WO2004008144A2 - METHODE DE DETECTION AUTOMATISABLE DE LA PrPres ET SES APPLICATIONS - Google Patents

METHODE DE DETECTION AUTOMATISABLE DE LA PrPres ET SES APPLICATIONS Download PDF

Info

Publication number
WO2004008144A2
WO2004008144A2 PCT/FR2003/002117 FR0302117W WO2004008144A2 WO 2004008144 A2 WO2004008144 A2 WO 2004008144A2 FR 0302117 W FR0302117 W FR 0302117W WO 2004008144 A2 WO2004008144 A2 WO 2004008144A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
buffer
prp
plasminogen
prp res
capture
Prior art date
Application number
PCT/FR2003/002117
Other languages
English (en)
Other versions
WO2004008144A3 (fr
Inventor
Nathalie Morel
Christophe Creminon
Jacques Grassi
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique filed Critical Commissariat A L'energie Atomique
Priority to AU2003263271A priority Critical patent/AU2003263271A1/en
Priority to JP2004520736A priority patent/JP2005537463A/ja
Priority to US10/520,397 priority patent/US20060188929A1/en
Priority to EP03763936A priority patent/EP1523681A2/fr
Publication of WO2004008144A2 publication Critical patent/WO2004008144A2/fr
Publication of WO2004008144A3 publication Critical patent/WO2004008144A3/fr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases

Definitions

  • the present invention relates to a sensitive, rapid, simple and fully automatable detection method for PrP res in a biological sample as well as to its applications.
  • Subacute transmissible spongiform encephalopathies are caused by unconventional transmissible agents (ATNC), also called prions, whose precise nature remains disputed to date.
  • ESST essentially includes Creutzfeldt-Jakob disease in humans (CJD or CJD for Creutzfeldt-Jakob disease), scrapie in sheep and goats and bovine spongiform encephalopathy (BSE or BSE for bovine spongiform encephalopathy) in cattle; other encephalopathies have been demonstrated in felines, mink or certain wild ruminants, such as deer.
  • PrP a host protein
  • PrP res an abnormal form
  • PrP res has significantly higher content in pleated ⁇ sheets, while normal PrP ( sense PrP) has a higher percentage of ' ⁇ propellers.
  • the infectious isoform PrP res is capable of converting the normal protein, that is to say the sense PrP, into infectious protein.
  • PrP res is partially resistant to proteases, in particular to proteinase K (PK), which causes cleavage of its N-terminal end. After action PK, PrP res is often called PrP27-30 because of the apparent molecular weight of the biglycosylated form; it is generally accepted that the PrP res cleavage site is located between amino acids 89 and 90 (Prusiner et al, Cell, 1984) for the usual strains.
  • - PrP res is insoluble and aggregates in non-ionic detergents, such as Triton XI 00 or Triton 114 by forming amyloid fibers (Scrapie Associated fibrils, SAFs).
  • PrP sense The normal form of the prion protein (PrP sense ) is, in principle, completely degraded by proteases and is perfectly soluble in the presence of non-ionic detergents.
  • PrP res abnormal PrP
  • PrP res abnormal PrP
  • sense PrP differ in their physical properties, it is in fact very difficult to develop immunological tests which make it possible to reliably differentiate the two isoforms of PrP, in particular due to the absence of specific antibodies to PrP res .
  • the only antibodies available recognize either sense PrP or the two forms of PrP (sense or res) after they have undergone a denaturation step. That is why in almost all immunoassays dedicated to the diagnosis of ESSTs include a denaturation step to allow the immunological detection of p r pres
  • histopathology which aims to detect (mainly in central nervous tissues) the lesions characteristic of ESSTs (spongiosis, vacuolization, astrogliosis, amyloid PrP plaques); it remains a reference method for confirming a clinical diagnosis. It is very specific since it allows direct observation of the stigma of the disease. However, we now know that it is less sensitive than other techniques. This method has the disadvantage of do not allow a pre-clinical diagnosis, since anatomical lesions appear late in the history of the disease. In addition, it is not at all suitable for analysis in large series.
  • bio-tests which aim to identify the infectious nature of a sample. Indeed, the most sensitive method for the diagnosis of ESSTs is, without question, experimental infection in laboratory animals. This method consists in injecting a homogenate prepared from the studied tissue into an animal and monitoring the appearance of clinical signs. The development of this experimental disease will be confirmed using conventional techniques (histology, immunohistolology, Western blot). For obvious practical reasons, these experiments are generally carried out on rodents (mice, hamsters) but in certain extreme cases, experimental infections have been carried out with sheep or cattle. The effectiveness of experimental transmission depends on many factors, including: the species barrier, the amount of transmissible agent inoculated, the prion strain, the sensitivity of the recipient species and the pathway inoculation.
  • the most effective route is the intracranial route, then the intravenous route (10 times less effective).
  • the least effective route is the oral route (100,000 times less effective than the intracranial route).
  • the most sensitive means of detecting the transmissible agent responsible for BSE is intracranial injection in cattle.
  • the main disadvantages of these methods are, on the one hand their heaviness and on the other hand their duration. Indeed, it takes between 300 and 700 days to carry out an experimental infection test in mice and between 3 and 10 years in cattle. The availability nibility of transgenic mice expressing the same PrP as that of the donor species will make it possible to shorten these times but, in all cases, these tests will last, at least three months.
  • PK digestion overcomes this drawback, meaning PrP being completely digested, while PrP res is little modified.
  • the specificity of this approach is due, among other things, to the fact that under the action of proteinase K, the molecular weight of PrP res is characteristically modified due to the partial degradation of the N-terminal part of the protein. Its sensitivity is of the same order of magnitude as that of immunohistology.
  • the main drawback of this technique is related to its difficulty of implementation, the duration of the analysis (> 8 hours) and the impossibility of automating it.
  • PrP res detection test which includes the immobilization of proteins on a nitrocellulose membrane, followed by protease digestion, denaturation and immunodetection with monoclonal antibodies.
  • the Prionics test uses the Western-blot technique in an industrialized form while the tests developed by Enfer Technology and Wallac are enzyme assays of the ELISA type.
  • the test developed by CEA first involves a selective purification of the PrP res which is then assayed using a sandwich assay using two monoclonal antibodies (enzymo-immunometric assay at two sites).
  • the Applicant has proposed a test for the quantitative detection of PrP res , which comprises a purification step which leads to a significantly more sensitive detection; this test is described in particular in PCT International Application WO 99/41280 and in a preliminary report from Directorate General XXIV of the European Commission (Consumer policy and health protection; http: // europa.
  • ligand capable of specifically recognizing PrP res .
  • This ligand immobilized on an adequate solid support could allow PrP res to be concentrated in media, such as blood or urine in which it is very little concentrated. Since the interaction between the ligand and PrP res is truly specific, treatment with proteinase K will not be necessary, just as it will not be necessary to use its aggregation properties. This type of ligand was recently described by the Adriano team
  • PrP res is therefore first concentrated by incubation with magnetic beads carrying plasminogen or fibrinogen, then detected by Western-blot analysis, ELISA, immunoprecipitation, BIACORE test, immunocytochemical test or histoblot test after elution of PrP res from the support. solid.
  • the conditions are as follows:
  • - sample preparation step homogenization and centrifugation of the homogenate; it is important to use, during the first stage of homogenization, low concentrations of ionic detergents, followed by centrifugation at low speed (500 g for 30 minutes), while in the following stages high concentrations in non-ionic detergents are used; preferably a protein concentration in the homogenate of at most 5 mg / ml is obtained;
  • - proteinase K digestion preferably in the presence of 50 ⁇ g / ml of PK, at 37 ° C, for at least half an hour;
  • the subject of the present invention is a method for detecting the
  • PrP res in a biological sample, using a solid support, in particular magnetic beads or microtiter plates, on which is immobilized plasminogen, which process is characterized in that it comprises:
  • a step of preparing the biological sample which can be constituted either by a homogenate of tissue or cells, or by serum or plasma, or by urine, during which the latter is incubated in a buffer selected from the group consisting of:
  • buffers for homogenizing the biological sample comprising (1) a buffer selected from the group consisting of buffers comprising at least one surfactant selected from the group consisting of ionic surfactants and nonionic surfactants , a glucose buffer, a sucrose-based buffer and a PBS buffer and (2) optionally, proteinase K at a final concentration between 1 and 8 ⁇ g / ml, preferably at a final concentration between 2 and 4 ⁇ g / ml and
  • the capture buffers comprising at least (1) a surfactant selected from the group consisting of ionic surfactants and (2) optionally a proteinase K at a final concentration of between 1 and 8 ⁇ g / ml, preferably at a final concentration between 2 and 4 ⁇ g / ml.
  • the plasminogen very preferably recognizes PrP res
  • a careful treatment beforehand with PK that is to say during from step (a) of preparation of the biological sample
  • PK makes it possible to suppress the signal linked to a residual recognition of the sense PrP. This is the reason why we consider that the careful implementation of PK at this stage is optional; moreover, in situations where it is feared that PK treatment affects PrP res (for example in a blood or urine sample), this PK treatment step can be omitted.
  • step (b) a step for capturing the PrP res on said solid support, necessarily carried out in the presence of a capture buffer as defined above, without PK, that is to say in which the surfactants are exclusively ionic surfactants, by incubation of the biological sample obtained in step (a) with said support on which plasminogen is immobilized covalently; this step comprises, if necessary, prior to incubation, a dilution of the biological sample obtained in step (a) in said capture buffer, in order to obtain the adjustment of the protein concentration, and this in particular in the case where step (a) was implemented in a homogenization buffer.
  • the optimal protein concentration in the biological sample varies depending on the environment studied. In the case of a homogenate of the brain, it is preferable that it does not exceed approximately 2 g / ml (corresponding to a homogenate at 2% w / v) under penalty of observing a loss of efficiency in the capture of PrP res .
  • This limitation is probably linked to the presence in the sample of uncharacterized substances which are also capable of binding to plasminogen. It is a drawback compared to other concentration methods (for example that described in PCT International Application WO 99/41280) which make it possible to treat more concentrated homogenates (homogenate at 20% w / v, ie approximately 20 mg / ml protein).
  • This gentle denaturation step is compatible with the maintenance of the plasminogen / PrP res complex.
  • the support on which the PrP res is optionally fixed can advantageously be washed; the washing conditions and in particular the washing buffer used, are not critical, in the process according to the invention.
  • the ionic surfactant used during step (a) or step (b) is selected from the group consisting of:
  • - anionic surfactants such as SDS (sodium dodecylsulfate), sarkosyl (lauroyl-sarcosine), sodium cholate, sodium deoxycholate (DOC), sodium taurocholate; and - zwitterionic surfactants, such as SB 3-10 (decyl-sulfobetaine), SB 3-12 (dodecyl-sulfobetaine), SB 3-14 (tetradecyl-sulfobetaine), SB 3-16 (hexadecyl- sulfobetaine), CHAPS and deoxyCHAPS.
  • SDS sodium dodecylsulfate
  • sarkosyl laauroyl-sarcosine
  • sodium cholate sodium deoxycholate
  • DOC sodium deoxycholate
  • - zwitterionic surfactants such as SB 3-10 (decyl-sulfobetaine), SB 3-12 (dodecyl-sulfobe
  • the nonionic surfactant, used during step (a) of the method according to the invention is selected from the group consisting of the C12E8
  • the incubation time of step (a) is between 5 and 30 minutes at 37 ° C, preferably for 10 minutes at 37 ° C.
  • the capture buffer preferably comprises sarkosyl at a final concentration of between 0.5% and 2% (w / v), even more preferred to a final sarkosyl concentration of 1% (w / v).
  • the capture buffer further comprises a salt preferably selected from alkali metal salts, preferably sodium chloride, even more preferably, a ne concentration between 0.15 M and 0.5 M.
  • the capture buffer further comprises a protein and even more preferably, bovine serum albumin at a concentration of 0.2 mg / ml.
  • the incubation time of step (b) is between 1 hour and 4 hours at room temperature.
  • the chaotropic agent used during stage (c) of gentle denaturation is selected from the group consisting of urea, a guanidine salt, such as guanidine hydrochloride or guanidine thiocyanate and sodium thiocyanate or a mixture thereof.
  • the incubation time of step (c) is between 10 and 60 minutes, preferably either for 30 minutes at 37 ° C with the plates microtitration either for 10 minutes at 100 ° C with the magnetic beads.
  • the tracer antibody of step (d) is a polyclonal or mono- antibody clonal selected from the group consisting of SAF antibodies and anti-recombinant PrP antibodies; more precisely, the SAF antibodies and more particularly the SAF -34, SAF-53 and SAF-61 antibodies were obtained by immunizing mice disabled for the PrP gene with denatured hamster SAFs (Demart et al., Biochem. Biophys. Res.
  • Antibodies BAR-221, BAR-224 and BAR-233 were obtained by immunizing mice disabled for the PrP gene with recombinant sheep PrP.
  • the antibody 8G8 was obtained by immunizing mice disabled for the PrP gene with a recombinant human PrP (Krasemann et al., J. Immunol. Methods, 1996, 199,109-118 and Mol. Med., 1996, 2, 725-734).
  • the solid support is advantageously selected from the group consisting of magnetic beads and microtiter plates.
  • the biological sample - is, if necessary, homogenized in a homogenization buffer optionally comprising PK, at very low concentrations (between 1 and 8 ⁇ g / ml),
  • Such a method makes it possible to carry out a continuous dosing that can be fully automated, unlike the method described in international PCT application WO 99/41280 which requires a centrifugation step.
  • Such an assay also has a sensitivity at least as good as that obtained with the methods implementing a purification step, as described in PCT International Application WO 99/41280.
  • the present invention also relates to a diagnostic kit for implementing the method as defined above, characterized in that it comprises in combination:
  • a proteinase K at a final concentration between 1 and 8 ⁇ g / ml, preferably at a final concentration between 2 and 4 ⁇ g / ml, and
  • Figure 1 illustrates the effect of proteinase K concentration on the CP signal ratio (positive control) to CN (negative control).
  • FIG. 2 represents a comparative study of the detection of PrP res from sheep using a conventional “sandwich” assay (BAR-224 / SAF-34) or with the plasminogen / BAR224 pair.
  • FIG. 3 represents a comparative study of the assay of PrP res from sheep suffering from scrapie using the technique described in International Application WO 99/41280 or the method according to the invention: assay “plasminogen / B AR224 sandwich on microtiter plate.
  • FIG. 5 illustrates the comparison of the detection of PrP res using the technique of preparation of SAFs followed by an immunometric assay (PCT International Application WO 99/41280) with that using the capture of PrP res on beads coupled to plasminogen followed by a direct assay (invention).
  • FIG. 6 shows the effect of the dilution of a homogenate of sheep brain scrapie on the detection of PrP res by direct assay on plasminogen coupled to magnetic beads.
  • FIG. 7 shows dilution curves of the brain of mice, cows and humans affected by ESST. It illustrates the capacity of the method according to the invention to carry out the diagnosis of all the ESSTs.
  • Plasminogen is immobilized covalently on the surface of Covalink NH microtiter plates (Nunc) using a homobifunctional coupling agent, disuccinimidyl suberate (DSS).
  • DSS disuccinimidyl suberate
  • 100 ⁇ l of a DSS solution (12.5 mg of DSS dissolved in 50 ml of DMSO and 50 ml of 50 mM carbonate buffer pH 9.5) are incubated on the surface of the Covalink NH wells for 1 hour at room temperature.
  • the wells are washed 3 times with distilled water and then 100 ⁇ l of a plasminogen solution at 2.5 ⁇ g / ml in 50 mM carbonate buffer pH 9.5 are incubated on the surface of the wells overnight at room temperature.
  • the wells are emptied and saturated with EIA buffer (0.1 M phosphate buffer pH 7.4 0.15 M NaCl, 0.1% BSA and 0.01% sodium azide)
  • step (a) of the process Preparation of the sample (step (a) of the process) and capture of the PrP res on the Covalink NH microtitration plates containing the plasminogen (step (b) of the process)
  • CP positive control
  • CN healthy
  • EIA buffer pH 7.4 comprising an ionic surfactant and proteinase K at a final concentration of 1 ⁇ g / ml, for 10 minutes at 37 ° C, then 10 ⁇ l of
  • Pefabloc TM proteose inhibitor corresponding to [4- (2-aminoethyl) fluoride) benzenesulfonyl] HCl
  • 100 ⁇ l of sample are deposited and incubated for 2 hours at room temperature in the wells of the Covalink NH microtiter plate containing the plasminogen.
  • Table I illustrates the results obtained using the antibody BAR-224 to detect PrP res associated with plasminogen after careful denaturation by treatment with guanidine / HCl.
  • Table I Effect of detergents on the capture of PrP res from sheep brain scrapie by plasminogen immobilized on a solid support Covalink NH microtiter plate.
  • EIA buffer 0.1M phosphate buffer pH 7.4 + 0.15 M NaCl + 0.1% BSA + 0.01% sodium azide
  • the capture conditions selected for the rest of the tests are: EIA buffer + SK 1%, even if in Table I above, other conditions have a slightly higher CP / CN ratio because these conditions provide a strong CP-CN differential and in other experiments the results were reversed, the value of CN varying.
  • Table II illustrates the results obtained. Table II: Effect of pH and NaCl concentration on the capture of PrP res from sheep brain scrapie by plasminogen immobilized on a Covalink NH microtiter plate.
  • EIA buffer 0.1 M phosphate buffer pH 7.4 + 0.1% BSA »+ sodium azide
  • the capture conditions of the PrP res preferably selected are as follows: EIA buffer + 0.5 M NaCl + 1% SK.
  • EIA buffer pH 7.4 comprising 0.5 M NaCl, 1% final of sarkosyl and proteinase K at different concentrations, 0 , 0.5, 1, 2, 4, and 8 ⁇ g / ml final for 10 minutes at 37 ° C., then 10 ⁇ l of Pefabloc TM at 100 mM are added. We then proceed as described above.
  • 25 ⁇ l of a homogenate of scrapie sheep brain and healthy sheep are incubated with 225 ⁇ l of EIA buffer pH 7.4 comprising 0.5 M NaCl, 1% sarkosyl and proteinase K at a final concentration of 1 ⁇ g / ml for 10 minutes at 37 ° C, then 10 ⁇ l of Pefabloc TM at 100 mM are added. 100 ⁇ l are placed in the wells of a microtiter plate containing immobilized plasminogen. After 2 hours of reaction at room temperature, the wells are washed and then incubated with 100 ⁇ l of different denaturing agents for 30 min at 37 ° C.
  • Table IN Effect of the denaturing agent used after capture and before detection of sheep PrP res by a labeled antibody.
  • Table N illustrates the results obtained.
  • Table V Selection of the tracer antibody for the detection of sheep PrP res .
  • the BAR224 tracer antibody gives the best CP / C ⁇ ratio as well as a good CP signal for the detection of sheep PrP res .
  • EXAMPLE 2 Comparative study of the detection of PrP res from sheep using a conventional “sandwich” assay (BAR224 / SAF34) or with the plasminogen / BAR224 pair. This study compared the detection sensitivity of the two types of sandwich.
  • a PrP res preparation (SAF) was obtained from a scrapie sheep brain:
  • the preparations of SAFs (according to the rapid SAFs protocol, as described in the international PCT application WO 99/41280) from 250 ⁇ l of sheep brain homogenate with scrapie or healthy, are taken up and denatured with 25 ⁇ l of denatu- rant (buffer C, as defined in PCT International Application WO 99/41280) for 10 min at 100 ° C.
  • the pellets are taken up with 250 ⁇ l of EIA buffer and successively diluted in EIA buffer. The dilutions are deposited in the wells of a microtiter plate containing the BAR224 antibody.
  • the wells are washed and then incubated with 100 ⁇ l of the SAF34 tracer antibody (at 5 EU / ml) for 2 hours at room temperature. After washing, 200 ⁇ l of the developer solution are added. The absorbance at 414 nm is measured after 30 minutes of reaction.
  • the SAFs preparations (identical to above) are taken up with 250 ⁇ l of EIA buffer containing final 4 mM Pefabloc TM, then treated by ultrasound until the pellet dissolves . Successive dilutions are then carried out in EIA buffer comprising Pefabloc TM. The dilutions are deposited on a solid support (microtitration plate) containing plasminogen.
  • the sensitivity of the two methods is compared by including, for the method according to Application WO 99/41280, the technique for preparing the SAFs and for the plasminogen technique, the dilution which is necessary to operate. before capture, in particular to obtain a protein concentration, in the homogenate, of 20 mg / ml (2% w / v).
  • Homogenate at 20% of sheep brain with scrapie is diluted or not in a homogenate of healthy sheep brain (dilution 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 and 1/320).
  • the SAFs are prepared from 250 ⁇ l of homogenate.
  • the BAR224 and SAF34 antibodies are used as capture antibodies and tracer antibodies respectively.
  • the plasminogen is immobilized on the microtitration plates as specified in Example 1;
  • the assay is carried out from 25 ⁇ l of homogenate, using as capture buffer, EIA buffer comprising 0.5 M NaCl, 1% sarkosyl and 2.5 ⁇ g / ml of proteinase K, as denaturing agent of guanidine / HCl 8M and as tracer antibody BAR224.
  • the results are illustrated in FIG. 3 and show that the test according to International PCT Application WO 99/41280 has a very clear advantage in terms of sensitivity because it treats 250 ⁇ l of homogenate at 20%, ie 50 mg of tissue. cerebral instead of 25 ⁇ l of the same homogenate at 20%, ie 5 mg for the test according to the invention.
  • This drawback results from the use of microtiter plates, because the volume of 2% homogenate treated is limited (at most 300 ⁇ l). However, this drawback disappears when magnetic beads are used which allow very large volumes to be treated (at least 50 ml).
  • plasminogen 100 ⁇ g were coupled to 1 ml of magnetic beads (Dynal M-280) according to the method described by the manufacturer.
  • the beads coupled to plasminogen are washed and then incubated with 500 ⁇ l of BAR224 tracer in 1% EIA / Tween 20 buffer (at 5 EU / ml) for 2 hours at room temperature under agitation. The beads are then washed twice with 1% EIA / Tween 20 buffer and once with PBS, before adding 600 ⁇ l of EUman reagent. After 30 minutes of reaction, 200 ⁇ l of reaction medium are removed and the absorbance at 412 nm is measured.
  • the denatured PrP eluted from the plasminogen is taken up with 300 ⁇ l of EIA buffer and measured using a BAR224 / SAF34 “sandwich” assay.
  • SAFs are prepared from 500 ⁇ l homogenate at 20% of healthy sheep brain or scrapie (diluted or not in a homogenate of healthy sheep brain 1/10, 1/50 and 1/100).
  • the SAF pellets are taken up and denatured with 50 ⁇ l of denaturation buffer (buffer C, as defined in PCT international application WO 99/41280) for 10 minutes at 100 ° C.
  • the amount of PrP is then measured with the BIO-RAD Platelia TM BSE detection kit (ref. 51103) (immunoenzymatic kit for the in vitro detection of PrP res after purification according to the method described in PCT International Application WO 99 / 41280).
  • the 500 ⁇ l of homogenate (the same as above) are diluted 10 times in EIA buffer comprising 0.5M NaCl and 1% sarkosyl, then incubated with 30 ⁇ l of beads containing the plasminogen immobilized for 3 hours at room temperature. After washing, gentle denaturation is carried out by treatment with a guanidine / HCl solution for 10 minutes at 100 ° C. After 3 washes with 1% EIA / Tween 20 buffer and washing with PBS, the beads are incubated with the BAR224 tracer in EIA buffer for 2 hours at room temperature. The beads are again washed 3 times with 1% EIA / Tween 20 buffer and once with PBS before adding the development solution (Ellman reagent).
  • FIG. 5 shows that the plasminogen technique appears at least as sensitive as the test according to International PCT Application WO 99/41280.
  • the use of magnetic beads makes it possible to work with a larger volume and to compensate for the drawback linked to the need to dilute the homogenate before capture by plasminogen.
  • EXAMPLE 6 Effect of the dilution of a homogenate of sheep brain affected with scrapie on the detection of PrP res by direct assay on plasminogen coupled to the magnetic beads. Demonstration of the method's ability to concentrate PrP res diluted in a large volume of sample.
  • 500 ⁇ l of a homogenate of sheep brain suffering from scrapie are diluted in 5, 10, 20 and 50 ml of EIA buffer pH 7.4 comprising 0.5 M NaCl and 1% sarkosyl, then incubated with 30 ⁇ l of balls coupled to plasminogen for 4 hours at room temperature. Then we proceed as described above.
  • FIG. 6 shows the capacity of the method according to the invention to concentrate the diluted PrP res .
  • EXAMPLE 7 Application of the invention to the detection of PrP res in homogenates of mouse, cow and human brains affected by ESST.
  • Homogenates at 20% (w / v) obtained from a mouse brain (infected with a scrapie strain), a bovine brain (infected with BSE) or a human brain ( infected with Creutzfeldt-Jakob disease) were diluted to a concentration of 1% (w / v) in the capture buffer (EIA buffer comprising 0.5 M NaCl and 1% sarkosyl (v / v ) final). These homogenates were then brought into contact with magnetic beads containing immobilized plasminogen and analyzed under the conditions described in Example 4.
  • EIA buffer comprising 0.5 M NaCl and 1% sarkosyl (v / v ) final
  • a negative or positive control homogenate of the brain (50 ml or less in a negative homogenate + 50 ⁇ l of SK10%) is added to 850 ⁇ l of 0.5 M EIA / NaCl buffer + 50 ⁇ l.
  • SK10% 10 ⁇ l of magnetic beads coupled to plasminogen; incubated for 2 h 30 min at room temperature under rotation; the beads are then washed, 3 times with EIA buffer comprising 1% of Tween 20, then once with PBS.
  • the denaturation is carried out in the presence of 50 ⁇ l of guanidine thiocyanate (Gn / SCN) 4 M at 100 ° C for 8 min.
  • the beads are washed in PBS and then incubated with 500 ⁇ l of tracer antibody 2 h at room temperature, with shaking (at 5 EU / ml). The beads are then washed twice with EIA Tween 20 1% buffer and once with PBS, before adding 1 ml of Ellman reagent. After 20 min of reaction, 200 ⁇ l of reaction medium are removed and the absorbance at 412 nm is measured.
  • FIG. 7 shows that the test described works with species other than sheep and can detect other strains of prions than the scrapie strains.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Procédé de détection automatisable de la PrPres dans un échantillon biologique ainsi que ses applications. Ledit procédé de détection met en uvre un support solide sur lequel est immobilisé du plasminogène. Il comprend essentiellement les étapes suivantes : (a) une étape de préparation de l'échantillon biologique au cours de laquelle ce dernier est incubé dans un tampon d'homogénéisation qui comprend un agent tensioactif ionique ou non-ionique, un tampon glucosé, un tampon à base de saccharose et un tampon PBS ou dans un tampon de capture comprenant un agent tensioactif ionique ; cette étape comprend optionnellement l'incubation avec une protéinase K à une concentration finale comprise entre 1 et 8 µg/ml, de préférence à une concentration finale comprise entre 2 et 4 µg/ml ; (b) une étape de capture de la PrPres sur ledit support solide, effectuée obligatoirement en présence d'un tampon de capture, tel que défini ci-dessus ; (c) une étape de dénaturation ménagée de la PrPres fixée sur ledit support comprenant une incubation avec un tampon de dénaturation comprenant au moins un agent chaotrope, à une température comprise entre la température ambiante et 100°C et (d) une étape de détection de la PrPres dénaturée et fixée sur ledit support avec un anticorps spécifique de la protéine PrP.

Description

MÉTHODE DE DÉTECTION AUTOMATISABLE DE LA PrPres ET SES
APPLICATIONS.
La présente invention est relative à un procédé de détection sensible, rapide, simple et entièrement automatisable de la PrPres dans un échantillon biologique ainsi qu'à ses applications.
Les encéphalopathies subaiguës spongiformes transmissibles (ESST) sont provoquées par des agents transmissibles non conventionnels (ATNC), encore appelés prions, dont la nature précise reste contestée à ce jour. Les ESST comprennent essentiellement la maladie de Creutzfeldt-Jakob, chez l'homme (MCJ ou CJD pour Creutzfeldt-Jakob disease), la tremblante chez le mouton et la chèvre et l'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB ou BSE pour bovine spongiform encephalopathy) chez lez bovins ; d'autres encéphalopathies ont été mises en évidence chez les félidés, chez le vison ou certains ruminants sauvages, tels que le cerf.
Ces maladies sont d'évolution constamment fatale et il n'existe, à l'heure actuelle, aucun traitement efficace.
Dans les ESST, on observe couramment, pendant la phase clinique de la maladie, une accumulation d'une protéine de l'hôte, la PrP (ou protéine du prion), sous une forme anormale (PrPres), principalement dans le système nerveux central sous la forme d'agrégats amorphes ou de plaques amyloïdes. La PrPres copuri- fie avec l'infectiosité et son accumulation précède l'apparition des lésions histo- logiques. In vitro, elle est toxique pour des cultures de neurones.
Les deux isoformes de la PrP présentent la même séquence en acides aminés, mais diffèrent dans leur structure secondaire : la PrPres présente un contenu significativement plus élevé en feuillets β plissés, alors que la PrP normale (PrPsens) présente un plus grand pourcentage d'hélices α.
L 'isoforme infectieuse PrPres est capable de convertir la protéine normale, c'est-à-dire la PrPsens, en protéine infectieuse.
Deux propriétés biochimiques permettent, généralement, de distinguer ces deux isoformes. - la PrPres est partiellement résistante aux protéases, notamment à la protéinase K (PK), qui entraîne un clivage de son extrémité N-terminale. Après action de la PK, la PrPres est souvent appelée PrP27-30 à cause du poids moléculaire apparent de la forme biglycosylée ; il est généralement admis que le site de clivage de la PrPres se situe entre les acides aminés 89 et 90 (Prusiner et al, Cell, 1984) pour les souches habituelles. - la PrPres est insoluble et s'agrège dans les détergents non-ioniques, tels que le Triton XI 00 ou le Triton 114 en formant des fibres amyloïdes (Scrapie Associated fibrils, SAFs).
La forme normale de la protéine du prion (PrPsens) est, en principe, complètement dégradée par les protéases et est parfaitement soluble en présence de détergents non-ioniques .
Pour déceler la présence de l'agent infectieux, la plupart des méthodes sont fondées sur une détection sélective de la PrP anormale (PrPres), liée à l'agent infectieux, en tirant profit de sa résistance partielle aux protéases et de ses propriétés d'agrégation. Toutefois, bien que la PrPres et la PrPsens diffèrent par leurs propriétés physiques, il est en fait très difficile de développer des tests immunologiques qui permettent de différencier de manière fiable les deux isoformes de la PrP, notamment en raison de l'absence d'anticorps spécifiques de la PrPres. En effet, à ce jour, les seuls anticorps disponibles reconnaissent soit la PrPsens soit les deux formes de la PrP (sens ou res) après qu'elles aient subi une étape de denaturation. C'est la raison pour laquelle dans presque tous les tests immunologiques dédiés au diagnostic des ESSTs on retrouve une étape de denaturation afin de permettre la détection immunologique de la prpres
Les cinq grandes méthodes conventionnellement utilisées pour le diagnostic des ESSTs sont :
1. l'histopathologie, qui vise à détecter (essentiellement dans des tissus nerveux centraux) les lésions caractéristiques des ESSTs (spongiose, vacuolisa- tion, astrogliose, plaques amyloïdes PrP) ; elle reste une méthode de référence pour la confirmation d'un diagnostic clinique. Elle est très spécifique puisqu'elle permet d'observer directement les stigmates de la maladie. Cependant, on sait maintenant qu'elle est moins sensible que d'autres techniques. Cette méthode a l'inconvénient de ne pas permettre un diagnostic pré-clinique, dans la mesure où les lésions anatomiques apparaissent tardivement dans l'histoire de la maladie. De plus elle n'est pas du tout adaptée à une analyse en grandes séries.
2. rimmunohistochimie, qui permet de détecter les plaques amyloïdes ou les dépôts de PrPres à l'aide d'anticorps spécifiques de la PrP. La sensibilité de l'observation au microscope peut, en effet, être augmentée de façon significative grâce à cette approche. Ces techniques font certainement partie des méthodes les plus sensibles aujourd'hui mais elles restent lourdes et sont surtout utilisées comme méthodes de confirmation. 3. la détection des fibres amyloïdes par microscopie électronique.
Cette méthode a l'inconvénient d'être peu sensible et lourde à mettre en œuvre. Elle est aujourd'hui quasiment abandonnée.
4. les bio-essais qui visent à identifier le caractère infectieux d'un échantillon. En effet, la méthode la plus sensible pour le diagnostic des ESSTs est, sans conteste, l'infection expérimentale chez l'animal de laboratoire. Cette méthode consiste à injecter chez un animal un homogénat préparé à partir du tissu étudié et à surveiller l'apparition des signes cliniques. Le développement de cette maladie expérimentale sera confirmé à l'aide de techniques classiques (histologie, immunohistolo- gie, Western-blot). Pour des raisons pratiques évidentes, ces expériences sont généralement réalisées sur des rongeurs (souris, hamster) mais dans certains cas extrêmes, des infections expérimentales ont été réalisées avec des ovins ou des bovins. L'efficacité de la transmission expérimentale dépend de nombreux facteurs et notamment : de la barrière d'espèce, de la quantité d'agent transmissible inoculée, de la souche de prion, de la sensibilité de l'espèce réceptrice et de la voie d'inoculation. La voie la plus efficace est la voie intra-crânienne, puis la voie intraveineuse (10 fois moins efficace). La voie la moins efficace est la voie orale (100.000 fois moins efficace que la voie intra-crânienne). Ainsi, le moyen le plus sensible pour détecter l'agent transmissible responsable de l'ESB est l'injection intra-crânienne chez le bovin. Les principaux inconvénients de ces méthodes sont, d'une part leur lourdeur et d'autre part leur durée. En effet, il faut compter entre 300 et 700 jours pour réaliser un test d'infection expérimental chez la souris et entre 3 et 10 ans chez les bovins. La dispo- nibilité de souris transgéniques exprimant la même PrP que celle de l'espèce donneuse va permettre de raccourcir ces délais mais, dans tous les cas, ces tests dureront, au moins trois mois.
5. les méthodes de Western-blot qui reposent sur la détection immu- nologique de la PrPres dans un extrait de tissu, après traitement de l'extrait par une protéase (PK, par exemple), de façon à détruire l 'isoforme normale de la PrP (PrPsens), séparation des protéines de l'extrait par électrophorèse, transfert sur une membrane de polymère, et détection par un anticorps spécifique reconnaissant la PrP (Schaller O. et al., Acta Neuropathol (Berl), 1999, 98, 437-443). Pour les raisons expliquées ci- dessus, la digestion par une protéase est nécessaire, dans la mesure où pour effectuer une analyse par Western-blot, la protéine est dénaturée, ce qui implique qu'il n'existe plus de différence entre la forme normale (PrPsens) et la forme pathologique (PrPres) de la protéine prion. La digestion à la PK pallie cet inconvénient, la PrPsens étant complètement digérée, alors que la PrPres est peu modifiée. La spécificité de cette approche tient, entre autre, au fait que sous l'action de la protéinase K, le poids moléculaire de la PrPres est modifié de façon caractéristique en raison de la dégradation partielle de la partie N-terminale de la protéine. Sa sensibilité est du même ordre de grandeur que celle de l'immunohistologie. Le principal inconvénient de cette technique est lié à sa difficulté de mise en œuvre, à la durée de l'analyse (> 8 heures) et à l'impossibilité de l'automatiser.
Plus récemment des tests de type ELISA ont été décrits. Parmi ceux ci, certains font intervenir un traitement des extraits de tissus par une protéase, on peut citer :
- celui décrit par Serban et al. (Neurology, 1990, 40, 110), qui ont développé un test de détection de la PrPres qui inclut l'immobilisation des protéines sur une membrane de nitrocellulose, suivie d'une digestion protéasique, d'une denaturation et d'une immunodétection avec des anticorps monoclonaux.
- celui décrit par Oesch et al. (Biochemistry, 1994, 33, 5926-5931), qui ont proposé, pour quantifier la quantité de PrPres, un test d'immunofiltration pour la purification de la PrPres (ELIFA ou enzyme-linked immunofiltration assay). - celui décrit par Grarwohl et al., 1997, qui proposent un dosage de type ELISA. Après traitement des échantillons à la protéinase K et purification de la PrPres par centrifugation, celle-ci est adsorbée sur des plaques de microtitration et détectée à l'aide d'anticorps polyclonaux de lapin. Aucune des méthodes citées ci-dessus n'est véritablement adaptée à un criblage à haut débit et ne peut se prêter à une automatisation. Après la première "crise de la vache folle" en 1996 et la prise en considération d'une possible transmission de cette maladie à l'homme, le besoin s'est fait sentir de développer de nouvelles approches diagnostiques, plus simples et plus rapides. Ces méthodes devront permet- tre soit d'effectuer des études épidémiologiques à grande échelle, afin d'évaluer plus précisément les caractéristiques de l'épizootie, soit de tester systématiquement, à l'abattoir par exemple, l'ensemble des animaux avant leur entrée dans la chaîne alimentaire ou les circuits industriels. Ainsi s'est développée une nouvelle génération de tests diagnostiques, dits rapides, qui sont tous fondés sur la détection immuno- logique de la PrPres.
En mai 1998, la Direction Générale XXIN de la Commission Européenne (Politique des consommateurs et protection de leur santé) a émis un appel d'offre mondial visant à recenser les techniques capables d'effectuer un criblage à haut débit de la BSE et susceptibles de donner lieu rapidement à un développement indus- triel. A l'issue de cet appel d'offre (juin 1998) quatre tests ont été sélectionnés. Trois d'entre eux ont été mis au point par des sociétés industrielles : Enfer Technology Ltd (Irlande) (Demandes Internationales PCT WO 98/35236, au nom de Enfer Technology Ltd et WO 93/11155, au nom de Proteus Molecular Design Limited), Prionics (Suisse) (Demande Internationale PCT WO 99/15651) et E.G. & G. Wallac (Grande Bretagne) (Demande Internationale WO 00/29850), le quatrième a été développé dans deux laboratoires du CE A (France). Ces quatre tests ont pour but de détecter dans le cerveau des animaux la présence de PrPres. Tous font intervenir un traitement des extraits de cerveaux par la protéinase K de façon à détruire la PrPseπs et permettre une mesure sélective de la PrPres. Le test de Prionics utilise la technique du Western-blot sous une forme industrialisée alors que les tests développés par Enfer Technology et Wallac sont des dosages enzymoi munologiques de type ELISA. Le test développé par le CEA implique d'abord une purification sélective de la PrPres qui est ensuite dosée à l'aide d'un dosage sandwich utilisant deux anticorps monoclonaux (dosage enzymo-immunométrique à deux sites). Cette étude a montré que trois des tests évalués (Prionics, Enfer et CEA) possédaient une excellente capacité à détecter spécifiquement les bovins au stade clinique de la maladie. Par ailleurs, le test développé par le CEA a démontré qu'il était significativement plus sensible que celui des concurrents en raison notamment de l'étape de purification concentration de la PrPres (Moynagh et al., Nature, 1999, 400, 105 ; http:/europa.eu.int/comm/dg24/health/). Ainsi, la Demanderesse a proposé un test pour la détection quantitative de la PrPres, qui comprend une étape de purification qui conduit à une détection significativement plus sensible ; ce test est notamment décrit dans la Demande Internationale PCT WO 99/41280 et dans un Rapport préliminaire de la Direction Générale XXIV de la Commission Européenne (Politique des consommateurs et protection de leur santé ; http ://europa. eu.int/comm/dg24/health/) ; elle a également proposé, dans la Demande Internationale PCT WO 01/35104 une méthode de diagnostic qui outre la possibilité de purification évoquée ci-dessus, met en œuvre un traitement de l'échantillon biologique avec une protéase, de manière à dégrader complètement la prpsens dans des conditions où tout ou partie des motifs octapeptides répétés de la PrPres sont conservés ; ceci permet de détecter la PrPres à l'aide d'un anticorps anti- octapeptides, d'affinité élevée. Cette méthode est très sensible et très spécifique ; toutefois, le procédé de purification/concentration comprend plusieurs étapes et notamment une étape de centrifugation qui interdit toute automatisation totale du test.
Depuis 1999, ces tests rapides ont démontré leur utilité dans le cadre d'études épidémiologiques portant sur des populations à risque (animaux morts, abattus en urgence ou euthanasiés pour maladie). Depuis le début de l'année 2001, ils sont utilisés à très grande échelle, pour tester tous les bovins de plus de 24 ou 30 mois entrant dans la chaîne alimentaire (8,5 millions de tests réalisés en 2001).
Aujourd'hui la priorité dans le domaine du diagnostic des maladies à prions est la mise au point d'un test ante-mortem et préclinique pour le variant de la maladie de Creutzfeldt-Jakob. L'objectif est d'abord de sécuriser la transfusion sanguine et ensuite de détecter de façon précoce les personnes atteintes par cette maladie afin de pouvoir envisager la mise en place d'un traitement (qui n'existe pas à ce jour) avant la phase de neuroinvasion et l'apparition des premiers signes cliniques irréversibles. Ceci implique obligatoirement la mise au point d'un test sur un prélève- ment de sang ou d'urine, les seuls fluides biologiques facilement prélevables de façon non invasive. Cet objectif apparaît réalisable puisque quelques publications font état de la présence de prions infectieux ou de PrPres dans le sang (Brown et al., Transfusion, 1999, 39, 1169-1178 ; Houston et al. The Lancet, 2000, 356, 999-1000 ; Schmerr et al., J. Chromât. A., 1999, 853, 207-214) ou dans l'urine (Shaked et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 31479-31482). Cependant, l'analyse de ce type d'échantillons pose des problèmes analytiques beaucoup plus difficiles à résoudre que ceux rencontrés pour analyser des tissus connus pour répliquer et accumuler la PrPres (cerveaux, tissus lymphoïdes). En effet, les données disponibles sur la physiopathologie des ESSTs montrent qu'en tout état de cause, la PrPres est au moins 100 fois moins concentrée dans le sang ou les urines que dans une rate ou un cerveau. D'autre part, il est probable que dans ces milieux (urine, cellules blanches du sang), les propriétés biochimiques de la PrPres soient différentes de celles observées dans les tissus où elle s'accumule de façon importante. Ses propriétés d'agrégation et sa résistance à la PK peuvent notamment être très diminuées. Il est possible, par exemple que les traitements à la protéi- nase K utilisés pour analyser un échantillon de cerveau, détruisent aussi les traces de PrPres contenues dans le sang. En conséquence, il faut développer pour analyser ce type d'échantillon des stratégies différentes de celles développées à ce jour.
Une des options possibles consiste à utiliser un ligand capable de reconnaître spécifiquement la PrPres. Ce ligand, immobilisé sur un support solide adéquat pourrait permettre de concentrer la PrPres dans les milieux, comme le sang ou l'urine dans lesquels elle est très peu concentrée. Dans la mesure où l'interaction entre le ligand et la PrPres est vraiment spécifique, un traitement à la protéinase K ne sera pas nécessaire, de même qu'il ne sera pas nécessaire de faire appel à ses propriétés d'agrégation. Ce type de ligand a été décrit récemment par l'équipe d'Adriano
Aguzzi (Fischer et al., Nature, 2000, 408, 479-483 ; Maissen et al., The Lancet, 2001, 357, 2026-2028) et a fait l'objet d'une Demande Internationale WO 01/23425. Dans cette Demande Internationale, pour permettre la détection de petites quantités de prion, il est proposé de concentrer la PrPres ou ses produits de digestion à la PK, par traitement de l'échantillon biologique concerné avec des billes magnétiques portant des sites de liaison aux prions : plasminogène purifié, fibrinogène, fraction I de précipitation au sulfate d'ammonium du sérum ou du plasma ou fraction II de précipitation au sulfate d'ammonium du sérum ou du plasma. La PrPres est donc d'abord concentrée par incubation avec des billes magnétiques portant du plasminogène ou du fibrinogène, puis détectée par analyse Western-blot, ELISA, immunoprécipitation, test BIACORE, test immunocytochimique ou test histoblot après élution de la PrPres du support solide. Dans cette méthode, les conditions sont les suivantes :
- étape de préparation de l'échantillon : homogénéisation et centrifugation de l'homogénat ; il est important d'utiliser, au cours de la première étape d'homogénéisation, des concentrations faibles en détergents ioniques, suivie d'une centrifugation à faible vitesse (500 g pendant 30 minutes), alors que dans les étapes suivantes des concentrations élevées en détergents non-ioniques sont mises en œuvre ; on obtient de préférence une concentration en protéine dans l'homogénat d'au plus 5 mg/ml ;
- digestion à la protéinase K : de préférence en présence de 50 μg/ml de PK, à 37°C, pendant au moins une demi-heure ;
- conditions d'incubation des billes magnétiques avec l'homogénat, dans un tampon non-ionique : environ 1 heure et demi à température ambiante.
- conditions de détection : pour réaliser cette opération, il y a tout d'abord lieu de procéder à une denaturation des protéines fixées, qui conduit à leur détachement des billes magnétiques : on procède en deux temps : lavage des billes avec un tampon de lavage comprenant du Tween 20 à 2 % et du NP-40 à 2 % dans du PBS, puis addition d'un tampon de chargement pour l'électrophorèse comprenant du Tris 50 mM, pH 6,8, du SDS à 2 %, du bleu de bromophénol à 0,01 % et du glycérol à 10 % et chauffage à 95 °C pendant 5 minutes. La PrPres dénaturée ainsi éluée du support solide contenant le plasminogène est ensuite analysée à l'aide d'un Western- blot. En effet, dans la mesure où il n'existe pas d'anticorps spécifique de la PrPres, capables de la détecter quand elle est liée au plasminogène, il est nécessaire de rompre la liaison plasminogène/PrPres et donc de dénaturer la PrPres, pour la détecter sous forme dénaturée par une autre méthode, ce qui implique qu'elle est décrochée des billes. Une telle procédure est adaptée à l'analyse par Western-blot, mais pas du tout aux tests de type ELISA mettant en œuvre un support tel que des plaques de microti- tration ou des billes magnétiques. En effet, les conditions utilisées dans la méthode décrite dans cette Demande Internationale WO 01/23425 (utilisation de SDS, notamment) du fait de la dissociation du complexe plasminogène/Prpres lors de sa denaturation, impose une étape de liaison supplémentaire à un support solide. Il faut noter, en outre, que la méthode décrite dans cette Demande ne montre aucune capacité à concentrer la PrPres contenue dans un grand volume d'échantillon.
C'est pourquoi la Demanderesse s'est donnée pour but de pourvoir à un procédé de détection spécifique, sensible, simple et rapide de la PrPres qui réponde mieux aux objectifs actuels du diagnostic des ESSTs que les méthodes de détection de l'art antérieur, notamment :
- en ce qu'elle est d'utilisation facile, c'est-à-dire mieux adaptée aux conditions d'utilisation en routine et donc entièrement automatisable ; et
- en ce qu'elle est capable de purifier et de concentrer la PrPres sans faire appel à ses propriétés de résistance à la PK ou d'agrégation. La présente invention a pour objet un procédé de détection de la
PrPres dans un échantillon biologique, mettant en œuvre un support solide, notamment des billes magnétiques ou des plaques de microtitration, sur lequel est immobilisé du plasminogène, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend :
(a) une étape de préparation de l'échantillon biologique, lequel peut être constitué soit par un homogenat de tissu ou de cellules, soit par du sérum ou du plasma, soit par de l'urine, au cours de laquelle ce dernier est incubé dans un tampon sélectionné dans le groupe constitué par :
(i) des tampons d'homogénéisation de l'échantillon biologique comprenant (1) un tampon sélectionné dans le groupe constitué par les tampons comprenant au moins un agent tensioactif sélectionné dans le groupe constitué par les agents tensioactifs ioniques et les agents tensioactifs non-ioniques, un tampon glucose, un tampon à base de saccharose et un tampon PBS et (2) optionnellement, une protéinase K à une concentration finale comprise entre 1 et 8 μg/ml, de préférence à une concentration finale comprise entre 2 et 4 μg/ml et
(ii) les tampons de capture comprenant au moins (1) un agent tensioactif sélectionné dans le groupe constitué par les agents tensioactifs ioniques et (2) optionnellement une protéinase K à une concentration finale comprise entre 1 et 8 μg/ml, de préférence à une concentration finale comprise entre 2 et 4 μg/ml.
Bien que dans les conditions de capture sélectionnées à l'étape (b) ci-après, le plasminogène reconnaisse de façon très préférentielle la PrPres, dans certaines situations un traitement ménagé préalable avec la PK (c'est-à-dire au cours de l'étape (a) de préparation de l'échantillon biologique) permet de supprimer le signal lié à une reconnaissance résiduelle de la PrPsens. C'est la raison pour laquelle on considère que la mise en œuvre ménagée de la PK à cette étape est optionnelle ; par ailleurs, dans les situations où l'on peut craindre que le traitement à la PK affecte la PrPres (par exemple dans un échantillon sanguin ou d'urine), cette étape de traitement à la PK peut être supprimée.
Il est à noter que la concentration en PK mise en œuvre est beaucoup plus faible que celle utilisée dans la Demande Internationale WO 01/23425 (50 μg/ml) ou dans les autres tests utilisant la PK (couramment entre 40 et 100 μg/ml). (b) une étape de capture de la PrPres sur ledit support solide, effectuée obligatoirement en présence d'un tampon de capture tel que défini ci-dessus, sans PK, c'est-à-dire dans lequel les agents tensioactifs sont exclusivement des agents tensioactifs ioniques, par incubation de l'échantillon biologique obtenu à l'étape (a) avec ledit support sur lequel est immobilisé de façon covalente du plasminogène ; cette étape comprend, si nécessaire, préalablement à l'incubation, une dilution de l'échantillon biologique obtenu à l'étape (a) dans ledit tampon de capture, pour obtenir l'ajustement de la concentration en protéine, et ce notamment dans le cas où l'étape (a) a été mise en œuvre dans un tampon d'homogénéisation.
La concentration optimale en protéine dans l'échantillon biologique varie selon le milieu étudié. Dans le cas d'un homogenat de cerveau, il est préférable qu'elle ne dépasse pas environ 2 g/ml (correspondant à un homogenat à 2 % p/v) sous peine d'observer une perte d'efficacité de la capture de la PrPres. Cette limitation est probablement liée à la présence dans l'échantillon de substances non caractérisées capables, elles aussi, de se lier au plasminogène. Elle constitue un inconvénient par rapport à d'autres méthodes de concentration (par exemple celle décrite dans la Demande Internationale PCT WO 99/41280) qui permettent de traiter des homogénats plus concentrés (homogenat à 20% p/v soit environ 20 mg/ml de protéine).
(c) une étape de denaturation ménagée de la PrPres fixée sur ledit support par l'intermédiaire du plasminogène, comprenant l'incubation de la PrPres avec un tampon de denaturation comprenant au moins un agent chaotrope, à une tempéra- ture comprise entre la température ambiante et 100°C.
Cette étape de denaturation ménagée est compatible avec le maintien du complexe plasminogène/PrPres.
(d) une étape de détection de la PrPres dénaturée et fixée sur ledit support avec un anticorps spécifique de la protéine PrP. Après l'étape (b) de capture, le support sur lequel est éventuellement fixé la PrPres, peut avantageusement être lavé ; les conditions de lavage et en particulier le tampon de lavage utilisé, ne sont pas critiques, dans le procédé selon l'invention.
Selon un mode de mise en œuvre avantageux du procédé selon l'invention, l'agent tensioactif ionique mis en œuvre au cours de l'étape (a) ou de l'étape (b) est sélectionné dans le groupe constitué par :
- des agents tensioactifs anioniques, tels que le SDS (dodécylsulfate de sodium), le sarkosyl (lauroyl-sarcosine), le cholate de sodium, le désoxycholate (DOC) de sodium, le taurocholate de sodium ; et - des agents tensioactifs zwitterioniques, tels que le SB 3-10 (décyl- sulfobétaïne), le SB 3-12 (dodécyl-sulfobétaïne), le SB 3-14 (tétradécyl-sulfobétaïne), le SB 3-16 (hexadécyl-sulfobétaïne), le CHAPS et le désoxyCHAPS.
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux du procédé selon l'invention, l'agent tensioactif non-ionique, mis en œuvre au cours de l'étape (a) du procédé selon l'invention, est sélectionné dans le groupe constitué par le C12E8
(dodécyl octaéthylène glycol), le Triton XI 00, le Triton XI 14, le Tween 20, le Tween 80, le MEGA 9 (nonanoyl méthyle glucamine), l'octylglucoside, le LDAO ( dodécyle diméthylamine oxyde) ou le NP40.
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux du procédé selon l'invention, la durée d'incubation de l'étape (a) est comprise entre 5 et 30 minutes à 37°C, de préférence pendant 10 minutes à 37°C.
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux du procédé selon l'invention, le tampon de capture comprend, de préférence, du sarkosyl à une concentration finale comprise entre 0,5 % et 2 % (p/v), de manière encore plus préférée à une concentration finale en sarkosyl de 1 % (p/v). Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux du procédé selon l'invention, le tampon de capture comprend en outre un sel sélectionné de préférence parmi les sels de métaux alcalins, de préférence du chlorure de sodium, de manière encore plus préférée, a ne concentration comprise entre 0,15 M et 0,5 M.
Selon encore un autre mode de mise en œuvre avantageux du procédé selon l'invention, le tampon de capture comprend en outre une protéine et de manière encore plus préférée, de la sérumalbumine bovine à une concentration de 0,2 mg/ml.
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux du procédé selon l'invention, la durée d'incubation de l'étape (b) est comprise entre 1 heure et 4 heures à température ambiante.
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux de l'invention, l'agent chaotrope mis en œuvre au cours de l'étape (c) de denaturation ménagée est sélectionné dans le groupe constitué par l'urée, un sel de guanidine, tel que le chlorhydrate de guanidine ou le thiocyanate de guanidine et le thiocyanate de sodium ou un mélange de ceux-ci.
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux du procédé selon l'invention, la durée d'incubation de l'étape (c) est comprise entre 10 et 60 minutes, de préférence soit pendant 30 minutes à 37°C avec les plaques de microtitration soit pendant 10 minutes à 100°C avec les billes magnétiques. Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux du procédé selon l'invention, l'anticorps traceur de l'étape (d) est un anticorps polyclonal ou mono- clonal sélectionné dans le groupe constitué par les anticorps SAF et les anticorps anti- PrP recombinante ; de manière plus précise, les anticorps SAF et plus particulièrement les anticorps SAF -34, SAF-53 et SAF-61 ont été obtenus en immunisant des souris invalidées pour le gène de la PrP avec des SAFs de hamster dénaturés (Demart et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 265,652-657). Les anticorps BAR-221, BAR-224 et BAR-233 ont été obtenus en immunisant des souris invalidées pour le gène de la PrP avec une PrP recombinante de mouton. L'anticorps 8G8 a été obtenu en immunisant des souris invalidées pour le gène de la PrP avec une PrP recombinante humaine (Krasemann et al., J. Immunol. Methods, 1996, 199,109-118 et Mol. Med., 1996, 2, 725-734).
Conformément à l'invention, le support solide est avantageusement sélectionné dans le groupe constitué par les billes magnétiques et les plaques de microtitration.
De manière surprenante, le fait que l'échantillon biologique : - est, si nécessaire, homogénéisé dans un tampon d'homogénéisation comprenant éventuellement de la PK, à des concentrations très faibles (entre 1 et 8 μg/ml),
- est incubé dans un tampon de capture ne contenant comme agent tensioactif exclusivement des agents tensioactifs ioniques, - est mis en contact avec un support solide, sur lequel est fixé, de manière covalente, du plasminogène,
- puis est soumis à une étape de denaturation ménagée qui également de manière surprenante n'entraîne pas la destruction de la liaison PrPres-plasminogène, permet une fixation sélective de la PrPres sur le support solide et un dosage direct de la PrPres sur le support solide, sans nécessiter d'étapes supplémentaires.
Un tel procédé permet d'effectuer un dosage continu complètement automatisable, à la différence du procédé décrit dans la demande internationale PCT WO 99/41280 qui requiert une étape de centrifugation. Un tel dosage présente, en outre, une sensibilité au moins aussi bonne que celle obtenue avec les méthodes mettant en œuvre une étape de purification, telles que décrites dans la Demande Internationale PCT WO 99/41280. La présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic pour la mise en œuvre du procédé tel que défini ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend en association :
- au moins un tampon d'homogénéisation, tel que défini ci-dessus, - au moins un tampon de capture tel que défini ci-dessus,
- au moins un tampon de denaturation tel que défini ci-dessus,
- une protéinase K à une concentration finale comprise entre 1 et 8 μg/ml, de préférence à une concentration finale comprise entre 2 et 4 μg/ml, et
- un support solide sur lequel est lié, de manière covalente, du plasminogène.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs du procédé selon l'invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la Figure 1 illustre l'effet de la concentration en protéinase K sur le rapport signal CP (contrôle positif) sur CN (contrôle négatif).
- la Figure 2 représente une étude comparative de la détection de la PrPres de mouton à l'aide d'un dosage « sandwich» classique (BAR-224/SAF-34) ou avec le couple plasminogène/BAR224. - la Figure 3 représente une étude comparative du dosage de la PrPres de mouton atteint de la tremblante en utilisant la technique décrite dans la Demande Internationale WO 99/41280 ou la méthode selon l'invention : dosage « sandwich » plasminogène/B AR224 sur plaque de microtitration.
- la Figure 4 représente une étude comparative du dosage direct (invention) et du dosage indirect (méthode selon la Demande Internationale WO
01/23425) de la PrPres de mouton atteint de la tremblante : comparaison des conditions de capture par le plasminogène immobilisé sur des billes magnétiques selon l'invention ou selon la Demande Internationale WO 01/23425.
- la Figure 5 illustre la comparaison de la détection de la PrPres utili- sant la technique de préparation de SAFs suivie par un dosage immunométrique (Demande Internationale PCT WO 99/41280) avec celle utilisant la capture de la PrPres sur des billes couplées au plasminogène suivie d'un dosage direct (invention).
- la Figure 6 représente l'effet de la dilution d'un homogenat de cerveau de mouton atteint de la tremblante sur la détection de la PrPres par dosage direct sur du plasminogène couplé à des billes magnétiques.
- La figure 7 représente des courbes de dilution de cerveau de souris, de vache et d'homme atteints par une ESST. Elle illustre la capacité du procédé selon l'invention à effectuer le diagnostic de toutes les ESSTs.
EXEMPLE 1 : Procédé de détection selon Pinvention : optimisation de différents paramètres
1. Couplage du plasminogène sur support solide Covalink NH
Le plasminogène est immobilisé de façon covalente à la surface de plaques de microtitration Covalink NH (Nunc) à l'aide d'un agent couplant homo- bifonctionnel, le disuccinimidyl suberate (DSS). 100 μl d'une solution de DSS (12,5mg de DSS dissous dans 50 ml de DMSO et 50 ml de tampon carbonate 50 mM pH 9,5) sont incubés à la surface des puits Covalink NH pendant 1 heure à température ambiante.
Les puits sont lavés 3 fois à l'eau distillée puis 100 μl d'une solution de plasminogène à 2,5 μg/ml en tampon carbonate 50 mM pH 9,5 sont incubés à la surface des puits pendant une nuit à température ambiante. Les puits sont vidés et saturés avec du tampon EIA (tampon phosphate 0,1 M pH 7,4 NaCl 0,15 M, BSA 0,1% et azoture de sodium 0,01%)
2. Préparation de l'échantillon (étape (a) du procédé) et capture de la PrPres sur les plaques de microtitration Covalink NH contenant le plasminogène (étape (b) du procédé)
A. Conditions de préparation de l'échantillon en vue de la capture
25 μl d'un homogenat de cerveau de mouton atteint de la tremblante
(CP = contrôle positif) ou sain (CN = contrôle négatif) sont incubés avec 225 μl de tampon EIA pH 7,4 comprenant un agent tensioactif ionique et de la protéinase K à une concentration finale de 1 μg/ml, pendant 10 minutes à 37°C, puis 10 μl de
Pefabloc™ (inhibiteur de protéases correspondant au fluorure de [4-(2-aminoéthyl) benzènesulfonyle] HCl) à 100 mM sont ajoutés. 100 μl d'échantillon sont déposés et incubés 2 heures à température ambiante dans les puits de la plaque de microtitration Covalink NH contenant le plasminogène.
B. Effet des agents tensioactifs sur la capture de la PrPres par le plasminogène immobilisé sur support solide Covalink NH
Le Tableau I ci-après illustre les résultats obtenus en utilisant l'anticorps BAR-224 pour détecter la PrPres associée au plasminogène après denaturation ménagée par traitement à la guanidine/HCl.
Ce Tableau I décrit les conditions testées sur la capture de la PrPres par le plasminogène ; Ce Tableau détaille l'effet de différents agents tensioactifs : Sarkosyl= SK, Triton XI 00= T, NP40= Nonidet P40, Tween 20= Tween et Sodium docécyl sulfate= SDS.
Tableau I : Effet des détergents sur la capture de la PrPres de cerveau de mouton atteint de la tremblante par le plasminogène immobilisé sur support solide plaque de microtitration Covalink NH.
Figure imgf000018_0001
* : Résultats obtenus dans une expérience différente et normalisés par rapport au résultat obtenu avec le tampon EIA + SK 1 % π : Conditions de la Demande Internationale WO 01/23425 utilisées pour la capture de la PrPres par le plasminogène. CN : contrôle négatif CP : contrôle positif
Tampon EIA : tampon phosphate 0,1M pH 7,4 + NaCl 0,15 M + BSA 0,1% + azoture de sodium 0,01%
Les conditions de capture sélectionnées pour la suite des essais sont : tampon EIA + SK 1 %, même si dans le Tableau I ci-dessus, d'autres conditions présentent un rapport CP/CN légèrement supérieur parce que ces conditions fournissent un différentiel CP-CN fort et que dans d'autres expériences les résultats étaient inversés, la valeur des CN variant.
En l'absence d'agent tensioactif, aucune capture spécifique n'est observée (on observe même une liaison de la PrPsens).
Les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant comme agent tensioactif, le sarkosyl.
C. Effets du pH et de la concentration en NaCl sur la capture de la PrPres par le plasminogène immobilisé sur support solide Covalink NH 25 μl d'un homogenat de cerveau de mouton atteint de la tremblante ou sain sont incubés avec 225 μl de tampon EIA contenant différentes concentrations de NaCl et à différents pH et comprenant du sarkosyl à une concentration finale (p/v) de 1 % et de la protéinase K à une concentration finale de 1 μg/ml, pendant 10 minutes à 37°C, puis 10 μl de Pefabloc™ à 100 mM sont ajoutés. On procède ensuite comme décrit précédemment.
Le Tableau II illustre les résultats obtenus. Tableau II : Effet du pH et de la concentration en NaCl sur la capture de la PrPres de cerveau de mouton atteint de la tremblante par le plasminogène immo- biϋsé sur une plaque de microtitration Covalink NH.
Figure imgf000019_0001
* : Résultats obtenus dans une expérience différente et normalisés par rapport au résultat obtenu avec le tampon EIA + SK1%
Tampon EIA : tampon phosphate 0,1 M pH 7,4 + BSA 0,1%» + azoture de sodium
0,01% Les conditions de capture de la PrPres sélectionnées de préférence sont les suivantes : tampon EIA + NaCl 0,5 M + SK 1%.
D. Effet de la concentration en protéinase K sur le rapport CP/CN
25 μl d'un homogenat de cerveau de mouton atteint de tremblante ou sain sont incubés avec 225 μl de tampon EIA pH 7,4 comprenant 0,5 M de NaCl, 1% final de sarkosyl et de la protéinase K à différentes concentrations, 0, 0,5, 1, 2, 4, et 8 μg/ml finale pendant 10 minutes à 37°C, puis 10 μl de Pefabloc™ à 100 mM sont ajoutés. On procède ensuite comme décrit précédemment.
Le Tableau III et la figure 1 illustrent les résultats obtenus. Tableau III : Optimisation de la concentration en protéinase K (PK)
Figure imgf000020_0001
Ces résultats montrent que la PK à faible concentration (2 à 4 μg/ml) améliore le rapport CP/CN, tout en conservant un bon signal CP. 3. Denaturation ménagée de la PrPres, dans des conditions où le complexe pIasminogène/PrPres n'est pas dissocié.
A. Conditions préférées de la denaturation
Après 2 heures de réaction à température ambiante, les puits sont lavés puis incubés avec 100 μl de guanidine/HCl 8M pendant 30 min à 37°C.
B. Effet de l'agent dénaturant utilisé après capture et avant détection de la PrPres, par un anticorps marqué
25 μl d'un homogenat de cerveau de mouton scrapie et mouton sain sont incubés avec 225 μl de tampon EIA pH 7,4 comprenant 0,5 M de NaCl, 1% de sarkosyl et de la protéinase K à une concentration finale de 1 μg/ml pendant 10 minutes à 37°C, puis 10 μl de Pefabloc™ à 100 mM sont ajoutés. 100 μl sont déposés dans les puits d'une plaque de microtitration contenant du plasminogène immobilisé. Après 2 heures de réaction à température ambiante, les puits sont lavés puis incubés avec 100 μl de différents agents dénaturants pendant 30 min à 37°C.
Les puits sont à nouveau lavés puis incubés avec un anticorps traceur, le BAR224 à 5 unités EUman/ml, pendant 2 heures à température ambiante.
Après lavage, 200 μl d'une solution de révélation (réactif d'Ellman) sont ajoutés. L'absorbance à 414 nm des puits est mesurée après 30 min de réaction.
Le Tableau IN illustre les résultats obtenus.
Tableau IN : Effet de l'agent dénaturant utilisé après capture et avant détection de la PrPres de mouton par un anticorps marqué.
Figure imgf000022_0001
* : Résultats obtenus dans une expérience différente et normalisés par rapport au résultat obtenu avec le tampon EIA + SK 1 % Seules certaines conditions testées donnent un bon signal CP : ce sont toujours des agents chaotropes forts qui donnent une bonne détection de la PrPres, comme l'urée, l'hydrochlorure de guanidine, le thiocyanate de guanidine et le thiocyanate de sodium. 4. Détection de la PrPres complexée au plasminogène directement sur le support solide: sélection de l'anticorps de révélation
On procède comme décrit au point 3., en utilisant comme agent dénaturant la guanidine/HCl 8M.
Huit Anticorps ont été testés à une concentration de 5 unités Ellman/ml : SAF34, SAF53, SAF61 , 8G8, BAR221 , BAR224, BAR231 et BAR233.
Le Tableau N illustre les résultats obtenus. Tableau V : Sélection de l'anticorps traceur pour la détection de la PrPres de mouton.
Figure imgf000023_0001
L'anticorps traceur BAR224 donne le meilleur rapport CP/CΝ ainsi qu'un bon signal CP pour la détection de la PrPres de mouton.
EXEMPLE 2 : Etude comparative de la détection de la PrPres de mouton à l'aide d'un dosage « sandwich» classique (BAR224/SAF34) ou avec le couple plasmino- gène/BAR224. Cette étude a permis de comparer la sensibilité de détection des deux types de sandwich. Une préparation de PrPres (SAF) a été obtenue à partir d'un cerveau de mouton atteint de tremblante :
- Pour le dosage « sandwich » BAR224/SAF34 : les préparations de SAFs (selon le protocole des SAFs rapides, tel que décrit dans la Demande internatio- nale PCT WO 99/41280) à partir de 250 μl d'homogénat de cerveau de mouton atteint de la tremblante ou sain, sont reprises et dénaturées avec 25 μl d'un tampon dénatu- rant (tampon C, tel que défini dans la Demande internationale PCT WO 99/41280) pendant 10 min à 100°C. Les culots sont repris avec 250 μl de tampon EIA et dilués successivement en tampon EIA. Les dilutions sont déposées dans les puits d'une plaque de microtitration contenant l'anticorps BAR224. Après 2 heures de réaction à température ambiante, les puits sont lavés puis incubés avec 100 μl de l'anticorps traceur SAF34 (à 5 UE/ml) pendant 2 heures à température ambiante. Après lavage, 200 μl de la solution de révélation sont ajoutés. L'absorbance à 414 nm est mesurée après 30 minutes de réaction.
- Pour le dosage « sandwich » plasminogène/BAR224 : les prépara- tions de SAFs (identiques à ci-dessus) sont reprises avec 250 μl de tampon EIA contenant du Pefabloc™ 4 mM finale, puis traitées par ultrasons jusqu'à dissolution du culot. On effectue ensuite des dilutions successives en tampon EIA comprenant du Pefabloc™. Les dilutions sont déposées sur support solide (plaque de microtitration) contenant du plasminogène. Après 2 heures d'incubation à température ambiante, les puits sont lavés ; après l'étape de lavage, la PrPres est dénaturée de façon ménagée par de la guanidine/HCl (8M, 30 minutes à 37°C) puis les différents puits sont incubés avec 100 μl de l'anticorps traceur BAR224 (à 5 UE/ml) pendant 2 heures à température ambiante. Après lavage, 200 μl de solution de révélation sont ajoutés. L'absorbance à 414 nm est mesurée après 30 minutes de réaction. La Figure 2 illustre les résultats obtenus et montre que les deux systèmes présentent une sensibilité comparable avec un léger avantage pour le dosage entièrement immunologique.
EXEMPLE 3 : Etude comparative du dosage de la PrPres de mouton atteint de la tremblante en utilisant la technique selon la Demande internationale PCT WO 99/41280 et le dosage « sandwich » plasminogène/BAR224 sur plaque de microtitration, selon l'invention.
Dans cette deuxième expérience, on compare la sensibilité des deux procédés en incluant, pour le procédé selon la Demande WO 99/41280, la technique de préparation des SAFs et pour la technique plasminogène, la dilution qu'il est néces- saire d'opérer avant capture, notamment pour obtenir une concentration en protéine, dans l'homogénat, de 20 mg/ml (2% p/v). Un homogenat à 20% de cerveau de mouton atteint de la tremblante est dilué ou non dans un homogenat de cerveau de mouton sain (dilution 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 et 1/320).
Dans le cas du test selon la Demande internationale WO 99/41280, les SAFs sont préparés à partir de 250 μl d'homogénat. Pour la partie détection, les anticorps BAR224 et SAF34 sont utilisés comme anticorps de capture et anticorps traceur respectivement.
Dans le cas du test selon l'invention :
. le plasminogène est immobilisé sur les plaques de microtitration comme précisé à l'exemple 1 ;
. le dosage est effectué à partir de 25 μl d'homogénat, en utilisant comme tampon de capture, du tampon EIA comprenant 0,5 M de NaCl, 1% de sarkosyl et 2,5 μg/ml de protéinase K, comme agent dénaturant de la guanidine/HCl 8M et comme anticorps traceur le BAR224. Les résultats sont illustrés à la figure 3 et montrent que le test selon la Demande internationale PCT WO 99/41280 a un avantage très net en termes de sensibilité parce qu'il traite 250 μl d'homogénat à 20%, soit 50 mg de tissu cérébral au lieu de 25 μl du même homogenat à 20%, soit 5 mg pour le test selon l'invention. Cet inconvénient résulte de l'utilisation de plaques de microtitration, parce que le volume d'homogénat à 2% traité est limité (au maximum 300 μl). Toutefois, cet inconvénient disparaît lorsqu'on utilise des billes magnétiques qui permettent de traiter des volumes très importants (au moins 50 ml).
EXEMPLE 4 : Etude comparative du dosage direct selon l'invention avec un dosage indirect de la PrPres de mouton atteint de la tremblante liée au plasmino- gène immobilisé sur des billes magnétiques. Comparaison avec les conditions de capture utilisées dans la Demande Internationale WO 99/41280.
- 100 μg de plasminogène ont été couplés à 1 ml de billes magnétiques (Dynal M-280) selon la méthode décrite par le fabricant.
- 25 μl d'un homogenat à 20 % de cerveau de mouton atteint de la tremblante ou sain sont incubés :
(1) soit avec 225 μl de tampon de capture, tel que défini ci-dessus (2) soit avec 225 μl de PBS comprenant 3% de NP-40 et 3% de Tween-20 (conditions décrites dans la Demande internationale PCT WO 01/23425).
- 10 μl de billes, couplées au plasminogène, sont ajoutés à chaque • échantillon puis incubés 2 heures à température ambiante sous rotation. Les billes sont lavées 3 fois :
. soit (1) avec du tampon EIA comprenant 1% de Tween 20,
. soit (2) avec du PBS comprenant 2% de NP-40 et 2% de Tween 20.
Après un lavage avec du PBS, on ajoute 30 μl de guanidine/HCl 6M pour le dosage direct et 30 μl d'urée 6 M et sarkosyl 0,25% pour le dosage indirect, puis on incube pendant 10 minutes à 100°C.
Les résultats sont illustrés à la figure 4 :
. Dans le cas du dosage direct, après l'étape de denaturation, les billes couplées au plasminogène sont lavées puis incubées avec 500 μl de traceur BAR224 en tampon EIA/Tween 20 1% (à 5 UE/ml) pendant 2 heures à température ambiante sous agitation. Les billes sont ensuite lavées 2 fois avec du tampon EIA/Tween 20 1% et une fois avec du PBS, avant d'ajouter 600 μl de réactif d'EUman. Après 30 minutes de réaction, 200 μl de milieu réactionnel sont prélevés et l'absorbance à 412 nm est mesurée.
. Dans le cas du dosage indirect, après l'étape de denaturation, la PrP dénaturée et éluée du plasminogène est reprise avec 300 μl de tampon EIA et mesurée à l'aide d'un dosage « sandwich » BAR224/SAF34.
Il ressort de cet exemple que les conditions de capture selon la présente invention permettent d'obtenir des résultats significativement supérieurs à ceux obtenus avec les conditions de capture de la Demande Internationale WO 01/23425. On notera aussi que le dosage direct, plus simple est aussi plus sensible.
Exemple 5 : Comparaison de la détection de la PrPres utilisant la technique de préparation de SAFs suivie par un dosage immunométrique (méthode selon la Demande Internationale WO 99/41280) avec celle utilisant la capture de la PrPres sur des billes couplées au plasminogène suivie d'un dosage direct. Dans le cas du dosage de la PrPres selon la méthode décrite dans la
Demande Internationale PCT WO 99/41280, les SAFs sont préparés à partir de 500 μl d'homogénat à 20% de cerveau de mouton sain ou atteint de la tremblante (dilué ou non dans un homogenat de cerveau de mouton sain au 1/10, 1/50 et 1/100). Les culots de SAFs sont repris et dénaturés avec 50 μl de tampon de denaturation (tampon C, tel que défini dans la Demande internationale PCT WO 99/41280) pendant 10 minutes à 100°C. La quantité de PrP est ensuite mesurée avec le kit de détection BIO-RAD Platelia™ BSE (réf. 51103) (trousse immuno-enzymatique pour la détection in vitro de la PrPres après purification selon la méthode décrite dans la Demande Internationale PCT WO 99/41280).
Dans le cas du dosage utilisant le plasminogène couplé à des billes magnétiques, les 500 μl d'homogénat (les mêmes que ci-dessus) sont dilués 10 fois dans du tampon EIA comprenant 0,5M de NaCl et 1% de sarkosyl, puis incubés avec 30 μl de billes contenant le plasminogène immobilisé pendant 3 heures à température ambiante. Après lavage, une denaturation ménagée est réalisée par traitement avec une solution de guanidine/HCl pendant 10 minutes à 100°C. Après 3 lavages avec du tampon EIA/Tween 20 1% et un lavage avec du PBS, les billes sont incubées avec le traceur BAR224 en tampon EIA pendant 2 heures à température ambiante. Les billes sont à nouveau lavées 3 fois avec du tampon EIA/Tween 20 1% et une fois avec du PBS avant d'ajouter la solution de révélation (réactif d'Ellman).
Les résultats sont illustrés à la figure 5, qui montre que la technique plasminogène apparaît au moins aussi sensible que le test selon la Demande Internationale PCT WO 99/41280. L'utilisation de billes magnétiques permet de travailler avec un volume plus important et de compenser l'inconvénient lié à la nécessité de diluer l'homogénat avant la capture par le plasminogène. EXEMPLE 6 : Effet de la dilution d'un homogenat de cerveau de mouton atteint de la tremblante sur la détection de la PrPres par dosage direct sur du plasminogène couplé aux billes magnétiques. Démonstration de la capacité de la méthode à concentrer la PrPres diluée dans un grand volume d'échantillon.
500 μl d'un homogenat de cerveau de mouton atteint de la tremblante sont dilués dans 5, 10, 20 et 50 ml de tampon EIA pH 7,4 comprenant 0,5 M de NaCl et 1% de sarkosyl, puis incubés avec 30 μl de billes couplées au plasminogène pendant 4 heures à température ambiante. Ensuite on procède comme décrit ci-dessus.
Les résultats sont illustrés à la figure 6 qui montre la capacité du procédé selon l'invention à concentrer la PrPres diluée. EXEMPLE 7 : Application de l'invention à la détection de PrPres dans des homogénats de cerveaux de souris, de vache et d'homme atteints par une ESST.
Des homogénats à 20% (p/v) obtenus à partir d'un cerveau de souris (infectée par une souche de tremblante du mouton), d'un cerveau de bovin (infecté par l'ESB) ou d'un cerveau humain (infecté par la maladie de Creutzfeldt-Jakob) ont été dilués jusqu'à une concentration de 1% (p/v) dans le tampon de capture (tampon EIA comprenant du NaCl 0,5 M et du sarkosyl à 1% (v/v) final). Ces homogénats ont ensuite été mis au contact de billes magnétiques contenant du plasminogène immobilisé et analysés dans les conditions décrites dans l'exemple 4.
De manière plus précise, on ajoute à 50 μl d'un homogenat de cerveau contrôle négatif ou positif (dilué ou non dans un homogenat négatif + 50 μl de SK10%), 850 μl de tampon EIA/NaCl 0,5 M + 50 μl de SK10 % + 10 μl de billes magnétiques couplées à du plasminogène ; on incube 2h30 à température ambiante sous rotation ; les billes sont ensuite lavées, 3 fois avec du tampon EIA comprenant 1% de Tween 20, puis une fois avec du PBS. La denaturation ménagée est effectuée en présence de 50 μl de thiocyanate de guanidine (Gn/SCN) 4 M à 100°C pendant 8 min. Après l'étape de denaturation, les billes sont lavées en PBS puis incubées avec 500 μl d'anticorps traceur 2h à température ambiante, sous agitation (à 5 UE/ml). Les billes sont ensuite lavées deux fois avec du tampon EIA Tween 20 1 % et une fois avec du PBS, avant d'ajouter 1 ml de réactif d'Ellman. Après 20 min de réaction, 200 μl de milieu réactionnel sont prélevés et l'absorbance à 412 nm est mesurée.
Cette expérience (figure 7) montre que le test décrit fonctionne avec d'autres espèces que les moutons et peut détecter d'autres souches de prions que les souches de tremblante.

Claims

REVENDICATIONS 1°) Procédé de détection de la PrPres dans un échantillon biologique, mettant en œuvre un support solide, notamment des plaques de microtitration ou des billes magnétiques, sur lequel est immobilisé du plasminogène, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend :
(a) une étape de préparation de l'échantillon biologique, au cours de laquelle ce dernier est incubé dans un tampon sélectionné dans le groupe constitué par :
(i) des tampons d'homogénéisation de l'échantillon biologique comprenant (1) un tampon sélectionné dans le groupe constitué par les tampons comprenant au moins un agent tensioactif sélectionné dans le groupe constitué par les agents tensioactifs ioniques et les agents tensioactifs non-ioniques, un tampon glucose, un tampon à base de saccharose et un tampon PBS et (2) optionnellement, une protéinase K à une concentration finale comprise entre 1 et 8 μg/ml, de préférence à une concentration finale comprise entre 2 et 4 μg/ml et
(ii) les tampons de capture comprenant au moins (1) un agent tensioactif sélectionné dans le groupe constitué par les agents tensioactifs ioniques et (2) optionnellement une protéinase K à une concentration finale comprise entre 1 et 8 μg/ml, de préférence à une concentration finale comprise entre 2 et 4 μg/ml ; (b) une étape de capture de la PrPres sur ledit support solide, effectuée obligatoirement en présence d'un tampon de capture, tel que défini ci-dessus, sans PK, par incubation de l'échantillon biologique obtenu à l'étape (a) avec ledit support sur lequel est immobilisé de façon covalente du plasminogène ;
(c) une étape de denaturation ménagée de la PrPres fixée sur ledit support par l'intermédiaire du plasminogène, comprenant l'incubation de la PrPres avec un tampon de denaturation comprenant au moins un agent chaotrope, à une température comprise entre la température ambiante et 100°C et
(d) une étape de détection de la PrPres dénaturée et fixée sur ledit support avec un anticorps spécifique de la protéine PrP. 2°) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'agent tensioactif ionique mis en œuvre au cours de l'étape (a) ou au cours de l'étape (b) est sélectionné dans le groupe constitué par :
- des agents tensioactifs anioniques, tels que le SDS (dodécylsulfate de sodium), le sarkosyl (lauroyl-sarcosine), le cholate de sodium, le désoxycholate de sodium, le taurocholate de sodium ; et
- des agents tensioactifs zwitterioniques, tels que le SB 3-10 (décyl- sulfobétaïne), le SB 3-12 (dodécyl-sulfobétaïne), le SB 3-14 (tétradécyl-sulfobétaïne), le SB 3-16 (hexadécyl-sulfobétaïne), le CHAPS et le désoxyCHAPS. 3°) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent tensioactif non-ionique, mis en œuvre au cours de l'étape (a) du procédé selon l'invention, est sélectionné dans le groupe constitué par le C12E8 (dodécyl octaéthylène glycol), le Triton XI 00, le Triton XI 14, le Tween 20, le Tween 80, le MEGA 9 (nonanoyl méthyle glucamine), l'octylglucoside, le LDAO ( dodécyle diméthylamine oxyde) ou le NP40.
4°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la durée d'incubation de l'étape (a) est comprise entre 5 et 30 minutes à 37°C, de préférence pendant 10 minutes à 37°C.
5°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le tampon de capture comprend de préférence du sarkosyl à une concentration finale comprise entre 0,5 % et 2 % (p/v), de manière encore plus préférée à une concentration finale en sarkosyl de 1 % (p/v).
6°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le tampon de capture comprend en outre un sel sélectionné de préfé- rence parmi les sels de métaux alcalins.
7°) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit sel est du chlorure de sodium, à une concentration comprise entre 0,15 M et 0,5 M.
8°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le tampon de capture comprend en outre une protéine et de manière encore plus préférée, de la sérumalbumine bovine à une concentration de 0,2 mg/ml. 9°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la durée d'incubation de l'étape (b) est comprise entre 1 heure et 4 heures à température ambiante.
10°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'étape (b) comprend, en outre, si nécessaire, préalablement à ladite incubation, une dilution de l'échantillon biologique obtenu à l'étape (a) dans ledit tampon de capture, pour obtenir l'ajustement de la concentration en protéine.
11°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'agent chaotrope mis en œuvre au cours de l'étape (c) de déna- turation ménagée est sélectionné dans le groupe constitué par l'urée, un sel de guanidine, tel que l'hydrochlorure de guanidine ou le thiocyanate de guanidine et le thiocyanate de sodium ou un mélange de ceux-ci.
12°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la durée d'incubation de l'étape (c) est comprise entre 10 et 60 minutes, de préférence soit pendant 30 minutes à 37°C avec les plaques de microtitration soit pendant 10 minutes à 100°C avec les billes magnétiques.
13°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'anticorps traceur de l'étape (d) est sélectionné dans le groupe constitué par les anticorps SAF et les anticorps anti-PrP recombinante. 14°) Trousse de diagnostic pour la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce qu'elle comprend en association :
- au moins un tampon d'homogénéisation, tel que défini ci-dessus,
- au moins un tampon de capture tel que défini ci-dessus, - au moins un tampon de denaturation tel que défini ci-dessus,
- une protéinase K à une concentration finale comprise entre 1 et 8 μg/ml, de préférence à une concentration finale comprise entre 2 et 4 μg/ml, et
- un support solide sur lequel est lié, de manière covalente, du plasminogène. 1/7
Figure imgf000032_0001
0 0,5 1 2 4 8 concentration de la PK en μg/ml
FIGURE 1
2/7
Figure imgf000033_0001
1/100 1/10
Dilution de l'homogénat
FIGURE 2
3/7
Figure imgf000034_0002
Figure imgf000034_0001
4/7
-Dosage direct
1,6 (PBS/NP40/Tween) 1,4 1,2 -Dosage direct 1,0 (TamponEIA/NaCI 0,8 0,5M/SK1%) 0,6 Dosage indirect 0,4 (PBS/NP40tTween) 0,2
Figure imgf000035_0001
0,0 Dosage indirect (Tampon EIA/NaCI0,5IWSK1%)
1/4 1/2 3/4 11/4 dilution de l'homogénat
FIGURE 4
- — Dosage direct sur billes/plasminogène
-• — Technique SAF
Figure imgf000036_0001
1/100 1/10 1 dilution de l'homogénat
FIGURE 5
6/7
Figure imgf000037_0001
FIGURE 6
7/7
Dosage de la PrPres de cerveau murin, humain et bovin
Figure imgf000038_0001
Dilution de l'échantillon infectieux
FIGURE 7
PCT/FR2003/002117 2002-07-09 2003-07-08 METHODE DE DETECTION AUTOMATISABLE DE LA PrPres ET SES APPLICATIONS WO2004008144A2 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003263271A AU2003263271A1 (en) 2002-07-09 2003-07-08 Method capable of being automated for detection of prpless thanspgreater thanresless than/spgreater than and uses thereof
JP2004520736A JP2005537463A (ja) 2002-07-09 2003-07-08 ＰｒＰｒｅｓの検出のために自動化され得る方法およびその使用
US10/520,397 US20060188929A1 (en) 2002-07-09 2003-07-08 Method capable of being automated for detection of prpres and uses thereof
EP03763936A EP1523681A2 (fr) 2002-07-09 2003-07-08 Methode de detection automatisable de la prpres et ses applications

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0208608A FR2842303B1 (fr) 2002-07-09 2002-07-09 Methode de detection automatisable de la prpres et ses applications
FR02/08608 2002-07-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2004008144A2 true WO2004008144A2 (fr) 2004-01-22
WO2004008144A3 WO2004008144A3 (fr) 2004-04-08

Family

ID=29763669

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2003/002117 WO2004008144A2 (fr) 2002-07-09 2003-07-08 METHODE DE DETECTION AUTOMATISABLE DE LA PrPres ET SES APPLICATIONS

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20060188929A1 (fr)
EP (1) EP1523681A2 (fr)
JP (1) JP2005537463A (fr)
AU (1) AU2003263271A1 (fr)
FR (1) FR2842303B1 (fr)
WO (1) WO2004008144A2 (fr)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007531895A (ja) * 2004-04-05 2007-11-08 アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド 伝染性海綿状脳症試験の試薬及び方法
CN103675115A (zh) * 2012-12-24 2014-03-26 张文 海洋天然活性物质磁珠高内涵快速筛选方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1596199A1 (fr) * 2004-05-14 2005-11-16 Prionics AG Méthode de détection des formes pathogènes des protéines prions.
ATE528649T1 (de) * 2005-02-15 2011-10-15 Adlyfe Inc Verfahren zum nachweis falsch gefalteter proteine und prionen
JP2010523977A (ja) * 2007-04-04 2010-07-15 ノバルティス アーゲー プリオンアッセイ
JP2014507649A (ja) * 2011-01-18 2014-03-27 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド ヒト血液中の抗βアミロイド抗体の測定
EP3420341B1 (fr) * 2016-02-24 2020-11-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Procédés et systèmes de détection de fluorescence
CN115728214A (zh) * 2021-08-30 2023-03-03 深圳市帝迈生物技术有限公司 一种稀释液及应用该稀释液的网织血小板检测试剂

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2774988A1 (fr) * 1998-02-16 1999-08-20 Commissariat Energie Atomique Procede de purification de la prpres a partir d'un echantillon biologique et ses applications
WO2000029850A1 (fr) * 1998-11-17 2000-05-25 Wallac Oy Immuno-essai de recherche d'encephalopathies spongiformes transmissibles chez les bovins
WO2001023425A1 (fr) * 1999-09-28 2001-04-05 Universität Zürich Facteurs ayant une activite de liaison au prion dans du serum ou du plasma et agents permettant de detecter l'encephalopathie spongiforme transmissible
WO2001035104A1 (fr) * 1999-11-12 2001-05-17 Commissariat A L'energie Atomique Procede de diagnostic d'une esst provoquee par une souche d'atnc dans un echantillon biologique

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2774988A1 (fr) * 1998-02-16 1999-08-20 Commissariat Energie Atomique Procede de purification de la prpres a partir d'un echantillon biologique et ses applications
WO2000029850A1 (fr) * 1998-11-17 2000-05-25 Wallac Oy Immuno-essai de recherche d'encephalopathies spongiformes transmissibles chez les bovins
WO2001023425A1 (fr) * 1999-09-28 2001-04-05 Universität Zürich Facteurs ayant une activite de liaison au prion dans du serum ou du plasma et agents permettant de detecter l'encephalopathie spongiforme transmissible
WO2001035104A1 (fr) * 1999-11-12 2001-05-17 Commissariat A L'energie Atomique Procede de diagnostic d'une esst provoquee par une souche d'atnc dans un echantillon biologique

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007531895A (ja) * 2004-04-05 2007-11-08 アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド 伝染性海綿状脳症試験の試薬及び方法
JP4934021B2 (ja) * 2004-04-05 2012-05-16 アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド 伝染性海綿状脳症試験の試薬及び方法
CN103675115A (zh) * 2012-12-24 2014-03-26 张文 海洋天然活性物质磁珠高内涵快速筛选方法
CN103675115B (zh) * 2012-12-24 2016-04-20 张文 海洋天然活性物质磁珠高内涵快速筛选方法

Also Published As

Publication number Publication date
FR2842303B1 (fr) 2004-09-24
FR2842303A1 (fr) 2004-01-16
WO2004008144A3 (fr) 2004-04-08
AU2003263271A8 (en) 2004-02-02
AU2003263271A1 (en) 2004-02-02
US20060188929A1 (en) 2006-08-24
EP1523681A2 (fr) 2005-04-20
JP2005537463A (ja) 2005-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2390891C (fr) Procede de diagnostic d'une esst provoquee par une souche d'atnc dans un echantillon biologique
Iwata et al. Presynaptic localization of neprilysin contributes to efficient clearance of amyloid-β peptide in mouse brain
Colvin et al. The conformational epitope for a new Aβ42 protofibril‐selective antibody partially overlaps with the peptide N‐terminal region
Taguchi et al. Critical significance of the region between Helix 1 and 2 for efficient dominant-negative inhibition by conversion-incompetent prion protein
WO2004008144A2 (fr) METHODE DE DETECTION AUTOMATISABLE DE LA PrPres ET SES APPLICATIONS
EP1889074A2 (fr) Procede utile pour la detection d'encephalopathies
EP1658494B1 (fr) Methode de titrage in vitro d'un atnc et son application a une methode d'evaluation et/ou de controle d'un procede d'obtention d'un produit biologique
AU2003266801B2 (en) Detection and diagnosis of transmissable spongiform encephalopathies
JP2009513927A (ja) 非対称的な自発的相互作用によるプロテアーゼ耐性プリオンタンパク質の検出
EP1402269B1 (fr) Procede de separation et/ou detection et/ou identification et/ou quantification de proteines prions
EP2269075A1 (fr) Methode de detection et/ou de titrage in vitro d'un agent transmissible non conventionnel
EP1952153A2 (fr) Procédé d'identification du génotype en position 171 de la protéine prion d'ovin ainsi que trousses de mise en oeuvre de ce procédé
EP1573336B1 (fr) Procede de detection de la prp utilisant un antibiotique des aminoglycosides du groupe ii
EP2503336B1 (fr) Nanobilles recouvertes de plasminogène comme support direct d'amplification cyclique de la protéine prion PrPsc
US8663943B2 (en) Antibodies for discrimination of prions
JP4049135B2 (ja) 病原性プリオン蛋白質の検出方法及びその濃縮方法、並びにその濃縮又は検出試薬キット
JP2004340924A (ja) プリオン識別抗体
FR2940446A1 (fr) Procede de detection d'une infection par prion

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004520736

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003763936

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003763936

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006188929

Country of ref document: US

Ref document number: 10520397

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10520397

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2003763936

Country of ref document: EP