CN103675115B - 海洋天然活性物质磁珠高内涵快速筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然药物筛选技术领域，本发明提供了一种海洋天然活性物质磁珠高内涵快速筛选方法，是基于磁珠键和高内涵多靶标蛋白集成的活性物质筛选和评价方法，本发明的配置为：硬件系统为永久磁铁、磁珠、靶标；软件系统负责液质数据采集。本发明的筛选方法与传统紫外筛选方法相比，显著提高了筛选效率、缩短了筛选时间，并且能够同时对多种生物活性进行考察、发现化合物之间的协同效应。本发明的筛选方法快速、准确、信息量大、重现性好，能够用于大规模天然产物库或组合化学库的筛选。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物筛选技术领域，具体是指应用磁性分离和化学信息采集技术筛选出海洋天然产物，用于抗肿瘤、降糖及降脂等药物的研发。
背景技术
天然产物中发现活性成分是新药创制的常规途径之一，传统的筛选方法包括提取、分离、纯化出单体化合物，然后进行活性筛选，这种方法繁琐费时效率低，无法揭示天然药物中多种成分的协同作用，而且化合物在分离纯化过程中可能降解变性失去活性，或者分离出非目标化合物。目前，基于亲和选择-质谱联用的方法在药用植物活性成分筛选中的应用越来越多，该法通过分离多种靶标结合物，然后进行结构鉴定，最后进行活性验证，大大加速了筛选的过程、提高了活性物质发现的效率（参见文献ZhouJL,QianZM,LuoYD,etal.ScreeningandmechanismstudyofcomponentstargetingDNAfromtheChineseherbLonicerajaponicabyliquidchromatography/massspectrometryandfluorescencespectroscopy.BiomedicalChromatography.2008,22(10):1164-1172.；QingLS,XueY，ZhengY，etal.LigandfishingfromDioscoreanipponicaextractusinghumanserumalbuminfunctionalizedmagneticnanoparticles.JournalofChromatographyA.2010,1217(28):4663-4668.；GuoLP，JiangTF,LvZH,etal.Screeningalpha-glucosidaseinhibitorsfromtraditionalChinesedrugsbycapillaryelectrophoresiswithelectrophoreticallymediatedmicroanalysis.JPharmBiomedAnal.2010,53(5):1250-1253.）。
DNA拓扑异构酶是一类广泛存在于真核和原核细胞中，专门参与介导DNA拓扑构型改变的酶。其在DNA的复制、转录、翻译、重组和修复中起着重要的作用。研究发现，DNA拓扑异构酶在肿瘤组织中高表达，通过抑制DNA拓扑异构酶的活性就有可能抑制肿瘤细胞的快速繁殖，进而杀死肿瘤细胞。目前DNA拓扑异构酶已成为公认的抗癌药物的作用靶点（LiuLF.DNATopoisomerasePoisonsasAntitumorDrugs.AnnualReviewofBiochemistry.1989,58:351-375.）。α-葡萄糖苷酶可促进糖的水解吸收，其抑制剂通过竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。α-葡萄糖苷酶已成为降糖药物研究的重要靶标。甘油三酯酶的作用主要是促进脂肪的吸收，其抑制剂能够降低人体对脂肪的摄入，起到降脂减肥的效果。随着人们生活水平的提高，食物中的脂肪摄入量正在迅速增加，肥胖已经成为一个全球性的健康问题。
目前尚无文献报道从海洋天然产物中快速筛选DNA拓扑异构酶、α-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶等“靶标蛋白”抑制剂的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海洋天然活性物质磁珠高内涵快速筛选方法。
本发明的筛选方法，基于磁珠键和高内涵多靶标蛋白（抗肿瘤、降糖、降脂）集成的活性物质筛选和评价方法。本发明所用配置为：硬件系统为永久磁铁、磁珠、靶标；软件系统负责液质数据采集。
本发明提供了一种海洋天然活性物质磁珠高内涵快速筛选方法，即从海洋天然产物中快速筛选靶标蛋白抑制剂，包括以下步骤：
A、采用磁珠为载体，应用化学键合技术在磁珠的表面键合靶标蛋白，得到功能化磁珠；
B、常规方法制备海洋生物提取物，将功能化磁珠与海洋生物提取物一起孵育；
C、孵育1小时以上后，移除上清液，清洗磁珠，采用变性溶剂使酶变性，收集洗脱液；
D、配体活性物质结构鉴定：洗脱液通过液相色谱—质谱联用和核磁共振技术鉴定分析，获得靶标蛋白的抑制剂；其中的液相色谱—质谱联用（液质）参数为：ESI正负离子模式。
所述的靶标蛋白是指DNA拓扑异构酶、α-葡萄糖苷酶或甘油三酯酶等。
所述的步骤A具体为：将磁珠清洗数次，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化磁珠表面，加入溶解的DNA拓扑异构酶、α-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶等药物作用相关“靶标蛋白”，孵育一段时间后，使酶键合在磁珠表面，清洗数次备用。
所述的步骤B中的常规方法制备海洋生物提取物，海洋生物提取物可以是海绵等无脊椎动物提取物，也可以是海藻、红树林等海洋植物提取物或海洋微藻、海洋放线菌、海洋真菌等海洋来源微生物的提取物。常规方法是指有机试剂-水不同比例的均相混合液总浸提物，经有机试剂/水两相萃取得到的不同极性萃取物（参考《海洋药物导论》第二版，张文主编，上海科学技术出版社，2012）。
步骤B具体为：取海洋产物提取物适量，用少量溶剂后用水溶解。较优的，称取海洋天然产物提取物1mg，加入少量二甲基亚砜（DMSO）溶解，后加入0.1mL的pH6.8的10mM磷酸缓冲液（PBS），超声溶解。
所述的步骤C：变性溶剂为乙腈或乙醇等。
所述的步骤D：其中的质谱信息由Finnigan液质联用仪器获取。
本发明的筛选方法的流程图如图5所示。
本发明的筛选方法具体步骤如下：
第一步：取出100μL磁珠，使用等体积25mM2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES，pH6）溶液清洗两次，每次10min；在使用之前，把1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）快速溶解在冷的（0–4℃）25mM的2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）（pH6）中至浓度为50mg/mL；用25mMMES(pH6)配置50mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，在清洗后的磁珠上加入50μL的EDC溶液和50μL的NHS溶液，混合均匀，在室温下缓慢倾斜旋转孵育30min。孵育后，将离心管放在磁铁上吸附4min，移除上清液，使用300μL25mMMES(pH6)清洗两次。
第二步：在活化磁珠上，分别加入60μL溶解在25mMMES溶液(pH6)中的DNA拓扑异构酶Ⅰ、α-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶，并分别加入40μL25mMMES溶液(pH6)至最终体积为100μL，震荡混合均匀，在室温孵育过夜，孵育后，将离心管放在磁铁上吸附4min，移除上清液；使用300μLPBS冲洗包被的磁珠4次，掩盖蛋白如牛血清蛋白(BSA)或脱脂奶粉浓度可以达到0.1-0.5%，把包被的磁珠重新分散在需要浓度的PBS和Tris缓冲液中；
第三步：使用透射电子显微镜对空白磁珠及键合的磁珠，进行性状表征；
第四步：称取海洋天然产物提取物1mg，加入少量二甲基亚砜（DMSO）溶解，后加入0.1mL磷酸缓冲液（PBS）溶液（pH6.8，10mM），超声10min溶解，吸取上清液进行液质分析，得到HPLC及分子量信息。
第五步：再取第四步得到的海洋天然产物上清液40μL，分别加到100μL键合DNA拓扑异构酶Ⅰ、α-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶的磁珠分散的醋酸胺溶液和空白磁珠分散的PBS缓冲液中，放在振荡器上混匀，孵育1小时；用PBS缓冲液清洗3次，每次的清洗液依次进液相分析；
第六步：将清洗液弃去，每个连通容器中加入10%乙腈-水（10mL）进行清洗，洗脱液进行液-质联用分析；
第七步：通过对比第四步和第六步得到的液质分析图谱，可以得到分别与DNA拓扑异构酶Ⅰ、α-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶的磁珠结合的海洋天然产物的保留时间和分子量信息。
第八步：通过核磁数据和理化性质鉴定海洋天然产物的化学结构。
第九步：对得到的化合物进行活性复筛，确认活性结构。
本发明还提供了上述方法用于海洋产物中抗肿瘤、降糖及降脂成分的筛选。
本发明可同时筛选和评价复杂体系中（天然产物以及化学合成药物）降糖、降脂及抗肿瘤作用物质。与传统紫外筛选方法相比，显著提高了筛选效率、缩短了筛选时间，并且能够同时对多种生物活性进行考察、发现化合物之间的协同效应。本筛选方法具有快速、准确、信息量大、重现性好等特征。
本发明设计合理，提供的筛选和评价系统效率高、结构完善，能够用于大规模天然产物库或组合化学库的筛选，而且设备简单经济，适合于在早期开展对于抗肿瘤药物（包括化学合成药以及天然产物）的筛选和先导化合物的发现。
附图说明
图1是磁珠透射电镜图（25000倍）
其中（A）为空白磁珠；（B）为结合了甘油三酯酶的磁珠。
图2是海洋产物提取物液质联用分析结果以及与DNA拓扑异构酶键合的磁珠作用后洗脱液液质联用分析结果，
其中A为海洋天然产物提取物正离子模式离子流图，B为海洋天然产物提取物与DNA拓扑异构酶Ⅰ键合磁珠作用后洗脱物正离子模式离子流图。
图3是海洋产物提取物液质联用分析结果以及与α-葡萄糖苷酶键合的磁珠作用后洗脱液液质联用分析结果，
其中A为海洋天然产物提取物正离子模式离子流图，B为海洋天然产物提取物与α-葡萄糖苷酶键合磁珠作用后洗脱物正离子模式离子流图。
图4是海洋产物提取物液质联用分析结果以及与甘油三酯酶键合的磁珠作用后洗脱液液质联用分析结果，
其中A为海洋天然产物提取物正离子模式离子流图，B为海洋天然产物提取物与甘油三酯酶键合磁珠作用后洗脱物正离子模式离子流图。
图5是本发明筛选方法的流程图。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例和附图对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例所用试剂：
DNA拓扑异构酶Ⅰ购自吴江近岸蛋白质科技有限公司(大肠杆菌，EC5.99.1.2)；α-葡萄糖苷酶、甘油三酯酶（提自猪胰酶）均购自Simga公司；羧基磁珠Dynabeads®MyOneCarboxylicAcid(invitrogen)、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC,sigma)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES,sigma)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,sigma)、氘代DMSO。
实施例所用仪器：
Agilent1100高效液相色谱串联FinniganLCQDecaXPPlus离子阱质谱，色谱柱：AgilentZorbaxSB-C18column(4.6×250mm,5μm)；Agilent1200制备液相(XDB-C18column,30×250mm,5μm)；恒温振荡孵育器、ELx800酶标仪。核磁共振仪（BrukerAvanceIII500MNMR）。
实施例1：基于磁珠键和DNA拓扑异构酶、α-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶的高内涵筛选方法
取出100μL磁珠，使用等体积25mMMES（pH6）溶液清洗两次，需要10min，要混合均匀。在使用之前，把EDC快速溶解在冷的25mM的MES（pH6）中至浓度为50mg/mL。用25mMMES(pH6)配置50mg/mL的NHS溶液，在清洗后的磁珠上加入50μL的EDC溶液和50μL的NHS溶液，混合均匀，在室温下缓慢倾斜旋转孵育30min。孵育后，把管子放在磁铁上4min，移除上清液，使用300μL25mMMES(pH6)清洗两次。
在活化磁珠上，分别加入60μL溶解在25mMMES溶液(pH6)中的DNA拓扑异构酶Ⅰ、α-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶，并分别加入40μL25mMMES溶液(pH6)至最终体积为100μL，震荡混合均匀，在室温孵育过夜，孵育后，把管子放在磁铁上4min，移除上清液。使用300μLPBS冲洗包被的磁珠4次，掩盖蛋白如BSA或脱脂奶粉浓度可以达到0.1-0.5%，把包被的磁珠重新分散在需要浓度的PBS和Tris缓冲液中。
使用透射电子显微镜对空白磁珠及键合的磁珠，进行性状表征，从图1可以看出，空白磁珠（A）透射电镜下十分的清晰，而结合了甘油三酯酶的磁珠（B）表面则非常模糊，这说明已有蛋白黏附在磁珠表面。
实施例2：本发明的筛选系统在海洋天然产物中的应用
称取海绵提取物1mg（海绵提取物制备方法参见《海洋药物导论》第二版，张文主编，上海科学技术出版社，2012），加入少量DMSO溶解，后加入0.1mLPBS溶液（pH6.8，10mM），超声10min溶解，吸取上清液进行液质分析，根据分子量信息，与文献进行对照进行结构表征。
取40μL上清液，分别加到100μL键合DNA拓扑异构酶Ⅰ、α-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶的磁珠分散的醋酸胺溶液和空白磁珠分散的PBS缓冲液中，放在振荡器上混匀，孵育1h。用PBS缓冲液清洗3次，每次的清洗液依次进液相分析。将清洗液弃去，每个连通容器中加入10%乙腈-水（10mL）进行清洗，洗脱液进行液质联用分析。平行操作三份。洗脱液进行液质分析。
液质分析的结果如下：
1、海洋产物提取物液质联用分析结果以及与DNA拓扑异构酶键合磁珠作用后洗脱液液质联用分析结果。
图2B为DNA拓扑异构酶Ⅰ键合磁珠洗脱物，洗脱物总共有有2个峰；其中峰1是保留时间为8.97min的微量成分，分子量为360；峰2是保留时间为25.24min的主要成分，分子量为421。
2、海洋产物提取物液质联用分析结果以及与α-葡萄糖苷酶键合的磁珠作用后洗脱液液质联用分析结果。
图3B为α-葡萄糖苷酶键合磁珠洗脱物，洗脱物只有1个峰，保留时间为25.24min，分子量为421。
3、海洋产物提取物液质联用分析结果以及与甘油三酯酶键合的磁珠作用后洗脱液液质联用分析结果。
图4B为甘油三酯酶键合磁珠洗脱物，洗脱物只有1个峰，保留时间为25.24min，分子量为421。
上述三种磁珠键合受体测试的测试结果均显示保留时间为25.24min、ESI离子质谱为421的化学成分是该海绵的主要活性成分。运用优化的法相制备高效液相色谱（XDB-C18column,30×250mm,5μm；35%CH3CN,18mL/min）可以发现该部分实际上包括两种成分（化合物1：30.5mg,20min；化合物2：18.5mg,19.3min)，其离子质谱均为421。这两种成分均表现为具有旋光活性的白色粉末。化合物1的1H及13CNMR表现为典型的9-甲基嘌呤信号，包括NH2(δ6.84,brs,2H,),N-CH3(δH4.10,s;δC32.4,CH3),及6个芳香基团(δH10.89,sand8.50,s;δC142.5and156.2,eachCH,and152.5,149.8,and110.0,eachC).分子中剩余的NMR信号与clerodane型二萜极为吻合。该化合物的1H、13CNMR信号及旋光符号（c1.0,inMeOH）与从日本同属海绵中分离得到的agelasineB完全一致（参见文献HWu,H.Nakamura,J.Kobayashi,M.Kobayashi,M.Kobayashi,Y.Ohizumi,Y.Hirata,BulletinofthechemicalsocietyofJapan,59(1986)2495-2504.），该化合物结构因而定位agelasineB。化合物2的NMR谱图与1的极为相似，其9-甲基嘌呤部分的信号完全一样，只是二萜母核的信号稍有不同，该化合物的1H、13CNMR信号及旋光符号（c1.0,inMeOH）与从印度尼西亚同属海绵中分离得到的(-)-agelasineD完全一致，其结构因而得以确定（T.Hertiani,R.Edrada-Ebel,S.Ortlepp,R.W.M.vanSoest,N.J.deVoogd,V.Wray,U.Hentschel,S.Kozytska,W.E.G.Müller,P.Proksch,Bioorganic&MedicinalChemistry,18(2010)1297–1311）。文献报道AgelasineB及(-)-agelasineD具有抑菌、抑制平滑肌收缩及Na+,K+-ATP酶抑制作用。本研究首次发现该类化合物具有DNA拓扑异构酶Ⅰ、α-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶抑制活性。该活性物质的发现进一步验证了方法的正确性及可靠性。
本法建立了基于磁珠键合的多靶标蛋白的高内涵筛选降脂、降糖及抗肿瘤药物的方法。与传统紫外筛选方法相比，显著提高了筛选效率、缩短了筛选时间，并且能够同时对多种生物活性进行考察、发现化合物之间的协同效应。本筛选方法具有快速、准确、信息量大、重现性好等特征。
与传统方法相比，该筛选系统优点在于能够快速地发现具有多种活性的化合物或同一化合物的多种活性，方法获得的信息量大、效率高、工作量少，对于复杂成分中活性物质的发现具有重要意义。由于海洋活性物质的研究缺乏文献记载及临床应用，而主要依赖于于现代筛选技术，因此这一方法对海洋活性物质的快速发现尤其具有重要的推动价值。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (1)
1.一种海洋天然活性物质磁珠高内涵快速筛选方法，即从海洋天然产物中快速筛选靶标蛋白抑制剂，具体步骤如下：
第一步：取出100μL磁珠，使用等体积pH6的25mM2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗两次，每次10min；在使用之前，把1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐快速溶解在0–4℃pH6的25mM的2-(N-吗啡啉)乙磺酸中至浓度为50mg/mL；用pH6的25mM2-(N-吗啡啉)乙磺酸配制50mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，在清洗后的磁珠上加入50μL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和50μL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，混合均匀，在室温下缓慢倾斜旋转孵育30min；孵育后，将离心管放在磁铁上吸附4min，移除上清液，使用300μLpH6的25mM2-(N-吗啡啉)乙磺酸清洗两次；
第二步：在活化磁珠上，分别加入60μL溶解在pH6的25mM2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液中的DNA拓扑异构酶Ⅰ、α-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶，并分别加入40μLpH6的25mM2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液至最终体积为100μL，震荡混合均匀，在室温孵育过夜，孵育后，将离心管放在磁铁上吸附4min，移除上清液；使用300μLPBS冲洗包被的磁珠4次，作为掩盖蛋白的牛血清蛋白或脱脂奶粉浓度达到0.1-0.5％，把包被的磁珠重新分散在需要浓度的PBS和Tris缓冲液中；
第三步：使用透射电子显微镜对空白磁珠及键合的磁珠，进行性状表征；
第四步：称取海洋天然产物提取物1mg，加入少量二甲基亚砜溶解，后加入0.1mLpH6.8的10mMPBS溶液，超声10min溶解，吸取上清液进行液质分析，得到HPLC及分子量信息；
第五步：再取第四步得到的海洋天然产物上清液40μL，分别加到100μL键合DNA拓扑异构酶Ⅰ、α-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶的磁珠分散的醋酸胺溶液和空白磁珠分散的PBS缓冲液中，放在振荡器上混匀，孵育1小时；用PBS缓冲液清洗3次，每次的清洗液依次进液相分析；
第六步：将清洗液弃去，每个连通容器中加入10mL10％乙腈-水进行清洗，洗脱液进行液-质联用分析；
第七步：通过对比第四步和第六步得到的液质分析图谱，可以得到分别与DNA拓扑异构酶Ⅰ、α-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶的磁珠结合的海洋天然产物的保留时间和分子量信息；
第八步：通过核磁数据和理化性质鉴定海洋天然产物的化学结构；
第九步：对得到的化合物进行活性复筛，确认活性结构。
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| 海洋生物活性药物对细胞周期与凋亡的调控在抗肿瘤治疗中的作用;齐相薇 等;《中国医药生物技术》;20120430;第7卷(第2期);第147-150页 * |
| 海藻提取物中α-葡萄糖苷酶抑制剂的初步筛选;李宪璀 等;《中国海洋药物》;20020430(第2期);第8-11页 * |
| 纳米粒子的靶向作用机制研究进展;赵君贤 等;《中国医药生物技术》;20071031;第2卷(第5期);第370-372页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103675115A (zh) | 2014-03-26 |
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