学杀真菌剂与所述第一和第二组分的杀真菌活性协同地或累加地起作用。

2.权利要求1的杀真菌组合物，其中所述化学杀真菌剂选自精甲霜灵、腈菌唑、百菌清、丙硫菌唑、肟菌酯、丙环唑、代森锰锌和铜。

3.权利要求2的杀真菌组合物，其中所述化学杀真菌剂是百菌清。

4.权利要求2的杀真菌组合物，其中所述化学杀真菌剂是代森锰锌。

5.固体杀细菌组合物，包含：

c.化学抗生素；

其中所述第一和第二水可溶剂化基质包括水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物或壳聚糖衍生物，其中所述组合物无活性，其中所述第一和第二组分暴露于水合作用或氧气使所述组合物活化，并导致所述产生过氧化氢的酶的所述底物被氧化成过氧化氢，其中所述过氧化氢充当所述产生自由基的酶的底物，并且其中产生具有杀细菌活性的所述自由基，其中所述化学抗生素与所述第一和第二组分的杀细菌活性协同地或累加地起作用。

6.权利要求5的杀细菌组合物，其中所述化学抗生素选自氨苄青霉素、链霉素、万古霉素和铜。

7.液体杀真菌组合物，包含：

a.用水可溶剂化基质配制的第一组分，所述第一组分具有磁性纳米颗粒的自组装中孔聚集体，所述聚集体包含产生自由基的酶；

b.第二组分，其具有所述产生自由基的酶的底物和过氧化氢源；和

c.化学杀真菌剂，

其中所述水可溶剂化基质包括水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物或壳聚糖衍生物，其中所述组合物无活性，其中混合所述第一和第二组分使所述组合物活化，并导致所述过氧化氢源充当所述产生自由基的酶的底物，并且其中产生具有杀真菌活性的所述自由基，其中所述化学杀真菌剂与所述第一和第二组分的杀真菌活性协同地或累加地起作用。

8.液体杀细菌组合物，包含：

c.化学抗生素；

其中所述水可溶剂化基质包括水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物或壳聚糖衍生物，其中所述组合物无活性，其中混合所述第一和第二组分使所述组合物活化，并导致所述过氧化氢源充当所述产生自由基的酶的底物，并且其中产生具有杀细菌活性的所述自由基，其中所述化学抗生素与所述第一和第二组分的杀细菌活性协同地或累加地起作用。

9.权利要求1-4或7任一项的杀真菌组合物，其中最终的化学杀真菌剂浓度为化学杀真菌剂的半数最大有效浓度(EC₅₀)的10％-2500％。

10.权利要求5-6或8任一项的杀细菌组合物，其中最终的化学抗生素浓度为化学抗生素的最低抑制浓度(MIC)或最低杀细菌浓度(MBC)的1-100％。

11.权利要求1-4或7任一项的杀真菌组合物，还包含化学抗生素。

12.权利要求1-8任一项的杀真菌或杀细菌组合物，其中所述磁性纳米颗粒的中孔聚集体具有氧化铁组合物。

13.权利要求1-8任一项的杀真菌或杀细菌组合物，其中所述磁性纳米颗粒的中孔聚集体具有如下磁性纳米颗粒尺寸分布，其中至少90％的磁性纳米颗粒具有至少3nm和至多30nm的尺寸；以及如下聚集颗粒尺寸分布，其中至少90％的所述磁性纳米颗粒的中孔聚集体具有至少10nm和至多500nm的尺寸。

14.权利要求1-8任一项的杀真菌或杀细菌组合物，其中所述磁性纳米颗粒的中孔聚集体具有至少10emu/g的饱和磁化强度。

15.权利要求1-6任一项的杀真菌或杀细菌组合物，其中所述产生自由基的酶和所述产生过氧化氢的酶以至多100％的饱和容量容纳在所述磁性纳米颗粒的中孔聚集体中。

16.权利要求1-6任一项的杀真菌或杀细菌组合物，其中所述产生过氧化氢的酶是氧化酶。

17.权利要求16的杀真菌或杀细菌组合物，其中所述氧化酶是葡糖氧化酶或醇氧化酶。

18.农产品，包含权利要求1-17任一项的杀真菌和杀细菌组合物。

19.液体杀有害生物剂产品，包含权利要求1-17任一项的杀真菌和杀细菌组合物。

20.种子包衣，其包含权利要求1-17任一项的杀真菌或杀细菌组合物。

21.权利要求20的种子包衣，其中所述种子选自：蔬菜种子、果实种子、花种子和大田作物种子。

22.权利要求21的种子包衣，其中所述蔬菜种子选自：番茄、豌豆、洋葱、大蒜、香芹菜、牛至、罗勒属植物、芫荽叶、胡萝卜、甘蓝、玉米、黄瓜、萝卜、胡椒、青花菜、花椰菜、菠菜、羽衣甘蓝、牛皮菜、朝鲜蓟和莴苣种子。

23.权利要求21的种子包衣，其中所述果实种子选自：柑橘、鳄梨、苹果、柿、梨、桃、油桃、草莓、树莓、葡萄、蓝莓、黑莓、樱桃、杏、葫芦、笋瓜、西葫芦、茄子、南瓜、椰子、番石榴、芒果、番木瓜、甜瓜、蜜瓜、香瓜、西瓜、香蕉、大蕉、菠萝、榲桲、山梨、枇杷、李子、穗醋栗、石榴、无花果、橄榄、番茄、橙、柠檬、酸橙、克莱门氏小柑橘和坚果种子。

24.权利要求21的种子包衣，其中所述大田作物种子选自：玉米、小麦、低芥酸菜子、高粱、马铃薯、甘薯、山药、豆类、木薯、咖啡、干草、荞麦、燕麦、大麦、油菜、柳枝稷、象草、甜菜、甘蔗和稻种子。

25.权利要求21的种子包衣，其中所述花种子选自：鳞茎、开花木本茎、康乃馨、玫瑰、郁金香、罂粟、金鱼草、百合、菊花、鸢尾属植物、六出花属植物、绒球花、紫藤和鹤望兰种子。

26.动物垫料，包含权利要求1-17任一项的杀真菌或杀细菌组合物。

27.伤口敷料，包含权利要求1-17任一项的杀真菌或杀细菌组合物。

28.织物，包含权利要求1-16任一项的杀真菌或杀细菌组合物。

29.提高植物产品产量的方法，包括在所述植物的种植或萌发之前或期间使权利要求21-25任一项的种子暴露于水合作用和氧合作用。

30.提高动物产品产量的方法，包括在被所述动物使用之前或期间使权利要求26的动物垫料暴露于水合作用和氧气。

31.权利要求30的方法，其中所述水合作用来自于所述动物的尿液。

32.权利要求30或31任一项的方法，其中所述动物产品选自活动物、乳、肉、脂肪、蛋、血清、抗体、酶和动物副产品。

33.权利要求30或31任一项的方法，其中所述动物选自奶牛、猪、鸡、火鸡、马、绵羊、山羊、驴、骡子、鸭、鹅、水牛、骆驼、牦牛、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠、豚鼠、爬行动物、两栖动物、鹦鹉、金丝雀、鸽子、斑鸠和昆虫。

34.权利要求27的伤口敷料，其中所述伤口敷料是杀细菌的。

35.产生权利要求1-17任一项的杀真菌或杀细菌组合物的方法，包括：用选自水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物和壳聚糖衍生物的基质材料配制所述第一组分，和用选自水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物和壳聚糖衍生物的基质材料配制所述第二组分。

36.权利要求35的方法，其中所述第一组分还经受喷雾干燥、冷冻干燥、转鼓式干燥、脉动燃烧干燥或旋转种子包衣。

37.权利要求35的方法，其中所述第二组分还经受喷雾干燥、冷冻干燥、转鼓式干燥、脉动燃烧干燥或旋转种子包衣。

38.权利要求7-8任一项的液体杀真菌或杀细菌组合物，其中所述组合物是杀真菌的。

39.防止农产品受到病原体侵害的方法，包括使所述产品暴露于权利要求1-17任一项的杀真菌或杀细菌组合物。

40.权利要求39的方法，其中所述病原体是植物、动物或人类病原体。

41.权利要求39的方法，其中所述病原体是真菌、卵菌或细菌。

42.权利要求41的方法，其中所述真菌选自丝核菌属(Rhizoctonia)物种和镰刀菌属(Fusarium)物种。

43.权利要求41的方法，其中所述病原体是选自如下的细菌：

野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)，

密执安棍状杆菌(Clavibacter michiganensis)，

燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)，

绿黄假单胞菌(Pseudomonas viridiflava)，

丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)，

大肠杆菌(Escherichia coli)，

沙门氏菌属(Salmonella)物种和

利斯特氏菌属(Listeria)物种。

44.权利要求41的方法，其中所述卵菌选自腐霉属(Pythium)物种和疫霉属(Phytophthora)物种。

45.减少或消除植物猝倒病的方法，包括使所述植物暴露于权利要求1-17任一项的杀真菌或杀细菌组合物。

46.固体杀线虫组合物，包含：

a.用第一水可溶剂化基质配制的第一组分，所述第一组分具有磁性纳米颗粒的自组装中孔聚集体，所述聚集体包含过氧化氢源和产生自由基的酶，其中所述过氧化氢源为产生过氧化氢的酶；

c.精油；

其中所述第一和第二水可溶剂化基质包括水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物或壳聚糖衍生物，其中所述组合物无活性，其中所述第一和第二组分暴露于水合作用或氧气使所述组合物活化，并导致所述产生过氧化氢的酶的所述底物被氧化成过氧化氢，其中所述过氧化氢充当所述产生自由基的酶的底物，并且其中产生具有杀线虫活性的所述自由基。

47.液体杀线虫组合物，包含：

b.第二组分，其具有所述产生自由基的酶的底物和过氧化氢源；

c.精油；

其中所述水可溶剂化基质包括水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物或壳聚糖衍生物，其中所述组合物无活性，其中混合所述第一和第二组分使所述组合物活化，并导致所述过氧化氢源充当所述产生自由基的酶的底物，并且其中产生的所述自由基具有杀线虫活性。

48.权利要求46或47任一项的杀线虫组合物，其中所述精油选自：茶树，木橘属，藿香，柑橘，香茅，松，桉树，万寿菊，天竺葵，柠檬草，橙，玫瑰草，薄荷，椒样薄荷，肉桂，丁香，迷迭香，百里香，大蒜，牛至，茴香，枯茗，姜黄根，姜黄，香菜，小茴香，洋葱和广藿香油。

49.权利要求48的杀线虫组合物，其中所述精油是茶树油。

50.农产品，其包含权利要求46-49任一项的杀线虫组合物。

51.液体杀有害生物剂产品，其包含权利要求47-49任一项的杀线虫组合物。

52.种子包衣，其包含权利要求46或49任一项的杀线虫组合物。

53.权利要求52的种子包衣，其中所述种子选自：蔬菜种子、果实种子、花种子和大田作物种子。

54.权利要求53的种子包衣，其中所述蔬菜种子选自：番茄、豌豆、洋葱、大蒜、香芹菜、牛至、罗勒属植物、芫荽叶、胡萝卜、甘蓝、玉米、黄瓜、萝卜、胡椒、青花菜、花椰菜、菠菜、羽衣甘蓝、牛皮菜、朝鲜蓟和莴苣种子。

55.权利要求53的种子包衣，其中所述果实种子选自：柑橘、鳄梨、苹果、柿、梨、桃、油桃、草莓、树莓、葡萄、蓝莓、黑莓、樱桃、杏、葫芦、笋瓜、西葫芦、茄子、南瓜、椰子、番石榴、芒果、番木瓜、甜瓜、蜜瓜、香瓜、西瓜、香蕉、大蕉、菠萝、榲桲、山梨、枇杷、李子、穗醋栗、石榴、无花果、橄榄、番茄、橙、柠檬、酸橙、克莱门氏小柑橘和坚果种子。

56.权利要求53的种子包衣，其中所述大田作物种子选自：玉米、小麦、低芥酸菜子、高粱、马铃薯、甘薯、山药、豆类、木薯、咖啡、干草、荞麦、燕麦、大麦、油菜、柳枝稷、象草、甜菜、甘蔗和稻种子。

57.权利要求53的种子包衣，其中所述花种子选自：鳞茎、开花木本茎、康乃馨、玫瑰、郁金香、罂粟、金鱼草、百合、菊花、鸢尾属植物、六出花属植物、绒球花、紫藤和鹤望兰种子。

58.动物垫料，包含权利要求46-49任一项的杀线虫组合物。

59.提高植物产品产量的方法，包括在所述植物的种植或萌发之前或期间使权利要求52-56任一项的种子包衣暴露于水合作用和氧合作用。

60.提高动物产品产量的方法，包括在被所述动物使用之前或期间使权利要求58的动物垫料暴露于水合作用和氧气。

61.权利要求60的方法，其中所述水合作用来自于所述动物的尿液。

62.权利要求60或61任一项的方法，其中所述动物产品选自：活动物、乳、肉、脂肪、蛋、血清、抗体、酶、和动物副产品。

63.权利要求60或61任一项的方法，其中所述动物选自：奶牛、猪、鸡、火鸡、马、绵羊、山羊、驴、骡子、鸭、鹅、水牛、骆驼、牦牛、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠、豚鼠、爬行动物、两栖动物、鹦鹉、金丝雀、鸽子、斑鸠和昆虫。

64.产生权利要求46-49任一项的杀线虫组合物的方法，包括：用选自水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物和壳聚糖衍生物的基质材料配制所述第一组分和用选自水可溶剂化纤维素衍生物、藻酸盐衍生物和壳聚糖衍生物的基质材料配制所述第二组分。

65.权利要求64的方法，其中所述第一组分还经受喷雾干燥、冷冻干燥、转鼓式干燥、脉动燃烧干燥或旋转种子包衣。

66.权利要求64的方法，其中所述第二组分还经受喷雾干燥、冷冻干燥、转鼓式干燥、脉动燃烧干燥或旋转种子包衣。

67.减少或消除线虫生长的方法，包括用权利要求46-48任一项的液体杀线虫组合物对物质进行喷雾。

68.防止农产品受到线虫侵害的方法，包括使所述产品暴露于权利要求46-49任一项的杀线虫组合物。

69.权利要求68的方法，其中所述线虫选自

根结线虫属物种(Meloidogyne species(spp.))、

异皮线虫属物种(Heterodera spp.)、

球胞囊属物种(Globodera spp.)、

短体属物种(Pratylenchus spp.)、

螺旋属物种(Helicotylenchus spp.)、

香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、

续断双垫刃线虫(Ditylenchus dipsaci)、

肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)、

剑线虫属物种(Xiphinema spp.)、

滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)、

弓蛔虫属物种(Toxocara spp.)、

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)和

旋毛线虫(trichinella spiralis)。

70.权利要求68的方法，其中所述线虫是根结线虫属物种。

71.权利要求68的方法，其中所述线虫是旋毛线虫。

72.权利要求68的方法，其中所述线虫是弓蛔虫属物种。